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CN1210290C - 核酸的送递 - Google Patents

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CN1210290C CNB951952420A CN95195242A CN1210290C CN 1210290 C CN1210290 C CN 1210290C CN B951952420 A CNB951952420 A CN B951952420A CN 95195242 A CN95195242 A CN 95195242A CN 1210290 C CN1210290 C CN 1210290C
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Abstract

本发明提供一种将核酸导入细胞的方法。所述方法包括使细胞暴露于具有结构式(1)的化合物，式中w是一个核酸，x是一个肽或氨基酸，y是一个链长相当于1到20个碳原子的连接物或无，R4是H或CH2O-R3；R1，R2和R3是相同的或不同的且为氢，甲基，乙基，羟基或由具有3到24个碳原子碳链长度的饱和或不饱和脂肪酸衍生而来的脂酰基团，条件是至少R1，R2和R3中的一个是由脂肪酸衍生而来的脂酰基团；或使细胞暴露于具有结构式(2)：w......xyNHCH2CH2OR5的化合物，其中w是一个核酸，x是一个肽或氨基酸，y是一个链长相当于1到20个碳原子的连接物或无，R5是一个由具有3到24个碳原子碳链长度的饱和或不饱和脂肪酸衍生而来的脂酰基团。本发明还涉及这些化合物。

Description

核酸的送递
本发明涉及一种将化合物，特别是核酸，导入细胞的方法。另外本发明还涉及此方法中用到的组合物。
有很多情形需要将特定的化合物送递到细胞内。这其中的一种情况是用DNA转染真核细胞。目前使用诸如“Transfectam”(Promega)，“DOTAP”(Boehringer Mannheim)，“Lipofectin”(脂转染试剂)或“Lipofectamine”(脂转染胺试剂)(BRL)的各种各样商品制剂或通过使用磷酸钙介导的转染来作这种工作。
将以核酸为基础的化合物送递到细胞的能力也可用于药物送递和基因治疗。化合物到细胞的送递将随着下式的化合物而改变。在对它们的作用时间(如缓慢释放或持续作用)，所需药物的量或送递的方式进行修饰时，这些变化可以显示出来。用下述参数范围内的化合物送递到细胞内还可以赋予药物以细胞或组织特异性定位能力。
本发明人发现将分子与下面通式的脂酰衍生物修饰的化合物结合可促进这些化合物到细胞内的送递。
相应地，本发明的第一方面为将核酸导入细胞的方法，该方法包括使细胞暴露于具有下述结构式的化合物：
其中：
w是一个核酸
x是一个肽或氨基酸
y是一个链长相当于1到20个碳原子的连接物或无
R4是H或CH2O-R3；R1，R2和R3是相同的或不同的且为氢，甲基，乙基，羟基或由一个具有3到24个碳原子碳链长度的饱和或不饱和脂肪酸衍生而来的脂酰基团，条件是至少R1，R2和R3中的一个是由脂肪酸衍生而来的脂酰基团。
本发明的第二个方面是将核酸导入细胞的方法，包括使细胞暴露于具有下述结构式的化合物：
w......x-y-NH-CH2-CH2O-R5
其中：
w是一个核酸
x是一个肽或氨基酸
y是一个链长相当于1到20个碳原子的连接物或无
R5是一个由具有3到24个碳原子碳链长度的饱和或不饱和脂肪酸衍生而来的脂酰基团。
本发明的第三个方面为用于将核酸导入细胞的一种化合物，此化合物具有下述结构式：
Figure C9519524200061
其中：
w是一个核酸
x是一个肽或氨基酸
y是一个链长相当于1到20个碳原子的连接物或无
R4是H或CH2O-R3；R1，R2和R3是相同的或不同的且为氢，甲基，乙基，羟基或由一个具有3到24个碳原子碳链长度的饱和或不饱和脂肪酸衍生而来的脂酰基团，条件是至少R1，R2和R3中的一个是由脂肪酸衍生而来的脂酰基团。
本发明的第四个方面为用于将核酸导入细胞的一种化合物，此化合物具有下述结构式：
w......x-y-NH-CH2-CH2O-R5
其中：
w是一个核酸
x是一个肽或氨基酸
y是一个链长相当于1到20个碳原子的连接物或无
R5是一个由具有3到24个碳原子碳链长度的饱和或不饱和脂肪酸衍生而来的脂酰基团。
在本发明的每一个方面的优选形式中y是存在的。
在本发明的优选实施方案中核酸是DNA，RNA或者DNA或RNA的寡聚核苷酸，修饰的寡聚核苷酸或上述的结合物。核酸还可以携带诸如荧光素(FITC)，胆固醇，生物素或放射性标记物的化学添加剂。
本发明的方法可以用于将核酸包括DNA，RNA，DNA或RNA的寡聚核苷酸，修饰的寡聚核苷酸或上述结合物导入到真核细胞，真核细胞包括动物或植物来源的确立细胞株，动物或植物来源的原始细胞株，系统或局部应用或通过气雾剂使用的整个动物或植物。有鉴于此，参阅文献EPO424688，以其全文作为参考文献。核酸还可以携带诸如荧光素(FITC)，胆固醇，生物素或放射性标记物的化学添加剂。
本发明的方法一般地涉及将处于一种基本上为含水的混合物中的化合物应用到感兴趣的细胞的表面。但是，在整个有机体的情况下可能有必要通过定向或系统注射，局部使用或通过吸入以一种基本上非含水形式使用此化合物。
本发明的描述包括将诸如荧光素(FITC)或生物素的标记化合物加到肽上以利于在细胞和器官中观察和追踪。标记的化合物可以以上面描述的任何途径或方法使用于细胞。
肽可以是任何长度并可以包括诸如核定位信号和/或核酸结合结构域的功能结构域。这些功能结构域可以包括在诸如可以用赖氨酸构建的串联结构中，或分支结构上。典型地，肽将拥有一个整体上的正电荷以吸引并缚住核酸，例如，一个有一个或多个赖氨酸残基的肽。但是，如果为有利于不同形式的送递，比如体内系统送递，则肽可以构建成整体上携带中性电荷。
连接物可以是本领域所熟知的大量分子中的任何一种。但是，目前优选的是连接物为一个氨基酸或肽，例如丙氨酸，亮氨酸，甘氨酸，苯丙氨酸，赖氨酸或这些氨基酸的同聚物或混聚物。此连接物还可以包括非典型氨基酸，因此允许连接物长度的延伸超过一个标准氨基酸的延伸。有鉴于此，特别优选的是连接物为氨基丁酸，氨基己酸或氨基辛酸。
在本发明的另一个优选实施方案中，R1，R2和R3是相同的，并且优选是脂肪酸的脂酰衍生物，脂肪酸包括由软脂酸，肉豆蔻酸，月桂酸，癸酸，油酸和胆固醇，尤其是月桂酸或肉豆蔻酸组成的一组。
在本申请人的澳大利亚专利申请No.649242中披露了通过环甲胺或乙醇胺衍生物将氨基酸或肽连接到1到3个脂酰衍生物上的方法。使用这种方法，可以形成宽范围的具有1到3个脂肪酸残基脂酰衍生物的肽/脂酰衍生物的缀合物(conjugate)。正是使用了在此申请中披露的方法，先导化合物三赖氨酸丙氨酸tris三软脂酸酯(K3ATP3)才得以形成。这一申请以其全文作为参考文献。
在化合物的“x”处使用正电荷氨基酸如赖氨酸，精氨酸，鸟氨酸等，核酸(化合物的“w”)可以与化合物的其余部分结合。特别优选的基团为单赖氨酸，双赖氨酸，三赖氨酸，四赖氨酸或五赖氨酸基团。或者，核酸可以共价结合到肽或氨基酸“x”上。另外，连接物基团的丙氨酸可以用，例如亮氨酸，甘氨酸，苯丙氨酸或α-BOC(ε-自由)赖氨酸基团取代并且脂酰衍生物的数目可以在1到3之间改变。还需要注意的是在需要使用一个脂酰衍生物的地方tris可以用乙醇胺代替。
据信用诸如二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)，DOPC(DOP胆碱)或胆固醇的脂类通过标准的方法配制成脂质体可以增加本发明将化合物送递到细胞的能力。在有两个脂酰衍生物时这种能力更可能发挥。形成脂质体的方法在，例如，Felgner，P.L.等人，1987，PNAS 84，7413-7417页和Yago，K等人，1993 Biochem.and Biophys.Res.Comm.196(3)1042-1048页中有描述。本发明还显示只将DOPE加入到化合物溶液中可以明显地增强它们的活性(下面的实验4，VerafectinG2+/-DOPE)。相似地，用加入诸如盐的添加剂对转染条件的其他修饰可以增强转染。离子强度的改变和碱土金属阳离子的存在已经被描述为可以改变转染效率(Loeffler and Bohr，Methods in Enzymology 1993，H，599-654)。
本发明的一个主要用途是用作基因治疗送递试剂。使用这种试剂观察到的基因进入细胞的相当有效的转移和其低毒性(当与商购制剂相比时尤为如此)使得本发明成了用于治疗的理想的一系列化合物。有关基因治疗的进一步信息可以在Nabel等人1993 PNAS90 pp11307-11311中发现，此文献以其全文作为参考文献。
为了更清楚地理解本发明的性质，以下将参照实施例和附图描述本发明的优选形式，其中：
图1a显示Verafectin和DMSO的毒性，图1b显示与DMSO相比细胞在Verafectin中的％存活率。
细胞毒性用标准的MTT(3-(4，5-二甲基-2-噻唑)-2，5-二苯基溴化四唑；噻唑蓝)分析法进行分析。
Verafectin是K3ATP3并且其浓度用μM表示，DMSO以与Verafectin稀释后浓度相当的浓度使用。
a.细胞死亡导致OD值的下降
b.细胞在仅存在稀释的DMSO时的存活率定为100％并且在Verafectin存在时的细胞存活率作相应地调整。
图2a显示Verafectin和乙醇的细胞毒性，图2b显示与乙醇相比细胞在Verafectin中的％存活率。
细胞毒性用标准的MTT(3-(4，5-二甲基-2-噻唑)-2，5-二苯基溴化四唑；噻唑蓝)分析法进行分析。
Verafectin(K3ATP3)以10mg/ml的浓度溶于100％温乙醇中并接着用水稀释到以μM表示的浓度。
a.平行稀释乙醇并用和稀释的Verafectin相同的浓度测试其细胞毒性。
b.细胞在仅存在稀释的乙醇时的存活率定为100％并且在Verafectin存在时的细胞存活率作相应地调整。
图3显示Verafectin介导的pSVLCAT转染后48小时CAT的表达。
