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CN121002183A - 用于基因治疗的组合物和方法 - Google Patents

用于基因治疗的组合物和方法

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Publication number
CN121002183A
CN121002183A CN202480025896.0A CN202480025896A CN121002183A CN 121002183 A CN121002183 A CN 121002183A CN 202480025896 A CN202480025896 A CN 202480025896A CN 121002183 A CN121002183 A CN 121002183A
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CN
China
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seq
nucleotide sequence
promoter
sequence encoding
certain embodiments
Prior art date
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Pending
Application number
CN202480025896.0A
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李少勇
叶国杰
吴振华
王立军
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hangzhou Jiayin Biotechnology Co ltd
Hangzhou Fuyin Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Hangzhou Jiayin Biotechnology Co ltd
Hangzhou Fuyin Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hangzhou Jiayin Biotechnology Co ltd, Hangzhou Fuyin Biotechnology Co ltd filed Critical Hangzhou Jiayin Biotechnology Co ltd
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Abstract

本文提供了多核苷酸，其包含编码生物分子（如人α‑半乳糖苷酶A）的核苷酸序列、编码启动子（如肝细胞特异性启动子或肝细胞‑肌细胞双特异性启动子）的核苷酸序列或编码表达盒（如人α‑半乳糖苷酶A表达盒）的核苷酸序列。本文还提供了启动子、表达盒、载体、宿主细胞、基因递送系统（例如，重组病毒颗粒，如重组腺相关病毒（AAV）颗粒和非病毒基因递送系统）、相关药物组合物，以及使用它们的方法。此类组合物和方法特别适用于基因治疗，尤其适用于溶酶体贮积症，包括法布里病。

Description

用于基因治疗的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2023年4月17日提交的PCT申请号PCT/CN2023/088738的权益和优先权。这些申请的内容出于所有目的通过引用整体并入本文。
技术领域
本文提供了多核苷酸，其包含编码生物分子（如人α-半乳糖苷酶A）的核苷酸序列、编码启动子（如肝细胞特异性启动子或肝细胞-肌细胞双特异性启动子）的核苷酸序列或编码表达盒（如人α-半乳糖苷酶A表达盒）的核苷酸序列。本文还提供了启动子、表达盒、载体、宿主细胞、基因递送系统（例如，重组病毒颗粒，如重组腺相关病毒（AAV）颗粒和非病毒基因递送系统）、相关药物组合物，以及使用它们的方法。此类组合物和方法特别适用于基因治疗，尤其适用于溶酶体贮积症，包括法布里病。
背景技术
基因治疗（包括基于AAV的基因治疗）有潜力成为许多疾病的有希望的治疗手段。
溶酶体贮积症是遗传性代谢障碍，其特征在于在各种器官的细胞中由于溶酶体的功能缺陷而积累异常量的底物。例如，法布里病（FD）是由于GLA基因中的致病性突变而导致的溶酶体酶α-半乳糖苷酶A（α-Gal A）缺乏引起的罕见X连锁代谢障碍。溶酶体内底物的逐渐积累导致细胞功能障碍和多器官损伤。
迄今为止，仍然需要开发用于基因治疗，特别是用于溶酶体贮积症（包括法布里病）的基因治疗的组合物、系统和方法。
发明内容
在一个方面，本文提供了包含编码人α-半乳糖苷酶A的核苷酸序列的多核苷酸，其中所述编码人α-半乳糖苷酶A的核苷酸序列包含SEQ ID NO：1或如SEQ ID NO：1所示。在某些实施方式中，所述编码人α-半乳糖苷酶A的核苷酸序列包含SEQ ID NO：1。在某些实施方式中，所述编码人α-半乳糖苷酶A的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
在一个方面，本文提供了包含编码启动子的核苷酸序列的多核苷酸，其中所述编码启动子的核苷酸序列（i）包含SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：10，或（ii）如SEQID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：10所示。在具体实施方式中，所述启动子是肝细胞特异性启动子。在具体实施方式中，所述启动子是肝细胞-肌细胞双特异性启动子。在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO：3。在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO：4。在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO：10。在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示。
在一个方面，本文提供了一种多核苷酸，其包含编码人α-半乳糖苷酶A的核苷酸序列和编码启动子的核苷酸序列，所述编码启动子的核苷酸序列可操作地连接到所述编码人α-半乳糖苷酶A的核苷酸序列，其中所述编码人α-半乳糖苷酶A的核苷酸序列包含SEQ IDNO：1或如SEQ ID NO：1所示。在某些实施方式中，所述编码人α-半乳糖苷酶A的核苷酸序列包含SEQ ID NO：1。在某些实施方式中，所述编码人α-半乳糖苷酶A的核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示。在具体实施方式中，所述启动子是肝细胞特异性启动子。在具体实施方式中，所述启动子是肝细胞-肌细胞双特异性启动子。在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO：3。在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO：4。在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO：10。在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示。在各种实施方式中，所述多核苷酸还包含编码polyA信号的核苷酸序列。
在一个方面，本文提供了一种多核苷酸，其包含编码生物分子的核苷酸序列和编码启动子的核苷酸序列，所述编码启动子的核苷酸序列可操作地连接到所述编码生物分子的核苷酸序列，其中所述编码启动子的核苷酸序列（i）包含SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：10，或（ii）如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：10所示。在具体实施方式中，所述启动子是肝细胞特异性启动子。在具体实施方式中，所述启动子是肝细胞-肌细胞双特异性启动子。在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO：3。在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO：4。在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列包含SEQID NO：10。在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示。在具体实施方式中，所述生物分子是人α-半乳糖苷酶A。在各种实施方式中，所述多核苷酸还包含编码polyA信号的核苷酸序列。
在一个方面，本文提供了包含编码表达盒的核苷酸序列的多核苷酸，其中所述编码表达盒的核苷酸序列包含SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：18或者如SEQ ID NO：16或SEQ IDNO：18所示。在某些实施方式中，所述编码表达盒的核苷酸序列包含SEQ ID NO：16。在某些实施方式中，所述编码表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示。在某些实施方式中，所述编码表达盒的核苷酸序列包含SEQ ID NO：18。在某些实施方式中，所述编码表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO：18所示。
在一个方面，本文提供了由核苷酸序列编码的启动子，所述核苷酸序列（i）包含SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：10，或者（ii）如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQID NO：10所示。在具体实施方式中，所述启动子是肝细胞特异性启动子。在具体实施方式中，所述启动子是肝细胞-肌细胞双特异性启动子。在某些实施方式中，编码所述启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO：3。在某些实施方式中，编码所述启动子的核苷酸序列如SEQ IDNO：3所示。在某些实施方式中，编码所述启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO：4。在某些实施方式中，编码所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。在某些实施方式中，编码所述启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO：10。在某些实施方式中，编码所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示。
在一个方面，本文提供了一种表达盒，其包含编码人α-半乳糖苷酶A的核苷酸序列和编码启动子的核苷酸序列，所述编码启动子的核苷酸序列可操作地连接到所述编码人α-半乳糖苷酶A的核苷酸序列，其中所述编码人α-半乳糖苷酶A的核苷酸序列包含SEQ ID NO：1或如SEQ ID NO：1所示。在某些实施方式中，所述编码人α-半乳糖苷酶A的核苷酸序列包含SEQ ID NO：1。在某些实施方式中，所述编码人α-半乳糖苷酶A的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。在具体实施方式中，所述启动子是肝细胞特异性启动子。在具体实施方式中，所述启动子是肝细胞-肌细胞双特异性启动子。在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO：3。在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO：4。在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO：10。在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列如SEQID NO：10所示。在各种实施方式中，所述表达盒还包含编码polyA信号的核苷酸序列。
在一个方面，本文提供了一种表达盒，其包含编码生物分子的核苷酸序列和编码启动子的核苷酸序列，所述编码启动子的核苷酸序列可操作地连接到所述编码生物分子的核苷酸序列，其中所述编码启动子的核苷酸序列（i）包含SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQID NO：10，或（ii）如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：10所示。在具体实施方式中，所述启动子是肝细胞特异性启动子。在具体实施方式中，所述启动子是肝细胞-肌细胞双特异性启动子。在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO：3。在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO：4。在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列包含SEQ IDNO：10。在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示。在具体实施方式中，所述生物分子是人α-半乳糖苷酶A。在各种实施方式中，所述表达盒还包含编码polyA信号的核苷酸序列。
在一个方面，本文提供了一种表达盒，其由（i）包含SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：18的核苷酸序列或（ii）如SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：18所示的核苷酸序列编码。在某些实施方式中，编码所述表达盒的核苷酸序列包含SEQ ID NO：16。在某些实施方式中，编码所述表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示。在某些实施方式中，编码所述表达盒的核苷酸序列包含SEQ ID NO：18。在某些实施方式中，编码所述表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO：18所示。
在一个方面，本文提供了包含编码本文所述的表达盒的核苷酸序列的多核苷酸。
在一个方面，本文提供了包含本文所述的多核苷酸、本文所述的启动子或本文所述的表达盒的载体。
在一个方面，本文提供了包含重组病毒基因组的重组病毒颗粒，所述重组病毒基因组包含本文所述的表达盒。
在一个方面，本文提供了重组腺相关病毒（AAV）颗粒，其包含：（a）AAV衣壳；和（b）重组AAV基因组，其包含侧接有AAV末端反向重复序列（ITR）的本文所述的表达盒。在具体实施方式中，所述重组AAV颗粒是重组AAV血清型9（rAAV9）颗粒。在具体实施方式中，所述AAV衣壳包含变体AAV9衣壳蛋白。在某些实施方式中，所述变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：31、38、49、51、53、55、57、59或61的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：30、37、48、50、52、54、56、58或60的氨基酸序列。
在一个方面，本文提供了一种宿主细胞，其包含本文所述的多核苷酸、本文所述的载体、本文所述的重组病毒颗粒或本文所述的重组AAV颗粒。
在一个方面，本文提供了由本文所述的重组病毒颗粒或本文所述的重组AAV颗粒稳定转导的宿主细胞群。
在一个方面，本文提供了一种药物组合物，其包含本文所述的重组病毒颗粒或本文所述的重组AAV颗粒，以及药学上可接受的载体。
在一个方面，本文提供了一种药物组合物，其包含本文所述的宿主细胞群和药学上可接受的载体。
在一个方面，本文提供了一种生产重组病毒颗粒或重组AAV颗粒的方法，包括培养本文所述的宿主细胞。
在一个方面，本文提供了一种在有需要的受试者中治疗疾病或障碍的方法，包括向所述受试者施用本文所述的重组病毒颗粒、本文所述的重组AAV颗粒或本文所述的药物组合物。在某些实施方式中，所述疾病或障碍是溶酶体贮积症。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是法布里病。在具体实施方式中，所述受试者是人。
说明性实施方式
本公开包括以下非限制性说明性实施方式：
1. 一种多核苷酸，其包含编码人α-半乳糖苷酶A的核苷酸序列，其中所述编码人α-半乳糖苷酶A的核苷酸序列包含SEQ ID NO：1或如SEQ ID NO：1所示。
2. 根据实施方式1所述的多核苷酸，其中所述编码人α-半乳糖苷酶A的核苷酸序列包含SEQ ID NO：1。
3. 根据实施方式1所述的多核苷酸，其中所述编码人α-半乳糖苷酶A的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
4. 一种包含编码启动子的核苷酸序列所述的多核苷酸，其中所述编码启动子的核苷酸序列（i）包含SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：10，或者（ii）如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：10所示。
5. 一种多核苷酸，其包含编码人α-半乳糖苷酶A的核苷酸序列和编码启动子的核苷酸序列，所述编码启动子的核苷酸序列可操作地连接到所述编码人α-半乳糖苷酶A的核苷酸序列，其中所述编码人α-半乳糖苷酶A的核苷酸序列包含SEQ ID NO：1或如SEQ ID NO：1所示。
6. 根据实施方式5所述的多核苷酸，其中所述编码人α-半乳糖苷酶A的核苷酸序列包含SEQ ID NO：1。
7. 根据实施方式5所述的多核苷酸，其中所述编码人α-半乳糖苷酶A的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
8. 根据实施方式4-7中任一项所述的多核苷酸，其中所述启动子是肝细胞特异性启动子。
9. 根据实施方式4-8中任一项所述的多核苷酸，其中所述启动子是肝细胞-肌细胞双特异性启动子。
10. 根据实施方式4-9中任一项所述的多核苷酸，其中所述编码启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO：3。
11. 根据实施方式4-8中任一项所述的多核苷酸，其中所述编码启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
12. 根据实施方式4-9中任一项所述的多核苷酸，其中所述编码启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO：4。
13. 根据实施方式4-9中任一项所述的多核苷酸，其中所述编码启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
14. 根据实施方式4-9中任一项所述的多核苷酸，其中所述编码启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO：10。
15. 根据实施方式4-9中任一项所述的多核苷酸，其中所述编码启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示。
16. 一种多核苷酸，其包含编码生物分子的核苷酸序列和编码启动子的核苷酸序列，所述编码启动子的核苷酸序列可操作地连接到所述编码生物分子的核苷酸序列，其中所述编码启动子的核苷酸序列（i）包含SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：10，或（ii）如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：10所示。
17. 根据实施方式16所述的多核苷酸，其中所述启动子是肝细胞特异性启动子。
18. 根据实施方式16或17所述的多核苷酸，其中所述启动子是肝细胞-肌细胞双特异性启动子。
19. 根据实施方式16-18中任一项所述的多核苷酸，其中所述编码启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO：3。
20. 根据实施方式16或17所述的多核苷酸，其中所述编码启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
21. 根据实施方式16-18中任一项所述的多核苷酸，其中所述编码启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO：4。
22. 根据实施方式16-18中任一项所述的多核苷酸，其中所述编码启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
23. 根据实施方式16-18中任一项所述的多核苷酸，其中所述编码启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO：10。
24. 根据实施方式16-18中任一项所述的多核苷酸，其中所述编码启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示。
25. 根据实施方式16-24中任一项所述的多核苷酸，其中所述生物分子是人α-半乳糖苷酶A。
26. 根据实施方式5-25中任一项所述的多核苷酸，其还包含编码polyA信号的核苷酸序列。
27. 一种包含编码表达盒的核苷酸序列的多核苷酸，其中所述编码表达盒的核苷酸序列包含SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：18或者如SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：18所示。
28. 根据实施方式27所述的多核苷酸，其中所述编码表达盒的核苷酸序列包含SEQ ID NO：16。
29. 根据实施方式27所述的多核苷酸，其中所述编码表达盒的核苷酸序列如SEQID NO：16所示。
30. 根据实施方式27所述的多核苷酸，其中所述编码表达盒的核苷酸序列包含SEQ ID NO：18。
31. 根据实施方式27所述的多核苷酸，其中所述编码表达盒的核苷酸序列如SEQID NO：18所示。
32. 一种启动子，其由（i）包含SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：10的核苷酸序列或（ii）如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列编码。
33. 根据实施方式32所述的启动子，其是肝细胞特异性启动子。
34. 根据实施方式32或33所述的启动子，其是肝细胞-肌细胞双特异性启动子。
35. 根据实施方式32-34中任一项所述的启动子，其中编码所述启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO：3。
36. 根据实施方式32或33所述的启动子，其中编码所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
37. 根据实施方式32-34中任一项所述的启动子，其中编码所述启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO：4。
38. 根据实施方式32-34中任一项所述的启动子，其中编码所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
39. 根据实施方式32-34中任一项所述的启动子，其中编码所述启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO：10。
40. 根据实施方式32-34中任一项所述的启动子，其中编码所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示。
41. 一种表达盒，其包含编码人α-半乳糖苷酶A的核苷酸序列和编码启动子的核苷酸序列，所述编码启动子的核苷酸序列可操作地连接到所述编码人α-半乳糖苷酶A的核苷酸序列，其中所述编码人α-半乳糖苷酶A的核苷酸序列包含SEQ ID NO：1或如SEQ ID NO：1所示。
42. 根据实施方式41所述的表达盒，其中所述编码人α-半乳糖苷酶A的核苷酸序列包含SEQ ID NO：1。
43. 根据实施方式41所述的表达盒，其中所述编码人α-半乳糖苷酶A的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
44. 根据实施方式41-43中任一项所述的表达盒，其中所述启动子是肝细胞特异性启动子。
45. 根据实施方式41-44中任一项所述的表达盒，其中所述启动子是肝细胞-肌细胞双特异性启动子。
46. 根据实施方式41-45中任一项所述的表达盒，其中所述编码启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO：3。
47. 根据实施方式41-44中任一项所述的表达盒，其中所述编码启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
48. 根据实施方式41-45中任一项所述的表达盒，其中所述编码启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO：4。
49. 根据实施方式41-45中任一项所述的表达盒，其中所述编码启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
50. 根据实施方式41-45中任一项所述的表达盒，其中所述编码启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO：10。
51. 根据实施方式41-45中任一项所述的表达盒，其中所述编码启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示。
52. 一种表达盒，其包含编码生物分子的核苷酸序列和编码启动子的核苷酸序列，所述编码启动子的核苷酸序列可操作地连接到所述编码生物分子的核苷酸序列，其中所述编码启动子的核苷酸序列（i）包含SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：10，或（ii）如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：10所示。
53. 根据实施方式52所述的表达盒，其中所述启动子是肝细胞特异性启动子。
54. 根据实施方式52或53的表达盒，其中所述启动子是肝细胞-肌细胞双特异性启动子。
55. 根据实施方式52-54中任一项所述的表达盒，其中所述编码启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO：3。
56. 根据实施方式52或53所述的表达盒，其中所述编码启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
57. 根据实施方式52-54中任一项所述的表达盒，其中所述编码启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO：4。
58. 根据实施方式52-54中任一项所述的表达盒，其中所述编码启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
59. 根据实施方式52-54中任一项所述的表达盒，其中所述编码启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO：10。
60. 根据实施方式52-54中任一项所述的表达盒，其中所述编码启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示。
61. 根据实施方式52-60中任一项所述的表达盒，其中所述生物分子是人α-半乳糖苷酶A。
62. 根据实施方式41-61中任一项所述的表达盒，其还包含编码polyA信号的核苷酸序列。
63. 一种表达盒，其由（i）包含SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：18的核苷酸序列或（ii）如SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：18所示的核苷酸序列编码。
64. 根据实施方式63所述的表达盒，其中编码所述表达盒的核苷酸序列包含SEQID NO.16。
65. 根据实施方式63所述的表达盒，其中编码所述表达盒的核苷酸序列如SEQ IDNO.16所示。
66. 根据实施方式63所述的表达盒，其中编码所述表达盒的核苷酸序列包含SEQID NO.18。
67. 根据实施方式63所述的表达盒，其中编码所述表达盒的核苷酸序列如SEQ IDNO.18所示。
68. 一种多核苷酸，其包含编码实施方式41-67中任一项所述的表达盒的核苷酸序列。
69. 一种载体，其包含实施方式1-31和68中任一项所述的多核苷酸、实施方式32-40中任一项所述的启动子或实施方式41-67中任一项所述的表达盒。
70. 一种包含重组病毒基因组的重组病毒颗粒，所述重组病毒基因组包含实施方式41-67中任一项所述的表达盒。
71. 一种重组腺相关病毒（AAV）颗粒，其包含：（a）AAV衣壳；和（b）重组AAV基因组，其包含侧接有AAV末端反向重复序列（ITR）的实施方式41-67中任一项所述的表达盒。
72. 根据实施方式71所述的重组AAV颗粒，其是重组AAV血清型9（rAAV9）颗粒。
73. 根据实施方式71或72所述的重组AAV颗粒，其中所述AAV衣壳包含变体AAV9衣壳蛋白。
74. 根据实施方式73所述的重组AAV颗粒，其中所述变体AAV9衣壳蛋白包含SEQID NO：31、38、49、51、53、55、57、59或61的氨基酸序列。
75. 根据实施方式74所述的重组AAV颗粒，其中所述变体AAV9衣壳蛋白包含SEQID NO：30、37、48、50、52、54、56、58或60的氨基酸序列。
76. 一种宿主细胞，其包含实施方式1-31和68中任一项所述的多核苷酸、实施方式69所述的载体、实施方式70所述的重组病毒颗粒或实施方式71-75中任一项所述的重组AAV颗粒。
77. 一种宿主细胞群，其由实施方式70所述的重组病毒颗粒或实施方式71-75中任一项所述的重组AAV颗粒稳定转导。
78. 一种药物组合物，其包含实施方式70所述的重组病毒颗粒或实施方式71-75中任一项所述的重组AAV颗粒，以及药学上可接受的载体。
79. 一种药物组合物，其包含实施方式77所述的宿主细胞群和药学上可接受的载体。
80. 一种生产重组病毒颗粒或重组AAV颗粒的方法，包括培养实施方式76所述的宿主细胞。
81. 一种在有需要的受试者中治疗疾病或障碍的方法，包括向所述受试者施用实施方式70所述的重组病毒颗粒、实施方式71-75中任一项所述的重组AAV颗粒或者实施方式78或79所述的药物组合物。
82. 根据实施方式81所述的方法，其中所述疾病或障碍是溶酶体贮积症。
83. 根据实施方式81所述的方法，其中所述疾病或障碍是法布里病。
84. 根据实施方式81-83中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
附图说明
图1.人α-半乳糖苷酶A（GLA）密码子优化。图1A：ELISA测定结果。图1B：α-半乳糖苷酶A活性结果。图1C：来自用编码hGLA的质粒转染的HepG2的细胞培养上清液的蛋白质印迹分析。WT：野生型；hGLA：人α-半乳糖苷酶A。
图2. 肝细胞-心肌细胞（HC）双特异性启动子体外测试。RLuc/FLuc比率用于测量五种启动子（HC1-HC5）的启动子强度。RLuc：海肾荧光素酶；FLuc：萤火虫荧光素酶。
图3. 截短型小鼠肌肉肌酸激酶（MCK）启动子体外测试。图3A：RLuc/FLuc比率用于测量三个版本的MCK启动子（MCK-D1~MCK-D3）的启动子强度。图3B和3C：通过体内成像系统（IVIS）评估启动子HC7的活性。在注射后一周（图3B）和三周（图3C）观察到肝脏和骨骼肌中的强发光信号。
图4. HepG2中的人GLA表达盒介导的α-半乳糖苷酶A表达（图4A）和活性（图4B）。图4A：阴性对照、盒1、盒2、盒3和盒4的α-Gal A浓度分别为：2 ng/mL、2993 ng/mL、2225 ng/mL、1919 ng/mL和1684 ng/mL。图4B：阴性对照、盒1、盒2、盒3和盒4的α-Gal A活性分别为：1.66x106nmol/mg/h、1.87x106nmol/mg/h、2.00x106nmol/mg/h和2.73x106nmol/mg/h。
图5. H9c2细胞中的人GLA表达盒介导的α-半乳糖苷酶A表达（图5A）和活性（图5B）。图5A：阴性对照、盒1、盒2、盒3和盒4的α-Gal A浓度分别为：2x10-1ng/mL、306 ng/mL、249 ng/mL、954 ng/mL和1350 ng/mL。图5B：阴性对照、盒1、盒2、盒3和盒4的α-Gal A活性分别为：1.14x104nmol/mg/h、1.45x104nmol/mg/h、1.80x104nmol/mg/h和2.57x104nmol/mg/h。
图6A-6J. 法布里小鼠模型中的盒1介导的活性和功效的表征。图6A：血清α-Gal A活性随时间的变化。图6B：第61天的血清α-Gal A活性（柱顶部的数字从左到右为：11、3、1959、25956、80140和203339）。图6C：肝脏中的hGLA转基因mRNA水平（柱顶部的数字从左到右为：0.3200、2.2752、3.9636、9.6976和0.0001）。图6D：心脏中的hGLA转基因mRNA水平（柱顶部的数字从左到右为：3.3037x10-5、0.0005、0.0005和0.0008）。图6E：肝脏中的载体基因组拷贝（柱顶部的数字从左到右为：0.94、10.88、28.28、79.60和0.02）。图6F：肝脏中的载体基因组拷贝（柱顶部的数字从左到右为：0.03、0.24、0.87和1.64）。图6G：蛋白质印迹结果。图6H：肝脏、心脏和肾脏中的α-Gal A活性。从左到右显示的肝脏数据是：2043（2E11 vg/kg）、48242（2E12 vg/kg）、108653（6E12 vg/kg）、175176（2E13 vg/kg）、12（GLA-KO）和35（野生型）。从左到右显示的心脏数据是：31（2E11 vg/kg）、1186（2E12 vg/kg）、1533（6E12 vg/kg）、12153（2e13 vg/kg）、26（GLA-KO）和10（野生型）。从左到右显示的肾脏数据是：18（2E11vg/kg）、217（2E12 vg/kg）、501（6E12 vg/kg）、1821（2E13 vg/kg）、6（GLA-KO）和21（野生型）。图6I：血清lyso-Gb3水平（柱顶部的数字从左到右为：0.57、147.22、3.67、0.76、0.59和0.55）。图6J：肝脏、心脏和肾脏中的lyso-Gb3水平。
图7A-7E.法布里小鼠模型中的AAV-hGLA介导的活性和功效的表征。图7A：血清α-GAL A活性随时间的变化。图7B：肝脏、心脏和四头肌中的载体基因组拷贝。图7C：肝脏、心脏和四头肌中的hGLA转基因mRNA水平。图7D：蛋白质印迹结果。图7E：肝脏、心脏和肾脏中盒3介导的α-Gal A活性。图7F：将用衣壳AVT908包装的HC7驱动的hGLAco1（盒3）静脉内施用至雄性8周龄Gla-ko小鼠。剂量为2e12 vg/kg。给药后8周，收获肝脏、心脏和肾脏并进行免疫组织化学（IHC）染色。将兔抗人GLA抗体（Sigma-Aldrich，目录号.HPA000237）以1∶1000稀释并用作第一抗体。将Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）（jacksonimmuno，111-035-003）稀释1000倍并用作检测抗体。DAB用作底物。棕色指示人GalA蛋白阳性染色。
