CN121006363A - 用于同时抑制两个靶基因表达的siRNA、药物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及了一种双靶向siRNA剂，其包括靶向两种不同基因的两种不同的siRNA或其药学上可接受的盐，所述两种不同的siRNA或其盐通过药学上可接受的配体相连接，所述s iRNA为正义链和反义链构成的dsRNA，所述两种不同基因选自血管紧张素原(AGT)、前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶9(PCSK9)和人血管生成素样蛋白3(ANGPTL3)中的两种。本发明提供了所述双靶向s iRNA剂在制备预防或治疗与高血压或/和脂质失调相关疾病的药物中的应用。本发明所述双靶向siRNA剂能实现同时在体内对两个靶基因表达的有效抑制，具有相互不拮抗活性强、安全性高的优势。本发明还提供了上述双靶向s iRNA剂的对应的基因的s iRNA及其用于预防或治疗与高血压或/和脂质失调相关疾病。

Description

用于同时抑制两个靶基因表达的siRNA、药物及其应用

本发明是申请号为202411229643.3，申请日为2024-09-03，发明名称为“用于同时抑制两个靶基因表达的siRNA、药物及其应用”的分案申请。

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及用于同时抑制两个靶基因表达的siRNA、药物及其应用。

背景技术

高血压、高血脂、高胆固醇血症等慢性疾病是心脑血管并发症的主要诱因，随着人类生活水平的提高，这些慢性疾病成了困扰人们健康以及降低生活质量的重要因素。在大多数高血压指南中，在未使用降压药的情况下，收缩压(Systolic blood pressure，SBP)或舒张压(Diastolic blood pressure，DBP)≥140/90mmHg则被定义为高血压(Whelton，PaulK et al.Hypertension vol.71，6(2018):1269-1324.)。据统计，在过去30年里，中国的高血压发生率大幅度上升，影响了约四分之一的成年人的健康(Wang，Ji-Guang etal.Nature reviews.Cardiology vol.20，8(2023):531-545.)。高血压通常与其他慢性疾病如高血脂、高胆固醇、糖尿病等一起出现。在2009年一项涉及4942例高血压门诊患者的研究中，其中同时患有糖尿病的患者占24.3％。血脂异常在中国高血压患者中也表现突出，在上述调查中高甘油三酯血症的患病率为18.9％，高胆固醇血症和低HDL胆固醇的患病率分别为13.5％和16.6％。这些疾病的同时出现不仅增加了心脑血管并发症的风险，还使得该类疾病的管理复杂化(Miao，Chao-Ying et al.Journal of clinical hypertensionvol.23，7(2021):1399-1404)。有报导指出降血压治疗有利于提高改善病人的各项指标，如每降低10mmHg收缩压心血管疾病的风险降低20％；另外冠心病、中风、心脏功能缺失的风险分别降低17％、27％与28％。由于拥有相同的风险因素以及发病机制，降压与降脂药物联用将对于上述慢性疾病的治疗具有协同的效应，而心脑血管疾病的情况改善亦可作为高血压治疗的终点指标(Ranasinghe，Priyanga et al.Journal of the American HeartAssociation vol.11，20(2022):e027694.)。

肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)是人体维持血压、血容量和水盐平衡的内分泌系统，该系统分泌产生的血管紧张素(ANG I/I I)具有收缩血管的作用。RAAS系统的过度启动是高血压形成的重要原因之一(Arendse，Lauren B et al.Pharmacological reviewsvol.71，4(2019):539-570)。目前临床上的降压药主要是RAAS抑制剂，包括血管紧张素转换酶抑制剂ACEI(如普利类药物)、血管紧张素I I拮抗剂ARB(如沙坦类药物)等。即使这些RAAS抑制剂药物的作用机理不完全相同，但具有一定的机体代偿性且均需要病人每天不间断服药，因此有些患者的依从性较差。值得关注的是，由肝脏细胞产生的血管紧张素原(AGT)是血管紧张素(Ang I I)的唯一前体。研究表明AGT基因的多态现象与机体的血压调控密切相关，因此AGT是基因沉默治疗高血压及相关疾病的重要靶标。抑制AGT能有效防止RAAS系统的过度启动因而起到降低血压的作用，弥补RAAS抑制剂药物的常见不足(Ren，Liwei et al.Current opinion in nephrology and hypertension vol.29，2(2020):180-189)。近期研究表明利用特异靶向肝细胞的GalNAc系统偶联的siRNA介导AGT基因沉默可使RAAS系统抑制持续数周至数月，仅需要单次给药，这比目前的RAAS抑制剂更能提高依从性和改善心脑血管疾病情况(Desai，Akshay S et al.The New England journal ofmedicine vol.389，3(2023):228-238.)。

上述提及高血压与高血脂症密切相关，高血脂症通常只血清中胆固醇和(或)甘油三酯水平升高造成的血脂异常，是动脉粥样硬化等心血管疾病的重要诱因。血管生成素样蛋白3(ANGPTL3)基因功能缺失变异与甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇和高密度脂蛋白胆固醇的血浆水平降低有关。人类遗传学研究表明，携带ANGPTL3功能缺失杂合变异的人群，其三酰甘油、高密度脂蛋白胆固醇和低密度脂蛋白(LDL-C)胆固醇的血清水平均显著低于没有这些变异的人群(Dewey，Frederick E et al.The New England journal of medicinevol.377，3(2017):211-221.)。功能方面，由肝细胞产生的ANGPTL3会被分泌到血液中，通过PCSK3或PCSK6剪切后形成活性分子，可对脂蛋白脂肪酶(其催化甘油三酯的水解)和内皮脂肪酶(其水解脂蛋白磷脂)起到抑制作用，进而导致甘油三酯、高密度脂蛋白(HDL)和磷脂的血浆水平增加，因此抑制ANGPTL3的表达可作为高血脂症治疗的重要靶点(Kersten，Sander.Nature reviews.Endocrinology vol.13，12(2017):731-739.)。

另外，高血压患者中出现高胆固醇血症的比例也很高，一般根据LDL-C和非HDL-C水平定义高胆固醇血症。同样地，人类遗传学研究表明，前白蛋白转化酶枯草菌素9(PCSK9)可能与家族性高胆固醇血症相关，两个常见的PCSK9失功能型突变(PCSK9-679X和PCSK9-142X)与血中低LDL-C水平呈现正相关(Cohen，Jonathan C et al.The New Englandjournal of medicine vol.354，12(2006):1264-72.)。PCSK9在肝脏中合成并被分泌至循环系统，细胞中的PCSK9可结合并引导新生成的LDL受体从高尔基体转运至溶酶体内进行降解；而循环系统中的PCSK9可与肝脏细胞表面的LDL受体特异结合，从而介导其进入肝细胞溶酶体内降解，最终导致肝脏结合和清除LDL-C的能力下降，血液中LDL-C水平升高(Horton，Jay D et al.Journal of lipid research vol.50Suppl，Suppl(2009):S172-7)。因此，抑制PCSK9的表达水平是治疗高胆固醇血症以及预防与LDL-C相关的心脑血管疾病的重要靶点。目前关于降脂的治疗方法，已开发出了分别针对ANGPTL3与PCSK9的单抗药物、反义寡聚核苷酸药物(ASOs)、siRNAs药物等，以LDL-C或甘油三酯为指标取得了较好的治疗效果(Chen，Ruoyu et al.Journal of clinical laboratory analysis vol.36，7(2022):e24552.)。

RNAi现象的发现将RNA治疗推向了新的高度，RNAi技术指的是外源siRNAs利用细胞内源系统使得靶向的目的基因降解。机制方面，外源导入的双链siRNAs可以被细胞中的核糖核酸内切酶Dicer识别并于RNA诱导沉默复合物(RISC)被分割为单链的引导单链及其互补链。作为引导单链的siRNA随后与Argonate2蛋白(AGO2)结合并将其指引至靶标RNA，由AGO2介导靶标RNA的降解。除了降解胞浆中的RNAs，siRNAs还能促使细胞核中染色体重塑与组蛋白修饰从而导致转录的沉默(Matzke et al.Nature reviews.Genetics vol.6，1(2005):24-35.)。目前已有多种siRNA药物获FDA批准，另有也有不少候选siRNAs正在进行III期临床试验(Zhu，Yiran et al.Cell death&disease vol.13，7644.23Jul.2022)。siRNA在血液与组织中不稳定，容易被体内的核酸酶消化降解，为了提高siRNA反义链以及正义链稳定性，合成siRNA药物时通常引入了2’-O-甲基化与2’-氟代修饰等化学修饰。关于siRNA药物的递送也是RNAi治疗的重要保障，目前最为成熟的递送系统是N-寡糖乙酰半乳糖胺(GalNAc)，GalNAc可与肝细胞特异性表达的去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)结合，其与siRNA偶联后可实现肝脏细胞主动递送，是RNA治疗领域的重要突破。而本发明关注的三个基因AGT、ANGPTL3与PCSK9均为肝细胞特异或高表达蛋白，因此利用GalNAc系统可实现单靶点或双靶向siRNA药物的肝脏递送(Debacker，Alexandre J et al.Molecular therapyvol.28，8(2020):1759-1771)。

目前针对PSCK9基因的RNAi药物已获批上市，而针对AGT以及ANGPTL3基因的RNAi药物仍处于研发阶段，并都表现出较好的治疗效果。但进一步研发高度有效且药效持续性长的RNAi药物仍具有重大意义，分别针对三个基因的siRNAs两两组合形成的双靶点RNAi药物对于联合治疗高血压、高血脂、高胆固醇血症等慢性心脑血管疾病具有巨大的临床应用前景。如AGT与ANGPTL3、AGT与PSCK9的siRNA组合成双靶点药物对于降血压与降血脂可能具有协同治疗作用；而ANGPTL3与PSCK9的siRNA组合成双靶点药物对于高胆固醇血症或高血脂治疗可能达到意想不到的药效持续性，提高治疗的效果。而单靶点真正适应临床应用的siRNA并不多，同时靶向两种目的基因的不同siRNA联合使用，更是难上加难。除了需要对靶基因有效控制之外，还要两种siRNA之间在体内不相互拮抗，以及还要保证2个靶点的持续时间要大体一致等高要求。但尽管如此，由于医学应用前景巨大，因此对多靶点的研究依然受到欢迎和期待。

发明内容

基于此，本发明的目的是提供一种用于同时抑制细胞中血管紧张素原(angiotensinogen，AGT)、前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶9(proprotein convertasesubtilisin/kexin type 9，PCSK9)以及血管生成素样蛋白3(angiopoietin-like 3，ANGPTL3)任意两个靶基因表达的双靶向siRNA剂及其应用，其具有能实现同时在体内对两个靶基因表达的有效抑制，相互不拮抗、活性高和安全性高的优势。

本发明的第一个方面，提供了双靶向siRNA剂(siRNA agent)，其中，双靶向siRNA剂包括靶向两种不同基因的两种不同的siRNA或其药学上可接受的盐，所述两种不同的siRNA或其盐通过与用于递送核酸的配体连接而成为一个整体，所述siRNA为正义链和反义链构成的dsRNA，所述两种不同基因选自AGT、PCSK9以及ANGPTL3中的两种；

其中，靶向AGT的siRNA的碱基组成选自以下一种dsRNA序列，或与其正义链或者反义链相差不超过1个核苷酸的序列：

A)dsRNA双链体为1167f，其中所述正义链包含UGACCAGCUUGUUUGUGAA(SEQ ID NO：59)，并且所述反义链包含UUCACAAACAAGCUGGUCGGG(SEQ ID NO：60)；

B)dsRNA双链体为1167b，其中所述正义链包含GCCGACCAGCUUGUUUGUGAA(SEQ IDNO：51)，并且所述反义链包含UUCACAAACAAGCUGGUCGGC(SEQ ID NO：52)；

C)dsRNA双链体为1165d，其中所述正义链包含GAGAACCAGUGUUUAGCGA(SEQ ID NO：39)，并且；所述反义链包含UCGCUAAACACUGGUUCUUGG(SEQ ID NO：40)；

D)dsRNA双链体为1165f，其中所述正义链包含CCAAGAACCAGUGUUUAGCGA(SEQ IDNO：43)，并且所述反义链包含UCGCUAAACACUGGUUCUUGG(SEQ ID NO：44)；

其中，靶向PCSK9的siRNA碱基组成选自以下一种dsRNA序列，或与其正义链或者反义链相差不超过1个核苷酸的序列：

E)dsRNA双链体为11040a，其中所述正义链包含CUUAUUCUGGGUUUUGUAGCA(SEQ IDNO：375)，并且所述反义链包含UGCUACAAAACCCAGAAUAAG(SEQ ID NO：376)；

F)dsRNA双链体为11002d，其中所述正义链包含GCAGCCAACUUUUCUAGAA(SEQ IDNO：259)，并且所述反义链包含UUCUAGAAAAGUUGGCUGUGG(SEQ ID NO：260)；

G)dsRNA双链体为11002a，其中所述正义链包含CUACAGCCAACUUUUCUAGAA(SEQ IDNO：253)，并且所述反义链包含UUCUAGAAAAGUUGGCUGUAG(SEQ ID NO：254)；

其中，靶向ANGPTL3的siRNA碱基组成选自以下一种dsRNA序列，或与其正义链或者反义链相差不超过1个核苷酸的序列：

H)dsRNA双链体为7061f，其中所述正义链包含UACUUGAACUCAACUCAAA(SEQ ID NO：579)，并且所述反义链包含UUUGAGUUGAGUUCAAGUGGG(SEQ ID NO：580)；I)dsRNA双链体为7061b，其中所述正义链包含GCCACUUGAACUCAACUCAAA(SEQ ID NO：571)，并且所述反义链包含UUUGAGUUGAGUUCAAGUGGC(SEQ ID NO：572)。

在其中的一些实施例中，所述双靶向siRNA剂，其靶向的基因为AGT和PCSK9，AGT和ANGPTL3，以及PCSK9和ANGPTL3。

在其中的一些实施例中，其靶向的基因为AGT与选自PCSK9、ANGPTL3中的任一种，优选为AGT与PCSK9。

本发明还提供了用于上述siRNA的核苷酸的修饰方法，用于提高siRNA在体内外的稳定性、活性及降低非靶点活性。修饰的核苷酸至少包括2′-O-甲基修饰的核苷酸、2′-氟修饰的核苷酸、2′-脱氧核苷酸、2′3′-seco核苷酸模拟物、LNA、开环核酸核苷酸(UNA)、乙二醇核酸核苷酸(GNA)、2′-F-阿拉伯糖核苷酸、2′-甲氧基乙基核苷酸、无碱基核苷酸、核糖醇、反向核苷酸、反向无碱基残基、反向2′-OMe核苷酸、反向2′-脱氧核苷酸、2′-氨基修饰核苷酸、2′-烷基修饰核苷酸、吗啉代核苷酸和3′-OMe核苷酸、包含5′-硫代磷酸酯基团的核苷酸，或与胆固醇衍生物或十二烷酸双癸酰胺基团连接的末端核苷酸、2′-氨基修饰的核苷酸、氨基磷酸酯，或包含核苷酸的非天然碱基等如下一种或多种。

在其中的一些实施例中，所述正义链包括不多于3、2、1或0个未修饰的核苷酸，所述正义链中的修饰核苷酸包含分别选自2'-O-甲基修饰的核苷酸、2'-脱氧核苷酸、2'-氟修饰的核苷酸、反向无碱基残基，所述正义链在5'-末端和3'-末端含有0，或1，或2，或3个硫代磷酸酯键；以及其中，所述反义链包括不多于3、2、1或0个未修饰的核苷酸，所述反义链中的修饰的核苷酸包括分别选自2'-O-甲基修饰的核苷酸、2'-脱氧核苷酸、2'-氟修饰的核苷酸、VPU(2’-O-甲基尿苷-5’-(E)-乙烯基磷酸-3’-磷酸酯)、VPU-S(2’-S-甲基尿苷-5’-(E)-乙烯基磷酸-3’-磷酸酯)或其他VPU衍生物，所述反义链在5'-末端和3'-末端各含有1-3个硫代磷酸酯键。

在其中的一些实施例中，靶向AGT基因的dsRNA双链体经过修饰，选自以下序列中的一种，或与其正义链或者反义链相差不超过1个核苷酸的序列：

a)dsRNA双链体为1167.25-19，其中所述5’-3’正义链包含

Invab*mU*mGmAmCmCmAfGfCfUfUmGfUmUmUmGmUmGmAmAInvab，并且所述5’-3’反义链包含VPU-S*fU*mCmAmCmAmAmAmCmAmAdGmCfUmGfGmUmCmG*mG*mG；

b)dsRNA双链体为1167.27-21，其中所述5’-3’正义链包含

Invab*mG*mCmCmGmAmCmCmAfGfCfUfUmGfUmUmUmGmUmGmAmAInvab，并且所述5’-3’反义链包含VPU-S*fU*mCmAmCmAmAmAmCmAmAdGmCfUmGfGmUmCmG*mG*mC；

c)dsRNA双链体为1165.5-14，其中所述5’-3’正义链包含

I nvab*mG*mAmGmAmAmCfCfAfGfUmGfUmUmUmAmGmCmGmAI nvab，并且所述5’-3’反义链包含VPU-S*fC*mGmCmUmAmAmAmCmAmCdTmGfGmUfUmCmUmU*mG*mG；

d)dsRNA双链体为1165.5-16，其中所述5’-3’正义链包含

I nvab*mC*mCmAmAmGmAmAmCfCfAfGfUmGfUmUmUmAmGmCmGmAI nvab，并且所述5’-3’反义链包含VPU-S*fC*mGmCmUmAmAmAmCmAmCdTmGfGmUfUmCmUmU*mG*mG。

在其中的一些实施例中，靶向PCSK9的siRNA经过修饰，选自以下序列中的一种，或与其正义链或者反义链相差不超过1个核苷酸的序列：

e)dsRNA双链体为11040.10-23，其中所述5’-3’正义链包含

Invab*mC*mUmUmAmUmUmCmUfGfGfGfUmUfUmUmGmUmAmGmCmAInvab，并且所述5’-3’反义链包含VPU-S*fG*mCmUmAmCmAmAmAmAmCdCmCfAmGfAmAmUmA*mA*mG；

f)dsRNA双链体为11002.17-21，其中所述5’-3’正义链包含

I nvab*mG*mCmAmGmCmCfAfAfCfUmUfUmUmCmUmAmGmAmAI nvab，并且所述5’-3’反义链包含VPU-S*fU*mCmUmAmGmAmAmAmAmGdTmUfGmGfCmUmGmU*mG*mG；

g)dsRNA双链体为11002.10-23，其中所述5’-3’正义链包含

I nvab*mC*mUmAmCmAmGmCmCfAfAfCfUmUfUmUmCmUmAmGmAmAI nvab，并且所述5’-3’反义链包含VPU-S*fU*mCmUmAmGmAmAmAmAmGdTmUfGmGfCmUmGmU*mA*mG。

在其中的一些实施例中，靶向ANGPTL3基因的dsRNA经过修饰，选自以下序列中的一种，或与其正义链或者反义链相差不超过1个核苷酸的序列：

h)dsRNA为7061.18-14，其中所述5’-3’正义链包含

I nvab*mU*mAmCmUmUmGfAfAfCfUmCfAmAmCmUmCmAmAmAI nvab，并且所述5’-3’反义链包含VPU-S*fU*mUmGmAmGmUmUmGmAmGdTmUfCmAfAmGmUmG*mG*mG；

i)dsRNA双链体为7061.4-16，其中所述5’-3’正义链包含

Invab*mG*mCmCmAmCmUmUmGfAfAfCfUmCfAmAmCmUmCmAmAmAInvab，并且所述5’-3’反义链包含VPU-S*fU*mUmGmAmGmUmUmGmAmGdTmUfCmAfAmGmUmG*mG*mC。

其中，上述VPU-S为2’-S-甲基尿苷-5’-(E)-乙烯基磷酸-3’-磷酸酯，mA为2’-O-甲基腺苷-3’-磷酸酯，mU为2’-O-甲基尿苷-3’-磷酸酯，mC为2’-O-甲基胞苷-3’-磷酸酯，mG为2’-O-甲基鸟苷-3’-磷酸酯，fA为2’-氟代腺苷-3’-磷酸酯，fU为2’-氟代尿苷-3’-磷酸酯，fC为2’-氟代胞苷-3’-磷酸酯，fG为2’-氟代鸟苷-3’-磷酸酯，dA为2’-脱氧腺苷-3’-磷酸酯，dT为2’-脱氧胸苷-3’-磷酸酯，dC为2’-脱氧胞苷-3’-磷酸酯，dG为2’-脱氧鸟苷-3’-磷酸酯，Invab为反向无碱基残基，*为硫代磷酸酯键。

在其中一些实施例中，所述配体为N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)或其衍生物。

在其中一些实施例中，所述N-乙酰基半乳糖胺或其衍生物与两种siRNA的正义链的3'端通过化学键分别连接，优选地，通过磷酸酯键或者硫代磷酸酯键连接。

在其中一些实施例中，所述配体的结构如下：

。

在其中一些实施例中，所述配体与siRNA的正义链的3’端连接。

在其中一些实施例中，所述配体与siRNA的正义链的3’端连接方式如下：

表示靶向AGT、PCSK9或ANGPTL3的修饰序列的siRNA。

在其中一些实施例中，靶向AGT和PCSK9基因时，所述双靶向的siRNA剂的每种siRNA选自表45中的DT03081，DT03086，DT03103，DT03099，DT03085，DT03101，DT03082，DT03097，DT03100或DT03102中的任一种所示的序列。

