CN120966800A - 氨肽酶突变体及其编码基因、重组载体、重组菌株以及它们的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及酶工程领域，公开了氨肽酶突变体及其编码基因、重组载体、重组菌株以及它们的应用，所述氨肽酶突变体为将氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的酶进行S88L、Y150C和Q268F中至少一种的突变。本发明的氨肽酶突变体可在β‑丙氨酸甲酯存在下，高选择性催化L‑组氨酸合成L‑肌肽，并具有较高的L‑肌肽产率和较低的杂质含量，具有工业化应用的价值。

Description

氨肽酶突变体及其编码基因、重组载体、重组菌株以及它们的 应用

技术领域

本发明涉及酶工程领域，具体涉及一种氨肽酶突变体、一种编码氨肽酶突变体的基因，一种重组载体，一种重组菌株，所述氨肽酶突变体、基因、重组载体、重组菌株中的至少一种在合成L-肌肽中的应用，以及一种L-肌肽合成的方法。

背景技术

L-肌肽又名β-丙氨酰-L-组氨酸，是由β-丙氨酸和L-组氨酸两种氨基酸缩合得到的二肽，是生物体内存在的一种天然抗氧化剂。肌肽作为一种天然二肽，在哺乳动物的肌肉和脑中大量存在。在生物体内，肌肽具有pH缓冲，抗氧化、抗自由基以及抗衰老等作用。在临床上，应用于减轻视觉疲劳、治疗白内障；含锌肌肽可用于治疗胃溃疡。与其他抗氧化剂相比，L-肌肽具有抗氧化能力强、无毒副作用的优点，并有多种生理活性，在医药、保健、卫生、美容等领域有广泛的应用前景。

L-肌肽的生产有多种方法。由于肌肽在动物肌肉中含量较高，早期直接从动物组织中进行肌肽的提取，这种方式产量低，纯度差，早已被淘汰。传统的化学合成法中，要对L-组氨酸和β-丙氨酸的活性基团分别进行活化和保护，并在随后的缩合反应之后消除保护基团，这种方法虽收率高，但整个合成过程反应步骤多，并且需要水合肼等剧毒制剂，而L-肌肽产品中不允许有肼的残留，因此对产品的提取、精制有很高的要求。已有多种酶法合成方法报道，包括二肽水解酶催化的β-丙氨酸和L-组氨酸的逆水解合成、氨肽酶催化的β-丙氨酰胺/丙氨酸酯与L-组氨酸之间的酰基转移反应合成以及肌肽合成酶催化的ATP供能的β-丙氨酸与L-组氨酸缩合反应合成。其中二肽水解酶催化的反应受反应平衡的限制，需要投加高浓度β-丙氨酸进行反应，L-组氨酸的转化率最高仅有30%左右。而肌肽合成酶催化的反应依赖ATP，存在成本问题。与上述这两类酶促反应相比，氨肽酶催化反应不需要投加高浓度组氨酸，不依赖ATP，反应步骤少，更适合于工业应用。

尽管如此，目前报道的氨肽酶活性低，副产物多，产物分离纯化复杂，严重限制了该方法的实际应用，因此有必要开发具有高活性和高选择性的氨肽酶。

发明内容

本发明的目的是为了提供具有高活性和高选择性的氨肽酶，具体提供了一种氨肽酶及其编码基因、重组载体、重组菌株以及它们的应用，该氨肽酶可在β-丙氨酸甲酯存在下，高选择性催化L-组氨酸合成L-肌肽，并具有较高的产率，具有工业化应用的价值。

为了实现上述目的，本发明第一方面提供一种氨肽酶突变体，所述氨肽酶突变体为将氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示的酶进行S88L、Y150C和Q268F中至少一种的突变。

优选地，所述氨肽酶突变体为SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列、SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列或SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列。

本发明第二方面提供一种编码氨肽酶突变体的基因，所述编码氨肽酶突变体的基因包含编码如上所述的氨肽酶突变体的核苷酸序列。

优选地，编码氨肽酶突变体的基因为核苷酸序列如SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 8所示的基因。

本发明第三方面提供一种重组载体，所述重组载体含有如上所述的基因。

本发明第四方面提供一种重组菌株，所述重组菌株含有如上所述的基因或者如上所述的重组载体。

本发明第五方面提供如上所述的氨肽酶突变体、如上所述的基因、如上所述的重组载体、如上所述的重组菌株中的至少一种在合成L-肌肽中的应用。

本发明第六方面提供一种L-肌肽合成的方法，该方法包括在β-丙氨酸甲酯或其盐和如上所述的氨肽酶突变体存在下催化L-组氨酸合成L-肌肽。

本发明的氨肽酶突变体可在β-丙氨酸甲酯存在下，高选择性催化L-组氨酸合成L-肌肽，并具有较高的L-肌肽产率和较低的杂质含量，具有工业化应用的价值。

具体实施方式

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

本发明第一方面提供一种氨肽酶突变体，所述氨肽酶突变体为将氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示的酶进行S88L、Y150C和Q268F中至少一种的突变。

