CN121002178A - 用于浓缩生物分子的装置和方法 - Google Patents

Abstract

描述了一种经由薄膜蒸发(TFE)将含有生物分子的溶液(例如含有寡核苷酸的溶液)从约≤20 mg/mL的起始浓度浓缩至≥约200 mg/mL浓度，以用于高剂量/低体积应用的方法。还描述了用于浓缩含有生物分子的溶液的装置，如本文所述。

Description

用于浓缩生物分子的装置和方法

以电子方式提交的序列表的引用

本公开连同以ST.26 XML格式的序列表一起提交。序列表作为名称为“30289_US_PRI”的文件提供，所述文件于2024年2月22日创建且大小为29.9千字节(kb)。以ST.26 XML格式的序列表信息通过引用以其整体并入本文。

技术领域

本公开涉及化学和工程学，并且更具体地其涉及这样的装置和方法，所述装置和方法用于浓缩溶液中的生物分子，例如单链(ss)或双链(ds)寡核苷酸(即，治疗性寡核苷酸)，以用作药物产品(DP)制造中的原料药(DS)。

背景技术

治疗性寡核苷酸是用于治疗且预防疾病和病症的一种较新的模态(modality)。治疗性寡核苷酸合成可涉及许多上游和下游步骤，例如合成、切割和脱保护、纯化和浓缩。本文特别关注的是溶液中的治疗性寡核苷酸的浓缩，所述治疗性寡核苷酸用作DP或其它药物组合物的制造中的DS。

浓缩含有寡核苷酸的溶液的多种方法是已知的，例如层析、透析、蒸发、沉淀和超滤/渗滤(UF/DF)。目前，浓缩含有寡核苷酸的溶液的这些方法无法可靠地使溶液中的最终寡核苷酸浓度达到大于约100 mg/mL。然而，需要含有高度浓缩的寡核苷酸的溶液用于以最少的溶液体积配制并向有此需要的个体给药。

因此，需要用于将含有生物分子的溶液例如含有寡核苷酸的溶液浓缩至浓度≥200 mg/mL的装置和方法。

发明内容

为了满足这一需求，本公开首先描述了一种浓缩含有寡核苷酸的溶液的方法，其至少包括以下步骤：

(a).使溶液流过蒸发容器，其中溶液具有≤约20 mg/mL的起始寡核苷酸浓度，其中蒸发容器包括可旋转刮刀、用于加热的装置和用于加压的装置，其中可旋转刮刀将溶液刮成围绕蒸发容器内表面的薄膜，并且其中蒸发容器可处于起始温度和起始压力；和

(b).使气体通过蒸发容器；

(c).在与蒸发容器流体连通的冷凝器中冷凝并收集来自溶液的挥发性液体，其中冷凝器可以处于起始温度；和

(d).重复步骤(a)至(c)，直至溶液可以具有≥约200 mg/mL的最终寡核苷酸浓度。

在一些情况下，含有寡核苷酸的溶液的流速可以为约0.5 mL/min至约4.5 mL/min。

在一些情况下，旋转刮刀可以以约15 rpm至约105 rpm的速度旋转。

在一些情况下，蒸发容器的起始温度可以为约35℃至约60℃。

在一些情况下，蒸发容器的起始压力可以为约10托至约65托。

在一些情况下，气体可以是惰性气体，例如氮气，并且可以处于约1.5 psi至约5psi的起始清扫压力。

在一些情况下，冷凝器可以是内置式冷凝器(即，位于蒸发容器内)。在其它情况下，冷凝器可以是外置式冷凝器(即，与蒸发容器分离)。

在一些情况下，冷凝器的起始温度可以为约0℃。

第二，本公开描述了一种浓缩含有寡核苷酸的溶液的方法，其至少包括以下步骤：

(a).将起始体积的溶液装入蒸发容器中，其中溶液可以具有≤约20 mg/mL的起始寡核苷酸浓度，并且其中蒸发容器可以处于起始压力和起始温度；

(b).将蒸发容器中的溶液煮沸一段时间；和

(c).经由冷凝器从蒸发容器中抽取水蒸气，其中冷凝器可以处于起始温度，从而使溶液可以具有≥约200 mg/mL的最终寡核苷酸浓度。

在一些情况下，含有寡核苷酸的溶液的起始体积为约1 mL至约10 mL。

在一些情况下，蒸发容器的起始压力可以为约20托至约30托。

在一些情况下，蒸发容器的起始温度可以为约55℃至约65℃。

在一些情况下，一段时间可以为约4分钟至约4.5分钟。

在一些情况下，冷凝器的起始温度可以为约0℃。

在一些情况下，该方法可以进一步包括以下步骤：

(d).将最终寡核苷酸浓度≥约200 mg/mL的溶液从蒸发容器转移到例如收集容器中。

在一些情况下，该方法可以进一步包括以下步骤：

(e) 对新鲜体积的含有寡核苷酸的溶液重复步骤(a)至(d)。

在上述方法的一些情况下，含有寡核苷酸的溶液可以是含有ss寡核苷酸的溶液。在上述方法的其它情况下，含有寡核苷酸的溶液可以是含有ds寡核苷酸的溶液。

在上述方法的一些情况下，最终寡核苷酸浓度可以为约200 mg/mL至约400 mg/mL。在上述方法的其它情况下，最终寡核苷酸浓度可以为≤约450 mg/mL。在上述方法的再其它情况下，最终寡核苷酸浓度可以为≤约500 mg/mL。

在上述方法的一些情况下，含有寡核苷酸的溶液的最终体积可以为≤约2 mL。

此外，上述方法任选地可以包括对溶液进行切向流过滤(TFF)或冻干的后续步骤，以用于附加的浓缩和/或纯化。

第三，本公开描述了一种组合物，其包含浓度≥约200 mg/mL的寡核苷酸，例如ds寡核苷酸。

或者，本公开描述了由上述方法得到的具有≥约200 mg/mL浓度的组合物。

在这些组合物的一些情况下，所述组合物是溶液。在其它情况下，该组合物是冻干粉末。

在这些组合物的一些情况下，尤其是当为溶液时，该溶液的最终体积可以为≤约2mL。

第四，本公开首次描述了一种通过间歇蒸发(IE)浓缩含有生物分子的溶液(例如含有寡核苷酸的溶液)用于高剂量/低体积施用的装置。该装置包括：

(i).蒸发容器，其中蒸发容器包括用于加热的装置和用于加压的第一装置；

(ii).与蒸发容器流体连通的第一储库，其中第一储库是用于未浓缩的含有生物分子的溶液的进料；

(iii).与蒸发容器流体连通的第二储库，其中第二储库是浓缩的含有生物分子的溶液的收集器；和

(iv).与蒸发容器流体连通的冷凝器，其中冷凝器包括用于冷却的装置和用于加压的第二装置。

本文方法的优点在于，它们可用于浓缩ss或ds寡核苷酸。

本文方法的优点在于，与常规刮膜蒸发(WFE)或TFF设置中可以实现的浓度相比，它们可以用于显著增加溶液中的寡核苷酸浓度。

本文方法的优点在于，它们不导致含有寡核苷酸的溶液中寡核苷酸化学纯度的可测量损失(即，不降解寡核苷酸)。

本文方法的优点在于，它们导致体积减少，以用于有效储存和潜在的高剂量要求。

本文方法的优点在于，它们可以与其它寡核苷酸浓缩方法(例如TFF或冻干)组合以实现其更高的浓度。

附图说明

当考虑下文详细描述时，除上文阐述的那些之外的优点、效果、特征和目的将变得更显而易见。此类详细描述参考下述附图，其中：

图1显示了用于经由WFE浓缩含有寡核苷酸的溶液的示例性装置。

图2显示了用于经由IE浓缩含有寡核苷酸的溶液的示例性装置。

图3A-B显示了含有寡核苷酸的溶液的叠加变性超高效液相色谱(UPLC)色谱图，其中图3A显示了仅经由TFF浓缩、经由TFF随后WFE浓缩、仅经由WFE浓缩和经由WFE浓缩随后WFE (“双程WFE (double-pass WFE)”)的结果，而图3B显示了经由IE浓缩的结果。

