CN121022813A

CN121022813A - 一种酮基异构酶突变体及其制备方法与应用

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Publication number: CN121022813A
Application number: CN202511582479.9A
Authority: CN
Inventors: 朱理平; 李亚静; 宋文竹; 徐良平
Original assignee: Zhucheng Haotian Pharm Co ltd
Current assignee: Zhucheng Haotian Pharm Co ltd
Priority date: 2025-10-31
Filing date: 2025-10-31
Publication date: 2025-11-28
Anticipated expiration: 2045-10-31

Abstract

本发明公开一种酮基异构酶突变体及其制备方法与应用，涉及基因工程技术领域。酮基异构酶突变体由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过如下突变所得：第34位氨基酸由N突变为R；同时，第188位氨基酸由I突变为K。SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过上述突变获得的酮基异构酶突变体的半衰期延长，酶活升高，从而进一步提高了D‑手性肌醇的产量。

Description

一种酮基异构酶突变体及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种酮基异构酶突变体及其制备方法与应用。

背景技术

D-手性肌醇（D-chiro-inositol，DCI）是肌醇的九种异构体中具有旋光性的一种。近年来人们研究发现D-手性肌醇除了具有肌醇促进肝脏脂代谢功能外，还具有如胰岛素增敏作用，降血糖，改善多囊卵巢综合症患者的排卵情况，调节激素平衡，改善月经失调，以及抗氧化、抗衰老、抗炎特殊的生理功能。

酮基异构酶与肌醇脱氢酶的双酶组合可以将底物肌肉肌醇转化为D-手性肌醇，但现有技术中的酮基异构酶的酶活较低、半衰期较短，且耐热性较差，导致整体转化率受限，是限制D-手性肌醇产量的关键瓶颈。

因此，传统技术有待改进。

发明内容

本发明的目的在于提供一种酮基异构酶突变体及其制备方法与应用，用于克服上述酮基异构酶的酶活较低、半衰期较短，且耐热性较差，导致整体转化率受限的缺陷。

第一方面，本发明提供了一种酮基异构酶突变体，所述酮基异构酶突变体由SEQID NO.2所示的氨基酸序列经过如下突变所得：

第34位氨基酸由N突变为R；同时，第188位氨基酸由I突变为K。

与现有技术相比，本发明对SEQ ID NO.2所示的酮基异构酶进行上述突变后，得到的酮基异构酶突变体在35℃及40℃下的热稳定性提高，半衰期延长，酶活提高，从而进一步提高了肌肉肌醇的转化率和D-手性肌醇的产量。

进一步地，所述酮基异构酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。其中，所述酮基异构酶突变体为N34R/I188K。

第二方面，本发明提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码上述所述的酮基异构酶突变体N34R/I188K。

进一步地，编码上述酮基异构酶突变体N34R/I188K的核酸分子序列如SEQ IDNO.9所示。

第三方面，本发明提供了一种表达载体，所述表达载体含有上述所述的核酸分子。

第四方面，本发明提供了一种重组菌株，所述重组菌株含有所述的核酸分子或所述的表达载体。

第五方面，本发明提供了一种酮基异构酶突变体N34R/I188K的制备方法，用于制备所述的酮基异构酶突变体N34R/I188K，包括以下步骤：

将所述的重组菌株于LB培养基中进行种子培养，得到种子液；

以1％~5％体积比的接种量将所述种子液接入另一LB培养基中，发酵培养，至OD₆₀₀值达到0.6~0.8，降温，加入终浓度为1mM~1.5mM的IPTG进行诱导培养至OD₆₀₀为4~7，获得含有酮基异构酶突变体N34R/I188K的发酵液；

将所述发酵液离心收集菌体，菌体重悬后破碎细胞，离心得到的上清液即为酮基异构酶突变体N34R/I188K粗酶液。

与现有技术相比，本发明使用重组菌株制备酮基异构酶突变体N34R/I188K，是因为该重组菌株中含有表达该酮基异构酶突变体N34R/I188K的核酸分子，因此，经过对重组菌株的培养、发酵即可获得酮基异构酶突变体N34R/I188K粗酶液，这一方法提高了生产效率，且操作简便易行，能够快速获得粗酶液，减少制备过程中的繁琐操作和时间成本。