SEQ ID NO: 1所示的酶为Gryganskiella cystojenkinii来源的氨肽酶。S88L意味着SEQ ID NO: 1所示酶的第88位氨基酸，由原本的丝氨酸（Serine，缩写S）突变为亮氨酸（Leucine，缩写L）；Y150C意味着SEQ ID NO: 1所示酶的第150位氨基酸，由原本的酪氨酸（Tyrosine，缩写Y）突变为半胱氨酸（Cysteine，缩写C）；Q268F意味着SEQ ID NO: 1所示酶的第268位氨基酸，由原本的谷氨酰胺（Glutamine，缩写Q）突变为苯丙氨酸（Phenylalanine，缩写F）。

S88L、Y150C和Q268F中至少一种的突变意味着所述突变体可以包含S88L、Y150C和Q268F中某一位点的突变，也可以是两个或三个位点同时突变。

在一些实施例中，所述氨肽酶突变体包含SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列、SEQID NO: 3所示的氨基酸序列或SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列。发明人研究发现，在该优选的实施方式下，突变体酶的活性更高，催化L-组氨酸合成L-肌肽的效率进一步提高。

本发明中，所述突变体可以制成相应的酶制剂，具体地，酶制剂可以以固体、半固体或液体形式存在。

本发明第二方面提供一种编码氨肽酶突变体的基因，所述编码氨肽酶突变体的基因包含编码如上所述的氨肽酶突变体的核苷酸序列。

本发明提供的核苷酸序列通常可以用聚合酶链式反应(PCR)扩增法、重组法、或人工合成的方法获得。一旦获得了有关核苷酸序列，就可以用重组法大批量的获得有关氨基酸序列。通常将所得核苷酸序列克隆入载体，再转入基因工程菌中，然后通过常规的方法从增殖后的宿主细胞分离得到有关核苷酸序列。此外，还可用公知的人工化学合成的方法来合成有关核苷酸序列。

优选地，编码氨肽酶突变体的基因包含核苷酸序列如SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO: 8所示的基因。其中，SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO: 8中的末端TAA编码终止子。

本发明第三方面提供一种重组载体，所述重组载体含有如上所述的基因。

本发明中的重组载体由所述核苷酸序列插入到表达载体的多克隆位点构建而成，表达载体通常指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。

所述表达载体可以为本领域常用质粒，比如可以为pET系列质粒，在一些实施例中，所述表达载体包括但不限于pET22b质粒、pET-29a质粒、pET-21a质粒、pET-50a质粒等。

本发明第四方面提供一种重组菌株，所述重组菌株含有如上所述的基因或者如上所述的重组载体。

本发明中的重组菌株含有如上所述的重组载体或基因组内整合有如上所述的基因。重组菌株可以是原核细胞，如细菌细胞（比如大肠杆菌E.coliDH5α）；或低等真核细胞，如酵母细胞；或高等真核细胞，如植物细胞。

本发明中，可以通过本领域常规的方法将所述重组载体转化、转导或者转染到宿主细胞(菌株)中，如氯化钙法化学转化、高压电击转化。

本发明第五方面提供如上所述的氨肽酶突变体、如上所述的基因、如上所述的重组载体、如上所述的重组菌株中的至少一种在合成L-肌肽中的应用。

本发明第六方面提供一种L-肌肽合成的方法，该方法包括在β-丙氨酸甲酯或其盐（比如可以为β-丙氨酸甲酯盐酸盐）和如上所述的氨肽酶突变体存在下催化L-组氨酸合成L-肌肽。

在一些实施方式中，催化体系中，β-丙氨酸甲酯或其盐的含量为50-200g/L，比如可以为 50g/L、80g/L、120g/L、150g/L、180g/L、200g/L，或上述数值中任意两个组成的范围，L-组氨酸的含量为40-80 mmol/L，比如可以为40 mmol/L、50mmol/L、60 mmol/L、70mmol/L、80 mmol/L，或上述数值中任意两个组成的范围。此次的含量以催化体系的总体积为基准。发明人研究发现，在该优选浓度下，既避免了低浓度下组氨酸不足导致的催化反应速率受限问题，也防止了高浓度下组氨酸对突变酶活性可能产生的抑制，进一步保障突变体持续高效催化L-组氨酸合成L-肌肽。

