CN120944819B - 一种小分子抑制剂维持人造血干细胞体外培养功能特性静息状态治疗mld的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于技术领域，具体涉及一种小分子抑制剂维持人造血干细胞体外培养功能特性静息状态治疗MLD的应用。本发明为MLD提供了高效的治疗方案，经Bohemine优化的造血干细胞移植基因疗法，使患者ARSA酶活性显著提升，达健康人水平，改善代谢异常与神经病变。Bohemine预处理可维持HSC体外静息状态，避免培养应激致ROS升高和自我更新功能丧失。预处理的HSC克隆形成及移植重建能力增强，短期培养仍接近新鲜HSC，解决体外培养功能缺陷。该疗法优化了HSC培养条件，提高转基因整合率与ARSA表达，增强治疗稳定性与成功率，转化潜力强，为HSC培养优化提供依据，推动其在细胞与基因治疗应用，意义重大。

Description

一种小分子抑制剂维持人造血干细胞体外培养功能特性静息 状态治疗MLD的应用

技术领域

本发明属于技术领域，具体涉及一种小分子抑制剂维持人造血干细胞体外培养功能特性静息状态治疗MLD的应用。

背景技术

异染性脑白质营养不良（MLD；OMIM：250100）是一种罕见的遗传性溶酶体储存障碍，由ARSA基因突变所致，该突变会导致ARSA酶功能出现缺陷。由于ARSA酶的缺乏，硫酸酯的代谢受损，导致这些物质在中枢和周围神经系统的细胞溶酶体中积累。溶酶体中硫酸酯的不断积累，会导致进行性脱髓鞘和神经退行性病变。该病的临床表现为发育停滞，之后逐渐出现运动功能、语言能力和认知能力的丧失。

至今，多种治疗方法已被用于异染性脑白质营养不良（MLD）的治疗，包括异基因造血干细胞移植（allogeneic-HSCT）、酶替代疗法、脐带移植以及基于慢病毒（LV）的基因疗法（autologous-HSCT）。其中，骨髓干细胞移植（HSCT）治疗MLD的原理，基于一种名为“交叉矫正”的现象，即健康的髓系前体细胞迁移到大脑并分化为小胶质细胞后，会分泌ARSA酶，这些酶会被缺乏功能的大脑细胞（如少突胶质细胞）吸收，从而改善神经元内的硫酸酯代谢。

有趣的是，本课题组之前开发了一种新的治疗方法，将造血干细胞移植（HSCT）与基因疗法结合，通过体外转导自体造血干细胞（HSC）携带ARSA编码的LV载体。经过12+年IIT（研究者发起的临床试验）临床研究显示，使用LV修饰的自体HSC成功修复了神经病理损伤。同时，本课题组早在2014年就开创了亚洲首个造血干细胞基因疗法，将其应用于有症状的青少年型MLD患者，并开展了一项多中心、单臂、开放的临床试验（ClinicalTrials.gov ID:NCT02559830），通过分析治疗后短期和长期随访期间发生的不良事件，评估该疗法的长期安全性，并通过ARSA活性检测、MRI评分及神经功能评分等评估临床获益。本课题组联合广州市妇女儿童医疗中心、深圳市第二人民医院、深圳市儿童医院及香港大学等医疗机构开展了长达近10年的临床研究，研究表明，慢病毒修饰的造血干细胞基因疗法（HSC-GT）对于发病后的青少年型MLD患者是安全有效的，出现症状的患者仍然可以从HSC-GT中获益，为临床患者群体的有效治疗带来了新的希望，这项研究成果也于2024年发表在《Protein&Cell》期刊上（Lentivirus-modified hematopoietic stem cell gene therapy for advancedsymptomatic juvenile metachromatic leukodystrophy:a long-term follow-up pilotstudy. Protein&Cell, 16(1), 16-27.）。

人类造血干细胞（HSC）是一种非常罕见的细胞群体，具有产生所有造血细胞的能力。在人体中，这类细胞富含CD34⁺、CD38^-/iow、CD45RA^-、CD90⁺等表面标志物，构成了特定的细胞群。HSC大多处于静息状态，具有自我更新能力和多向分化潜能。这些特性使其成为再生医学、细胞和基因治疗的强大工具。在移植环境中，CD34⁺细胞被用作一种异质细胞产品，其中包含造血祖细胞、前体细胞以及HSC—这些细胞分别负责短期和长期的血液细胞生成。HSC的移植疗效与移植细胞的数量密切相关。脐带血中的HSC因易于采集，且相比其他异体来源的HSC具有更低的免疫原性，正越来越多地应用于移植治疗中。在基因治疗中，CD34⁺细胞通常需在含有细胞因子及生长因子（如干细胞因子（SCF）、血小板生成素（TPO）和FLT3配体（FLT3L））的特定培养基中至少培养两天，以促进HSC的存活，并便于通过病毒载体对其进行基因修饰。然而，虽然生长因子信号传导可支持CD34⁺细胞的高效基因校正，但也可能促使其发生部分分化，进而导致HSC特性的丧失。已知成人HSC存在于特定特定微环境中，该环境处于低氧状态（即缺氧），并参与维持HSC的功能特性。