在覆盖在细胞上用于转染之前，用μM表示的量的Verafectin与1μg的pSVLCAT混合。显示的结果是测自转染后48小时50μl细胞培养物培养基中的CAT表达水平。
图4显示测试试剂介导的CHO细胞转染后48小时CAT的表达。
显示的结果是来自实验中给出最高转染水平时转染试剂的浓度。这时每种情况中的量为5μl。
CAT分析根据Neuman J.R.，Morency，C.A.and Russian，K.O.(1987)Biotechniques 5，p444447的方法进行。
无：没有转染试剂，TF：Transfectam(Promega)，Lfe：Lipofectamine(BRL)，VFA3：K3ATP3，VF G2：K3GTP2。
图5显示测试试剂介导的Cos1细胞转染后48小时CAT的表达。
显示的结果是来自实验中给出最高转染水平时转染试剂的浓度。无：无试剂，VFA3：K3ATP3，VF G2：K3GTP2，VF G2+DOPE：K3GTP2+DOPE。
图6显示转染试剂的相对细胞毒性。
图示说明
a.(CHO细胞)
用不同的试剂转染后在收获细胞用于CAT分析时细胞的存活。
无：无转染试剂，TF：Transfectam，Lfe：脂转染胺试剂，VF G2：Verafectin G2，所有试剂均为5μl，高的OD指示高的细胞存活。
b.(Cos1细胞)
同图a的细胞存活。VF A3；Verafectin A3 9μl，Lfe 5μl。此实验中的分析在35mm培养皿中操作。
图7a和7b显示“x”肽实验“a”的结果
图8显示“x”肽实验“b”的结果
图9显示来自“x”肽实验“c”的结果
(图示说明-图7，8和9；无；没有与质粒DNA共同使用的试剂，rb/空白；试剂空白，化合物描述后面的数字指示2mM贮液的(用水稀释)的μl数)。7b：不使用DNA或转染试剂的“模拟转染的”培养皿定为100％细胞存活率。在无细胞存在的情况下的存活率定为0％。用染料alamar蓝指示存活。)
图10a和10b显示来自“y”连接物实验“a”的结果
图11显示来自“y”连接物实验“b”的结果
图12显示来自“y”连接物实验“c”的结果
(图示说明-图10a，10b，11，12；试剂；除非另有说明测试化合物来自2mM贮液。(.4)；试剂贮液为0.4mM。0：没有试剂。标准转染情况下只有DNA。培养基空白：CAT分析中只有培养基。相对存活(alamar蓝)：37℃时加入alamar蓝温育一段时间测量的培养基的OD570-595。)
图13a和13b显示来自R1-R4衍生物实验“a”的结果
(图示说明：见图10a，10b，11，12的图示说明)
图14a和14b显示来自R1-R4衍生物实验“b”的结果
(图示说明：见图10a，10b，11，12的图示说明)
图15a和15b显示来自R1-R4实验“c”的结果
(图示说明：见图10a，10b，11，12的图示说明。显示了标准偏差)
图16a和16b显示来自R1-R4衍生物实验“d”的结果
图17a和17b显示R1-R4衍生物实验“e”的结果
图18a和18b显示R1-R4衍生物实验“g”的结果
根据标准分析在60mm培养皿中转染Cos1细胞。将50μl 48小时培养上清在37℃温育5小时以进行CAT分析。
图19a和19b显示R1-R4，C10-C16实验“b”的结果。Hela细胞。
(图示说明-图19a和图19b；Lfe；Lipofectamine，(1.39)最适转染发生时[脂类]/[DNA]比率，无；在转染中没有试剂但有DNA。细胞毒性用alamar蓝测定。)
图20a和20b显示来自“y”连接物非标准氨基酸实验“1”的结果。
(图示说明；LFE；Lipofectamine。在“a”中基因表达的水平以β-半乳糖苷酶的单位表示。在“b”中用染料“alamar蓝”测定相对存活并以在染料存在时温育一段时间后测定的光密度表示。高的OD值指示高的细胞存活。)
图21a和21b显示来自“y”连接物非标准氨基酸实验“2”的结果。
(图示说明；lfe；Lipofectamine，vf；Verafectin A3，C3；K3C3TL3，C5；K3C5TL3，C7；K3C7TL3，根据一些区域上的染蓝的细胞数量与没有染色的那些细胞相比计算转染体的百分比。a；CHO细胞，b；Cos1细胞。)
图22a和22b显示来自“y”连接物非标准氨基酸在PC3和Jurkat细胞株上的结果。
图23a显示“配制”实验“A”的结果。
用不同的脂质体配制品，成分和Lipofectamine(Lfe)转染的CHO细胞的CAT表达。显示了一个代表性实验的结果。
图23b显示“配制”实验“b”的结果。
用脂质体配制品，成分试剂和商业制剂转染的细胞的百分率。VF A2；K3ATP2。用VF A2和DOPE以指定的VF A2∶DOPE比率配制脂质体。显示的结果是一个单一实验的结果。
图24显示“未配制的混合物”实验“2”的结果。
(图示说明；转染效率以表达48小时后β-gal单位的水平来计量。L3：K3ATL3，M3；K3ATM3。峰指示给出最高读数的脂肽和DNA的组合。[脂类]指示所用的总脂肽的浓度。)
实施例
                                  化学
所用的缩写：
α-BOC(ε-Z-Lys)＝α-丁氧羰基-ε-苄氧羰基-赖氨酸
AEP             ＝丙氨酸-乙醇胺-软脂酸酯
ATP1            ＝丙氨酸-Tris-单软脂酸酯
ATP2            ＝丙氨酸-Tris-双软脂酸酯
ATP3            ＝丙氨酸-Tris-三软脂酸酯
CDCl3          ＝氯仿-d
DCCD            ＝二环己基碳二亚胺
DCM             ＝二氯甲烷
DIEA            ＝二异丙基乙胺
DMAP            ＝二甲氨基吡啶
DMF             ＝二甲基甲酰胺
DMSO-D6         ＝二甲亚砜-d6
DSC             ＝二琥珀酰亚胺碳酸酯
FATP1           ＝荧光素丙氨酸-Tris-单软脂酸酯
FATP2           ＝荧光素丙氨酸-Tris-双软脂酸酯
FATP3           ＝荧光素丙氨酸-Tris-三软脂酸酯
FITC            ＝异硫氰酸荧光素(异构体I)
HOSU            ＝羧基琥珀酰亚胺
TEA             ＝三乙胺
TFA             ＝三氟乙酸
THF             ＝四氢呋喃
Tris            ＝2-氨基-2-羟基甲基-1，3-丙二醇
Z               ＝N-苄氧羰基
材料与方法
α-BOC(ε-Z-Lys)从Peptide Institute，Inc.(Osaka，Japan)购买，DSC从Tokyo KaseiKogyo Co.(Tokyo，Japan)购买。除非另有提及，所有的氨基酸都是L-构象并从SigmaChemical Company(St.Louis，MO)购买。所有的溶剂都是分析纯的并且买来即用。
薄层层析(TLC)
在下列溶液系统中在Alufolein Silica gel 60 F254板(Merck)上进行：Rf1，氯仿/甲醇/乙酸：95/5/3；Rf2氯仿/甲醇/三乙胺：95/7/3。
高效液相层析(HPLC)
在Millipore Waters HPLC仪器(Waters Chromatography Division of Millipore，Milford，MA)上进行分析HPLC，此仪器包括一个具有自动梯度控制器的6000A系列溶液送递系统和Model 746 Date Module。层析用NOVAPAKTM C18反相柱(100×8mm)进行。在5分钟内以2ml/分钟的流速用加有0.1％TFA的24-80％乙腈线性梯度洗脱分析本发明的肽和肽-tris缀合物(系统A)。在260nm处用Waters Lambda Max 480进行检测；(RtA)。在C18柱上5分钟内以2ml/分钟的流速用从加有0.1％TFA的50％水，50％乙腈到加有0.1％TFA的50％乙腈，50％THF线性梯度洗脱分析脂肽缀合物(系统B)；(Rt B)。在一个PrePakR C4半制备反相柱(25×10)上以6ml/分钟的流速分离荧光标记的化合物。
制备性HPLC
用一个PrePak C4反相柱(100×40mm)在Millipore Waters DeltaPrep 4000 HPLC上进行分离，所述柱用与上述分析HPLC相同的洗脱缓冲系统以20ml/分钟的流速线性梯度洗脱。
核磁共振(NMR)
用一个200MHz Brucker分光光度计记录NMR光谱。
化学合成
ATP1，ATP2和ATP3的制备
这些化合物在乙醇中在碳表面钯原子(10％)存在的情况下，在一个Parr氢化器中通过Z-丙氨酸-Tris-单软脂酸，Z-丙氨酸-Tris-双软脂酸，和Z-丙氨酸-Tris-三软脂酸在40psi压力下的氢化作用来获得。苄氧羰基基团的清除用HPLC(系统B)来监控。通过溶剂的过滤和蒸发清除催化剂后，获得了定量产量的ATP1，ATP2和ATP3。ZATP1，ZATP2，ZATP3和相应的甘氨酰化合物的合成和纯化在Whittaker，R.G.，Hayes，P.J.and Bender，V.J.，(1993)，《肽研究》，6，125-128.，和Whittaker R.W.Patent No.649242，《与脂肪偶联的氨基酸，肽或其衍生物》中有描述。
FATP1，FATP2和FATP3的制备
边搅拌边在溶于DCM(500μl)的ATP1(10mg，25μmole)溶液中加入溶于DMF(500μl)的FITC(10mg，25μmole)溶液。通过加入TEA使反应的表观pH值保持在9.0且反应用HPLC(系统B)控制。荧光素-丙氨酸-Tris-单软脂酸在10分钟后形成，产物用制备性HPLC纯化以获得色谱纯状态的FATP1产物，Rt：7.08。在减压下除去溶剂并在叔丁醇中冻干FATP1产品。