图4A-B显示了含有寡核苷酸的溶液的叠加非变性UPLC色谱图，其中图4A显示了仅经由TFF浓缩、经由TFF随后WFE浓缩、仅经由WFE浓缩和经由“双程”WFE浓缩的结果，而图4B显示了经由IE浓缩的结果。

详述

概述

治疗性寡核苷酸，尤其是基于激活RNA (aRNA)、编辑RNA (eRNA)、抑制性RNA(iRNA)和信使RNA (mRNA)的治疗性寡核苷酸，是新兴类别的生物分子。虽然冻干通常是制备DS以产生固体粉末的最后步骤，但使用治疗性寡核苷酸的DS溶液会是有利的，因为它们在液体或冷冻溶液中的高稳定性，并且在制备DP溶液时可以简化生产流程。例如，DS制备的最终步骤可以是经由冻干去除任何水溶液以形成固体粉末，而DP工艺反过来可以包括将DS(作为固体粉末/冻干物)溶解在水中以形成DP。因此，需要冻干的替代方案，以允许从DS到DP的更无缝过渡，并消除冻干所需的成本和时间。

使用常规的TFF，由于渗透通量下降(会是由于渗透压升高、粘度增加和/或膜表面结垢)，含ds寡核苷酸溶液的浓度>100 mg/mL是难以实现的。虽然常规的WFE不像TFF那样面临相同的基于膜的挑战，但在蒸发容器(即，柱)中，会存在寡核苷酸的凝胶化或干燥的问题，当条件有利于缓慢的进料流速或为了在一次通过容器期间达到非常高的浓缩倍数而进行大量蒸发时，会发生这种情况。

相比之下，如下文实施例所示，本文的“双程”WFE方法和本文的IE方法实现浓度>约200 mg/mL。对于IE方法，避免使用WFE的“刮膜”元件可有助于减轻或抑制薄膜过度蒸发导致的凝胶和固体形成，从而允许经系统的单程浓缩，并避免刮刀(wiper blade)降解的可能性。本文的装置和方法可以提供在低体积溶液(即，≤约2 mL)中的高浓度治疗性寡核苷酸(即，>约200 mg/mL)。

缩写和定义

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有与本公开所属领域的技术人员通常理解相同的含义。尽管本文描述了优选的方法和材料，但与本文所述的那些方法和材料类似或等同的任何方法和材料都可以用于本文方法的实践或测试中。

另外，通过不定冠词“一个”或“一种”提及要素并不排除存在多于一个/种要素的可能性，除非上下文明确要求存在一个/种且仅一个/种要素。因此，不定冠词“一个”或“一种”通常意指“至少一个/种”。

此外，“包括/包含(including)”以及其它形式例如“包括/包含但不限于”、“包括/包含("include"、"includes"和"included")”的使用不是限制性的。

本文使用的某些缩写如下：

“ADAR”指作用于RNA酶的腺苷脱氨酶；“API”指活性药物成分；“aRNA”指激活RNA；“ASO”指反义寡核苷酸；“DF”指稀释倍数；“DIPEA”指N,N-二异丙基乙胺；“DIW”指去离子水；“DNA”指脱氧核糖核酸；“DP”指药物产品；“ds”指双链；“DS”指原料药；“DsiRNA”指Dicer底物干扰RNA；“eRNA”指编辑RNA；“GalNAc”指N-乙酰半乳糖胺；“H₂O”指水；“HFIP”指六氟异丙醇；“hr”指小时；“iRNA”指抑制性RNA；“IE”指间歇蒸发；“kDa”指千道尔顿；“L”指升；“MEC”指摩尔消光系数；“mg”指毫克；“min”指分钟；“mL”指毫升；“mol”指摩尔；“mRNA”指信使RNA；“miRNA”指微小RNA；“MW”指分子量；“MWCO”指截留分子量；“PES”指聚醚砜；“PFA”指全氟烷氧基；“psi”指磅/平方英寸；“RISC”指RNA诱导沉默复合物；“RITA”指RNA诱导转录激活；“RNA”指核糖核酸；“rRNA”指核糖体RNA；“rpm”指每分钟转数；“shRNA”指短发夹RNA；“siRNA”指小干扰RNA；“SPS”指固相合成；“ss”指单链；“TFE”指薄膜蒸发；“TFF”指切向流过滤；“TMP”指跨膜压(transmembrane pressure)；“tRNA”指转移RNA；“UPLC”指超高效液相色谱；“UV”指紫外线；“V”指体积；“W”指重量；“WFE”指刮膜蒸发。

本文使用的某些定义如下进行定义：

如本文使用的，“约”意指在一个或多个值的统计学有意义的范围内，所述值例如陈述的浓度、流速、长度、分子量、pH、压力、序列相似性、速度、时间范围、温度、体积等。此类值或范围通常可以在给定值或范围的20%内，更通常在10%内，且甚至更通常在5%内的数量级内。由“约”所涵盖的容许偏差将取决于处于研究下的特定系统，并且可以由本领域技术人员容易地了解。

如本文使用的，“激活RNA”或“aRNA”意指这样的核酸，其含有RNA并且经由RNA诱导转录激活(RITA)复合物途径介导RNA转录物的启动子或其它非编码转录物的靶向激活。aRNA通常是ds。aRNA激活、增加、调节或上调细胞中的靶核苷酸序列的表达。

如本文使用的，“生物分子”等意指包括或掺入氨基酸、碳水化合物、脂质和/或核苷酸的分子或化合物。本文感兴趣的生物分子的实例包括但不限于核酸(例如，寡核苷酸和多核苷酸)、肽、多肽和蛋白质。

如本文使用的，“脱氧核糖核苷酸”意指当与核糖核苷酸相比时，在其戊糖的2'位置处具有代替羟基的氢的核苷酸。修饰的脱氧核糖核苷酸在2'位置处具有除羟基外的原子的一种或多种修饰或取代，包括在核碱基、糖或磷酸基团中的修饰或取代或核碱基、糖或磷酸基团的修饰或取代。

如本文使用的，“药物产品”或“DP”意指任何治疗剂例如治疗性寡核苷酸的成品，其可在市场上获得，并且已准备好用于通常(但不必然)与一种或多种其它药学上可接受的成分结合使用。

如本文使用的，“原料药”或“DS”意指活性成分(例如治疗性寡核苷酸)，其旨在诊断、治愈、缓和、治疗和/或预防疾病或影响身体结构或任何功能方面提供药理活性或其它直接效应，但不包括此类成分的合成中使用的中间体。DS也称为活性药物成分(API)。DS用于制备DP。

如本文使用的，“编辑RNA”或“eRNA”意指这样的核酸，其含有RNA并且介导在靶核苷酸序列内的核苷酸插入、缺失且甚至碱基取代。RNA编辑已在许多不同类型的RNA，例如mRNA、微小RNA (miRNA)、转移RNA (tRNA)和核糖体RNA (rRNA)中观察到。RNA编辑是酶促介导的，或通过外源提供作用于RNA酶的腺苷脱氨酶(ADAR)，或通过将内源性ADAR引导至靶RNA核苷酸序列中的特异性位点，并且通常涉及通过经由互补寡核苷酸将ADAR引导至单一核苷酸位点而在该位点处的编辑。eRNA通常是ss。