此外，在缺氧条件下对人类CD34⁺细胞进行体外培养，有助于维持HSC的特性。事实上，缺氧可使HSC的活性氧（ROS）维持在极低状态。这些高度反应性分子在水平过高时会诱导氧化应激并损害细胞，但同时也可作为信号分子，驱动HSC的分化与增殖。

多种细胞机制可用于清除由生理信号及各种外部压力产生的活性氧。具体而言，有几种酶通过协同作用限制高反应性物质的积累：超氧化物歧化酶（SOD）家族将O₂ ^-转化为H₂O₂，随后其他不同家族的酶（如硫氧还蛋白、过氧化还原蛋白、过氧化氢酶或谷胱甘肽过氧化物酶）可对H₂O₂进行代谢，以阻止其转化为HO^●。这些系统至关重要，因为HSC中活性氧水平升高会导致其分化和功能丧失，从而降低体内造血重建能力。当CD34⁺细胞（包括HSC）用于基因治疗的培养流程时，可能会部分丧失功能，这主要是由于非生理性O₂水平及生长因子信号导致活性氧水平升高所致。在这类培养条件下，可通过多种方法维持HSC的功能。

近期研究提出了多种HSC培养方案，包括在缺氧条件下培养、在疏水性水凝胶中培养，以及在UM171.25-27等小分子存在的环境中培养。尽管这些放方法极具吸引力，但缺氧条件和水凝胶在临床应用中不易调控，且作用机制尚未明确。在前期研究中，发现抗氧化剂预处理可以保护HSC，使其免受低剂量辐射引发的活性氧损伤。基于此推测，在基因治疗前对HSC进行体外抗氧化处理，或许有助于维持其功能。

Bohemine是一种嘌呤类似物，也是一种合成的选择性CDK抑制剂，对Cdk2/cyclinE，Cdk2/cyclin A和Cdk9/cyclin T1的IC₅₀（Half maximal inhibitory concentration，半抑制浓度） 分别为4.6μM，83μM和2.7μM。Bohemine还可以抑制 ERK2，相应的IC₅₀ 为52μM，对CDK1，CDK4 和 CDK6 的抑制作用较小。为实现维持人HSC体外培养时的自我更新功能特性这一目标，本发明采用Bohemine来保护HSC，使其免受体外培养过程中产生的氧化应激损伤，同时也能抵御辐射带来的影响。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，本发明证明了Bohemine能够保护HSC免受培养过程中氧化应激的损害，维持其在体外培养中的静息状态，并保持HSC的干性。同时证实，在细胞/基因治疗方案中，向培养基中添加Bohemine有助于改善HSC在体外培养中的功能维持。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

本发明第一方面提供了Bohemine在维持人造血干细胞（HSC）体外培养功能特性静息状态中的应用。

本发明第二方面提供了一种维持人造血干细胞体外培养功能特性静息状态的处理方法，具体为：在人造血干细胞（HSC）长期培养前，先将HSC接种至转导培养基中，添加Bohemine预培养2天；所述转导培养基由BIT培养基添加80-150ng/mL干细胞因子（SCF）、90-130ng/mL FMS样酪氨酸激酶3配体（FLT3L）、50-70ng/mL白细胞介素- 3（IL-3）和7-15nM促血小板生成素（TPO）配制而成。

优选地，所述Bohemine的工作浓度为200-500µM。

优选地，在人造血干细胞长期培养中，以StemSpan SFEM培养基替代BIT培养基。

优选地，所述人造血干细胞来源于脐带血。

尽管本发明的研究主要聚焦于出生后早期脐带血样本中的HSC，但该方法或许也适用于骨髓或外周血中处于不同发育阶段（较成熟）的HSC。事实上，活性氧水平升高通常与HSC老化有关，而众所周知，成年HSC在造血系统重建方面的效率不及新生儿脐带血HSC。鉴于骨髓或动员的外周血CD34+细胞在自体移植及基因治疗方案中应用广泛，保护这些HSC免受进一步的氧化应激损害，将有助于优化基因治疗方案。总体而言，这些结果证实了Bohemine对HSC维持具有促进作用，并验证了其在体外培养中保护HSC的有效性。