在其中一些实施例中，靶向AGT和ANGPTL3基因时，所述双靶向siRNA剂的每种siRNA选自表45中的DT02043或DT02047中的任一种所示的序列。

在其中一些实施例中，靶向ANGPTL3和PCSK9基因时，所述双靶向siRNA剂的每种siRNA选自表45中的DT09001，DT09003和DT09005中的任一种所示的序列。

本发明的第二个方面，提供了上述任一种双靶向siRNA剂在制备同时抑制AGT、PCSK9以及ANGPTL3任意组合的两个靶点(靶基因)表达的双链siRNA的产品中的应用。

在其中一些实施例中，所述产品为生物制剂或者药物制剂。

本发明的第三个方面，是提供上述任一种双靶向siRNA剂在制备预防和/或治疗高血压或/和脂质失调相关疾病的药物中的应用。

本发明的第四个方面，是提供一种用于同时抑制AGT、PCSK9以及ANGPTL3中任意组合的两个靶基因表达的生物制剂或者药物制剂，其活性成分包括上述任一项的双靶向siRNA剂。

本发明的第五个方面，是提供一种同时抑制AGT、PCSK9以及ANGPTL3中任意组合的两个靶基因表达的方法，该方法包括:

(a)将体内或体外的细胞与上述对应的任一种双靶向siRNA剂或上述的生物制剂或者药物制剂接触；和

(b)将步骤(a)中产生的细胞维持足以获得AGT、PCSK9以及ANGPTL3中任意组合的两个靶点表达的mRNA转录本的降解的时间，从而同时抑制细胞中AGT、PCSK9以及ANGPTL3中任意组合的两个靶点在细胞中的表达。

一种治疗与AGT基因和/或PCSK9基因和/或ANGPTL3基因相关病症的方法，其中，包含对该受验者给药治疗有效量的上述的双靶向siRNA剂或上述的生物制剂或者药物制剂，从而治疗该受验者。

在其中一些实施例中，其中所述细胞在受试者体内或体外。优选地，所述受试者是哺乳动物。

在其中一些实施例中，其中受试者是人。

在其中一些实施例中，其中AGT、PCSK9以及ANGPTL3表达被抑制至少约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约98％或约100％。

其中，所述高血压方面的疾病是由AGT基因介导的，包括但不限于临界性高血压、原发性高血压、继发性高血压、高血压危症、高血压急迫状态、孤立性收缩期和舒张期高血压、妊娠相关的高血压、糖尿病性高血压、顽固性高血压、难治性高血压、阵发性高血压、肾血管性高血压、戈德布拉特氏高血压、肺动脉高压、门静脉高压、系统性静脉高血压、收缩期高血压和不稳定性高血压或与AGT基因介导有关的其它疾病。

其中，所述脂质失调方面的疾病是由PCSK9基因介导的，包括但不限于高脂血症、动脉粥样硬化、非酒精性脂肪性肝炎、非酒精性脂肪性肝病或与PCSK9基因介导有关的其它疾病。

其中，所述脂质失调方面的疾病是由ANGPTL3基因介导的，包括但不限于高脂血症、高甘油三酯血症、脂质和/或胆固醇代谢异常、纯合子和杂合子家族性高胆固醇血症、他汀类药物抵抗性高胆固醇血症、心脏代谢疾病、肥胖、动脉粥样硬化、II型糖尿病、心血管疾病、冠状动脉疾病、非酒精性脂肪性肝炎、非酒精性脂肪性肝病、高甘油三酯血症引起的胰腺炎或与ANGPTL3基因介导有关的其它疾病。

本发明的第六个方面，是提供一种靶向AGT基因、PCSK9基因或ANGPTL3基因的siRNA，其可以作为一种单靶点的药物，也可以用于双靶点的药物。

一种靶向AGT基因的siRNA或其药学上可接受的盐，其序列选自以下一种，或与其相差不超过1个核苷酸的正义链或者反义链序列：

A)dsRNA为1167f，其中所述正义链包含UGACCAGCUUGUUUGUGAA(SEQ ID NO：59)，并且所述反义链包含UUCACAAACAAGCUGGUCGGG(SEQ ID NO：60)；

B)dsRNA为1167b，其中所述正义链包含GCCGACCAGCUUGUUUGUGAA(SEQ ID NO：51)，并且所述反义链包含UUCACAAACAAGCUGGUCGGC(SEQ ID NO：52)；

C)dsRNA为1165d，其中所述正义链包含GAGAACCAGUGUUUAGCGA(SEQ ID NO：39)，并且所述反义链包含UCGCUAAACACUGGUUCUUGG(SEQ ID NO：40)；

D)dsRNA为1165f，其中所述正义链包含CCAAGAACCAGUGUUUAGCGA(SEQ ID NO：43)，并且所述反义链包含UCGCUAAACACUGGUUCUUGG(SEQ ID NO：44)；

在其中的一些实施例中，所述siRNA经过修饰，选自以下序列中的一种，或与其相差不超过1个核苷酸的正义链或者反义链序列：

a)dsRNA为1167.25-19，其中所述5’-3’正义链包含

I nvab*mU*mGmAmCmCmAfGfCfUfUmGfUmUmUmGmUmGmAmAI nvab，并且所述5’-3’反义链包含VPU-S*fU*mCmAmCmAmAmAmCmAmAdGmCfUmGfGmUmCmG*mG*mG；

b)dsRNA为1167.27-21，其中所述5’-3’正义链包含

I nvab*mG*mCmCmGmAmCmCmAfGfCfUfUmGfUmUmUmGmUmGmAmAI nvab，并且所述5’-3’反义链包含VPU-S*fU*mCmAmCmAmAmAmCmAmAdGmCfUmGfGmUmCmG*mG*mC；

c)dsRNA为1165.5-14，其中所述5’-3’正义链包含

I nvab*mG*mAmGmAmAmCfCfAfGfUmGfUmUmUmAmGmCmGmAI nvab，并且所述5’-3’反义链包含VPU-S*fC*mGmCmUmAmAmAmCmAmCdTmGfGmUfUmCmUmU*mG*mG；

d)dsRNA为1165.5-16，其中所述5’-3’正义链包含

I nvab*mC*mCmAmAmGmAmAmCfCfAfGfUmGfUmUmUmAmGmCmGmAI nvab，并且所述5’-3’反义链包含VPU-S*fC*mGmCmUmAmAmAmCmAmCdTmGfGmUfUmCmUmU*mG*mG；

一种靶向PCSK9基因的siRNA或其药学上可接受的盐，其序列选自以下一种，或与其相差不超过1个核苷酸的正义链或者反义链序列：

E)dsRNA为11040a，其中所述正义链包含CUUAUUCUGGGUUUUGUAGCA(SEQ ID NO：375)，并且所述反义链包含UGCUACAAAACCCAGAAUAAG(SEQ ID NO：376)；

F)dsRNA为11002d，其中所述正义链包含GCAGCCAACUUUUCUAGAA(SEQ ID NO：259)，并且所述反义链包含UUCUAGAAAAGUUGGCUGUGG(SEQ ID NO：260)；

G)dsRNA为11002a，其中所述正义链包含CUACAGCCAACUUUUCUAGAA(SEQ ID NO：253)，并且所述反义链包含UUCUAGAAAAGUUGGCUGUAG(SEQ ID NO：254)；

在其中一些实施例中，所述的靶向前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶9基因(PCSK9基因)的siRNA经过修饰，选自以下序列中的一种，或与其相差不超过1个核苷酸的正义链或者反义链序列：

e)dsRNA为11040.10-23，其中所述5’-3’正义链包含

I nvab*mC*mUmUmAmUmUmCmUfGfGfGfUmUfUmUmGmUmAmGmCmAI nvab，并且所述5’-3’反义链包含VPU-S*fG*mCmUmAmCmAmAmAmAmCdCmCfAmGfAmAmUmA*mA*mG；

f)dsRNA为11002.17-21，其中所述5’-3’正义链包含

I nvab*mG*mCmAmGmCmCfAfAfCfUmUfUmUmCmUmAmGmAmAI nvab，并且所述5’-3’反义链包含VPU-S*fU*mCmUmAmGmAmAmAmAmGdTmUfGmGfCmUmGmU*mG*mG；

g)dsRNA为11002.10-23，其中所述5’-3’正义链包含

I nvab*mC*mUmAmCmAmGmCmCfAfAfCfUmUfUmUmCmUmAmGmAmAI nvab，并且所述5’-3’反义链包含VPU-S*fU*mCmUmAmGmAmAmAmAmGdTmUfGmGfCmUmGmU*mA*mG；

一种靶向ANGPTL3基因的siRNA或其药学上可接受的盐，其序列选自以下一种，或与其相差不超过1个核苷酸的正义链或者反义链序列：

H)dsRNA为7061f，其中所述正义链包含UACUUGAACUCAACUCAAA(SEQ ID NO：579)，并且所述反义链包含UUUGAGUUGAGUUCAAGUGGG(SEQ ID NO：580)；

I)dsRNA为7061b，其中所述正义链包含GCCACUUGAACUCAACUCAAA(SEQ ID NO：571)，并且所述反义链包含UUUGAGUUGAGUUCAAGUGGC(SEQ ID NO：572)；

在其中的一些实施例中，所述siRNA经过修饰，选自以下序列中的一种，或与其相差不超过1个核苷酸的正义链或者反义链序列：

h)dsRNA为7061.18-14，其中所述5’-3’正义链包含

I nvab*mU*mAmCmUmUmGfAfAfCfUmCfAmAmCmUmCmAmAmAI nvab，并且所述反义链包含VPU-S*fU*mUmGmAmGmUmUmGmAmGdTmUfCmAfAmGmUmG*mG*mG；

i)dsRNA为7061.4-16，其中所述5’-3’正义链包含

Invab*mG*mCmCmAmCmUmUmGfAfAfCfUmCfAmAmCmUmCmAmAmAInvab，并且所述反义链包含VPU-S*fU*mUmGmAmGmUmUmGmAmGdTmUfCmAfAmGmUmG*mG*mC；

本发明的第七个方面，是提供一种靶向AGT基因、PCSK9基因或ANGPTL3基因的siRNA剂，其活性成分包括任一项上述的siRNA或其药学上可接受的盐与配体连接而成。

在其中一些实施例中，所述配体是N-乙酰基半乳糖胺衍生物，优选地，其配体的结构式如下：

在其中一些实施例中，所述配体通过化学键与正义链的3'端连接，优选地，化学键分别是磷酸酯键或者硫代磷酸酯键，其连接方式如下：

我们经过对siRNA序列研究，并通过大量的实验，筛选到多条能够用于同时抑制AGT、PCSK9以及ANGPTL3等任意组合的两个靶点表达的双靶向siRNA剂，在此基础上，还进行了合适的修饰以提高靶标的沉默能力并降低非靶点活性，其能够针对单靶点使用，更能针对双靶点使用。同时，本发明所述的siRNA剂可以采用合适的、优选组合的两个靶点通过递送系统可以同时递送到肝脏中起作用，起到更好的活性效果。所述有望应用于临床上进行与AGT、PCSK9以及ANGPTL3等任意组合的两个靶点相关的高血压或/和脂质失调方面的疾病中的应用。

附图说明

图160nmol/kg剂量下AAV8-hAGT/hPCSK9小鼠中AGT/PCSK9双靶向siRNA DT03081对AGT靶点的抑制效果随时间变化曲线。

图260nmol/kg剂量下AAV8-hAGT/hPCSK9小鼠中AGT/PCSK9双靶向siRNA DT03081对PCSK9靶点的抑制效果随时间变化曲线。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

本发明提供了一种双靶向siRNA剂，其包括靶向两种不同的基因的两种不同的siRNA或其药学上可接受的盐，所述siRNA为正义链和反义链构成的dsRNA，其中，包括针对靶向第一基因的第一dsRNA和靶向第二基因的第二dsRNA，所述第一dsRNA和第二dsRNA通过药学上可接受的配体相连接，所述第一靶向基因和第二靶向基因分别选自血管紧张素原(angiotensinogen，AGT)、血管生成素样蛋白3(angiopoietin-like 3，ANGPTL3)、以及前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶9(proprotein convertase subtilisin/kexin type9，PCSK9)；

AGT、ANGPTL3以及PCSK9等任意组合的两个靶点的表达可基于与AGT、ANGPTL3以及PCSK9基因表达相关的任何变量的水平而评价，如组织或血清中的AGT、ANGPTL3以及PCSK9mRNA水平、AGT、ANGPTL3以及PCSK9蛋白质水平，相关血脂水平等。抑制可通过此等变量之一者或多者的绝对水平或相对水平相较于对照水平的下降而评价。该对照水平可为该技术领域中采用的任何类型的对照水平，如给药前基线水平、或自未治疗或经对照治疗的类似受验者、细胞或样本测得的水平、以及已知族群水平。

在其中一些实施例中，与AGT、ANGPTL3以及PCSK9等任意组合的两个靶点的表达相关的疾病为高血压或/和脂质失调方面的应用。

所述治疗或/和预防高血压方面的疾病的药物中的应用，其中，所述高血压方面的疾病是由AGT基因介导的，包括但不限于临界性高血压、原发性高血压、继发性高血压、高血压危症、高血压急迫状态、孤立性收缩期和舒张期高血压、妊娠相关的高血压、糖尿病性高血压、顽固性高血压、难治性高血压、阵发性高血压、肾血管性高血压、戈德布拉特氏高血压、肺动脉高压、门静脉高压、系统性静脉高血压、收缩期高血压和不稳定性高血压或与AGT基因介导有关的其它疾病。

所述治疗或/和预防脂质失调方面的疾病的药物中的应用，其中，所述脂质失调方面的疾病是由PCSK9基因介导的，包括但不限于高脂血症、动脉粥样硬化、非酒精性脂肪性肝炎、非酒精性脂肪性肝病或与PCSK9基因介导有关的其它疾病。

所述治疗或/和预防脂质失调方面的疾病的药物中的应用，其中，所述脂质失调方面的疾病是由ANGPTL3基因介导的，包括但不限于高脂血症、高甘油三酯血症、脂质和/或胆固醇代谢异常、纯合子和杂合子家族性高胆固醇血症、他汀类药物抵抗性高胆固醇血症、心脏代谢疾病、肥胖、动脉粥样硬化、I I型糖尿病、心血管疾病、冠状动脉疾病、非酒精性脂肪性肝炎、非酒精性脂肪性肝病、高甘油三酯血症引起的胰腺炎。或与ANGPTL3基因介导有关的其它疾病。

将本发明的siRNA剂递送至细胞，如受验者(如人受验者，如患有AGT、ANGPTL3以及PCSK9等相关病症如血色素沉着症的受验者)内的细胞，可通过多种不同路径达成。举例而言，可通过令细胞与本发明的siRNA或于活体外或于活体内接触而施行递送。活体内递送亦可通过将包含siRNA或其盐的组成物给药至受验者。

通常，任一递送核酸分子的方法(活体外或活体内可参考已有的递送技术。对于活体内递送，为了递送siRNA分子考虑的因素系包括，举例而言，所递送的分子的生物学安定性、非专一性效果的预防、以及所递送的分子到达目标组织内的蓄积。可通过局部给药(举例而言，通过直接注射或植入组织或外用给药)制剂。局部给药至治疗位点是最大化该药物制剂的局部浓度，限制该剂曝露至可被该剂伤害或可令该剂降解的全身性组织，以及容许待给药的siRNA分子的较低总剂量。

对于全身性给药siRNA而治疗疾病，该RNA可经修饰或使用药物递送系统递送；两种方法皆作用以防止通过活体内的核酸内切酶及核酸外切酶造成的dsRNA的快速降解。对RNA或药学载剂的修饰亦可容许该siRNA组成物靶向至目标组织，并避免脱靶效果。siRNA分子可通过化学接合至亲脂性基如胆固醇而修饰，例如脂质颗粒，以提升细胞摄取并防止降解。

本发明也包括药物组成物及制剂，其包括本发明的任一所述siRNA或其盐。在其中一些实施例中，所述药物制剂含有本文中描述的siRNA或其盐以及药学可接受的载体的药物组成物。含有该siRNA之药物组成物有用于治疗与AGT、ANGPTL3以及PCSK9等相关的疾病或病症，如血色素沉着症。此等药物组成物基于递送模式而配制。

在其中一些实施例中，配制为用于经由不经肠道递送如静脉(IV)递送或皮下(SC)递送而全身给药的组成物。于本发明的方法中，该siRNA或其盐的药物制剂可于溶液中给药，优选在无菌溶液中给药，例如通过注射给药。

本发明中，“治疗有效量”包括，当对患者给药用于治疗AGT、ANGPTL3以及PCSK9等相关疾病时，siRNA或其盐的量系足以造成该疾病的治疗(如，透过削弱、减轻或维持现有疾病、或疾病的一种或多种症候)。该“治疗有效量”可依据该siRNA或其盐的药物制剂、该制剂如何给药、疾病及其严重性、及待治疗的患者的病史、年龄、体重、家族病史、基因组成、通过AGT、ANGPTL3以及PCSK9等表现介导的病理过程的阶段、先前治疗或联合治疗的类型(若有)、及其他独立特征而改变。

本发明中，“预防有效量”包括，当对尚未经历或显现AGT、ANGPTL3以及PCSK9等相关疾病的症候但可能易患该疾病的受验者给药时，包含siRNA或其盐的药物剂的量足以预防或减轻该疾病或该疾病的一种或多种症候。减轻该疾病包括延缓该疾病的进程或降低后续发展的疾病的严重性。该“预防有效量”可依据该siRNA或其盐的药物制的如何给药、疾病的风险程度、及待治疗的患者的病史、年龄、体重、家族病史、基因组成、通过AGT、ANGPTL3以及PCSK9表现介导的病理过程的阶段、先前治疗或联合治疗的类型(若有)、及其他独立特征而改变。

“治疗有效量”或“预防有效量”也包括一种siRNA的量，以任何治疗可接受的合理的效益、风险比。

本发明所述靶向性递送配体或其他类型递送载体，所述配体优选为N-乙酰基半乳糖胺衍生物(GalNAc载体)，其他类型递送载体如特异性递送到肝脏细胞的脂质体只要能实现siRNA的递送都可用于本发明。

近年来，GalNAc载体目前已经有比较深入研究，GalNAc-核酸是糖类化合物与核酸形成的单缀合物，将N-乙酰化的半乳糖胺以三价态的方式共价缀合到不同序列的RNA的正义链3′和/或5′末端，形成GalNAc-siRNA药物，从而实现向肝细胞的特异性递送，并通过细胞内吞作用使药物进入细胞和发挥功能。

本发明中所有siRNA均靶向人源的AGT、PCSK9或ANGPTL3，在一些实施例中，采用hAGT、hPCSK9或hANGPTL3表述靶点，是为了强调，在AAV8转染小鼠或人源化小鼠中检测的基因或蛋白是人AGT、人PCSK9或人ANGPTL3。

以下部分实施例中，双靶点GalNAc配体结构如下：

单靶点GalNAc配体如下：

以下部分实施例中，双靶点GalNAc配体连接siRNA后的结构如下：

单靶点GalNAc配体连接siRNA后的结构如下：

本发明核酸序列表中，使用的核苷酸单体的缩写及结构如下：

本领域技术人员根据已有的技术，所述siRNA的药学上可接受的盐可为钠盐或钾盐，例如，在纯化的时候，产生的钠盐。

人血管紧张素原(AGT)mRNA【NCBI参考序列：NM_001384479.1】。

人前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶9基因(PCSK9)mRNA【NCBI参考序列。

NM_174936.4】：

人血管生成素样蛋白3(ANGPTL3)mRNA【NCBI参考序列：NM_014495.4】。

以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。

实施例1靶向人AGT(hAGT)的siRNA

在北京擎科生物科技有限公司12通道核酸合成仪上，使用固相寡核苷酸合成方案进行0.2-1μmol的寡核苷酸合成，siRNA序列需要在CPG预填充柱上进行合成，根据需要使用偶联GalNAc的CPG或通用型CPG。在合成的寡核苷酸中加入氨解试剂，并在45-80℃下孵育，将寡核苷酸与固相载体分离使寡核苷酸游离下来。然后用乙醇沉淀粗制寡核苷酸，高速离心弃去上清液，重复两遍获得粗制寡核苷酸，并将沉淀重悬于DEPC水中。通过离子配对HPLC方法对粗制寡核苷酸进行纯化，将收集到的产物在真空离心干燥器中干燥至粉末状。用DEPC水溶解纯化后得到的产物，并通过TOF LC-MS进行分析。测定寡核苷酸浓度，计算等摩尔量的正义链、反义链所需体积，将等摩尔量的正义链、反义链混合均匀，通过95℃加热5分钟，然后自然冷却至室温的退火方法制备双链。