进一步地，所述种子培养的温度为35℃~38℃，转速为120r/min~220r/min，培养时间为10h~15h。

进一步地，所述发酵培养的温度为35℃~38℃。

进一步地，所述降温为降温至16℃~20℃。

第六方面，本发明提供了所述的酮基异构酶突变体N34R/I188K或所述的酮基异构酶突变体N34R/I188K粗酶液在制备D-手性肌醇中的应用。

与现有技术相比，本发明中的酮基异构酶突变体N34R/I188K或酮基异构酶突变体N34R/I188K粗酶液的稳定性提高，半衰期延长，酶活升高，在与肌肉肌醇混合后，可以显著提高肌肉肌醇的转化率和D-手性肌醇的产量。

第七方面，本发明提供了一种D-手性肌醇的制备方法，在磷酸盐缓冲液中加入肌肉肌醇、NADP⁺、酮基异构酶突变体N34R/I188K粗酶液、肌醇脱氢酶，反应生成D-手性肌醇。

与现有技术相比，本发明在反应体系中加入了酮基异构酶突变体N34R/I188K粗酶液，其中的酮基异构酶突变体N34R/I188K的半衰期显著延长，酶活更高，能够进一步提高肌肉肌醇的转化率和D-手性肌醇的产量。

进一步地，反应体系中各组分浓度如下：

肌肉肌醇8mg/mL~12mg/mL、NADP⁺1mM~3mM、酮基异构酶突变体N34R/I188K粗酶2mg/mL~4mg/mL、肌醇脱氢酶2mg/mL~4mg/mL、磷酸盐缓冲液80mM~120mM。

进一步地，反应温度为30℃~37℃，反应pH值为7.0~8.0。

附图说明

图1为野生型酮基异构酶粗酶和酮基异构酶突变体N34R/I188K粗酶在35℃下孵育0h、2h、4h、6h、8h、10h后的残余酶活。

图2为野生型酮基异构酶粗酶和酮基异构酶突变体N34R/I188K粗酶在40℃下孵育0h、2h、4h、6h、8h、10h后的残余酶活。

具体实施方式

为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

应理解，以下实施例中所用原料如无特殊说明均为市售原料。

实施例1重组质粒pET28a-KMI的构建

对野生型酮基异构酶的核苷酸进行密码子优化后得到序列1，以序列1为模板，设计上游引物F1、下游引物R1，进行PCR扩增，得到带有Hind Ⅲ和Xho Ⅰ酶切位点同源臂的KMI目的基因片段。PCR扩增反应体系如表1所示，PCR扩增反应条件如表2所示。

序列1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的野生型酮基异构酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

F1:5’-TCGAGCTCCGTCGACAAGCTTATGAAGACTACTCTGAACCACATGAC-3’，SEQ ID NO.3；

R1:5’-GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTAAGCAGCACGTGCCTGC-3’，SEQ ID NO.4。

表1PCR扩增反应体系

表2PCR扩增反应条件

上述PCR扩增结束后对反应产物进行琼脂糖凝胶回收，得到纯度较高的KMI基因片段。

对表达载体pET28a使用限制性内切酶Hind Ⅲ和Xho Ⅰ进行双酶切，回收纯化双酶切产物，得到带有酶切位点的线性化载体pET28a，酶切体系如表3所示。

表3酶切体系

将上述PCR扩增得到的KMI基因片段连接到线性化载体pET28a的Hind Ⅲ和Xho Ⅰ的酶切位点之间，得到重组质粒pET28a-KMI，连接体系如表4所示。反应温度为37℃，反应时间为30 min。

表4连接体系

上述连接完成后采用化学转化法将连接产物转化至E.coli DH5α感受态细胞中，挑取单菌落进行质粒抽提，并将提取的质粒进行DNA测序。

实施例2构建突变质粒

以实施例1的重组质粒pET28a-KMI为模板，以F-N34R和R-N34R为引物进行反向PCR扩增得到pET28a-KMI^N34R。

上述反向PCR扩增反应体系如表5所示，扩增反应条件如表6所示。

表5反向PCR扩增反应体系

表6反向PCR扩增反应条件

然后再以pET28a-KMI^N34R为模板，以F-N34R/I188K和R-N34R/I188K为引物进行反向PCR扩增得到pET28a-KMI^N34R/I188K。该反向PCR扩增反应体系如表7所示，扩增反应条件如表6所示。

表7反向PCR扩增反应体系

其中：

F-N34R：5’-AGGTCCGTCGCGATATCGCTCGTCCGCTGTT-3’，SEQ ID NO.5；

R-N34R：5’-GATATCGCGACGGACCTCAACACCGATACA-3’，SEQ ID NO.6；

F-N34R/I188K：5’-GACGGGCAAAGTCCATATTTCCGCTGTTACGG-3’，SEQ ID NO.7；

R-N34R/I188K：5’-TATGGACTTTGCCCGTCTGTTCCGGGTA-3’，SEQ ID NO.8。

消除模板：上述反向PCR反应完成后得到反应液，吸取2.5μL限制性核酸内切酶DpnⅠ加入反应液（25μL）中，进行温和吹吸混匀，在37℃反应1 h，并使用琼脂糖凝胶电泳对酶切消化液进行验证。

