CN121027526A - 谷氨酰胺及mkrn3蛋白赖氨酸-谷氨酰胺化修饰在中枢性性早熟检测中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于疾病诊断和分子生物学技术领域，谷氨酰胺及MKRN3蛋白赖氨酸‑谷氨酰胺化修饰在中枢性性早熟检测中的应用。具体的，本发明首次发现中枢性性早熟患儿血清Gln水平异常升高与MKRN3蛋白K‑Gln修饰显著相关，将血清中代谢物Gln的含量与血清中MKRN3‑K‑Gln含量建立二元逻辑回归方程，提高了单指标预测模型的诊断效能，经实验证明，建立的诊断模型准确度高，灵敏度好，有潜力成为早期预测CPP的有效工具，且受试者依从性高，因此具有良好的实际应用之价值。

Description

谷氨酰胺及MKRN3蛋白赖氨酸-谷氨酰胺化修饰在中枢性性早 熟检测中的应用

技术领域

本发明属于疾病诊断和分子生物学技术领域，具体涉及谷氨酰胺及MKRN3蛋白赖氨酸-谷氨酰胺化修饰在中枢性性早熟检测中的应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

性早熟根据病因及发病机制可分为中枢性（Central Precocious Puberty, CPP）与外周性两类。CPP作为真性性早熟的主要类型（占比约80%），其核心病理机制在于下丘脑促性腺激素释放激素（GnRH）脉冲分泌的异常提前激活。近年来我国流行病学监测显示，伴随生活方式与膳食结构的显著改变，儿童性早熟发病率呈现持续上升趋势。以第二性征发育为例，青春期启动年龄呈现每十年提前约3个月的代际加速现象。

CPP的临床危害呈多维度特征：（1）生长学损害：骨骼成熟加速导致成年身高受损；（2）社会心理学影响：性征早现引发心理适应障碍；（3）远期代谢风险：与肥胖、胰岛素抵抗及心血管疾病风险正相关。近年遗传学研究揭示，MKRN3（Makorin Ring Finger Protein3）基因失活突变是家族性CPP的重要分子基础。该基因通过泛素化修饰PABPC1及MBD3调控GnRH1 mRNA稳定性。MKRN3突变导致靶蛋白泛素化水平下降，促使GnRH分泌亢进，最终加速性腺轴激活进程。

当前CPP诊断主要依赖促性腺激素释放激素类似物（GnRHa）激发试验，但存在多重局限性：（1）操作繁琐且患者依从性较低；（2）假阴性风险导致漏诊；（3）过度诊疗可能促进性征发育。现有生物标志物（如基础黄体生成素、盆腔超声）敏感性与特异性不足，难以实现早期预警。更值得注意的是，基于代谢-表观遗传调控网络的分子诊断体系尚未建立。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明提供谷氨酰胺及MKRN3蛋白赖氨酸-谷氨酰胺化修饰在中枢性性早熟检测中的应用。具体的，本发明通过试验证明，血清谷氨酰胺（Gln）浓度及MKRN3蛋白赖氨酸-谷氨酰胺化（K-Gln）修饰水平联合可用于中枢性性早熟诊断，具有灵敏度高、特异性好等优点。基于上述研究成果，从而完成本发明。

具体的，本发明涉及以下技术方案：

本发明的第一个方面，提供一种中枢性性早熟检测的生物标志物，所述生物标志物包括谷氨酰胺和MKRN3蛋白赖氨酸-谷氨酰胺化修饰。

本发明的第二个方面，提供检测上述生物标志物表达水平的试剂在制备中枢性性早熟检测产品中的应用。

本发明的第三个方面，提供一种中枢性性早熟检测的系统，所述系统包括：

i）分析模块，所述分析模块包含：用于确定受试者的待测样品中生物标志物的检测试剂，以及；

ii）评估模块，所述评估模块包含：根据i）中确定的所述生物标志物的表达水平对所述受试者的中枢性性早熟患病情况进行评估；

所述ii）的评估模块具体评估流程包括：根据i）中确定的所述生物标志物的表达水平，基于疾病风险评估模型的风险评分进行对受试者的患病情况进行判断；

其中，所述疾病风险评估模型，其计算公式=7.87×Gln(mM)+8.42×MKRN3 K-Gln(ng/mL)-12.30。

以上一个或多个技术方案的有益技术效果：

上述技术方案首次发现 CPP患儿血清Gln水平异常升高与MKRN3蛋白K-Gln修饰显著相关，将血清中代谢物Gln的含量与血清中MKRN3-K-Gln含量建立二元逻辑回归方程，提高了单指标预测模型的诊断效能，经实验证明，建立的诊断模型准确度高，灵敏度好，有潜力成为早期预测CPP的有效工具，且受试者依从性高，因此具有良好的实际应用之价值。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1是本发明实施例中中枢性性早熟（CPP）患者血清中谷氨酰胺（Glutamine,Gln）和MKRN3 K-Gln水平及构建的二元一次逻辑回归方程。A, ELISA检测血清中Gln水平；B, ELISA检测血清中MKRN3 K-Gln水平；C, Medcalc软件计算血清Gln预测CPP的敏感性、特异性、AUC；D, Medcalc软件计算血清MKRN3 K-Gln预测CPP的敏感性、特异性、AUC；E,Medcalc软件计算血清Gln联合MKRN3 K-Gln预测CPP的敏感性、特异性、AUC；F, 汇总C,D,E三条曲线。CON，正常人；CPP，中枢性性早熟。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。下列具体实施方式中如果未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域技术内的生物学的常规方法和条件，这种技术和条件在文献中有完整解释。