表1：未修饰靶向AGT基因的siRNA的正义链和反义链序列

接下来，我们对siRNA进行修饰，以提高其在体内外的稳定性，增强对靶点的活性，并降低对非靶点的活性。除非另有说明，在进行单靶点序列的体内和体外筛选时，均采用L96递送方式，以更真实地反映肝靶向siRNA的效果。siRNA与L96的连接方式为正义链的3'端与L96相连。

双链体1000PM(AD-85481)为进展最快的AGT靶点药物Zilebesiran，目前在进行临床二期研究，专利号为US11015201 B2，用作阳性比对序列。

表2：靶向AGT基因的修饰siRNA序列

实施例2靶向AGT的siRNA的体外筛选

实验方法一：在Hep3B细胞中采用脂质体转染方法进行siRNA体外筛选

细胞培养和96孔板转染：在Hep3B细胞中进行体外实验，采用MEM+10％FBS+1X青霉素链霉素+1X非必需氨基酸培养基，细胞平铺面积达80％时用胰蛋白酶消化，并用Scepter自动细胞计数仪(Millipore，#PHCC00000)测定细胞密度，同时在96孔板中将siRNA、Opti-MEM和INTERFERin(Polyplus)混合并置于室温孵育10分钟，然后每孔加入含有Hep3B细胞的完全培养基，将96孔板放于37℃，5％CO₂的培养箱中孵育24小时。

96孔板RNA提取、反转录：使用Ol igo d(T)25Magnetic Beads试剂(NEB)提取96孔板细胞mRNA，将96孔板中培养基吸走，用DPBS清洗一次，每孔加入100μl细胞裂解液，再加入20μl beads，在振荡器上震荡，将96孔板置于磁分离架上，吸走孔内裂解液，每孔加入100μl的清洗缓冲液A，吹打后置于磁分离架上，吸走清洗缓冲液A，然后用100μl清洗缓冲液B将beads吹起，转移到新的96孔板，置于磁分离架，吸走清洗缓冲液B，再用100μl低盐缓冲液将beads吹起转移到96孔PCR板中，将96孔PCR板置于磁分离架上，吸走低盐缓冲液。每孔加入10μL洗脱缓冲液将beads吹起，50℃孵育2分钟，将mRNA从Beads上洗脱下来。通过StarScript Pro一管化去基因组反转录预混液(genstar)配制反转录体系，96孔PCR中分装每孔5μL，加入上一步得到的mRNA溶液5μL混匀，短暂离心，用封板膜封板。9)在PCR仪上进行37℃孵育3分钟，50℃孵育50分钟，后85℃孵育2分钟，降温至4℃，反转录结束。

实时荧光定量PCR：反转录结束后将96孔板置于磁分离架上直到beads都吸附在底部，吸走反转试剂，将配好的QPCR体系加入到96孔PCR板中，封板膜封板，在StepOnePlus的实时PCR系统(appl ied biosystems)上进行PCR。采用ΔΔCt方法分析数据，并采用同样浓度下阴性对照序列转染的细胞进行测试标准化。

阴性对照AD-1955序列如下：

正义链：CUUACGCUGAGUACUUCGAdTdT(SEQ ID NO：703)

反义链：UCGAAGUACUCAGCGUAAGdTdT(SEQ ID NO：704)。

检测AGT的引物如下：

正向引物：ATTCTGCACACCGAGCTGAA(SEQ ID NO：705)

反向引物：TCAAGCTCAAAAAAAATGCTGTTC(SEQ ID NO：706)

探针:CTGCAAAAATTGAGCAATGACCGCATC(SEQ ID NO：707)(报告基因5'FAM，淬灭基团3'MGB)

实验方法二：在人源化AGT小鼠(购于集萃药康)或同时表达人AGT(hAGT)及ANGPTL3(h ANGPTL3)的AAV8病毒感染的小鼠的原代肝细胞中进行体外筛选。

同时稳定表达hAGT和hANGPTL3的AAV8病毒感染小鼠的构建(AAV8-hAGT/hANGPTL3小鼠)：通过1x10¹¹滴度超纯化重组AAV8-hAGT和1x10¹¹滴度超纯化重组AAV8-hANGPTL3病毒颗粒感染小鼠，获得同时稳定表达hAGT和hANGPTL3的转基因小鼠。

小鼠原代肝细胞提取：通过下腔静脉灌注法，用胶原酶消化提取小鼠肝细胞。经组织细胞滤网(BIOLOGIX，15-1070)过滤，得到活性良好的小鼠原代肝细胞，重悬于DMEM培养基+10％FBS+1X青霉素链霉素中，用Scepter自动细胞计数仪测定细胞密度。

siRNA转染、RNA提取、反转及实时荧光定量PCR方法同方法一，自由摄取方式递送siRNA无需添加INTERFERin。

表3：Hep3B细胞中0.1nM修饰siRNA通过脂质体转染的实验结果

我们通过Hep3B细胞对靶向AGT的一些序列进行活性筛选，通过表3得出，在0.1nM浓度下，1131.21-11，1165.1-1，1167.1-1，1172.1-1等多条序列活性与阳性参照相近或更好。

表4：人源化AGT小鼠原代肝细胞中1nM修饰siRNA通过L96递送的实验结果

我们进一步使用人源化AGT小鼠原代肝细胞，对修饰siRNA进行体外活性评价。从表4可以看出，通过L96递送时，1131.21-11，1167.1-1等多条siRNA活性优于阳性参照序列。

表5：AAV8-hAGT/hANGPTL3小鼠原代肝细胞中0.1nM修饰siRNA通过L96递送的实验结果

从表5的实验数据我们可以发现1165.4-13、1167.3-14等多条siRNA在0.1nM浓度，AAV8-hAGT/hANGPTL3小鼠原代肝细胞中采用L96递送的条件下活性优于阳性参照1000PM。而且我们发现，即使种子区相同，1165.4-13的活性优于1165.2-3，而19/21配对的1167.3-14序列活性要优于21/21配对的1167.2-4，说明siRNA在结尾碱基上的一些改变，也会极大影响序列的活性。我们接下来对上述几个体外实验中活性比较好的序列在小鼠体内进行评测。

实施例3AAV8-hAGT小鼠中评估优选序列对AGT蛋白表达的影响

实验方法：

1.腺病毒整合hAGT

通过1x10¹¹滴度超纯化重组AAV8病毒颗粒感染小鼠，获得稳定表达hAGT的转基因小鼠。

2.实验分组给药

小鼠注射病毒14天后，颌下静脉取血，室温静置30分钟，1000×g离心10分钟，取上清血清，分装冻存于-80度冰箱。血清样品稀释1000倍，通过Human Angiotensinogen/AGT/SerpinA8 ELISA Kit(联科生物，货号：EK1202–96)检测小鼠血清中hAGT的表达。以hAGT表达量为基准，将小鼠平均分组，每组4只。siRNA用PBS溶解，浓度调整为0.2mg/kg，小鼠按1mg/kg剂量皮下注射siRNA溶液。

3.ELISA检测

siRNA注射后，每隔一定时间颌下静脉取血，室温静置30分钟，1000×g离心10分钟，取上清血清，稀释1000倍后ELISA检测hAGT表达量。AGT剩余量(％)＝第N天hAGT蛋白浓度/第0天hAGT蛋白浓度*100％。

表6：1mg/kg剂量下hAGT靶向siRNA通过L96递送进AAV8-hAGT小鼠体内后hAGT蛋白表达水平随时间变化的实验结果

NA表示未检测

从表6中我们可以看到，一些在体外活性比较好的序列，进入体内后活性并没有阳性参照好，1161.3-7，1165.3-11，1167.4-14，1172.2-17及1172.9-28等几条siRNA活性与阳性参考1000PM相当或更好。尤其是第56天时，可以明显看出阳性参照序列1000PM组的hAGT蛋白表达水平出现明显回升，而1165.3-11，1167.4-14、1172.2-17及1172.9-28组的hAGT蛋白表达水平仍然维持在50％以下。此外，1161.3-7在第30天时AGT表达仅剩余24％，而1161.3-11在第30天剩余45.1％，这表明，同一条裸序列在进行不同修饰后，其活性差异显著，进一步证明了修饰对siRNA活性的影响极为重要。

实施例4siRNA安全性测试

每两周一次向7-8周龄小鼠(维通利华)皮下注射400mg/kg的siRNA，持续4周，共注射3次。对照组小鼠每两周一次皮下注射生理盐水，持续4周，共注射3次，每组4-6只小鼠。均在最后一次注射24小时后收集血清用于检测谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)水平。

表7：靶向AGT siRNA安全性实验结果

siRNA	ALT(U/L)	AST(U/L)
			生理盐水	42	135
1167.3-14	31	75
			1172.2-17	221	219
1191.1-1	325	347

从表7我们可以看出，不同的siRNA序列对小鼠的肝功能有不同的影响。1167.3-14在小鼠中对肝功能没有影响，而1172.2-17和1191.1-1影响很大。

实施例5不同修饰对靶向AGT的优选序列活性及稳定性的影响

序列活性方法参考实施例2。

siRNA稳定性研究实验方法如下：

用DEPC水精确稀释受试的化合物序列，稀释至浓度为10μM的工作液。

肝匀浆的制备：称量200mg小鼠肝脏，加入1mL磷酸钾缓冲溶液和5颗磁珠，在研磨仪中60HZ，30s/次条件下匀浆3次，得到200mg/mL肝匀浆。

72h样品的制备：取17μL 10μM受试化合物/阳性化合物工作溶液，加入153μL肝匀浆混合，涡旋30s，取75μL化合物与肝匀浆混合溶液于EP管中，平行样本数为2，置于37℃孵育箱孵育72h，孵育完后取出50μL。

0h样品的制备：取75μL肝匀浆于EP管中，平行样本数为2，置于37℃孵育箱孵育72h，孵育完后取出45μL肝匀浆，加入5μL 10μM受试化合物/阳性化合物，混匀。

孵育后的样品每管加入5μL 50μg/ml内标，混匀，每管再加入100μL裂解液，涡旋30s，静置20min。

所有样品采用合适前处理方法处理后，取上清进行仪器分析。随后计算，相对剩余率(％)＝(72h化合物含量/0h化合物含量)×100％。

我们接下来探讨1167附近序列是否都具有高活性，所以我们在1167附近，选取了与1167相差1-2个核苷酸的序列在人源化AGT小鼠原代肝细胞中进行了活性评测。结果见表8。

表8：小鼠原代肝细胞中1nM修饰siRNA通过L96递送的实验结果

我们发现1198.1-1，1222.1-1，1223.1-1，1224.1-1等序列与1167.3-5相比活性差很多。同时我们还发现，即使同一个种子区，采用19/21配对的1167.3-5，也比采用21/21配对的1167.2-4及1167.11-15活性高很多。

我们接下来探讨不同的修饰对于1167活性的影响，结果见表9。

表9：不同细胞中不同浓度修饰siRNA通过不同转染方式的实验结果

NA表示未检测

对优选序列1167，设计了不同的修饰siRNA，并在Hep3B细胞，AAV8-hAGT/hPCSK9小鼠原代肝细胞，以及人源化AGT小鼠原代肝细胞中，分别通过脂质体转染及自由摄取的方式，在体外对这些序列进行了活性比较。实验方法参照实施例2。从表9可以看出，不同修饰对于序列的活性影响非常大，活性最高的1167.17-19远高于阳性参照，而活性最差的1167.12-14活性比阳性参照差很多，进一步说明了修饰对于siRNA活性的重要性。我们接下来对活性好的序列进行肝匀浆稳定性测试，用于评估序列在体内的稳定性。

表10：不同修饰siRNA的肝匀浆稳定性实验结果

siRNA	72h时反义链残余比例(％)
		1167.3-5	70.74
1167.3-16	58.98
		1167.16-5	79.27
1167.16-16	68.00
		1167.17-17	90.89
1167.17-19	91.16

从表10可以看出，修饰不同，序列在肝匀浆中的稳定性也不同。活性最好的1167.17-19相比其他修饰的1167序列在肝匀浆中也更稳定。

表11：人源化AGT小鼠原代肝细胞中0.1nM修饰siRNA通过脂质体递送的实验结果

表12：不同修饰siRNA的肝匀浆稳定性实验结果

siRNA	72h时反义链残余比例(％)
		1167.17-19	81.96
1167.22-19	86.08
		1167.23-19	68.25
1167.24-19	59.74

通过表11及表12我们发现，不同结尾对于1167序列的活性和稳定性影响很大，当1167采用mGmG结尾时，无论活性还是稳定性相比mCmC，dTdT或者mAmA都要高很多。

表13：AGT/PCSK9双人源化小鼠原代肝细胞中0.3nM修饰siRNA通过L96递送的实验结果

从表13可以看出，VPU-S修饰的1167.25-19活性跟VPU修饰的1167.17-19相当。

我们进一步优化1165及1161两条活性好，安全性高的序列，检测了不同修饰，更改不同碱基时体外活性变化。

表14：AGT/PCSK9双人源化小鼠原代肝细胞中0.3nM修饰siRNA双链通过L96递送的实验结果

优选序列1161与1165，通过改变碱基和修饰，对这两条序列进行进一步优化。发现VPU-S修饰对这两条序列活性影响非常大。其中，对于序列1161，1161.4-13，1161.5-14，1161.7-15这三种修饰活性最好。对于序列1165，1165.8-17，1165.5-14，1165.5-16这三种修饰活性都很好。且这些优选序列活性远高于阳性参考1000PM。

表15：AAV8-AGT/ANGPTL3小鼠原代肝细胞中不同浓度修饰siRNA通过SL01递送的实验结果

针对优选序列1161.7-15，1161.7-17，1165.5-14，1165.5-16，1167.25-19，1167.27-21，在1nM和0.1nM浓度下，对采用SL01递送的siRNA双链进行了体外活性评价。从表15看出，在1nM及0.1nM下，优选序列活性均要高于Alnylam阳性参考，其中活性最好的是1167.25-19，1165.5-14与1165.5-16。

接下来我们在体内对多条优选序列进行评测。

表16：1mg/kg剂量下AGT靶向siRNA通过L96递送进AAV8-hAGT小鼠体内后hAGT蛋白表达水平实验结果

从表16可以看出，1167.25-19，1167.27-21，1165.5-16的体内活性远优于阳性参照，特别是在长效性方面。在第74天时，阳性参考1000PM对AGT表达的抑制率仅剩余20％，而优选序列1167.25-19，1167.27-21，1165.5-16对AGT表达的抑制率仍然有50％左右。我们接下来测试采用SL01递送优选序列在体内的活性

表17：1mg/kg剂量下hAGT靶向siRNA通过SL01递送进AAV8-hAGT/hPCSK9小鼠体内后hAGT蛋白表达水平实验结果

对活性最好的两条序列，进一步在体内验证其活性。其中阳性参考采用L96递送，1167.25-19与1165.5-16采用SL01递送。可以看出，两条优选序列的活性要远优于阳性参考。

实施例6靶向PCSK9的siRNA的合成

合成方法参考实施例1。双链体11000PM为已经获批上市的药物inclisiran，专利号CN108220295B，用做阳性对比序列。

表18：未修饰靶向PCSK9的siRNA的正义链和反义链序列

接下来，我们对siRNA进行修饰，以提高其在体内外的稳定性，增强对靶点的活性，并降低对非靶点的活性。除非另有说明，在进行单靶点序列的体内和体外筛选时，均采用L96递送方式，以更真实地反映肝靶向siRNA的效果。siRNA与L96的连接方式为正义链的3'端与L96相连。

表19：靶向PCSK9的修饰siRNA序列

实施例7靶向PCSK9的siRNA体外活性及稳定性的实验结果

人源化PCSK9小鼠购于上海南方模式生物科技股份有限公司，其原代肝细胞提取实验方法与细胞靶基因qPCR检测方法参考实施例2。

检测PCSK9的引物如下：

正向引物：ACGTGGCTGGCATTGCA(SEQ ID NO：708)

反向引物：AAGTGGATCAGTCTCTGCCTCAA(SEQ ID NO：709)

探针:CATGATGCTGTCTGCCGAGCCG(SEQ ID NO：710)(报告基因5'NED，淬灭基团3'BHQ1)

表20：Hep3B细胞中不同浓度修饰siRNA通过脂质体转染的实验结果

NA表示未检测

表21：人源化PCSK9小鼠原代肝细胞中不同浓度修饰siRNA通过脂质体转染或L96递送的实验结果

表22：人源化PCSK9小鼠原代肝细胞中10nM修饰siRNA通过L96递送的实验结果

Hep3B及人源化PCSK9小鼠肝原代细胞体外活性数据显示，11002.1-1、11040.1-1及11042.1-1在内的多条序列活性比阳性参照好。接下来我们在人源化PCSK9小鼠中测试这些序列的活性。

实施例8在人源化PCSK9小鼠中评估单次皮下注射1mg/kg siRNA对PCSK9蛋白表达的影响

实验方法：

1.实验分组给药

对实验前小鼠采用颌下静脉取血的方式，获取全血，血样室温静置30分钟，1000×g离心10分钟，取上清血清，分装冻存于-80度冰箱。血清样品稀释1000倍，通过Human PCSK9ELISA Kit(proteintech，Cat No:KE00278)检测小鼠血清中PCSK9的表达。以PCSK9表达量为基准，将小鼠平均分组，每组4只。siRNA用生理盐水溶解，浓度调整为0.1mg/ml，小鼠按1mg/kg剂量单次皮下注射siRNA溶液。

2.ELISA检测

siRNA注射后，每隔一段时间颌下静脉取少量血，室温静置30分钟，1000×g离心10分钟，取上清血清，稀释1000倍后ELISA检测PCSK9表达量。

实验结果见表23。

表23：1mg/kg剂量下PCSK9靶向siRNA抑制人源化PCSK9小鼠体内PCSK9蛋白表达水平实验结果

数据显示，血清PCSK9蛋白抑制率在给药后第30天达到最大，此后有所回升。阳性参照组在第40天时PCSK9蛋白剩余约89.7％，抑制率约为10.3％，其余各实验组抑制率均比阳性参照高，尤其是11040.1-6、11042.1-15，抑制率均大于50％，11002.1-8抑制率也有46.8％，在第55天时11042.1-15组抑制率仍有50％。11040.1-6活性高于11040.1-8活性，说明即使同一个序列，不同修饰在体内的活性也不同。

实施例9靶向PCSK9 siRNA安全性测试

siRNA安全性测试方法参见实施例4，实验结果见表24

表24：靶向PCSK9 siRNA安全性实验结果

siRNA	ALT(U/L)	AST(U/L)
			生理盐水	47	154
11002.7-14	47	172
			11040.3-10	39	85
11042.1-15	526	320

注：11042.1-15数据为第二次注射10天后的测试。

从表24我们可以看出，11002.7-14和11040.3-10在小鼠安全性很好，而11042.1-15对小鼠来说对肝功能影响很大。

实施例1011002及11040不同修饰及碱基改动对序列活性及稳定性的影响

表25：人源化PCSK9小鼠原代肝细胞中1nM修饰siRNA通过L96递送的实验结果

从表25可以得出，同一条序列，不同正义链修饰对活性影响很大。11040.1-23的修饰活性最好。

表26：人源化PCSK9小鼠原代肝细胞中3nM修饰siRNA通过L96递送的实验结果

从表26可以得出，不同序列进行碱基及修饰改动，活性变化不同。

表27：不同修饰siRNA肝匀浆中代谢稳定性数据

siRNA	72h时反义链残余比例(％)
		11000PM	68.26
11002.1-1	73.45
		11002.3-10	70.31
11002.5-14	63.18
		11002.7-14	86.41
11040.1-1	107.97
		11040.3-10	48.69
11040.5-10	24.93
		11040.7-18	25.32

从表27可以得出，不同序列进行修饰及碱基改动对稳定性影响也不同，其中11002.7-14及11040.1-1在肝匀浆中非常稳定，而11002.5-14及11040.5-10等稳定性下降明显。

表28：人源化PCSK9小鼠原代肝细胞中不同浓度修饰siRNA通过L96或脂质体转染递送的实验结果

表29：人源化PCSK9小鼠原代肝细胞中不同浓度修饰siRNA通过L96或脂质体转染递送的实验结果

表30：AVV8-hPCSK9小鼠原代肝细胞中0.3nM修饰siRNA通过脂质体递送的实验结果

表31：AVV8-hPCSK9小鼠原代肝细胞中0.1nM修饰siRNA通过脂质体转染的实验结果

表32：AVV8-hPCSK9小鼠原代肝细胞中不同浓度修饰siRNA通过L96递送的实验结果

表28-32中的实验数据显示我们对11002和11040序列从正义链和反义链等多个方面进行了优化。结果表明，优选序列11002.17-21、11002.10-23及11040.10-23的活性均优于阳性参照11000PM。我们接下来在体内验证优选序列的活性。

表33：1mg/kg剂量下PCSK9靶向siRNA抑制人源化PCSK9小鼠体内PCSK9蛋白表达水平实验结果

从表33可以得出，11002.17-21和11040.10-23在体内的活性远优于阳性参照1000PM。

实施例11靶向ANGPTL3的siRNA合成

具体合成方法参考实施例1.