如本文使用的，“抑制性RNA”或“iRNA”意指这样的核酸，其含有RNA并且经由RNA干扰，例如通过RNA诱导沉默复合物(RISC)途径，介导RNA转录物的靶向切割。一些iRNA是ss，而其它iRNA是ds并且具有有义链和反义链，其中所述有义链和反义链形成双链体。iRNA经由RNA干扰引导mRNA的序列特异性降解。iRNA减弱、抑制、调节或降低细胞中的靶核苷酸序列的表达。iRNA的实例包括但不限于反义寡核苷酸(ASO)、Dicer底物干扰RNA (DsiRNA)、miRNA、短发夹RNA (shRNA)或小干扰RNA (siRNA)。

如本文使用的，“间歇蒸发”或“IE”意指浓缩工艺，其中将限定量的待浓缩溶液装入加热并处于真空状态的容器中，并其中在装入另一批之前去除浓缩溶液。浓缩材料在此以“间歇”工艺收集，但该工艺也可以是连续的。

如本文使用的，“核苷酸”意指具有核苷(核碱基，例如腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶；以及戊糖，例如核糖或2'-脱氧核糖)和磷酸基团的有机化合物。核苷酸可以充当核酸聚合物例如脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)的单体单元。

如本文使用的，“寡核苷酸”意指短的核酸化合物(例如，长度小于约100个核苷酸的聚合物)，其可以包括脱氧核糖核苷酸(或修饰的脱氧核糖核苷酸)、核糖核苷酸(或修饰的核糖核苷酸)或两者。同样地，寡核苷酸可以是ss或ds，并且因此可以具有或可以不具有双链体区域。

如本文使用的，“合成的”是指这样的核酸或其它化合物，其是人工合成的(例如，使用机器例如固相核酸合成仪)，或否则并非衍生自通常产生核酸或其它化合物的天然来源(例如，细胞或生物)。

如本文使用的，“核糖核苷酸”意指具有核糖作为其戊糖的核苷酸，其在其2'位置处含有羟基基团。修饰的核糖核苷酸是在2'位置处具有除氢外的原子的一种或多种修饰或取代的核糖核苷酸，包括在核碱基、糖或磷酸基团中的修饰或取代或核碱基、糖或磷酸基团的修饰或取代。

如本文使用的，“治疗性寡核苷酸”意指具有治疗应用(即，在治疗疾病中的应用)的ss或ds核酸。此类核酸通常含有一个或多个修饰的核苷酸残基或键合，并且还可以包括靶向配体和/或递送媒介物。治疗性寡核苷酸的实例包括但不限于aRNA、eRNA、iRNA和mRNA。治疗性寡核苷酸的具体实例包括但不限于ASO、适体、短激活RNA (saRNA)、siRNA、miRNA和诱饵(decoys)。

如本文使用的，“刮膜蒸发”或“WFE”意指浓缩工艺，该工艺利用低浓度进料溶液(即，含有寡核苷酸的溶液)沿加热并在减压下的柱的受控向下流动，同时旋转刮刀将溶液刮成围绕柱内表面的薄膜，从而促进溶液中挥发性液体(例如，H₂O)的蒸发。同样且本文所用的，“双程WFE”是指对同一含有ds寡核苷酸的溶液进行至少两次WFE的工艺。

装置

本公开的示例性WFE装置如图1所示。此处，待浓缩的含有低浓度ss或ds寡核苷酸的溶液(未示出)可放置/储存在第一储库(1)中，该储库与本领域已知的用于WFE的蒸发容器(2) (即，包括例如加热装置和可旋转刮刀)流体连通。蒸发容器(2)可以进一步与用于去除挥发性液体的冷凝器(3)、用于缓解装置内冷凝形成的气体吹扫源(未示出)以及用于收集浓缩的含有寡核苷酸的溶液的第二储库(4)流体连通。可经由真空泵和控制器(6)对装置施加真空。在一些情况下，冷凝器可以是外部冷凝器(如图1所示)，尽管内部冷凝器也可以使用。如果使用内部冷凝器，则任选的收集容器(5)可用于收集蒸发的水或溶剂。

本公开的示例性IE装置如图2所示。此处，待浓缩的含有ss或ds寡核苷酸的溶液(未示出)可放置/储存在第一储库(1)(例如，注射泵)中，该第一储库(1)与蒸发容器(2)(例如，包括用于将柱加热至起始温度的装置和用于将柱加压至起始压力的装置的柱)流体连通。蒸发容器(2)可以进一步与用于去除挥发性液体的冷凝器(3)和用于收集浓缩的含有寡核苷酸的溶液的第二储库(4)流体连通。可经由真空泵和控制器(6)对第二储库(4)施加真空。冷凝器(3)可与用于收集浓缩的含有寡核苷酸的溶液的第三储库(8)流体连通。可经由真空泵和控制器(7)对第三储库(8)施加真空。在一些情况下，真空泵和控制器(6)可以与真空泵和控制器(7)为同一类型；然而，在其它情况下，真空泵和控制器(6)可以与真空泵和控制器(7)为不同类型。该装置任选地可以包括用于测量已收集的浓缩的含有寡核苷酸的溶液的量的天平(9)。

用于加热的示例性装置包括但不限于循环加热流体，例如气体或液体。在一些情况下，用于加热装置可以是乙二醇/水溶液。

用于加压的示例性装置包括但不限于真空。

方法

该方法可以包括本文所述的步骤，并且这些步骤可以(但不必然)以如所述的顺序进行。然而，其它顺序也是可设想的。此外，各个或多重步骤可以平行和/或在时间上重叠和/或单独地或以多重的重复步骤进行。此外，该方法可包括另外的、未指定的步骤。

同样，寡核苷酸可以通过本领域已知的任何方法进行制备，例如固相合成(SPS)单个链，然后，对于ds寡核苷酸在水中退火成双链体之前和/或之后，可以任选地对其进行用于纯化、溶剂交换、脱盐和浓缩的另外步骤。

“双程”WFE

简而言之，经由“双程”WFE浓缩含有寡核苷酸的溶液的方法可以包括步骤(a)使溶液流过具有可旋转刮刀的蒸发容器，其中蒸发容器可以处于起始压力和起始温度，并且其中可旋转刮刀将溶液刮成围绕蒸发容器内表面的薄膜。

在一些情况下，寡核苷酸可以为ss寡核苷酸。在其它情况下，寡核苷酸可以为ds寡核苷酸。

在一些情况下，含有寡核苷酸的溶液中的起始寡核苷酸浓度可以为≤约20 mg/mL。在其它情况下，起始寡核苷酸浓度可以为约5 mg/mL至约20 mg/mL或约10 mg/mL至约15mg/mL之间。在又其它情况下，起始寡核苷酸浓度可以为约5 mg/mL、约6 mg/mL、约7 mg/mL、约8 mg/mL、约9 mg/mL、约10 mg/mL、约11 mg/mL、约12 mg/mL、约13 mg/mL、约14 mg/mL、约15 mg/mL、约16 mg/mL、约17 mg/mL、约18 mg/mL、约19 mg/mL或约20 mg/mL。在又其它情况下，起始寡核苷酸浓度可以为≥约20 mg/mL但≤约30 mg/mL。在一些情况下，起始寡核苷酸浓度可以≥约30 mg/mL，只要其体积足够大且粘度足够低以流过系统(例如，在适当的情况下甚至≥约100 mg/mL)。