图8A-8B.将包装在衣壳AVT917、AVT918或AAV9中的hGLA表达盒3以2E13 vg/kg（N=1/衣壳）的剂量静脉内施用至成年雄性食蟹猴。在施用之前和之后收集血浆。图8A：通过基于荧光的4-MU法测量血浆中的Gal A活性。图8A：使用ELISA测量血浆中表达的人Gal A蛋白。
图9A. NHP中的AAV载体基因组生物分布。将含有hGLA表达盒3的AVT917以2E13vg/kg的剂量静脉内施用至成年雄性食蟹猴。给药后十三周，收集并处理组织以通过ddPCR进行载体基因组拷贝分析。RNA酶P基因用作参考。
图9B. AVT917和HC7启动子在NHP中介导hGLA转基因表达。将含有hGLA表达盒3的AVT917以2E13 vg/kg的剂量静脉内施用至成年雄性食蟹猴。给药后十三周，收集并处理组织以通过RT-qPCR进行转基因mRNA水平分析。GADPH基因用作参考。数据被表示为2-ΔCt。
图9C.在用AVT917-hGLA处理的NHP组织中的Gal A活性。将含有hGLA表达盒3的AVT917以2E13 vg/kg的剂量静脉内施用至成年雄性食蟹猴。给药后十三周，收集并处理组织以通过基于荧光的4-MU法进行Gal A活性分析。
图10.AVT917在法布里小鼠中介导高hGLA表达。向成年（16周龄）雄性法布里小鼠（Gla-KO）以3个剂量静脉内注射溶媒（制剂缓冲液）或AVT919-HC7-hGLA（盒3）（n=10/组）。每两周收集血浆用于α-Gal A活性测量。数据显示为具有SD的平均值。**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001，双因素重复测量方差分析随后Tukey多重比较检验。
图11.AVT917在法布里小鼠的组织中介导hGLA mRNA表达。向成年（16周龄）雄性法布里小鼠（Gla-KO）以3个剂量静脉内注射溶媒（制剂缓冲液）或AVT919-HC7-hGLA（盒3）（n=10/组）。给药后8周，收集主要组织并处理以进行总RNA分离。通过RT-qPCRl定量hGLA特异性mRNA转录本。小鼠GAPDH（MsGAPDH）用作管家基因。数据显示为具有SD的平均值。*p<0.05，****p<0.0001，单因素方差分析随后Tukey多重比较检验。
图12.在用AVT917-HC7-hGLA处理的法布里小鼠中显著减少底物。向成年（16周龄）雄性法布里小鼠（Gla-KO）以3个剂量静脉内注射溶媒（制剂缓冲液）或AVT919-HC7-hGLA（盒3）（n=10/组）。给药后8周，收集并处理主要组织以使用LC-MS/MS进行Lyso-Gb3定量。数据显示为具有SD的平均值。柱上的百分比表示相对Lyso-Gb3水平，并且将溶媒组中的水平设为100%。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001，单因素方差分析随后Tukey多重比较检验；#p<0.0001，未配对t检验。
图13A.AVT917介导的NHP中的hGLA表达。将AVT917-HC7-hGLA以2E12 vg/kg（N=3）和6E12 vg/kg（N=2）的剂量静脉内施用至成年雄性食蟹猴。在施用之前和之后收集血浆。通过基于荧光的4-MU法测量血浆中的α-Gal A活性。
图13B. 将AVT917-HC7-hGLA以2E12 vg/kg（N=3）和6E12 vg/kg（N=2）的剂量静脉内施用至成年雄性食蟹猴。在施用之前和之后收集血浆。通过ELISA测量血浆中表达的人α-Gal A蛋白。
图14. 将含有盒3（SEQ ID：18）的AVT917或AVT919以2E12 vg/kg（N=1/衣壳）的剂量静脉内施用至成年雄性食蟹猴。收集血浆用于通过ELISA测量人α-Gal A蛋白浓度。
具体实施方式
本公开描述了编码人α-半乳糖苷酶A的经密码子优化的核苷酸序列，并且描述了表明这些核苷酸序列特别适用于法布里病的基因治疗的数据。本公开还描述了编码肝细胞特异性或肝细胞-肌细胞双特异性启动子的核苷酸序列，并且描述了表明这些核苷酸序列特别适用于基因治疗、尤其是适用于包括法布里病的溶酶体贮积症的数据。本公开还描述了编码人α-半乳糖苷酶A表达盒的核苷酸序列，并且描述了表明这些核苷酸序列特别适用于法布里病的基因治疗的数据。本公开提供了与这些核苷酸序列相关的多核苷酸、启动子、表达盒、载体、宿主细胞、基因递送系统（例如，重组病毒颗粒，如重组腺相关病毒（AAV）颗粒和非病毒基因递送系统）和药物组合物，以及使用它们的方法。
5.1定义
本文描述或引用的技术和程序包括本领域技术人员通常很好理解和/或通常使用常规方法使用的那些，例如，在Green和Sambrook, Molecular Cloning: A LaboratoryManual, 4thEd., Cold Spring Harbor Laboratory （Cold Spring Harbor, N.Y. 2012）；Current Protocols in Molecular Biology （Ausubel et al. eds., 2003）；Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic （An ed. 2009）；Monoclonal Antibodies:Methods and Protocols（Albitar ed. 2010）；以及Antibody EngineeringVols 1 and 2 （Kontermann and Dübel eds., 2d ed. 2010）中描述的广泛使用的方法。
除非本文另有定义，否则本说明书中使用的技术和科学术语具有本领域普通技术人员通常理解的含义。出于解释本说明书的目的，将适用以下术语描述。
术语“多肽”和“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，并且是指任意长度的氨基酸的聚合物。聚合物可以是直链或支链的，可以包含修饰的氨基酸，并且可以被非氨基酸中断。这些术语还涵盖天然或通过干预修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰。定义中还包括例如含有一种或多种氨基酸类似物的多肽，包括但不限于非天然氨基酸，以及本领域已知的其它修饰。
如本文可互换使用的“多核苷酸”或“核酸”是指任何长度的核苷酸的聚合物，并且包括DNA（包括cDNA）和RNA（包括mRNA）。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基和/或它们的类似物，或可以通过DNA或RNA聚合酶或通过合成反应掺入聚合物中的任何底物。多核苷酸可以是单链的或双链的。多核苷酸可以是直链的或环状的。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸及其类似物。如本文所用，“寡核苷酸”是指长度通常但不一定小于约200个核苷酸的短合成多核苷酸。术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”不是相互排斥的。以上对多核苷酸的描述同样且完全适用于寡核苷酸。除非另有说明，否则本文公开的任何单链多核苷酸序列的左侧端是5’端；双链多核苷酸序列的左侧方向被称为5’方向。新生RNA转录本的5’至3’添加的方向被称为转录方向；DNA链上与位于RNA转录本的5'端的5'的RNA转录本具有相同序列的序列区域被称为“上游序列”；DNA链上位于RNA转录本的3'端的3'的RNA转录本具有相同序列的序列区域被称为“下游序列”。在某些实施方式中，本文所述的多核苷酸可以通过针对特定宿主细胞或递送靶细胞类型的替代或优选密码子使用进行优化。密码子优化可使用本领域已知的任何合适的方法（例如，使用本领域已知的合适软件）进行。
如本文所用，“分离的多核苷酸”或“分离的核酸”是核酸，例如RNA、DNA或混合核酸，其通常基本上与其他基因组DNA序列以及蛋白质或复合物（例如核糖体和聚合酶）分离，其天然伴随天然序列。“分离的”核酸分子是与存在于核酸分子的天然来源中的其他核酸分子分离的核酸分子。此外，“分离的”核酸分子，例如cDNA分子，当通过重组技术生产时可以基本上不含其他细胞材料或培养基，或者当化学合成时基本上不含化学前体或其他化学物质。该术语涵盖已经从其天然存在的环境中去除的核酸序列，并且包括重组或克隆的DNA分离物和化学合成的类似物或通过异源系统生物合成的类似物。基本上纯的分子可以包括分子的分离形式。具体地，编码本文所述多肽的“分离的”核酸分子是与至少一个污染核酸分子鉴定和分离的核酸分子，所述核酸分子在其生产的环境中通常与其相关。
如本文所用，术语“同源性”是指两个多核苷酸或两个多肽部分之间的同一性百分比。当序列在限定长度的分子上表现出至少约50%、至少约75%、至少约80%-85%、至少约90%、至少约95%-98%序列同一性、至少约99%或其间的任何百分比时，两个DNA或两个多肽序列彼此“基本上同源”。如本文所用，基本上同源还指与指定DNA或多肽序列显示完全同一性的序列。
如本文所用，术语“同一性”是指两个多核苷酸或多肽序列的精确核苷酸与核苷酸或氨基酸与氨基酸的对应关系。测定同一性百分比的方法是本领域公知的。例如，同一性百分比可以通过比对序列，计数两个比对序列之间的匹配的精确数量，除以较短序列的长度，并将结果乘以100，从而通过直接比较两个分子之间的序列信息来确定。可以使用现有的计算机程序来辅助分析，例如ALIGN, Dayhoff, M. O. in Atlas of Protein Sequence andStructure M. O. Dayhoff ed., 5 Suppl. 3:353-358, National Biomedical ResearchFoundation, Washington, D.C.，其改编自Smith和Waterman的Advances in Appl. Math.2:482-489, 1981中的局部同源性算法用于肽分析。用于确定核苷酸序列同一性的程序可在Wisconsin序列分析包版本8（可从Genetics Computer Group, Madison, Wis获得）中获得，例如BESTFIT、FASTA和GAP程序，其也依赖于Smith和Waterman算法。这些程序容易与制造商推荐且在上文提及的Wisconsin序列分析包中描述的默认参数一起使用。例如，特定核苷酸序列与参考序列的同一性百分比可使用Smith和Waterman的同源性算法以及默认评分表和六个核苷酸位置的空位罚分来确定。在本发明的上下文中建立同一性百分比的另一种方法是使用由爱丁堡大学拥有版权、由John F. Collins和Shane S. Sturrok开发并由IntelliGenetics，Inc.（Mountain View，CA）发布的MPSRCH程序包。从该软件包中，可以采用Smith-Waterman算法，其中默认参数用于评分表（例如，起始空位罚分（gap openpenalty）为12，延续空位罚分（gap extension penalty）为1，空位为6）。根据生成的数据，“匹配”值反映“序列同一性”。用于计算序列之间的同一性或相似性百分比的其他合适的程序在本领域中通常是已知的，例如，另一个比对程序是BLAST，与默认参数一起使用。例如，可以使用以下默认参数来使用BLASTN和BLASTP：遗传代码=标准；过滤器=无；链=两者；截断值=60；期望值=10；矩阵=BLOSUM62；描述=50个序列；排序依据=高分；数据库=非冗余，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻译+Swiss蛋白+Spupdate+PIR。这些程序的细节在本领域中是公知的。或者，可以通过在同源区域之间形成稳定双链体的条件下杂交多核苷酸，然后用单链特异性核酸酶消化，并确定消化片段的大小来确定同源性。基本上同源的DNA序列可以在Southern杂交实验中在例如严格条件下鉴定，如针对该特定系统所定义的。定义适当的杂交条件在本领域的技术范围内。参见例如Sambrook等，同上；DNA克隆，同上；核酸杂交，同上。
如本文所用，术语“载体”是指用于携带或包括核酸序列的物质，例如，以便将核酸序列引入宿主细胞中。适用的载体包括例如表达载体、质粒、杆状病毒质粒、粘性质粒、构建体、噬菌体载体、病毒载体、附加体和人工染色体，其可以包括可操作用于稳定整合到宿主细胞的染色体中的选择序列或标记。另外，载体可以包括一种或多种选择标志基因和适当的表达控制序列。可以包括的选择标志基因例如提供对抗生素或毒素的抗性，补足营养缺陷型缺陷，或供应不在培养基中的关键营养素。表达控制序列可以包括本领域公知的组成型和诱导型启动子、转录增强子、转录终止子等。当要共表达两个以上核酸分子时，可以将两个核酸分子插入例如单个表达载体或单独的表达载体中。可以使用本领域公知的方法确认将核酸分子引入宿主细胞。这样的方法包括例如核酸分析，例如RNA印迹或mRNA的聚合酶链式反应（PCR）扩增、用于基因产物表达的免疫印迹、或其他合适的分析方法以测试引入的核酸序列或其相应基因产物的表达。术语“载体”包括克隆和表达载体，以及病毒载体。在某些实施方式中，本文提供的载体是重组病毒载体。在具体实施方式中，本文提供的载体是重组AAV载体。
如本文所用，术语“重组AAV载体（rAAV载体）”是指包含来自AAV的核酸序列和一个或多个异源序列（即，非AAV来源的核酸序列）的多核苷酸载体。在一些实施方式中，一个或多个异源序列侧接至少一个（在某些实施方式中为两个）AAV末端反向重复序列（ITR）。在一些实施方式中，这样的rAAV载体可以被复制并包装到感染性病毒衣壳颗粒中，例如，当存在于已经被合适的辅助病毒感染（或表达合适的辅助功能）并且表达AAV rep和cap基因产物（即AAV Rep和Cap蛋白）的宿主细胞中时。rAAV载体可以掺入较大的多核苷酸中（例如，在染色体中或在另一种载体如用于克隆或转染的质粒中），并且可以在AAV包装功能和合适的辅助功能的存在下通过复制和包裹来“拯救”。rAAV载体可以是多种形式中的任何一种，包括但不限于质粒、线性人工染色体、与脂质复合、包封在脂质体内以及包裹在病毒衣壳颗粒（特别是AAV颗粒）中。可以将rAAV载体包装到AAV衣壳中以产生“重组腺相关病毒衣壳颗粒（rAAV颗粒）”。
如本文所用，与核酸序列如编码序列和控制序列连用的术语“异源”是指通常不连接在一起和/或通常不与特定细胞相关的序列。因此，核酸构建体或载体的“异源”区域是在另一个核酸分子内或与另一个核酸分子连接的核酸区段，该核酸区段在自然界中不与另一个分子共同存在。例如，核酸构建体的异源区域可包括编码序列，其侧接有与自然界中不与该编码序列关联的序列。异源编码序列的另一个实例是其中编码序列本身在自然界中不存在的构建体（例如，具有不同于天然基因的密码子的合成序列）。
如本文所用，关于侧接有其他元件的序列的术语“侧接”指示相对于该序列存在一个或多个侧接元件上游和/或下游，即5’和/或3’。术语“侧接”不旨在指示序列必须是连续的。例如，在编码转基因的核酸和侧接元件之间可能存在间插序列。“侧接”有两个其他元件（例如，ITR）的序列（例如，转基因）指示一个元件位于该序列的5’，而另一个位于序列的3’；然而，在它们之间可能存在间插序列。
如本文所用，术语“末端反向重复”或“ITR”序列是指在相反方向的病毒基因组末端发现的相对短的序列。“AAV末端反向重复（ITR）”序列是本领域公知的，并且通常是存在于天然单链AAV基因组的两个末端的约145个核苷酸的序列。ITR的最外125个核苷酸可以以两种替代取向中的任一种存在，导致不同AAV基因组之间和单个AAV基因组的两端之间的异质性。最外125个核苷酸还含有几个较短的自互补区域（指定为A、A’、B、B’、C、C’和D区域），允许在ITR的该部分内发生链内碱基配对。
“编码序列”或“编码”所选多肽的序列是当置于适当调节序列的控制下时被转录（在DNA的情况下）和翻译（在mRNA的情况下）成多肽的核酸分子。编码序列的边界由5’（氨基）端的起始密码子和3’（羧基）端的翻译终止密码子确定。转录终止序列可以位于编码序列的3’位。
术语“控制序列”是指在特定宿主生物体中表达可操作地连接的编码序列所必需的DNA序列。适用于原核生物的控制序列例如包括启动子、任选的操纵子序列和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、聚腺苷酸化信号和增强子。
如本文所用，当用于提及核酸或氨基酸时，术语“可操作地连接的”和类似短语（例如，遗传融合的）分别是指彼此以功能关系放置的核酸序列或氨基酸序列的操作连接。例如，可操作地连接的启动子、增强子元件、开放阅读框、5’和3’UTR和终止子序列导致核酸分子（例如RNA）的准确生产。在一些实施方式中，可操作地连接的核酸元件导致开放阅读框的转录并最终生产多肽（即，开放阅读框的表达）。作为另一个实例，可操作地连接的肽是其中功能结构域彼此以适当的距离放置以赋予每个结构域的预期功能的肽。
如本文所用，术语“表达盒”或“核酸表达盒”是指包括一种或多种转录控制元件（例如但不限于启动子、应答元件、聚腺苷酸化序列和内含子）的核酸分子，所述转录控制元件在一种或多种期望的细胞类型、组织或器官中指导生物分子的表达，例如指导(转)基因表达。通常，它们还将含有转基因，尽管还考虑表达盒在插入核酸序列的细胞中指导内源基因的表达。
如本文所用，术语“应答元件（RE）”是指能够调节和/或控制基因转录的转录控制元件，特别是非编码顺式作用转录控制元件。应答元件包含至少一个转录因子结合位点（TFBS）。应答元件可以位于它们在体内调节的基因的上游（例如在启动子区中）或下游（例如在3’UTR中），并且可以位于基因的附近或更远的位置。值得注意的是，应答元件可以是天然存在的序列或非天然存在的序列。
如本文所用，术语“增强子”是指通过增加启动子的活性来增加转录速率的核酸序列。
如本文所用，术语“启动子”在其普通意义上是指包含DNA调节序列的核苷酸区，其中调节序列源自能够结合RNA聚合酶并启动下游（3’方向）编码序列转录的基因。转录启动子可以包括“诱导型启动子”（其中与启动子可操作地连接的多核苷酸序列的表达由分析物、辅因子、调节蛋白等诱导）、“可阻遏启动子”（其中与启动子可操作地连接的多核苷酸序列的表达由分析物、辅因子、调节蛋白等诱导）和“组成型启动子”。
如本文所用，术语“TATA盒”是指在基因的启动子区中发现的DNA序列，其可以在DNA解链和被RNA聚合酶II结合期间被TATA结合蛋白和转录因子II D结合。TATA盒序列典型地包括TATAAA序列并且通常包括另外的3’腺嘌呤核苷酸。
如本文所用，术语“转录起始位点”是指转录在基因序列的5’端开始的位置。
如本文所用，术语“ORF（开放阅读框）”是指编码氨基酸的一系列核苷酸三联体（密码子）。这些序列通常可翻译成肽。
如本文所用，术语“转录因子（TF）”是指结合特定DNA序列并由此控制遗传信息从DNA到RNA的转移（或转录）的蛋白质。TF通过促进（作为激活子）或阻断（作为抑制子）RNA聚合酶（执行遗传信息从DNA到RNA的转录的酶）募集到特定基因，单独或与复合物中的其他蛋白质一起执行该功能。TF结合的特定DNA序列被称为应答元件（RE）或调节元件。其他名称包括顺式元件和顺式作用转录调节元件。转录因子使用静电（其中氢键是特例）和范德华力的组合与其结合位点相互作用。由于这些化学相互作用的性质，大多数转录因子以序列特异性方式结合DNA。然而，并非转录因子结合位点中的所有碱基都可以实际上与转录因子相互作用。此外，这些相互作用中的一些可能比其他相互作用弱。因此，许多转录因子不仅结合一个序列，而且能够结合密切相关序列的子集，每个序列具有不同的相互作用强度。例如，尽管TATA结合蛋白（TBP）的共有结合位点是TATAAAA；然而，TBP转录因子也可以结合类似的序列，例如TATATAT或TATATAA。可以基于许多方面对转录因子（TF）进行分类。例如，蛋白质结构DNA结合序列的二级、三级和四级结构和特性，与DNA双螺旋的相互作用，以及金属和其他结合特性。JASPAR数据库和TRANSFAC（TRANSFAC.RTM.7.0 Public 2005）是两个基于网络的转录因子的数据库，包括它们经实验证明的结合位点和调节基因。
如本文所用，广义上的术语“转基因”意指掺入载体诸如病毒载体中的任何异源核苷酸序列，例如用于在靶细胞中表达，并且其可与表达控制序列例如启动子相关。本领域技术人员理解，表达控制序列将基于促进靶细胞中转基因表达的能力来选择。转基因的实例是编码治疗性多肽或可检测标记的核酸。
如本文所用，术语“AAV衣壳”或“AAV衣壳蛋白”或“AAV cap”是指由AAV衣壳（cap）基因（例如，VP1、VP2和VP3）编码的蛋白或其变体。例如，该术语包括但不限于源自任意AAV血清型的衣壳蛋白，例如AAV1、AAV2、AAV2i8、AAV3、AAV3-B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV-DJ、AAV-2/1、AAV 2/6、AAV 2/7、AAV 2/8、AAV 2/9、AAV LK03、AAVrh10、AAVrh74、AAV44-9或其变体。该术语还包括由重组AAV如嵌合AAV表达或衍生的衣壳蛋白。
如本文所用，术语“AAV衣壳颗粒”或“AAV颗粒”包括至少一种AAV衣壳蛋白（例如，VP1蛋白、VP2蛋白、VP3蛋白或其变体），并且任选地包封来自AAV基因组（包括rAAV基因组）的核酸或源自AAV基因组（包括rAAV基因组）的核酸。
关于载体或病毒衣壳使用的术语“血清型”由基于衣壳蛋白序列和衣壳结构的不同免疫学谱定义。
如本文所用，关于病毒衣壳或颗粒，术语“嵌合”意指衣壳或颗粒包括来自不同细小病毒，优选不同AAV血清型的序列，如Rabinowitz等美国专利第6,491,907号中所述，其公开内容通过引用整体并入本文。
术语“重组”意指不同于通常在自然界中发现的遗传实体。当应用于多核苷酸、基因、启动子、表达盒等时，意指其是克隆、限制、连接和/或合成步骤以及导致产生与天然存在的多核苷酸、基因、启动子、表达盒等不同的构建体的其他程序的各种组合的产物。当在本文中用于描述病毒时，术语“重组”是指已经例如通过将异源核酸构建体添加或插入颗粒中而发生遗传改变的病毒。例如，如本文所用，术语“重组AAV颗粒”或“rAAV”是指例如通过内源AAV基因的缺失或其他突变和/或将异源核酸构建体添加或插入AAV颗粒的多核苷酸中而发生遗传改变的AAV。
如本文所用，“特异性杂交”是指反义化合物在反义寡核苷酸和靶核酸之间具有足够程度的互补性以诱导所需效应，同时在需要特异性结合的条件下，即在体内测定和治疗处理的情况下的生理条件下，对非靶核酸表现出最小的效应或没有效应。
如本文所用，“严格杂交条件”或“严格条件”是指低聚化合物将与其靶序列杂交但与最少数量的其他序列杂交的条件。
如本文所用，术语“转染的”或“转化的”或“转导的”是指将外源核酸转移或引入宿主细胞的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已经用外源核酸转染、转化或转导的细胞。例如，术语“转染”用于指细胞对外源DNA的摄取，并且当外源DNA已被引入细胞膜内时，细胞已被“转染”。许多转染技术是本领域公知的。参见例如Graham等（1973）Virology,52 :456，Green和Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4thEd., ColdSpring Harbor Laboratory（Cold Spring Harbor, N.Y. 2012），Davis等（1986）BasicMethods in Molecular Biology, Elsevier，以及Chu等（1981） Gene 13:197。此类技术可用于将一种或多种外源分子引入合适的宿主细胞中。病毒对细胞的“转导”意指将核酸如DNA或RNA从病毒颗粒转移到细胞中。
如本文所用，术语“宿主细胞”是指可用核酸分子、载体、病毒颗粒或非病毒基因递送系统转染的特定细胞，以及此类细胞的后代或潜在后代。宿主细胞可以是细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。
术语“纯化的”是指分离物质（化合物、多核苷酸、蛋白质、多肽、多肽组合物），使得感兴趣的物质占其所在样品的大部分。通常，在样品中，基本上纯化的组分包含样品的50%、80%-85%、90-99%，例如至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%。用于纯化感兴趣的多核苷酸和多肽的技术是本领域公知的，并且包括例如离子交换色谱、亲和色谱和根据密度的沉降。
如本文所用，术语“治疗”是指由施用一种或多种疗法引起的疾病或病症的进展、严重性和/或持续时间的减少或缓解。可以通过评估是否存在与潜在障碍相关的一种或多种症状的减少、减轻和/或缓解来确定治疗，使得尽管患者可能仍然患有潜在障碍，但患者仍观察到改善。术语“治疗”包括控制和缓解疾病。术语“管理”是指受试者从不一定导致疾病治愈的疗法中获得的有益效果。“治疗”包括：（1）预防疾病，即预防疾病的发展或导致疾病在可能暴露于或易患疾病但尚未经历或显示疾病的症状的受试者中以较低的强度发生，（2）抑制疾病，即阻止发展、预防或延缓进展或逆转疾病状态，（3）减轻疾病的症状，即减少受试者经历的症状的数量，以及（4）减少、预防或延缓疾病或其症状的进展。术语“预防”是指降低疾病、障碍、病症或相关症状发作（或复发）的可能性。
如本文所用，“施用”是指将物质（例如，本文提供的药物组合物）注射或以其他方式物理递送至受试者或患者（例如，人）的动作，例如通过口服、黏膜、局部、皮内、肠胃外、静脉内、玻璃体内、关节内、视网膜下、肌内、鞘内递送和/或本文所述的或本领域已知的任何其他物理递送方法。在特定实施方式中，施用是通过静脉内输注。本文提供的治疗剂（例如，药物组合物）可以全身递送或递送至特定组织。
如本文所用，术语“有效量”或“治疗有效量”是指足以治疗、诊断、预防、延迟给定病症、障碍或疾病和/或与其相关的症状的发作，减少和/或缓解其严重性和/或持续时间的治疗剂（例如，本文提供的药物组合物）的量。这些术语还涵盖减少、减慢或缓解给定疾病的进展或发展，减少、减慢或缓解给定疾病的复发、发展或发作，和/或提高或增强另一种疗法的预防或治疗效果或用作另一种疗法的桥梁所需的量。在一些实施方式中，如本文所用的“有效量”还指实现指定结果的本文所述的治疗剂（例如，本文提供的药物组合物）的量。
如本文所用，术语“受试者”和“患者”可互换使用，并且是指哺乳动物，例如非灵长类动物（例如，牛、猪、马、猫、狗、羊、兔、大鼠、小鼠等）或灵长类动物（例如，猴和人），例如人。在某些实施方式中，受试者是诊断患有本文所述疾病或障碍的哺乳动物，例如人。在另一个实施方式中，所述受试者是处于本文所述的疾病或障碍发展的风险中的哺乳动物，例如人。在具体实施方式中，所述受试者是人。在具体实施方式中，所述受试者是成人。在具体实施方式中，所述受试者是人类青少年。在具体实施方式中，所述受试者是人类儿童。
如本文所用，术语“疗法”可指可用于预防、治疗、管理或缓解疾病或障碍或其症状（例如，本文所述的疾病或障碍或与其相关的一种或多种症状或病症）的任何操作规程、方法、组合物、制剂和/或试剂。在某些实施方式中，术语“疗法”是指可用于治疗、管理、预防或缓解疾病或障碍或其一种或多种症状的基因疗法。
如本文所用，术语“基因治疗”是指将异源核酸分子引入一个或多个受体细胞中，其中异源核酸本身或受体细胞中异源核酸的表达影响细胞的功能并在受试者中产生治疗效果。例如，异源核酸分子可以编码影响受体细胞功能的蛋白质。
如在本公开中所用的并且除非另有说明，否则术语“约”和“大约”应被解释为允许由本领域技术人员所判断的正常变化，或者意指在由本领域普通技术人员所确定的特定值的可接受误差范围内，这将部分地取决于如何测量或确定该值（即，测量系统的限制），例如，在所述值的20%或10%%或5%内的变化，或者在本领域的每个实践的1个或多于1个标准偏差内的变化。在具体实施方式中，术语“约”和“大约”涵盖所述的精确值。除非上下文另有明确指明，否则本文提供的所有数值均由术语“约”修饰。
如本公开中所使用的，单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指示物，除非上下文另有明确规定。除非上下文另有明确规定，否则术语“一”（或“一种”）以及术语“一种或多种”和“至少一种”在本文中可以互换使用。
应当理解，在本文中凡是使用术语“包含”描述实施方式，也提供了以“由……组成”和/或“基本上由……组成”描述的其他类似实施方式。还应当理解，在本文中凡是使用短语“基本上由……组成”描述实施方式，也提供了以“由……组成”描述的类似实施方式。
在例如“在A和B之间”或“在A-B之间”的短语中使用的术语“在……之间”是指包括A和B两者的范围。
本文在例如“A和/或B”的短语中使用的术语“和/或”旨在包括A和B两者；A或B；A（单独）；和B（单独）。同样，在例如“A、B和/或C”的短语中使用的术语“和/或”旨在涵盖以下实施方式中的每一个：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A（单独）；B（单独）；和C（单独）。
术语“或”和“和”可以互换使用，并且可以理解为表示“和/或”，除非上下文另有明确规定。
5.2多核苷酸、启动子和表达盒
本公开描述了编码人α-半乳糖苷酶A的经密码子优化的核苷酸序列。由本公开中描述的核苷酸序列编码的人α-半乳糖苷酶A可以是野生型人α-半乳糖苷酶A或突变的（例如，截短的）人α-半乳糖苷酶A，但优选地是功能性人α-半乳糖苷酶A。在具体实施方式中，所述编码人α-半乳糖苷酶A的经密码子优化的核苷酸序列包含与SEQ ID NO：1具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%或99.8%或100%同一性的核苷酸序列。在一个实施方式中，所述编码人α-半乳糖苷酶A的经密码子优化的核苷酸序列包含SEQ ID NO：1。在一个实施方式中，所述编码人α-半乳糖苷酶A的经密码子优化的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。在具体实施方式中，所述编码人α-半乳糖苷酶A的经密码子优化的核苷酸序列包含与SEQ ID NO：2具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%或99.8%或100%同一性的核苷酸序列。在一个实施方式中，所述编码人α-半乳糖苷酶A的经密码子优化的核苷酸序列包含SEQ ID NO：2。在具体实施方式中，所述编码人α-半乳糖苷酶A的经密码子优化的核苷酸序列包含与SEQ ID NO：20具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%或99.8%或100%同一性的核苷酸序列。在一个实施方式中，所述编码人α-半乳糖苷酶A的经密码子优化的核苷酸序列包含SEQ ID NO：20。在一个实施方式中，所述编码人α-半乳糖苷酶A的经密码子优化的核苷酸序列如SEQ ID NO：20所示。不希望受任何一种理论的束缚，这些核苷酸序列特别适用于法布里病的基因疗法。
本公开还描述了编码肝细胞特异性或肝细胞-肌细胞双特异性启动子的核苷酸序列。在某些实施方式中，所述核苷酸序列编码肝细胞特异性启动子。在某些实施方式中，所述核苷酸序列编码肝细胞-肌细胞双特异性启动子。
在具体实施方式中，所述编码肝细胞特异性或肝细胞-肌细胞双特异性启动子的核苷酸序列包含与SEQ ID NO：3具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%或99.8%或100%同一性的核苷酸序列。在一个实施方式中，编码肝细胞特异性或肝细胞-肌细胞双特异性启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO：3。在一个实施方式中，编码肝细胞特异性或肝细胞-肌细胞双特异性启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。不希望受任何一种理论的束缚，这些核苷酸序列特别适用于在肝细胞中（即，在肝脏中）和任选地在其他细胞类型（例如，肌细胞和/或肾细胞）中指导生物分子的表达，例如指导（转）基因表达，并且因此特别适用于基因治疗，尤其适用于包括法布里病的溶酶体贮积症。
在具体实施方式中，所述编码肝细胞特异性或肝细胞-肌细胞双特异性启动子的核苷酸序列包含与SEQ ID NO：4具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%或99.8%或100%同一性的核苷酸序列。在一个实施方式中，编码肝细胞特异性或肝细胞-肌细胞双特异性启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO：4。在一个实施方式中，编码肝细胞特异性或肝细胞-肌细胞双特异性启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。在具体实施方式中，所述编码肝细胞特异性或肝细胞-肌细胞双特异性启动子的核苷酸序列包含与SEQ ID NO：5具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%或99.8%或100%同一性的核苷酸序列。在一个实施方式中，编码肝细胞特异性或肝细胞-肌细胞双特异性启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO：5。在一个实施方式中，编码肝细胞特异性或肝细胞-肌细胞双特异性启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。在具体实施方式中，所述编码肝细胞特异性或肝细胞-肌细胞双特异性启动子的核苷酸序列包含与SEQ ID NO：6具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%或99.8%或100%同一性的核苷酸序列。在一个实施方式中，编码肝细胞特异性或肝细胞-肌细胞双特异性启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO：6。在一个实施方式中，编码肝细胞特异性或肝细胞-肌细胞双特异性启动子的核苷酸序列如SEQ IDNO：6所示。在具体实施方式中，所述编码肝细胞特异性或肝细胞-肌细胞双特异性启动子的核苷酸序列包含与SEQ ID NO：7具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%或99.8%或100%同一性的核苷酸序列。在一个实施方式中，编码肝细胞特异性或肝细胞-肌细胞双特异性启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO：7。在一个实施方式中，编码肝细胞特异性或肝细胞-肌细胞双特异性启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。在具体实施方式中，所述编码肝细胞特异性或肝细胞-肌细胞双特异性启动子的核苷酸序列包含与SEQ ID NO：8具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%或99.8%或100%同一性的核苷酸序列。在一个实施方式中，编码肝细胞特异性或肝细胞-肌细胞双特异性启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO：8。在一个实施方式中，编码肝细胞特异性或肝细胞-肌细胞双特异性启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示。在具体实施方式中，所述编码肝细胞特异性或肝细胞-肌细胞双特异性启动子的核苷酸序列包含与SEQ ID NO：9具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%或99.8%或100%同一性的核苷酸序列。在一个实施方式中，编码肝细胞特异性或肝细胞-肌细胞双特异性启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO：9。在一个实施方式中，编码肝细胞特异性或肝细胞-肌细胞双特异性启动子的核苷酸序列如SEQ IDNO：9所示。在具体实施方式中，所述编码肝细胞特异性或肝细胞-肌细胞双特异性启动子的核苷酸序列包含与SEQ ID NO：10具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%或99.8%或100%同一性的核苷酸序列。在一个实施方式中，编码肝细胞特异性或肝细胞-肌细胞双特异性启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO：10。在一个实施方式中，编码肝细胞特异性或肝细胞-肌细胞双特异性启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示。不希望受任何一种理论的束缚，这些核苷酸序列特别适合于在肝细胞（即，在肝脏中）和肌细胞（即，在肌肉中）（例如，在心肌（例如，心房肌和/或心室肌）和/或骨骼肌（例如，二头肌、三头肌、四头肌、胫骨前肌、腓肠肌、腹直肌、膈肌、胸大肌）中）以及任选地在其他细胞类型（例如，肾细胞）中指导生物分子的表达，例如指导(转)基因表达，并且因此特别适用于基因治疗，尤其适用于包括法布里病的溶酶体贮积症。在特定实施方式中，肌肉可以用作生物分子的生产工厂，该生物分子从肌细胞分泌并最终被另一组织或器官的细胞吸收以发挥其治疗效果。