表34：未修饰靶向ANGPTL3的siRNA的正义链和反义链序列

接下来，我们对siRNA进行修饰，以提高其在体内外的稳定性，增强对靶点的活性，并降低对非靶点的活性。除非另有说明，在进行单靶点序列的体内和体外筛选时，均采用L96递送方式，以更真实地反映肝靶向siRNA的效果。siRNA与L96的连接方式为正义链的3'端与L96相连。

7000PM(AD-1331212)为US11613751 B2专利中最优序列。ARO-ANG3为US10995335B2专利中最优序列，用做阳性比对序列，序列信息见表34。为考察序列活性，采用相同的GalNAc进行递送。

表35：靶向ANGPTL3的修饰siRNA序列

实施例12靶向ANGPTL3的siRNA体外活性评测

Hep3B细胞体外活性评测方法参考实施例2。利用原代肝细胞进行体外活性评价时，稳定表达hANGPTL3的转基因小鼠的获取及原代肝细胞提取方法参考实施例2。

检测ANGPTL3的引物如下：

正向引物：ACATGTGGCTGAGATTGCTGG(SEQ ID NO：711)

反向引物：CCTTTGCTCTGTGATTCCATGTAG(SEQ ID NO：712)

探针:CCTCCCAGAGCACACAGACCTGATGTTT(SEQ ID NO：713)(报告基因5'NED，淬灭基团3'MGB)

表36：Hep3B和人源化ANGPTL3小鼠原代肝细胞中不同浓度修饰siRNA通过脂质体转染或L96递送的实验结果

NA表示未检测

在Hep3B细胞和人源化ANGPTL3小鼠原代肝细胞中分别通过脂质体转染和自由摄取对修饰的siRNA进行活性评价，从表中数据可知，多条序列活性优于阳性参考。我们接下来对其进行体内活性评测。结果见下表37。

实施例13在AAV8-hANGPTL3小鼠中评估体外优选序列对肝中hANGPTL3表达的影响在表达hANGPTL3的小鼠中评估体外优选序列对肝中hANGPTL3表达的影响。

实验方法：

1.腺病毒整合hANGPTL3

通过1-10x10¹¹滴度纯化重组AAV8病毒颗粒感染小鼠，获得稳定表达hANGPTL3的转基因小鼠。

2.给药

小鼠注射病毒14天后，将小鼠平均分组，每组4只。siRNA用生理盐水溶解，皮下注射，给药剂量1mg/kg或者3mg/kg。

3.取肝检测

siRNA注射后不同时间点取肝，通过TRI REAGENT(MRC，货号：TR118)提取肝组织中的RNA，用PrimeScript RT regent Kit(Takara，货号：RR047A)将提取的RNA反转录为cDNA。配好的QPCR体系加入到96孔PCR板中，封板膜封板，在StepOnePlus的实时PCR系统(applied biosystems)上进行QPCR，检测hANGPTL3表达量。

表37：1mg/kg剂量下ANGPTL3靶向siRNA抑制AAV8-hANGPTL3小鼠肝脏内hANGPTL3基因表达水平实验结果

NA表示未检测

体外活性比较好的siRNA以1mg/kg剂量进行体内活性筛选，实验结果见表37。7061.1-11活性最优，远好于阳性参照ARO-ANG3。

表38：AAV8-hAGT/hANGPTL3小鼠原代肝细胞中0.3nM修饰siRNA通过L96递送的实验结果

从表38得出，7061.9-13和7061.1-11活性都远高于阳性参考ARO-ANG3

表39：Hep3B细胞中0.3nM修饰siRNA通过脂质体转染的实验结果

从表39得出，多条序列体外活性优于阳性参考或跟阳性参考活性相当。其中7061.9-13序列活性最好。我们选取表中活性比较好的序列，在AAV8-hANGPTL3小鼠体内进行活性评估。

表40：AAV8-hANGPTL3小鼠体内实验数据

以1mg/kg剂量进行体内活性筛选，实验结果见表40。第28天时，序列7061.9-13，7083.1-1的活性优于阳性参照ARO-ANG3。对序列7061进行进一步优化，同时检测7061相邻序列活性。

表41：人源化ANGPTL3小鼠原代肝细胞中1nM修饰siRNA通过L96递送的实验结果

对序列7061，在其修饰siRNA 7061.9-13的基础上做进一步优化，并在人源化ANGPTL3小鼠原代肝细胞中进行体外活性评价。从表41可以看出，7061不同修饰，活性差异很大。其中7061.4-16活性最高。我们还同时比较了与序列7061相邻区间序列7094.1-1，7095.1-1，7096.1-1的活性，可以看出在采用同样修饰的情况下，7061活性明显要优于其邻近序列。

我们进一步在人源化ANGPTL3小鼠原代肝细胞中，评估7061.18-14及7061.4-16的活性，结果见表42。

表42：人源化ANGPTL3小鼠原代肝细胞中1nM修饰siRNA通过L96递送的实验结果

从表42得出，7061.18-14和7061.4-16活性远高于阳性参考ARO-ANG3。

我们接下来检测7061和7083序列的安全性。实验结果见表43

表43：靶向ANGPTL3 siRNA安全性实验结果

siRNA	ALT(U/L)	AST(U/L)
			生理盐水	31	121
7061.1-11	38	133
			7083.9-2	484	639

从表43我们可以看出，7061.1-11在小鼠安全性很好，而7083.9-2对小鼠肝功能影响很大。

接下来，我们将在体内进行进一步活性评价。

实施例14在AAV8-hANGPTL3小鼠中对序列7061的优化siRNA进行活性评价

表44：对优选序列进行体内活性评测的结果

在AAV8-hANGPTL3小鼠中，1mg/kg剂量下，通过SL01递送，在体内对序列7061.4-16进行活性评测。通过表44可以看出，7061.4-16活性优于阳性参照。

通过以上单靶点的筛选，我们已经找到各自靶点比较好的序列，接下来，我们通过如下结构将活性比较好的单靶点序列连接成一个整体，使其可同时抑制2个基因的表达。

实施例15SL01-CPG的制备

化合物1a-1的制备：将(3R，5S)-5-(双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)吡咯烷-3-醇(10克，23.84毫摩尔，1.0当量)，12-甲氧基-12-氧代癸酸(5.8克，23.84毫摩尔，1.0当量)，N，N-二异丙基乙胺(12.3克，95.36毫摩尔，4.0当量)的二氯甲烷(100毫升)混合物在室温下搅拌2.0小时。混合物用碳酸钠溶液洗，水相用二氯甲烷萃取(50毫升x3)。有机相用饱和盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压除去溶剂。残留物用硅胶柱层析纯化(洗脱剂为：二氯甲烷/甲醇＝100/1到20/1)得到黄色油体产物1a-1(16.7克，收率：79.3％)。

化合物1a-2的制备：往化合物1a-1(16.7克，25.89毫摩尔，1.0当量)的四氢呋喃/甲醇/水(80毫升/16毫升/16毫升)混合物中加入氢氧化锂一水合物(3.1克，64.73毫摩尔，2.5当量)。混合物在40℃下反应4小时。反应液减压除去溶剂。残留物水溶液冻干。残留物用二氯甲烷溶解并过滤。滤液减压浓缩得到白色固体产物1a-2(14.3克，收率：85.3％)。LCMS(ESI)：m/z＝630[M-1]^-。

化合物1a-3的制备：往化合物(氮杂二基双(乙烷-2，1-二基))氨基甲酸叔丁酯(3.0克，9.9毫摩尔，1.0当量)和碳酸钠(1.57克，14.85毫摩尔，1.5当量)的四氢呋喃(20毫升)和水(10毫升)混合物中加入氯甲酸苄酯(2.03克，11.88毫摩尔，1.2当量)。混合物在室温下搅拌过夜。混合物用水(50毫升)稀释然后用乙酸乙酯(20毫升×3)萃取。合并的有机层用饱和食盐水(20毫升×1)洗涤，经无水硫酸钠干燥并浓缩。残余物在硅胶上进行柱色谱分离(石油醚∶乙酸乙酯＝3∶1)，得到白色固体产物1a-3(3.80克，收率：88％)。LCMS(ESI)：m/z＝438[M+1]^+.

化合物1a-4的制备：往化合物1a-3(3.74克，8.55毫摩尔，1.0当量)的甲醇(10毫升)混合物中加入氯化氢-二氧六环溶液(4摩尔每升，15毫升)。混合物在室温下搅拌1.5小时。减压下除去溶剂。残余物在真空下干燥得到白色固体产物1a-4(2.92克，粗品)。LCMS(ESI)：m/z＝238[M+1]⁺.

化合物1a-5的制备：-20℃下，往化合物(S)-4-(叔丁氧基)-3-((叔丁氧基羰基)氨基)-4-氧代丁酸(45克，155.54毫摩尔，1.0当量)和N-甲基吗啉(15.7克，155.54毫摩尔，1.0当量)的四氢呋喃(220毫升)混合物中逐滴加入氯甲酸异丁酯(20.17毫升，155.54毫摩尔，1.0当量)。混合物搅拌10分钟后，将混合物过滤。-30℃下，往滤液中缓慢加入硼氢化钠(11.8克，311.08毫摩尔，2.0当量)的水(70毫升)溶液。混合物升到0℃并搅拌0.5小时。混合物用水(200毫升)稀释然后用乙酸乙酯(100毫升×3)萃取。合并的有机层用饱和食盐水(100毫升×1)洗涤，经无水硫酸钠干燥并浓缩，得到无色油状物1a-5(43.67克，粗品)。LCMS(ESI)：m/z＝276[M+1]⁺.

化合物1a-6的制备：0℃下，往化合物1a-5(42.8克，155.54毫摩尔，1.0当量)和碳酸氢钠(39.2克，466.62毫摩尔，3.0当量)的二氯甲烷(300毫升)混合物中加入戴斯马丁试剂(79.2克，186.65毫摩尔，1.2当量)。混合物升到室温并搅拌2小时。混合物过滤。滤液在减压下浓缩。残余物用乙酸乙酯(200毫升)稀释，依次用饱和硫代硫酸钠溶液(100毫升×1)，饱和碳酸氢钠溶液(100毫升×1)和饱和食盐水(100毫升×1)洗涤，经无水硫酸钠干燥并浓缩，得到淡黄色油状物1a-6(40克，粗品)。LCMS(ESI)：m/z＝274[M+1]⁺.

化合物1a-7的制备：将苄胺(6.1克，57.01毫摩尔，1.0当量)，化合物1a-6(38克，139.2毫摩尔，2.44当量)和乙酸(3.26毫升，57.01毫摩尔，1.0当量)的甲醇(200毫升)混合物在室温下搅拌10分钟。混合物冷却到0℃，然后缓慢加入氰基硼氢化钠(12.53克，199.54毫摩尔，3.5当量)。混合物升到室温并搅拌过夜。减压下除去溶剂，残余物用水(150毫升)稀释。加入碳酸氢钠固体调节pH＝9，水层用乙酸乙酯(60毫升×3)萃取。合并的有机层用饱和食盐水(50毫升×1)洗涤，经无水硫酸钠干燥并浓缩。残余物在硅胶上进行柱色谱分离(石油醚∶乙酸乙酯＝50∶1至5∶1)，得到无色油状物1a-7(24.1克，收率：68％)。LCMS(ESI)：m/z622[M+1]⁺.

化合物1a-8的制备：0℃下，往化合物1a-7(27.5克，44.23毫摩尔，1.0当量)和N，N-二异丙基乙胺(1.54毫升，8.85毫摩尔，0.2当量)的乙腈(125毫升)混合物中逐滴加入1-氯乙基氯甲酸酯(7.16毫升，66.34毫摩尔，1.当量)。混合物升到室温并搅拌2小时。减压下除去溶剂。残余物用甲醇(20毫升)稀释。混合物加热到63℃搅拌1.5小时。减压下除去溶剂，残余物用二氯甲烷(150毫升)稀释。有机层用饱和碳酸氢钠溶液(30毫升×1)和饱和食盐水(50毫升×1)洗涤，经无水硫酸钠干燥并浓缩。残余物在硅胶上进行柱色谱分离(二氯甲烷∶甲醇＝200∶1至20∶1)，得到淡黄色油状物1a-8(11.5克，收率：49％)。LCMS(ESI)：m/z＝532[M+1]⁺.

化合物1a-9的制备：往化合物1a-8(4.3克，22.7毫摩尔，1.05当量)和3-(叔丁氧羰基)氨基)丙酸(4.3克，22.7毫摩尔，1.05当量)和N，N-二异丙基乙胺(5.58克，43.24毫摩尔，2.0当量)的二氯甲烷(70毫升)混合物中加入6-氯苯并三氮唑-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯(9.84克，23.78毫摩尔，1.1当量)。混合物在室温下搅拌2.5小时。减压下除去溶剂。残余物在硅胶上进行柱色谱分离(石油醚∶乙酸乙酯＝4∶1至2∶1)，得到淡黄色固体产物1a-9(14.98克，收率：99％)。LCMS(ESI)：m/z＝703[M+1]⁺.

化合物1a-10的制备：将化合物1a-9(14.9克，21.19毫摩尔，1.0当量)的氯化氢-二氧六环(4摩尔每升，90毫升)混合物室温下搅拌过夜。减压除去溶剂。残余物溶解在四氢呋喃(100毫升)和水(100毫升)中。加入碳酸钠(13.48克，127.14毫摩尔，6.0当量)和二叔丁基碳酸酯(24.36毫升，105.95毫摩尔，5.0当量)。混合物在室温下搅拌48小时。减压下除去四氢呋喃。残余物用水(200毫升)稀释，然后用二氯甲烷(60毫升×4)洗涤。向水层中加入2摩尔每升的稀盐酸溶液调节pH＝3，然后使用乙酸乙酯(60毫升×4)萃取。合并的有机层用饱和食盐水(50毫升×1)洗涤，经无水硫酸钠干燥并浓缩，得到淡黄色固体产物1a-10(10.5克，收率：84％)。LCMS(ESI)：m/z＝592[M+1]⁺.

化合物1a-11的制备：0℃下，30分钟内往6-氯苯并三氮唑-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯(6.58克，15.9毫摩尔，2.5当量)的二氯甲烷(570毫升)的混合物中逐滴加入化合物1a-10(3.76克，6.36毫摩尔，1.0当量)，化合物1a-4(1.97克，6.36毫摩尔，1.0当量)和N，N-二异丙基乙胺(4.92克，38.16毫摩尔，6.0当量)的二氯甲烷(60毫升)溶液。混合物升到室温并搅拌20分钟。减压下除去溶剂。残余物用饱和碳酸氢钠溶液(50毫升)稀释，然后用乙酸乙酯(30毫升×3)萃取。合并的有机层用饱和食盐水(50毫升×1)洗涤，经无水硫酸钠干燥并浓缩。残余物在硅胶上进行柱色谱分离(乙酸乙酯∶甲醇＝50∶1至30∶1)，得到白色固体产物1a-11(1.97克，收率：39％)。LCMS(ESI)：m/z＝792[M+1]⁺.

化合物1a-13的制备：将1a-11(1.97克，2.49毫摩尔，1.0当量)的氯化氢-二氧六环(4摩尔每升，13毫升)混合物在室温下搅拌1.5小时。减压除去溶剂。残余物用二氯甲烷(60毫升)稀释。加入化合物1a-12(3.34克，7.47毫摩尔，3.0当量)，N，N-二异丙基乙胺(2.57克，19.92毫摩尔，8.0当量)和2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸酯(3.03克，7.97毫摩尔，3.2当量)。混合物在室温下搅拌1.5小时。混合物用饱和碳酸氢钠溶液(30毫升×2)和饱和食盐水(30毫升×1)洗涤，经无水硫酸钠干燥并浓缩。残余物在硅胶上进行柱色谱分离(二氯甲烷∶甲醇＝30∶1，加1％三乙胺)，得到淡黄色固体产物1a-13(3.43克，收率：77％)。LCMS(ESI)：m/z＝1780[M+1]⁺.

化合物1a-14的制备：往化合物1a-13(3.47克，1.95毫摩尔，1.0当量)和三氟乙酸(0.15毫升，1.95毫摩尔，1.0当量)的异丙醇(50毫升)和乙醇(25毫升)混合物中加入氢氧化钯/碳(10％，0.69克)。混合物在氢气球压力下室温搅拌20小时。混合物过滤。滤液在减压下浓缩，得到白色固体产物1a-14(3.45克，粗品)。LCMS(ESI)：m/z＝1646[M+1]⁺.

化合物1a-15(化合物31)的制备：往化合物1a-14(1.0克，0.57毫摩尔，1.0当量)，化合物1a-2(0.396克，0.63毫摩尔，1.1当量)和N，N-二异丙基乙胺(0.441克，3.42毫摩尔，6.0当量)的二氯甲烷(15毫升)混合物中加入2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸酯(0.26克，0.68毫摩尔，1.2当量)。混合物在室温下搅拌2.5小时。减压下除去溶剂。残余物用制备高效液相色谱纯化(A:pH＝7的磷酸缓冲液，B:乙腈，30分钟内乙腈浓度50％-70％)，得到白色固体产物1a-15(化合物31)(0.45克，收率：35％)。LCMS(ESI)：m/z＝980[(M-302+2)/2]⁺.

化合物1a-16的制备：往化合物1a-15(130毫克，0.058毫摩尔，1.0当量)，三乙胺(70毫克，0.696毫摩尔，12.0当量)和4-二甲氨基吡啶(3.5毫克，0.029毫摩尔，0.5当量)的二氯甲烷(1毫升)混合物中加入丁二酸酐(34.5毫克，0.348毫摩尔，6.0当量)。混合物在室温下搅拌2天。混合物用二氯甲烷(10毫升)稀释，然后用饱和碳酸氢钠溶液(5毫升×2)和饱和食盐水(5毫升×1)洗涤，经无水硫酸钠干燥并浓缩，得到白色固体产物1a-16(111毫克，收率：81％)。LCMS(ESI)：m/z＝1030.5[(M-302)/2+H]^+.1H NMR(500MHz,DMSO)δ8.42–8.25(m,2H),8.06(t,J＝25.8Hz,2H),7.89–7.70(m,4H),7.30(dd,J＝14.4,6.9Hz,4H),7.20(dd,J＝10.1,6.9Hz,5H),6.93–6.84(m,4H),6.58(d,J＝5.9Hz,1H),5.76(s,1H),5.21(s,3H),4.97(d,J＝13.1Hz,3H),4.50(d,J＝8.2Hz,3H),4.20(s,3H),4.02(s,9H),3.87(dd,J＝18.8,9.5Hz,3H),3.80–3.63(m,11H),3.41(d,J＝8.7Hz,10H),3.24(s,2H),3.20–3.12(m,3H),3.03(dd,J＝26.7,13.8Hz,3H),2.47(d,J＝9.6Hz,3H),2.44–2.36(m,4H),2.31–2.18(m,5H),2.11(d,J＝10.6Hz,13H),2.07(s,2H),2.03(d,J＝7.3Hz,3H),1.99(s,9H),1.89(s,9H),1.77(s,12H),1.47(s,16H),1.25(s,11H).

化合物SL01-CPG的制备：往化合物1a-16(111毫克，0.047毫摩尔，1.0当量)和N，N-二异丙基乙胺(36毫克，0.282毫摩尔，6.0当量)的N，N-二甲基甲酰胺(5.5毫升)混合物中加入2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸酯(21毫克，0.056毫摩尔，1.2当量)和1-羟基苯并三唑(9毫克，0.066毫摩尔，1.4当量)。混合物在室温下振荡5分钟。加入CPG-NH₂(0.167毫摩尔/克，550毫克，0.092毫摩尔，1.95当量)，混合物在室温下振荡22小时。将混合物过滤，滤饼用二氯甲烷、乙腈、二氯甲烷洗涤并在真空下干燥1小时。残余物加入吡啶/乙酸酐(3毫升/1毫升)，室温下振荡3小时。将混合物过滤，滤饼用二氯甲烷、乙腈、二氯甲烷洗涤，并在真空下干燥1小时得到白色固体产物SL01-CPG(578毫克，载量：35微摩尔/克)。

实施例16中间体M的制备

向11-氨基十一烷酸(5克，24.8毫摩尔，1.0当量)和三乙胺(2.5克，24.8毫摩尔，1.0当量)的甲醇(50毫升)混合物中加入2，2，2-三氟乙酸乙酯(4.4克，31.0毫摩尔，1.25当量)。将混合物在室温下搅拌过夜。在真空下除去甲醇，残留物溶解在水中，并用1摩尔每升的盐酸溶液调节pH至1到2。用乙酸乙酯萃取，有机相用饱和食盐水洗，真空下浓缩得到黄色油状产物11-(2，2，2-三氟乙酰胺)十一烷酸(中间体M-1，6.16克，收率：83.4％)。LCMS(ESI)：m/z＝298[M+H]⁺.

向11-(2，2，2-三氟乙酰胺)十一烷酸(6.06克，20.4毫摩尔，1.0当量)，(3R，5S)-5-(双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)吡咯烷-3-醇(8.55克，20.4毫摩尔，1.0当量)和N，N-二异丙基乙胺(7.8克，61.2毫摩尔，3.0当量)的N，N-二甲基甲酰胺(60毫升)混合物中加入2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸酯(8.1克，21.4毫摩尔，1.05当量)。混合物在室温下搅拌1小时。混合物用水稀释并用乙酸乙酯萃取。有机相用饱和食盐水洗涤，在真空下浓缩。残留物通过硅胶柱纯化(洗脱液：石油醚/乙酸乙酯＝2/1～3/1，加0.5％三乙胺)得到白色固体的产物N-(11-((2S，4R)-2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-羟基吡咯烷-1-基)-11-氧代十一烷基)-2，2，2-三氟乙酰胺(中间体M-2，11.6克，产率：80.7％)。LCMS(ESI)：m/z＝699[M+H]⁺.