FATP2和FATP3通过在将溶于DCM(500μl)的ATP2(16.3mg，25μmole)和ATP3(22mg，25μmole)与FITC(10mg，26μmole)反应以同样的方式合成，相应地获得色谱纯的产物Rt：8.61和9.92。
荧光素标记的丙氨酸-乙醇胺-软脂酸酯的制备
在乙醇中在炭表面钯原子(10％)存在的情况下，通过在一个Parr氢化器中Z-丙氨酸-乙醇胺-软脂酸的氢化作用来制备丙氨酸-乙醇胺-软脂酸(AEP)。苄氧羰基基团的清除用HPLC(系统B)来监控。通过溶剂的过滤和蒸发清除催化剂后，获得了定量产量的题述化合物。
(Lys)n化合物的制备
Z-丙氨酸-乙醇胺和相应的软脂酸酯的合成和纯化在Whittaker，R.G.，Hayes，P.J.andBender，V.J.，(1993)，《肽研究》，6，125-128.，和Whittaker R.W.Patent No.649242，《与脂肪偶联的氨基酸，肽或其衍生物》中有描述。
边搅拌边在溶于DMF(500μl)的AEP(20mg，54μmole)溶液中加入FITC(22mg，56μmole)并通过加入TEA使反应的表观pH值保持在9.0。不到20分钟反应即可完成，产物用制备性HPLC纯化以获得色谱纯状态的题述化合物，Rt：7.01。
寡聚-Lys化合物[(BOC(ε-Z-Lys)n]的合成通过经典的溶液方法(1)实现。脂肽BOC(ε-Z-Lys)n-X-Tris-软脂酸酯的合成是通过一个连接物氨基酸(X)-Tris化合物将寡聚-Lys和软脂酸连在一起来实现。合成的途径是通过活性酯方法将BOC-(ε-Z-Lys)n-OH和氨基酸-Tris(2)连在一起，并进一步通过对称酐方法(1)将软脂酸连到此缀合物上。中间物和最终产物的纯度通过TLC，HPLC和NMR来检测。
1)Bodanszky，M.and Bodanszky，A.1984.《肽合成原则》Springer-Verlag，Berlin。
2)Whittaker，R.G.，Hayes，P.J.，and Bender，V.J.，1993，将Tris连接到氨基酸和肽上的一般方法，《肽研究》，6，3(p.125-128)。
典型的合成例子如下：
步骤(I)α-BOC(ε-Z-Lys)2OH
α-BOC(ε-Z-Lys)OH(9.9g，30mmol)溶于100ml DCM中。在此溶液中加入HOSU(5.2g，45mmol)和DIEA(9.0g，15mmol)并冷却至0℃。将溶于50ml DCM的DCCD(6.2g，30mmol)滴入上述反应混合物中。0℃搅拌一小时后置室温过夜以获得活性酯(α-BOC(ε-Z-Lys)OSU，HPLC测定产率为86％。将DCU(二环己基脲)沉淀过滤去除并在反应混合物中加入α-氨基((ε-Z-Lys)OH(7.56g，27mmol)，室温下搅拌过夜。HPLC测定化合物I的形成产率为93％。在减压下除去溶剂，油状残留物溶于乙酸乙酯，用酸，碱，和水洗涤。乙酸乙酯相在硫酸钠上干燥并蒸发至干燥。残留物用二乙醚研磨获得16.6g的化合物I，产率为93％，Rf1：0.52，RtA：7.33分钟；1HNMR：δ(DMSO-d6，ppm)，1.39(9H，s，BOC(CH3)3)，1.4-1.8(12H，brs，β，γ，δCH2)，2.99(4H，brs，εCH2)，3.95(1H，m，αCH)，4.14(1H，m，αCH)，5.03(4H，s，Ar-CH2)，6.89(1H，d，α-尿烷NH，J＝7.5Hz)，7.25(2H，t，ε-尿烷NH)，7.41(10H，m，Ar(H))，7.95(1H，d，酰胺NH，J＝8.5Hz)。
步骤(II)H(ε-Z-Lys)2OH
化合物I(15.6g，27mmol)溶于50mlDCM中，并冷却至0℃。在此反应混合物中加入TFA(50ml)并在0℃搅拌10分钟，室温继续搅拌50分钟。溶剂和过量的TFA被蒸发至干燥，油状残留物用二乙醚研磨。得到15.3g的化合物II；Rf2：0.19，RtA：6.07分钟。
步骤(III)α-BOC(ε-Z-Lys)3OH
按例I的方法用HOSU和DCCD激活α-BOC(ε-Z-Lys)OH(8.96g，27mmol)。过滤去除DCU并将过滤物加到15.1g的化合物II中。在此反应混合物中加入DIEA(6g，46mmol)并在室温搅拌过夜。将溶剂蒸发并将残留物溶于乙酸乙酯，用酸，碱和水洗涤。乙酸乙酯相在硫酸钠上干燥并蒸发至干燥。残留物用二乙醚研磨获得20g化合物I的白色沉淀，产率为87％，Rf1：0.36，RtA：7.92分钟；1HNMR：δ(DMSO-d6，ppm)，1.39(9H，s，BOC(CH3)3)，1.4-1.8(18H，brs，β，γ，δCH2)，2.99(6H，brs，εCH2)，3.95(1H，m，αCH)，4.14(1H，m，αCH)，4.34(1H，m，αCH)，5.03(6H，s，Ar-CH2)，6.8(1H，d，ε-尿烷NH，J＝7.5Hz)，7.25(3H，t，ε-尿烷NH)，7.41(15H，m，Ar(H))，7.80(1H，d，酰胺NH，J＝8Hz)，8.15(1H，d，酰胺NH，J＝8Hz)。
步骤(IV)α-BOC(ε-Z-Lys)3-Ala-Tris
α-BOC(ε-Z-Lys)3OH(1g，1.2mmol)溶于40mlDMF，并加入DSC(0.92g，3.6mmol)。加入DIEA(0.2ml，1.2mmol)并在室温搅拌一小时后，形成了三赖氨酸的活性酯，HPLC测定的产率为78％。在此反应混合物中加入Ala-Tris(0.46g，2.4mmol)并通过加入0.6ml的DIEA调节pH值为8。题述化合物形成后进行HPLC。2小时后，此活性酯几乎全部被利用，或与Ala-Tris连在一起形成化合物IV，或水解成三赖氨酸化合物。HPLC测定化合物IV的产率为52％。制备性HPLC提供了270mg的纯化合物，RtA：7.4分钟；1HNMR：δ(DMSO-d6，ppm)，1.39(9H，s，BOC(CH3)3)，1.4-1.9(18H，brs，β，γ，δCH2)，2.97(6H，brs，εCH2)，3.53(6H，d，Tris(CH2)，J＝3Hz)，3.75-4.43(4H，brs，αCH)，3.89(3H，t，OH)，5.08(6H，s，Ar-CH2)，6.8(1H，d，α-尿烷NH，J＝7.4Hz)，7.19(3H，t，ε-尿烷NH)，7.41(15H，m，Ar(H))，7.80(1H，d，酰胺NH，J＝8Hz)，8.15(1H，d，酰胺NH，J＝8Hz)，8.35(1H，d，酰胺NH，J＝8Hz)。
步骤(V)α-BOC(ε-Z-Lys)3-Ala-Tris(软脂酸)n，n＝1，2，3
α-BOC(ε-Z-Lys)3-Ala-Tris(173mg，0.173mmol)溶于3ml DCM和1ml DMF。在此反应混合物中加入软脂酸(89mg，0.346mmol)和催化量的DMAP。冷却至0℃并将溶于2mlDCM的DCCD(71mg，0.346mmol)滴入此反应混合物中。0℃搅拌30分钟后置室温过夜。HPLC(系统B)测定题述化合物中单，双，和三软脂酸酯的比例为17％，40％和43％。
将溶剂蒸发至干燥并将残留物重新溶于DCM。过滤去除DCU并用碳酸氢钠(5％)和水洗涤过滤物。此混合物的制备性HPLC提供了高纯度的单软脂酸酯化合物(17mg，RtB：7.63分钟)，双软脂酸酯化合物(76mg，RtB：8.65分钟)，和三软脂酸酯化合物(63mg，RtB：9.29分钟)。三软脂酸化合物的1HNMR：δ(CDCl3，ppm)：0.8-0.95(9H，t，CH3)，1.3-1.47(84H，m，BOC(CH3)3)，软脂酸(CH2)，Ala(CH3))，1.47-1.9(18H，brs，β，γ，δCH2)，1.83(6H，t，CH2)，2.28(6H，t，CH2)，3.09(6H，brs，εCH2)，3.97(2H，m，αCH)，4.29(1H，m，αCH)，4.35(6H，s，Tris(CH2))，4.47(1H，t，αCH)，5.04(6H，s，Ar-CH2)，5.56(1H，d，酰胺NH，J＝7Hz)，5.7(1H，d，酰胺NH，J＝7.5Hz)，5.78(1H，d，酰胺NH，J＝7.5Hz)，6.92(1H，d，α-尿烷NH，J＝7.4Hz)，7.19(3H，t，ε-尿烷NH)，7.35(15H，m，Ar(H))。
步骤(VI)(Lys)3-Ala-Tris(软脂酸)3
将化合物V(45mg)溶于DCM(2ml)中并冷却至0℃。加入TFA(2ml)，0℃10分钟和室温30分钟以除去Boc基团。通过与二乙醚的重复共蒸发彻底除去溶剂和过量的TFA。此化合物的1HNMR显示BOC(CH3)基团消失。然后残留物溶于DCM/甲醇(50/50，4ml)溶液并在一个Parr氢化器中40psi压力下使用10％钯/碳氢化2小时以除去Z基团。Z基团的清除通过1HNMR光谱学确认(通过在5.04和7.35ppm处化学迁移的消失确认)。
                              生物学
使用的缩写：
A         ＝丙氨酸
DDME      ＝(耗竭)Dulbeccos改良的Eagles培养基，配制成2倍浓度，冰冻，使用前37℃融化，过滤并稀释到1倍(Loeffler，J-P and Behr，J-P，Methods inEnzymology(1993)H，p 599-654。
DME       ＝Dulbeccos改良的Eagles培养基
DOPE      ＝二油酰磷脂酰乙醇胺
EM        ＝电子显微镜(术)
F         ＝苯丙氨酸
FCS       ＝胎牛血清
FLAEP     ＝荧光素丙氨酸乙醇胺软脂酸酯
FLATP3    ＝荧光素丙氨酸Tris三软脂酸酯
G         ＝甘氨酸
K         ＝赖氨酸
K3ATP1-3  ＝三赖氨酸甘氨酸tris单-三软脂酸酯
L           ＝亮氨酸
Lfe         ＝Lipofectamine(Gibco BRL)
MTS         ＝3-(4.5-二甲基-2-噻唑)-5-(3-羧甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四