本公开进一步描述了编码人α-半乳糖苷酶A表达盒的核苷酸序列。在具体实施方式中，所述编码人α-半乳糖苷酶A表达盒的核苷酸序列包含与SEQ ID NO：16具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%或99.8%或100%同一性的核苷酸序列。在一个实施方式中，所述编码人α-半乳糖苷酶A表达盒的核苷酸序列包含SEQ ID NO：16。在一个实施方式中，所述编码人α-半乳糖苷酶A表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示。在具体实施方式中，所述编码人α-半乳糖苷酶A表达盒的核苷酸序列包含与SEQ ID NO：17具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%或99.8%或100%同一性的核苷酸序列。在一个实施方式中，所述编码人α-半乳糖苷酶A表达盒的核苷酸序列包含SEQ ID NO：17。在一个实施方式中，所述编码人α-半乳糖苷酶A表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO：17所示。在具体实施方式中，所述编码人α-半乳糖苷酶A表达盒的核苷酸序列包含与SEQ ID NO：18具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%或99.8%或100%同一性的核苷酸序列。在一个实施方式中，所述编码人α-半乳糖苷酶A表达盒的核苷酸序列包含SEQ ID NO：18。在一个实施方式中，所述编码人α-半乳糖苷酶A表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO：18所示。在具体实施方式中，所述编码人α-半乳糖苷酶A表达盒的核苷酸序列包含与SEQ ID NO：19具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%或99.8%或100%同一性的核苷酸序列。在一个实施方式中，所述编码人α-半乳糖苷酶A表达盒的核苷酸序列包含SEQ ID NO：19。在一个实施方式中，所述编码人α-半乳糖苷酶A表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO：19所示。不希望受任何一种理论的束缚，这些核苷酸序列特别适用于法布里病的基因疗法。
本公开尤其提供了与这些核苷酸序列相关的多核苷酸、启动子和表达盒。
5.2.1多核苷酸
在一个方面，本文提供了包含编码人α-半乳糖苷酶A的核苷酸序列的多核苷酸，其中所述编码人α-半乳糖苷酶A的核苷酸序列包含与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ IDNO：20具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%或99.8%或100%同一性的核苷酸序列。
在某些实施方式中，所述编码人α-半乳糖苷酶A的核苷酸序列包含SEQ ID NO：1。在某些实施方式中，所述编码人α-半乳糖苷酶A的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
在某些实施方式中，所述编码人α-半乳糖苷酶A的核苷酸序列包含SEQ ID NO：2。在某些实施方式中，所述编码人α-半乳糖苷酶A的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
在某些实施方式中，所述编码人α-半乳糖苷酶A的核苷酸序列包含SEQ ID NO：20。在某些实施方式中，所述编码人α-半乳糖苷酶A的核苷酸序列如SEQ ID NO：20所示。
在一个方面，本文提供了包含编码启动子的核苷酸序列的多核苷酸，其中所述编码启动子的核苷酸序列包含与SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%或99.8%或100%同一性的核苷酸序列。
在具体实施方式中，所述启动子是肝细胞特异性启动子。在具体实施方式中，所述启动子是肝细胞-肌细胞双特异性启动子。在具体实施方式中，所述启动子是肝细胞-肾细胞双特异性启动子。在具体实施方式中，所述启动子是肝细胞-肌细胞-肾细胞多特异性启动子。
在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO：3。在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO：4。在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO：5。在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。
在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO：6。在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。
在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO：7。在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。
在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO：8。在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示。
在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO：9。在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。
在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO：10。在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示。
在一个方面，本文提供了一种多核苷酸，其包含编码人α-半乳糖苷酶A的核苷酸序列和编码启动子的核苷酸序列，所述编码启动子的核苷酸序列可操作地连接到所述编码人α-半乳糖苷酶A的核苷酸序列，其中所述编码人α-半乳糖苷酶A的核苷酸序列包含与SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：20具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%或99.8%或100%同一性的核苷酸序列。
在某些实施方式中，所述编码人α-半乳糖苷酶A的核苷酸序列包含SEQ ID NO：1。在某些实施方式中，所述编码人α-半乳糖苷酶A的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
在某些实施方式中，所述编码人α-半乳糖苷酶A的核苷酸序列包含SEQ ID NO：2。在某些实施方式中，所述编码人α-半乳糖苷酶A的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
在某些实施方式中，所述编码人α-半乳糖苷酶A的核苷酸序列包含SEQ ID NO：20。在某些实施方式中，所述编码人α-半乳糖苷酶A的核苷酸序列如SEQ ID NO：20所示。
在具体实施方式中，所述启动子是肝细胞特异性启动子。在具体实施方式中，所述启动子是肝细胞-肌细胞双特异性启动子。在具体实施方式中，所述启动子是肝细胞-肾细胞双特异性启动子。在具体实施方式中，所述启动子是肝细胞-肌细胞-肾细胞多特异性启动子。
在各种实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列包含与SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%或99.8%或100%同一性的核苷酸序列。
在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO：3。在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO：4。在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO：5。在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。
在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO：6。在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。
在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO：7。在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。
在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO：8。在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示。
在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO：9。在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。
在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO：10。在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示。
在各种实施方式中，多核苷酸还包含一个或多个调节控制元件（参见第5.2.5节）。在具体实施方式中，所述多核苷酸还包含编码polyA信号的核苷酸序列。
在一个方面，本文提供了一种多核苷酸，其包含编码生物分子的核苷酸序列和编码启动子的核苷酸序列，所述编码启动子的核苷酸序列可操作地连接到所述编码生物分子的核苷酸序列，其中所述编码启动子的核苷酸序列包含与SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%或99.8%或100%同一性的核苷酸序列。
在具体实施方式中，所述启动子是肝细胞特异性启动子。在具体实施方式中，所述启动子是肝细胞-肌细胞双特异性启动子。在具体实施方式中，所述启动子是肝细胞-肾细胞双特异性启动子。在具体实施方式中，所述启动子是肝细胞-肌细胞-肾细胞多特异性启动子。
在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO：3。在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO：4。在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO：5。在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。
在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO：6。在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。
在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO：7。在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。
在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO：8。在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示。
在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO：9。在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。
在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO：10。在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示。
生物分子的更多描述在第5.2.4节中提供。在具体实施方式中，所述生物分子是人α-半乳糖苷酶A（优选功能性人α-半乳糖苷酶A）。
在各种实施方式中，多核苷酸还包含一个或多个调节控制元件（参见第5.2.5节）。在具体实施方式中，所述多核苷酸还包含编码polyA信号的核苷酸序列。
在一个方面，本文提供了包含编码表达盒的核苷酸序列的多核苷酸，其中所述编码表达盒的核苷酸序列包含与SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：19具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%或99.8%或100%同一性的核苷酸序列。
在某些实施方式中，所述编码表达盒的核苷酸序列包含SEQ ID NO：16。在某些实施方式中，所述编码表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示。
在某些实施方式中，所述编码表达盒的核苷酸序列包含SEQ ID NO：17。在某些实施方式中，所述编码表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO：17所示。
在某些实施方式中，所述编码表达盒的核苷酸序列包含SEQ ID NO：18。在某些实施方式中，所述编码表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO：18所示。
在某些实施方式中，所述编码表达盒的核苷酸序列包含SEQ ID NO：19。在某些实施方式中，所述编码表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO：19所示。
在一个方面，本文提供了包含编码第5.2.3节中所述的表达盒的核苷酸序列的多核苷酸。
在各个方面和实施方式中，本文所述的多核苷酸是被纯化的。在各个方面和实施方式中，本文所述的多核苷酸是被分离的。在各个方面和实施方式中，本文所述的多核苷酸是重组多核苷酸。
在某些实施方式中，本文所述的多核苷酸是DNA多核苷酸。在具体实施方式中，本文所述的多核苷酸是双链DNA。在具体实施方式中，本文所述的多核苷酸是单链DNA。
多核苷酸的更多描述在第5.1节中提供。
5.2.2启动子
在一个方面，本文提供了一种启动子，其由包含与SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%或99.8%或100%同一性的核苷酸序列的核苷酸序列编码。
在具体实施方式中，所述启动子是肝细胞特异性启动子。在具体实施方式中，所述启动子是肝细胞-肌细胞双特异性启动子。在具体实施方式中，所述启动子是肝细胞-肾细胞双特异性启动子。在具体实施方式中，所述启动子是肝细胞-肌细胞-肾细胞多特异性启动子。
在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO：3。在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO：4。在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO：5。在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。
在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO：6。在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。
在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO：7。在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。
在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO：8。在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示。
在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO：9。在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。
在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO：10。在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示。
在各个方面和实施方式中，本文所述的启动子是重组启动子。
启动子的更多描述在第5.1节和第5.2.5节中提供。
5.2.3表达盒
在一个方面，本文提供了一种表达盒，其包含编码人α-半乳糖苷酶A的核苷酸序列和编码启动子的核苷酸序列，所述编码启动子的核苷酸序列可操作地连接到所述编码人α-半乳糖苷酶A的核苷酸序列，其中所述编码人α-半乳糖苷酶A的核苷酸序列包含与SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：20具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%或99.8%或100%同一性的核苷酸序列。
在某些实施方式中，所述编码人α-半乳糖苷酶A的核苷酸序列包含SEQ ID NO：1。在某些实施方式中，所述编码人α-半乳糖苷酶A的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
在某些实施方式中，所述编码人α-半乳糖苷酶A的核苷酸序列包含SEQ ID NO：2。在某些实施方式中，所述编码人α-半乳糖苷酶A的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
在某些实施方式中，所述编码人α-半乳糖苷酶A的核苷酸序列包含SEQ ID NO：20。在某些实施方式中，所述编码人α-半乳糖苷酶A的核苷酸序列如SEQ ID NO：20所示。
在具体实施方式中，所述启动子是肝细胞特异性启动子。在具体实施方式中，所述启动子是肝细胞-肌细胞双特异性启动子。在具体实施方式中，所述启动子是肝细胞-肾细胞双特异性启动子。在具体实施方式中，所述启动子是肝细胞-肌细胞-肾细胞多特异性启动子。
在各种实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列包含与SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%或99.8%或100%同一性的核苷酸序列。
在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO：3。在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO：4。在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO：5。在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。
在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO：6。在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。
在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO：7。在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。
在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO：8。在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示。
在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO：9。在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。
在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO：10。在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示。
在各种实施方式中，表达盒还包含一个或多个调节控制元件（参见第5.2.5节）。在具体实施方式中，所述表达盒还包含编码polyA信号的核苷酸序列。
在一个方面，本文提供了一种表达盒，其包含编码生物分子的核苷酸序列和编码启动子的核苷酸序列，所述编码启动子的核苷酸序列可操作地连接到所述编码生物分子的核苷酸序列，其中所述编码启动子的核苷酸序列包含与SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%或99.8%或100%同一性的核苷酸序列。
在具体实施方式中，所述启动子是肝细胞特异性启动子。在具体实施方式中，所述启动子是肝细胞-肌细胞双特异性启动子。在具体实施方式中，所述启动子是肝细胞-肾细胞双特异性启动子。在具体实施方式中，所述启动子是肝细胞-肌细胞-肾细胞多特异性启动子。
在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO：3。在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO：4。在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO：5。在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。
在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO：6。在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。
在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO：7。在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。
在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO：8。在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示。
在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO：9。在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。
在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO：10。在某些实施方式中，所述编码启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示。
生物分子的更多描述在第5.2.4节中提供。在具体实施方式中，所述生物分子是人α-半乳糖苷酶A（优选功能性人α-半乳糖苷酶A）。
在各种实施方式中，表达盒还包含一个或多个调节控制元件（参见第5.2.5节）。在具体实施方式中，所述表达盒还包含编码polyA信号的核苷酸序列。
在一个方面，本文提供了由包含与SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：19具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%或99.8%或100%同一性的核苷酸序列的核苷酸序列编码的表达盒。
在某些实施方式中，所述编码表达盒的核苷酸序列包含SEQ ID NO：16。在某些实施方式中，所述编码表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示。
在某些实施方式中，所述编码表达盒的核苷酸序列包含SEQ ID NO：17。在某些实施方式中，所述编码表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO：17所示。
在某些实施方式中，所述编码表达盒的核苷酸序列包含SEQ ID NO：18。在某些实施方式中，所述编码表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO：18所示。
在某些实施方式中，所述编码表达盒的核苷酸序列包含SEQ ID NO：19。在某些实施方式中，所述编码表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO：19所示。
在各个方面和实施方式中，本文所述的表达盒是重组表达盒。
表达盒的更多描述在第5.1节中提供。
5.2.4生物分子
本公开所述的生物分子可以是例如但不限于多肽、蛋白质、核酸（例如，DNA或RNA）或寡核苷酸（例如，siRNA、shRNA、miRNA或适配体）。在具体实施方式中，所述生物分子是多肽或蛋白质。在优选的实施方式中，所述生物分子是人多肽或人蛋白。所述生物分子可以是报告分子，诸如报告蛋白（例如，荧光蛋白（例如，绿色荧光蛋白（GFP））、荧光素酶（例如，萤火虫荧光素酶）、β-内酰胺酶或β-半乳糖苷酶（LacZ））。所述生物分子也可以是治疗性分子，诸如治疗性蛋白质。治疗分子可以用于校正或缓解与疾病或障碍相关的基因缺陷。示例性治疗分子可以包括但不限于酶、细胞因子、生长因子、激酶、显性负性突变蛋白、抗体及其抗原结合片段、白细胞介素、激素和分化因子。
在某些实施方式中，所述生物分子是治疗性蛋白。本文所述的治疗性蛋白包括激素以及生长和分化因子，包括但不限于胰岛素、胰高血糖素、生长激素（GH）、甲状旁腺激素（PTH）、生长激素释放因子（GRF）、促卵泡激素（FSH）、促黄体激素（LH）、人绒毛膜促性腺激素（hCG）、血管内皮生长因子（VEGF）、血管生成素、血管抑制素、粒细胞集落刺激因子（GCSF）、红细胞生成素（EPO）、结缔组织生长因子（CTGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、酸性成纤维细胞生长因子（aFGF）、表皮生长因子（EGF）、血小板衍生生长因子（PDGF）、胰岛素生长因子I和II（IGF-I和IGF-II）、转化生长因子α超家族中的任一种（包括TGFα）、活化素、抑制素、或骨形态发生蛋白（BMP）BMP 1-15中的任一种、生长因子的heregulin/神经调节蛋白（neuregulin）/ARIA/neu分化因子（NDF）家族中的任一种、神经生长因子（NGF）、脑源性神经营养因子（BDNF）、neurotrophin NT-3和NT-4/5、睫状神经营养因子（TF）、胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）、neurturin、聚集蛋白、semaphorins/collapsins家族中的任一种、netrin-1和netrin-2、肝细胞生长因子（HGF）、肝配蛋白、noggin、音猬因子和酪氨酸羟化酶。
本文所述的其他治疗性蛋白质包括调节免疫系统的那些，包括但不限于细胞因子和淋巴因子，诸如血小板生成素（TPO）、白细胞介素（IL）IL-1至IL-25（包括IL-2、IL-4、IL-12和IL-18）、单核细胞趋化蛋白、白血病抑制因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、Fas配体、肿瘤坏死因子α和β、干扰素α、β和γ、干细胞因子、flk-2/flt3配体。由免疫系统生产的蛋白质也是有用的。这些包括但不限于免疫球蛋白IgG、IgM、IgA、IgD和IgE、嵌合免疫球蛋白、人源化抗体、单链抗体、T细胞受体、嵌合T细胞受体、单链T细胞受体、I类和II类MHC分子以及工程化免疫球蛋白和MHC分子。有用的蛋白质还包括补体调节蛋白，例如补体调节蛋白、膜辅蛋白（MCP）、衰变加速因子（DAF）、CR1、CF2和CD59。
本文所述的其它治疗性蛋白是激素、生长因子、细胞因子、淋巴因子、调节蛋白和免疫系统蛋白的受体。本公开涵盖用于胆固醇调节和/或脂质调节的受体，包括低密度脂蛋白（LDL）受体、高密度脂蛋白（HDL）受体、极低密度脂蛋白（VLDL）受体和清道夫受体。本公开还涵盖蛋白质，例如类固醇激素受体超家族的成员，包括糖皮质激素受体和雌激素受体、维生素D受体和其他核受体。此外，有用的蛋白质包括转录因子，如jun、fos、max、mad、血清应答因子（SRF）、AP-1、AP2、myb、MyoD和成肌蛋白、含有ETS盒的蛋白质、TFE3、E2F、ATF1、ATF2、ATF3、ATF4、ZFS、NFAT、CREB、HNF-4、C/EBP、SP1、CCAAT盒结合蛋白、干扰素调节因子（IRF-1）、Wilms肿瘤蛋白、ETS结合蛋白、STAT、GATA盒结合蛋白（例如GATA-3）以及翼式螺旋蛋白（winged helix protein）的叉头家族。
本文所述的其它有用的生物分子包括氨甲酰基合成酶I、鸟氨酸氨甲酰基转移酶、精氨琥珀酸合成酶、精氨琥珀酸裂解酶、精氨酸酶、延胡索酰乙酰乙酸水解酶、苯丙氨酸羟化酶、α-1抗胰蛋白酶、葡萄糖-6-磷酸酶、胆色素原脱氨酶、胱硫醚β-合酶、支链酮酸脱羧酶、白蛋白、异戊酰coA脱氢酶、丙酰CoA羧化酶、甲基丙二酰CoA变位酶、戊二酰CoA脱氢酶、胰岛素、β-葡糖苷酶、丙酮酸羧化酶、肝磷酸化酶、磷酸化酶激酶、甘氨酸脱羧酶、H-蛋白、T-蛋白、囊性纤维化跨膜调节因子（CFTR）序列和抗肌萎缩蛋白cDNA序列。其他有用的蛋白质包括酶，例如可用于酶替代疗法的酶，其可用于由酶活性缺陷引起的各种情况。例如，含有甘露糖-6-磷酸的酶可用于溶酶体贮积症的治疗（例如，合适的基因包括编码β-葡萄糖醛酸酶（GUSB）的基因）。
本文所述的其它有用的生物分子还包括非天然存在的多肽，例如具有含有插入、缺失或氨基酸取代的非天然存在的氨基酸序列的嵌合或杂合多肽。例如，单链工程化免疫球蛋白可用于某些免疫功能低下的患者。其它类型的非天然存在的基因序列包括反义分子和催化核酸，例如核酶，其可用于减少靶的过表达。
本文所述的其他合适的生物分子包括可用于通过针对与自身免疫相关的靶标（包括细胞受体和产生“自身”导向抗体的细胞）赋予广泛的保护性免疫应答来治疗患有自身免疫性疾病和障碍的个体的那些。T细胞介导的自身免疫性疾病包括类风湿性关节炎（RA）、多发性硬化（MS）、干燥综合征（Sjogren’s syndrome）、结节病、胰岛素依赖性糖尿病（IDDM）、自身免疫性甲状腺炎、反应性关节炎、强直性脊柱炎、硬皮病、多发性肌炎、皮肌炎、银屑病、血管炎、韦格纳肉芽肿、克罗恩病和溃疡性结肠炎。这些疾病中的特征均在于T细胞受体（TCR）结合内源抗原并引发与自身免疫性疾病相关的炎症级联反应。
生物分子可用于减少和/或调节感兴趣的蛋白质的表达，以治疗以过度增殖细胞为特征的过度增殖病症，如癌症和银屑病。靶多肽包括与正常细胞相比在过度增殖细胞中专门或以更高水平产生的那些多肽。靶抗原包括由致癌基因如myb、myc、fyn和易位基因bcr/abl、ras、src、P53、neu、trk和EGRF编码的多肽。除了作为靶抗原的致癌基因产物之外，用于抗癌治疗和保护方案的靶多肽包括由B细胞淋巴瘤制备的抗体的可变区以及T细胞淋巴瘤的T细胞受体的可变区，在一些实施方式中，其也用作自身免疫性疾病的靶抗原。其它肿瘤相关多肽可用作靶多肽，例如在肿瘤细胞中以更高水平发现的多肽，包括单克隆抗体17-1A识别的多肽和叶酸结合多肽。
在某些实施方式中，所述生物分子是RNA。这些RNA分子包括但不限于通过RNA干扰（shRNA、RNAi）、micro-RNA调节（miR）、催化性RNA、反义RNA、RNA适配体等发挥其功能的分子。
生物分子可以用于诱导对所选抗原的免疫应答。例如，为了促进免疫应答，抗原可以由本文公开的启动子表达，载体可以如本文所述进行佐剂化，和/或载体可以放入退行性组织中。
合适的免疫原性抗原的实例包括选自多种病毒科的那些。值得期待产生免疫反应的理想病毒科实例包括小核糖核酸病毒科，其包括鼻病毒属，其引起约50%的普通感冒病例；肠病毒（enterovirus）属，其包括脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、埃可病毒和人肠病毒，例如甲型肝炎病毒；和口蹄疫病毒属，其主要在非人动物中引起足部和嘴部疾病。在小核糖核酸病毒科中，靶抗原包括VP1、VP2、VP3、VP4和VPG。其它病毒科包括星状病毒和卡利西病毒科。卡利西病毒科涵盖Norwalk病毒组，其是流行性胃肠炎的重要病原体。用于靶向抗原以在人和非人动物中诱导免疫应答的另一个理想病毒科是披膜病毒科，其包括甲病毒属，包括辛德毕斯病毒、罗斯河病毒和委内瑞拉、东方&西方马脑炎，以及风疹病毒属，包括风疹病毒。黄病毒科包括登革热、黄热病、日本脑炎、圣路易脑炎和蜱传脑炎病毒。其他靶抗原可以由丙型肝炎或冠状病毒科产生，其包括许多非人病毒，例如传染性支气管炎病毒（家禽）、猪传染性胃肠炎病毒（猪）、猪血凝素脑脊髓炎病毒（猪）、猫传染性腹膜炎病毒（猫）、猫肠冠状病毒（猫）、犬冠状病毒（狗）和人呼吸道冠状病毒，其可以引起普通感冒和/或非甲、乙或丙型肝炎，并且其包括严重急性呼吸综合征（SARS）的推定原因。在冠状病毒科中，靶抗原包括E1（也称为M或基质蛋白）、E2（也称为S或刺突蛋白）、E3（也称为HE或血凝素酯酶）、糖蛋白（并非所有冠状病毒都有）或N（核衣壳）。其它抗原可以靶向动脉炎病毒科和弹状病毒科。弹状病毒科包括水疱病毒属（例如，水疱性口炎病毒）和普通丽沙病毒属（例如，狂犬病毒）。在弹状病毒科中，合适的抗原可以源自G蛋白或N蛋白。包括出血热病毒（诸如马尔堡和埃博拉病毒）的丝状病毒科可以是合适的抗原来源。副粘病毒科包括副流感病毒1型、副流感病毒3型、牛副流感病毒3型、腮腺炎病毒属（腮腺炎病毒）、副流感病毒2型、副流感病毒4型、新城疫病毒（鸡）、牛瘟、包括麻疹和犬瘟热在内的麻疹病毒、以及包括呼吸道合胞病毒在内的肺病毒。流感病毒被分类在正粘病毒科中，并且是抗原（例如HA蛋白、N1蛋白）的合适来源。布尼亚病毒科包括布尼亚病毒属（加利福尼亚脑炎，La Crosse）、白蛉病毒属（Phlebovirus）（裂谷热）、汉坦病毒属（puremala是一种出血热病毒）、内罗病毒属（内罗毕羊病）和各种未分类的布尼亚病毒。沙粒病毒科提供了针对LCM和拉沙热病毒的抗原来源。抗原的另一个来源是博尔纳病毒（bornavirus）科。呼肠孤病毒科包括呼肠孤病毒属、轮状病毒属（其在儿童中引发急性胃肠炎）、环状病毒属和科罗拉多蜱热病毒属（科罗拉多蜱热，Lebombo（人）、马脑炎、蓝舌）。逆转录病毒科包括oncorivirinal亚科，其涵盖人和兽医疾病，如猫白血病病毒、HTLVI和HTLVII、慢病毒（其包括HIV、猴免疫缺陷病毒、猫免疫缺陷病毒、马传染性贫血病毒和泡沫病毒（spumavirinal））。乳头多瘤空泡病毒科包括多瘤病毒亚科（BKU和JCU病毒）和乳头瘤病毒亚科（与癌症或乳头瘤的恶性进展相关）。腺病毒科包括引起呼吸道疾病和/或肠炎的病毒（EX、AD7、ARD、O.B.）。细小病毒科包括猫细小病毒（猫肠炎）、猫泛白细胞减少症病毒、犬细小病毒和猪细小病毒。疱疹病毒科包括疱疹病毒α亚科，其涵盖单纯疱疹病毒属（HSVI、HSVII）、水痘病毒属（伪狂犬病、水痘带状疱疹）和疱疹病毒β亚科，其包括巨细胞病毒属（HCMV、鼠巨细胞病毒）以及疱疹病毒γ亚科，其包括淋巴滤泡病毒属、EBV（伯基特淋巴瘤）、人疱疹病毒6A、6B和7、卡波西肉瘤相关疱疹病毒和猕猴疱疹病毒（B病毒）、感染性鼻气管炎、马立克氏病病毒和细长病毒（rhadinovirus）。痘病毒科包括脊椎动物痘病毒（chordopoxvirinae）亚科，其涵盖正痘病毒属（大天花（天花）和牛痘（Cowpox））、副痘病毒属、禽痘病毒属、山羊痘病毒属、野兔痘病毒属、猪痘病毒属和昆虫痘病毒亚科。嗜肝DNA病毒科包括乙型肝炎病毒。可能是合适的抗原来源的一种未分类的病毒是丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒和朊病毒。作为抗原来源的另一种病毒是Nipan病毒。其它病毒来源可以包括禽类传染性法氏囊病以及猪呼吸生殖综合征病毒。甲病毒科包括马动脉炎病毒和各种脑炎病毒。