在一些情况下，含有寡核苷酸的溶液的pH可以为约6.0至约7.0。在其它情况下，含有寡核苷酸的溶液的pH可以为约6.0、约6.1、约6.2、约6.3、约6.4、约6.5、约6.6、约6.7、约6.8、约6.9或约7.0。

在一些情况下，含有寡核苷酸的溶液可以以约0.5 mL/min至约4.5 mL/min的起始流速流过蒸发容器。在其它情况下，起始流速可以为约0.6 mL/min至约4.4 mL/min、约0.7mL/min至约4.3 mL/min、约0.8 mL/min至约4.2 mL/min、约0.9 mL/min至约4.1 mL/min、约1.0 mL/min至约4.0 mL/min、约1.1 mL/min至约3.9 mL/min、约1.2 mL/min至约3.8 mL/min、约1.3 mL/min至约3.7 mL/min、约1.4 mL/min至约3.6 mL/min、约1.5 mL/min至约3.5mL/min、约1.6 mL/min至约3.4 mL/min、约1.7 mL/min至约3.3 mL/min、约1.8 mL/min至约3.2 mL/min、约1.9 mL/min至约3.1 mL/min、约2.0 mL/min至约3.0 mL/min、约2.1 mL/min至约2.9 mL/min、约2.2 mL/min至约2.8 mL/min、约2.3 mL/min至约2.7 mL/min、约2.4mL/min至约2.6 mL/min或约2.5 mL/min。在又其它情况下，起始流速可以为约0.5 mL/min至约1.0 mL/min、约1.0 mL/min至约1.5 mL/min、约1.5 mL/min至约2.0 mL/min、约2.0mL/min至约2.5 mL/min、约2.5 mL/min至约3.0 mL/min、约3.0 mL/min至约3.5 mL/min、约3.5 mL/min至约4.0 mL/min或约4.0 mL/min至约4.5 mL/min。在又其它情况下，起始流速可以为约0.5 mL/min、约0.6 mL/min、约0.7 mL/min、约0.8 mL/min、约0.9 mL/min、约1.0mL/min、约1.1 mL/min、约1.2 mL/min、约1.3 mL/min、约1.4 mL/min、约1.5 mL/min、约1.6mL/min、约1.7 mL/min、约1.8 mL/min、约1.9 mL/min、约2.0 mL/min、约2.1 mL/min、约2.2mL/min、约2.3 mL/min、约2.4 mL/min、约2.5 mL/min、约2.6 mL/min、约2.7 mL/min、约2.8mL/min、约2.9 mL/min、约3.0 mL/min、约3.1 mL/min、约3.2 mL/min、约3.3 mL/min、约3.4mL/min、约3.5 mL/min、约3.6 mL/min、约3.7 mL/min、约3.8 mL/min、约3.9 mL/min、约4.0mL/min、约4.1 mL/min、约4.2 mL/min、约4.3 mL/min、约4.4 mL/min或约4.5 mL/min。

在一些情况下，流速在浓缩期间可以固定(即，可以保持)。在其它情况下，流速在浓缩期间可以变化(即，可以从起始流速增加或可以从起始流速减少)。

在一些情况下，蒸发容器的起始压力可以为约10托至约65托。在其它情况下，起始压力可以为约11托至约64托、约12托至约63托、约13托至约62托、约14托至约61托、约15托至约60托、约16托至约59托、约17托至约58托、约18托至约57托、约19托至约56托、约20托至约55托、约21托至约54托、约22托至约53托、约23托至约52托、约24托至约51托、约25托至约50托、约26托至约49托、约27托至约48托、约28托至约47托、约29托至约46托、约30托至约45托、约31托至约44托、约32托至约43托、约33托至约42托、约34托至约41托、约35托至约40托、约36托至约39托、或约37托至约38托。在又其它情况下，起始压力可以为约10托至约15托、约15托至约20托、约20托至约25托、约25托至约30托、约30托至约35托、约35托至约40托、约40托至约45托、约45托至约50托、约50托至约55托、约55托至约60托、或约60托至约65托。在又其它情况下，起始压力可以为约10托、约11托、约12托、约13托、约14托、约15托、约16托、约17托、约18托、约19托、约20托、约21托、约22托、约23托、约24托、约25托、约26托、约27托、约28托、约29托、约30托、约31托、约32托、约33托、约34托、约35托、约36托、约37托、约38托、约39托、约40托、约41托、约42托、约43托、约44托、约45托、约46托、约47托、约48托、约49托、约50托、约51托、约52托、约53托、约54托、约55托、约56托、约57托、约58托、约59托、约60托、约61托、约62托、约63托、约64托或约65托。

在一些情况下，蒸发容器的压力在浓缩期间可以固定(即，可以保持)。在其它情况下，蒸发容器的压力在浓缩期间可以变化(即可以从起始压力增加或可以从起始压力减少)。

在一些情况下，蒸发容器的起始温度可以为约35℃至约60℃。在其它情况下，起始温度可以为约36℃至约59℃、约37℃至约58℃、约38℃至约57℃、约39℃至约56℃、约40℃至约55℃、约41℃至约54℃、约42℃至约53℃、约43℃至约52℃、约44℃至约51℃、约45℃至约50℃、约46℃至约49℃或约47℃至约48℃。在又其它情况下，起始温度可以为约35℃至约40℃、约40℃至约45℃、约45℃至约50℃、约50℃至约55℃、或约55℃至约60℃。在又其它情况下，起始温度可以是约35℃、约36℃、约37℃、约38℃、约39℃、约40℃、约41℃、约42℃、约43℃、约44℃、约45℃、约46℃、约47℃、约48℃、约49℃、约50℃、约51℃、约52℃、约53℃、约54℃、约55℃、约56℃、约57℃、约58℃、约59℃或约60℃。

在一些情况下，蒸发容器的温度在浓缩期间可以固定(即，可以保持)。在其它情况下，蒸发容器的温度在浓缩期间可以变化(即可以从起始温度增加或可以从起始温度减少)。

在一些情况下，旋转刮刀可以以约15 rpm至约105 rpm的起始速度旋转。在其它情况下，起始速度可以为约16 rpm至约104 rpm、约17 rpm至约103 rpm、约18 rpm至约102rpm、约19 rpm至约101 rpm、约20 rpm至约100 rpm、约21 rpm至约99 rpm、约22 rpm至约98rpm、约23 rpm至约97 rpm、约24 rpm至约96 rpm、约25 rpm至约95 rpm、约26 rpm至约94rpm、约27 rpm至约93 rpm、约28 rpm至约92 rpm、约29 rpm至约91 rpm、约30 rpm至约90rpm、约31 rpm至约89 rpm、约32 rpm至约88 rpm、约33 rpm至约87 rpm、约34 rpm至约86rpm、约35 rpm至约85 rpm、约36 rpm至约84 rpm、约37 rpm至约83 rpm、约38 rpm至约82rpm、约39 rpm至约81 rpm、约40 rpm至约80 rpm、约41 rpm至约79 rpm、约42 rpm至约78rpm、约43 rpm至约77 rpm、约44 rpm至约76 rpm、约45 rpm至约75 rpm、约46 rpm至约74rpm、约47 rpm至约73 rpm、约48 rpm至约72 rpm、约49 rpm至约71 rpm、约50 rpm至约70rpm、约51 rpm至约69 rpm、约52 rpm至约68 rpm、约53 rpm至约67 rpm、约54 rpm至约66rpm、约55 rpm至约65 rpm、约56 rpm至约64 rpm、约57 rpm至约63 rpm、约58rpm至约62rpm、约59 rpm至约61 rpm或约60 rpm。在又其它情况下，起始速度可以为约15 rpm至约20rpm、约20 rpm至约25 rpm、约25 rpm至约30 rpm、约30 rpm至约35 rpm、约35 rpm至约40rpm、约40 rpm至约45 rpm、约45 rpm至约50 rpm、约50 rpm至约55 rpm、约55 rpm至约60rpm、约60 rpm至约65 rpm、约65 rpm至约70 rpm、约70 rpm至约75 rpm、约75 rpm至约80rpm、约80 rpm至约85 rpm、约85 rpm至约90 rpm、约90 rpm至约95 rpm、约95 rpm至约100rpm，或约100 rpm至约105 rpm。在又其它情况下，起始速度可以为约15 rpm、约20 rpm、约25 rpm、约30 rpm、约35 rpm、约40 rpm、约45 rpm、约50 rpm、约55 rpm、约60 rpm、约65rpm、约70 rpm、约75 rpm、约80 rpm、约85 rpm、约90 rpm、约95 rpm、约100 rpm或约105rpm。