              唑，内盐；(Owen’s试剂)
MTT         ＝3-(4，5-二甲基-2-噻唑)-2，5-二苯基溴化四唑，噻唑蓝
PBS         ＝磷酸缓冲盐水
TEM         ＝透射电子显微镜
VF          ＝Verafectin＝K3ATP3
VFA3        ＝K3ATP3
VFG2        ＝K3GTP2
A.细胞吸收和分布
为了评估送递化合物到细胞的能力，用荧光素丙氨酸乙醇胺软脂酸酯(FLAEP)和荧光素丙氨酸tris三软脂酸酯(FLATP3)进行初步实验。
将FLAEP和FLATP3缀合物从DMSO溶液中稀释到水介质中(PBS)至浓度为10μM并将其加到在煮沸过的盖玻片上生长到铺满的洗下的单层Cos1细胞上。按实验中的指定温育一段时间后，处理至24小时，洗涤细胞并在甲醛中固定20分钟。然后在激光激发状况下在一台Bio Rad MRC 500共聚焦显微镜下观察细胞。
用FLAEP或FLATP3处理后只固定15分钟的细胞显示强烈的细胞质着色。只暴露于相当水平的荧光素的细胞在整个细胞上仅显示非常弱的一般化荧光。尤其值得注意的是FLATP3好象更优选与细胞膜和核膜结合在一起，这种情形在生长至24小时的细胞内始终保持，甚至此缀合物溶液被从单细胞层上洗掉并在2小时后用含血清的培养基代替仍保持这种染色模式。在同样的情况下没有观察到FLAEP缀合物的同样的染色规律。
在4％多聚甲醛中固定比甲醛固定剂更好地保持了细胞形态。因此，获得了细胞内荧光的更高分辨率的图像。这指示两种缀合物好象均定位在细胞质的很分立的区域内而不是显示普遍的分布。光学显微镜水平的观察指示定位的区域可以是内质网，高尔基体和可能是线粒体膜。
在低分辨率(40×物镜)时对采取与固定细胞相同的处理期的活的未固定细胞的观察，指示了一个不同的染色模式。FLAEP缀合物好象很容易进入细胞，但特别地集中在核内。这可能指示这种普遍的细胞质和核分布是因为分子与这些区域组分保持不接触而造成的。在固定时这些分子被从细胞内洗掉只留下结合在细胞组分上的缀合物。然而，不管细胞是活的或固定的，FLATP3缀合物都显示相似的模式。
用两种化合物的任一种以10μM的浓度处理至2小时的细胞内没有明显的细胞毒性发生。将Cos1细胞用50μM或更高浓度的FLAEP连续处理72小时后，用标准MTT细胞毒性分析法(见下面)分析观察到了明显的细胞毒性。相同的72小时延长处理后，FLATP3在12.5μM浓度时引起约80％的细胞毒性(相对于同样浓度的DMSO稀释剂)，在6.25μM是为70％的细胞毒性。
这些结果清楚地指示携带脂酰衍生物的先导化合物可以帮助它们自己进入细胞。在化合物进入细胞必需的时间段内观察到的细胞毒性是可以忽略的，但延长处理明显增加了观察到的细胞毒性。相应地，还进行了一些实验以测定是否相似的化合物可以用于通过连在一起而将诸如DNA的其他化合物导入细胞。
B.转染实验
a)细胞毒性
细胞毒性用标准的MTT(3-(4，5-二甲基-2-噻唑)-2，5-二苯基溴化四唑；噻唑蓝)分析法进行测定。简要地说，将Cos1细胞以2×104细胞/孔的密度植于一个96孔微量滴定板中并在100μl培养基中过夜以使细胞粘附。然后将在100μl培养基中的2×浓度(用来双倍稀释)的测试化合物加到板上。在37℃和5％CO2的正常培养情况下将细胞培养72小时。在37℃时加入20μl MTT(5mg/ml于PBS中)温育2.5小时，然后除掉所有的液体。加入100μl酸性丙醇，在以OD 630nm为参照读取570nm处的OD值之前将板振荡10分钟。
配制一种称为VerafectinA3的K3ATP3(三赖氨酸丙氨酸tris三软脂酸)的先导化合物，期望此化合物通过其整体携带正电荷的性质来吸引DNA。它不溶于水溶液中，部分溶于温乙醇中并在DMSO中可溶。通过将Cos1细胞连续暴露于K3ATP3 72小时来测试细胞毒性，此K3ATP3是从溶于25％DMSO的2.5mg/ml贮液稀释而来。与相同浓度的DMSO相比较在12.5-50μM化合物的细胞有70％的存活率(图1a和b)。当此化合物溶于相似浓度的乙醇时，细胞的存活率稍有提高(图1a和b)。
b)DNA送递
实验1：为了测试先导化合物K3ATP3(VerafectinA3)的转染性质，将携带在SV40晚期启动子控制下的编码CAT(氯霉素乙酰转移酶)基因的完整未切质粒，pSVLCAT(Cameron，F.H.and Jennings，P.A.(1989)PNAS 86，9139-9143)与测试试剂混合并在不同情况下置于Cos1细胞上。培养48小时后从培养基中分析分泌的CAT的水平。
方法：
溶液I：在500μl Dulbeccos改良的Eagles培养基(DME)中的1μg质粒DNA
溶液II：在500μl DME中的0-20μl VerafectinA3(2.5mg/ml 25％DMSO)，旋转振荡
合并溶液I和II，轻轻旋转振荡并在室温温育10分钟。
将混合物加入到60mm组织培养皿中的洗涤过的细胞中(前一天以0.5×106/皿植入)，37℃，5％CO2温育6小时。
加入2ml DME+10％FCS继续温育48小时。
分析组织培养物中CAT水平(Sleigh，M.J.(1986)Anal.Biochem.156.251-256)。
结果：
从那些用5μl(12.5μg)或更多的VerafectinA3(2.5mg/ml＝1.8mM)转染的样品中鉴定出了显著的CAT水平。CAT水平的高峰是在用10μl(25μg)VerafectinA3转染的样品中观察到的(图3)。
实验2：
用以比较使用溶于100％DMSO或乙醇的VerafectinA3贮液(10mg/ml)在Cos1细胞的转染水平和优化细胞暴露于VerafectinA3/DNA复合体的时间。
方法：
a-比较溶于DMSO或乙醇的VerafectinA3。
b-比较VerafectinA3作用于细胞6小时至过夜。
将在100％溶剂中的10mg/ml VerafeetinA3用水稀释至2.5mg/ml。
按实验1的方法实施转染。使VerafectinA3与细胞接触不同时间。
结果：
(i)在所有用10μl(25μg)或更多的VerafectinA3处理的样品中检测出显著水平的CAT。
(ii)乙醇样品显示出降低的转染性。
(iii)与6小时温育相比用VerafectinA3过夜温育降低CAT水平约50％。
实验3：
用以比较用VerafectinA3和G2对CHO细胞的转染水平与用商购试剂Transfectam(Promeea)和 Lipofectamine(BRL)对CHO细胞的转染水平。
方法：
除了每60mm皿使用0.5μg的pSVLCAT DNA外，Verafectin和Transfectam的实验方案与上述是相同的(参见上面)。
Lipofectamine实验方案根据制造商提供的指南。
0.5μg pSVLCAT/60mm皿。
CHO细胞以10×105/60mm皿植入并在加有10％FCS的DME/Hams培养基中吸附过夜。
Transfectam 5或10μl 1mg/400μl贮液。
Lipofectamine5或10μl 2mg/ml(与DOPE 3∶1混合)。
VerafectinA3(K3ATP3)和VerafectinG2(K3G[甘氨酸]TP2)每个为5，10和15μl的2mM(相应为2.8和2.3mg/ml)贮液。
有测试试剂和DNA存在的无血清培养阶段为6小时，然后加入1ml DME/Hams+10％FCS。培养至24小时时培养基换为2ml新鲜DME/Hams+10％FCS直到48小时收获为止。
结果：
开始转染步骤48小时后裂解CHO细胞并分析CAT活性。用5μl转染试剂在所有的情况下都观察到了峰值转染。用VerafectinA3获得的CAT水平大约是用 Transfectam的54％， Lipofectamine的18％。
用VerafectinG2获得的CAT水平大约是用 Transfectam的64％， Lipofectamine的22％。
参见图4。
实验4：
用以比较用VerafectinA3(K3ATP3)和VerafectinG2(K3GTP2)对Cos1细胞的转染水平与用商购试剂 Lipofectamine(BRL)对Cos1细胞的转染水平。
实验方案与上面描述的Verafectins相同。 Lipofectamine实验方案根据制造商提供的指南。
Cos1细胞以5×105/60mm皿植入并在加有10％FCS的DME培养基中吸附过夜。
溶液A：0.5μg pSVLCAT/60mm皿。
溶液B： Lipofectamine 10或15μl 2mg/ml(与DOPE 3∶1混合)。
OR；VerafectinA3和VerafectinG2 20μl的2mM(相应为2.8和2.3mg/ml)贮液。
OR；VerafectinG2还与等摩尔数的DOPE一起测试。VerafectinG2和DOPE在DDME中混合，使用前旋转振荡30秒。
在加到洗过的细胞之前将溶液A和B合并。
有测试试剂和DNA存在的无血清培养阶段为6小时，然后加入1ml DME+10％FCS。培养至24小时时培养基换为2ml新鲜DME+10％FCS直到48小时收获为止。
结果：
开始转染步骤48小时后分析Cos1细胞的组织培养物培养基样品(上清)的CAT活性。VerafectinA3和VerafectinG2转染Cos1细胞的水平相应地约是使用 Lipofectamine的60％和30％。在一个VerafectinG2样品中加入等摩尔的未配制的DOPE(2mM于DMSO/H2O中)与只用VerafectinG2相比转染效率大约增加一倍，为使用 Lipofectamine的60％并等于VerafectinA3。获得的CAT水平如图5所示。
C.相对细胞毒性
在实验过程中使用染料“Alamar蓝”(Alamar，Sacramento CA)比较了不同试剂引起的细胞毒性的相对水平。本发明的几种化合物一般显示明显地比其他试剂低的细胞毒性。
例如图6a和b
在接下来的实验中还使用染料MTS，记为Cell titre 96 Aqueous(Promega)，分析了细胞毒性的相对水平。
D.不同的先导“转染”化合物的相对效率