本公开还可以涵盖基于蛋白质的免疫原作为生物分子，其可用于使人类或非人动物免疫其他病原体，包括感染人类和非人脊椎动物的细菌、真菌、寄生微生物或多细胞寄生虫，或来自癌细胞或肿瘤细胞。细菌病原体的实例包括致病性革兰氏阳性球菌，包括肺炎球菌；葡萄球菌（和由此产生的毒素，例如肠毒素B）；和链球菌。致病性革兰氏阴性球菌包括脑膜炎球菌；淋病球菌。致病性肠道革兰氏阴性杆菌包括肠杆菌科；假单胞菌属、不动杆菌属（acinetobacteria）和艾肯氏菌属（Eikenella）；类鼻疽（melioidosis）；沙门氏菌属；志贺菌属；嗜血杆菌属；莫拉氏菌属；杜克雷嗜血杆菌（H. ducreyi）（其引起软下疳）；布鲁氏菌属（布鲁氏菌病）；野兔热杆菌（其引起野兔热）；鼠疫杆菌（鼠疫）和其它耶尔森氏菌（巴斯德菌属）；念珠状链杆菌和螺菌属；革兰氏阳性杆菌包括李斯特菌；猪红斑丹毒丝菌；白喉杆菌（白喉）；霍乱；炭疽杆菌（炭疽）；杜诺凡病（腹股沟肉芽肿）；和巴尔通体病。由致病性厌氧细菌引起的疾病包括破伤风；肉毒中毒（肉毒梭菌及其毒素）；产气荚膜梭菌及其ε毒素；其他梭菌；结核病；麻风；和其他分枝杆菌。致病性螺旋体病包括梅毒；密螺旋体病：雅司病、品他病和地方性梅毒；和钩端螺旋体病。由高致病性细菌和致病性真菌引起的其他感染包括鼻疽病（鼻疽菌）；放线菌病；诺卡菌病；隐球菌病、芽生菌病、组织胞浆菌病和球孢子菌病；念珠菌病、曲霉病和毛霉菌病；孢子丝菌病；副球孢子菌病、petriellidiosis、球拟酵母病、足分支菌病和着色真菌病；和皮肤癣菌病。立克次体感染包括斑疹伤寒、落基山斑疹热、Q热（伯氏考克斯氏体）和立克次氏体痘。支原体和衣原体感染的实例包括：肺炎支原体；性病性淋巴肉芽肿；鹦鹉热；和围产期衣原体感染。致病性真核生物涵盖致病性原生动物和蠕虫以及由此产生的感染，包括：阿米巴病；疟疾；利什曼病；锥虫病；弓形虫病（toxoplasmosis）；卡氏肺孢菌；鞭毛虫（Trichans）；弓形虫（Toxoplasma gondii）；巴贝虫病；贾第虫病；旋毛虫病；丝虫病；血吸虫病；线虫病；吸虫病（trematodes）或吸虫（fluke）；和绦虫（cestode/tapeworm）感染。
许多这些生物体和/或由此产生的毒素已被疾病控制中心[（CDC），健康和人类服务部，美国]鉴定为具有用于生物攻击的潜力的试剂。例如，这些生物制剂中的一些包括炭疽芽孢杆菌（炭疽）、肉毒梭菌及其毒素（肉毒中毒）、鼠疫杆菌（鼠疫）、大天花（天花）、野兔热杆菌（兔热病）和病毒出血热[丝状病毒（例如，埃博拉病毒、马尔堡病毒）和沙粒病毒[例如，拉沙热病毒、马秋波病毒]），所有这些目前都被分类为A类制剂；伯氏考克斯氏体（Q热）；布鲁氏菌属（布鲁氏菌病）、鼻疽菌（鼻疽病）、类鼻疽假单胞菌（类鼻疽）、蓖麻及其毒素（蓖麻毒素）、产气荚膜杆菌及其毒素（ε毒素）、葡萄球菌属及其毒素（肠毒素B）、鹦鹉热衣原体（鹦鹉热）、水安全威胁（例如，霍乱弧菌、小隐孢子虫）、斑疹伤寒（Richettsia powazekii）、和病毒性脑炎（甲病毒，例如委内瑞拉马脑炎；东部马脑炎；西部马脑炎）；所有这些目前均被分类为B类制剂；以及Nipan病毒和汉坦病毒，其目前均被分类为C类制剂。此外，被如此分类或不同地分类的其他生物体可以在将来被识别和/或用于这样的目的。容易理解的是，本文所述的病毒载体和其他构建体可用于递送来自这些生物体、病毒、它们的毒素或其他副产物的抗原，这将预防和/或治疗感染或与这些生物制剂的其他不良反应。
在某些实施方式中，所述生物分子是一种蛋白质，其为引发免疫应答（即消除细胞毒性T细胞）的T细胞可变区的区段。在类风湿性关节炎（RA）中，已经表征了疾病中涉及的的TCR的若干特定可变区。这些TCR包括V-3、V-14、V-17和V-17。因此，递送编码这些多肽中的至少一种的核酸序列将引发将靶向RA中涉及的T细胞的免疫应答。在多发性硬化（MS）中，已经表征了疾病中涉及的TCR的若干特定可变区。这些TCR包括V-7和V-10。因此，递送编码这些多肽中的至少一种的转基因将引发将靶向MS中涉及的T细胞的免疫应答。在硬皮病中，已经表征了疾病中涉及的TCR的若干特定可变区。这些TCR包括V-6、V-8、V-14和V-16、V-3C、V-7、V-14、V-15、V-16、V-28和V-12。因此，递送编码这些多肽中的至少一种的核酸分子将引发将靶向硬皮病中涉及的T细胞的免疫应答。
在具体实施方式中，所述生物分子通常在肝细胞中表达（例如，通常在肝细胞中以相对于其他细胞类型更高的水平表达）。在具体实施方式中，所述生物分子通常在肌细胞中表达（例如，通常在肌细胞中以相对于其他细胞类型更高的水平表达）。在具体实施方式中，所述生物分子通常在肾细胞中表达（例如，通常在肾细胞中以相对于其他细胞类型更高的水平表达）。在具体实施方式中，所述生物分子通常在肝细胞和肌细胞两者中表达（例如，在肝细胞和肌细胞两者中以相对于其他细胞类型更高的水平表达）。在具体实施方式中，所述生物分子通常在肝细胞和肾细胞两者中表达（例如，在肝细胞和肾细胞两者中以相对于其他细胞类型更高的水平表达）。在具体实施方式中，所述生物分子通常在肝细胞、肌细胞和肾细胞中表达（例如，在肝细胞、肌细胞和肾细胞中以相对于其他细胞类型更高的水平表达）。在具体实施方式中，所述生物分子在肝细胞中起作用（例如，对于肝细胞的正常功能是必需的或重要的）。在具体实施方式中，所述生物分子在肌细胞中起作用（例如，对于肌细胞的正常功能是必需的或重要的）。在具体实施方式中，所述生物分子在肾细胞中起作用（例如，对于肾细胞的正常功能是必需的或重要的）。在具体实施方式中，所述生物分子在肝细胞和肌细胞两者中起作用（例如，对于肝细胞和肌细胞两者的正常功能是必需的或重要的）。在具体实施方式中，所述生物分子在肝细胞和肾细胞两者中起作用（例如，对于肝细胞和肾细胞两者的正常功能是必需的或重要的）。在具体实施方式中，所述生物分子在肝细胞、肌细胞和肾细胞中起作用（例如，对于肝细胞、肌细胞和肾细胞的正常功能是必需的或重要的）。在具体实施方式中，本文所述的肌细胞是骨骼肌细胞（例如，二头肌、三头肌、四头肌、胫骨前肌、腓肠肌、腹直肌、膈肌和/或胸大肌细胞）和/或心肌细胞（例如，心房肌和/或心室肌细胞）。在特定实施方式中，肌肉可以用作生物分子的生产工厂，该生物分子从肌细胞分泌并最终被另一组织或器官的细胞吸收以发挥其治疗效果。
在具体实施方式中，本文所述的生物分子与溶酶体贮积症相关。在具体实施方式中，本文所述的生物分子中的缺陷是溶酶体贮积症的至少部分原因。在具体实施方式中，本文所述的生物分子的异常低表达或缺乏表达是溶酶体贮积症的至少部分原因。
在具体实施方式中，所述生物分子是一种蛋白质，其为α-半乳糖苷酶A（GLA）（优选人GLA）。在具体实施方式中，所述生物分子是一种蛋白质，其为清道夫受体B类成员2（SCARB2）（优选人SCARB2）。在具体实施方式中，所述生物分子是一种蛋白质，其为天冬氨酰氨基葡糖苷酶（AGA）（优选人AGA）。在具体实施方式中，所述生物分子是一种蛋白质，其为棕榈酰蛋白硫酯酶1（PPT1）（优选人PPT1）。在具体实施方式中，所述生物分子是一种蛋白质，其为三肽基肽酶1（TPP1）（优选人TPP1）。在具体实施方式中，所述生物分子是一种蛋白质，其为CLN3溶酶体/内体跨膜蛋白，battenin（CLN3）（优选人CLN3）。在具体实施方式中，所述生物分子是一种蛋白质，其为DnaJ热休克蛋白家族（Hsp40）成员C5（DNAJC5）（优选人DNAJC5）。在具体实施方式中，所述生物分子是一种蛋白质，其为CLN5细胞内运输蛋白（CLN5）（优选人CLN5）。在具体实施方式中，所述生物分子是一种蛋白质，其为CLN6跨膜ER蛋白（CLN6）（优选人CLN6）。在具体实施方式中，所述生物分子是一种蛋白质，其为含主要促进因子超家族结构域蛋白8（Major Facilitator Superfamily Domain Containing 8，MFSD8）（优选人MFSD8）。在具体实施方式中，所述生物分子是一种蛋白质，其为CLN8跨膜ER和ERGIC蛋白（CLN8）（优选人CLN8）。在具体实施方式中，所述生物分子是一种蛋白质，其为组织蛋白酶D（CTSD）（优选人CTSD）。在具体实施方式中，所述生物分子是一种蛋白质，其为颗粒蛋白前体（GRN）（优选人GRN）。在具体实施方式中，所述生物分子是一种蛋白质，其为ATP酶阳离子转运13A2（ATP13A2）（优选人ATP13A2）。在具体实施方式中，所述生物分子是一种蛋白质，其为组织蛋白酶F（CTSF）（优选人CTSF）。在具体实施方式中，所述生物分子是一种蛋白质，其为含钾通道四聚体结构域蛋白7（Potassium Channel TetramerizationDomain Containing 7，KCTD7）（优选人KCTD7）。在具体实施方式中，所述生物分子是一种蛋白质，其为cystinosin，溶酶体胱氨酸转运蛋白（CTNS）（优选人CTNS）。在具体实施方式中，所述生物分子是一种蛋白质，其为溶酶体相关膜蛋白2（LAMP2）（优选人LAMP2）。在具体实施方式中，所述生物分子是一种蛋白质，其为N-酰基鞘氨醇酰氨水解酶1（ASAH1）（优选人ASAH1）。在具体实施方式中，所述生物分子是一种蛋白质，其为α-L-岩藻糖苷酶1（FUCA1）（优选人FUCA1）。在具体实施方式中，所述生物分子是一种蛋白质，其为组织蛋白酶A（CTSA）（优选人CTSA）。在具体实施方式中，所述生物分子是一种蛋白质，其为β-葡糖脑苷脂酶（GBA）（优选人GBA）。在具体实施方式中，所述生物分子是一种蛋白质，其为酸性α-葡糖苷酶（GAA）（优选人GAA）。在具体实施方式中，所述生物分子是一种蛋白质，其为肌球蛋白VA（MYO5A）（优选人MYO5A）。在具体实施方式中，所述生物分子是一种蛋白质，其为RAS癌基因家族成员RAB27A（RAB27A, Member RAS Oncogene Family，RAB27A）（优选人RAB27A）。在具体实施方式中，所述生物分子是一种蛋白质，其为溶酶体运输调节因子（LYST）（优选人LYST）。在具体实施方式中，所述生物分子是一种蛋白质，其为半乳糖苷酶β1（GLB1）（优选人GLB1）。在具体实施方式中，所述生物分子是一种蛋白质，其为己糖胺酶亚基α（HEXA）（优选人HEXA）。在具体实施方式中，所述生物分子是一种蛋白质，其为己糖胺酶亚基β（HEXB）（优选人HEXB）。在具体实施方式中，所述生物分子是一种蛋白质，其为神经节苷脂GM2激活剂（GM2A）（优选人GM2A）。在具体实施方式中，所述生物分子是一种蛋白质，其为HPS1溶酶体细胞器生物发生复合体3亚基1（HPS1 biogenesis of lysosomal organelles complex 3subunit 1，HPS1）（优选人HPS1）。在具体实施方式中，所述生物分子是一种蛋白质，其为衔接因子相关蛋白复合体3亚基β1（AP3B1或HPS2）（优选人HPS2）。在具体实施方式中，所述生物分子是一种蛋白质，其为HPS3溶酶体细胞器生物发生复合体2亚基1（HPS3）（优选人HPS3）。在具体实施方式中，所述生物分子是一种蛋白质，其为HPS4溶酶体细胞器生物发生复合体3亚基2（HPS4）（优选人HPS4）。在具体实施方式中，所述生物分子是一种蛋白质，其为HPS5溶酶体细胞器生物发生复合体2亚基2（HPS5）（优选人HPS5）。在具体实施方式中，所述生物分子是一种蛋白质，其为HPS6溶酶体细胞器生物发生复合体2亚基3（HPS6）（优选人HPS6）。在具体实施方式中，所述生物分子是一种蛋白质，其为营养不良短小蛋白结合蛋白1（dystrobrevin binding protein 1）（DTNBP1或HPS7）（优选人HPS7）。在具体实施方式中，所述生物分子是一种蛋白质，其为溶酶体细胞器生物发生复合体1亚基3（biogenesis oflysosomal organelles complex 1 subunit 3）（BLOC1S3或HPS8）（优选人HPS8）。在具体实施方式中，所述生物分子是一种蛋白质，其为溶酶体细胞器生物发生复合体1亚基6（BLOC1S6或HPS9）（优选人HPS9）。在具体实施方式中，所述生物分子是一种蛋白质，其为半乳糖神经酰胺酶（GALC）（优选人GALC）。在具体实施方式中，所述生物分子是一种蛋白质，其为甘露糖苷酶α 2B类成员1（MAN2B1）（优选人MAN2B1）。在具体实施方式中，所述生物分子是一种蛋白质，其为甘露糖苷酶β（MANBA）（优选人MANBA）。在具体实施方式中，所述生物分子是一种蛋白质，其为芳基硫酸酯酶A（ARSA）（优选人ARSA）。在具体实施方式中，所述生物分子是一种蛋白质，其为N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶亚基α和β（GNPTAB）（优选人GNPTAB）。在具体实施方式中，所述生物分子是一种蛋白质，其为N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶亚基α和β（GNPTAB）（优选人GNPTAB）。在具体实施方式中，所述生物分子是一种蛋白质，其为N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶亚基γ（GNPTG）（优选人GNPTG）。在具体实施方式中，所述生物分子是一种蛋白质，其为粘脂蛋白TRP阳离子通道1（MCOLN1）（优选人MCOLN1）。在具体实施方式中，所述生物分子是一种蛋白质，其为α-L-艾杜糖醛酸酶（IDUA）（优选人IDUA）。在具体实施方式中，所述生物分子是一种蛋白质，其为艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶（IDS）（优选人IDS）。在具体实施方式中，所述生物分子是一种蛋白质，其为N-磺氨基葡糖磺基氢化酶（SGSH）（优选人SGSH）。在具体实施方式中，所述生物分子是一种蛋白质，其为N-乙酰基-α-氨基葡萄糖苷酶（NAGLU）（优选人NAGLU）。在具体实施方式中，所述生物分子是一种蛋白质，其为乙酰肝素-α-氨基葡萄糖N-乙酰转移酶（HGSNAT）（优选人HGSNAT）。在具体实施方式中，所述生物分子是一种蛋白质，其为葡糖胺(N-乙酰基)-6-硫酸酯酶（GNS）（优选人GNS）。在具体实施方式中，所述生物分子是一种蛋白质，其为半乳糖胺(N-乙酰基)-6-硫酸酯酶（GALNS）（优选人GALNS）。在具体实施方式中，所述生物分子是一种蛋白质，其为半乳糖苷酶β1（GLB1）（优选人GLB1）。在具体实施方式中，所述生物分子是一种蛋白质，其为芳基硫酸酯酶B（ARSB）（优选人ARSB）。在具体实施方式中，所述生物分子是一种蛋白质，其为β-葡萄糖醛酸酶（GUSB）（优选人GUSB）。在具体实施方式中，所述生物分子是一种蛋白质，其为透明质酸酶1（HYAL1）（优选人HYAL1）。在具体实施方式中，所述生物分子是一种蛋白质，其为硫酸酯酶修饰因子1（SUMF1）（优选人SUMF1）。在具体实施方式中，所述生物分子是一种蛋白质，其为鞘磷脂磷酸二酯酶1（SMPD1）（优选人SMPD1）。在具体实施方式中，所述生物分子是一种蛋白质，其为NPC细胞内胆固醇转运蛋白1（NPC1）（优选人NPC1）。在具体实施方式中，所述生物分子是一种蛋白质，其为NPC细胞内胆固醇转运蛋白2（NPC2）（优选人NPC2）。在具体实施方式中，所述生物分子是一种蛋白质，其为溶质载体家族17成员5（SLC17A5）（优选人SLC17A5）。在具体实施方式中，所述生物分子是一种蛋白质，其为α-N-乙酰半乳糖胺酶（NAGA）（优选人NAGA）。在具体实施方式中，所述生物分子是一种蛋白质，其为神经氨酸酶1（NEU1）（优选人NEU1）。在具体实施方式中，所述生物分子是一种蛋白质，其为脂肪酶A，溶酶体酸型（LIPA）（优选人LIPA）。在具体实施方式中，所述生物分子是一种蛋白质，其为运动神经元生存（SMN）蛋白（优选人SMN蛋白）。在具体实施方式中，所述生物分子是一种蛋白质，其为微抗肌萎缩蛋白（优选人微抗肌萎缩蛋白）。在具体实施方式中，所述生物分子是一种蛋白质，其为苯丙氨酸羟化酶（PAH）（优选人PAH）。在具体实施方式中，所述生物分子是一种蛋白质，其为凝血因子VIII（FVIII）（优选人FVIII）。在具体实施方式中，所述生物分子是一种蛋白质，其为凝血因子IX（FIX）（优选人FIX）。在优选的实施方式中，所述生物分子是功能性蛋白质（例如野生型蛋白质）。
5.2.5调节控制元件
调节控制元件包括与编码感兴趣的生物分子的核苷酸序列连续的表达控制元件和以反式或顺式但远距离作用以控制感兴趣的生物分子表达的表达控制元件。
表达控制元件包括但不限于适当的转录起始、终止、启动子和增强子序列；聚腺苷酸化（polyA）信号；稳定细胞质mRNA的序列；增强翻译效率的序列（即Kozak共有序列）；增强蛋白质稳定性的序列；分泌信号；和核定位序列。
在各种实施方式中，所述调节控制元件是启动子。在某些实施方式中，所述启动子是组成型启动子。在某些实施方式中，所述启动子是诱导型启动子。在某些实施方式中，所述启动子是编码生物分子的核苷酸序列的天然启动子。在某些实施方式中，所述启动子是组织特异性启动子。在优选的实施方式中，组织特异性启动子是肝细胞（即肝脏）特异性启动子。在具体实施方式中，所述组织特异性启动子是肝细胞（即，肝脏）-肌细胞（即，肌肉）双特异性启动子。在具体实施方式中，所述组织特异性启动子是肝细胞（即，肝脏）-肾脏双特异性启动子。在具体实施方式中，所述组织特异性启动子是肝细胞（即，肝脏）-肌细胞（即，肌肉）-肾脏多特异性启动子。所述肌肉可以是心肌（例如，心房肌和/或心室肌）和/或骨骼肌（例如，二头肌、三头肌、四头肌、胫骨前肌、腓肠肌、腹直肌、膈肌、胸大肌）。
调节控制元件的更多描述在第5.1节和第5.3节中提供。
5.3载体、基因递送系统和病毒颗粒
本公开还提供了与上述核苷酸序列、多核苷酸、启动子和/或表达盒相关的载体和基因递送系统。
在一个方面，本文提供了包含本文所述的多核苷酸（例如，第5.2.1节中所述的多核苷酸）的载体。
在一个方面，本文提供了包含本文所述的启动子（例如，第5.2.2节中所述的启动子）的载体。
在一个方面，本文提供了包含本文所述的表达盒（例如，第5.2.3节中所述的表达盒）的载体。
在各种实施方式中，本文所述的载体是质粒。在各种实施方式中，本文所述的载体是表达载体。
在各种实施方式中，本文所述的载体是重组病毒载体。在各种实施方式中，本文所述的载体是重组AAV载体。
载体的更多描述在本节下文和第5.1节中提供。
本文提供的基因递送系统包括重组病毒颗粒，例如重组AAV颗粒和非病毒基因递送系统。
病毒颗粒由包封在称为衣壳的蛋白质外壳中的病毒基因组组成。“AAV颗粒”是指由至少一种AAV衣壳蛋白和被包装的AAV基因组组成的AAV病毒。AAV基因组是线性单链DNA分子，其在病毒基因组的5’和3’端含有末端反向重复序列（ITR）。ITR作为DNA复制的起点和病毒基因组的包装信号起顺式作用。
在一个方面，本文提供了包含本文所述的多核苷酸（例如，第5.2.1节中所述的多核苷酸）的重组病毒颗粒。
在一个方面，本文提供了包含重组病毒基因组的重组病毒颗粒，所述重组病毒基因组包含本文所述的表达盒（例如，第5.2.3节中所述的表达盒）。
在一个方面，本文提供了包含本文所述的载体（例如，本节中所述的载体）的重组病毒颗粒。
在一个方面，本文提供了重组AAV颗粒，其包含：（a）AAV衣壳；和（b）重组AAV基因组，其包含侧接AAV末端反向重复序列（ITR）的本文所述的表达盒（例如，第5.2.3节中所述的表达盒）。
已经开发了许多基于病毒的系统用于将基因转移到哺乳动物细胞中。病毒载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、牛痘载体、单纯疱疹病毒载体、及其衍生物。病毒载体技术在本领域中是众所周知的，并且例如在Green和Sambrook， Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4thEd., Cold SpringHarbor Laboratory （Cold Spring Harbor, N.Y. 2012）以及其他病毒学和分子生物学手册中描述。
在某些实施方式中，本文提供的病毒载体或病毒颗粒源自腺病毒。示例性载体基于或衍生自HAd5、ChAd3、HAd26、HAd6、AdCH3NSmut、HAd35、ChAd63、HAd4、rcAd26。重组腺病毒载体可以根据本领域已知的方法构建。参见例如O’Connor等，Virology，217(1):11-22(1996)；Hardy等，Journal of Virology，73(9):7835-7841 (1999)；Hardy等，Journal of Virology，71(3):1842-1849(1997)。在一些实施方式中，第三代腺病毒载体（也称为“高容量腺病毒载体”（HCAds）、辅助依赖性或“Gutless”腺病毒载体）在本文中可用于递送更长的序列。在一些实施方式中，将感兴趣的核酸构建体克隆到仅含有ITR和包装信号的腺病毒载体中。辅助腺病毒载体可以共转染到HEK细胞中以产生腺病毒颗粒。参见Lee等，Genes and Diseases，4(2):43-63 (2007)。
在某些实施方式中，本文提供的病毒载体或病毒颗粒源自慢病毒。示例性载体基于或源自HIV-1、HIV-2、SIVSM、SIVAGM、EIAV、FIV、VNV、CAEV或BIV。慢病毒载体可以根据本领域已知的方法生产，例如，如Chribs等，BMC Biotechnology，13:98(2003)；Merten等，Mol Ther Methods Clin Dev.，13(3):16017(2016)；Durand和Cimarelli，Viruses，3:132-159(2011)中所述。在一些实施方式中，本文使用第三代自失活慢病毒载体。
在某些实施方式中，本文提供的病毒载体或病毒颗粒源自单纯疱疹病毒（HSV）。在一些实施方式中，所述单纯疱疹病毒是单纯疱疹1型病毒（HSV-1）、单纯疱疹2型病毒（HSV-2）、或其任意衍生物。示例性载体基于或源自HSV-1、HSV-2、CMV、VZV、EBV和KSHV。基于HSV的载体可以根据本领域已知的方法构建，例如，如美国专利第7,078,029号、第6,261,552号、第5,998,174号、第5,879,934号、第5,849,572号、第5,849,571号、第5,837,532号、第5,804,413号和第5,658,724号，以及国际专利申请WO 91/02788、WO 96/04394、WO 98/15637和WO 99/06583中所述，其全部内容通过引用并入本文。
在一些实施方式中，本文提供的基于HSV的载体是扩增子载体。在其他实施方式中，本文提供的基于HSV的载体是复制缺陷型载体（replication-defective vector）。在其他实施方式中，本文提供的基于HSV的载体是复制型载体（replication-competentvector）。
扩增子是质粒衍生的载体，其被工程化以含有HSV DNA复制起点（ori）和HSV切割-包装识别序列（pac）。当扩增子被转染到具有HSV辅助功能的哺乳动物细胞中时，它们被复制，形成头-尾连接的多联体，然后被包装到病毒颗粒中。目前有两种主要方法用于生产扩增子颗粒，一种基于缺陷型辅助HSV感染，另一种基于HSV-1基因的转染，例如一组pac缺失的重叠粘性质粒或pac缺失和ICP27缺失的BAC-HSV-1。在一些实施方式中，本文使用的扩增子可以容纳外来DNA的大片段（例如，至多152 kb），包括转基因的多个拷贝（例如，至多15个拷贝），并且是无毒的。
在一些实施方式中，本文所用的基于HSV的载体缺乏至少一种必需HSV基因，并且基于HSV的载体还可包含非必需基因的一个或多个缺失。在一些实施方式中，基于HSV的载体是复制缺陷型的。大多数复制缺陷型基于HSV的载体含有缺失以去除一个或多个即刻早期、早期或晚期HSV基因以防止复制。在其他实施方式中，基于HSV的载体缺乏选自由ICP0、ICP4、ICP22、ICP27、ICP47及其组合组成的组的即刻早期基因。在具体的实施方式中，基于HSV的载体对于ICP0、ICP4、ICP22、ICP27和ICP47全部是缺陷型的。示例性复制型载体包括NV-1020（HSV-1）、RAV9395（HSV-2）、AD-472（HSV-2）、NS-gEnull（HSV-1）和ImmunoVEX（HSV2）。示例性复制缺陷型载体包括dl5-29（HSV-2）、dl5-29-41L（HSV-1）、DISC-dH （HSV-1and HSV-2）、CJ9gD（HSV-1）、TOH-OVA（HSV-1）、d106（HSV-1）、d81（HSV-1）、HSV-SIV d106（HSV-1）和d106（HSV-1）。
复制缺陷型基于HSV的载体通常在补足细胞系中生产，所述补足细胞系提供在复制缺陷型基于HSV的载体中不存在但病毒增殖所需的适当水平的基因功能，以便产生高滴度的病毒载体储备。示例性细胞系补足不存在于复制缺陷型基于HSV的载体中的至少一种，并且在一些实施方式中，所有复制必需基因功能。例如，ICP0、ICP4、ICP22、ICP27和ICP47缺陷型基于HSV的载体可由人骨肉瘤细胞系U2OS补足。细胞系还可以补足当缺失时降低生长或复制效率的非必需基因（例如，UL55）。补足细胞系可以对由早期区域、即刻早期区域、晚期区域、病毒包装区域、病毒相关区域或其组合编码的至少一种复制必需基因功能的缺陷进行补足，包括所有HSV功能（例如，以使得包括最小HSV序列（例如仅末端反向重复序列和包装信号或仅ITR和HSV启动子）的HSV扩增子能够增殖）。在一些实施方式中，细胞系的进一步特征在于，其含有与基于HSV的载体的非重叠方式的补足基因，这最小化并且实际上消除了基于HSV的载体基因组与细胞DNA重组的可能性。因此，如果在载体库中没有避免，则有复制能力的HSV的存在被最小化，因此，这适用于某些治疗目的，尤其是基因治疗目的。补足细胞系的构建涉及本领域公知的标准分子生物学和细胞培养技术。
在某些实施方式中，本文提供的病毒载体或病毒颗粒源自腺相关病毒（AAV）。与AAV相关的更详细描述在下文第5.3.1节中提供。
本文所述的核苷酸序列、启动子、表达盒可以使用本领域任何已知的分子克隆方法克隆到病毒载体中，包括例如使用限制性内切核酸酶位点和一个或多个选择标记。
在一个实施方式中，病毒载体基因组包含至少一个增强转基因靶标特异性和表达的元件（参见例如Powell等,Viral Expression Cassette Elements to EnhanceTransgene Target Specificity and Expression in Gene Therapy, 2015；其内容通过引用整体并入本文），例如内含子或具有来自哺乳动物基因组的修饰序列的合成内含子。内含子的非限制性实例包括MVM（67-97 bps）、F.IX截短型内含子1（300 bps）、β-球蛋白SD/免疫球蛋白重链剪接受体（250 bps）、腺病毒剪接供体/免疫球蛋白剪接受体（500 bps）、SV40晚期剪接供体/剪接受体（19S/16S）（180 bps）和杂合腺病毒剪接供体/IgG剪接受体（230bps）。在一个实施方式中，所述内含子的长度可以是100-500个核苷酸。内含子的长度可以为80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490或500。
在一些实施方式中，所述病毒载体还含有选择标志基因或报告基因，以从通过病毒载体转染的宿主细胞群中选择表达蛋白质的细胞。选择标记和报告基因两者可以侧接有适当的调节序列，以使得能够在宿主细胞中表达。例如，病毒载体可以含有可用于调节核酸序列表达的转录和翻译终止子、起始序列和启动子。
本文提供的非病毒基因递送系统包括但不限于基于脂质的基因递送系统（例如，基于脂质体的基因递送系统）、基于肽的基因递送系统、无机基因递送系统和聚合物递送系统。非限制性示例性非病毒基因递送系统描述于例如Sung和Kim，2019，Biomater Res 23:8；Zu和Gao，2021，AAPS J 23:78；以及Lan等，2022，Mol Cancer 21:71；其各自以其整体并入本文。
在一个方面，本文提供了包含本文所述的多核苷酸（例如，第5.2.1节中所述的多核苷酸）的非病毒基因递送系统。
在一个方面，本文提供了包含多核苷酸的非病毒基因递送系统，所述多核苷酸包含编码本文所述的表达盒（例如，第5.2.3节中所述的表达盒）的核苷酸序列。
在一个方面，本文提供了包含本文所述的载体（例如，本节中所述的载体）的非病毒基因递送系统。
5.3.1AAV载体和AAV颗粒
任意AAV血清型或其变体可用于本公开。AAV血清型可以包括但不限于AAV1（Genbank Accession No. NC_002077.1；HC000057.1）、AAV2（Genbank Accession No. NC_001401.2, JC527779.1）、AAV2i8（Asokan, A., 2010, Discov. Med. 9:399）、AAV3（Genbank Accession No. NC_001729.1）、AAV3-B（Genbank Accession No. AF028705.1）、AAV4（Genbank Accession No. NC_001829.1）、AAV5（Genbank Accession No. NC_006152.1；JC527780.1）、AAV6（Genbank Accession No. AF028704.1；JC527781.1）、AAV7（Genbank Accession No. NC_006260.1；JC527782.1）、AAV8（Genbank Accession No. NC_006261.1；JC527783.1）、AAV9（Genbank Accession No AX753250.1；JC527784.1）、AAV10（Genbank Accession No AY631965.1）、AAVrh10（Genbank Accession No. AY243015.1）、AAV11（Genbank Accession No AY631966.1）、AAV12（Genbank Accession NoDQ813647.1）、AAV13（Genbank Accession No EU285562.1）、AAV LK03、AAVrh74、AAV DJ（WuZ, et al., J Virol. 80:11393–7（2006））、AAVAnc81、Anc82、Anc83、Anc84、Anc110、Anc113、Anc126或Anc127（Zin, E. et al., Cell. Rep. 12:1056（2016））、AAV_go.1（Arbetum, A.E. et al., J. Virol. 79:15238（2005））、AAVhu.37、AAVrh8、AAVrh8R和AAVrh.8（Wang et al., Mol. Ther. 18:119-125（2010）或其变体。
AAV变体包括但不限于AAV1变体（例如，包含AAV1变体衣壳蛋白的AAV）、AAV2变体（例如，包含AAV2变体衣壳蛋白的AAV）、AAV3变体（例如，包含AAV3变体衣壳蛋白的AAV）、AAV3-B变体（例如，包含AAV3-B变体衣壳蛋白的AAV）、AAV4变体（例如，包含AAV4变体衣壳蛋白的AAV）、AAV5变体（例如，包含AAV5变体衣壳蛋白的AAV）、AAV6变体（例如，包含AAV6变体衣壳蛋白的AAV）、AAV7变体（例如，包含AAV7变体衣壳蛋白的AAV）、AAV8变体（例如，包含AAV8变体衣壳蛋白的AAV）、AAVrh8、AAVrh8R（例如，包含AAVrh8或AAVrh8R变体衣壳蛋白的AAV）、AAV9变体（例如，包含AAV9变体衣壳蛋白的AAV）、AAV10变体（例如，包含AAV10变体衣壳蛋白的AAV）、AAVrh10变体（例如，包含AAVrh10变体衣壳蛋白的AAV）、AAV11变体（例如，包含AAV11变体衣壳蛋白的AAV）、AAV12变体（例如，包含AAV12变体衣壳蛋白的AAV）、AAV13变体（例如，包含AAV13变体衣壳蛋白的AAV）、AAV LK03变体（例如，包含AAV LK03变体衣壳蛋白的AAV）、AAVrh74变体（例如，包含AAVrh74变体衣壳蛋白的AAV）。
本公开中使用的重组AAV（rAAV）载体可以根据已知技术构建。在一些实施方式中，构建rAAV载体以包括在转录方向上可操作地连接的组分。控制元件可包括本文提供的重组启动子、应答元件、转录起始区和转录终止区。可以基于感兴趣的细胞来选择控制元件。在一些实施方式中，所得包含可操作地连接的组分的rAAV载体构建体侧接（5’和3’）有功能性AAV ITR序列。在一些实施方式中，所得rAAV载体可具有结构为（5’AAV ITR）-（启动子）-感兴趣的转基因）-（3’AAV ITR）的基因组。
在某些实施方式中，本文所述的启动子与至少一个另外的调节序列可操作地连接。在某些实施方式中，调节序列可以例如包括增强子序列，例如上游增强子序列（USE），RNA处理信号，例如剪接信号、聚腺苷酸化信号序列、稳定细胞质mRNA的序列，转录后调节元件（PRE）和/或microRNA（miRNA）靶序列。在某些实施方式中，调节序列可以包括增强翻译效率的序列（例如，Kozak序列）、增强蛋白质稳定性的序列和/或增强蛋白质加工和/或分泌的序列。在一些实施方式中，所包括的调节序列在体内促进与本文所述启动子可操作地连接的转基因的转录或表达。调节序列可以包含通常与感兴趣的转基因相关的控制序列或可选地异源控制序列。
在某些实施方式中，调节序列包含调节控制元件。在某些实施方式中，所述调节控制元件是转基因的5’（即，存在于5’非翻译区；5’UTR）。在其他实施方式中，所述调节控制元件是转基因的3’（即，存在于3’非翻译区；3’UTR）。在某些实施方式中，所述调节序列包含多于一个调节控制元件，例如可以包含两个、三个、四个或五个控制元件。在调节序列包含多于一个控制元件的情况下，每个控制元件可以独立地是本文所述的启动子的5’、3’、侧翼或内部。
在某些实施方式中，所述病毒载体可以包含至少一个聚腺苷酸化（polyA）信号序列，其是本领域公知的。在存在聚腺苷酸化序列的情况下，它通常位于转基因的3’端和3’ITR的5’端之间。在某些实施方式中，所述病毒载体还在polyA信号序列的5’包含polyA上游增强子序列。在某些情况下，所述调节序列是提高翻译效率的序列，例如Kozak序列。
在某些实施方式中，所述病毒载体包含内含子。在某些实施方式中，所述内含子存在于转基因内。在某些实施方式中，所述内含子是转基因的5'或3'。在某些实施方式中，所述内含子侧接转基因的5’或3’端。在某些实施方式中，所述核酸构建体包含两个内含子。在一些实施方式中，一个内含子是转基因的5'，一个内含子是转基因的3'。在某些实施方式中，一个内含子侧接转基因的5’端，第二个内含子侧接转基因的3’端。在某些实施方式中，所述内含子是SV40内含子，例如5’ UTR SV40内含子。
本领域已知的AAV ITR序列可用于本发明的rAAV载体。在一些实施方式中，用于本发明载体的AAV ITR具有野生型核苷酸序列。在其他实施方式中，本发明载体中使用的AAVITR序列不是野生型序列，而是包含例如核苷酸的插入、缺失或取代。本文提供的AAV ITR可以源自任意AAV血清型，包括但不限于AAV1、AAV2、AAV2i8、AAV3、AAV3-B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV-DJ、AAVLK03、AAVrh74、AAV44-9或其变体。