在一些情况下，旋转刮刀的速度在浓缩期间可以固定(即，可以保持)。在其它情况下，旋转刮刀的速度在浓缩期间可以变化(即可以从起始速度增加或可以从起始速度减少)。

该方法还可以包括步骤(b)，将气体(例如惰性气体)通入蒸发容器。在一些情况下，该气体可以是氮气。在一些情况下，该气体的起始吹扫压力可以为约1.5 psi至约5.0psi。在其它情况下，起始吹扫压力可以为约1.6 psi至约4.9 psi、约1.7 psi至约4.8 psi、约1.8 psi至约4.7 psi、约1.9 psi至约4.6 psi、约2.0 psi至约4.5 psi、约2.1 psi至约4.4 psi、约2.2 psi至约4.3 psi、约2.3 psi至约4.2 psi、约2.4 psi至约4.1 psi、约2.5psi至约4.0 psi、约2.6 psi至约3.9 psi、约2.7 psi至约3.8 psi、约2.8 psi至约3.7psi、约2.9 psi至约3.6 psi、约3.0 psi至约3.5 psi、约3.1 psi至约3.2 psi、或约3.3psi至约3.4 psi。在其它情况下，起始吹扫压力可以为约1.5 psi至约2.0 psi、约2.0 psi至约2.5 psi、约2.5 psi至约3.0 psi、约3.0 psi至约3.5 psi、约3.5 psi至约4.0 psi、约4.0 psi至约4.5 psi、或约4.5 psi至约5.0 psi。在又其它情况下，起始吹扫压力可以为约1.5 psi、约1.6 psi、约1.7 psi、约1.8 psi、约1.9 psi、约2.0 psi、约2.1 psi、约2.2psi、约2.3 psi、约2.4 psi、约2.5 psi、约2.6 psi、约2.7 psi、约2.8 psi、约2.9 psi、约3.0 psi、约3.1 psi、约3.2 psi、约3.3 psi、约3.4 psi、约3.5 psi、约3.6 psi、约3.7psi、约3.8 psi、约3.9 psi、约4.0 psi、约4.1 psi、约4.2 psi、约4.3 psi、约4.4 psi、约4.5 psi、约4.6 psi、约4.7 psi、约4.8 psi、约4.9 psi或约5.0 psi。

在一些情况下，吹扫压力在浓缩期间可以固定(即，可以保持)。在其它情况下，吹扫压力在浓缩期间可以变化(即，可以从起始压力增加或可以从起始压力减少)。

该方法还可以包括步骤(c)在与蒸发容器流体连通的冷凝器中冷凝并收集来自溶液的挥发性液体，其中冷凝器处于起始温度。

在一些情况下，冷凝器是内置式冷凝器(即，位于蒸发容器内)。在其它情况下，冷凝器是外置式冷凝器(即，与蒸发容器分离)。在一些情况下，冷凝器的起始温度为约0℃。

在一些情况下，冷凝器的温度在浓缩期间可以固定(即，可以保持)。在其它情况下，冷凝器的温度在浓缩期间可以变化(即，可以从起始温度增加或可以从起始温度减少)。

该方法还可以包括步骤(d)，将步骤(a)至(c)重复至少额外一次，从而使溶液具有≥约200 mg/mL的最终寡核苷酸浓度。在其它情况下，最终寡核苷酸浓度可以为约200 mg/mL至约400 mg/mL。在又其它情况下，最终寡核苷酸浓度可以为约210 mg/mL至约390 mg/mL、约220 mg/mL至约380 mg/mL、约230 mg/mL至约370 mg/mL、约240 mg/mL至约360 mg/mL、约250 mg/mL至约350 mg/mL、约260 mg/mL至约340 mg/mL、约270 mg/mL至约330 mg/mL、约280 mg/mL至约320 mg/mL、约290 mg/mL至约310 mg/mL或约300 mg/mL。在又其它情况下，最终寡核苷酸浓度可以为约200 mg/mL、约210 mg/mL、约220 mg/mL、约230 mg/mL、约240 mg/mL、约250 mg/mL、约260 mg/mL、约270 mg/mL、约280 mg/mL、约290 mg/mL、约300mg/mL、约310 mg/mL、约320 mg/mL、约330 mg/mL、约340 mg/mL、约350 mg/mL、约360 mg/mL、约370 mg/mL、约380 mg/mL、约390 mg/mL或约400 mg/mL。在仍其它情况下，最终寡核苷酸浓度为≤约450 mg/mL。在上述方法的又其它情况下，最终寡核苷酸浓度可以为≤约500mg/mL。

在一些情况下，含有寡核苷酸的溶液的最终体积可以为≤约2 mL。

“单通”IE

简而言之，经由IE浓缩含有寡核苷酸的溶液的方法可以包括步骤(a)将起始体积的溶液装入蒸发容器中，其中蒸发容器处于起始压力和起始温度。

在一些情况下，含有寡核苷酸的溶液中的起始寡核苷酸浓度可以为≤20 mg/mL。在其它情况下，起始寡核苷酸浓度可以为约5 mg/mL至约20 mg/mL或约10 mg/mL至约15mg/mL之间。在又其它情况下，起始寡核苷酸浓度可以为约5 mg/mL、约6 mg/mL、约7 mg/mL、约8 mg/mL、约9 mg/mL、约10 mg/mL、约11 mg/mL、约12 mg/mL、约13 mg/mL、约14 mg/mL、约15 mg/mL、约16 mg/mL、约17 mg/mL、约18 mg/mL、约19 mg/mL或约20 mg/mL。在又其它情况下，起始寡核苷酸浓度可以为>约20 mg/mL但<约30 mg/mL。在一些情况下，起始寡核苷酸浓度可以为>约30mg/mL，只要其体积足够大且粘度足够低以流过系统即可(例如，在适当情况下甚至>约100 mg/mL)。

在一些情况下，含有寡核苷酸的溶液的pH可以为约6.0、约6.1、约6.2、约6.3、约6.4、约6.5、约6.6、约6.7、约6.8、约6.9或约7.0。

在一些情况下，含有寡核苷酸的溶液的起始体积约为1 mL至约10 mL。在其它情况下，起始体积可以为约2 mL至约9 mL、约3 mL至约8 mL、约4 mL至约7 mL或约5 mL至约6mL。在又其它情况下，起始体积可以为约1 mL、约2 mL、约3 mL、约4 mL、约5 mL、约6 mL、约7mL、约8 mL、约9 mL或约10 mL。在甚至其它情况下且根据蒸发容器的尺寸，含有寡核苷酸的溶液的起始体积可以为>10 mL。