将N-(11-((2S，4R)-2-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-羟基吡咯烷-1-基)-11氧代十一烷基)-2，2，2-三氟乙酰胺(11.6克，16.5毫摩尔，1.0当量)和氢氧化钾(9.3克，165毫摩尔，10.0当量)的甲醇(110毫升)混合物在室温下搅拌过夜。混合物用水稀释并用乙酸乙酯萃取。有机相用饱和食盐水洗涤，在真空下浓缩。残留物通过硅胶柱(洗脱液：二氯甲烷/甲醇＝50/1，加0.5％三乙胺)纯化得到黄色油状产物中间体M(9.24克，产率：92.4％)。LCMS(ESI)：m/z＝603[M+H]⁺.实施例17DL07-CPG的制备

化合物2b-2的制备：将化合物2b-1(22.02克，50.00毫摩尔，1.0当量)，(2-氨基乙基)氨基甲酸苄酯(9.71克，50.00毫摩尔，1.0当量)，N，N-二异丙基乙胺(12.90克，10.00毫摩尔，2.0当量)和6-氯苯并三氮唑-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯(21.72克，52.50毫摩尔，1.05当量)的N，N-二甲基甲酰胺(250毫升)混合物室温下搅拌30分钟。混合物加水稀释然后过滤。滤饼用水洗涤。滤饼干燥得到白色固体产物2b-2(粗品)。LCMS(ESI)：m/z＝617[M+H]^+.1HNMR(500MHz,DMSO)δ7.87(t,J＝8.1Hz,3H),7.67(d,J＝6.9Hz,2H),7.42(d,J＝7.4Hz,2H),7.37–7.26(m,7H),7.19(d,J＝4.7Hz,2H),6.84(d,J＝7.2Hz,1H),5.00(s,2H),4.34–4.15(m,3H),3.90(d,J＝5.0Hz,1H),3.19–2.94(m,6H),1.78(d,J＝6.6Hz,1H),1.62(dd,J＝13.1,6.6Hz,1H),1.37(s,9H).

化合物2b-3的制备：将化合物2b-2(粗品)的哌啶/乙腈(50毫升/200毫升)混合物在室温下搅拌1小时。将混合物过滤，滤液浓缩，残余物经硅胶柱层析纯化(洗脱液：二氯甲烷至二氯甲烷/甲醇＝20/1)得到黄色固体产物2b-3(15.0克，收率：76.14％)。

LCMS(ESI)：m/z＝395[M+H]⁺.

化合物2b-4的制备：将化合物2b-3(7.80克，19.80毫摩尔，1.5当量)，(2-溴乙基)氨基甲酸叔丁酯(2.96克，13.20毫摩尔，1.0当量)和碳酸钾(3.64克，26.40毫摩尔，2.0当量)的N，N-二甲基甲酰胺(80毫升)混合物室温搅拌过夜。混合物加水稀释，用乙酸乙酯萃取。有机相用饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥并浓缩。残余物经硅胶柱层析纯化(洗脱液：二氯甲烷/甲醇＝100/1至50/1)得到无色油状产物2b-4(4.0克，收率：56.43％)。LCMS(ESI)：m/z＝538[M+H]^+.1H NMR(500MHz,DMSO)δ7.92(s,1H),7.42–7.28(m,5H),7.19(s,1H),6.93(d,J＝7.3Hz,1H),6.75(s,1H),5.01(s,2H),3.95(d,J＝5.4Hz,1H),3.14(ddd,J＝18.3,12.5,6.1Hz,2H),3.05(d,J＝5.5Hz,4H),2.68–2.56(m,4H),1.79(s,1H),1.72–1.60(m,1H),1.37(s,18H).

化合物2b-6的制备：将化合物2b-4(4.0克，7.45毫摩尔，1.0当量)，化合物2b-5(2.39克，7.08毫摩尔，0.95当量)，N，N-二异丙基乙胺(1.92克，14.90毫摩尔，2.0当量)和6-氯苯并三氮唑-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯(3.08克，7.45毫摩尔，1.0当量)的N，N-二甲基甲酰胺(50毫升)混合物在室温下搅拌1小时。混合物用水稀释，用乙酸乙酯萃取。有机相用饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥并浓缩。残余物经硅胶柱层析纯化(洗脱液：二氯甲烷/甲醇＝60/1)得到白色固体产物2b-6(4.4克，收率：72.52％)。LCMS(ESI)：m/z＝858[M+H]^+.1H NMR(500MHz,DMSO)δ7.88(d,J＝12.6Hz,1H),7.32(d,J＝22.7Hz,10H),7.26–7.13(m,2H),7.01–6.65(m,2H),5.25–5.03(m,2H),5.00(s,2H),4.10–3.96(m,1H),3.82(s,1H),3.17(d,J＝

43.7Hz,6H),3.03(d,J＝22.8Hz,4H),2.43–2.21(m,2H),2.03–1.86(m,1H),1.79(s,2H),1.63(s,1H),1.44–1.29(m,27H).

化合物2b-7的制备：将化合物2b-6(4.4克，5.13毫摩尔，1.0当量)的氯化氢-二氧六环(40毫升)溶液在室温下搅拌1小时。在真空下除去溶剂。残余物无需纯化直接用于下一步(粗品)。LCMS(ESI)：m/z＝557[M+H]⁺.

化合物2b-8的制备：将2b-7(粗品)，N，N-二异丙基乙胺(6.60克，51.16毫摩尔，10.0当量)，化合物1a-12(7.10克，15.87毫摩尔，3.1当量)和2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸酯(6.20克，16.31毫摩尔，3.2当量)的乙腈(70毫升)混合物在室温下搅拌1小时。混合物用水稀释，用乙酸乙酯萃取。有机相用饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥并浓缩。残留物经硅胶柱层析纯化(洗脱液：二氯甲烷/甲醇＝50/1至25/1)得到黄色固体产物2b-8(6.0克，收率：63.39％)。LCMS(ESI)：m/z＝923[M/2+H]⁺.

化合物2b-9的制备：在氢气氛围下，将化合物2b-8(6.0克，3.25毫摩尔，1.0当量)，氢氧化钯/碳(1.5克，25％质量分数)和三氟乙酸(371毫克，3.25毫摩尔，1.0当量)的乙醇(100毫升)混合物在室温下搅拌过夜。混合物通过硅藻土过滤。滤饼用乙醇洗涤，滤液浓缩。残留物无需纯化直接用于下一步(5.0克，收率：94.93％)。LCMS(ESI)：m/z＝811[M/2+H]⁺.

化合物2b-10的制备：在氮保护下，向6-叠氮基己酸(30克，190.8毫摩尔，1.0当量)和1-羟基吡咯烷-2，5-二酮(24克，210毫摩尔，1.1当量)的二氯甲烷/N，N-二甲基甲酰胺(270/30毫升)混合物中加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(40.2克，210毫摩尔，1.1当量)。混合物室温下搅拌过夜。在真空下除去二氯甲烷，加入1摩尔每升盐酸溶液和甲基叔丁基醚，分液，有机层用碳酸氢钠溶液和饱和食盐水洗涤。将有机相干燥并在真空下浓缩，得到黄色油状产物2b-10(46.8克，收率：96.8％)。LCMS(ESI)：m/z＝255[M+1]⁺.

化合物2b-11的制备：将化合物2b-9(5.0克，3.09毫摩尔，1.0当量)，化合物2b-10(824毫克，3.24毫摩尔，1.05当量)和N，N-二异丙基乙胺(1.19克，9.22毫摩尔，3.0当量)的乙腈(60毫升)混合物在室温下搅拌1小时。反应无需后处理直接进行下一步反应。LCMS(ESI)：m/z＝881[M/2+H]⁺.

化合物2b-12(化合物54)的制备：将化合物2b-11(粗品)，中间体M(2.04克，3.39毫摩尔，1.1当量)，N，N-二异丙基乙胺(796毫克，6.17毫摩尔，2.0当量)和6-氯苯并三氮唑-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯(1.4克，3.39毫摩尔，1.1当量)的乙腈(60毫升)混合物搅拌1小时。混合物直接使用高效液相色谱(色谱柱：UniSil 10-120C18，30×250mm)纯化，得到白色固体产物2b-12(化合物54)(3.1克，收率：42.79％)。LCMS(ESI)：m/z＝1022[(M-302)/2+H]^+.1HNMR(500MHz,DMSO)δ8.04–7.72(m,9H),7.30(dd,J＝17.9,8.1Hz,4H),7.23–7.10(m,5H),6.93–6.81(m,4H),5.76(s,1H),5.21(d,J＝2.3Hz,3H),5.02–4.83(m,4H),4.49(d,J＝8.2Hz,3H),4.15(s,3H),4.02(s,9H),3.87(q,J＝9.5Hz,3H),3.72(d,J＝12.9Hz,9H),3.41(s,3H),3.29(d,J＝6.8Hz,2H),3.07(ddd,J＝

23.5,22.3,17.2Hz,14H),2.22(dd,J＝22.2,15.1Hz,4H),2.11(d,J＝13.0Hz,13H),2.04(dd,J＝14.3,6.9Hz,5H),1.99(s,10H),1.89(s,9H),1.84(d,J＝13.3Hz,3H),1.77(s,9H),1.68(d,J＝35.4Hz,2H),1.50(dd,J＝14.8,7.4Hz,19H),1.35(s,3H),1.30–1.18(m,13H).

化合物2b-13的制备：将化合物2b-12(3.1克，1.32毫摩尔，1.0当量)，丁二酸酐(793毫克，7.93毫摩尔，6.0当量)，三乙胺(1.60克，15.84毫摩尔，12.0当量)和4-二甲氨基吡啶(16毫克，0.13毫摩尔，0.1当量)的二氯甲烷(25毫升)混合物在室温下搅拌6小时。混合物用10％的碳酸氢钠溶液和乙腈洗涤。将有机相浓缩得到浅紫色固体产物2b-13(3.4克，粗品)。LCMS(ESI)：m/z＝1072[(M-302)/2+H]⁺.

化合物DL07-CPG的制备：往化合物2b-13(300毫克，0.12毫摩尔，1.0当量)的N，N-二甲基甲酰胺溶液中加入2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸酯(56毫克，0.15毫摩尔，1.2当量)，1-羟基苯并三唑(23毫克，0.17毫摩尔，1.4当量)和N，N-二异丙基乙胺(63毫克，0.49毫摩尔，4.0当量)，混合物在室温下摇摆5分钟。往混合物中加入1.5克CPG-NH₂，在室温下振荡过夜。将混合物过滤，滤饼用二氯甲烷、乙腈、二氯甲烷洗涤并在真空下干燥1小时。残余物加入吡啶/乙酸酐(12毫升/4毫升)，室温下振荡3小时。将混合物过滤，滤饼用二氯甲烷、乙腈、二氯甲烷洗涤，并在真空下干燥1小时得到浅黄色固体产物DL07-CPG(1.61克，载量：41.1微摩尔/克)。

实施例18DL09-CPG的制备

化合物4a-2的制备：在氮保护下，将化合物4a-1(10克，62毫摩尔，1.0当量)，化合物2b-10(17克，68毫摩尔，1.1当量)和N，N-二异丙基乙胺(18克，136毫摩尔，2.2当量)的乙腈(100毫升)混合物在室温下搅拌过夜。在真空下除去乙腈，加入1摩尔每升的盐酸溶液和甲基叔丁基醚，分液，有机层用水和饱和食盐水洗涤。有机相干燥并在真空下浓缩得到黄色油状产物4a-2(18.5克，收率：99.4％)。LCMS(ESI)：m/z＝301[M+1]⁺.

化合物4a-3的制备：向化合物4a-2(18.5克，61.5毫摩尔，1.0当量)，3-(2-氨基乙氧基)丙酸叔丁酯(11.6克，61.5毫摩尔，1.0当量)和N，N-二异丙基乙胺(17.4克，135.2毫摩尔，2.0当量)的N，N-二甲基甲酰胺(180毫升)混合物中加入6-氯苯并三氮唑-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯(28克，67.6毫摩尔，1.1当量)。混合物在室温下搅拌1小时。混合物用水稀释并用乙酸乙酯提取。有机相用饱和食盐水洗涤，在真空下浓缩。残留物通过硅胶柱层析纯化(洗脱液：石油醚/乙酸乙酯＝2/1至二氯甲烷/甲醇＝20/1)，得到白色固体的产物4a-3(14.8克，收率：51.4％)。LCMS(ESI)：m/z＝472[M+1]⁺.

化合物4a-4的制备：将化合物4a-3(8.86克，20.7毫摩尔，1.0当量)的三氟乙酸/二氯甲烷(10/50毫升)混合物在室温下搅拌5.0小时。混合物在真空下浓缩得到黄色油状产物4a-4(8克，粗品)。LCMS(ESI)：m/z＝416[M+1]⁺.

化合物4a-5的制备：向化合物4a-4(8.86克，18.7毫摩尔，1.0当量)，(3R，5S)-5-(双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)吡咯烷-3-醇(7.8克，18.7毫摩尔，1.0当量)和N，N-二异丙基乙胺(9.6克，75毫摩尔，4.0当量)的N，N-二甲基甲酰胺(90毫升)混合物中加入6-氯苯并三氮唑-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯(8.1克，19.7毫摩尔，1.1当量)。混合物在室温下搅拌1小时。混合物用水稀释并用乙酸乙酯萃取。有机相用饱和食盐水洗涤，在真空下浓缩。残留物通过硅胶柱层析纯化(洗脱液：石油醚/二氯甲烷/甲醇＝50/50/1至30/30/1)，得到白色固体的产物4a-5(7.5克，收率：49％)。LCMS(ESI)：m/z＝817[M+1]⁺.

化合物4a-6的制备：将化合物4a-5(7.5克，9.19毫摩尔，1.0当量)和氢氧化锂一水合物(1.1克，27.5毫摩尔，3.0当量)的四氢呋喃/甲醇/水(60/30/30毫升)混合物在室温下搅拌过夜。混合物用水稀释并用甲基叔丁基醚洗涤。水相用二氯甲烷萃取。有机相在真空下浓缩得到浅白色固体产物4a-6(4.68克，收率：63.4％)LCMS(ESI)：m/z＝801[M-1]^-.

化合物4a-7(化合物53)的制备：往化合物1a-14(570毫克，0.32毫摩尔，1.0当量)，化合物4a-6(260毫克，0.32毫摩尔，1.0当量)和N，N-二异丙基乙胺(146毫克，1.13毫摩尔，3.5当量)的N，N-二甲基甲酰胺(2.5毫升)混合物中加入2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸酯(148毫克，0.39毫摩尔，1.2当量)。混合物在室温下搅拌过夜。混合物用制备高效液相色谱纯化(A:pH＝7的磷酸缓冲液，B:乙腈，30分钟内乙腈浓度30％-90％)，得到白色固体产物4a-7(化合物53)(245毫克，收率：31％)。LCMS(ESI)：m/z＝1065[(M-302+2)/2]⁺.

化合物4a-8的制备：往化合物4a-7(245毫克，0.10毫摩尔，1.0当量)，三乙胺(121毫克，1.2毫摩尔，12.0当量)和4-二甲氨基吡啶(12毫克，0.10毫摩尔，1.0当量)的二氯甲烷(2毫升)混合物中加入丁二酸酐(60.5毫克，0.60毫摩尔，6.0当量)。混合物在室温下搅拌20小时。混合物用二氯甲烷(10毫升)稀释，然后用饱和碳酸氢钠溶液(10毫升×2)和饱和食盐水(10毫升×1)洗涤，经无水硫酸钠干燥并浓缩，得到白色固体产物4a-8(275毫克，粗品)。LCMS(ESI)：m/z＝1115[(M-302+2)/2]⁺.

化合物DL09-CPG的制备：往化合物4a-8(253毫克，0.10毫摩尔，1.0当量)和N，N-二异丙基乙胺(77毫克，0.60毫摩尔，6.0当量)的N，N-二甲基甲酰胺(10毫升)混合物中加入2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸酯(57毫克，0.15毫摩尔，1.5当量)和1-羟基苯并三唑(20毫克，0.15毫摩尔，1.5当量)。混合物在室温下振荡5分钟。加入CPG-NH₂(0.167毫摩尔/克，1.27克，0.21毫摩尔，2.1当量)，混合物在室温下振荡22小时。将混合物过滤，滤饼用二氯甲烷、乙腈、二氯甲烷洗涤并在真空下干燥1小时。残余物加入吡啶/乙酸酐(12毫升/4毫升)，室温下振荡3小时。将混合物过滤，滤饼用二氯甲烷、乙腈、二氯甲烷洗涤，并在真空下干燥1小时得到白色固体DL09-CPG(1.36克，载量：30微摩尔/克)。

实施例19DL15-CPG的制备

化合物15a-1的制备：向化合物10a-5(6.0克，14.7摩尔，1.5当量)和(2-溴乙基)氨基甲酸叔丁酯(2.2克，9.8毫摩尔，1.0当量)在30毫升二甲基甲酰胺的混合物中于室温下加入碳酸钾(5.07克，36.75毫摩尔，2.5当量)，搅拌过夜。用乙酸乙酯稀释混合物，用水和饱和食盐水洗。有机相减压浓缩至干。残留物用硅胶柱层析纯化(洗脱剂为：二氯甲烷/甲醇＝30/1到10/1，加氨水)得到白色固体化合物15a-1(3.29克，收率：60.8％)。LCMS(ESI)：m/z＝552(M+H)⁺.

化合物15a-2的制备：将化合物15a-1(1.7克，3.08毫摩尔，1.0当量)，化合物10a-2(3.2克，9.97毫摩尔，3.2当量)，乙酸(185毫克，3.08毫摩尔，1.0当量)和氰基硼氢化钠(626毫克，9.97毫摩尔，3.2当量)加入到24毫升甲醇。混合物在室温搅拌96小时，减压浓缩，加入碳酸钠溶液，用乙酸乙酯萃取。有机相经过水和饱和食盐水洗，减压浓缩至干。残留物用硅胶柱层析纯化(洗脱剂为：二氯甲烷/甲醇＝40/1到10/1，加入氨水)得到白色固体化合物15a-2(1.72克，收率：54.0％)。LCMS(ESI)：m/z＝857.5(M+H)⁺.

化合物15a-3的制备：将化合物15a-2(1.72克，2.01毫摩尔，1.0当量)加入到20毫升4M氯化氢-二氧六环溶液。混合物在室温下搅拌1小时。混合物经减压浓缩，得到化合物15a-3(1.57克，粗品)。LCMS(ESI)：m/z＝557(M+H)⁺.

化合物15a-4的制备：将粗品化合物15a-3(1.57克，2.01毫摩尔，1.0当量)，化合物1a-12(2.87克，6.41摩尔，3.2当量)，二异丙基乙胺(2.58克，20.1毫摩尔，10.0当量)和2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸酯(2.87克，6.41毫摩尔，3.2当量)加入到35毫升乙腈，混合物在室温搅拌1小时。加入乙酸乙酯。有机相经过水和饱和食盐水洗，减压浓缩至干。残留物用硅胶柱层析纯化(洗脱剂为：二氯甲烷/甲醇＝40/1到15/1，加入三乙胺)得到白色固体化合物15a-4(2.01克，收率：54.1％)。LCMS(ESI)：m/z＝1845(M+H)⁺.

化合物15a-5的制备：将化合物15a-4(2.0克，1.08毫摩尔，1.0当量)溶解于45毫升乙醇，加入三氟乙酸(160毫克，1.41毫摩尔，1.3当量)和300毫克10％氢氧化钯/碳。混合物在氢气氛围下于室温搅拌过夜。混合物经硅藻土过滤，滤液经减压浓缩得到白色固体化合物15a-5(2.0克，粗品)。LCMS(ESI)：m/z＝1621(M+H)⁺.

化合物15a-6的制备：将化合物15a-5(2.0克，1.08毫摩尔，1.0当量)，二异丙基乙胺(418毫克，3.24毫摩尔，3.0当量)和化合物2b-10(307毫克，1.21毫摩尔，1.12当量)加入到15毫升乙腈，混合物在室温搅拌1.5小时。加入二异丙基乙胺(209毫克，1.62毫摩尔，1.5当量)，6-氯苯并三氮唑-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯(538毫克，1.30毫摩尔，1.2当量)和中间体M(783毫克，1.30毫摩尔，1.2当量)，混合物在室温搅拌1小时。加入乙酸乙酯。有机相经过水和饱和食盐水洗，减压浓缩至干。残留物用制备液相色谱纯化(洗脱剂为：pH7.0磷酸二氢钾-氢氧化钾缓冲溶液/乙腈)得到白色固体化合物15a-6(1.81克，收率：37.1％)。LCMS(ESI)：m/z＝1022((M-302)/2+H)⁺.