在一些实施方式中，所述rAAV载体包含来自AAV1的ITR。在一些实施方式中，所述rAAV载体包含来自AAV2的ITR。在一些实施方式中，所述rAAV载体包含来自AAV2i8的ITR。在一些实施方式中，所述rAAV载体包含来自AAV3的ITR。在一些实施方式中，所述rAAV载体包含来自AAV3-B的ITR。在一些实施方式中，所述rAAV载体包含来自AAV4的ITR。在一些实施方式中，所述rAAV载体包含来自AAV5的ITR。在一些实施方式中，所述rAAV载体包含来自AAV6的ITR。在一些实施方式中，所述rAAV载体包含来自AAV7的ITR。在一些实施方式中，所述rAAV载体包含来自AAV8的ITR。在一些实施方式中，所述rAAV载体包含来自AAVrh8的ITR。在一些实施方式中，所述rAAV载体包含来自AAVrh8R的ITR。在一些实施方式中，所述rAAV载体包含来自AAV9的ITR。在一些实施方式中，所述rAAV载体包含来自AAV10的ITR。在一些实施方式中，所述rAAV载体包含来自AAVrh10的ITR。在一些实施方式中，所述rAAV载体包含来自AAV11的ITR。在一些实施方式中，所述rAAV载体包含来自AAV12的ITR。在一些实施方式中，所述rAAV载体包含来自AAV13的ITR。在一些实施方式中，所述rAAV载体包含来自AAV-DJ的ITR。在一些实施方式中，所述rAAV载体包含来自AAV LK03的ITR。在一些实施方式中，所述rAAV载体包含来自AAVrh74的ITR。
在一些实施方式中，侧接于本文提供的rAAV载体中的核苷酸序列的5’和3’ITR是相同的并且源自相同的AAV血清型。在其他实施方式中，侧接于本文提供的rAAV载体中的核苷酸序列的5’和3’ ITR是不同的和/或源自不同的AAV血清型。
在一些实施方式中，包含侧接有AAV ITR的感兴趣的表达盒的rAAV载体可以通过将感兴趣的盒直接插入AAV基因组，例如插入切除的AAV开放阅读框中而构建，并且AAV基因组的某些部分可以任选地缺失，如WO 1993/003769；Kotin （1994） Human Gene Therapy5:793-801；Shelling和Smith （1994） Gene Therapy 1:165-169；以及Zhou等（1994） J.Exp. Med. 179:1867-1875中所述。
在其他实施方式中，从AAV基因组或从含有此类ITR的AAV载体切除AAV ITR，然后使用标准连接技术将其与存在于另一个载体中的感兴趣的表达盒的5’和3’融合。
在某些实施方式中，本文提供的rAAV载体包含重组自补足基因组。包含自补足基因组的rAAV通常可以通过其部分补足序列（例如，补足转基因的编码链和非编码链）快速形成双链DNA分子。更具体地，在一些实施方式中，本文提供的rAAV载体包含rAAV基因组，其包含第一异源多核苷酸序列（例如，治疗性转基因编码链）和第二异源多核苷酸序列（例如，治疗性转基因的非编码或反义链），并且第一异源多核苷酸序列可以与第二多核苷酸序列形成链内碱基对。在一些实施方式中，第一异源多核苷酸序列和第二异源多核苷酸序列通过促进链内碱基配对的序列（例如发夹DNA结构）连接。在一些实施方式中，第一异源多核苷酸序列和第二异源多核苷酸序列通过突变的ITR连接，使得rep蛋白不在突变的ITR处切割病毒基因组。包含自互补基因组的rAAV载体可以使用本领域已知的方法制备，例如，如美国专利号7,125,717；7,785,888；7,790,154；7,846,729；8,093,054；和8,361,457中所述。
在一些实施方式中，本文提供的rAAV载体中的重组病毒基因组的大小小于约5千碱基（kb）。在一些实施方式中，本文提供的rAAV载体中的重组病毒基因组的大小小于约4.5kb。在一些实施方式中，本文提供的rAAV载体中的重组病毒基因组的大小小于约4.0 kb。在一些实施方式中，本文提供的rAAV载体中的重组病毒基因组的大小小于约3.5 kb。在一些实施方式中，本文提供的rAAV载体中的重组病毒基因组的大小小于约3.0 kb。在一些实施方式中，本文提供的rAAV载体中的重组病毒基因组的大小小于约2.5 kb。
衣壳蛋白可以源自与ITR相同的血清型或其衍生物。衣壳也可以是与ITR不同的血清型。例如，在某些实施方式中，AAV颗粒包含AAV2 ITR和AAV6衣壳（AAV 2/6）、AAV2 ITR和AAV7衣壳（AAV 2/7）、AAV2 ITR和AAV8衣壳（AAV 2/8）或AAV2 ITR和AAV9衣壳（AAV 2/9）。
天然存在的AAV衣壳包含AAV VP1、VP2和VP3衣壳蛋白，其各自由AAV cap基因的剪接变体编码。通常，AAV颗粒包含三种蛋白质VP1、VP2和VP3，其中VP2和VP3是VP1的截短形式，因此具有也包含VP1中的序列。通常，VP1的氨基酸序列定义衣壳的血清型。因此，例如，如果VP1衣壳蛋白编码AAV2 VP1蛋白，则AAV将是AAV2血清型，而如果VP1衣壳蛋白编码AAV9VP1蛋白，则AAV将是AAV9血清型。
通常，AAV衣壳蛋白包含多个可变区（VR）和位于可变区之间的恒定区。“GH环”是指在AAV衣壳蛋白的内部β-桶内侧接β-链G和β-链H的环序列，并且包含可变区VR IV至VRVIII。
VP2和VP3衣壳蛋白的序列以及各种结构域（例如可变区和GH环）的位置可以由技术人员通过本领域已知的合适方法从给定的VP1序列容易地和常规地确定，诸如，通过使用合适的算法将VP1序列与注释的VP1序列（优选地，来自密切相关的AAV物种的注释的VP1序列）进行比较或比对。优选地，这种带注释的VP1序列是带注释的野生型AAV VP1序列。
在一些实施方式中，本发明rAAV颗粒中的AAV衣壳蛋白（例如，VP1、VP2和/或VP3）不是天然存在的衣壳蛋白。在一些实施方式中，AAV衣壳蛋白（例如，VP1、VP2和/或VP3）衍生自天然存在的衣壳蛋白。
在一些实施方式中，所述AAV衣壳蛋白是VP1衣壳蛋白。在其他实施方式中，所述AAV衣壳蛋白是VP2衣壳蛋白。在其他实施方式中，所述AAV衣壳蛋白是VP3衣壳蛋白。在一些实施方式中，所述rAAV颗粒包含VP1衣壳蛋白、VP2衣壳蛋白和/或VP3衣壳蛋白。在其他实施方式中，所述rAAV颗粒包含VP1衣壳蛋白、VP2衣壳蛋白和VP3衣壳蛋白。在一些实施方式中，所述rAAV颗粒包含VP1衣壳蛋白、VP2衣壳蛋白和/或VP3衣壳蛋白，其中所述rAAV颗粒的衣壳蛋白具有相同的血清型。在其他实施方式中，所述rAAV颗粒包含VP1衣壳蛋白、VP2衣壳蛋白和VP3衣壳蛋白，其中所述AAV颗粒的衣壳蛋白具有相同的血清型。
在某些方面，所述衣壳蛋白是变体衣壳蛋白。与相应的参考衣壳蛋白（例如天然存在的亲本衣壳蛋白，即其来源的衣壳蛋白）相比，变体衣壳蛋白可以包含一个或多个突变，例如氨基酸取代、氨基酸缺失和异源肽插入。在一些实施方式中，AAV衣壳蛋白的氨基酸序列与野生型或参照或亲本AAV衣壳蛋白的氨基酸序列相同，除了1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸残基，例如除了1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸残基取代。在一些实施方式中，本文所述的衣壳蛋白或AAV颗粒可以分别是嵌合衣壳蛋白或AAV颗粒，其分别包含两种或更多种AAV血清型衣壳蛋白或颗粒的蛋白质序列。
在各种实施方式中，本文所述的变体AAV衣壳蛋白是变体AAV VP1衣壳蛋白。本文还描述了变体AAV衣壳蛋白，其是本文所述的VP1衣壳蛋白的VP2和VP3对应物。本文还描述了此类变体AAV衣壳蛋白的片段（例如，VP1、VP2或VP3衣壳蛋白的片段），包括但不限于可变区（例如，VR IV和VR VIII）、GH环和基本上保留相应衣壳蛋白的生物活性及其相关组织趋向性的功能片段。在某些实施方式中，本文所述的VP1、VP2或VP3衣壳蛋白的片段长度为至少7个氨基酸。在某些实施方式中，本文所述的VP1、VP2或VP3衣壳蛋白的片段长度为至少8个氨基酸。在某些实施方式中，本文所述的VP1、VP2或VP3衣壳蛋白的片段长度为至少9个氨基酸。在某些实施方式中，本文所述的VP1、VP2或VP3衣壳蛋白的片段长度为至少10个氨基酸。在某些实施方式中，本文所述的VP1、VP2或VP3衣壳蛋白的片段长度为至少20个氨基酸。在某些实施方式中，本文所述的VP1、VP2或VP3衣壳蛋白的片段长度为至少30个氨基酸。在某些实施方式中，本文所述的VP1、VP2或VP3衣壳蛋白的片段长度为至少40个氨基酸。在某些实施方式中，本文所述的VP1、VP2或VP3衣壳蛋白的片段长度为至少50个氨基酸。在某些实施方式中，本文所述的VP1、VP2或VP3衣壳蛋白的片段长度为至少100个氨基酸。在某些实施方式中，本文所述的VP1、VP2或VP3衣壳蛋白的片段长度为至少200个氨基酸。在某些实施方式中，本文所述的VP1、VP2或VP3衣壳蛋白的片段长度为至少300个氨基酸。在某些实施方式中，本文所述的VP1、VP2或VP3衣壳蛋白的片段长度为至少400个氨基酸。在某些实施方式中，本文所述的VP1、VP2或VP3衣壳蛋白的片段长度为至少500个氨基酸。在某些实施方式中，本文所述的VP1、VP2或VP3衣壳蛋白的片段长度为7-10个氨基酸。在某些实施方式中，本文所述的VP1、VP2或VP3衣壳蛋白的片段长度为10-50个氨基酸。在某些实施方式中，本文所述的VP1、VP2或VP3衣壳蛋白的片段长度为50-100个氨基酸。在某些实施方式中，本文所述的VP1、VP2或VP3衣壳蛋白的片段长度为100-200个氨基酸。在某些实施方式中，本文所述的VP1、VP2或VP3衣壳蛋白的片段长度为200-300个氨基酸。在某些实施方式中，本文所述的VP1、VP2或VP3衣壳蛋白的片段长度为300-400个氨基酸。在某些实施方式中，本文所述的VP1、VP2或VP3衣壳蛋白的片段长度为400-500个氨基酸。
在一些实施方式中，本文提供的rAAV颗粒中的衣壳蛋白来自AAV1、AAV2、AAV2i8、AAV3、AAV3-B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV-DJ、AAV LK03、AAVrh74、AAV44-9衣壳蛋白。在具体实施方式中，本文提供的rAAV颗粒中的衣壳蛋白具有与AAV1、AAV2、AAV2i8、AAV3、AAV3-B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV-DJ、AAV LK03、AAVrh74、AAV44-9衣壳蛋白的氨基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或100%同一性的氨基酸序列。
在某些实施方式中，本文提供的AAV颗粒包含VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白，其包含与AAV1的任意VP1、VP2或VP3氨基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或100%序列同一性的VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白序列。
在某些实施方式中，本文提供的AAV颗粒包含VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白，其包含与AAV2的任意VP1、VP2或VP3氨基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或100%序列同一性的VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白序列。
在某些实施方式中，本文提供的AAV颗粒包含VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白，其包含与AAV2i8的任意VP1、VP2或VP3氨基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或100%序列同一性的VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白序列。
在某些实施方式中，本文提供的AAV颗粒包含VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白，其包含与AAV3的任意VP1、VP2或VP3氨基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或100%序列同一性的VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白序列。
在某些实施方式中，本文提供的AAV颗粒包含VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白，其包含与AAV3-B的任意VP1、VP2或VP3氨基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或100%序列同一性的VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白序列。
在某些实施方式中，本文提供的AAV颗粒包含VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白，其包含与AAV4的任意VP1、VP2或VP3氨基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或100%序列同一性的VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白序列。
在某些实施方式中，本文提供的AAV颗粒包含VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白，其包含与AAV5的任意VP1、VP2或VP3氨基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或100%序列同一性的VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白序列。
在某些实施方式中，本文提供的AAV颗粒包含VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白，其包含与AAV6的任意VP1、VP2或VP3氨基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或100%序列同一性的VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白序列。
在某些实施方式中，本文提供的AAV颗粒包含VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白，其包含与AAV7的任意VP1、VP2或VP3氨基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或100%序列同一性的VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白序列。
在某些实施方式中，本文提供的AAV颗粒包含VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白，其包含与AAV8的任意VP1、VP2或VP3氨基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或100%序列同一性的VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白序列。
在某些实施方式中，本文提供的AAV颗粒包含VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白，其包含与AAVrh8的任意VP1、VP2或VP3氨基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或100%序列同一性的VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白序列。
在某些实施方式中，本文提供的AAV颗粒包含VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白，其包含与AAVrh8R的任意VP1、VP2或VP3氨基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或100%序列同一性的VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白序列。
在某些实施方式中，本文提供的AAV颗粒包含VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白，其包含与AAV9的任意VP1、VP2或VP3氨基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或100%序列同一性的VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白序列。
在某些实施方式中，本文提供的AAV颗粒包含VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白，其包含与AAV10的任意VP1、VP2或VP3氨基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或100%序列同一性的VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白序列。
在某些实施方式中，本文提供的AAV颗粒包含VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白，其包含与AAVrh10的任意VP1、VP2或VP3氨基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或100%序列同一性的VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白序列。
在某些实施方式中，本文提供的AAV颗粒包含VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白，其包含与AAV11的任意VP1、VP2或VP3氨基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或100%序列同一性的VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白序列。
在某些实施方式中，本文提供的AAV颗粒包含VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白，其包含与AAV12的任意VP1、VP2或VP3氨基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或100%序列同一性的VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白序列。
在某些实施方式中，本文提供的AAV颗粒包含VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白，其包含与AAV13的任意VP1、VP2或VP3氨基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或100%序列同一性的VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白序列。
在某些实施方式中，本文提供的AAV颗粒包含VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白，其包含与AAV-DJ的任意VP1、VP2或VP3氨基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或100%序列同一性的VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白序列。
在某些实施方式中，本文提供的AAV颗粒包含VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白，其包含与AAV LK03的任意VP1、VP2或VP3氨基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或100%序列同一性的VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白序列。
在某些实施方式中，本文提供的AAV颗粒包含VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白，其包含与AAVrh74的任意VP1、VP2或VP3氨基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或100%序列同一性的VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白序列。
在某些实施方式中，本文提供的AAV颗粒包含VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白，其包含与AAV44-9的任意VP1、VP2或VP3氨基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或100%序列同一性的VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白序列。
在一些具体实施方式中，本文提供的rAAV颗粒包含AAV VP1衣壳蛋白，其包含与SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：136、SEQ ID NO：137、SEQ ID NO：138、SEQ ID NO：139、SEQ IDNO：140或SEQ ID NO：141，其VP2衣壳蛋白对应物和/或其VP3衣壳蛋白对应物具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或100%序列同一性的氨基酸序列。
在一些具体实施方式中，本文提供的rAAV颗粒包含AAV VP1衣壳蛋白，其包含SEQID NO：21、SEQ ID NO：136、SEQ ID NO：137、SEQ ID NO：138、SEQ ID NO：139、SEQ ID NO：140或SEQ ID NO：141的氨基酸序列，其VP2衣壳蛋白对应物和/或其VP3衣壳蛋白对应物。
在具体实施方式中，本文提供的rAAV颗粒是重组AAV血清型9（rAAV9）颗粒。在具体实施方式中，本文提供的rAAV颗粒包含AAV9衣壳蛋白。在特定实施方式中，本文提供的rAAV颗粒的AAV衣壳包含变体AAV9衣壳蛋白。
在各种实施方式中，所述变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：25、27、29、31、33、35、36、38、40、42、46、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133或135的氨基酸序列。
在各种实施方式中，所述变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：24、26、28、30、32、34、37、39、41、43、45、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132或134的氨基酸序列。
在各种实施方式中，所述变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：31、38、49、51、53、55、57、59或61的氨基酸序列。
在各种实施方式中，所述变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：30、37、48、50、52、54、56、58或60的氨基酸序列。
在某些实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列。在具体实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列。
在某些实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列。在具体实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列。
在某些实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列。在具体实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列。
在某些实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列。在具体实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列。
在某些实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：33的氨基酸序列。在具体实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列。
在某些实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列。在某些实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列。在某些实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列并且包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列。在具体实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQID NO：34的氨基酸序列。
在某些实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：38的氨基酸序列。在具体实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列。
在某些实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列。在具体实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列。
在某些实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：42的氨基酸序列。在具体实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列。
在某些实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：44的氨基酸序列。在具体实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：43的氨基酸序列。
在某些实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：46的氨基酸序列。在某些实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：47的氨基酸序列。在某些实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：46的氨基酸序列并且包含SEQ ID NO：47的氨基酸序列。在具体实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQID NO：45的氨基酸序列。
在某些实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：49的氨基酸序列。在具体实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：48的氨基酸序列。
在某些实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：51的氨基酸序列。在具体实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：50的氨基酸序列。
在某些实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列。在具体实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列。
在某些实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：55的氨基酸序列。在具体实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列。
在某些实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：57的氨基酸序列。在具体实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：56的氨基酸序列。
在某些实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：59的氨基酸序列。在具体实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：58的氨基酸序列。
在某些实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：61的氨基酸序列。在具体实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：60的氨基酸序列。
在某些实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：63的氨基酸序列。在具体实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：62的氨基酸序列。
在某些实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：65的氨基酸序列。在具体实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：64的氨基酸序列。
在某些实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：67的氨基酸序列。在具体实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：66的氨基酸序列。
在某些实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：69的氨基酸序列。在具体实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：68的氨基酸序列。
在某些实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：71的氨基酸序列。在具体实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：70的氨基酸序列。
在某些实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：73的氨基酸序列。在具体实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：72的氨基酸序列。
在某些实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：75的氨基酸序列。在具体实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：74的氨基酸序列。
在某些实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：77的氨基酸序列。在具体实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：76的氨基酸序列。
在某些实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：79的氨基酸序列。在具体实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：78的氨基酸序列。
在某些实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：81的氨基酸序列。在具体实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：80的氨基酸序列。
在某些实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：83的氨基酸序列。在具体实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：82的氨基酸序列。
在某些实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：85的氨基酸序列。在具体实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：84的氨基酸序列。
在某些实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：87的氨基酸序列。在具体实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：86的氨基酸序列。
在某些实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：89的氨基酸序列。在具体实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：88的氨基酸序列。
在某些实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：91的氨基酸序列。在具体实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：90的氨基酸序列。
在某些实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：93的氨基酸序列。在具体实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：92的氨基酸序列。
在某些实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：95的氨基酸序列。在具体实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：94的氨基酸序列。
在某些实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：97的氨基酸序列。在具体实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：96的氨基酸序列。
在某些实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：99的氨基酸序列。在具体实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：98的氨基酸序列。
在某些实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：101的氨基酸序列。在具体实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：100的氨基酸序列。
在某些实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：103的氨基酸序列。在具体实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：102的氨基酸序列。