在一些情况下，蒸发容器的起始压力可以为约20托至约30托。在其它情况下，起始压力可以为约20托至约22托、约22托至约24托、约24托至约26托、约26托至约28托或约28托至约30托。在又其它情况下，起始压力可以为约20托、约21托、约22托、约23托、约24托、约25托、约26托、约27托、约28托、约29托或约30托。

在一些情况下，蒸发容器的压力在浓缩期间可以固定(即，可以保持)。在其它情况下，蒸发容器的压力在浓缩期间可以变化(即可以从起始压力增加或可以从起始压力减少)。

在一些情况下，蒸发容器的起始温度可以为约55℃至约65℃。在其它情况下，起始温度可以为约56℃至约64℃、约57℃至约63℃、约58℃至约62℃、约59℃至约61℃或约60℃。在又其它情况下，起始温度可以为约55℃至约57℃、约57℃至约59℃、约59℃至约61℃、约61℃至约63℃或约63℃至约65℃。在又其它情况下，起始温度可以为约55℃、约56℃、约57℃、约58℃、约59℃、约60℃、约61℃、约62℃、约63℃、约64℃或约65℃。

在一些情况下，蒸发容器的温度在浓缩期间可以固定(即，可以保持)。在其它情况下，蒸发容器的温度在浓缩期间可以变化(即可以从起始温度增加或可以从起始温度减少)。

该方法还可以包括步骤(b)，将蒸发容器中的溶液煮沸一段时间。

在一些情况下，煮沸的起始时段可以为约4分钟至约4.5分钟。在其它情况下，起始时段可以为约4.1分钟至约4.4分钟或约4.2分钟至约4.3分钟。在又其它情况下，起始时段可以为约4分钟至4.1分钟、约4.1分钟至约4.2分钟、约4.2分钟至约4.3分钟、约4.3分钟至约4.4分钟或约4.4分钟至约4.5分钟。在又其它情况下，起始时段可以为约4分钟、约4.1分钟、约4.2分钟、约4.3分钟、约4.4分钟或约4.5分钟，尤其是约4.25分钟。

该方法还可以包括步骤(c)，经由冷凝器从蒸发容器中抽取水蒸气，其中冷凝器为起始温度，从而使溶液具有≥约200 mg/mL的最终寡核苷酸浓度。

在一些情况下，冷凝器是内置式冷凝器(即，位于蒸发容器内)。在其它情况下，冷凝器是外置式冷凝器(即，与蒸发容器分离)。在一些情况下，冷凝器的起始温度为约0℃。

在一些情况下，冷凝器的起始温度在浓缩期间可以固定(即，可以保持)。在其它情况下，冷凝器的起始温度在浓缩期间可以变化(即，可以从起始温度增加或可以从起始温度减少)。

在一些情况下，该方法还可以包括步骤(d)，将最终寡核苷酸浓度≥约200 mg/mL的溶液从蒸发容器转移到例如收集容器。

在一些情况下，该方法还可以包括步骤(e)，对新鲜的起始体积的含有寡核苷酸的溶液重复步骤(a)至(d)。

在一些情况下，寡核苷酸为ss寡核苷酸。在其它情况下，寡核苷酸为ds寡核苷酸。

在一些情况下，含有寡核苷酸的溶液中的最终寡核苷酸浓度可以为≥约200 mg/mL。在其它情况下，最终寡核苷酸浓度可以为约200 mg/mL至约400 mg/mL。在又其它情况下，最终寡核苷酸浓度可以为约210 mg/mL至约390 mg/mL、约220 mg/mL至约380 mg/mL、约230 mg/mL至约370 mg/mL、约240 mg/mL至约360 mg/mL、约250 mg/mL至约350 mg/mL、约260 mg/mL至约340 mg/mL、约270 mg/mL至约330 mg/mL、约280 mg/mL至约320 mg/mL、约290 mg/mL至约310 mg/mL或约300 mg。在又其它情况下，最终寡核苷酸浓度可以为约200mg/mL、约210 mg/mL、约220 mg/mL、约230 mg/mL、约240 mg/mL、约250 mg/mL、约260 mg/mL、约270 mg/mL、约280 mg/mL、约290 mg/mL、约300 mg/mL、约310 mg/mL、约320 mg/mL、约330 mg/mL、约340 mg/mL、约350 mg/mL、约360 mg/mL、约370 mg/mL、约380 mg/mL、约390mg/mL或约400 mg/mL。在仍其它情况下，最终寡核苷酸浓度可以为≤约450 mg/mL。在上述方法的又其它情况下，最终寡核苷酸浓度可以为≤约500 mg/mL。

在一些情况下，含有寡核苷酸的溶液的最终体积可以为≤约2mL。

实施例

提供下述非限制性实施例用于说明性而非限制性目的。

实施例1：经由TFF和WFE的组合浓缩含有ds寡核苷酸的溶液

目的：评估TFF和WFE组合对于浓缩含有ds寡核苷酸的溶液的效果。

方法：含有寡核苷酸的溶液：所用的ds寡核苷酸为钠盐双链体，其由与22个核苷酸的反义链(SEQ ID NO:4)复合的、在位置28-30上含有GalNAc糖的36个核苷酸的有义链(SEQID NO:3)组成。ds寡核苷酸在H₂O中的浓度为20 mg/mL(通过UV测定法测定)，并取新鲜等分样品作为起始材料。

TFF：使用Pendotech®TFF系统对含有20 mg/mL ds寡核苷酸的溶液进行TFF，Pendotech®TFF系统具有2 L截留液储库、6.4 mm内径管道尺寸(Masterflex® 96410-17)、截留液和渗透液天平(Ohaus)以及Quattroflow® 150循环泵(PSG)。所用的膜列于表2中。使用前，系统和膜用H₂O冲洗并平衡，且然后在截留液储库中装入765 mL含有20 mg/mLds寡核苷酸的溶液，使得上样量为约15.3 g ds寡核苷酸。浓缩实验用1 mL/min的进料流速和30 psi的跨膜压(TMP)进行。当达到截留液容器的最小体积时，停止运行。收集初级截留液，然后用约60 mL和100 mL H₂O清洗。通过用0.5 N NaOH冲洗1小时将系统消毒并储存在0.1 N NaOH中。

表1：用于含有寡核苷酸的溶液的TFF的过滤器

过滤器名称	制造商	材料	批号#	表面积(m2)	MWCO (kDa)
						Centramate T-系列	Pall	Omega PES	31279015R	0.1	3
Centramate T-系列	Pall	Omega PES	31279016R	0.1	3
						Centramate T-系列	Pall	Omega PES	31279013R	0.1	3