可以理解的是，所述催化体系包括β-丙氨酸甲酯或其盐、L-组氨酸、氨肽酶突变体和水。

在一些实施方式中，所述催化的条件包括：pH 为 7-10，比如可以为 7、8、9、10，或上述数值中任意两个组成的范围；温度为 20-50℃，比如可以为 20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃，或上述数值中任意两个组成的范围。

在一些实施方式中，β-丙氨酸甲酯或其盐和/或L-组氨酸以分批加入的方式加入催化体系中。本领域技术人员可以根据实际情况进行调整。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。如果没有特殊说明，所有操作可以按照本领域常规的方式进行。

以下实施例中，pET-29a质粒购自生工生物工程（上海）股份有限公司；大肠杆菌E.coliDH5α和BL21（DE3）购自泰坦科技股份有限公司。

其余原料和试剂均为常规市售品。

LB液体培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaC1 10g/L，pH调节至6.5，在高压下蒸汽灭菌21min，备用。

LB固体培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCL10g/L，琼脂15g/L，pH调节至7.0，在高压下蒸汽灭菌21min，备用。

实施例1

本实施例用于说明氨肽酶的挖掘与改造。

发明人通过文献调研、NCBI酶基因挖掘和多序列比对，选出了合成肌肽的氨肽酶，来源于Gryganskiella cystojenkinii，命名为WT，野生型氨肽酶可能会存在催化效率低等问题，因此发明人又基于结构模拟和分子对接，挑选了活性口袋附近的热点以及一些空间距离活性位点较近的氨基酸，最终筛选出可能提高其选择性和催化活性的三种突变体：S88L、Y150C、Q268F分别命名为M1、M2、M3。

野生型和三种突变体氨基酸序列分别为SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ IDNO: 3、SEQ ID NO: 4，其分别对应的核苷酸序列为SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ IDNO: 7、SEQ ID NO: 8，序列如表1所示。

表1 氨肽酶的氨基酸序列和核苷酸序列

注：*表示终止子。

实施例2

本实施例用于说明野生型氨肽酶及其突变体工程菌的构建。

2.1 野生型氨肽酶及其突变体载体构建

野生型的氨肽酶序列由江苏赛索飞生物科技有限公司合成，合成的氨肽酶基因分别连接到pET-29a的NdeI和HindIII的酶切位点中间，pET-29a由本实验室保藏。为了构建M1/M2/M3的表达载体，以带有野生型氨肽酶序列的质粒为模板，在突变位点设计引物进行反向PCR，将扩增得到的PCR产物经Dpn I过夜消化后于80℃灭活20 min，转至E.coliDH5α感受态细胞中，加入LB液体培养基培养50 min，涂布于含有100 μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上，37℃倒置过夜培养，挑取单克隆外送至测序公司进行测序验证，用SnapGene软件分析测序结果，确定突变位点氨基酸正确突变，即得到含有氨肽酶突变位点的重组载体。

2.2野生型氨肽酶及其突变体表达宿主菌的构建与表达

为获得表达野生型氨肽酶及其突变体的工程菌，将4个重组质粒转化到BL21（DE3）感受态细胞中，加入LB液体培养基培养50 min，涂布于含有100 μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上，37℃倒置过夜培养。生长的单菌落即为野生型的氨肽酶及其突变体的工程菌。

将各工程菌划线于LB固体平板上37℃培养12h后挑单菌落接种至含100 μg/mL卡那霉素的5ml LB液体培养基中，37℃震荡培养12h。按1％(v/v)接种量转接至100ml同样含100 μg/mL卡那霉素的新鲜LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD₆₀₀达到0.6左右时，加入终浓度为0.1 mmol/L的IPTG，25℃诱导培养20h。培养结束后，将培养液12000rpm离心10min，弃上清液，收集菌体。该菌体即为表达野生型氨肽酶及突变体蛋白的菌体。

实施例3：野生型及其突变体催化反应

3.1 氨肽酶蛋白的获取

将诱导表达收集的菌体用0 .1M，pH8 .5的Tris-HCl缓冲液清洗两次，得静息细胞，再将所得细胞用0 .1M，pH8.5的Tris-HCl缓冲液重悬，冰浴超声破碎，高速离心收集上清液，0.22μm滤膜过滤，即得含有氨肽酶的粗酶液。

3.2 催化反应验证

在含有野生型和突变体的粗酶液中，加入组氨酸，使其终浓度为60 mmol/L，搅拌溶解，然后加入120 mmol/L β-丙氨酸甲酯盐酸盐，总反应体积为100 mL。30℃反应12 h后，用滴管取1mL反应液，加入50 μL终止液（3M HCl）终止反应，振荡混匀，12000 rpm离心10min，取上清经0.22 μm滤膜过滤处理后用液相分析其选择性和产率，结果如表2所示。