结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照销售公司所推荐的条件；实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径购买得到。

术语“生物标志物”，是指“一种可客观检测和评价的特性，可作为正常生物学过程、病理过程或治疗干预药理学反应的指示因子”。例如，核酸标志物(也可以称为基因标志物，例如DNA)，蛋白质标志物，细胞因子标记物，趋化因子标记物，碳水化合物标志物，抗原标志物，抗体标志物等。在本发明中，所述生物标志物为蛋白质标志物。

如本发明所使用的术语“试剂盒”是指优选地单独提供或提供在单个容器内的上述组分的集合。容器还优选地包含有用于实施本发明方法的说明。在本说明书中已经给出了试剂盒的这些组分的实例及其使用方法。优选地，试剂盒包含在即用型制剂中的上述组分。优选地，试剂盒可另外地包括说明书，例如用于调节组分(例如，检测剂的浓度)以及用于解释关于通过本发明方法所提供诊断的任何测定的结果的用户手册。特别地，这样的手册可以包括用于将确定基因产物的量分配至诊断类型的信息。细节见于本说明书的别处。此外，这样的用户手册可以提供关于正确地使用试剂盒组分用于确定相应生物标志物的量的说明。用户手册可以以纸质或电子形式提供(例如，存储在CD或CD ROM上)。本发明还涉及所述试剂盒在根据本发明的任何方法中的用途。

如前所述，目前，临床上缺乏CPP相关的早期预测和预防的手段，只有儿童出现第二性征的发育，才被高度怀疑性早熟，且CPP的诊断主要通过促性腺激素释放激素类似物激发试验进行准确诊断，检查过程比较繁琐、依从性差，常存在假阴性、过度检查和治疗、促进乳房进一步发育等风险。目前临床亟需CPP的早期检测手段。

有鉴于此，本发明使用ELISA试剂盒检测了血清中MKRN3的泛K-Gln修饰水平，初步评估血清中Gln联合MKRN3 K-Gln水平作为CPP生物标志物的可行性，建立二元Logistic回归方程，分析发现：基于ROC曲线下面积为0.886；Y的临界值为0.4651时，诊断CPP的敏感性为95.7%，特异性为76.9%；与目前文献中报道的盆腔彩超结果联合基础促性腺激素水平多指标联合诊断模型对CPP的敏感性（84.9%）与特异性（86.2%）相似，且大大优于单一Gln参数对CPP的诊断价值。提示血清MKRN3 K-Gln联合Gln构建血CPP双指标联合诊断模型，有潜力成为早期预测CPP的有效工具。

本发明的一个典型具体实施方式中，提供一种中枢性性早熟检测的生物标志物，所述生物标志物包括谷氨酰胺和MKRN3蛋白赖氨酸-谷氨酰胺化修饰。

本发明的又一具体实施方式中，提供检测上述生物标志物表达水平的试剂在制备中枢性性早熟检测产品中的应用。

其中，所述中枢性性早熟检测包括但不限于对中枢性性早熟的筛查和诊断；所述诊断可以为对中枢性性早熟的辅助诊断；进一步的，所述诊断为对中枢性性早熟的早期（辅助）诊断。

所述试剂可以为现有已知任意用于谷氨酰胺和MKRN3蛋白赖氨酸-谷氨酰胺化修饰的试剂，在本发明的一个具体实施方式中，可以为ELISA检测试剂，从而对谷氨酰胺和MKRN3蛋白谷氨酰胺化水平进行检测。所述谷氨酰胺和MKRN3蛋白赖氨酸-谷氨酰胺化来自于受试者的血液，进一步为血清。

所述产品可以为检测试剂盒、检测装置或设备，在此不做具体限定。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种中枢性性早熟检测的系统，所述系统包括：

i）分析模块，所述分析模块包含：用于确定受试者的待测样品中生物标志物的检测试剂，以及；

ii）评估模块，所述评估模块包含：根据i）中确定的所述生物标志物的表达水平对所述受试者的中枢性性早熟患病情况进行评估。

其中，所述分析模块中，所述待测样品为血液，进一步为血清。

所述生物标志物选自谷氨酰胺和MKRN3蛋白赖氨酸-谷氨酰胺化修饰。

所述ii）的评估模块具体评估流程包括：根据i）中确定的所述生物标志物的表达水平，基于疾病风险评估模型的风险评分对受试者的患病情况进行判断；

其中，所述疾病风险评估模型，其计算公式=7.87×Gln(mM)+8.42×MKRN3 K-Gln(ng/mL)-12.30。

本发明的又一具体实施方式中，计算得截断值为0.4651，则受试者风险评分大于等于0.4651时，判定受试者患有中枢性性早熟；受试者风险评分小于0.4651时，判定受试者为非中枢性性早熟。