WFE：WFE在2英寸直径的刮膜(即，短程)分子蒸馏器(Pope Scientific Inc.)上进行，其中改进如图1所示。将进料漏斗替换为1 L注射泵(Isco)，以允许连续进料流动，其中在进料流路中安装计量阀，以在注射泵中提供正背压。将残余收集瓶替换为全氟烷氧基(PFA)管(1/2英寸外径，3/8英寸内径)，通过Swagelok®手动阀连接到尺寸 #35 Ace螺纹玻璃瓶。将一段1/16英寸的长管插入1/2英寸PFA管中，从手动阀上方延伸至刮膜蒸馏器主体，以帮助液体流过管顶部的窄开口，在此处其连接到玻璃连接器。如图1所示连接氮气管线，以减轻收集管附近形成的冷凝。氮气管线调节至2 psi，并连接到计量阀以调节氮气流量。该系统通过真空控制器连接到真空泵。热乙二醇/水浴在系统中循环，为蒸发提供热量，且另一个冷乙二醇/水浴用于冷凝水蒸气。加热/冷却液体与系统的连接有两种配置：(1)热液体流过蒸馏器的外套，而冷液体先流过中心冷凝棒且然后流过外部冷凝器；或(2)热液体首先流过蒸馏器的外套且然后流过中心冷凝棒，而冷液体仅流过外部冷凝器。配置1为短程蒸发，适用于高通量和低真空度，而配置2更适合更好地控制蒸发程度。

对于浓缩实验，将含有ds寡核苷酸的溶液装入注射泵，并以设定的流速送入装置。加热套温度设定为55℃，外部冷凝器温度设定为0℃，刮刀转速设定为20 rpm，并且2 psi氮气阀打开至刻度5。调节氮气吹扫，使连接到残余烧瓶的臂上没有水凝结并且同时仍能将压力保持在目标设定点。真空压力和进料流速在不同实验之间略有不同，其中真空压力值在20-32托的范围且进料流速在3.4-3.6 mL/min的范围。根据需要更改数值，以防止或减轻任何观察到的凝胶形成。

密度和浓度测定：在密度和浓度测量之前，用0.22 μm过滤器(Millipore；Burlington, MA，具有0.22 μm Durapore PVDF膜的Steriflip 50 mL)过滤浓缩样品。

在20℃下，使用DMA 4100 M密度计(Anton Paar；Ashland, VA)记录密度测量值。密度测量值用于制备含有寡核苷酸的溶液的重量稀释物用于浓度测量。

浓度值是使用UV测定法生成的。样品先用重量法稀释至约2 mg/mL，然后再进一步稀释至0.02 mg/mL，以便使用Cary UV-Vis Multicell Peltier仪器进行测量。使用1 cm路径长度比色皿对每个样品进行一式三份测量，以H₂O为参比。使用以下等式用于生成平均浓度值，其中Abs为来自一式三份测量的在258 nm处的平均吸光度值，V为第一稀释物的体积，密度为浓缩溶液的测量密度，MW为分子的游离酸形式的分子量(20675 g/mol)，DF为第二稀释物的稀释倍数，W为浓缩样品的样品重量，MEC是摩尔消光系数(548000 M^-1cm^-1)，路径长度为1 cm，并且纯度由非变性UPLC测定。

变性和非变性UPLC纯度测定：使用变性和非变性UPLC测定以分析和比较浓缩实验前后寡核苷酸的纯度。样品稀释至约2 mg/mL用于测量。

变性测定采用Waters Acquity UPLC肽BEH C18色谱柱(1.7 µm，2.1 x 100 mm，部件号186003686)，柱温80℃，以及在20 Hz、259 nm的检测进行。流动相A为28 mM DIPEA和100 mM HFIP，而流动相B为90:10的甲醇:异丙醇(IPA)混合物，其中方法梯度列于表2。

表2：用于变性UPLC的梯度

	时间(min)	流速(mL/min)	%A	%B	曲线
						1	起始	0.400	85.0	15.0	起始
2	1.00	0.400	85.0	15.0	6
						3	15.00	0.400	79.0	21.0	6
4	15.10	0.400	40.0	60.0	6
						5	17.00	0.400	40.0	60.0	6
6	17.10	0.400	85.0	15.0	6
						7	20.00	0.400	85.0	15.0	6

非变性分析采用Waters XBridge BEH C18色谱柱(2.5 µm，2.1 x 50 mm，部件号186006029)，柱温20℃，以及在20 Hz、260 nm的检测进行。流动相A为95 mM TEA和14 mMHFIP，而流动相B为75:25的甲醇:异丙醇(IPA)混合物，其中方法梯度列于表4。

表3：用于非变性UPLC的梯度

	时间(min)	流速(mL/min)	%A	%B	曲线
						1	起始	0.250	95.0	5.0	起始
2	3.00	0.250	95.0	5.0	6
						3	12.00	0.250	67.0	33.0	6
4	13.00	0.250	40.0	60.0	6
						5	15.00	0.250	40.0	60.0	6
6	15.10	0.250	95.0	5.0	6
						7	19.00	0.250	95.0	5.0	6

粘度测定：对从附加的WFE实验中收集的不同浓度的样品进行粘度测定。对于低于350 mg/mL的样品，在20℃下使用Anton Paar Lovis2000M粘度计测量粘度。使用1.8 mm毛细管和1.5 mm钢球进行测量。对于高于350 mg/mL的样品，在20℃下使用RheoSense VROC®Initium粘度计测量粘度。

结果：各种处理后含有ds寡核苷酸的溶液浓度如下表4所示。

表4：含有20mg/mL寡核苷酸的溶液在处理后的最终ds寡核苷酸浓度

样品	处理	最终ds寡核苷酸浓度(mg/mL)
			1	无	20
2	仅TFF	64
			3	TFF然后WFE	280

变性测定结果显示，观察到与ds寡核苷酸的有义和反义单链二者相关的两个主峰(图3A)。没有观察到起始样品和浓缩样品之间的杂质的显著差异。此外，非变性测定结果显示与双链体相关的主峰，且都具有相似的纯度水平(约98.5-98.7面积%，具有约0.8-1面积%残余反义链)(图4A)。这些结果表明，没有由于浓缩方法导致的化学纯度的显著改变。

此处需要双程方法以实现约300 mg/mL的ds寡核苷酸浓度。

实施例2：经由WFE浓缩含有ds寡核苷酸的溶液

目的：评估单独WFE和重复WFE (“双程”WFE)对于浓缩含有ds寡核苷酸的溶液的效果。

方法：含有寡核苷酸的溶液：含有寡核苷酸的溶液如上述实施例1所述。

WFE：WFE如上述实施例1中所述进行；然而，在一些情况下，对一个样品进行两次WFE。

密度和浓度测定：密度和浓度测定如上述实施例1所述进行。

变性和非变性UPLC纯度测定：UPLC纯度测定如上述实施例1所述进行。

粘度测定：粘度测定如上述实施例1所述进行。

结果：各种处理后含有ds寡核苷酸的溶液浓度如下表5所示。

表5：含有20 mg/mL寡核苷酸的溶液在处理后的最终ds寡核苷酸浓度

样品	处理	最终ds寡核苷酸浓度(mg/mL)
			1	无	20
4	仅WFE	115
			5	WFE然后WFE	346

当从约80 mg/mL至约115 mg/mL范围的中间ds寡核苷酸浓度(通过单程WFE实现)开始时，通过“双程”WFE可靠地实现最终ds寡核苷酸浓度>300 mg/mL。

变性测定结果显示，观察到与ds寡核苷酸的有义和反义单链二者相关的两个主峰(图3A)。没有观察到起始样品和浓缩样品之间的杂质的显著差异。此外，非变性测定结果显示与双链体相关的主峰，且都具有相似的纯度水平(约98.5-98.7面积%，具有约0.8-1面积%残余反义链)(图4A)。这些结果表明，没有由于浓缩方法导致的化学纯度的显著改变。