更优选地，使用Ficoll梯度离心法分离脐带血中的单核细胞，再使用CD34微珠试剂盒通过免疫磁选法纯化CD34⁺细胞，即得到人造血干细胞。

本发明第三方面提供了人造血干细胞在制备治疗异染性脑白质营养不良（MLD）的药物中的应用，所述人造血干细胞经过第二方面所述的处理方法预培养。

理想的MLD治疗方案，必须确保治疗性ARSA转基因实现靶向高表达，且这种表达方式需同时满足两个条件：一是维持野生型基因拷贝数，二是维持HSC在体外培养中的未分化静息状态，与此避免转基因的非预期整合及ARSA酶的低活性表达。基于Bohemine预处理HSC技术，为生物医学领域中特定细胞类型的靶向基因高表达提供了可行方案。多项针对造血干祖细胞（HSPC）和T细胞的临床及临床前研究，已对该技术的应用潜力进行探讨，并成功通过同源定向修复（HDR）通路，在细胞内源性基因位点实现了靶向转基因整合。已知有超过200种不同的ARSA突变可导致良MLD，因此理想的治疗方案必须采用通用型基因校正策略，以实现不依赖突变类型的治疗效果。

为此，本发明采用了分步研究法：首先在造血干细胞（HSC）中通过Bohemine预处理，维持其体外培养的干性，随后对HSC进行转染，从中筛选出编辑效率最高（>87%）的sgRNA，用于评估无筛选条件下HSC内源ARSA位点的转基因整合效率（>40%），这一过程提高了转基因整合率，进而优化并提升了ARSA酶的表达，为MLD患者提供了一种可行的治疗方法。

绿色荧光蛋白（GFP）与ARSA转基因在整合效率上的差异，凸显了HSC在体外培养中保持静息状态的重要性。研究发现，从患者来源的HSC中观察到的ARSA整合频率较低，这与HSC长期冻存（>10年）以及其质量相较于新鲜分离的供体细胞出现下降存在重要关联性。本发明通过精心设计，采用Bohemine预处理HSC，以提升其体外培养的功能特性并维持静息状态，同时降低ROS水平及氧化应激反应，经Bohemine处理培养的HSC在体内展现出更优的造血重建能力，保留了长期的体外及体内功能，通过抑制HSC细胞分化，维持了其体外功能及静息状态，并延缓线粒体活性，进而优化并提高了ARSA酶的表达，其表达水平与健康成年人的分化髓系前体细胞相当。

总之，本发明研究为MLD患者提供了一种可行的治疗方法，其疗效已得到证实，且具有从实验室向临床转化的潜力。这项概念验证研究进一步为MLD患者提供了一种不依赖特定突变的治疗方案，其疗效同样已获证实，具备从实验室到临床的转化潜力。

优选地，所述药物还包括药学上可接受的辅料。

更优选地，所述辅料包括赋形剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂与反絮凝剂、抗氧剂、吸附剂、助滤剂、释放阻滞剂中的至少一种。

优选地，所述药物的剂型包括片剂、胶囊、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、脂质体、透皮剂或栓剂。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明为MLD提供了突破性治疗方案，借助小分子抑制剂Bohemine优化的造血干细胞移植基因疗法，能使患者的ARSA酶活性显著恢复，达到健康成年人水平，有效改善硫酸酯代谢异常及神经退行性病变。

在HSC体外培养中，Bohemine可维持其静息状态，避免因培养应激导致的ROS水平升高和自我更新功能丧失。经其预处理的HSC，克隆形成能力和异种移植重建能力显著增强，短期培养后仍接近新鲜HSC特性，解决了体外培养导致的干细胞功能缺陷问题。

该疗法优化了HSC体外培养条件，提高转基因整合率与ARSA酶表达，增强治疗稳定性与成功率，具有强大的临床转化潜力。同时，为HSC培养体系优化提供科学依据，推动造血干细胞在细胞治疗和基因治疗领域的应用发展，对MLD治疗及相关研究意义重大。

附图说明

图1为造血干细胞（HSC）体外培养功能与分子机制研究的实验结果关联图；A：实验设计流程图，B：LTC-IC实验功能验证，C：主成分分析，D：火山图，E-F（热图+GSEA分析），G：表观调控基因热图，H：通路GSEA分析。