使用每种转染化合物的系列浓度用0.5μg的pSVLCAT或2μg的pPGKlacZ质粒转染了细胞株Cos1或CHO。使用了化合物的最佳浓度，即在48小时CAT达到最高水平或在24小时1ac z(β-半乳糖苷酶)染色细胞达到最大百分率的浓度，为表1的数据作参照。因为没有在单一实验中测试所有的化合物，所以没有使用显示转染的绝对值。更确切地说，符号用来指示与在所有实验中作为对照的 Lipofectamine(BRL)相关的转染效率。因此表1显示介导至少一种细胞转染的一些化合物的相对转染效率。
表1.由报告基因表达评估的测试化合物达到的相对转染效率
化合物                细胞类型        转染(CAT)      转染(βGal)
Lipofectamine         Cos1            +++++          细胞的8-10％
                      CHO             +++++          细胞的8-10％
Transfectam           Cos1            ++++           nd
                      CHO             ++++           nd
Lipofectin            Cos1            +++(+)         nd
K3                    Cos1            -              nd
K3ATP0                Cos1            -              nd
K3ATP1                Cos1            +              nd
                      CHO             +              nd
K3ATP2                Cos1            +/-            nd
                      CHO             +/-            nd
K3ATP3                Cos1            +++(+)         nd
                      CHO             +++            nd
K3GTP0                Cos1            -              nd
K3GTP1                Cos1            +              nd
                      CHO             +              nd
K3GTP2                Cos1            ++             nd
                      CHO             +++            ＜1％
K3GTP3                Cos1            +/-            nd
                      CHO             +              nd
K4ATP2                Cos1            +              nd
K4ATP3                Cos1            +(+)           ＜1％
实验按上面的部分B的实验1的描述进行，有实验3描述的变动。显示的结果来自转染试剂的最佳水平。所有显示的结果都出自本发明作者；没有包括与商品制剂相伴的公司文献。
其它不同的合成并测试的化合物描述如下。
结论
上表中显示的结果指示所有具有K1-4，A或G连接物和软脂酸酯1-3的被测试化合物都能在所测试细胞类型中有一定水平的转染。缺失一个赖氨酸或一个软脂酸酯的化合物不能支持转染，这表明吸引DNA的部分(K)和假定的穿透细胞部分(软脂酸)都是必需的。不同的连接物对转染水平有影响但都能够支持转染。
先导化合物的变动改变转染效率
在第3页描述的通式的化合物被阐述是由所述的基本结构块：“x，y，R1-R4”组成。将这些组成成分进行系统变动以评估在一个标准分析系统中标准细胞株转染所需的最佳结构块。结果将通过使用实验例子提供，并以标准条件下报告基因表达的总体水平(CAT或β-半乳糖苷酶表达)或以转染细胞的％(β-半乳糖苷酶-蓝色细胞)来显示。还将描述细胞毒性的代表水平。
“x”肽
上面描述的先导化合物“VerafectinA3”携带3个赖氨酸残基(K3)使此分子带4+电荷。测试了携带K0到K5并相应地带电0+到6+的不同化合物。
目的：评估有效转染的最佳K残基数目。
方法：在分离的实验中，比较在下列之间进行：
a.K0ATP3，K3ATP3，K5ATP3和
  K2ATP2，K5ATP2(CHO细胞)
b.K1ATP2，K2ATP2(Cos1细胞)
c.K3ATP3，K4ATP3，K5ATP3(CHO细胞)
所有测试的脂肽试剂首先溶于75％DMSO至浓度为10mM，然后用水稀释配制成4℃贮存的2mM贮液。
将2μl到15μl体积的2mM贮存脂肽在500μl DDME中稀释。将1μg的质粒pSVLCAT在另一500μl的DDME中稀释。室温下将溶液合并10-20分钟，然后加到铺满CHO细胞(2×105day-1)或Cos1细胞(2×105day-1)的60mm皿中的500μl DDME中，所述的细胞用DDME洗掉血清。
在37℃和5％CO2的标准条件下将细胞温育6小时。在细胞上加入1.5ml的DME/Hams+10％FCS(CHO)或DME+10％FCS(Cos1)培养基过夜培养。用新鲜的DME/Hams+10％FCS或DME+10％FCS换培养基继续培养24小时直到收获。制备细胞裂解物按上面的描述分析CAT活性。对Cos1细胞来说，用培养上清分析CAT活性。
结果：
a：在三软脂酸酯化合物中K3ATP3产生了良好的转染(在37℃，1μl C14乙酰辅酶A(全部可能的计数40-50,000cpm)时，20分钟分析时间后25μl裂解物的平均计数为6237cpm)。K5化合物在其最佳水平时计数显著降低(平均1785cpm)。在此分析系统中K0化合物测不出转染，但是，在CHO细胞中用β-gal分析系统(下面有述)观察到了低水平的转染。
对于双软脂酸酯化合物，K2的存在明显有利于转染，平均计数为5418cpm，而K5化合物的平均计数为132cpm。转染皿的细胞的存活率示于图7b。在显示转染的最高水平的培养皿中毒性最高(OD最低)。
参见图7a和b
b：含单K确实能产生明显的转染，平均计数为12670cpm(25μl裂解物，135分钟温育37℃，2μl C14乙酰辅酶A(全部可能的计数90-100,000cpm))。第二个赖氨酸残基的存在引起近5倍的转染水平增长(平均62,215cpm)，此最佳结果发生在同样水平的化合物上。
图8
c：20μl裂解物温育2小时后，K4ATP3和K5ATP3化合物与K3ATP3相比都导致转染的明显降低，测定的CAT活性的平均水平相应地分别为1071，6363和13467cpm。
图9
结论
从显示的数据看，Kn＝1-5ATP2/3上含0到5个赖氨酸之间的最佳活性的顺序可以表示如下：
K3≥K2＞K5＞K4＞K1。
显示了实验b的细胞存活的代表性图形，(参见图7b)。这指示细胞存活和转染之间呈负相关。这是一个普遍发现。
“y”连接物
上面描述的先导化合物携带3个赖氨酸残基(K3)并在“y”位置上有一个丙氨酸(A)连接物。测试了携带丙氨酸(A)，亮氨酸(L)，苯丙氨酸(F)，赖氨酸(K)或甘氨酸(G)的化合物变种。
目的：评估有利于有效转染的最佳连接物残基。
方法：在分离的实验中，比较在下列之间进行：
a.K2   K/F/L   TP2   (Cos1)
b.K2   A/L     TP2   (Cos1)
c.K3   A/L/G   TL3   (Cos1)
为了pSVLCAT的转染和接下来的CAT酶分析，按上面的描述实施实验“a”和“b”。
对实验“c”来说，转染了在小鼠PGK启动子控制下编码β-半乳糖苷酶的质粒pPGKlaczNLS(G.Hannan惠赠)或利用SV40早期启动子的pSVGAL质粒(Sleigh，M.J.andLockett，T.J.(1985).EMBO J.4：3831-3837))。此实验和分析是根据Felgner et al J.Biol.Chem.269(4)2550-2561 1994提供的方法的修正。此实验方案可以在一个微量滴定板上同时测定DNA和测试试剂的72个不同组合和浓度。选择显示基因产物最大水平的孔作为每种试剂的最佳结果。
用alamar蓝测定细胞毒性，显示了实验a的样图。
结果
a：在比较一个双赖氨酸，双软脂酸酯化合物中连接物K，F和L的实验中，L稍稍优于F，但实质上比K化合物更为有效。参见图10a。L和F化合物的毒性一定程度上高于K化合物，这表明较高的CAT水平不只因为较高细胞存活水平。
图10b。
b：在比较用于肽比较实验的A连接物和在实验“a”中显示较高基因表达水平的L连接物时，两个化合物显示具有非常相似的活性。
图11。
c：相对于G连接物以三赖氨酸，三月桂酸(L3)为背景测试了两个先导连接物A和L。这种情况下，A连接物化合物的转染效率最高，其它化合物显示的相对转染水平为：L 57％，G 12％和Lipofectamine 39％。
图12。
结论
从提供的数据的比较分析，不同连接物的效率顺序可排列为：
A≥L＞F＞K＞＞G。
“R1-R4”脂酰衍生物
I.tris连接物上的脂酰衍生物的数目，1到3
tris连接物为在肽和连接物上加一个，两个或三个脂酰衍生物提供方便。一般来说，所有这些衍生物相互之间是相同的。使用上面描述的标准转染和分析方案，比较了携带所有相同的结构块但又携带一个，两个或三个脂酰衍生物的化合物。
目的.比较携带一个，两个或三个脂酰衍生物的肽脂酰衍生物化合物转染哺乳动物细胞的能力。
方法.