以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例

研究方法：

按照中枢性性早熟诊断与治疗专家共识（2022），收集了36例CPP女童和20例正常女童的血液样本，其中24例患者和13例正常女童作为训练集，10例患者和7例正常患儿作为验证集。使用核磁技术检测了所收集血清样本中的代谢物水平。用酶联免疫吸附测定试剂盒（Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay; ELISA）高通量痕量检测血清中MKRN3 K-Gln修饰水平。制备人MKRN3 K-Gln蛋白ELISA检测试剂盒，采用双抗体夹心ELISA法。

主要实验步骤如下：

1）制备酶标板：将制备好的抗体用PBS稀释至工作浓度，立即100μL/孔加入96孔微孔板（Immuno透明标准板），密封室温下孵育过夜；每孔填充清洗缓冲液（400μl）进行洗涤，共洗涤三次，最后一次洗涤去除干净洗涤缓冲液；向每孔中加入300μl试剂稀释剂（BSA配置）封板，室温下孵育1小时；洗涤三次后去除缓冲液，待用；

2）加样，分别设零孔、标准孔、待测样品孔，100μl/孔，酶标板覆膜，37℃反应90min；洗涤三次后甩干；

3）加入检测抗体：加入酶标抗体工作液100μl/孔，37℃、1h；洗涤三次后甩干；

4）加入二抗：加入底物工作液二抗100ul/孔，37℃暗处反应30分钟；加入100ul/孔终止液，混匀；

5）酶标仪检测：30分钟内用酶标仪在450nm处测吸光值；使用ElisaCalc软件取四参数多项式作图，画出标准曲线。根据样品OD值计算出蛋白量。前期利用MKRN3泛K-GlnElisa试剂盒（上海西唐生物，产品货号：FP12238）检测了收集的血清样本。

根据变量构建二元一次逻辑回归方程。初步评估血清中Gln联合MKRN3 K-Gln水平作为CPP生物标志物的可行性，建立二元Logistic回归方程：Y=7.87×Gln(mM)+8.42×MKRN3 K-Gln(ng/mL)-12.30，分析发现：基于ROC曲线下面积为0.886；Y的临界值为0.4651时（即截断值，Y≧0.4651患病、Y<0.4651不患病），诊断CPP的敏感性为95.7%，特异性为76.9%；使用验证集进行验证，其敏感性为91.7%，特异性为85.7%。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种中枢性性早熟检测的生物标志物，其特征在于，所述生物标志物包括谷氨酰胺和MKRN3蛋白赖氨酸-谷氨酰胺化修饰。

2.检测权利要求1所述生物标志物表达水平的试剂在制备中枢性性早熟检测产品中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述中枢性性早熟检测包括对中枢性性早熟的筛查和诊断；所述诊断为对中枢性性早熟的辅助诊断；进一步的，所述诊断为对中枢性性早熟的早期（辅助）诊断。

4.如权利要求2所述应用，其特征在于，所述试剂为ELISA检测试剂。

5.如权利要求2所述应用，其特征在于，所述谷氨酰胺和MKRN3蛋白赖氨酸-谷氨酰胺化来自于受试者的血液，进一步为血清。

6.如权利要求5所述应用，其特征在于，所述产品为检测试剂盒、检测装置或设备。

7.一种中枢性性早熟检测的系统，其特征在于，所述系统包括：

i）分析模块，所述分析模块包含：用于确定受试者的待测样品中生物标志物的检测试剂，以及；

ii）评估模块，所述评估模块包含：根据i）中确定的所述生物标志物的表达水平对所述受试者的中枢性性早熟患病情况进行评估；

所述生物标志物选自谷氨酰胺和MKRN3蛋白赖氨酸-谷氨酰胺化修饰。

8.如权利要求7所述的系统，其特征在于，所述分析模块中，所述待测样品为血液，进一步为血清。

9.如权利要求7所述的系统，其特征在于，所述评估模块具体评估流程包括：根据i）中确定的所述生物标志物的表达水平，基于疾病风险评估模型的风险评分对受试者的患病情况进行判断；

其中，所述疾病风险评估模型，其计算公式=7.87×Gln(mM)+8.42×MKRN3 K-Gln(ng/mL)-12.30。

10.如权利要求9所述的系统，其特征在于，受试者风险评分大于等于0.4651时，判定受试者患有中枢性性早熟；受试者风险评分小于0.4651时，判定受试者为非中枢性性早熟。