反向PCR产物自身环化：使用上述获得的酶切消化液，按表8配制反应液，轻轻混匀，置于16℃下反应1h，得到含有酮基异构酶突变体基因的突变质粒pET28a-KMI^N34R/I188K。

应理解，每完成一次反向PCR都要对模板进行消除，以及进行反向PCR产物的自身环化。

表8反应液

突变质粒验证：将上述环化后得到的突变质粒通过化学转化法转化至E .coliDH5α感受态细胞中，挑取平板上的单克隆菌落进行质粒抽提，并将提取的质粒进行DNA测序。其中，突变质粒pET28a-KMI^N34R/I188K含有酮基异构酶突变体N34R/I188K的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。

实施例3制备粗酶液

取1μL上述实施例2中测序正确的突变质粒pET28a-KMI^N34R/I188K加入大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中，将混合后的反应体系冰上放置30 min后于42℃水浴热激60s，而后冰上孵育5min，得到重组菌株；而后将重组菌株转移到500μL的LB液体培养基中于37℃震荡复苏1h，取100μL菌液涂板，筛选出含有突变质粒pET28a-KMI^N34R/I188K的阳性转化子（即突变菌株）。

将筛选得到的突变菌株在液体LB培养基中进行种子培养，于37℃、120rpm的条件下培养14h，得到突变菌株的种子液。

以2％体积比的接种量将上述突变菌株的种子液接入新的LB液体培养基中进行发酵培养，37℃下培养至OD₆₀₀值为0.7，之后降温至18℃，加入终浓度为1.0mM的IPTG进行诱导培养，诱导培养至OD₆₀₀值达到5，获得含有酮基异构酶突变体N34R/I188K的发酵液。

将含有酮基异构酶突变体N34R/I188K的发酵液在4℃、4000r/min下离心15min，收集菌体，使用pH值为7.5的磷酸盐缓冲液对收集的菌体进行重悬。而后使用超声波细胞粉碎机分别对菌体细胞进行破碎，超声功率为450W，每破碎3s停2s，共超声30min，超声破碎结束后分别于4℃、12000r/min下离心去除细胞碎片，收集上清液，得到酮基异构酶突变体N34R/I188K的粗酶液，该粗酶液中，酮基异构酶突变体N34R/I188K粗酶的浓度为4mg/mL。

取1μL实施例1中测序正确的重组质粒pET28a-KMI，以上述同样的方法制备得到野生型酮基异构酶的粗酶液，该粗酶液中，野生型酮基异构酶粗酶的浓度为4mg/mL。

实施例4检测酶活和半衰期

在pH值为7.5、100mM的磷酸盐缓冲液中加入肌肉肌醇、NADP⁺、野生型酮基异构酶粗酶液、肌醇脱氢酶酶液，配置得到10mL的反应体系一，反应体系一中的各组分浓度为：肌肉肌醇30mM、NADP⁺1.5mM、野生型酮基异构酶粗酶3mg/mL、肌醇脱氢酶3mg/mL。

同时，在pH值为7.5、100mM的磷酸盐缓冲液中加入肌肉肌醇、NADP⁺、酮基异构酶突变体N34R/I188K粗酶液、肌醇脱氢酶酶液，配置得到10mL的反应体系二，反应体系二中的各组分浓度为：肌肉肌醇30mM、NADP⁺1.5mM、酮基异构酶突变体N34R/I188K粗酶3mg/mL、肌醇脱氢酶3mg/mL。

将上述两个反应体系分别在35℃的条件下反应5min，测定酶活。

酶活定义：在上述反应体系与条件下，1min内消耗1μmol肌肉肌醇所需的酶量。

以野生型酮基异构酶的酶活为100%，计算酮基异构酶突变体N34R/I188K的相对酶活，结果如表9所示。

表9酶活测定结果

由上述结果可知：相较于野生型酮基异构酶粗酶，酮基异构酶突变体N34R/I188K粗酶的酶活显著提高。

将上述酮基异构酶突变体N34R/I188K粗酶液及野生型酮基异构酶粗酶液分别在35℃、40℃温度下分别孵育0h、2h、4h、6h、8h、10h，然后将经不同温度、不同时间孵育后的粗酶液按照上述反应体系一和反应体系二配置反应体系，以孵育0h的酶活为100%，按照上述酶活计算方法分别测定酮基异构酶突变体N34R/I188K粗酶及野生型酮基异构酶粗酶在孵育不同时间后的残余酶活，得到35℃和40℃下的半衰期。结果见图1和图2。