按上面的描述测试化合物转染在质粒上携带的CAT或β-gal基因的能力，并分析。
实验：
a.K2 AT    P1/P2/P3(软脂酸酯，1，2或3)    (Cos1)
b.K2 FT     P1/P2/P3                     (Cos1)
c.K2 LT     P1/P2/P3                     (Cos1)
d.K2 KT     P2/P3                        (Cos1)
e.K3 AT     P2/P3                        (CHO)
f.K3 AT     P1/P3                        (Cos1)
  K3 AT     M1/M2/M3(肉豆蔻酸酯，1，2或3)(Cos1)
  K3 AT     L1/L2/L3(月桂酸酯，1，2或3)  (Cos1)
g.K4 AT     P1/P2/P3                     (Cos1)
结果
a：在实验“a”中测试的化合物的比较显示双和三软脂酸酯分子都产生高水平转染，而单软脂酸酯分子的效率非常低。
图13a。
在其它实验中，K3单软脂酸酯化合物显示的活性是三软脂酸酯K3分子的30％(没有示出)。
图13b。
b：带苯丙氨酸连接物的单，双和三软脂酸酯化合物的相对转染能力与带丙氨酸连接物(a)的化合物相似。
图14a和b。
c：带亮氨酸连接物的单，双和三软脂酸酯化合物的相对转染能力与带丙氨酸连接物(a)的化合物相似。
图15a和b。
d：在赖氨酸连接物的情况下，双软脂酸酯比三软脂酸酯分子显示明显的低活性。如上面例子所看到的，三软脂酸酯的增加的转染活性与细胞毒性的增加是相伴生的。
图16a和b。
e：在此比较实验中，三软脂酸酯分子(平均8325cpm)比双软脂酸酯(平均984cpm)更引人注目地有效。随着增加的转染，细胞毒性的水平一定程度上更高了。
图17a和b。
f：在此比较实验中，在3个不同长度的脂酰衍生物(软脂酸酯，肉豆蔻酸酯和月桂酸酯)的背景下比较了携带不同数目的脂酰基团(n＝1-3)的化合物的转染效率。结果显示有3个脂酰基团的化合物的转染比有2个基团或一个基团的化合物始终更有效。3个脂酰基团存在下的毒性通常稍高但总是低于lipofectamine的毒性。参见表2。
表2.
测试试剂        比率            单位β-gal        MTS OD490-655
                [脂类]/[DNA]
K3ATP1          (5.55)          9.32×10-6        1.34
K3ATP3          (0.69)          2.73×10-4        1.244
K3ATM1*        (0.69)          5.85×10-6        nd
K3ATM2          (0.35)          3.46×10-5        1.56
K3ATM3          (1.39)          2.86×10-4        1.22
K3ATL1*        (0.35)          1.09×10-5        nd
K3ATL2          (0.69)          1.06×10-5        1.544
K3ATL3          (1.39)          4.95×10-4        1.363
Lfe             (1.39)          4.65×10-4        0.924
无                             -5.62×10-6        1.482
每个显示的结果是微量滴定板的72个不同情况的最高读数。[脂类]/[DNA]的比率显示的是得到的最大值。显示的实验是按上面的描述在Cos1细胞中实施的。MTS OD是用不同的试剂处理的细胞的相对存活的度量，较高的值指示较高的细胞存活。*这些点是从一个分离实验中获得的并且绝对数字之间的一些微小变动在实验之间是意料之中的。此实验中的存活是用染料alamar蓝测量的，因此不是直接可比的。
g.K4化合物
在四赖氨酸丙氨酸(K4ATP1/2/3)的背景下在一个到三个软脂酸酯之间进行了比较。如前面实验所看到的，三软脂酸酯比双或单软脂酸酯更为有效。当使用化合物的任一种时活性都是可测量的。甚至在需要高水平的这些试剂以进行最佳转染时细胞毒性仍是低的。
图18a和b。
结论
用“K3”化合物获得的实验结果与用“K4”化合物的结果相似。即，在它们转染细胞的能力上三个脂酰基团优于两个或一个基团。
R1-R4部分的结论
如上面的例子所示，在转染细胞的能力上带三个脂酰衍生物的化合物一般比带一个或两个脂酰衍生物的化合物更高。在转染的最佳点，这些化合物对细胞的毒性一般比商品制剂“Lipofectamine”明显地低。虽然此部分的多数数据是来自在Cos1细胞所作的实验，但是在CHO细胞上获得的结果反映了这些结果。不同化合物的最佳浓度在细胞株之间有变动，就象基因产物的绝对水平那样，但是[脂类]/[DNA]之间的最佳比率通常是不依赖于细胞的，这些化合物可转染性的相对水平是相似的。
比较提供的数据，可以得出未配制未混合的化合物的脂酰基团的不同数目(n＝1-3)的效率顺序为：
3＞2＞1。
“R1-R4”脂酰衍生物
II.碳链的长度
目的：测定对于C16(软脂酸酯)的不同长度的脂酰衍生物是否对转染哺乳动物细胞有更高的能力。
方法：生成了三赖氨酸丙氨酸tris(K3AT)的各种化合物，这些化合物携带一个到三个相同的脂酰衍生物，脂酰衍生物的长度变化如下：
C16  软脂酸酯  (P)
C14  肉豆蔻酸酯 (M)
C12  月桂酸酯   (L)
C10  癸酸酯     (C)
用上述的标准条件在标准细胞株上测试了这些化合物的转染能力和细胞毒性。
结果
a.在Cos1和CHO细胞中比较P，M，L和C衍生物之间的差别。
此表显示携带月桂酸酯和肉豆蔻酸酯的化合物一般能够比最初使用的软脂酸酯衍生物更有效地转染细胞。在这些化合物中癸酸酯是活性最低的衍生物。
表3：
    试剂     β-gal(Cos1)     存活(Cos1)     β-gal(CHO)     存活(CHO)
    K3ATL1(.35)(2.77)K3ATM1(.69)(.69)K3ATP1(5.55)K3ATL2(.69)K3ATM2(.3 5)K3ATC3(2.77)K3ATL3(.69)(.69)K3ATP3(1.39)#K3ATL3(1.39)#K3ATM3(1.39)#K3ATP3(.69)Lfe(1.39)无Lfe(1.39)     1.09×10-55.85×10-69.32×10-61.06×10-53.46×10-59.08×10-63.02×10-43.52×10-54.95×10-42.86×10-42.73×10-41.71×10-43.10×10-64.65×10-4     0.1040.1021.34*1.55*1.56*0.1040.0950.0771.36*1.22*1.24*0.0820.110.924*     2.99×10-65.18×10-65.27×10-67.89×10-43.97×10-6     0.0720.070.0520.0270.059
说明：
每个显示的结果是微量滴定板的72个不同情况的最高读数。取得最大值的[脂类]/[DNA]的比率以在括号中的两个如下顺序的不同的细胞株显示；(Cos1)(CHO)。显示的实验是按上面的描述在Cos1细胞中实施的。存活是用染料alamar蓝测量的。#表示在分离实验中测试的化合物。*在此实验中的存活是用MTS测定的。OD是用不同的试剂处理的细胞的相对存活的度量，并如alamar蓝那样，较高的值指示较高的细胞存活。
b.在Hela细胞上测试C10到C16的R1-R4
目的：测定在Cos1和CHO细胞中最有效的脂酰基团是否在Hela细胞中也是最有效的。
方法：将Hela细胞以2×104/孔的密度植入DME+10％FCS培养基中取代Cos1或CHO细胞，并如上述用pPGKlaczNLS转染。
48小时时，用alamar蓝测定毒性并对细胞进行β-gal分析。
结果：
β-gal分析结果指示，就象在Cos1和CHO细胞中那样，当碳链长度从C16降低至C12时转染能力提高。当使用C10分子时，转染能力严重降低，指示在此实验系列中C12显示最高转染效率。没有料到的是，细胞存活的峰值水平也发生在C12化合物(K3ATL3)上。
图19a和b。
结论
脂酰衍生物长度的变化对化合物转染几种细胞类型的能力有非常大的影响。在所有被测试的细胞类型中转染的顺序保持不变。肉豆蔻酸酯和月桂酸酯都比原型软脂酸酯的转染水平高，月桂酸酯在所有测试中是最优的。
“y”连接物-非标准氨基酸
已经使用了一系列的氨基酸作为连接物基团。如上面所阐明的那样，这些氨基酸包括：亮氨酸，甘氨酸，丙氨酸，苯丙氨酸，α-BOC(ε-自由)赖氨酸。另外，还测试了诸如氨基丁酸，氨基己酸和氨基辛酸的非标准氨基酸(相应地提供3，5和7个碳-碳单键的连接物延伸长度)。
实验1
目的：通过在“y”位置使用不同长度的非标准氨基酸连接物测定带有较长长度的Tris和带电肽“x”之间的间隔基的化合物的转染性质。
方法：使用非标准氨基酸氨基丁酸(C3)，氨基己酸(C5)和氨基辛酸(C7)作为连接物基团，三赖氨酸用作核酸结合结构域且月桂酸用作三个脂酰基团合成了肽/脂酰缀合物。与原型分子相比，在这些新的缀合物中，DNA结合点和tris/脂酰部分之间相应地被额外的3，5和7个碳键长度分开。然后以上面描述的标准的方式测试这些化合物转染细胞的相对能力。
结果：用上面描述的标准β-gal报告基因系统比较K3“y”TL3化合物，其中y＝C3，C5，C7，A，L，G，相互之间的和与商品制剂Lipofectamine之间的转染效率。
除了K3GTL3之外，发现所有化合物的转染效率都比Lipofectamine高。引人注目的是，C3，C5，和尤其是C7化合物比使用标准的单个氨基酸连接物的化合物显示更高的效率。
图20a。
这些试剂的细胞毒性在图20b中显示
注意转染水平的增强并不与细胞毒性的增加相伴。
实验2
被转染的细胞的比例
目的：测定是否C3-C7化合物展示的转染的增加反映被转染的细胞比例的增加。