产率通过如下公式计算：实际产量/理论产量×100%，其中理论产量为根据反应方程式过程计算得到。

表2 野生型及突变体反应情况

组氨酸转化情况：在60 mmol/L的组氨酸情况下，野生型氨肽酶和突变体均能催化组氨酸生成肌肽，WT、M1、M2、M3的肌肽产率分别为61.5%、75.9%、77.5%、81.7%。在60 mmol/L的组氨酸条件下，突变体M3相比野生型氨肽酶产物的产率提高了1.3倍。

实施例4：突变体M3催化反应条件的优化

4.1 pH的优化

发明人发现突变体M3能显著提高氨肽酶的催化活性，因此在突变体M3的条件下，优化反应条件，选择pH7、pH8、pH9、pH10共4个pH进行催化反应。具体的，按照前述条件获得表达M3的菌体后，用不同pH的磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液、Gly-NaOH缓冲液重悬后，按照相同的催化条件分别进行催化反应，分析肌肽产率，结果如表3所示。

表3 M3不同pH下反应情况

在pH7-10范围内，pH8.0时，突变体M3的肌肽产率最高，为85.6%。

4.2 温度的优化

在组氨酸浓度保持不变（60 mmol/L）、pH8.0条件下，将配置好的反应体系在20、30、40、50℃条件下，进行催化反应，分析产率，结果如表4所示。

表4 M3不同温度下反应情况

在20~50℃范围之间，温度为40℃时，突变体M3的肌肽产率最高，为89.3%。

4.3 β-丙氨酸甲酯盐酸盐浓度的优化

该酶催化反应会将产物继续反应转化为杂质，在高浓度的β-丙氨酸甲酯盐酸盐条件下虽能推动催化反应的正向合成，但反应后期产物持续反应会导致产量下降，因此对体系中不同浓度的β-丙氨酸甲酯盐酸盐进行探究，进行催化反应，分析肌肽产率。结果如表5所示。

表5 M3在不同浓度条件的β-丙氨酸甲酯盐酸盐下反应情况

在组氨酸浓度保持不变（60 mmol/L）的情况下，肌肽的产量和产率随β-丙氨酸甲酯盐酸盐的增加呈现先增后减的趋势，当β-丙氨酸甲酯盐酸盐的浓度为90 mmol/L时，突变体M3的肌肽产率最高，为91.4%。

4.4 β-丙氨酸甲酯盐酸盐添加方式的优化

发明人发现在最优条件下，继续提高β-丙氨酸甲酯盐酸盐浓度，会存在产物与组氨酸反应的情况，这导致了继续提高β-丙氨酸甲酯盐酸盐浓度，产物的产率无法继续提高，甚至降低，且杂质产量逐渐提高，因此对β-丙氨酸甲酯盐酸盐投加方式进行探究。在控制β-丙氨酸甲酯盐酸盐总投加量不变的情况下（一次性投加时β-丙氨酸甲酯盐酸盐的浓度为90mmol/L）按照表6所示的方法分别进行催化反应，分析肌肽产率。结果如表6所示。

表6 M3在不同组氨酸投加方式下反应情况

在组氨酸浓度保持不变（60 mmol/L）的情况下，在不同β-丙氨酸甲酯盐酸盐的投加方式下，将其溶解后均匀流加4h时，突变体M3的肌肽产率最高，为93.6%。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种氨肽酶突变体，其特征在于，所述氨肽酶突变体为将氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的酶进行S88L、Y150C和Q268F中至少一种的突变。

2.根据权利要求1所述的氨肽酶突变体，其特征在于，所述氨肽酶突变体为SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列、SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列或SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列。

3.一种编码氨肽酶突变体的基因，其特征在于，所述编码氨肽酶突变体的基因包含编码权利要求1或2所述的氨肽酶突变体的核苷酸序列。

4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于，编码氨肽酶突变体的基因为SEQ ID NO:6、SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 8所示的核苷酸序列。

5.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体含有权利要求3或4所述的基因。

6.一种重组菌株，其特征在于，所述重组菌株含有权利要求3或4所述的基因或者权利要求5所述的重组载体。

7.权利要求1或2所述的氨肽酶突变体、权利要求3或4所述的基因、权利要求5所述的重组载体、权利要求6所述的重组菌株中的至少一种在合成L-肌肽中的应用。

8.一种L-肌肽合成的方法，其特征在于，该方法包括在β-丙氨酸甲酯或其盐和权利要求1或2所述的氨肽酶突变体存在下催化L-组氨酸合成L-肌肽。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，催化体系中，β-丙氨酸甲酯或其盐的含量为50-200g/L，L-组氨酸的含量为40-80 mmol/L；

所述催化的条件包括：pH为7-10，温度为20-50℃。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，β-丙氨酸甲酯或其盐和/或L-组氨酸以分批加入的方式加入催化体系中。