由图1和图2可知，酮基异构酶突变体N34R/I188K粗酶的热稳定性在35℃及40℃较野生型酮基异构酶粗酶均有提高，35℃半衰期由3h延长至6h，40℃下半衰期由2h提高至3.7h。

实施例5制备D-手性肌醇

在pH值为7.5、100mM的磷酸盐缓冲液中加入肌肉肌醇、NADP⁺、野生型酮基异构酶粗酶液、肌醇脱氢酶酶液，配置得到10mL的反应体系三，反应体系三中的各组分浓度为：肌肉肌醇10mg/mL、NADP⁺2mM、野生型酮基异构酶粗酶3mg/mL、肌醇脱氢酶3mg/mL。

在pH值为7.5、100mM的磷酸盐缓冲液中加入肌肉肌醇、NADP⁺、酮基异构酶突变体N34R/I188K粗酶液、肌醇脱氢酶酶液，配置得到10mL的反应体系四，反应体系四中的各组分浓度为：肌肉肌醇10mg/mL、NADP⁺2mM、酮基异构酶突变体N34R/I188K粗酶3mg/mL、肌醇脱氢酶3mg/mL。

将上述反应体系三、反应体系四分别在35℃的条件下反应1h，分别得到反应液，用高效液相色谱法分别检测反应液中D-手性肌醇含量并计算底物肌肉肌醇的转化率。

检测条件：规格为4.6×250 mm的色谱柱、5μm的氨基柱、流动相（乙腈和50 mM乙酸铵水溶液的体积比为75 : 25），设置柱温为30℃，流速1.0 mL/min。用示差折光检测器进行检测，检测结果如表10所示。

其中，转化率=生成D-手性肌醇含量/初始肌肉肌醇含量。

表10 D-手性肌醇含量及肌肉肌醇的转化率

由上述结果可知：相较于野生型酮基异构酶粗酶，本发明中的酮基异构酶突变体N34R/I188K粗酶可以进一步提高底物肌肉肌醇的转化率，从而进一步提高D-手性肌醇的产量。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种酮基异构酶突变体，其特征在于，所述酮基异构酶突变体由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过如下突变所得：

第34位氨基酸由N突变为R；同时，第188位氨基酸由I突变为K；

所述酮基异构酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。

2.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1所述的酮基异构酶突变体。

3.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有权利要求2所述的核酸分子。

4.一种重组菌株，其特征在于，所述重组菌株含有权利要求2所述的核酸分子或权利要求3所述的表达载体。

5.一种酮基异构酶突变体的制备方法，用于制备权利要求1所述的酮基异构酶突变体，其特征在于，包括以下步骤：

将权利要求4所述的重组菌株于LB培养基中进行种子培养，得到种子液；

以1％~5％体积比的接种量将所述种子液接入另一LB培养基中，发酵培养，至OD₆₀₀值达到0.6~0.8，降温，加入终浓度为1mM~1.5mM的IPTG进行诱导培养至OD₆₀₀为4~7，获得含有酮基异构酶突变体的发酵液；

将所述发酵液离心收集菌体，菌体重悬后破碎细胞，离心得到的上清液即为酮基异构酶突变体粗酶液。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述种子培养的温度为35℃~38℃，转速为120r/min~220r/min，培养时间为10h~15h；和/或，

所述发酵培养的温度为35℃~38℃；和/或，

所述降温为降温至16℃~20℃。

7.权利要求1所述的酮基异构酶突变体、或权利要求5所述的制备方法制备得到的酮基异构酶突变体粗酶液在制备D-手性肌醇中的应用。

8.一种D-手性肌醇的制备方法，其特征在于，在磷酸盐缓冲液中加入肌肉肌醇、NADP⁺、权利要求5所述的制备方法制备得到的酮基异构酶突变体粗酶液、肌醇脱氢酶，反应生成D-手性肌醇。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，反应体系中各组分浓度如下：

肌肉肌醇8mg/mL~12mg/mL、NADP⁺1mM~3mM、酮基异构酶突变体粗酶2mg/mL~4mg/mL、肌醇脱氢酶2mg/mL~4mg/mL、磷酸盐缓冲液80mM~120mM；和/或，

反应温度为30℃~37℃，反应pH值为7.0~8.0。