实施例3：经由IE浓缩含有ds寡核苷酸的溶液

目的：评估单独IE对于浓缩含有ds寡核苷酸的溶液的效果。

方法：含有寡核苷酸的溶液：含有寡核苷酸的溶液如上述实施例1所述。

IE：IE采用如图2所示的自动化定制装置进行。浓缩实验中，将含有寡核苷酸的溶液装入注射泵(1 L，Isco)，并且每次5 mL注入蒸发容器中。热传热溶液(乙二醇/水)的温度设定为60℃，且真空度设定为25托，同时水蒸气通过外部冷凝器收集。在规定的4.25分钟沸腾时间后，经由通过暂时释放蒸发器中的真空12秒产生的压力差，将浓缩溶液转移到收集容器中。

密度和浓度测定：密度和浓度测定如上述实施例1所述进行。

变性和非变性UPLC纯度测定：UPLC纯度测定如上述实施例1所述进行。

粘度测定：粘度测定如上述实施例1所述进行。

结果：处理后含有ds寡核苷酸的溶液浓度如下表6所示。

表6：含有20mg/mL寡核苷酸的溶液在处理后的最终ds寡核苷酸浓度

样品	处理	最终ds寡核苷酸浓度(mg/mL)
			1	无	20
6	仅IE	359*

*由于样品体积小，无法取得准确的密度测量。显示的浓度值是使用来自样品5的密度计算的。使用同一次运行产生的一系列密度值，实际浓度在353-365 mg/mL的范围。

变性测定结果显示，观察到与ds寡核苷酸的有义和反义单链二者相关的两个主峰(图3B)。没有观察到起始样品和浓缩样品之间的杂质的显著差异。此外，非变性测定结果显示与双链体相关的主峰，且都均具有相似的纯度水平(约98.5-98.7面积%，其中约0.8-1面积%残余反义链)(图4B)。这些结果表明，没有由于浓缩方法导致的化学纯度的显著改变。

序列表

下述核苷酸和/或氨基酸序列在上文公开中提及，并且在下文提供用于参考。

SEQ ID NO:1 – 合成寡核苷酸1 (36 nt)

SEQ ID NO:2 – 合成寡核苷酸2 (22 nt)

SEQ ID NO:3 – 合成寡核苷酸3 (36 nt)

SEQ ID NO:4 – 合成寡核苷酸4 (22 nt)

Claims (40)

1.一种浓缩溶液中的寡核苷酸的方法，所述方法包括以下步骤：

(a) 使含有寡核苷酸的溶液流过蒸发容器，其中所述溶液具有≤约20 mg/mL的起始寡核苷酸浓度，其中所述蒸发容器包括可旋转刮刀、用于加热的装置和用于加压的装置，其中所述可旋转刮刀将所述溶液刮成围绕所述蒸发容器内表面的薄膜，并且其中所述蒸发容器处于起始压力和起始温度；

(b) 使气体通过所述蒸发容器；

(c) 在与所述蒸发容器流体连通的冷凝器中冷凝并收集来自所述溶液的挥发性液体，其中所述冷凝器处于起始温度；和

(d) 重复步骤(a)至(c)至少额外一次，从而使所述溶液具有≥约200 mg/mL的最终寡核苷酸浓度。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述含有寡核苷酸的溶液的pH在约6至约7之间。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述寡核苷酸是单链(ss)。

4.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述寡核苷酸是双链(ds)。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述含有寡核苷酸的溶液以约0.5mL/min至约4.5 mL/min的起始流速流过所述蒸发容器。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述起始流速为约3.4 mL/min至约3. 6mL/min。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述可旋转刮刀以约15 rpm至约105rpm的起始速度旋转。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述起始速度为约20 rpm。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述蒸发容器的起始压力为约10托至约65托。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述起始压力为约20托至约32托。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述蒸发容器的起始温度为约35℃至约60℃。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述起始温度为约55℃。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述气体的起始吹扫压力为约1.5psi至约5 psi。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述起始吹扫压力为约2 psi。

15.根据权利要求13或权利要求14所述的方法，其中所述气体是氮气气体。

16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述冷凝器的起始温度为约0℃。

17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中步骤(a)至(c)重复一次。

18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述最终寡核苷酸浓度为约200mg/mL至约400 mg/mL。

19.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述最终寡核苷酸浓度为≤约450mg/mL。

20.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述最终寡核苷酸浓度为≤约500mg/mL。

21.一种浓缩溶液中的寡核苷酸的方法，所述方法包括以下步骤：

(a) 将起始体积的含有寡核苷酸的溶液装入蒸发容器中，其中所述溶液具有≤约20mg/mL的起始寡核苷酸浓度，并且其中所述蒸发容器处于起始压力和起始温度；

(b) 将所述蒸发容器中的溶液煮沸一段起始时段；和

(c) 经由冷凝器从所述蒸发容器中抽取水蒸气，其中所述冷凝器处于起始温度，从而使所述溶液具有≥约200 mg/mL的最终寡核苷酸浓度。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述含有寡核苷酸的溶液的pH为约6至约7之间。

23.根据权利要求21或权利要求22所述的方法，其中所述寡核苷酸是单链(ss)。

24.根据权利要求21或权利要求22所述的方法，其中所述寡核苷酸是双链(ds)。

25.根据权利要求21至24中任一项所述的方法，其中所述含有寡核苷酸的溶液的起始体积为约1 mL至约10 mL。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述起始体积为约5 mL。

27.根据权利要求21至26中任一项所述的方法，其中所述蒸发容器的起始压力为约20托至约30托。

28.根据权利要求21至27中任一项所述的方法，其中所述蒸发容器的起始温度为约55℃至约65℃。

29.根据权利要求28所述的方法，其中所述起始温度为约60℃。

30.根据权利要求21至29中任一项所述的方法，其中所述煮沸的起始时段为约4分钟至约4.5分钟。

31.根据权利要求30所述的方法，其中所述起始时段为约4.25分钟。

32.根据权利要求21至31中任一项所述的方法，其中所述冷凝器的起始温度为约0℃。

33.根据权利要求21至32中任一项所述的方法，其进一步包括以下步骤：

(d) 从所述蒸发容器中转移最终寡核苷酸浓度≥约200 mg/mL的溶液。

34.根据权利要求21至33中任一项所述的方法，其进一步包括以下步骤：

(e) 对新鲜的起始体积的含有寡核苷酸的溶液重复步骤(a)至(d)。

35.根据权利要求21至33中任一项所述的方法，其中连续重复步骤(a)至(d)。

36.根据权利要求21至35中任一项所述的方法，其中所述最终寡核苷酸浓度为约200mg/mL至约400 mg/mL。

37.根据权利要求21至35中任一项所述的方法，其中所述最终寡核苷酸浓度为≤约450mg/mL。

38.根据权利要求21至35中任一项所述的方法，其中所述最终寡核苷酸浓度为≤约500mg/mL。

39.根据权利要求1至38中任一项所述的方法，其进一步包括以下步骤：

对溶液进行切向流过滤(TFF)或冻干以用于附加的浓缩和/或纯化。

40.一种用于浓缩溶液中的生物分子的装置，所述装置包括：

(i) 蒸发容器，其中所述蒸发容器包括用于加热蒸发容器的装置和用于加压蒸发容器的装置；

(ii) 与所述蒸发容器流体连通的第一储库，其中所述第一储库是用于未浓缩的含有生物分子的溶液的进料；

(iii) 与所述蒸发容器流体连通的第二储库，其中所述第二储库是用于浓缩的含有生物分子的溶液的收集器；和

(iv) 与所述蒸发容器流体连通的冷凝器，其中所述冷凝器包括用于冷却冷凝器的装置和用于加压冷凝器的装置。