在某些实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：105的氨基酸序列。在具体实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：104的氨基酸序列。
在某些实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：107的氨基酸序列。在具体实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：106的氨基酸序列。
在某些实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：109的氨基酸序列。在具体实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：108的氨基酸序列。
在某些实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：111的氨基酸序列。在具体实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：110的氨基酸序列。
在某些实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：113的氨基酸序列。在具体实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：112的氨基酸序列。
在某些实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：115的氨基酸序列。在具体实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：114的氨基酸序列。
在某些实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：117的氨基酸序列。在具体实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：116的氨基酸序列。
在某些实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：119的氨基酸序列。在具体实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：118的氨基酸序列。
在某些实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：121的氨基酸序列。在具体实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：120的氨基酸序列。
在某些实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：123的氨基酸序列。在具体实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：122的氨基酸序列。
在某些实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：125的氨基酸序列。在具体实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：124的氨基酸序列。
在某些实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：127的氨基酸序列。在具体实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：126的氨基酸序列。
在某些实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：129的氨基酸序列。在具体实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：128的氨基酸序列。
在某些实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：131的氨基酸序列。在具体实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：130的氨基酸序列。
在某些实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：133的氨基酸序列。在具体实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：132的氨基酸序列。
在某些实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：135的氨基酸序列。在具体实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ ID NO：134的氨基酸序列。
在某些实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含本文所述的VP1衣壳蛋白的VP2衣壳蛋白对应物。
在某些实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含本文所述的VP1衣壳蛋白的VP3衣壳蛋白对应物。
在某些实施方式中，本文提供的变体AAV9衣壳蛋白包含本文所述的VP1衣壳蛋白的片段（例如，功能片段）。
在各种实施方式中，相对于野生型AAV颗粒，本文所述的重组AAV颗粒对一种或多种组织具有增加的趋向性。所述一种或多种组织可以是例如肝脏、肌肉（例如，骨骼肌（例如，二头肌、三头肌、四头肌、胫骨前肌、腓肠肌、腹直肌、膈肌和/或胸大肌）和/或心肌（例如，心房肌和/或心室肌））、肾脏、脑（例如，中前脑、中后脑、前脑和/或后脑）、肺和/或脾脏。
在某些实施方式中，相对于野生型AAV颗粒，本文所述的重组AAV颗粒对肝脏具有增加的趋向性。
在某些实施方式中，相对于野生型AAV颗粒，本文所述的重组AAV颗粒对肌肉（例如，骨骼肌（例如，二头肌、三头肌、四头肌、胫骨前肌、腓肠肌、腹直肌、膈肌和/或胸大肌）和/或心肌（例如，心房肌和/或心室肌））具有增加的趋向性。
在某些实施方式中，相对于野生型AAV颗粒，本文所述的重组AAV颗粒对肾脏具有增加的趋向性。
在某些实施方式中，相对于野生型AAV颗粒，本文所述的重组AAV颗粒对肝脏和肌肉（例如，骨骼肌（例如，二头肌、三头肌、四头肌、胫骨前肌、腓肠肌、腹直肌、膈肌和/或胸大肌）和/或心肌（例如，心房肌和/或心室肌））两者具有增加的趋向性。
在某些实施方式中，相对于野生型AAV颗粒，本文所述的重组AAV颗粒对肝脏和肾脏两者具有增加的趋向性。
在某些实施方式中，相对于野生型AAV颗粒，本文所述的重组AAV颗粒对肝脏、肌肉（例如，骨骼肌（例如，二头肌、三头肌、四头肌、胫骨前肌、腓肠肌、腹直肌、膈肌和/或胸大肌）和/或心肌（例如，心房肌和/或心室肌））和肾脏具有增加的趋向性。
在各种实施方式中，相对于野生型AAV颗粒，本文所述的重组AAV颗粒对一种或多种组织具有降低的趋向性。一种或多种组织可以是例如肌肉（例如，骨骼肌（例如，二头肌、三头肌、四头肌、胫骨前肌、腓肠肌、腹直肌、膈肌和/或胸大肌）和/或心肌（例如，心房肌和/或心室肌））、肾脏、脑（例如，中前脑、中后脑、前脑和/或后脑）、肺和/或脾脏。
在各种实施方式中，本文所述的重组AAV颗粒具有如上所述的对一种或多种组织的增加的趋向性和如上所述的对另一种或多种组织的降低的趋向性。
在各种实施方式中，在向受试者全身施用重组AAV颗粒之后，测量本文所述的对组织的趋向性。在某些实施方式中，在向受试者静脉内施用重组AAV颗粒之后，测量本文所述的对组织的趋向性。
在优选的实施方式中，本文所述的重组AAV颗粒是非天然存在的AAV颗粒。在某些实施方式中，本文所述的重组AAV颗粒是被分离的。在某些实施方式中，本文所述的重组AAV颗粒是被纯化的。
5.4细胞
在一个方面，本文提供了包含本文所述的多核苷酸（例如，第5.2.1节中所述的多核苷酸）的宿主细胞。
在一个方面，本文提供了包含本文所述的载体（例如，第5.3节中所述的载体）的宿主细胞。
在某些实施方式中，宿主细胞还在与本文所述的多核苷酸或载体（例如，第5.2.1节中所述的多核苷酸或第5.3节中所述的载体）相同或不同的多核苷酸或载体中包含编码AAV rep基因的核苷酸序列。在某些实施方式中，宿主细胞还在与本文所述的多核苷酸或载体（例如，第5.2.1节中所述的多核苷酸或第5.3节中所述的载体）相同或不同的多核苷酸或载体中包含编码AAV cap基因的核苷酸序列。在某些实施方式中，所述宿主细胞还包含辅助功能，诸如一种或多种辅助质粒和/或一种或多种辅助病毒（关于辅助功能参见第5.5节）。
在一个方面，本文提供了包含本文所述的重组病毒颗粒（例如，第5.3节中所述的重组病毒颗粒）的宿主细胞。
在一个方面，本文提供了生产本文所述的重组病毒颗粒（例如，第5.3节中所述的重组病毒颗粒）的宿主细胞。
在一个方面，本文提供了包含本文所述的重组AAV颗粒（例如，第5.3节中所述的重组AAV颗粒）的宿主细胞。
在一个方面，本文提供了生产本文所述的重组AAV颗粒（例如，第5.3节中所述的重组AAV颗粒）的宿主细胞。
在一个方面，本文提供了包含本文所述的非病毒递送系统（例如，第5.3节中所述的非病毒递送系统）的宿主细胞。
在一个方面，本文提供了生产本文所述的非病毒递送系统（例如，第5.3节中所述的非病毒递送系统）的宿主细胞。
在一些实施方式中，所述宿主细胞是离体宿主细胞。在一些实施方式中，所述宿主细胞是体外宿主细胞。在一些实施方式中，所述宿主细胞是体内宿主细胞。
如本文所用，术语“宿主”是指携带多核苷酸、载体、病毒颗粒（例如，rAAV颗粒）或非病毒基因递送系统的细胞（例如，来自昆虫、动物（包括人和非人动物）、酵母和细菌等的细胞）。本公开不旨在限定于任何特定类型的宿主细胞。实际上，预期任何合适的细胞将在本文中用作宿主。宿主细胞可以处于单细胞、群、培养物（诸如液体培养物或固体基质上的培养物）、细胞系、生物体或其部分的形式或源自单细胞、群、培养物（诸如液体培养物或固体基质上的培养物）、细胞系、生物体或其部分。
宿主细胞可用于扩增、复制或生产本文所述的多核苷酸、载体、重组病毒颗粒（例如，rAAV颗粒）、非病毒基因递送系统或生物分子。适合于此目的的宿主细胞可以是例如细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞（例如人细胞或非人哺乳动物细胞）。可用作宿主细胞的非限制性示例性昆虫细胞包括Ao38、High Five、Sf9、Se301、SeIZD2109、SeUCR1、Sf900+、Sf21、BTI-TN-5B1-4、MG-1、Tn368、HzAm1、BM-N、Ha2302和Hz2E5。可用作宿主细胞的非限制性示例性哺乳动物细胞包括HEK293、HEK293-T、HeLa、WEHI、10T1/2、MDCK、W138、Jurkat、2V6.11、Saos、C2C12、L、HT1080、HepG2、COS1、BSC 1、BSC 40、BMT 10、CHO、NS0、SP2/0、PER.C6、Vero、RD、BHK、HT 1080、A549、Cos-7、ARPE-19、MRC-5、原代成纤维细胞、肝细胞和成肌细胞。在某些实施方式中，所述宿主细胞是人细胞。在具体实施方式中，所述人细胞对于待治疗的受试者（例如，人类患者）而言是自体的。在具体实施方式中，所述人细胞对于待治疗的受试者（例如，人类患者）而言是同种异体的。
所述宿主细胞本身也可以用作治疗剂。适合于此目的的宿主细胞优选源自受试者的相同物种。因此，如果待治疗的受试者是人患者，则适合用作治疗剂本身的宿主细胞优选是人细胞。在具体实施方式中，所述人细胞对于待由人细胞治疗的受试者（例如，人类患者）而言是自体的。在具体实施方式中，所述人细胞对于待由人细胞治疗的受试者（例如，人类患者）而言是同种异体的。
在一个方面，本文提供了由本文所述的重组病毒颗粒（例如，重组AAV颗粒）稳定转导的宿主细胞群。在一个方面，本文提供了由本文所述的非病毒基因递送系统稳定转导的宿主细胞群。在具体实施方式中，所述宿主细胞群是离体宿主细胞群。在具体实施方式中，所述宿主细胞群是体外宿主细胞群。在具体实施方式中，所述宿主细胞群是体内宿主细胞群。在具体实施方式中，所述宿主细胞群是人宿主细胞群。在具体实施方式中，所述宿主细胞群是人离体宿主细胞群。在具体实施方式中，所述宿主细胞群是人体外宿主细胞群。
在某些实施方式中，此类宿主细胞群可以用于产生重组病毒颗粒（例如，重组AAV颗粒）群，其用作治疗剂并施用至有需要的受试者（例如，人类患者）。
在某些实施方式中，此类宿主细胞群可以用于产生非病毒基因递送系统分子群，其用作治疗剂并施用至有需要的受试者（例如，人类患者）。
在某些实施方式中，此类宿主细胞群可以用于产生如第5.2.4节中所述的生物分子群，其用作治疗剂并施用至有需要的受试者（例如，人类患者）。
在某些实施方式中，此类宿主细胞群可以用作治疗剂本身，并且施用至有需要的受试者（例如，人类患者）。在具体实施方式中，所述宿主细胞群对待由宿主细胞群治疗的受试者（例如，人类患者）而言是自体的。在具体实施方式中，所述宿主细胞群对待由宿主细胞群治疗的受试者（例如，人类患者）而言是同种异体的。
5.5生产方法
在另一方面，本文提供了生产本文所述的重组病毒颗粒的方法，所述重组病毒颗粒例如本文所述的重组AAV颗粒（例如，重组病毒颗粒，例如第5.3节中所述的重组AAV颗粒）。
在另一方面，本文提供了生产本文所述的非病毒基因递送系统（例如，第5.3节中所述的非病毒基因递送系统）的方法。
本文还描述了生产本文所述的多核苷酸（例如，第5.2.1节中所述的多核苷酸）、本文所述的启动子（例如，第5.2.2节中所述的启动子）、本文所述的表达盒（例如，第5.2.3节中所述的表达盒）、本文所述的载体（例如，第5.3节中所述的载体）或本文所述的宿主细胞（例如，第5.4节中所述的宿主细胞）的方法。
本公开的多核苷酸、启动子、表达盒、载体、宿主细胞、重组病毒颗粒（例如重组AAV颗粒）和非病毒基因递送系统可以通过本领域已知的任何合适的方法生产，包括重组生产、基因工程、分子克隆、化学合成和其他合成方法。此类生产方法在本领域技术人员的知识范围内并且不是对本发明的限制。
本公开的多核苷酸、启动子、表达盒和/或载体可以使用本领域已知的任何合适的基因工程和蛋白生产技术进行，包括但不限于克隆、限制性内切核酸酶消化、连接、转化、质粒纯化、DNA测序、化学合成、体外翻译和体内表达，例如如Green和Sambrook，MolecularCloning: A Laboratory Manual, 4thEd., Cold Spring Harbor Laboratory （ColdSpring Harbor, N.Y. 2012）中所述。
可以使用任何合适的方法使宿主细胞携带本公开的多核苷酸、载体、重组病毒颗粒（例如重组AAV颗粒）或非病毒基因递送系统，包括但不限于转染、电穿孔、转导、脂质体递送、膜融合技术、高速DNA包被的颗粒、病毒感染和原生质体融合。
重组病毒颗粒（例如重组AAV颗粒）可以由宿主细胞生产，其允许重组病毒颗粒（例如重组AAV颗粒）的生产和复制。生产包括重组AAV颗粒的重组病毒颗粒的方法是本领域熟知的，并且在例如Adeno-Associated Virus: Methods andProtocols (Methods InMolecular Biology, 280), ed. Snyder and Moullier, HumanaPress, NJ (2011)；Viral Vectors for Gene Therapy: Methods and Protocols （Methods in MolecularBiology, 1937）；ed. Manfredsson and Benskey, Humana Press, NJ (2019)；O’Reilly等，Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, Oxford Univ. Press(1994)；Samulski等，J. Vir. 63:3822-8 (1989)；Kajigaya等，Proc. Nat’l. Acad. Sci.USA 88: 4646-50 (1991)；Ruffing等，J. Vir. 66:6922-30 (1992)；Kimbauer等，Vir.219:37-44 (1996)；Zhao等，Vir. 272:382-93 (2000)；U.S.专利号US5064764、US5756283、US6194191、US6204059、US6258595、US6261551、US6270996、US6281010、US6365394、US6475769、US6482634、US6485966、US6566118、US6943019、US6953690、US7022519、US7238526、US7291498、US7491508和US8137948；及国际专利申请公开号WO1996039530、WO1998010088、WO1999014354、WO1999015685、WO1999047691、WO2000055342、WO2000075353、WO2001023597、WO2015191508、WO2018022608、WO2019217513、WO2019222132、WO2019222136和WO2020232044中进行了描述；其公开内容通过引用整体并入本文。
本文所述的rAAV颗粒可使用本领域已知的任何合适的方法生产。例如，宿主细胞（例如，哺乳动物细胞）可以被工程化以稳定地表达用于AAV颗粒生产的必要组分。这可以通过将包含AAV rep和cap基因和选择标记（例如抗生素（例如新霉素或氨苄青霉素）抗性基因）的质粒（或多个质粒）整合到细胞基因组中来实现。细胞可以是例如昆虫或哺乳动物细胞，然后可以用辅助病毒（例如，提供辅助功能的腺病毒或杆状病毒）和包含5’和3’AAV ITR的rAAV载体共感染。可选择标记的使用允许rAAV的大规模生产。作为另一个非限制性实例，腺病毒或杆状病毒而不是质粒可用于将rep和cap基因引入到包装细胞中。作为又一个非限制性实例，含有5’和3’AAV ITR以及rep和cap基因的病毒载体都可以稳定地整合到生产细胞的DNA中，并且辅助功能可以由野生型腺病毒提供以生产rAAV。
用于AAV的辅助病毒是指允许AAV被宿主细胞复制和包装的病毒。辅助病毒提供允许复制AAV的辅助功能。已经鉴定了许多这样的辅助病毒，包括腺病毒、疱疹病毒和痘病毒例如牛痘。腺病毒涵盖许多不同的亚组，尽管最常用亚组C的5型腺病毒（Ad5）。许多人、非人哺乳动物和鸟类来源的腺病毒是已知的，并且可从诸如ATCC的保藏库获得。也可从诸如ATCC的保藏中心获得的疱疹病毒科的病毒包括例如单纯疱疹病毒（HSV）、EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）、巨细胞病毒（CMV）和伪狂犬病病毒（PRV）。用于复制AAV的腺病毒辅助功能的实例包括E1A功能、E1B功能、E2A功能、VA功能和E4orf6功能。
如果感染性AAV颗粒与感染性辅助病毒颗粒的比率为至少约102:1；至少约104:1；至少约106:1；或至少约108:1，则认为AAV制剂基本上不含辅助病毒。制剂也可以不含等量的辅助病毒蛋白（即，如果上述辅助病毒颗粒杂质以破坏的形式存在，则由于这种水平的辅助病毒而存在的蛋白）。通常可以观察到病毒和/或细胞蛋白污染，因为SDS凝胶上考马斯染色条带的存在（例如，除了对应于AAV衣壳蛋白VP1、VP2和VP3的条带之外的条带的出现）。
在某些实施方式中，使含有上述rAAV载体的宿主细胞能够提供AAV辅助功能，以复制和包封编码侧接有AAV ITR的感兴趣的蛋白的转基因，从而生产rAAV颗粒。AAV辅助功能通常是AAV衍生的编码序列，其可以被表达以提供AAV基因产物，所述AAV基因产物进而以反式作用用于生产性AAV复制。本文使用AAV辅助功能来补足rAAV载体中缺失的必要AAV功能。在一些实施方式中，AAV辅助功能包括主要AAV ORF（即rep和cap编码区）或其功能同源物中的一者或两者。
通过在转染rAAV载体之前或同时用AAV辅助构建体转染宿主细胞，可以将AAV辅助功能引入宿主细胞。例如，AAV辅助构建体可以用于至少提供AAV rep和/或cap基因的瞬时表达，以补足失去生产性AAV感染所必需的AAV功能。通常，AAV辅助构建体缺乏AAV ITR，并且本身既不能复制也不能包装。AAV辅助构建体可以是例如质粒、噬菌体、转座子、粘性质粒、病毒或病毒体的形式。
在某些实施方式中，宿主细胞还能够提供或被提供非AAV衍生的功能或“辅助功能”以生产rAAV颗粒。辅助功能是非AAV衍生的病毒和/或AAV依赖于其复制的细胞功能，例如AAV复制中所需的非AAV蛋白和RNA，包括涉及AAV基因转录的激活、阶段特异性AAV mRNA剪接、AAV DNA复制、Cap表达产物的合成和AAV衣壳组装的那些。在一些实施方式中，基于病毒的辅助功能可以源自已知的辅助病毒。
在一些实施方式中，作为用辅助病毒和/或辅助功能载体感染宿主细胞的结果，生产重组AAV颗粒，并且所生产的rAAV颗粒是感染性的复制缺陷型病毒，并且包括AAV蛋白壳，所述AAV蛋白壳包封两端都侧接有AAV ITR的感兴趣的异源核苷酸序列。
rAAV颗粒可以使用本领域已知的纯化方法，例如色谱法、CsCl梯度和例如美国专利号6,989,264和8,137,948以及WO 2010/148143中所述的其他方法从宿主细胞中纯化。在一些实施方式中，可以使用已知方法，例如通过加热来灭活残留的辅助病毒。
5.6药物组合物
在一个方面，本文提供了一种药物组合物，其包含本文所述的重组病毒颗粒，例如本文所述的重组AAV颗粒（例如，重组病毒颗粒，例如第5.3节中所述的重组AAV颗粒），以及药学上可接受的载体。
在一个方面，本文提供了一种药物组合物，其包含本文所述的非病毒基因递送系统（例如，第5.3节中所述的非病毒基因递送系统），以及药学上可接受的载体。
在一个方面，本文提供了一种药物组合物，其包含由本文所述的重组病毒颗粒稳定转导的本文所述的宿主细胞群，例如本文所述的重组AAV颗粒（例如，由重组病毒颗粒稳定转导的宿主细胞群，例如重组AAV颗粒，如第5.4节中所述），以及药学上可接受的载体。
在一个方面，本文提供了一种药物组合物，其包含由本文所述的非病毒基因递送系统稳定转导的本文所述的宿主细胞群（例如，由如第5.4节中所述的非病毒基因递送系统稳定转导的宿主细胞群），以及药学上可接受的载体。
在某些实施方式中，本文所述的药物组合物中重组病毒颗粒（例如，重组AAV颗粒）的浓度可以在1x108vg/ml至1x1020vg/ml的范围内。在具体实施方式中，本文所述的药物组合物中重组病毒颗粒（例如，重组AAV颗粒）的浓度可以在1x109vg/ml至1x1019vg/ml的范围内。在具体实施方式中，本文所述的药物组合物中重组病毒颗粒（例如，重组AAV颗粒）的浓度可以在1x1010vg/ml至1x1018vg/ml的范围内。在具体实施方式中，本文所述的药物组合物中重组病毒颗粒（例如，重组AAV颗粒）的浓度可以在1x1011vg/ml至1x1017vg/ml的范围内。在具体实施方式中，本文所述的药物组合物中重组病毒颗粒（例如，重组AAV颗粒）的浓度可以在1x1012vg/ml至1x1016vg/ml的范围内。在具体实施方式中，本文所述的药物组合物中重组病毒颗粒（例如，重组AAV颗粒）的浓度可以在1x1013vg/ml至1x1015vg/ml的范围内。在某些实施方式中，本文所述的药物组合物中重组病毒颗粒（例如，重组AAV颗粒）的浓度可以在1x108vg/ml至1x1015vg/ml的范围内。
在某些实施方式中，本文所述的药物组合物中宿主细胞的浓度可以在1x102细胞/ml至1x1012细胞/ml的范围内。在具体实施方式中，本文所述的药物组合物中宿主细胞的浓度可以在1×103细胞/ml至1×1011细胞/ml的范围内。在具体实施方式中，本文所述的药物组合物中宿主细胞的浓度可以在1×104细胞/ml至1×1010细胞/ml的范围内。在具体实施方式中，本文所述的药物组合物中宿主细胞的浓度可以在1x105细胞/ml至1x109细胞/ml的范围内。在具体实施方式中，本文所述的药物组合物中宿主细胞的浓度可以在1×106细胞/ml至1×108细胞/ml的范围内。
在某些实施方式中，本文所述的药物组合物以约0.1 ml至约20 ml的体积注射。在某些实施方式中，本文所述的药物组合物以约1 ml至约10 ml的体积注射。
通常，当药剂（例如赋形剂或载体）是安全、无毒的并且不是生物学上或其他方面不期望的时，该药剂是药学上可接受的，并且对于兽医用途以及人类药物用途是可接受的。
在某些实施方式中，本文所述的药物组合物包含一种或多种药学上可接受的赋形剂，以为组合物提供储存和/或施用给受试者以治疗疾病或障碍的有利特性。在某些实施方式中，本文所述的药物组合物包含一种或多种缓冲剂，诸如磷酸氢二钠和/或磷酸二氢钠一水合物。在某些实施方式中，本文所述的药物组合物包含一种或多种等渗剂，例如氯化钠。在某些实施方式中，本文所述的药物组合物包含一种或多种填充剂，例如甘露醇、蔗糖、右旋糖酐、乳糖、海藻糖和/或聚维酮（PVP K24）。在某些实施方式中，本文所述的药物组合物包含一种或多种表面活性剂，例如聚山梨酯80、聚山梨酯20、十二烷基硫酸钠、硬脂酸钠、月桂基硫酸铵、TRITON AG 98（Rhone-Poulenc）、泊洛沙姆（Poloxamer）407和/或泊洛沙姆188。
优选地，本文所述的药物组合物是稳定的，并且可长时间储存，而质量、效力或纯度没有不可接受的变化，例如在低于-60℃、约-20℃、约2℃至8℃和/或室温下储存。
优选地，本文所述的药物组合物在制造和储存条件下是无菌且稳定的。本文所述的药物组合物可以被配制成溶液、微乳液、脂质体、冻干组合物或适于适应高药物浓度的其他有序结构。
在某些实施方式中，本文所述的药物组合物被配制用于向受试者施用的途径。可使用的施用途径的非限制性实例包括直接递送至靶器官、经口、吸入、静脉内、肌内、皮下、皮内、鼻内、鞘内、胰腺内、腹膜内、肿瘤内和其它肠胃外施用途径。在具体实施方式中，本文所述的药物组合物被配制用于向受试者全身施用。在具体实施方式中，本文所述的药物组合物被配制用于向受试者静脉内施用。
在一些实施方式中，本文提供的药物组合物以有效治疗或预防疾病或障碍的量（例如作为治疗有效或预防有效量）含有本文所述的病毒颗粒、本文所述的非病毒基因递送系统或本文所述的宿主细胞群。在一些实施方式中，治疗或预防功效通过定期评估所治疗的受试者来监测。
5.7方法和用途
在一个方面，本文提供了一种在有需要的受试者中治疗疾病或障碍的方法，包括向受试者施用（优选治疗有效量的）本文所述的重组病毒颗粒，例如本文所述的重组AAV颗粒（如，重组病毒颗粒，例如第5.3节中所述的重组AAV颗粒）。
在一个方面，本文提供了一种在有需要的受试者中治疗疾病或障碍的方法，包括向受试者施用（优选治疗有效量的）本文所述的非病毒基因递送系统（例如，第5.3节中所述的非病毒基因递送系统）。
在一个方面，本文提供了一种在有需要的受试者中治疗疾病或障碍的方法，包括向所述受试者施用（优选治疗有效量的）本文所述的药物组合物（例如，第5.6节中所述的药物组合物）。
在一个方面，本文提供了一种将生物分子递送至一种或多种离体靶细胞的方法，包括用本文所述的重组病毒颗粒例如本文所述的重组AAV颗粒（如，重组病毒颗粒，例如第5.3节中所述的重组AAV颗粒）转导所述一种或多种靶细胞。
在一个方面，本文提供了一种将生物分子递送至一种或多种离体靶细胞的方法，包括用本文所述的非病毒基因递送系统（如，第5.3节中所述的非病毒基因递送系统）转导所述一种或多种靶细胞。
在一个方面，本文提供了一种将生物分子递送至一种或多种体外靶细胞的方法，包括用本文所述的重组病毒颗粒例如本文所述的重组AAV颗粒（如，重组病毒颗粒，例如第5.3节中所述的重组AAV颗粒）转导所述一种或多种靶细胞。
在一个方面，本文提供了一种将生物分子递送至一种或多种体外靶细胞的方法，包括用本文所述的非病毒基因递送系统（例如，第5.3节中所述的非病毒基因递送系统）转导所述一种或多种靶细胞。
在一个方面，本文提供了一种将生物分子递送至受试者中的一种或多种体内靶细胞的方法，包括向所述受试者施用本文所述的重组病毒颗粒，例如本文所述的重组AAV颗粒（如，重组病毒颗粒，例如第5.3节中所述的重组AAV颗粒）。
在一个方面，本文提供了一种将生物分子递送至受试者中的一种或多种体内靶细胞的方法，该方法包括向受试者施用本文所述的非病毒基因递送系统（例如，第5.3节中所述的非病毒基因递送系统）。
在另一方面，本文提供了一种将生物分子递送至受试者中的一种或多种体内靶细胞的方法，包括向受试者施用本文所述的药物组合物（例如，第5.6节中所述的药物组合物）。
生物分子的更多描述在第5.2.4节中提供。
在某些实施方式中，所述一种或多种靶细胞是一种或多种肝细胞。在某些实施方式中，所述一种或多种靶细胞是一种或多种肌细胞。在某些实施方式中，所述一种或多种靶细胞是一种或多种肾细胞。在某些实施方式中，所述一种或多种靶细胞是一种或多种肝细胞和一种或多种肌细胞。在某些实施方式中，所述一种或多种靶细胞是一种或多种肝细胞和一种或多种肾细胞。在某些实施方式中，所述一种或多种靶细胞是一种或多种肝细胞、一种或多种肌细胞和一种或多种肾细胞。在具体实施方式中，本文所述的一种或多种肌细胞是一种或多种骨骼肌细胞（例如，二头肌、三头肌、四头肌、胫骨前肌、腓肠肌、腹直肌、膈肌和/或胸大肌）和/或一种或多种心肌细胞（例如，心房肌和/或心室肌细胞）。在特定实施方式中，肌肉可以用作生物分子的生产工厂，该生物分子从肌细胞分泌并最终被另一组织或器官的细胞吸收以发挥其治疗效果。
可以基于疾病或障碍的性质、受试者的状况和医师的知识来确定施用或递送的途径以及待施用向受试者施用的重组病毒颗粒（例如，重组AAV颗粒）、非病毒基因递送系统或药物组合物的量。可使用的施用或递送途径的非限制性实例包括直接递送至靶器官、经口、吸入、静脉内、肌内、皮下、皮内、鼻内、鞘内、胰腺内、腹膜内、肿瘤内和其它肠胃外施用途径。在具体实施方式中，本文所述的重组病毒颗粒（例如，重组AAV颗粒）、非病毒基因递送系统或药物组合物被全身施用或递送。在具体实施方式中，本文所述的重组病毒颗粒（例如，重组AAV颗粒）、非病毒基因递送系统或药物组合物被静脉内施用或递送。
在某些实施方式中，所述方法以1x108至1x1017载体基因组（vg）的剂量向受试者施用本文所述的重组病毒颗粒（例如，重组AAV颗粒）。在某些实施方式中，所述方法以1x109至1x1016载体基因组（vg）的剂量向受试者施用本文所述的重组病毒颗粒（例如，重组AAV颗粒）。在某些实施方式中，所述方法以1x1010至1x1015载体基因组（vg）的剂量向受试者施用本文所述的重组病毒颗粒（例如，重组AAV颗粒）。在某些实施方式中，所述方法以1x1011至1x1014载体基因组（vg）的剂量向受试者施用本文所述的重组病毒颗粒（例如，重组AAV颗粒）。
在某些实施方式中，所述方法以1x108至1x1017载体基因组/kg（vg/kg）的剂量向受试者施用本文所述的重组病毒颗粒（例如，重组AAV颗粒）。在某些实施方式中，所述方法以1x109至1x1016载体基因组/kg（vg/kg）的剂量向受试者施用本文所述的重组病毒颗粒（例如，重组AAV颗粒）。在某些实施方式中，所述方法以1x1010至1x1015载体基因组/kg（vg/kg）的剂量向受试者施用本文所述的重组病毒颗粒（例如，重组AAV颗粒）。在某些实施方式中，所述方法以1x1011至1x1014载体基因组/kg（vg/kg）的剂量向受试者施用本文所述的重组病毒颗粒（例如，重组AAV颗粒）。
本文所述的递送方法和治疗方法可用于治疗各种疾病或障碍，包括但不限于遗传障碍（例如溶酶体贮积症）、癌症（例如癌、肉瘤、白血病、淋巴瘤、生殖细胞肿瘤和母细胞瘤）、自身免疫性疾病和感染性疾病。
在具体实施方式中，所述疾病或障碍至少由肝脏功能障碍引起。在具体实施方式中，所述疾病或障碍至少由肌肉（例如，骨骼肌（例如，二头肌、三头肌、四头肌、胫骨前肌、腓肠肌、腹直肌、膈肌和/或胸大肌）和/或心肌（例如，心房肌和/或心室肌））的功能障碍引起。在具体实施方式中，所述疾病或障碍至少由肾脏功能障碍引起。在具体实施方式中，所述疾病或障碍至少由肝脏功能障碍和肌肉（例如，骨骼肌（例如，二头肌、三头肌、四头肌、胫骨前肌、腓肠肌、腹直肌、膈肌和/或胸大肌）功能障碍引起。在具体实施方式中，所述疾病或障碍至少由肝脏功能障碍和肾脏功能障碍引起。在具体实施方式中，所述疾病或障碍至少由肝脏功能障碍、肌肉（例如，骨骼肌（例如，二头肌、三头肌、四头肌、胫骨前肌、腓肠肌、腹直肌、膈肌和/或胸大肌））功能障碍和肾脏功能障碍引起。
在具体实施方式中，所述疾病或障碍与肝细胞相关。在具体实施方式中，所述疾病或障碍与肌细胞（例如，骨骼肌细胞（例如，二头肌、三头肌、四头肌、胫骨前肌、腓肠肌、腹直肌、膈肌和/或胸大肌细胞）和/或心肌细胞（例如，心房肌和/或心室肌细胞））相关。在具体实施方式中，所述疾病或障碍与肾细胞相关。在具体实施方式中，所述疾病或障碍与肝细胞和肌细胞（例如，骨骼肌细胞（例如，二头肌、三头肌、四头肌、胫骨前肌、腓肠肌、腹直肌、膈肌和/或胸大肌细胞）和/或心肌细胞（例如，心房肌和/或心室肌细胞））相关。在具体实施方式中，所述疾病或障碍与肝细胞和肾细胞相关。在具体实施方式中，所述疾病或障碍与肝细胞、肌细胞（例如，骨骼肌细胞（例如，二头肌、三头肌、四头肌、胫骨前肌、腓肠肌、腹直肌、膈肌和/或胸大肌细胞）和/或心肌细胞（例如，心房肌和/或心室肌细胞））和肾细胞相关。
在某些实施方式中，所述疾病或障碍是溶酶体贮积症。