化合物15a-7的制备：在氮气保护下，将化合物15a-6(300毫克，0.128毫摩尔，1.0当量)，三乙胺(155毫克，1.54毫摩尔，12.0当量)，丁二酸酐(77毫克，0.768毫摩尔，6.0当量)和对二甲氨基吡啶(1.6毫克，0.013毫摩尔，0.1当量)加入到1.5毫升二氯甲烷，混合物在室温搅拌过夜。混合物用二氯甲烷/乙腈稀释，用10％碳酸氢钠溶液和饱和食盐水洗。有机相经过无水硫酸钠干燥，减压浓缩得到白色固体化合物15a-7(375毫克，粗品)。LCMS(ESI)：m/z＝1072((M-302)/2+H)⁺.

化合物DL15-CPG的制备：将化合物15a-7(375毫克，0.128毫摩尔，1.0当量)，2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸酯(68毫克，0.179毫摩尔，1.4当量)，1-羟基苯并三唑(28毫克，0.205毫摩尔，1.6当量)和二异丙基乙胺(76毫克，0.59毫摩尔，4.6当量)加入到13毫升二甲基甲酰胺，混合物在室温下搅拌5分钟。加入1.735克CPG-NH2，混合物在室温下振荡过夜。混合物过滤，用二氯甲烷和乙腈洗固相，减压干燥固相。加入10毫升吡啶和3.4毫升乙酸酐，混合物振荡3小时。过滤，用二氯甲烷和乙腈洗固相，减压干燥固相得到黄色固体化合物DL15-CPG(1.39克，37.5微摩尔/克)。

实施例20DL16-CPG的制备

化合物16a-1的制备：氮气保护，冰浴条件下向化合物2b-3(3.2克，8.1毫摩尔，1.0当量)和N，N-二异丙基乙胺(2.0克，16.2毫摩尔，2.0当量)的四氢呋喃(40毫升)混合物中滴加2，4-二硝基苯磺酰氯(2.6克，9.7毫摩尔，1.2当量)的四氢呋喃(10毫升)溶液。混合物冰浴下搅拌1小时。往混合物中加入乙酸乙酯，水洗，稀盐酸洗，碳酸氢钠水溶液洗，盐水洗，无水硫酸钠干燥，减压浓缩得到棕色固体16a-1(6.0克，粗品)。LCMS(ESI)：m/z＝582[M+H]⁺.

化合物16a-2的制备：将化合物16a-1(1克，1.6毫摩尔，1.0当量)，(叔丁氧羰基)-L-高丝氨酸苄酯(1.24克，4.0毫摩尔，2.5当量)和三苯基膦(1.26克，4.8毫摩尔，3.0当量)加入到30毫升甲苯中，在室温下搅拌5分钟。冰浴下滴加偶氮二甲酸二乙酯(0.835克，4.8毫摩尔，3.0当量)，混合物在室温下搅拌2小时。混合物过滤。残留物溶于30毫升二氯甲烷，加入30毫升石油醚。混合物室温搅拌1小时。混合物过滤。残留物用二氯甲烷/石油醚(1/1)洗。干燥得到黄色固体化合物16a-2(1.42克，收率：96.59％)。LCMS(ESI)：m/z＝916(M+H)⁺.

化合物16a-3的制备：将化合物16a-2(1.6克，1.75毫摩尔，1.0当量)和三乙胺(530毫克，5.25毫摩尔，3.0当量)加入至10毫升二氯甲烷中。加入2-巯基乙酸(322毫克，3.5毫摩尔，2.0当量)，混合物在室温搅拌10分钟。加入乙酸乙酯萃取。有机相经过碳酸钠水溶液和饱和食盐水洗。有迹象减压浓缩得到黄色油状化合物16a-3(1.2克，粗品)。LCMS(ESI)：m/z＝686(M+H)⁺.

化合物16a-4的制备：将化合物16a-3(1.2克，1.75毫摩尔，1.0当量)，3-(叔丁氧羰基)氨基)丙酸(331毫克，1.75毫摩尔，1.0当量)，二异丙基乙胺(451毫克，3.5毫摩尔，2.0当量)和2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸酯(798毫克，2.1毫摩尔，1.2当量)加入到30毫升二氯甲烷，混合物在室温搅拌1小时。加入乙酸乙酯萃取。有机相经过水和饱和食盐水洗，减压浓缩至干。残留物用硅胶柱层析纯化(洗脱剂为：二氯甲烷/甲醇＝25/1到10/1，加入三乙胺)得到白色固体化合物16a-4(740毫克，收率：49.33％)。LCMS(ESI)：m/z＝858(M+H)⁺.

化合物16a-5的制备：将化合物16a-4(740毫克，0.86毫摩尔，1.0当量)加入到5毫升4M氯化氢-二氧六环溶液。混合物在室温下搅拌1小时。混合物经减压浓缩，得到黄色固体化合物16a-5(482毫克，粗品)。LCMS(ESI)：m/z＝557(M+H)⁺.

化合物16a-6的制备：将化合物16a-5(482毫克，0.86毫摩尔，1.0当量)，化合物1a-12(1.2克，2.68毫摩尔，3.1当量)，二异丙基乙胺(1.12克，8.64毫摩尔，10.0当量)和2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸酯(1.05克，2.76毫摩尔，3.2当量)加入到10毫升乙腈，混合物在室温搅拌1小时。加入乙酸乙酯萃取。有机相经过水和饱和食盐水洗，减压浓缩至干。残留物用硅胶柱层析纯化(洗脱剂为：二氯甲烷/甲醇＝25/1到10/1，加入三乙胺)得到白色固体化合物16a-6(879毫克，收率：55.28％)。LCMS(ESI)：m/z＝1844(M+H)⁺.

化合物16a-7的制备：将化合物16a-6(879毫克，0.476毫摩尔，1.0当量)溶解于5毫升乙醇，加入三氟乙酸(54毫克，0.476毫摩尔，1.0当量)和88毫克10％氢氧化钯/碳。混合物在氢气氛围下于室温搅拌过夜。混合物经硅藻土过滤，滤液经减压浓缩得到白色固体化合物16a-7(800毫克，粗品)。LCMS(ESI)：m/z＝1621(M+H)⁺.

化合物16a-8(化合物65)的制备：将化合物16a-7(800毫克，0.476毫摩尔，1.0当量)，二异丙基乙胺(184毫克，1.428毫摩尔，3当量)和化合物2b-10(133毫克，0.523毫摩尔，1.1当量)加入到10毫升乙腈，混合物在室温搅拌1.5小时。加入二异丙基乙胺(184毫克，1.428毫摩尔，3当量)，6-氯苯并三氮唑-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯(236毫克，0.57毫摩尔，1.2当量)和中间体M(343毫克，0.57毫摩尔，1.2当量)，混合物在室温搅拌1小时。加入乙酸乙酯萃取。有机相经过水和饱和食盐水洗，减压浓缩至干。残留物用制备液相色谱纯化(洗脱剂为：pH7.0磷酸二氢钾-氢氧化钾缓冲溶液/乙腈)得到黄色固体化合物16a-8(343毫克，收率：30.90％)。LCMS(ESI)：m/z＝1022((M-302)/2+H)⁺.

化合物16a-9的制备：将化合物16a-8(343毫克，0.146毫摩尔，1.0当量)，三乙胺(177毫克，1.752毫摩尔，12.0当量)，丁二酸酐(88毫克，0.878毫摩尔，6.0当量)和对二甲氨基吡啶(2毫克，0.014毫摩尔，0.1当量)加入到5毫升二氯甲烷，混合物在室温搅拌过夜。混合物用二氯甲烷稀释，用10％碳酸氢钠溶液和饱和食盐水洗。有机相经过无水硫酸钠干燥，减压浓缩得到黄色固体化合物16a-9(396毫克，粗品)。LCMS(ESI)：m/z＝1072((M-302)/2+H)⁺.

化合物DL16-CPG的制备：将化合物16a-9(396毫克，0.162毫摩尔，1.0当量)，2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸酯(74毫克，0.194毫摩尔，1.2当量)，1-羟基苯并三唑(30毫克，0.226毫摩尔，1.4当量)和二异丙基乙胺(84毫克，0.648毫摩尔，4.0当量)加入到10毫升二甲基甲酰胺，混合物在室温下搅拌5分钟。加入1.58克CPG-NH2，混合物在室温下振荡过夜。混合物过滤，用二氯甲烷和乙腈洗固相，减压干燥固相。加入9毫升吡啶和3毫升乙酸酐，混合物振荡3小时。过滤，用二氯甲烷和乙腈洗固相，减压干燥固相得到黄色固体化合物DL16-CPG(1.68克，载量：45.7微摩尔/克)。

实施例21DL18-CPG的制备

化合物18a-2的制备：往化合物18a-1(4.0克，43.96毫摩尔，1.0当量)和碳酸钾(18.2克，131.88毫摩尔，3.0当量)在乙醇(40毫升)的混合物中加入溴化苄(13.1毫升，109.89毫摩尔，2.5当量)。混合物加热至回流反应3小时。减压下除去溶剂。残余物用水(60毫升)稀释然后用二氯甲烷(50毫升×2)萃取。合并的有机层用饱和食盐水(50毫升×1)洗涤，经无水硫酸钠干燥并浓缩。残余物在硅胶上进行柱色谱分离(二氯甲烷∶甲醇80∶1)，得到白色固体化合物18a-2(9.89克，收率：83％)。LCMS(ESI)：m/z272[M+1]⁺；TLC：Rf 0.5(二氯甲烷:甲醇酯＝50:1)。

化合物18a-3的制备：往化合物18a-2(6.7克，24.72毫摩尔，1.0当量)，溴乙酸叔丁酯(28.78克，147.55毫摩尔，6.0当量)和四丁基硫酸氢胺(1.26克，3.71毫摩尔，0.15当量)在水(50毫升)和甲苯(65毫升)的混合物中加入氢氧化钠(15克，375毫摩尔，15当量)。混合物加热至50℃反应40小时。混合物用水(50毫升)稀释然后用二氯甲烷(50毫升×2)萃取。合并的有机层用饱和食盐水(50毫升×1)洗涤，经无水硫酸钠干燥并浓缩。残余物在硅胶上进行柱色谱分离(石油醚∶乙酸乙酯50∶1)，得到无色油状化合物18a-3(3.61克，收率：29％)。LCMS(ESI)：m/z 500[M+1]⁺；TLC：Rf 0.5(石油醚:乙酸乙酯＝30:1)。

化合物18a-4的制备：将化合物18a-3(3.73克，7.46毫摩尔，1.0当量)的氯化氢-二氧六环(4M，20毫升，)的混合物在室温下搅拌过夜。减压除去溶剂。残余物用二氯甲烷(40毫升)稀释。加入氯化铵(2.39克，44.76毫摩尔，6.0当量)，N，N-二异丙基乙胺(7.7克，59.68毫摩尔，8.0当量)和2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯(8.51克，22.38毫摩尔，3.0当量)。混合物在室温下搅拌7小时。减压下除去溶剂。残余物用饱和碳酸钠溶液(50毫升)稀释，然后用乙酸乙酯(20毫升×3)萃取。合并的有机层用饱和盐水(30毫升×1)洗涤，经无水硫酸钠干燥并浓缩，得到淡黄色油状化合物18a-4(3.5克，粗品)。LCMS(ESI)：m/z 386[M+1]⁺；TLC：Rf 0.5(二氯甲烷:甲醇＝20:1)。

化合物18a-5的制备：往化合物18a-4(2.87克，7.46毫摩尔，1.0当量)在四氢呋喃(40毫升，)中的混合物中加入硼烷二甲硫醚络合物(10M，5.97毫升，，59.7毫摩尔，8.0当量)。混合物加热到65℃反应5小时。混合物用水(25毫升)淬灭。加入碳酸钠(2.37克，22.38毫摩尔，3.0当量)和二碳酸二叔丁酯(4.88克，22.38毫摩尔，3.0当量)。混合物在室温下搅拌3小时。混合物用水(50毫升)稀释，然后用乙酸乙酯(30毫升，×2)萃取。合并的有机层用饱和食盐水(30毫升×1)洗涤，经无水硫酸钠干燥并浓缩。残余物在硅胶上进行柱色谱分离(石油醚∶乙酸乙酯8∶1至3∶1)，得到淡黄色油状化合物18a-5(741毫克，收率：18％)。LCMS(ESI)：m/z 558[M+1]⁺；TLC：Rf 0.5(石油醚:乙酸乙酯＝5:1)。

化合物18a-6的制备：往化合物18a-5(741毫克，1.33毫摩尔，1.0当量)在甲醇(2毫升)的混合物中加入氯化氢-二氧六环溶液(4M，5毫升)。混合物在室温下搅拌1小时。减压下除去溶剂。残余物在真空下干燥得到白色固体粗品化合物18a-6。LCMS(ESI)：m/z 358[M+1]⁺；TLC：Rf 0.2(二氯甲烷:甲醇＝10:1)。

化合物18a-7的制备：0℃下，往6-氯苯并三氮唑-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯(1.38克，3.33毫摩尔，2.5当量)的二氯甲烷(85毫升)的混合物中30分钟内逐滴加入化合物1a-10(786毫克，1.33毫摩尔，1.0当量)，化合物18a-6(616毫克，1.33毫摩尔，1.0当量)和N，N-二异丙基乙胺(1.03克，7.98毫摩尔，6.0当量)的二氯甲烷(15毫升)溶液。混合物升到室温并搅拌20分钟。减压下除去溶剂。残余物用饱和碳酸钠溶液(30毫升)稀释，然后用乙酸乙酯(20毫升×3)萃取。合并的有机层用饱和盐水(20毫升×1)洗涤，经无水硫酸钠干燥并浓缩。残余物在硅胶上进行柱色谱分离(乙酸乙酯∶甲醇50∶1至30∶1)，得到白色固体化合物18a-7(0.42克，收率：35％)。LCMS(ES I)：m/z911[M+1]⁺；TLC：Rf 0.3(乙酸乙酯:二氯甲烷＝1:1)。

化合物18a-8的制备：化合物18a-7(0.42克，0.46毫摩尔，1.0当量)在氯化氢-二氧六环(4M，4毫升，)的混合物在室温下搅拌1小时。减压除去溶剂。残余物用二氯甲烷(10毫升)稀释。加入化合物1a-12(618毫克，1.38毫摩尔，3.0当量)，N，N-二异丙基乙胺(475毫克，3.68毫摩尔，8.0当量)和2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯(525毫克，1.38毫摩尔，3.0当量)。混合物在室温下搅拌1小时。混合物加二氯甲烷(20毫升)稀释，用饱和碳酸氢钠溶液(20毫升×2)和饱和食盐水(20毫升×1)洗涤，经无水硫酸钠干燥并浓缩。残余物在硅胶上进行柱色谱分离(二氯甲烷∶甲醇∶三乙胺30∶1∶0.3)，得到白色固体化合物18a-8(778毫克，收率：89％)。LCMS(ESI)：m/z1900[M+1]⁺；TLC：Rf 0.5(二氯甲烷:甲醇＝10:1)。

化合物18a-9的制备：往化合物18a-8(778毫克，0.409毫摩尔，1.0当量)和三氟乙酸(47毫克，0.409毫摩尔，1.0当量)在甲醇(10毫升)和乙醇(5毫升)的混合物中加入氢氧化钯/碳(10％，0.5g)。混合物在氢气球压力下室温搅拌过夜。混合物过滤。滤液在减压下浓缩，得到淡黄色固体化合物18a-9(600毫克，粗品)。LCMS(ESI)：m/z1720[M+1]⁺；TLC：Rf 0.3(二氯甲烷:甲醇＝10:1)。

化合物18a-10的制备：往化合物18a-9(600毫克，0.33毫摩尔，1.0当量)，化合物4a-6(265毫克，0.33毫摩尔，1.0当量)和N，N-二异丙基乙胺(255毫克，1.98毫摩尔，6.0当量)在N，N-二甲基甲酰胺(2毫升)的混合物中加入2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯(188毫克，0.495毫摩尔，1.5当量)。混合物在室温下搅拌0.5小时。混合物用制备液相色谱纯化(A:pH＝7的磷酸缓冲液，B:乙腈，30分钟内乙腈浓度30％-90％)，得到白色固体化合物18a-10(180毫克，收率：22％)。LCMS(ESI)：m/z1102[(M-302+2)/2]⁺；TLC：Rf 0.5(二氯甲烷:甲醇＝10:1)。

化合物18a-11的制备：往化合物18a-10(180毫克，0.072毫摩尔，1.0当量)，三乙胺(87毫克，0.862毫摩尔，12.0当量)和4-二甲氨基吡啶(4.4毫克，0.036毫摩尔，0.5当量)在二氯甲烷(2毫升)的混合物中加入丁二酸酐(43毫克，0.43毫摩尔，6.0当量)。混合物在室温下搅拌20小时。混合物用二氯甲烷(10毫升)稀释，然后用饱和碳酸氢钠溶液(10毫升×2)和饱和食盐水(10毫升×1)洗涤，经无水硫酸钠干燥并浓缩，得到白色固体化合物18a-11(155毫克，收率：83％)。LCMS(ESI)：m/z 1152[(M-302+2)/2]⁺；TLC：Rf 0.3(二氯甲烷:甲醇＝10:1)。

化合物DL18-CPG的制备：往化合物18a-11(155毫克，0.06毫摩尔，1.0当量)和N，N-二异丙基乙胺(46毫克，0.36毫摩尔，6.0当量)在N，N-二甲基甲酰胺(8毫升)的混合物中加入2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯(34毫克，0.09毫摩尔，1.5当量)和1-羟基苯并三唑(12毫克，0.09毫摩尔，1.5当量)。混合物在室温下搅拌5分钟。加入CPG-NH2(0.167毫摩尔/克，775毫克，0.13毫摩尔，2.2当量)。混合物在室温下搅拌过夜。混合物过滤。固体用二氯甲烷(8毫升×5)洗涤。加入吡啶(6毫升)和乙酸酐(2毫升)。混合物在室温下搅拌3小时。混合物过滤。固体用二氯甲烷(8毫升×5)洗涤，并在真空下干燥，得到白色固体化合物DL18-CPG(785毫克，21.5微摩尔/克，收率：29％)。

实施例22DL20-CPG的制备

化合物20a-1的制备：化合物二氨基甲酸二叔丁酯(5.0克，16.48毫摩尔，1.00当量)，2-溴乙酸乙酯(3.1克，18.13毫摩尔，1.1当量)，碳酸钾(4.5克，32.96毫摩尔，2.0当量)于N，N-二甲基甲酰胺(40毫升)中在常温下反应过夜。混合物用水稀释后用乙酸乙酯萃取。有机相用盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥并浓缩得到黄色油状产物20a-1(6.4克，粗品)。LCMS(ESI)：m/z＝390[M+H]⁺.

化合物20a-2的制备：将化合物20a-1(6.2克，15.94毫摩尔，1.0当量)，氢氧化锂一水合物(1.6克，39.85毫摩尔，2.5当量)的四氢呋喃+甲醇+水溶液(40毫升+10毫升+10毫升)在40℃下搅拌2.5小时。混合物加水，加2摩尔稀盐酸调节PH＝5，水相用乙酸乙酯萃取。有机相用盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥并浓缩得到化合物20a-2(5.1克，粗品)。LCMS(ESI)：m/z＝362[M+H]⁺。

化合物20a-3的制备：将化合物2b-2(13.6克，22.05毫摩尔，1.00当量)于三氟乙酸/二氯甲烷溶液(50毫升/100毫升)中在常温下反应1小时。混合物旋干。残留物加水调节PH至8。有机相用盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥并浓缩得到白色固体产物20a-3(6.1克，产率：53.6％)。LCMS(ESI)：m/z＝517[M+H]⁺.

化合物20a-4的制备：将化合物20a-2(4.3克，11.82毫摩尔，1.0当量)，化合物20a-3(6.1克，11.82毫摩尔，1.0当量)，2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸酯(5.4克，14.18毫摩尔，1.2当量)，二异丙基乙胺(3.1克，23.04毫摩尔，2.0当量)于N，N-二甲基甲酰胺(50毫升)中室温搅拌1小时。混合物用水稀释后用乙酸乙酯萃取。有机相用盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥并浓缩。残余物用二氯甲烷/石油醚＝1：1搅拌。混合物过滤得到黄色固体化合物20a-4(10克，crude)。LCMS(ESI)：m/z＝861[M+H]⁺.