方法：使用这些缀合物用pPGKlacZNLS质粒转染CHO和Cos1细胞以估计被转染的细胞的比例。使用的转染条件是根据上面描述的CAT实验，细胞生长在35mm培养皿中以用于转染。在转染的前一天以每皿3.4×105(Cos1)或以每皿6.8×104(CHO)的密度植入细胞。转染后24小时时分析存活率后，将细胞用PBS洗涤2次，然后在4℃用含0.2％戊二醛的0.1M磷酸缓冲液，pH7.3固定5分钟。将细胞用冷PBS洗涤2次。每个皿中加入2ml新鲜染色溶液(10ml 0.1M磷酸缓冲液，pH7.3；1.0ml溶于2.5ml水的105mg亚铁氰化钾和溶于2.5ml水的82mg高铁氰化钾的1∶1混合物；0.2ml溶于二甲基甲酰胺的2％X-gal；11.2μl 1M MgSO4)并将培养皿在37℃温育直到显色为止。在光学显微镜下检测某随机区域的细胞并测定蓝色细胞(β-GAL表达)的比例。
结果：通过蓝染细胞的数量显示的被转染的细胞比例增加反映了用测试试剂观察到的转染的增加。
图21a显示的是用CHO细胞获得的结果，而图21b显示的是用Cos1细胞获得的结果。X轴上的Lfe指示lipofectamine；vf为原型肽/脂酰缀合物K3ATP3；A为K3ATL3而C3，C5，C7分别代表氨基丁酸，氨基己酸和氨基辛酸连接的缀合物。
图21a和b
结论
增加肽/脂酰缀合物的连接部分的长度明显地提高了它们的转染特性，此结果在报告基因表达的总体水平和被转染细胞的比例上都有反映。特别值得注意的是使用这些试剂取得的转染峰值水平是在毒性相对低的水平时。这些试剂不符合早期的观察，即转染水平的增加直接与增加的细胞毒性水平相关联。
携带提高转染的较长连接物的缀合物的这种增强的能力似乎不依赖于细胞类型。
图22a和b显示的数据指示，对人前列腺癌上皮细胞株PC3(图22a)和Jurkat T细胞株(图22b)来说，氨基辛酸连接的缀合物，K3C7TL3，也是一个比lipofectamine更为有效的转染试剂。
图22a和b
测试的细胞类型
如上面所描述的，所述的通式的缀合物已经被用来成功地转染几种细胞类型。更为完整的清单提供如下：
被转染的细胞
    细胞株     细胞描述     被转染的质粒
    Cos1CHOHelaPC3JurkatCSL503     非洲绿猴成纤维细胞中国仓鼠卵巢细胞人癌细胞前列腺癌上皮细胞人T淋巴细胞绵羊上皮细胞     pSVLCATpGKlaczNLSpSVGALpSVLCATpGKlaczNLSpSVGALpGKlaczNLSpGKlaczNLSpSVGALpGKlaczNLSpSVGALpGKlaczNLSpSVGAL
寡聚核苷酸转染
目的：测定能够将在完整质粒上的报告基因转染到细胞的化合物是否在寡聚核苷酸的转染中也是有效的。
方法：将一个18-聚体5’-荧光素标记的硫代磷酸酯寡聚核苷酸转染到CHO细胞。比较了K3C7ATL3，K3ATL3和无试剂转染寡聚核苷酸到细胞内的能力。将寡聚核苷酸从121.2μM核苷酸系列稀释到60.6和30.3μM核苷酸。将84μM测试脂肽系列稀释到42和21μM。将这些稀释物在3×3基质中合并，产生的浓度是上面描述的一半。即，最大稀释的寡聚核苷酸成了60.6μM核苷酸(3.37μM 18-聚体寡聚核苷酸)，脂肽成了42μM。将混合物置室温温育10分钟，然后将总体积100μl放在用DDME洗掉血清的CHO细胞(提前一天以1×104/孔的密度植入)上。在同样的情况下，接受无测试试剂的混合物的孔具有三个不同浓度的寡聚核苷酸。
在37℃和5％CO2的标准条件下温育3小时后，去除混合物并用50μl的DDME代替。在共聚焦显微镜下活体观察细胞。荧光素的水平如此之高以致于BioRad MRC 500共聚焦显微镜上的激光孔被关到了最小。然后以同样的设定收集所有图像用于定量比较。
共聚焦分析后，将100μl EMEM+10％FCS加到孔内，细胞在标准条件下培养过夜。重新检测细胞的荧光。
结果
转染后3小时时间点的转染结果见表4：
表4.
测试试剂[核苷酸]μM ％细胞荧光[测试试剂]μM 表观毒性[测试试剂]μM
42 21 10.5 0 42 21 10.5 0
K3C7TL360.630.315.15 100100100 100100100 100100100 +++++++++ ++++++ --++
K3ATL360.630.315.15 100100100 1001 00100 100100100 +++++++++ +++++ ---
无试剂60.630.315.15 4112 ---
*荧光较弱
#更多的“+”＝更大的细胞死亡或毒性；4+为＞90％细胞死亡；“-”＝没有明显的毒性
结论
每种转染试剂的使用都产生100％的存活细胞吸收高水平的寡聚核苷酸。在实验中描述的转染后3小时时间点时，细胞核被荧光素标记的寡聚核苷酸强烈染色。
除了无试剂实验外，用星号“*”标记的结果比没有标记的荧光稍弱。在本实验使用的检测水平上，无试剂时荧光的水平被限制在每种细胞荧光的变化强度的单一位点上。
在无转染试剂存在的情况下，可能有比表4载明的更大比例的细胞吸收寡聚核苷酸，但是吸收的数量不足以在所使用的检测水平上被检测出来。
用完全培养基(EMEM+10％FCS)培养过夜后，所有样品的荧光水平都减弱，最显著的变化是多数细胞核内荧光的消失，但细胞质依然着色。使用转染试剂的样品中的荧光的水平仍然明显高于没有使用转染试剂的那些样品。
配制脂质体
绝大多数的商品化转染化合物是用中性脂二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)配制成的脂质体。另外，文献中提示有两个脂酰衍生物的化合物比那些有一个或三个脂酰衍生物的化合物更可能形成稳定的脂质体结构，并且商品制剂确实都无一例外地具有两个脂酰衍生物。从上面的显示短链脂酰衍生物，尤其是月桂酸酯，展示增强的转染细胞的能力的结果来看，使用短链的磷脂酰乙醇胺化合物也可能显示出更为有效的转染。因此应该看到以这种方式使用DOPE可以说明而不是限制其在形成有效的转染的脂质体结构上的能力。
目的：测试用DOPE脂配制脂质体的效果。
方法：使用标准的方法(K.Yagi et al.Biochem.Biophys.Res.Comm.196 3.，1993pp1042-1048)将Verafectin A2(K3ATP2)配制成脂质体并吸收H2O至2mM。用DOPE以1∶2，1∶1，和2∶1的摩尔比率配制脂质体。
将这些脂质体与在下面的分离实验中描述的商品化合物进行比较：
a.用上面描述的标准转染方案，和1μg质粒pSVLCAT，以相当于每个样品10μl的Verafectin A2(2mM)的单浓度在CHO细胞上测试这些脂质体并与在相同的细胞类型中测试的未脂质体化的化合物和 Lipofectamine进行比较。转染48后小时分析CAT的产生。
b.还以同样的浓度用编码β-gal表达的质粒pPGKlacz测试了这些脂质体并与Lipofectamine和 DOTAP(Boehringer Mannheim)进行了比较。转染后24小时，将细胞固定并染色以进行β-gal表达分析。
结果：
a.在两个分离实验中使用三种不同的比率的脂质体在CHO细胞中产生的CAT表达是最佳 Lipofectamine诱导表达的62％-156％。使用未配制的VFA2化合物产生的CAT水平只有 Lipofectamine的约5％。只有DOPE，不管是未脂质体化的还是脂质体化的，均没有造成转染。
NB.只有DOPE不形成真正的脂质体，参见下面的电子显微镜部分。
图23a。
b.染色对未染色细胞的初步细胞计数显示最好的脂质体配制品(K3ATP2∶DOPE 1∶2)产生的转染细胞是用Lipofectamine产生的转染细胞的一倍，DOTAP产生的转染细胞约是Lipofectamine的一半。在这些情况下使用Lipofectamine产生的转染的CHO细胞比例为17.5％。
图23b。
没有优化这些Verafectin A2/DOPE配制品的试剂浓度。但是从Lipofectamine和DOTAP而来的数据是来自最优浓度。
初步的数据指示这些配制品的细胞毒性粗略地相当于Lipofectamine和DOTAP(没有示出)。
电子显微术
分析了配制的和未配制的化合物溶液的潜在的膜类似结构。在分离实验中分析了下列样品：
a：配制的化合物K3ATP∶DOPE，DOPE和未配制的化合物K3C7ATL3和Lipofectamine的负染样品。
b：与两个比例的核苷酸(质粒)混合的K3C7ATL3和Lipofectamine的旋转投影样品。
方法：
负染色：
2mM的脂质体样品原液用过滤的蒸馏水稀释10倍，并与过滤的负染试剂(钼酸铵2％，pH 6.5)1∶1混合，喷涂在碳-透明塑胶覆盖的200目的电子显微镜铜/铑网上，在一台Jeol JEM 100CX电子显微镜上以60kV，放大倍数33k到100k之间检测。
旋转金属投影：
用水以脂质体0.69和0.25∶1摩尔DNA核苷酸的比率稀释并在室温混合10分钟，喷涂在碳-透明塑胶覆盖的网上并用铂-钯(60∶40)在角度为7°时蒸发旋转金属-投影，在电子显微镜上以60kV，放大倍数26k到66k之间检测。
结果：
a：为了测定脂质体的成功形成，在透射电子显微镜上分析配制的K3ATP2∶DOPE的负染样品。结果显示这些样品形成了多片层脂质体结构，而在相同的情况下DOPE本身不能形成脂质体结构。
因为配制的脂质体能够产生有效的转染，所以有兴趣检查产生有效转染的纯的未配制的化合物是否具有某些类似的膜结构。因此将这些化合物中的一些进行负染并在透射电子显微镜上分析。感兴趣的是发现这些产生有效转染并具有三个脂酰衍生物的化合物自发形成了大小从10nm到0.2μm不等的膜结合的小泡的“堆”(raft)和“堆积”(stack)。
b：以脂肽：核苷酸的次最佳(0.25)和最佳(0.69)比率将化合物和质粒DNA混合并旋转投影。这些样品的分析显示在转染的最佳比率时绝大多数DNA引人注目地合并进了脂质体的组成中。在化合物不足的比率(0.25∶1)时，大量DNA游离于溶液中。此结果对测试化合物K3C7TL3和Lipofectamine都是正确的，虽然它们在未与DNA复合时的表观很不相同，但当与DNA混合时在电镜下看起来却非常相似。
转染化合物和其它脂类的未配制的混合物
在用寡聚核苷酸转染的细胞的比例(100％发荧光细胞)和表达基因产物的细胞的比例(＜100％蓝色细胞)之间存在矛盾。因为DNA到基因产物必需通过吸收进入细胞核，转录和翻译过程，而寡聚核苷酸只需通过质膜而完成“转染”，所以这不是一个令人惊奇的结果。但是，此结果确实说明成功的转染和基因产物的产生是一个可以从具有不同的跨越不同膜例如质膜和核膜的能力的化合物的联合使用中受益的多步骤程序。
考虑到这些，按下面的描述将一些携带数目和长度均不同的脂酰基团而其它相同的化合物联合使用并在β-gal分析中测试。
如上面使用Verafectin G2(K3GTP2)的实验4中所看到的，通过只加入中性脂DOPE也提高了一些化合物的转染能力。
目的：测定在此应用中描述的具有通式的脂肽化合物的混合物是否比使用纯化合物更有利于获得基因的转染，基因的转染是通过基因产物的显示来分析。
化合物的混合；实验1.