在具体实施方式中，所述疾病或障碍是法布里病。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是动作性肌阵挛-肾衰竭综合征。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是天冬氨酰葡萄糖胺尿症。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是CLN1疾病或神经元蜡样脂褐质沉积症1。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是CLN2疾病或Jansky–Bielschowsky病。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是CLN3疾病。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是CLN4疾病。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是CLN5疾病。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是CLN6疾病。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是CLN7疾病。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是CLN8疾病。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是CLN10疾病。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是CLN11疾病。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是CLN12疾病。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是CLN13疾病。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是CLN14疾病。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是胱氨酸沉积症。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是Danon病。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是Farber脂质肉芽肿病。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是岩藻糖苷沉积症。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是半乳糖唾液酸苷沉积症。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是戈谢病。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是糖原贮积病2型（GSD II）或庞贝氏症。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是格里塞利综合征1或Elejalde综合征。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是格里塞利综合征2。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是Chédiak-Higashi综合征。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是GM1神经节苷脂沉积症。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是GM2神经节苷脂沉积症Tay-Sachs病。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是GM2神经节苷脂沉积症Sandhoff病。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是GM2神经节苷脂沉积症GM2激活剂缺乏。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是Hermansky-Pudlak综合征1型。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是Hermansky-Pudlak综合征2型。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是Hermansky-Pudlak综合征3型。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是Hermansky-Pudlak综合征4型。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是Hermansky-Pudlak综合征5型。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是Hermansky-Pudlak综合征6型。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是Hermansky-Pudlak综合征7型。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是Hermansky-Pudlak综合征8型。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是Hermansky-Pudlak综合征9型。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是克拉伯病。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是α-甘露糖苷贮积症。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是β-甘露糖苷贮积症。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是异染性脑白质营养不良。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是黏脂质症II α/β或I细胞疾病。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是黏脂质症III α/β或假性Hurler多发性营养不良。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是黏脂质症III γ，变体假性Hurler多发性营养不良。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是黏脂质症IV。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是黏多糖贮积症I型（MPS I）或Hurler综合征。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是黏多糖贮积症II型（MPS II）或Hunter综合征。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是黏多糖贮积症IIIA型（MPS IIIA）或Sanfilippo综合征A。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是黏多糖贮积症IIIB型（MPS IIIB）或Sanfilippo综合征B。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是黏多糖贮积症IIIC型（MPS IIIC）或Sanfilippo综合征C。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是黏多糖贮积症IIID型（MPS IIID）或Sanfilippo综合征D。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是黏多糖贮积症IVA型（MPS IVA）或Morquio综合征A。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是黏多糖贮积症IVB型（MPS IVB）或Morquio综合征B。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是黏多糖贮积症VI型（MPS VI）或Maroteaux-Lamy综合征。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是黏多糖贮积症VII型（MPS VII）或Sly疾病。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是黏多糖贮积症IX型（MPS IX）。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是多种硫酸酯酶缺乏症。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是尼曼匹克病A型和B型。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是尼曼匹克病C1型。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是尼曼匹克病C2型。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是Salla病。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是Schindler病或神崎病。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是唾液酸沉积症I型或樱桃红斑肌阵挛综合征。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是Wolman病和胆固醇酯贮积病。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是脊髓性肌萎缩症。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是杜氏肌营养不良症（DMD）。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是苯丙氨酸羟化酶缺乏症。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是血友病A。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是血友病B。
在具体实施方式中，所述疾病或障碍是法布里病，并且所述生物分子是一种蛋白质，其为α-半乳糖苷酶A（GLA）（优选人GLA）。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是动作性肌阵挛-肾衰竭综合征（action myoclonus-renal failure syndrome），并且所述生物分子是一种蛋白质，其为清道夫受体B类成员2（SCARB2）（优选人SCARB2）。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是天冬氨酰葡萄糖胺尿症（Aspartylglucos-aminuria），并且所述生物分子是一种蛋白质，其为天冬氨酰氨基葡糖苷酶（AGA）（优选人AGA）。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是CLN1疾病或神经元蜡样脂褐质沉积症1，并且所述生物分子是一种蛋白质，其为棕榈酰蛋白硫酯酶1（PPT1）（优选人PPT1）。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是CLN2疾病或Jansky–Bielschowsky病，并且所述生物分子是一种蛋白质，其为三肽基肽酶1（TPP1）（优选人TPP1）。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是CLN3疾病，并且所述生物分子是一种蛋白质，其为CLN3溶酶体/内体跨膜蛋白，battenin（CLN3）（优选人CLN3）。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是CLN4疾病，并且所述生物分子是一种蛋白质，其为DnaJ热休克蛋白家族（Hsp40）成员C5（DNAJC5）（优选人DNAJC5）。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是CLN5疾病，并且所述生物分子是一种蛋白质，其为CLN5细胞内运输蛋白（CLN5）（优选人CLN5）。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是CLN6疾病，并且所述生物分子是一种蛋白质，其为CLN6跨膜ER蛋白（CLN6）（优选人CLN6）。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是CLN7疾病，并且所述生物分子是一种蛋白质，其为含主要促进因子超家族结构域蛋白8（MFSD8）（优选人MFSD8）。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是CLN8疾病，并且所述生物分子是一种蛋白质，其为CLN8跨膜ER和ERGIC蛋白（CLN8）（优选人CLN8）。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是CLN10疾病，并且所述生物分子是一种蛋白质，其为组织蛋白酶D（CTSD）（优选人CTSD）。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是CLN11疾病，并且所述生物分子是一种蛋白质，其为颗粒蛋白前体（GRN）（优选人GRN）。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是CLN12疾病，并且所述生物分子是一种蛋白质，其为ATP酶阳离子转运13A2（ATPase cation transporting 13A2，ATP13A2）（优选人ATP13A2）。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是CLN13疾病，并且所述生物分子是一种蛋白质，其为组织蛋白酶F（CTSF）（优选人CTSF）。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是CLN14疾病，并且所述生物分子是一种蛋白质，其为钾通道四聚体结构域蛋白7（KCTD7）（优选人KCTD7）。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是胱氨酸沉积症，并且所述生物分子是一种蛋白质，其为cystinosin，溶酶体胱氨酸转运蛋白（CTNS）（优选人CTNS）。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是Danon病，并且所述生物分子是一种蛋白质，其为溶酶体相关膜蛋白2（LAMP2）（优选人LAMP2）。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是Farber脂质肉芽肿病，并且所述生物分子是一种蛋白质，其为蛋白质，其为N-酰基鞘氨醇酰胺水解酶1（ASAH1）（优选人ASAH1）。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是岩藻糖苷沉积症（fucosidosis），并且所述生物分子是一种蛋白质，其为α-L-岩藻糖苷酶1（FUCA1）（优选人FUCA1）。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是半乳糖唾液酸苷沉积症（galactosialidosis），并且所述生物分子是一种蛋白质，其为组织蛋白酶A（CTSA）（优选人CTSA）。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是戈谢病，并且所述生物分子是一种蛋白质，其为β-葡糖脑苷脂酶（GBA）（优选人GBA）。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是2型糖原贮积病（GSD II）或庞贝氏症，并且所述生物分子是一种蛋白质，其为酸性α-葡糖苷酶（GAA）（优选人GAA）。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是格里塞利综合征1（Griscelli syndrome1）或Elejalde综合征，并且所述生物分子是一种蛋白质，其为肌球蛋白VA（MYO5A）（优选人MYO5A）。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是格里塞利综合征2，并且所述生物分子是一种蛋白质，其为RAS癌基因家族成员RAB27A（RAB27A）（优选人RAB27A）。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是Chédiak-Higashi综合征，并且所述生物分子是一种蛋白质，其为溶酶体运输调节因子（LYST）（优选人LYST）。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是GM1神经节苷脂沉积症（gangliosidosis），并且所述生物分子是一种蛋白质，其为半乳糖苷酶β1（GLB1）（优选人GLB1）。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是GM2神经节苷脂沉积症Tay-Sachs病，并且所述生物分子是一种蛋白质，其为己糖胺酶亚基α（HEXA）（优选人HEXA）。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是GM2神经节苷脂沉积症Sandhoff病，并且所述生物分子是一种蛋白质，其为己糖胺酶亚基β（HEXB）（优选人HEXB）。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是GM2神经节苷脂沉积症GM2激活剂缺乏，并且所述生物分子是一种蛋白质，其为神经节苷脂GM2激活剂（GM2A）（优选人GM2A）。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是Hermansky-Pudlak综合征1型，并且所述生物分子是一种蛋白质，其为HPS1溶酶体细胞器生物发生复合体3亚基1（HPS1）（优选人HPS1）。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是Hermansky-Pudlak综合征2型，并且所述生物分子是一种蛋白质，其为衔接因子相关蛋白复合体3亚基β1（AP3B1或HPS2）（优选人HPS2）。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是Hermansky-Pudlak综合征3型，并且所述生物分子是一种蛋白质，其为HPS3溶酶体细胞器生物发生复合体2亚基1（HPS3）（优选人HPS3）。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是Hermansky-Pudlak综合征4型，并且所述生物分子是一种蛋白质，其为HPS4溶酶体细胞器生物发生复合体3亚基2（HPS4）（优选人HPS4）。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是Hermansky-Pudlak综合征5型，并且所述生物分子是一种蛋白质，其为HPS5溶酶体细胞器生物发生复合体2亚基2（HPS5）（优选人HPS5）。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是Hermansky-Pudlak综合征6型，并且所述生物分子是一种蛋白质，其为HPS6溶酶体细胞器生物发生复合体2亚基3（HPS6）（优选人HPS6）。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是Hermansky-Pudlak综合征7型，并且所述生物分子是营养不良短小蛋白结合蛋白1（DTNBP1或HPS7）（优选人HPS7）。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是Hermansky-Pudlak综合征8型，并且所述生物分子是一种蛋白质，其为溶酶体细胞器生物发生复合体1亚基3（BLOC1S3或HPS8）（优选人HPS8）。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是Hermansky-Pudlak综合征9型，并且所述生物分子是一种蛋白质，其为溶酶体细胞器生物发生复合体1亚基6（BLOC1S6或HPS9）（优选人HPS9）。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是克拉伯病，并且所述生物分子是一种蛋白质，其为半乳糖神经酰胺酶（GALC）（优选人GALC）。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是α-甘露糖苷贮积症，并且所述生物分子是一种蛋白质，其是甘露糖苷酶α 2B类成员1（MAN2B1）（优选人MAN2B1）。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是β-甘露糖苷贮积症，并且所述生物分子是一种蛋白质，其为甘露糖苷酶β（MANBA）（优选人MANBA）。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是异染性脑白质营养不良，并且所述生物分子是一种蛋白质，其为芳基硫酸酯酶A（ARSA）（优选人ARSA）。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是黏脂质症II α/β或I细胞疾病，并且所述生物分子是一种蛋白质，其为N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶亚基α和β（GNPTAB）（优选人GNPTAB）。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是黏脂质症III α/β或假性Hurler多发性营养不良，并且所述生物分子是一种蛋白质，其为N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶亚基α和β（GNPTAB）（优选人GNPTAB）。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是黏脂质症III γ，变体假性Hurler多发性营养不良，并且所述生物分子是一种蛋白质，其为N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶亚基γ（GNPTG）（优选人GNPTG）。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是黏脂质症IV，并且所述生物分子是一种蛋白质，其为粘脂蛋白TRP阳离子通道1（MCOLN1）（优选人MCOLN1）。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是黏多糖贮积症I型（MPS I）或Hurler综合征，并且所述生物分子是一种蛋白质，其为α-L-艾杜糖苷酸酶（IDUA）（优选人IDUA）。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是黏多糖贮积症II型（MPS II）或Hunter综合征，并且所述生物分子是一种蛋白质，其为艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶（IDS）（优选人IDS）。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是黏多糖贮积症IIIA型（MPSIIIA）或Sanfilippo综合征A，并且所述生物分子是一种蛋白质，其为N-磺氨基葡糖磺基氢化酶（SGSH）（优选人SGSH）。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是黏多糖贮积症IIIB型（MPS IIIB）或Sanfilippo综合征B，并且所述生物分子是一种蛋白质，其为N-乙酰基-α-氨基葡萄糖苷酶（NAGLU）（优选人NAGLU）。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是黏多糖贮积症IIIC型（MPS IIIC）或Sanfilippo综合征C，并且所述生物分子是一种蛋白质，其为乙酰肝素-α-氨基葡萄糖N-乙酰转移酶（HGSNAT）（优选人HGSNAT）。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是黏多糖贮积症IIID型（MPS IIID）或Sanfilippo综合征D，并且所述生物分子是一种蛋白质，其为葡糖胺（N-乙酰基）-6-硫酸酯酶（GNS）（优选人GNS）。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是黏多糖贮积症IVA型（MPS IVA）或Morquio综合征A，并且所述生物分子是一种蛋白质，其为半乳糖胺（N-乙酰基）-6-硫酸酯酶（GALNS）（优选人GALNS）。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是黏多糖贮积症IVB型（MPS IVB）或Morquio综合征B，并且所述生物分子是一种蛋白质，其为半乳糖苷酶β1（GLB1）（优选人GLB1）。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是黏多糖贮积症VI型（MPS VI）或Maroteaux-Lamy综合征，并且所述生物分子是一种蛋白质，其为芳基硫酸酯酶B（ARSB）（优选人ARSB）。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是黏多糖贮积症VII型（MPS VII）或Sly疾病，并且所述生物分子是一种蛋白质，其为β-葡萄糖醛酸酶（GUSB）（优选人GUSB）。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是黏多糖贮积症IX型（MPSIX），并且所述生物分子是一种蛋白质，其为透明质酸酶1（HYAL1）（优选人HYAL1）。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是多种硫酸酯酶缺乏症，并且所述生物分子是一种蛋白质，其为硫酸酯酶修饰因子1（SUMF1）（优选人SUMF1）。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是尼曼匹克病A型和B型，并且所述生物分子是一种蛋白质，其为鞘磷脂磷酸二酯酶1（SMPD1）（优选人SMPD1）。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是尼曼匹克病C1型，并且所述生物分子是一种蛋白质，其为NPC细胞内胆固醇转运蛋白1（NPC1）（优选人NPC1）。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是尼曼匹克病C2型，并且所述生物分子是一种蛋白质，其为NPC细胞内胆固醇转运蛋白2（NPC2）（优选人NPC2）。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是Salla病，并且所述生物分子是一种蛋白质，其为溶质载体家族17成员5（SLC17A5）（优选人SLC17A5）。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是Schindler病或神崎病（Kanzaki disease），并且所述生物分子是一种蛋白质，其为α-N-乙酰半乳糖胺酶（NAGA）（优选人NAGA）。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是唾液酸沉积症I型或樱桃红斑肌阵挛综合征，并且所述生物分子是一种蛋白质，其为神经氨酸酶1（NEU1）（优选人NEU1）。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是Wolman病和胆固醇酯贮积病，并且所述生物分子是一种蛋白质，其为脂肪酶A，溶酶体酸型（LIPA）（优选人LIPA）。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是脊髓性肌萎缩症，并且所述生物分子是一种蛋白质，其为运动神经元生存（SMN）蛋白（优选人SMN蛋白）。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是杜氏肌营养不良症（DMD），并且所述生物分子是一种蛋白质，其为微抗肌萎缩蛋白（优选人微抗肌萎缩蛋白）。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是苯丙氨酸羟化酶缺乏症，并且所述生物分子是一种蛋白质，其为苯丙氨酸羟化酶（PAH）（优选人PAH）。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是血友病A，并且所述生物分子是一种蛋白质，其为凝血因子VIII（FVIII）（优选人FVIII）。在具体实施方式中，所述疾病或障碍是血友病B，并且所述生物分子是一种蛋白质，其为凝血因子IX（FIX）（优选人FIX）。在优选的实施方式中，所述生物分子是功能性蛋白质（例如野生型蛋白质）。
在某些实施方式中，所述方法用于遗传性血色素沉着症（HH）、铁过载的主要病症、威尔逊氏病、铜过载的遗传病症或α1-抗胰蛋白酶缺乏的治疗。在某些实施方式中，所述生物分子是人α1-抗胰蛋白酶（登录号：P01009.3）、HFE蛋白（登录号NP_000401.1或Q30201）或肝蛋白ATP7B（登录号P35670.4）或具有大于50、60、70、80、90、95或95序列同一性或相似性的变体。
在某些实施方式中，所述方法用于高胆固醇血症的治疗。在某些实施方式中，所述生物分子是人苯丙氨酸羟化酶（登录号：P00439.1）或具有大于50、60、70、80、90、95或95序列同一性或相似性的变体。
在某些实施方式中，所述方法用于1型酪氨酸血症的治疗。在某些实施方式中，所述生物分子是人延胡索酰乙酰乙酸水解酶（登录号：P16930.2）或具有大于50、60、70、80、90、95或95序列同一性或相似性的变体。
在某些实施方式中，所述方法用于2型酪氨酸血症的治疗。在某些实施方式中，所述生物分子是人酪氨酸氨基转移酶（登录号：P17735.1）或具有大于50、60、70、80、90、95或95序列同一性或相似性的变体。
在某些实施方式中，所述方法用于高胱氨酸尿症和高同型半胱氨酸血症的治疗。在某些实施方式中，所述生物分子是人甲烯四氢叶酸还原酶（登录号：P42898.3）或具有大于50、60、70、80、90、95或95序列同一性或相似性的变体。
在某些实施方式中，所述方法用于高脂血症和高胆固醇血症的治疗。在某些实施方式中，所述生物分子是人中链酰基辅酶A脱氢酶（登录号：P11310.1）或具有大于50、60、70、80、90、95或95序列同一性或相似性的变体。
在某些实施方式中，所述方法用于半乳糖血症的治疗。在某些实施方式中，所述生物分子是人半乳糖-1-磷酸尿苷转移酶（登录号：P07902.3）或具有大于50、60、70、80、90、95或95序列同一性或相似性的变体。
在某些实施方式中，所述方法用于莱施尼汉综合征（Lesch-Nyhan syndrome）的治疗。在某些实施方式中，所述生物分子是人次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶（登录号：P00492.2）或具有大于50、60、70、80、90、95或95序列同一性或相似性的变体。
在某些实施方式中，所述方法用于戈谢病的治疗。在某些实施方式中，所述生物分子是人脑苷脂酶（登录号：P07602.2，登录号：P04062.3）或具有大于50、60、70、80、90、95或95序列同一性或相似性的变体。
在某些实施方式中，所述方法用于Tay-Sachs病的治疗。在某些实施方式中，所述生物分子是人β-己糖胺酶A（登录号：P06865.2）或具有大于50、60、70、80、90、95或95序列同一性或相似性的变体。
在某些实施方式中，所述方法用于法布里病的治疗。在某些实施方式中，所述生物分子是人α-半乳糖苷酶（登录号：P06280.1）或具有大于50、60、70、80、90、95或95序列同一性或相似性的变体。
在某些实施方式中，所述方法用于Hunter综合征的治疗。在某些实施方式中，所述生物分子是人艾杜糖醛酸硫酸酯酶（登录号：P22304.1）或具有大于50、60、70、80、90、95或95序列同一性或相似性的变体。
在某些实施方式中，所述方法用于糖原贮积病Ia型的治疗。在某些实施方式中，所述生物分子是人葡萄糖-6-磷酸酶（登录号：P35575.2）或具有大于50、60、70、80、90、95或95序列同一性或相似性的变体。
在某些实施方式中，所述方法用于氨代谢的治疗。在某些实施方式中，所述生物分子是人鸟氨酸氨甲酰基转移酶（登录号：P00480.3）或具有大于50、60、70、80、90、95或95序列同一性或相似性的变体。
在某些实施方式中，所述方法用于苯丙酮尿症的治疗。在某些实施方式中，所述生物分子是人低密度脂蛋白受体（登录号：P01130.1）或具有大于50、60、70、80、90、95或95序列同一性或相似性的变体。
在某些实施方式中，所述方法用于丙酸血症的治疗。在某些实施方式中，所述生物分子是人丙酰辅酶A羧化酶，PCCA和/或PCCB（登录号：P05166.3β、NP_000273.2α、NP_001121164.1α）或具有大于50、60、70、80、90、95或95序列同一性或相似性的变体。
5.8测定
5.8.1mRNA水平的分析
基因的水平或表达的变化可以本领域已知的多种方式测定。
例如，检测或定量mRNA水平的多种方法是本领域已知的。示例性方法包括但不限于RNA印迹（northern blot）、核糖核酸酶保护测定、基于PCR的方法等。基因的mRNA序列可用于制备与mRNA序列至少部分互补的探针。然后可以使用任何合适的测定，例如基于PCR的方法、RNA印迹、测定杆（dipstick）测定等，使用探针来检测样品中的mRNA。
测定方法可以根据所需mRNA信息的类型而变化。示例性方法包括但不限于RNA印迹和基于PCR的方法（例如，qRT-PCR）。诸如qRT-PCR的方法还可以准确地定量样品中mRNA的量。
可以使用任何合适的测定平台来确定样品中mRNA的存在。例如，测定可以是测定杆、膜、芯片、盘、测试条、过滤器、微球、载玻片、多孔板或光纤的形式。测定系统可以具有固体支持物，对应于mRNA的核酸附接在该固体支持物上。固体支持物可以包括例如塑料、硅、金属、树脂、玻璃、膜（membrane）、颗粒、沉淀物、凝胶、聚合物、片材、球体、多糖、毛细管、薄膜（film）、板或载玻片。测定组分可作为用于检测mRNA的试剂盒制备和包装在一起。
如果需要，可以标记核酸以制备标记的mRNA群。通常，可以使用本领域公知的方法（例如，使用DNA连接酶、末端转移酶或通过标记RNA骨架等）来标记样品。参见，例如，Ausubel等，Short Protocols in Molecular Biology（Wiley&Sons, 3rd ed. 1995）；Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual （Cold Spring Harbor,N.Y., 3rd ed. 2001）。在一些实施方式中，样品用荧光标记物标记。示例性荧光染料包括但不限于氧杂蒽（xanthene）染料、荧光素染料（例如，异硫氰酸荧光素（FITC）、6-羧基荧光素（FAM）、6-羧基-2’,4’,7’,4,7-六氯荧光素（HEX）、6-羧基-4’,5’-二氯-2',7'-二甲氧基荧光素（JOE）、罗丹明染料（例如，罗丹明110（R110）、N,N,N’,N'-四甲基-6-羧基罗丹明（TAMRA）、6-羧基-X-罗丹明（ROX）、5-羧基罗丹明6G（R6G5或G5）、6-羧基罗丹明6G（R6G6或G6））、花青染料（例如，Cy3、Cy5和Cy7）、Alexa染料（例如，Alexa-fluor-555）、香豆素、二乙基氨基香豆素、伞形酮、苯甲亚胺染料（例如，Hoechst 33258）、菲啶染料（例如，德克萨斯红）、乙锭染料、吖啶染料、咔唑染料、吩噁嗪染料、卟啉染料、聚甲炔染料、BODIPY染料、喹啉染料、芘、荧光素氯三嗪基（Ctriazinyl）、曙红染料、四甲基罗丹明、丽丝胺、萘基荧光素等。
典型的mRNA测定方法可以包含以下步骤：1）获得表面结合的受试者探针（subjectprobe）；2）在足以提供特异性结合的条件下将mRNA群与表面结合的探针杂交；（3）杂交后洗涤以去除未与表面结合的探针特异性结合的核酸；和（4）检测杂交的mRNA。这些步骤中的每一个中使用的试剂及其使用条件可以根据特定应用而变化。
杂交可以在合适的杂交条件下进行，其严格性可以根据需要变化。典型的条件足以在互补结合成员之间，即在样品中的表面结合的受试者探针和互补mRNA之间的固体表面上生产探针/靶复合物。在某些实施方式中，可以采用严格杂交条件。
杂交通常在严格杂交条件下进行。标准杂交技术（例如，在足以提供样品中的靶mRNA与探针的特异性结合的条件下）描述于Kallioniemi等，Science, 258:818-821（1992）和国际专利申请公开号WO 93/18186中。一般技术的若干指导是可用的，例如Tijssen，Hybridization with Nucleic Acid Probes，第I和II部分（Elsevier，Amsterdam1993）。对于适合于原位杂交的技术的描述，参见Gall等，Meth. Enzymol. 1981, 21:470-480；Angerer等，Genetic Engineering: Principles and Methods, Vol 7, pgs 43-65（Plenum Press, New York, Setlow and Hollaender, eds. 1985）。适当条件（包括温度、盐浓度、多核苷酸浓度、杂交时间、洗涤条件的严格性等）的选择将取决于实验设计，包括样品来源、捕获剂的类型（identity）、预期的互补性程度等，并且可以根据本领域普通技术人员的常规实验来确定。