化合物20a-5的制备：将化合物20a-4(9.5克，11.05毫摩尔，1.0当量)的二乙胺/乙腈(20/80毫升)溶液在室温下搅拌1小时。混合物用硅胶柱色谱(洗脱液：二氯甲烷到二氯甲烷/甲醇＝10/1)纯化得到黄色固体产物20a-5(5.1克，产率：72.5％)。LCMS(ESI)：m/z＝638[M+H]⁺。

化合物20a-6的制备：在0℃下，往(叔丁氧羰基)-L-高丝氨酸苄酯(2.3克，7.44毫摩尔，1.0当量)的四氢呋喃(30毫升)溶液中加入戴斯马丁试剂(4.7克，11.17毫摩尔，1.5当量)。混合物在常温下下搅拌2小时。混合物用饱和硫代硫酸钠溶液淬灭，再用乙酸乙酯萃取。有机相用盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥并浓缩得到黄色油状产物20a-6(3.5克，粗品)。LCMS(ESI)：m/z＝308[M+H]⁺。

化合物20a-7的制备：将化合物20a-5(3.65克，5.72毫摩尔，1.0当量)，化合物20a-6(1.8克，6.01毫摩尔，1.05当量)，醋酸(343毫克，5.72毫摩尔，1.0当量)的甲醇溶液(50毫升)在常温下搅拌30分钟。氰基硼氢化钠在0℃下加入。混合物在室温下搅拌1.5小时。混合物加水淬灭并用乙酸乙酯萃取。有机相用饱和碳酸钠溶液和盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥并浓缩。残余物经硅胶柱色谱(洗脱液：二氯甲烷到二氯甲烷/甲醇＝100/1到30/1)纯化，得到白色固体产物20a-7(2.65克，收率：49.9％)。LCMS(ESI)：m/z＝930[M+H]⁺。

化合物20a-8的制备：将化合20a-7(3克，3.23毫摩尔，1.0当量)，3-(叔丁氧羰基)氨基)丙酸(611毫克，3.23毫摩尔，1.0当量)，二异丙基乙胺(835毫克，6.46毫摩尔，2.0当量)和2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸酯(1.5毫克，3.88毫摩尔，1.2当量)加入到二氯甲烷(36毫升，)，混合物在室温搅拌1小时。混合物用水稀释后用乙酸乙酯萃取。有机相用盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥并浓缩。残留物用硅胶柱层析纯化(洗脱剂为：二氯甲烷/甲醇＝100/1到20/1，加入1％三乙胺)得到白色固体化合物20a-8(1.5克，收率：42.1％)。LCMS(ESI)：m/z＝1101[M+H]⁺.

化合物20a-9的制备：将化合物20a-8(1.5克，1.36毫摩尔，1.0当量)加入到20毫升4M氯化氢-二氧六环溶液。混合物在室温下搅拌1小时。混合物经减压浓缩，得到黄色固体产物20a-9(1.1克，粗品)。LCMS(ESI)：m/z＝700[M+H]⁺.

化合物20a-10的制备：将化合物20a-9(1.1克，1.27毫摩尔，1.0当量)，化合物1a-12(2.3克，5.21毫摩尔，4.1当量)，二异丙基乙胺(2克，15.24毫摩尔，12.0当量)和2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸酯(2克，5.33毫摩尔，4.2当量)加入到15毫升乙腈，混合物在室温搅拌1小时。混合物用水稀释后用乙酸乙酯萃取。有机相用盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥并浓缩。残留物用硅胶柱层析纯化(洗脱剂为：二氯甲烷/甲醇＝100/1到10/1，加入三乙胺)得到白色固体化合物DL20-8(1.8克，收率：58.6％)。LCMS(ESI)：m/z＝1209[M/2+H]⁺.

化合物20a-11的制备：将化合物20a-10(800毫克，0.331毫摩尔，1.0当量)溶解于8毫升乙醇，加入三氟乙酸(38毫克，0.331毫摩尔，1.0当量)和80毫克10％氢氧化钯/碳。混合物在氢气氛围下于室温搅拌两天。混合物过滤，滤液经减压浓缩得到白色固体化合物20a-11(890毫克，粗品)。LCMS(ESI)：m/z＝1097[M/2+H]⁺.

化合物20a-12的制备：将化合物20a-11(760毫克，0.346毫摩尔，1.0当量)，二异丙基乙胺(134毫克，1.038毫摩尔，3.0当量)和化合物2b-10(97毫克，0.381毫摩尔，1.1当量)加入到10毫升乙腈，混合物在室温搅拌1.5小时。加入二异丙基乙胺(134毫克，1.038毫摩尔，3.0当量)，6-氯苯并三氮唑-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯(171毫克，0.415毫摩尔，1.2当量)和中间体M(249毫克，0.415毫摩尔，1.2当量)，混合物在室温搅拌1小时。混合物减压除去溶剂。残留物用制备液相色谱纯化(洗脱剂为：pH7.0磷酸二氢钾-氢氧化钾缓冲溶液/乙腈)得到黄色固体化合物DL20-10(272毫克，收率：27.2％)。LCMS(ESI)：m/z＝1308[(M-302)/2+H]⁺.

化合物20a-13的制备：将化合物20a-12(172毫克，0.0589毫摩尔，1.0当量)，三乙胺(71毫克，0.707毫摩尔，12.0当量)，丁二酸酐(35毫克，0.354毫摩尔，6.0当量)和对二甲氨基吡啶(1毫克，0.00589mmo l，0.1当量)加入到1毫升二氯甲烷，混合物在室温搅拌过夜。混合物用二氯甲烷稀释，用10％碳酸氢钠溶液和饱和食盐水洗。有机相经过无水硫酸钠干燥，减压浓缩得到黄色固体化合物20a-13(167毫克，粗品)。LCMS(ESI)：m/z＝1358[(M-302)/2+H]+.

化合物DL20-CPG的制备：将化合物20a-13(167毫克，0.0554毫摩尔，1.0当量)，2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸酯(29毫克，0.0775毫摩尔，1.2当量)，1-羟基苯并三唑(12毫克，0.0886毫摩尔，1.6当量)和二异丙基乙胺(29毫克，0.222毫摩尔，4.0当量)加入到2毫升二甲基甲酰胺，混合物在室温下搅拌5分钟。加入501毫克CPG-NH2，混合物在室温下振荡过夜。混合物过滤，用二氯甲烷和乙腈洗固相，减压干燥固相。加入6毫升吡啶和2毫升乙酸酐，混合物振荡3小时。过滤，用二氯甲烷和乙腈洗固相，减压干燥固相得到黄色固体化合物DL20-CPG(532毫克，载量：28.6微摩尔/克)。

实施例23Q20-CPG的制备

化合物8a-2的制备：将化合物8a-1(2.72克，18.99毫摩尔，1.0当量)，4-羧酸哌啶甲酯(2.72克，18.99毫摩尔，1.0当量)，N，N-二异丙基乙胺(4.90克，37.98毫摩尔，2.0当量)和2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸酯(8.47克，22.28毫摩尔，1.2当量)的二氯甲烷(50毫升)混合物室温下搅拌30分钟。将混合物减压浓缩，残余物用水稀释并用乙酸乙酯萃取。有机相用饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥并浓缩得到黄色油状产物8a-2(12.7克，粗品)。LCMS(ESI)：m/z＝389[M+H]⁺.

化合物8a-3的制备：将化合物8a-2(粗品)的氯化氢-二氧六环(40毫升)溶液室温下搅拌1小时。在真空下除去溶剂。残余物无需纯化直接用于下一步(粗品)。LCMS(ESI)：m/z＝289[M+H]⁺.

化合物8a-4的制备：将化合物8a-3(粗品)，庚-6-炔酸(2.35克，18.69毫摩尔，1.0当量)，N，N-二异丙基乙胺(7.23克，56.06毫摩尔，3.0当量)和2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸酯(8.52克，22.42毫摩尔，1.2当量)的二氯甲烷(50毫升)混合物室温下搅拌30分钟。混合物减压浓缩，残余物用水稀释并用乙酸乙酯萃取。有机相用饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥并浓缩。残余物经硅胶柱色谱纯化(洗脱液：乙酸乙酯到二氯甲烷/甲醇＝20/1)，得到黄色油状产物8a-4(8.19克，粗品)。LCMS(ESI)：m/z＝397[M+H]⁺.

化合物8a-5的制备：将化合物8a-4(8.19克，18.69毫摩尔，1.0当量)和氢氧化钠(1.24克，30.94毫摩尔，1.5当量)的四氢呋喃/甲醇/水(20毫升/10毫升/10毫升)混合物在室温下搅拌1小时。混合物减压浓缩，用水稀释，用稀盐酸调pH＝3并用二氯甲烷萃取。有机相用无水硫酸钠干燥并浓缩得到黄色油状产物8a-5(6.0克，粗品)。LCMS(ESI)：m/z＝383[M+H]⁺.

化合物8a-6的制备：将化合物8a-5(1.1克，2.87毫摩尔，1.0当量)，化合物2a-6(1.22克，2.15毫摩尔，0.75当量)，N，N-二异丙基乙胺(1.11克，8.62毫摩尔，3.0当量)和2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸酯(1.31克，3.45毫摩尔，1.2当量)的N，N-二甲基甲酰胺(10毫升)混合物室温下搅拌1小时。混合物使用制备高效液相色谱纯化(A:pH＝7的磷酸缓冲液，B:乙腈，30分钟内乙腈浓度30％-90％)，得到白色固体产物8a-6(320毫克，收率：16％)。LCMS(ESI)：m/z＝627[(M-302)+H]⁺.

化合物8a-7的制备：将化合物8a-6(320毫克，0.34毫摩尔，1.0当量)，丁二酸酐(207毫克，2.07毫摩尔，6.0当量)，三乙胺(418毫克，4.14毫摩尔，12.0当量)和4-二甲氨基吡啶(5毫克，0.034毫摩尔，0.1当量)的二氯甲烷(5毫升)混合物室温下搅拌过夜。混合物用二氯甲烷稀释并用10％的碳酸氢钠溶液和饱和食盐水洗涤。有机相用无水硫酸钠干燥并真空浓缩，得到黄色固体产物8a-7(380毫克，粗品)。LCMS(ESI)：m/z＝727[(M-302)+H]^+.1HNMR(500MHz,MeOD)δ7.42–7.12(m,9H),6.93–6.71(m,4H),5.55–5.28(m,1H),4.40(dd,J＝44.2,7.2Hz,2H),4.32–4.16(m,3H),3.91–3.82(m,2H),3.77(s,6H),3.72–3.60(m,8H),3.54(td,J＝13.4,6.2Hz,6H),3.35(dd,J＝14.8,9.4Hz,4H),3.18–3.05(m,6H),3.02–2.82(m,1H),2.64–2.41(m,6H),2.39–2.24(m,1H),2.17(dtd,J＝17.2,12.8,5.6Hz,5H),1.81–1.60(m,5H),1.51(dt,J＝14.4,7.0Hz,3H).

化合物Q20-CPG的制备：向化合物8a-7(380毫克，0.37毫摩尔，1.0当量)的N，N-二甲基甲酰胺溶液(10毫升)中加入2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸酯(169毫克，0.44毫摩尔，1.2当量)，1-羟基苯并三唑(70毫克，0.52毫摩尔，1.4当量)和N，N-二异丙基乙胺(191毫克，1.48毫摩尔，4.0当量)，混合物在室温下振荡5分钟。然后向反应混合物中加入CPG-NH₂(1.9克)，在室温下振荡过夜。将混合物过滤，滤饼用二氯甲烷、乙腈、二氯甲烷洗涤并在真空下干燥1小时。残余物加入吡啶/乙酸酐(7.5毫升/2.5毫升)，在室温下振荡3小时。将混合物过滤，滤饼用二氯甲烷、乙腈、二氯甲烷洗涤，并在真空下干燥1小时得到浅黄色固体产物Q20-CPG(2.08克，载量：101微摩尔/克)。

实施例24双靶向siRNA的合成

1.用于双靶向siRNA偶联的两个siRNA正义链的合成

首先通过实施例1中固相寡核苷酸合成方法，将固相载体替换成DL07-CPG和Q20-CPG，分别合成含叠氮基团的DL07-siRNA-1-SS和含炔基的Q20-siRNA-2-SS；同时使用通用型CPG合成对应的反义链。

2.双靶向siRNA-SS链的合成

分别取一定量的DL07-siRNA-1-SS和Q20-siRNA-2-SS，将其分别溶于DEPC水中，按1：1.5的当量比混合，加入CuSO₄·5H₂O(45equiv.)，THPTA(225equiv.)，NaVc(205equiv.)，MgCl₂水溶液(100mM，50equiv.)，TEAA Buffer(2M，1000equiv.)和DMSO(1/2DEPC水体积)，室温过夜反应。LC-MS监测反应完全后，向反应液中加入反应液三倍体积的无水乙醇，1/3体积的3M NaCl溶液，充分震荡后置于-20℃约30min；4℃，15000rpm离心3min，吸去溶液后，再加入DEPC水溶解，检测浓度后，利用HPLC进行纯化，从而得到双靶向siRNA-SS链(siRNA-1-SS-DL07-Q20-siRNA-2-SS)。

3.双靶向siRNA的合成

将一定量的双靶向siRNA-SS(siRNA-1-SS-DL07-Q20-siRNA-2-SS)链溶于DEPC水中，向其中加入等当量的两条反义链siRNA-1-AS和siRNA-2-AS；95℃加热5mins，然后自然冷却至室温，从而得到双靶向siRNA(siRNA-1-DL07-Q20-siRNA-2)。

更换为其他linker和递送系统时，双靶向siRNA的合成可参照该实施例。

表45：双靶点序列及递送系统结构信息

上表中所列双靶向siRNA连接配体的结构示意如下：

实施例25AAV8-hAGT/hPCSK9小鼠原代肝细胞中评估不同结构递送的双靶向siRNA对AGT及PCSK9表达影响

表46：AAV8-hAGT/hPCSK9小鼠原代肝细胞中不同浓度下双靶向siRNA不同递送方式的实验结果

通过实验可知，所有的双靶向siRNA活性都比通过混合方式的两个独立阳性参考活性高很多。同时我们发现，不同的递送系统对两个靶点的活性影响也不同，其中采用DL07-Q20、DL09-Q20及DL20-Q20递送的siRNA活性最好，远高于阳性参考1000PM混合11000PM。我们接下来测试活性好的双靶点结构DT03081在AAV8-hAGT/hPCSK9小鼠原代肝细胞中对两个靶点敲降的IC50值。

表47：DT03081在AAV8-hAGT/hPCSK9小鼠原代肝细胞中的IC50实验结果

通过表47可知，DT03081对AGT靶点及PCSK9靶点的抑制IC50都达到了44pM左右，活性极高。同时对两个靶点抑制活性相当，意味着DT03081在体内可以同步持久的抑制两个靶点的表达。

对AGT和PCSK9靶点优选序列的一些其他组合，在采用同一递送系统下，在体外进行了活性评测，结果如下。

表48：AAV8-hAGT/hPCSK9小鼠原代肝细胞中不同浓度下双靶向siRNA不同递送方式的实验结果

可以从数据看出，多个优选序列组合的双靶向siRNA活性都要优于阳性参考1000PM混合11000PM

实施例26在同时表达hAGT和hPCSK9的小鼠中评估不同双靶点序列对hAGT及hPCSK9蛋白表达水平影响

实验方法：

1.腺病毒整合hAGT/hPCSK9

通过1.5x10¹¹滴度超纯化重组AAV8-hAGT及1.5x10¹¹滴度超纯化重组AAV8-hPCSK9病毒颗粒共同感染小鼠，获得稳定表达hAGT/hPCSK9的转基因小鼠。

2.实验分组给药

小鼠注射病毒14天后，颌下静脉取血，室温静置30分钟，1000×g离心10分钟，取上清血清，分装冻存于-80度冰箱。血清样品稀释1000倍，通过Human Angiotensinogen/AGT/SerpinA8 ELISA Kit(联科生物，货号：EK1202–96)及Human PCSK9 ELISA Kitproteintech(Cat No:KE00278)分别检测小鼠血清中hAGT及hPCSK9的表达。以hAGT及hPCSK9的表达量为基准，将小鼠平均分组，每组4只。siRNA用生理盐水溶解，浓度调整为10uM，小鼠按60nmol/kg或180nmol/kg剂量皮下注射siRNA溶液。

3.ELISA检测

siRNA注射后，每隔一周颌下静脉取少量血，室温静置30分钟，1000×g离心10分钟，取上清血清，稀释1000倍后ELISA检测hPCSK9表达量。

实验结果见表及图1

表49：60nmol/kg剂量下AAV8-hAGT/hPCSK9小鼠中AGT/PCSK9双靶向siRNADT03081对两个靶点的抑制效果

从表49及图1和图2中我们可以看到，在60nmol/kg的给药剂量下，DT03081对AGT靶点及PCSK9靶点的体内敲降效果都很好，且远远好于Zilebesiran混合Inclisiran的药效。且从两个阳性药物混合给药持续时间我们可以看出，1000PM在第56天时抑制率还有50％左右，而11000PM在第27天时对PCSK9的抑制率就已恢复至50％左右，两序列对靶点的抑制左右持续时间不一致。而通过序列优选及递送结构优化得到的DT03081在两个靶点中的抑制水平随时间变化基本趋势一致，因此临床上对于给药时间和频率更具有可控性。

表50：不同剂量下AAV8-hAGT/hPCSK9小鼠中AGT/PCSK9双靶向siRNA对两个靶点的抑制效果

我们进一步比较了我们优选序列组成双靶点后的活性，从数据中可以看出，DT03081、DT03082、DT03085及DT03086活性相当。

对其他优选序列组合成双靶点后的活性，在60nmol/kg给药剂量下也进行了比较。

实验方法：

1.腺病毒整合hAGT/hPCSK9

通过1.5x10¹¹滴度超纯化重组AAV8-hAGT病毒颗粒感染人源化PCSK9小鼠，获得稳定表达hAGT/hPCSK9的转基因小鼠。

2.实验分组给药

小鼠注射病毒14天后，颌下静脉取血，室温静置30分钟，1000×g离心10分钟，取上清血清，分装冻存于-80度冰箱。血清样品稀释1000倍，通过Human Angiotensinogen/AGT/SerpinA8 ELISA Kit(联科生物，货号：EK1202–96)及Human PCSK9 ELISA Kitproteintech(Cat No:KE00278)分别检测小鼠血清中hAGT及hPCSK9的表达。以hAGT及hPCSK9的表达量为基准，将小鼠平均分组，每组4只。siRNA用生理盐水溶解，浓度调整为10uM，小鼠按60nmol/kg剂量皮下注射siRNA溶液。

3.ELISA检测

siRNA注射后，每隔一周颌下静脉取少量血，室温静置30分钟，1000×g离心10分钟，取上清血清，稀释1000倍后ELISA检测hPCSK9表达量。

实验结果见表。

表51：60nmol/kg剂量下感染AAV8 hAGT病毒的人源化PCSK9小鼠中AGT/PCSK9双靶向siRNA对两个靶点的抑制效果

从数据可以看出，多个双靶向siRNA活性与DT03081相当或略优。实施例27在同时表达hAGT和hANGPTL3的小鼠中评估不同双靶点序列对肝中hAGT及hANGPTL3表达影响

实验方法：

1.腺病毒整合hAGT和hANGPTL3

通过1x10¹¹滴度超纯化重组AAV8 hAGT和1x10¹¹滴度超纯化重组AAV8 hANGPTL3病毒颗粒感染小鼠，获得同时稳定表达hAGT和hANGPTL3的转基因小鼠。100ul病毒加入5.9mLPBS中，每只小鼠静脉注射200ul病毒稀释液。

2.给药

小鼠注射病毒14天后，将小鼠平均分组，每组4只。siRNA用生理盐水溶解，皮下注射，给药剂量60nmol/kg。

3.取肝检测

siRNA注射后不同时间点取肝，通过TRI REAGENT(MRC，货号：TR118)提取肝组织中的RNA，用PrimeScript RT regent Kit(Takara，货号：RR047A)将提取的RNA反转录为cDNA。配好的QPCR体系加入到96孔PCR板中，封板膜封板，在StepOnePlus的实时PCR系统(applied biosystems)上进行QPCR，检测hAGT和hANGPTL3表达量。

表52：60nmol/kg剂量下AAV8-hAGT/hANGPTL3小鼠中AGT/ANGPTL3双靶向siRNA对两个靶点的抑制效果

将AGT靶点优选序列1167.25-19，1167.27-21，1165.5-16，1161.7-17与ANGPTL3靶点优选序列7061.18-14，7061.4-16进行组合，得到AGT/ANGPTL3双靶向siRNA DT02042，DT02043，DT02047，DT02058和DT02059，在体内与阳性参考序列一起进行活性评测。从表52可以看出，不同序列组合活性差异很大，活性最好的序列是DT02043，其两个靶点活性都远优于阳性参考1000PM混合ARO-ANG3，而活性最差的双靶向siRNA DT02042活性比阳性参考差。进一步比较DT02043和DT02047可知，虽然2个双靶点siRNA中靶向ANGPTL3部分都采用7061.4-16序列，但由于连接的靶向AGT的序列不同，导致靶向ANGPTL3的活性差异很大。

实施例28在同时表达hANGPTL3和hPCSK9的小鼠中评估不同双靶点序列对hANGPTL3及hPCSK9表达水平影响

实验方法：

1.腺病毒整合hANGPTL3/hPCSK9

通过1.5x10¹¹滴度超纯化重组AAV8-hANGPTL3及1.5x10¹¹滴度超纯化重组AAV8-hPCSK9病毒颗粒共同感染小鼠，获得稳定表达hANGPTL3/hPCSK9的转基因小鼠。

2.实验分组给药

小鼠注射病毒14天后，颌下静脉取血，室温静置30分钟，1000×g离心10分钟，取上清血清，分装冻存于-80度冰箱。血清样品稀释1000倍，通过Human PCSK9 ELISAKitproteintech(Cat No:KE00278)检测小鼠血清中hPCSK9的表达。以hPCSK9的表达量为基准，将小鼠平均分组，每组4只。siRNA用生理盐水溶解，浓度调整为10uM，小鼠按60nmol/kg剂量皮下注射siRNA溶液。