方法：使用化合物K3ATL3获得的最佳水平的转染已经在前面的实验中被测定为需要约5μM K3ATL3。将K3ATL3与K3ATL1，K3ATL2，K3ATM3，K3ATP3和K3ATC3的每种以0∶5，1∶4，2∶3，3∶2，4∶1和5∶0的比率混合，最终脂的总浓度为100μl中有5μM。将K3ATM3与K3ATM1，K3ATM2和K3ATP3以相似的方式混合。将每种脂混合物与一定数量的pSVGAL DNA(0.5μg/孔)合并并按正常的程序进行转染。
结果：所以孔的表达都很低，如同使用了两倍于最佳水平的DNA，但是在含有K3ATL3和K3ATM3的4∶1的混合物的孔中的表达水平很强，其β-gal表达的水平高于只含K3ATL3或K3ATM3的孔(数据未示出)。
实验2：
通过配制两种脂肽K3ATL3和K3ATM3的4∶1混合物和将其在包含脂肽和DNA浓度的双倍稀释物的标准平板分析中测试来进一步测试此结果。将其与在正常情况下使用纯化合物K3ATL3获得的表达进行比较。
结果：使用脂肽的混合物获得了表达的一个小的但有限的增加。在所测试的脂肽的每个浓度，转染试剂的最佳水平导致使用L3/M3 4∶1混合物比同样浓度的L3更高的转染水平。
图24。
结论
脂肽转染试剂的组合使用可以获得比每种试剂单独使用更高的转染水平。可以预料用这些化合物进一步测试可以产生其它比每种试剂单独使用更高的转染水平的组合。这些结果显示这些分子的混合物可能对它们的单独转染性质具有明显的影响。
体内转染
目的：测定上面描述的结构式的化合物是否可以用于将DNA有效地送递到整个有机体中，并导致所送递基因的表达。
方法：将10μg(在10μl中)的编码绿色荧光蛋白的质粒pGFP-N1(Clontech)稀释到20μl 5％葡萄糖水溶液中，然后与溶于27.9μl 5％葡萄糖水溶液的2.1μl的10mMK3ATL3(10％DMSO)合并。室温温育10分钟后将混合物注射到无毛小鼠的腿部肌肉中。24小时后处死小鼠并将肌肉小块置于干冰上冰冻。制备组织的冰冻切片并在共聚焦显微镜下分析荧光。
结果：在肌肉细胞的细胞质中观察到了中断荧光，并且在运动终板内也看到了很强的荧光。从没有注射的腿切下来的组织中没有观察到荧光。
结论
初步实验显示使用这些化合物可以有效地将基因转移到整个动物体内。
本发明提供了将化合物尤其是DNA送递到真核细胞内的有效方法。此方法比标准的CaPO4转染法更为有效，本发明的一些实施方案实质上优于商品转染制剂。可以相信本发明的方法对诸如以核酸为基础的药物，如核酶，反义核酸等等的其它化合物的送递同样有用。
本领域熟练技术人员完全了解在没有偏离本发明所广泛描述的精神或范围的情况下，如本发明的具体实施方案所显示的那样，可以对本发明进行各种变化和/或修改。因此，本发明的实施方案在所有方面是说明性的而非限制性的。

Claims (26)

1、具有如下结构式的一种缀合物在制备用于将核酸导入细胞的药物中的应用，所述结构式为：
Figure C951952420002C1
其中：
w是一个核酸
x是一个肽或氨基酸
…代表w和x之间的一个共价或非共价结合
y是一个链长相当于1到20个碳原子的连接物或不存在
R4是H或CH2O-R3；R1，R2和R3是相同的或不同的且为氢，甲基，乙基，羟基或由具有3到24个碳原子碳链长度的饱和或不饱和脂肪酸衍生而来的脂酰基团，条件是至少R1，R2和R3中的一个是由脂肪酸衍生而来的脂酰基团。
2、权利要求1中所述的应用，其中所述y是存在的。
3、权利要求1或权利要求2中所述的应用，其中所述核酸是DNA，RNA或者修饰的寡聚核苷酸或上述的结合。
4、权利要求1所述的应用，其中R1，R2和R3是相同的。
5、权利要求1所述的应用，其中R1，R2和/或R3是选自由软脂酸酯，肉豆蔻酸酯，月桂酸酯，癸酸酯，油酸酯和胆固醇组成的一组的脂肪酸的脂酰衍生物。
6、权利要求5中所述的应用，其中R1，R2和/或R3是肉豆蔻酸酯或月桂酸酯的脂酰衍生物。
7、权利要求1所述的应用，其中所述细胞是动物细胞。
8、权利要求1所述的应用，其中所述细胞是植物细胞。
9、权利要求1所述的应用，其中所述缀合物是以脂质体或与另一种脂类混合的形式存在。
10、权利要求1所述的应用，其中所述缀合物含有一个链长相当于3到7个碳原子的连接物基团“y”。
11、权利要求10中所述的应用，其中所述y是氨基丁酸，氨基己酸或氨基辛酸。
12、权利要求1所述的应用，其中所述x携带一个总体正电荷。
13、权利要求12中所述的应用，其中所述x是单赖氨酸，双赖氨酸，三赖氨酸，四赖氨酸或五赖氨酸。
14、权利要求1所述的应用，其中所述w共价结合于x。
15、一种用于将核酸导入细胞内的缀合物，此缀合物具有下面结构式：
Figure C951952420003C1
其中：
w是一个核酸
x是一个肽或氨基酸
…代表w和x之间的一个共价或非共价结合
y是一个链长相当于1到20个碳原子的连接物或不存在
R4是H或CH2O-R3；R1，R2和R3是相同的或不同的且为氢，甲基，乙基，羟基或由具有3到24个碳原子碳链长度的饱和或不饱和脂肪酸衍生而来的脂酰基团，条件是至少R1，R2和R3中的一个是由脂肪酸衍生而来的脂酰基团。
16、权利要求15中所述的缀合物，其中所述y是存在的。
17、权利要求15中所述的缀合物，其中w是DNA，RNA或者修饰的寡聚核苷酸或上述的结合。
18、权利要求15所述的缀合物，其中R1，R2和R3是相同的。
19、权利要求15所述的缀合物，其中R1，R2和/或R3是选自由软脂酸酯，肉豆蔻酸酯，月桂酸酯，癸酸酯，油酸酯和胆固醇组成的一组的脂肪酸的脂酰衍生物。
20、权利要求19中所述的缀合物，其中R1，R2和/或R3是肉豆蔻酸酯或月桂酸酯的脂酰衍生物。
21、权利要求15所述的缀合物，其中所述缀合物是以脂质体或与另一种脂类混合的形式存在。
22、权利要求15所述的缀合物，其中所述缀合物含有一个链长相当于3到7个碳原子的连接物基团“y”。
23、权利要求22中所述的缀合物，其中所述y是氨基丁酸，氨基己酸或氨基辛酸。
24、权利要求15所述的缀合物，其中所述x携带一个总体正电荷。
25、权利要求24中所述的缀合物，其中所述x是单赖氨酸，双赖氨酸，三赖氨酸，四赖氨酸或五赖氨酸。
26、权利要求19所述的缀合物，其中所述w共价结合于x。
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