普通技术人员将容易认识到，可以利用替代但相当的杂交和洗涤条件来提供类似严格性的条件。
在mRNA杂交程序之后，通常洗涤表面结合的多核苷酸以去除未结合的核酸。洗涤可以使用任何方便的洗涤方案进行，其中洗涤条件通常是严格的，如上所述。然后使用标准技术检测靶mRNA与探针的杂交。
其他方法，例如基于PCR的方法，也可以用于检测基因的表达。PCR法的实例可见于美国专利第6,927,024号中，其全部内容通过引用并入本文。RT-PCR法的实例可见于美国专利第7,122,799号，其全部内容通过引用并入本文。荧光原位PCR的方法描述在美国专利第7,186,507号中，其全部内容通过引用并入本文。
在一些实施方式中，定量反转录PCR（qRT-PCR）可用于检测和定量RNA靶标两者（Bustin等，Clin. Sci. 2005，109:365-379）。通过qRT-PCR获得的定量结果通常比定性数据更具信息量。因此，在一些实施方式中，基于qRT-PCR的测定可用于在基于细胞的测定期间测量mRNA水平。qRT-PCR法也可用于监测患者治疗。基于qRT-PCR-的方法的实例可见于例如美国专利第7,101,663号中，其全部内容通过引用并入本文。
与常规逆转录酶PCR和琼脂糖凝胶分析相反，qRT PCR给出定量结果。qRT-PCR的另一个优点是相对容易和使用方便。用于qRT-PCR的仪器（例如Applied Biosystems 7500）是可商购的，试剂（例如TaqMan® Sequence Detection Chemistry）也是可商购的。例如，根据制造商的说明书，可以使用TaqMan® Gene Expression Assay。这些试剂盒是用于快速、可靠地检测和定量人、小鼠和大鼠mRNA转录本的预配制的基因表达测定。为了确定与特定扩增子累积相关的荧光信号越过阈值（称为CT）的循环数，可以例如使用7500 Real-Time PCR系统序列检测软件相对于使用比较CT相对定量计算方法来分析数据。使用该方法，输出表示为表达水平的倍数变化。在一些实施方式中，可选择阈值水平为由软件自动确定。在一些实施方式中，阈值水平被设为高于基线但足够低以确保其在扩增曲线的指数生长区域内。
在其他实施方式中，可以通过下一代测序（NGS）来检测或定量靶RNA。
5.8.2蛋白水平的分析
蛋白表达水平的变化可以通过测量感兴趣的蛋白质的水平来评估。蛋白水平可以本领域公知的多种方式评估或定量，例如免疫沉淀、蛋白质印迹分析（免疫印迹）、酶联免疫吸附测定（ELISA）、定量蛋白质测定、蛋白质活性测定（例如，半胱天冬酶(Caspase)活性测定）、免疫组织化学、免疫细胞化学或荧光激活细胞分选（FACS）、LC-MS（液相色谱-质谱）和其他方法。针对靶标的抗体可以从各种来源鉴定和获得，例如抗体的MSRS目录（AerieCorporation, Birmingham, Mich.），或者可以通过本领域公知的常规单克隆或多克隆抗体产生方法制备。用于检测小鼠、大鼠、猴和人感兴趣的蛋白的抗体是可商购的。在MassSpec的情况下，可以使用标记或未标记的方法测量蛋白水平。
5.8.3体内分析
体内测定可用于评估重组病毒颗粒（包括本公开的重组AAV颗粒、非病毒基因递送系统或药物组合物）的治疗功效。
在一些实施方式中，运动功能通过动物的翻正（righting）、旷场行为表现（openfield performance）来测量。在某些实施方式中，通过动物体内的全身体积描记器（wholebody plethysmograph）、侵入性抵抗力（invasive resistance）和顺应性测量（compliancemeasurement）来测量呼吸。
在一些实施方式中，总体存活（OS）和无疾病存活（DFS）通过活动物中每天两次体重、健康状态观察来测量。
测试可以在正常动物或实验疾病模型中进行。为了施用至动物，寡核苷酸可配制在药学上可接受的稀释剂例如磷酸盐缓冲盐水中。施用包括肠胃外施用途径，例如腹膜内、静脉内和皮下。本公开的重组病毒颗粒（包括重组AAV颗粒、非病毒基因递送系统或药物组合物）的剂量和施用频率的计算在本领域技术人员的能力范围内，并且取决于例如施用途径和动物体重等因素。在用本公开的重组病毒颗粒（包括重组AAV颗粒、非病毒基因递送系统或药物组合物）治疗一段时间后，可以从感兴趣的组织（包括肝脏、肌肉、肾脏、脾脏、CNS组织或CSF）中分离RNA或蛋白质，并且例如使用NGS测量感兴趣的蛋白的表达变化。
5.9试剂盒和制品
还提供了包含本文所述的任何组合物的试剂盒、单位剂量和制造品。在一些实施方式中，提供了试剂盒，其含有本文所述的药物组合物中的任一种，并且优选提供其使用说明书。
本申请的试剂盒在合适的包装中。合适的包装包括但不限于小瓶、瓶、罐、柔性包装（例如，密封的聚酯薄膜（Mylar）或塑料袋）等。试剂盒可以任选地提供另外的组分，例如缓冲液和解释性信息。因此，本申请还提供了制造品，其包括小瓶（例如密封小瓶）、瓶、罐、柔性包装等。
制造品可包括容器以及在容器上或与容器相关的标签或包装附页。合适的容器包括例如瓶、小瓶、注射器等。容器可由多种材料例如玻璃或塑料形成。通常，容器容纳有效治疗本文所述的疾病或障碍的组合物，并且可以具有无菌进入孔（例如，容器可以是静脉内溶液袋或具有可由皮下注射针刺穿的塞子的小瓶）。标签或包装附页指示组合物用于在个体中治疗特定病症。标签或包装附页将进一步包括将组合物施用至个体的说明书。标签可以指示复溶和/或使用的指导。容纳药物组合物的容器可以是多用途小瓶，其允许重复施用（例如2-6次施用）重构制剂。包装附页是指通常包括在治疗产品的商业包装中的说明书，其包含关于适应症、用途、剂量、施用、禁忌症和/或关于此类治疗产品的使用的警告的信息。另外，制造品还可以包括第二容器，其包含药学上可接受的缓冲液，例如抑菌注射用水（BWFI）、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。从商业和用户的角度来看，还可以包括其他期望的材料，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针和注射器。
试剂盒或制造品可以包括多个单位剂量的药物组合物和使用说明书，以足以在药房（例如医院药房和配制药房）中储存和使用的量包装。
序列
表1.序列表
实施例
本文提供的某些实施方式通过以下非限制性实施例说明，其描述了各种人α-半乳糖苷酶A编码序列、启动子、表达盒和重组腺相关病毒（AAV）颗粒的设计和测试，表明它们特别适用于基因治疗，尤其适用于包括法布里病的溶酶体贮积症。
实施例1：通过静脉内施用AAV-GLA校正法布里病小鼠模型中的底物水平
1.人α-半乳糖苷酶A（GLA）密码子优化。
合成经密码子优化的野生型（WT）人GLA编码序列的两个版本（hGLAco1和hGLAco2，分别具有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的核苷酸序列），并与鸡-β肌动蛋白（CB）启动子和牛生长激素（bGH）poly A序列一起克隆到表达盒骨架。将HepG2细胞接种到48孔板中（1e5细胞/孔）。接种后约20小时，使用Lipofectamine 3000转染表达hGLA或GFP（阴性对照，Neg.ctrl）的500 ng质粒。转染后72小时，收集上清液并以2,000 rpm离心10 min。将用于GLA的样品稀释100或1000倍，并且将来自GFP组的未稀释样品用于使用人α-半乳糖苷酶AELISA对试剂盒（Cat. No. SEK12078）的ELISA（图1A）。将样品稀释10倍以使用试剂盒（ab239716）测定α-半乳糖苷酶A活性（图1B）。使用抗α-半乳糖苷酶多克隆抗体（1∶1000，PA5-27349，Thermo Fisher），上样10微升经或未经PNGase F处理的样品用于蛋白质印迹分析（图1C）。PNGase F处理后的模式还证明了从HepG2细胞表达的α-半乳糖苷酶A的适当糖基化。hGLAco1显示比野生型GLA高2倍的蛋白表达。因此，选择hGLAco1（SEQ ID NO.1）用于进一步研究。
2.体外测试中的肝细胞-心肌细胞（HC）双特异性启动子。
将含有与各种心肌细胞特异性转录因子结合位点（C1-C5）连接的固定59-bp肝细胞启动子（SEQ ID NO.3）的五个启动子（HC1-HC5，分别具有SEQ ID NO：4-8的核苷酸序列）克隆到海肾荧光素酶（RLuc）报告基因的上游。由HSV-TK启动子驱动的另一个报告的基因即萤火虫荧光素酶（FLuc）在同一构建体上并用作内部对照。大鼠心肌细胞细胞系H9c2（ATCC）和HepG2细胞接种在96孔板中。接种后一天，使用Lipofectamine 3000转染含启动子HC1-HC5的质粒。转染后两天，按照制造商的指南，使用双荧光素酶测定试剂盒（Cat. No.E1500，Promega）和具有SpectraMax Injector Cartridge的SpectraMax i3x Multi-ModeMicroplate Reader进行发光定量。RLuc/FLuc比率用于测量HC启动子强度（图2）。SV40启动子驱动的RLuc和HSV-TK启动子驱动的FLuc质粒用作阳性对照（Pos.Ctrl）。HC1启动子（SEQID NO.4）在HepG2和H9c2中均显示强基因表达（图2）。其被选择用于体内研究。
3.体外测试中的截短型小鼠肌肉肌酸激酶（MCK）启动子。
将具有来自CK8e启动子（SEQ ID NO：14）的50-bp、55-bp和105-bp截短的三种版本的MCK启动子（MCK-D1~MCK-D3，分别具有SEQ ID NO：11-13的核苷酸序列）克隆到海肾荧光素酶（RLuc）报告基因的上游。将C2C12成肌细胞接种在96孔板中。接种后一天，使用Lipofectamine 3000转染含有MCK启动子的质粒。转染后两天，使用双荧光素酶测定试剂盒（Cat. No. E1500，Promega）和具有SpectraMax Injector Cartridge的SpectraMax i3xMulti-Mode Microplate Reader进行发光定量。RLuc/FLuc比率用于测量启动子强度（图3A）。CK8e启动子驱动的RLuc和HSV-TK启动子驱动的FLuc质粒用作对照。与CK8e启动子相比，50-bp、55-bp和105-bp截短不导致活性降低（图3A）。选择MCK-D3启动子（SEQ IDNO.13））用于进一步体内研究。通过组合59-bp肝细胞启动子和MCK-D3启动子构建合成启动子HC7（SEQ ID NO.10））。通过体内成像系统（IVIS）评估启动子HC7的活性。六周龄BALB/c雄性小鼠静脉内（尾静脉）注射含有由HC7启动子驱动的萤火虫荧光素酶转基因的AAV（1E11vg/小鼠）。在注射后一周（图3B）和三周（图3C），在肝脏和骨骼肌中观察到强发光信号。
4.人GLA表达盒介导HepG2中的α-半乳糖苷酶A表达和活性。
将具有不同启动子或GLA变体的四种构建体（表2）克隆到自补足腺相关病毒（scAAV）载体骨架。将HepG2细胞接种到48孔板中（1e5细胞/孔）。接种后一天，使用Lipofectamine 3000转染含有hGLA盒（表2）或GFP（阴性对照，Neg.ctrl）的500 ng质粒。通过组合59-bp肝细胞启动子以及截短和修饰的人MCK启动子（SEQ ID NO：15）构建启动子HC6（SEQ ID NO.9）。转染后三天，收集上清液并以2,000 rpm离心10 min。将用于GLA的样品稀释100或1000倍，并且将来自GFP组的未稀释样品用于使用人α-半乳糖苷酶A ELISA对试剂盒（Cat. No. SEK12078）的ELISA（图4A）。将样品稀释10倍以使用试剂盒（ab239716）测定α-半乳糖苷酶A活性（图4B）。thGLAco1：在C端具有2个氨基酸缺失的截短型人α-半乳糖苷酶A（核苷酸序列如SEQ ID NO：20所示）。所有构建体在HepG2中显示出高α-半乳糖苷酶A蛋白表达和活性。
表2.人GLA表达盒构建体。
5.人GLA表达盒介导H9c2细胞中的α-半乳糖苷酶A表达和活性。
使用Lipofectamine 3000将四种构建体（盒1-4）转染至H9c2细胞。表达GFP的质粒用作阴性对照。转染后三天，收集上清液用于人α-半乳糖苷酶A ELISA（图5A）和活性（图5B）分析。构建体盒3分别显示盒1和盒2的3.1倍、3.8倍表达（图5A）。最后两个氨基酸缺失导致体外1.4倍的α-半乳糖苷酶A活性（图5B）。
6.在法布里小鼠模型中表征盒1介导的活性和功效。
将表达盒1包装至scAAV9。通过三重质粒转染生产scAAV9，并通过碘克沙醇梯度超速离心法纯化。通过ddPCR测量载体基因组滴度，并通过SDS-PAGE确认纯度。通过0.22 μm过滤scAAV9载体，并在具有0.001% Pluronic F68（制剂缓冲液）的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中调节至约1E13 vg/mL。四组成年雄性GLA-KO小鼠（JAX stock #003535）通过尾静脉以4个剂量（2E11 vg/kg、2E12 vg/kg、6E12 vg/kg、2E13 vg/kg）静脉内注射含有盒1表达盒的scAAV9。将两组GLA-KO和野生型小鼠静脉内注射制剂缓冲液作为对照。每两周使用K2-EDTA管收集血清用于α-半乳糖苷酶A活性分析。α-Gal A在血清中的稳定表达持续至小鼠研究结束（图6A）。在第61天，与用缓冲液处理的野生型小鼠相比，接受scAAV9-盒1处理的GLA-KO小鼠在2E11 vg/kg、2E12 vg/kg、6E12 vg/kg和2E13 vg/kg剂量下在血清中分别显示出178倍、2360倍、7285倍和18485倍的人α-Gal A活性（图6B）。在终点，处死小鼠并用冷PBS灌注。从肝脏和心脏分离总RNA。DNA酶I处理的总RNA用于逆转录（RT）。使用hGLAco1特异性引物/探针将转化的cDNA用于定量实时PCR。将小鼠GAPDH引物/探针用作标准化的参考。显然，hGLA转基因mRNA水平在肝脏中显示剂量依赖性作用（图6C）。与低剂量组（2E11 vg/kg）相比，高剂量组（2E12 vg/kg、6E12 vg/kg、2E13 vg/kg）在心脏中观察到更高的hGLA转基因mRNA水平（图6D）。使用DNeasy Blood&Tissue试剂盒（Qiagen）从肝脏和心脏分离基因组DNA。通过使用hGLAco1和小鼠TFRC引物/探针的液滴数字PCR（ddPCR）测量那些组织中的AAV载体基因组拷贝。载体基因组拷贝在肝脏（图6E）和心脏（图6F）中均显示剂量依赖性方式。用RIPA缓冲液裂解约15 mg肝脏样品。离心后的上清液用或不用PNGase F处理。对于蛋白质印迹，上样2μg蛋白质/样品，并使用抗α-半乳糖苷酶多克隆抗体（1∶2000，PA5-27349，Thermo Fisher）。在scAAV9-盒1处理后，蛋白质印迹结果显示肝细胞中强人α-Gal A蛋白表达和适当的糖基化（图6G）。在缓冲液处理的GLA-KO和野生型小鼠中未检测到人α-Gal A蛋白。来自肝脏、心脏和肾脏的裂解样品用于α-Gal A活性分析（图6H）。与缓冲液处理的野生型小鼠相比，接受最低剂量（2E11 vg/kg）的scAAV9-盒1的GLA-KO小鼠在肝脏、心脏和肾脏中分别显示58倍、3倍和0.8倍的α-Gal A活性。用2E12 vg/kg的scAAV9-盒1处理的GLA-KO小鼠分别在肝脏、心脏和肾脏中显示1378倍、119倍和10倍的α-Gal A活性。用6E12 vg/kg的scAAV9-盒1处理的GLA-KO小鼠分别在肝脏、心脏和肾脏中显示3104倍、153倍和24倍的α-Gal A活性。用2E13vg/kg的scAAV9-盒1处理的GLA-KO小鼠分别在肝脏、心脏和肾脏中显示5005倍、1215倍和87倍的α-Gal A活性。
由于lyso-Gb3是法布里病的生物标志物，使用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）来定量底物水平。与溶媒对照处理的GLA-KO小鼠相比，所有AAV处理的GLA-KO小鼠在血清中显示显著降低的lyso-Gb3水平（图6I）。2E11 vg/kg的scAAV9-盒1处理将lyso-Gb3降低至GLA-KO对照小鼠的2.5%。三个较高剂量（2E12、6E12和2E13 vg/kg）的处理使得血清中的lyso-Gb3水平完全恢复正常（图6I）。2E12 vg/kg的scAAV9-盒1处理使得肝脏、心脏和肾脏中的lyso-Gb3水平完全恢复正常（图6J）。
7.在法布里小鼠模型中表征AAV-hGLA介导的活性和功效。
两个表达盒（盒1和盒3）包装有AAV9衍生的肝-肌肉趋向性变体AVT908。AAV生产、纯化和表征与上述类似。对于每个hGLA表达盒，四组成年雄性GLA-KO小鼠（JAX stock #003535）通过尾静脉以2个剂量（6E11 vg/kg、2E12 vg/kg）进行静脉内注射（n=5/组）。每两周使用K2-EDTA管收集血清用于α-半乳糖苷酶A活性测量（图7A）。处理后8周，盒3的血清中的α-Gal A活性显示为盒1的134%。对于两种表达盒，在肝脏中观察到类似的hGAL转基因mRNA水平。在肌肉组织中具有类似或甚至更低的载体基因组拷贝（图7B）的情况下，盒3在心脏和四头肌中显示出比盒1显著更高的hGLA转基因mRNA水平（图7C）。一致地，对于两种剂量，与盒1相比，盒3在心脏中显示出84倍的活性。RT-qPCR数据证实肝细胞-肌肉双特异性启动子HC7在肝脏和肌肉两者中的活性。由于小鼠在组织收集前用PBS完全灌注，在心脏中检测到的α-Gal A蛋白源自心肌细胞和/或被它们摄取。通过蛋白质印迹，高剂量的盒3导致心脏中存在更高的α-Gal A蛋白（图7D）。2E12 vg/kg剂量的盒1也在心脏中显示α-Gal A蛋白的存在。小鼠GAPDH用作对照。将肝脏、心脏和肾脏组织裂解用于α-Gal A活性测量。所有组织在AAV-hGLA处理后显示高活性。2E12 vg/kg的盒3给药在肝脏、心脏和肾脏中分别显示出其6E11 vg/kg给药的274%、632%、189%的α-Gal A活性（图7E）。与缓冲液处理的GLA-KO小鼠相比，在AAV的背景下，通过用2E12 vg/kg的盒3处理的GLA-KO小鼠的肝脏和心脏中的免疫染色来检测稳健且广泛表达的人α-Gal A蛋白（图7F）。在肾脏中还观察到AAV表达的人α-Gal A蛋白的存在（图7F）。
实施例2：通过静脉内施用AAV-GLA校正法布里病小鼠模型中的底物水平
法布里病（FD）是一种罕见的X连锁代谢障碍，其由GLA基因中的致病性突变导致的溶酶体酶α-半乳糖苷酶A（α-Gal A）缺乏引起。溶酶体内底物的逐渐积累导致细胞功能障碍和多器官损伤。目前的酶替代疗法是FD的有效治疗，然而，每两周的终生输注对患者来说是重大负担。为了提供具有持久作用的单次施用，本研究旨在开发用于FD的基于重组腺相关病毒（rAAV）载体的基因治疗。使用两种算法生成具有最小CpG的经密码子优化的人GLA（hGLA）cDNA。在体外评价了一系列合成肝亲和性启动子。然后选择优化的转基因表达盒并包装到AAV9（scAAV9-hGLA）中。对10周龄α-Gal A KO雄性小鼠单次静脉内注射scAAV9-hGLA导致血清、肝脏、心脏和肾脏中剂量依赖性α-Gal A活性。α-Gal A在血清中的稳定表达持续至8周小鼠研究结束。与溶媒对照（缓冲液）处理的野生型小鼠相比，接受最低剂量（2×1011vg/kg）的GLA-KO小鼠在血清、肝脏、心脏和肾脏中分别显示178倍（×）、58×、3×、0.8×的α-Gal A活性。用2×1012vg/kg的scAAV9-hGLA处理的GLA-KO小鼠显示2360×、1378×、119×、10×的α-Gal A活性。最高剂量（2×1013vg/kg）导致血清中高达18,485×的α-Gal A活性。由于lyso-Gb3是FD的生物标志物，使用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）来定量底物水平。与溶媒对照处理的GLA-KO小鼠相比，所有AAV处理的GLA-KO小鼠在血清中显示显著降低的lyso-Gb3水平。2×1011vg/kg的scAAV9-hGLA处理将lyso-Gb3降低至GLA-KO对照小鼠的2.5%。三个较高剂量（2×1012、6×1012和2×1013vg/kg）的治疗完全使血清、肝脏、心脏和肾脏中的lyso-Gb3水平恢复正常。经密码子优化的hGLA转基因mRNA水平与肝脏中的AAV载体基因组拷贝相关，并且显示出剂量依赖性作用。通过蛋白印迹证明了源自肝脏的稳健的人α-Gal A蛋白表达和适当的糖基化。免疫染色证实了肝脏、心脏和肾脏中α-Gal A的存在。组织病理学检查显示所有剂量均没有观察到毒性。最后，该研究证明，通过使用内部开发的新型肝-肌趋向性衣壳AVT908和启动子，可以进一步最小化有效剂量。数据支持用于法布里病的低剂量AAV-GLA基因治疗的开发。
实施例3：工程化AAV衣壳介导NHP中的稳健hGLA表达
将人GLA转基因表达盒3（SEQ ID NO：18）包装在衣壳AAV9（SEQ ID NO：21）、AVT917（SEQ ID NO：56）和AVT918（SEQ ID NO：58）中。通过三重转染法在HEK293细胞中生产所有3种AAV。在用亲和色谱纯化并通过0.22 μm过滤后，使用hGLA引物/探针通过液滴数字PCR（ddPCR）确定载体基因组滴度。通过SDS-PAGE分析纯度。内毒素水平低于1 EU/mL的AAV产品用于非人灵长类动物（NHP）研究。
使用没有预先存在针对AAV9的中和抗体的三只成年（>3岁）雄性食蟹猴来比较不同的AAV衣壳介导的体内hGLA表达。
将每只动物以2E13 vg/kg的剂量用表达hGLA的单一AAV静脉内施用，且不使用免疫抑制剂。
在施用后8周处死注射含hGLA表达盒3的AVT918的动物。收获并处理血浆、肝脏、心脏、肾脏和骨骼肌以进行α-Gal A活性测量。
在施用后13周处死注射含hGLA表达盒3的AVT917的动物。收获血浆、肝脏、心脏、肾脏和骨骼肌并进行α-Gal A活性测量。通过DNeasy Blood&Tissue试剂盒（Qiagen，69506）提取来自主要组织的总基因组DNA。用转基因hGLA特异性引物/探针（正向引物：正向：5’-GGCAGCTTTGGCTACTATGA-3’，反向：5’-GTCACAGTAGCAGCCATCAA-3’，探针：5’-FAM-TTGATGCCCAGACCTTTGCTGACT-BHQ1-3’）通过ddPCR（Bio-Rad，QX200）测量组织中的AAV载体基因组拷贝。使用RNA酶P引物/探针（Thermo Fisher Scientific，4403326）作为参考。为了定量组织中的转基因mRNA水平，通过TaKaRa MiniBEST通用RNA提取试剂盒（Takara，9767）分离总RNA。使用具有gDNA Eraser的PrimeScript™ RT试剂盒（Takara，RR047B）产生cDNA。hGLA引物/探针用于转基因特异性转录本。猕猴GAPDH（正向：5’-GCACCGTGAAGGCTGAGAAC-3’，反向：5’-GGATCTCGCTCCTGGAAGATG-3’，探针：5’-HEX-CTCGTCATCAATGGAAGCCCCATCA-BHQ1-3’）用作管家基因。使用2-ΔCt法计算相对转基因mRNA水平。
在监测血浆α-Gal A活性26周后，释放注射含hGLA表达盒3的AAV9的动物。从第6周以来，该动物中的血浆α-Gal A活性和人α-Gal A蛋白水平是稳定的（图8中的三角形符号）。26周长期数据表明，HC7启动子（SEQ ID NO：10）在NHP中在AAV的情况下具有稳定的活性。
在不同的时间点收集血浆和血清样品。使用基于荧光的酶活性测定来测量血浆中的α-Gal A活性。简言之，将4-甲基伞形酮（4-MU）（Sigma-Aldrich，M1381-100G）溶解在DMSO中并作为标准品连续稀释。使用4-MU-α-D-吡喃半乳糖苷（4-MU-α-Gal）（Cayman Chemical，16551）作为底物。还向样品中添加了N-乙酰基半乳糖胺（Sigma-Aldrich，A2795-500MG），一种α-半乳糖苷酶B抑制剂。在黑色96孔板（Corning，3603）中以100 rpm振荡在37℃下孵育2小时后，向每个孔中添加0.1 mL的0.5M甘氨酸-NaOH缓冲液（pH 10.5）以停止反应。使用终点设置测量荧光强度（Ex/Em=365/450 nm）。根据4MU标准曲线计算α-Gal A活性，并表示为nmol/h/mL血浆或nmol/h/mg蛋白质。
所有3种衣壳（AAV9、AVT917和AVT918）在静脉内施用后在NHP血浆中介导高α-GalA活性水平（图8A）。AVT917在血浆中介导最高的α-Gal A活性，并显示比基线水平高1,778倍（表）。
表3.用AAV-hGLA处理的NHP中的血浆α-Gal A活性（nmol/h/mL）。
/：不适用；ND：未测定。
所有3种衣壳（AAV9、AVT917和AVT918）在静脉内施用后在NHP的血浆中介导特异性人α-Gal A蛋白表达（图8B）。根据血浆中的人α-Gal A蛋白浓度，AVT917显示出最高的GLA表达（表）。
表4.在静脉内施用后在NHP中AAV介导的hGLA表达（ng/mL）。
/：不适用；ND：未测定。
通过ddPCR测量用AVT917处理的NHP组织中的AAV载体基因组（vg）拷贝。肝脏左叶、肝脏右叶、心脏、肾脏、三头肌、四头肌、腓肠肌中的载体基因组拷贝分别为990、1126、8.6、0.7、1.2、1.6、2.0 vg/二倍体基因组（dpg）。中枢神经系统（CNS）组织中的载体基因组拷贝低于1 vg/dpg（图9A）。通过RT-qPCR评估HC7启动子（SEQ ID NO：10）驱动的转基因hGLAmRNA水平和组织特异性。HC7启动子在肝脏中显示出稳健的活性，随后是心脏和骨骼肌（图9B）。在肾脏和CNS的组织中观察到弱启动子活性。在血浆中监测AVT917衣壳和HC7启动子介导的高hGLA转基因表达和高水平的α-Gal A活性。在施用含HC7-hGLA表达盒3的AVT917后十三周，收获主要组织并处理用于α-Gal A活性。与来自非AAV-hGLA处理的动物（Neg Ctrl）的组织中的α-Gal A活性相比，在心脏、肝脏、肾脏、腓肠肌、四头肌和三头肌分别观察到约80×、54×、1.6×、197×、68×、138×的提高（图9C）。
实施例4：含HC7-hGLA的衣壳AVT917在法布里小鼠中介导的功效。
将人GLA转基因表达盒3（SEQ ID NO：18）包装在衣壳AVT917（SEQ ID NO：56）中，并通过三重转染法在HEK293细胞中生产。纯化的AAV制备物称为AVT917-HC7-hGLA。为了探索最小有效剂量，向成年（~16周龄）雄性法布里小鼠（Gla-KO）静脉内注射3个剂量（2E11 vg/kg、6E11 vg/kg、2E12 vg/kg，n=10/组）的溶媒（制剂缓冲液）或AVT919-HC7-hGLA（盒3）。每两周收集血浆用于α-Gal A活性测量。与溶媒组小鼠相比，用AVT917-HC7-hGLA处理的所有小鼠在8周研究期间在血浆中显示超生理学α-Gal A活性（图10A）。在AVT917-HC7-hGLA处理的组中观察到α-Gal A活性的剂量依赖性增加（图10A）。处理后八周，在溶媒、低剂量（2E11vg/kg）、中剂量（6E11 vg/kg）、高剂量（2E13 vg/kg）组小鼠中的平均血浆α-Gal A活性分别为1.37 nmol/h/mL、2336.19 nmol/h/mL、6140.66 nmol/h/mL、18189.11 nmol/h/mL，对应于溶媒处理的法布里小鼠中的平均血浆α-Gal A活性水平的1×、1710×、4495×、13314×的提高。
通过RT-qPCR评估用AVT917-HC7-hGLA处理的法布里小鼠的组织中的转基因hGLAmRNA水平。首先，hGLA转录本在肝脏和心脏中（图11A，B）。弱hGLA mRNA水平在四头肌和腓肠肌骨骼肌中（图11D，E）。在肾脏和脾脏中观察到可忽略的转基因表达（图11C，F）。这些数据支持HC7启动子在体内具有肝细胞-肌细胞双特异性活性。
在法布里小鼠中单次静脉内给药AVT917-HC7-hGLA后八周，收获关键组织并使用液相色谱与串联质谱法（LC-MS-MS）处理用于底物Lyso-Gb3测量。与溶媒处理的法布里小鼠相比，用AVT917-HC7-hGLA处理的所有法布里小鼠在血浆、肝脏、心脏和肾脏中显示出显著的底物减少（图12）。与溶媒处理的法布里小鼠相比，用低剂量（2E11 vg/kg）的AVT917-HC7-hGLA处理的法布里小鼠在血浆、肝脏、心脏和肾脏中分别仅保留2.13%、4.16%、0.89%、8.73%的Lyso-Gb3（图12）。将溶媒处理的法布里小鼠组织中的Lyso-Gb3水平设为100%。
实施例4：NHP中AVT917介导的hGLA转基因表达
将AVT917-HC7-hGLA以2E12 vg/kg（N=3）和6E12 vg/kg（N=2）的剂量静脉内施用至成年雄性食蟹猴。收集血浆并通过基于荧光的4-MU法测量α-Gal A活性。AAV施用前5只动物的平均α-Gal A活性为15.6 nmol/h/L。施用后一周，2E12 vg/kg和6E12 vg/kg分别导致α-Gal A活性比基线水平提高234×、711×。从第6周以来，用2E12 vg/kg处理的3只动物的血浆中的α-Gal A活性是稳定的（图13A）。其中一只动物的观察时间长达26周。用6E12 vg/kg处理的2只动物的血浆中的α-Gal A活性在第2周和第6周之间是稳定的（图13A）。第6周后酶活性略微增加（图13A）。这些数据支持低剂量的AVT917-HC7-hGLA可以在单次静脉内施用后在NHP中提供超生理学和稳定的α-Gal A活性。
通过ELISA测量来自用AVT917-HC7-hGLA处理的NHP表达的人α-Gal A蛋白。在施用前，血浆中未检测到人α-Gal A蛋白。在AVT917-HC7-hGLA处理后一周，剂量为2E12 vg/kg的3只动物在血浆中显示53 ng/mL、105 ng/mL和224 ng/mL的人α-Gal A。第2周后这3只动物中人α-Gal蛋白水平是稳定的（平均水平：27~36 ng/mL）（图13B）。在第26周，一只动物在血浆中显示63 ng/mL的人α-Gal A蛋白。这些数据证实HC7可在NHP中提供稳定的启动子活性。在第1周，用6E12 vg/kg的AVT917-HC7-hGLA处理的2只动物在血浆中显示192 ng/mL和433ng/mL的人α-Gal A。第2周、第13周的平均人α-Gal A蛋白水平分别为123 ng/mL、111 ng/mL（图13B）。
实施例5：在NHP中AVT917和AVT919介导的hGLA转基因表达的比较
将含有盒3（SEQ ID：18）的AVT917或AVT919以2E12 vg/kg（N=1/衣壳）的剂量静脉内施用至成年雄性食蟹猴。收集血浆用于通过ELISA的人α-Gal A蛋白浓度测量。AAV施用前血浆中人α-Gal A的水平为0 ng/mL。施用一周后，AVT917和AVT919分别在血浆中产生224ng/mL、147 ng/mL的人α-Gal A（图14）。AVT917介导的血浆人α-Gal A水平高于AVT919（图14）。
通过引用并入
本文引用的所有参考文献通过引用整体并入本文并用于所有目的，其程度与每个单独的出版物或专利或专利申请被具体地和单独地指示出于所有目的通过引用整体并入。
在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对本发明进行许多修改和变化，这对于本领域技术人员来说是显而易见的。本文描述的具体实施方式仅作为示例提供，并且本发明仅由所附权利要求书的条款以及这些权利要求所赋予的等同物的全部范围来限制。
本公开一般使用肯定语言来描述许多实施方式来公开。本公开还具体地包括完全或部分地排除特定主题的实施方式，例如物质或材料、方法步骤和条件、操作规程、过程、测定或分析。因此，即使本公开在本文中通常没有根据本公开不包括的内容来表达，但是本文仍然公开了未明确包括在本公开中的方面。

Claims (28)

1. 一种包含编码人α-半乳糖苷酶A的核苷酸序列的多核苷酸，其中所述编码人α-半乳糖苷酶A的核苷酸序列包含SEQ ID NO：1。
2.一种表达盒，其包含权利要求1所述的包含编码人α-半乳糖苷酶A的核苷酸序列的多核苷酸以及包含编码启动子的核苷酸序列的多核苷酸，其中所述编码启动子的核苷酸序列可操作地连接到所述编码人α-半乳糖苷酶A的核苷酸序列。
3. 根据权利要求2所述的表达盒，其中所述编码启动子的核苷酸序列包含SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：10。
4.根据权利要求2或3所述的多核苷酸，其中所述启动子是肝细胞特异性启动子。
5.根据权利要求2或3所述的多核苷酸，其中所述启动子是肝细胞-肌细胞双特异性启动子。
6.根据权利要求2-5所述的表达盒，其还包含编码polyA信号的核苷酸序列。
7. 根据权利要求6所述的表达盒，其中编码所述表达盒的核苷酸序列包含SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：18。
8. 一种包含编码启动子的核苷酸序列的多核苷酸，其中所述编码启动子的核苷酸序列（i）包含SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：10。
9.一种表达盒，其包含权利要求8所述的包含编码启动子的核苷酸序列的多核苷酸以及包含编码人α-半乳糖苷酶A的核苷酸序列的多核苷酸，其中所述编码启动子的核苷酸序列可操作地连接到所述编码人α-半乳糖苷酶A的核苷酸序列。
10. 根据权利要求9所述的表达盒，其中所述编码人α-半乳糖苷酶A的核苷酸序列包含SEQ ID NO：1。
11.根据权利要求9所述的表达盒，其中所述启动子是肝细胞特异性启动子。
12.根据权利要求9所述的表达盒，其中所述启动子是肝细胞-肌细胞双特异性启动子。
13.根据权利要求9-12中任一项所述的表达盒，其还包含编码polyA信号的核苷酸序列。
14. 根据权利要求13所述的表达盒，其中编码所述表达盒的核苷酸序列包含SEQ IDNO：16或SEQ ID NO：18。
15.一种载体，其包含权利要求1或8所述的多核苷酸、或权利要求2-7或9-14中任一项所述的表达盒。
16.一种包含重组病毒基因组的重组病毒颗粒，所述重组病毒基因组包含权利要求2-7或9-14中任一项所述的表达盒。
17.一种重组腺相关病毒（AAV）颗粒，其包含：（a）AAV衣壳；和（b）重组AAV基因组，其包含侧接有AAV末端反向重复序列（ITR）的权利要求2-7或9-14中任一项所述的表达盒。
18.根据权利要求17所述的重组AAV颗粒，其是重组AAV血清型9（rAAV9）颗粒。
19.根据权利要求17或18所述的重组AAV颗粒，其中所述AAV衣壳包含变体AAV9衣壳蛋白。
20. 根据权利要求19所述的重组AAV颗粒，其中所述变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ IDNO：31、38、49、51、53、55、57、59或61的氨基酸序列。
21. 根据权利要求20所述的重组AAV颗粒，其中所述变体AAV9衣壳蛋白包含SEQ IDNO：30、37、48、50、52、54、56、58或60的氨基酸序列。
22.一种宿主细胞，其包含权利要求1或8所述的多核苷酸、权利要求15所述的载体、权利要求16所述的重组病毒颗粒或权利要求17-21中任一项所述的重组AAV颗粒。
23.一种宿主细胞群，其由权利要求16所述的重组病毒颗粒或权利要求17-21中任一项所述的重组AAV颗粒稳定转导。
24.一种药物组合物，其包含权利要求16所述的重组病毒颗粒或权利要求17-21中任一项所述的重组AAV颗粒、权利要求23所述的宿主细胞群，以及药学上可接受的载体。
25.一种生产重组病毒颗粒或重组AAV颗粒的方法，包括培养权利要求22所述的宿主细胞。
26.一种在有需要的受试者中治疗疾病或障碍的方法，包括向所述受试者施用权利要求16所述的重组病毒颗粒、权利要求17-21中任一项所述的重组AAV颗粒或权利要求24所述的药物组合物。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述疾病或障碍是溶酶体贮积症或法布里病。
28.根据权利要求26所述的方法，其中所述受试者是人。
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