3.ELISA检测

siRNA注射后，每隔一周颌下静脉取少量血，室温静置30分钟，1000×g离心10分钟，取上清血清，稀释1000倍后ELISA检测hPCSK9表达量。

4.取肝检测

siRNA注射后不同时间点取肝，通过TRI REAGENT(MRC，货号：TR118)提取肝组织中的RNA，用PrimeScript RT regent Kit(Takara，货号：RR047A)将提取的RNA反转录为cDNA。配好的QPCR体系加入到96孔PCR板中，封板膜封板，在StepOnePlus的实时PCR系统(applied biosystems)上进行QPCR，检测hPCSK9和hANGPTL3表达量。

表53：60nmol/kg剂量下AAV8-hPCSK9/hANGPTL3小鼠中PCSK9/ANGPTL3双靶向siRNA对两个靶点的抑制效果

将ANGPTL3靶向序列7061优选siRNA 7061.4-16，7061.18-14与PCSK9靶向序列11040.10-23，11002.17-21进行组合，得到ANGPTL3/PCSK9双靶向siRNA DT09001，DT09003和DT09005，并在AAV8-hANGPTL3/hPCSK9小鼠中进行活性评价。于不同时间点取血和肝，分别通过ELISA和QPCR检测PCSK9和ANGPTL3表达水平。从数据可以看出DT09001及DT09005对两个靶点的敲降活性最好。在该实验中我们同样发现，即使双靶点siRNADT09003和DT09005都采用11002.17-21序列靶向PCSK9，但由于连接的靶向ANGPTL3的序列不同，导致靶向PCSK9的活性差异很大。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (31)

1.双靶向siRNA剂，其特征在于，所述双靶向siRNA剂包括靶向两种不同基因的两种不同的siRNA或其药学上可接受的盐，所述两种不同的siRNA或其盐通过与用于递送核酸的配体连接而成为一个整体，每种所述siRNA为正义链和反义链构成的dsRNA，所述两种不同基因选自血管紧张素原(angiotensinogen，AGT)、前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶9(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9，PCSK9)以及血管生成素样蛋白3(angiopoietin-like 3，ANGPTL3)中的两种；

其中，靶向血管紧张素原基因的siRNA的碱基组成选自以下任一种dsRNA序列：

A)1167f：其正义链如SEQ ID NO：59所示，其反义链如SEQ ID NO：60所示；

B)1167b：其正义链如SEQ ID NO：51所示，其反义链如SEQ ID NO：52所示；

C)1165d：其正义链如SEQ ID NO：39所示，其反义链如SEQ ID NO：40所示；

D)1165f：其正义链如SEQ ID NO：43所示，其反义链如SEQ ID NO：44所示；

其中，靶向前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶9基因的siRNA的碱基组成选自以下任一种dsRNA序列：

E)11040a：其正义链如SEQ ID NO：375所示，其反义链如SEQ ID NO：376所示；

F)11002d：其正义链如SEQ ID NO：259所示，其反义链如SEQ ID NO：260所示；

G)11002a：其正义链如SEQ ID NO：253所示，其反义链如SEQ ID NO：254所示；

其中，靶向血管生成素样蛋白3的siRNA的碱基组成选自以下任一种dsRNA序列：

H)7061f：其正义链如含SEQ ID NO：579所示，其反义链如SEQ ID NO：580所示；

I)7061b，其正义链如SEQ ID NO：571所示，其反义链如SEQ ID NO：572所示。

2.根据权利要求1所述双靶向siRNA剂，其特征在于，其靶向的两种基因为AGT和选自PCSK9和ANGPTL3中的任一种。

3.根据权利要求1所述的双靶向siRNA剂，其特征在于，所述靶向血管紧张素原基因的siRNA经过修饰，选自以下序列中的一种：

b)1167.27-21：其5’-3’正义链为Invab*mG*mCmCmGmAmCmCmAfGfCfUfUmGfUmUmUmGmUmGmAmAInvab，其5’-3’反义链为VPU-S*fU*mCmAmCmAmAmAmCmAmAdGmCfUmGfGmUmCmG*mG*mC；

c)1165.5-14：其5’-3’正义链为Invab*mG*mAmGmAmAmCfCfAfGfUmGfUmUmUmAmGmCmGmAInvab，其5’-3’反义链为VPU-S*fC*mGmCmUmAmAmAmCmAmCdTmGfGmUfUmCmUmU*mG*mG；

其中，VPU-S为2’-S-甲基尿苷-5’-(E)-乙烯基磷酸-3’-磷酸酯，mA为2’-O-甲基腺苷-3’-磷酸酯，mU为2’-O-甲基尿苷-3’-磷酸酯，mC为2’-O-甲基胞苷-3’-磷酸酯，mG为2’-O-甲基鸟苷-3’-磷酸酯，fA为2’-氟代腺苷-3’-磷酸酯，fU为2’-氟代尿苷-3’-磷酸酯，fC为2’-氟代胞苷-3’-磷酸酯，fG为2’-氟代鸟苷-3’-磷酸酯，dA为2’-脱氧腺苷-3’-磷酸酯，dT为2’-脱氧胸苷-3’-磷酸酯，dC为2’-脱氧胞苷-3’-磷酸酯，dG为2’-脱氧鸟苷-3’-磷酸酯，Invab为反向无碱基残基，*为硫代磷酸酯键。

4.根据权利要求3所述的双靶向siRNA剂，其特征在于，靶向前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶9基因的siRNA经过修饰，选自以下序列中的一种：

f)11002.17-21，其5’-3’正义链为Invab*mG*mCmAmGmCmCfAfAfCfUmUfUmUmCmUmAmGmAmAInvab，其5’-3’反义链为VPU-S*fU*mCmUmAmGmAmAmAmAmGdTmUfGmGfCmUmGmU*mG*mG；

g)11002.10-23，其5’-3’正义链为Invab*mC*mUmAmCmAmGmCmCfAfAfCfUmUfUmUmCmUmAmGmAmAInvab，其5’-3’反义链为VPU-S*fU*mCmUmAmGmAmAmAmAmGdTmUfGmGfCmUmGmU*mA*mG；

其中，VPU-S为2’-S-甲基尿苷-5’-(E)-乙烯基磷酸-3’-磷酸酯，mA为2’-O-甲基腺苷-3’-磷酸酯，mU为2’-O-甲基尿苷-3’-磷酸酯，mC为2’-O-甲基胞苷-3’-磷酸酯，mG为2’-O-甲基鸟苷-3’-磷酸酯，fA为2’-氟代腺苷-3’-磷酸酯，fU为2’-氟代尿苷-3’-磷酸酯，fC为2’-氟代胞苷-3’-磷酸酯，fG为2’-氟代鸟苷-3’-磷酸酯，dA为2’-脱氧腺苷-3’-磷酸酯，dT为2’-脱氧胸苷-3’-磷酸酯，dC为2’-脱氧胞苷-3’-磷酸酯，dG为2’-脱氧鸟苷-3’-磷酸酯，Invab为反向无碱基残基，*为硫代磷酸酯键。

5.根据权利要求3所述的双靶向siRNA剂，其特征在于，所述靶向血管生成素样蛋白3基因的siRNA经过修饰，所述siRNA选自以下序列中的一种：

h)7061.18-14：其5’-3’正义链为Invab*mU*mAmCmUmUmGfAfAfCfUmCfAmAmCmUmCmAmAmAInvab，其5’-3’反义链为VPU-S*fU*mUmGmAmGmUmUmGmAmGdTmUfCmAfAmGmUmG*mG*mG；

i)7061.4-16：其5’-3’正义链为Invab*mG*mCmCmAmCmUmUmGfAfAfCfUmCfAmAmCmUmCmAmAmAInvab，其5’-3’反义链为VPU-S*fU*mUmGmAmGmUmUmGmAmGdTmUfCmAfAmGmUmG*mG*mC；

其中，VPU-S为2’-S-甲基尿苷-5’-(E)-乙烯基磷酸-3’-磷酸酯，mA为2’-O-甲基腺苷-3’-磷酸酯，mU为2’-O-甲基尿苷-3’-磷酸酯，mC为2’-O-甲基胞苷-3’-磷酸酯，mG为2’-O-甲基鸟苷-3’-磷酸酯，fA为2’-氟代腺苷-3’-磷酸酯，fU为2’-氟代尿苷-3’-磷酸酯，fC为2’-氟代胞苷-3’-磷酸酯，fG为2’-氟代鸟苷-3’-磷酸酯，dA为2’-脱氧腺苷-3’-磷酸酯，dT为2’-脱氧胸苷-3’-磷酸酯，dC为2’-脱氧胞苷-3’-磷酸酯，dG为2’-脱氧鸟苷-3’-磷酸酯，Invab为反向无碱基残基，*为硫代磷酸酯键。

6.根据权利要求4所述的双靶向siRNA剂，其特征在于，靶向AGT和PCSK9基因时，所述双靶向的siRNA剂的每种siRNA选自表45中的DT03103，DT03099，DT03085，DT03101，DT03082，DT03097，DT03100或DT03102中的任一种双靶向的siRNA。

7.根据权利要求5所述的双靶向siRNA剂，其特征在于，靶向AGT和ANGPTL3基因时，所述双靶向siRNA剂的每种siRNA选自表45中的DT02043或DT02047中的任一种。

8.根据权利要求1所述的双靶向siRNA剂，其特征在于，靶向ANGPTL3和PCSK9基因时，所述双靶向siRNA剂的每种siRNA选自表45中的DT09001，DT09003和DT09005中的任一种。

9.根据权利要求1-3任一项所述的双靶向siRNA剂，其特征在于，所述药学上可接受的盐为钠盐或钾盐。

10.根据权利要求1-3任一项所述的双靶向siRNA剂，其特征在于，所述配体为N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)或其衍生物。

11.根据权利要求10所述的双靶向siRNA剂，其特征在于，所述N-乙酰基半乳糖胺衍生物与两种siRNA的正义链的3'端通过化学键分别连接，优选地，化学键分别是磷酸酯键或者硫代磷酸酯键。

12.根据权利要求11所述的双靶向siRNA剂，其特征在于，所述N-乙酰基半乳糖胺衍生物具有如下结构，其与每种siRNA的正义链的3'端连接方式如下：

其中表示靶向AGT基因、PCSK9基因或ANGPTL3基因的修饰序列的siRNA。

13.权利要求1-12任一项所述的双靶向siRNA剂在制备用于同时抑制细胞中AGT、PCSK9以及ANGPTL3任意两个靶基因表达的产品中的应用，优选地，所述产品为生物制剂或者药物制剂。

14.一种用于同时抑制AGT、PCSK9以及ANGPTL3中任意组合的两个靶基因表达的生物制剂或者药物制剂，其特征在于，其活性成分包括权利要求1-12任一项所述的双靶向siRNA剂。

15.权利要求1-12任一项所述的双靶向siRNA剂在制备预防和/或治疗与高血压和/或脂质失调相关疾病的药物中的应用，其特征在于，所述高血压是由AGT基因介导的，所述脂质失调相关疾病是由PCSK9基因介导的或ANGPTL3基因介导。

16.根据权利要求15所述应用，其特征在于，所述高血压为临界性高血压、原发性高血压、继发性高血压、孤立性收缩期或舒张期高血压、妊娠高血压、糖尿病性高血压、顽固性高血压、阵发性高血压、肾血管性高血压、肺动脉高压、门静脉高压中的任一种。

17.根据权利要求15所述应用，其特征在于，所述脂质失调相关疾病是由PCSK9基因介导的，选自高脂血症、动脉粥样硬化、非酒精性脂肪性肝炎、非酒精性脂肪性肝病。

18.根据权利要求15所述应用，其特征在于，所述脂质失调相关疾病是由ANGPTL3基因介导的，选自高脂血症、高甘油三酯血症、脂质和/或胆固醇代谢异常、纯合子和杂合子家族性高胆固醇血症、他汀类药物抵抗性高胆固醇血症、心脏代谢疾病、肥胖、动脉粥样硬化、II型糖尿病、心血管疾病、冠状动脉疾病、非酒精性脂肪性肝炎、非酒精性脂肪性肝病、高甘油三酯血症引起的胰腺炎中的任一种。

19.一种同时抑制体内或体外细胞中AGT、PCSK9以及ANGPTL3中任意两个靶基因表达的方法，其特征在于，所述方法包括：

(a)将体内或体外细胞与权利要求1-12任一项所述的双靶向siRNA剂或权利要求15所述的生物制剂或者药物制剂接触；和

(b)将步骤(a)中产生的细胞维持足以获得AGT、PCSK9以及ANGPTL3中任意两个靶基因表达的mRNA转录本的降解的时间，从而同时抑制细胞中AGT、PCSK9以及ANGPTL3任意两个靶基因在细胞中的表达。

20.一种治疗患有AGT和/或PCSK9和/或ANGPTL3相关病症的方法，其特征在于，包含对该受验者给药治疗有效量的权利要求1-12任一项所述的双靶向siRNA剂或权利要求15所述的生物制剂或者药物制剂，从而治疗该受验者。

21.一种靶向AGT基因的siRNA或其药学上可接受的盐，其特征在于，其序列选自以下一种：

A)1167f：其正义链如SEQ ID NO：59所示，其反义链如SEQ ID NO：60所示；

B)1167b：其正义链如SEQ ID NO：51所示，其反义链如SEQ ID NO：52所示；

C)1165d：其正义链如SEQ ID NO：39所示，其反义链如SEQ ID NO：40所示；

D)1165f，其正义链如SEQ ID NO：43所示，其反义链如SEQ ID NO：44所示。

22.根据权利要求21所述的靶向AGT基因的siRNA或其药学上可接受的盐，其中，所述siRNA经过修饰，选自以下序列中的一种：

a)1167.25-19：其5’-3’正义链为Invab*mU*mGmAmCmCmAfGfCfUfUmGfUmUmUmGmUmGmAmAInvab，并且5’-3反义链为VPU-S*fU*mCmAmCmAmAmAmCmAmAdGmCfUmGfGmUmCmG*mG*mG；

b)1167.27-21：其5’-3’正义链为Invab*mG*mCmCmGmAmCmCmAfGfCfUfUmGfUmUmUmGmUmGmAmAInvab，其5’-3’反义链为VPU-S*fU*mCmAmCmAmAmAmCmAmAdGmCfUmGfGmUmCmG*mG*mC；

c)1165.5-14：其5’-3’正义链为Invab*mG*mAmGmAmAmCfCfAfGfUmGfUmUmUmAmGmCmGmAInvab，其5’-3’反义链为VPU-S*fC*mGmCmUmAmAmAmCmAmCdTmGfGmUfUmCmUmU*mG*mG；

d)1165.5-16：其5’-3’正义链为Invab*mC*mCmAmAmGmAmAmCfCfAfGfUmGfUmUmUmAmGmCmGmAInvab，其5’-3’反义链为VPU-S*fC*mGmCmUmAmAmAmCmAmCdTmGfGmUfUmCmUmU*mG*mG；

其中，VPU-S为2’-S-甲基尿苷-5’-(E)-乙烯基磷酸-3’-磷酸酯，mA为2’-O-甲基腺苷-3’-磷酸酯，mU为2’-O-甲基尿苷-3’-磷酸酯，mC为2’-O-甲基胞苷-3’-磷酸酯，mG为2’-O-甲基鸟苷-3’-磷酸酯，fA为2’-氟代腺苷-3’-磷酸酯，fU为2’-氟代尿苷-3’-磷酸酯，fC为2’-氟代胞苷-3’-磷酸酯，fG为2’-氟代鸟苷-3’-磷酸酯，dA为2’-脱氧腺苷-3’-磷酸酯，dT为2’-脱氧胸苷-3’-磷酸酯，dC为2’-脱氧胞苷-3’-磷酸酯，dG为2’-脱氧鸟苷-3’-磷酸酯，Invab为反向无碱基残基，*为硫代磷酸酯键。

23.一种靶向PCSK9基因的siRNA或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述siRNA选自以下序列中的一种：

E)11040a：其正义链如SEQ ID NO：375所示，其反义链如SEQ ID NO：376所示；

F)11002d：其正义链如SEQ ID NO：259所示，其反义链如SEQ ID NO：260所示；

G)11002a：其正义链如SEQ ID NO：253所示，其反义链如SEQ ID NO：254所示。

24.根据权利要求23所述靶向PCSK9基因的siRNA或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述siRNA经过修饰，选自以下序列中的一种：

e)11040.10-23，其5’-3’正义链为Invab*mC*mUmUmAmUmUmCmUfGfGfGfUmUfUmUmGmUmAmGmCmAInvab，其5’-3’反义链为VPU-S*fG*mCmUmAmCmAmAmAmAmCdCmCfAmGfAmAmUmA*mA*mG；

f)11002.17-21，其5’-3’正义链为Invab*mG*mCmAmGmCmCfAfAfCfUmUfUmUmCmUmAmGmAmAInvab，其5’-3’反义链为VPU-S*fU*mCmUmAmGmAmAmAmAmGdTmUfGmGfCmUmGmU*mG*mG；

g)11002.10-23，其5’-3’正义链为Invab*mC*mUmAmCmAmGmCmCfAfAfCfUmUfUmUmCmUmAmGmAmAInvab，其5’-3’反义链为VPU-S*fU*mCmUmAmGmAmAmAmAmGdTmUfGmGfCmUmGmU*mA*mG；

其中，VPU-S为2’-S-甲基尿苷-5’-(E)-乙烯基磷酸-3’-磷酸酯，mA为2’-O-甲基腺苷-3’-磷酸酯，mU为2’-O-甲基尿苷-3’-磷酸酯，mC为2’-O-甲基胞苷-3’-磷酸酯，mG为2’-O-甲基鸟苷-3’-磷酸酯，fA为2’-氟代腺苷-3’-磷酸酯，fU为2’-氟代尿苷-3’-磷酸酯，fC为2’-氟代胞苷-3’-磷酸酯，fG为2’-氟代鸟苷-3’-磷酸酯，dA为2’-脱氧腺苷-3’-磷酸酯，dT为2’-脱氧胸苷-3’-磷酸酯，dC为2’-脱氧胞苷-3’-磷酸酯，dG为2’-脱氧鸟苷-3’-磷酸酯，Invab为反向无碱基残基，*为硫代磷酸酯键。

25.一种靶向ANGPTL3基因的siRNA或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述siRNA经过修饰，选自以下序列中的一种：

H)7061f：其正义链如SEQ ID NO：579所示，其反义链如SEQ ID NO：580所示；

I)7061b，其正义链如SEQ ID NO：571所示，其反义链如SEQ ID NO：572所示。

26.根据权利要求25所述靶向ANGPTL3基因的siRNA或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述siRNA经过修饰，选自以下序列中的一种：

h)7061.18-14：其5’-3’正义链为Invab*mU*mAmCmUmUmGfAfAfCfUmCfAmAmCmUmCmAmAmAInvab，其5’-3’反义链为VPU-S*fU*mUmGmAmGmUmUmGmAmGdTmUfCmAfAmGmUmG*mG*mG；

i)7061.4-16：其5’-3’正义链为Invab*mG*mCmCmAmCmUmUmGfAfAfCfUmCfAmAmCmUmCmAmAmAInvab，其5’-3’反义链为VPU-S*fU*mUmGmAmGmUmUmGmAmGdTmUfCmAfAmGmUmG*mG*mC；

其中，VPU-S为2’-S-甲基尿苷-5’-(E)-乙烯基磷酸-3’-磷酸酯，mA为2’-O-甲基腺苷-3’-磷酸酯，mU为2’-O-甲基尿苷-3’-磷酸酯，mC为2’-O-甲基胞苷-3’-磷酸酯，mG为2’-O-甲基鸟苷-3’-磷酸酯，fA为2’-氟代腺苷-3’-磷酸酯，fU为2’-氟代尿苷-3’-磷酸酯，fC为2’-氟代胞苷-3’-磷酸酯，fG为2’-氟代鸟苷-3’-磷酸酯，dA为2’-脱氧腺苷-3’-磷酸酯，dT为2’-脱氧胸苷-3’-磷酸酯，dC为2’-脱氧胞苷-3’-磷酸酯，dG为2’-脱氧鸟苷-3’-磷酸酯，Invab为反向无碱基残基，*为硫代磷酸酯键。

27.一种靶向AGT的siRNA剂，其特征在于，所述siRNA剂由权利要求21-22任一项所述的siRNA或其药学上可接受的盐与用于递送核酸的配体连接而成。

28.一种靶向PCSK9的siRNA剂，其特征在于，所述siRNA剂由权利要求23-24任一项所述的siRNA或其药学上可接受的盐与用于递送核酸的配体连接而成。

29.一种靶向ANGPTL3的siRNA剂，其特征在于，所述siRNA剂由权利要求25-26任一项所述的siRNA或其药学上可接受的盐与用于递送核酸的配体连接而成。

30.根据权利要求27-29任一项所述的siRNA剂，其特征在于，所述配体是N-乙酰基半乳糖胺或其衍生物，优选地，其配体的结构式如下：

31.根据权利要求30所述的siRNA剂，其特征在于，所述配体通过化学键与正义链的3'端连接，优选地，化学键分别是磷酸酯键或者硫代磷酸酯键，其连接方式如下：

其中表示靶向AGT基因、PCSK9基因或ANGPTL3基因的修饰序列的siRNA。