图2为验证Bohemine对造血干细胞（HSC）抗氧化及抗氧化应激保护作用的实验结果图；A：直接测ROS水平的流式结果（左侧）和散点图（右侧），B：抗氧化基因表达谱，C：流式直方图（左侧）和柱状图（右侧）。

图3为验证Bohemine对造血干细胞（HSC）功能保护作用的实验结果图；A：原代CFU-C实验，B：次级CFU-C实验，C（5 周）、D（10 周）：通过限制稀释法，统计“长期培养起始细胞（LTC-IC）频率”，E：统计“人源细胞嵌合率”，F：分析“髓系/淋巴系分化比例”，G：检测“HSC表型细胞比例”。

图4为Bohemine维持造血干细胞（HSC）体外功能机制的实验结果图；A：测HSC生长曲线，B：分析“未成熟表面标志物（CD34⁺CD90⁺）”，C：通过CFSE染色看分化率；D-E：细胞周期观察图，F-G：研究线粒体状态。

图5为验证基因编辑联合Bohemine预处理，对造血干细胞（HSC）基因校正效率及功能影响的实验结果图；A：流式散点图，B：量化不同MOI下的eGFP⁺比例，C：ddPCR检测HDR（同源定向修复）的信号图，D-E：量化不同处理组的HDR比例，F：通过qPCR检测“ARSA mRNA”，G：ARSA 酶活性，H：髓系分化分析。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到。

异染性脑白质营养不良（MLD）是一种罕见的遗传性疾病，由ARSA基因突变引起。这种酶在脑细胞中的硫酸酯代谢中起着关键作用，其缺乏会导致神经退行性病变。本发明提供了一种借助小分子抑制剂使人造血干细胞在体外培养时维持功能特性静息状态的异基因造血干细胞移植（allogeneic-HSCT）基因疗法（autologous-HSCT），该疗法可作为MLD的潜在治疗方案，在临床治疗中能显著增强ARSA酶的活性恢复（提高>30倍），达到与健康成年人相当的水平。总之，本发明的研究为MLD患者提供了一种经证实有效的治疗方法，且该方法具有强大的临床转化潜力。

在静息状态下，人造血干细胞（HSC）的活性氧（ROS）水平极低。而在应激条件下，HSC会被激活并启动增殖和分化程序，以保障血液细胞的再生。一旦被激活，HSC的ROS水平便会升高，并作为信号分子调控其增殖和分化程序。然而，当应激结束后，HSC的ROS水平需恢复到正常状态，否则可能导致HSC耗竭。研究表明，小分子抑制剂能够在多种情况下防止HSC自我更新功能的丧失，并维持其体外静息状态。例如，已知新鲜的脐带血HSC（D0 CBHSC）大多处于静息状态，其特点是细胞分裂分化进程减缓，线粒体激活延迟，同时能保持HSC自我更新潜能，且不会出现HSC耗竭的情况。这一现象表明，小分子抑制剂可用于在体外培养诱导的应激条件下，维持HSC的自我更新功能特性，使其保持静息状态。

HSC在细胞治疗和基因治疗中的应用日益广泛，这类治疗通常需要对HSC进行数天的体外培养。研究发现，HSC的体外培养时间即使较短，也会导致其自我更新功能特性出现严重缺陷——其转录程序会从干细胞特性向分化方向转变，无法维持静息状态，这与预期效果一致。此外，在HSC体外培养实验中观察到一个有趣现象：用小分子抑制剂Bohemine预处理体外培养的HSC后，在二次克隆形成单位细胞（CFU-C）试验中，其克隆形成能力显著提升，在异种移植模型中，其重建能力也明显增强，且这两方面表现均优于未处理的体外培养HSC。综上，本发明的研究证实，添加Bohemine能够保护HSC在体外培养过程中的自我更新功能特性，维持其静息状态。

本发明的研究结果证实，Bohemine能够在短期（2天）体外培养中保护HSC的功能，常规的两天体外培养会促使HSC状态向祖细胞特征程序转变，这一培养过程会激活HSC，同时导致其自我更新能力和干细胞特性逐渐丧失。而Bohemine可通过增强CFU-C的生成，提高长期培养起始细胞（LTC-IC）的发生频率，以及挽救因培养导致的体内造血重建能力丧失，使培养的HSC特性更接近于新鲜的0天HSC（D0-HSC）。

本发明发现，即使较短的培养时间也会导致HSC的自我更新功能特性严重受损，具体表现为ROS水平升高。此外，研究还证实，小分子抑制剂Bohemine能够保护HSC免受培养诱导的应激影响，维持其自我更新功能特性，并保持体外培养静息状态。这些研究结果为优化HSC的培养条件奠定了基础。通过优化培养条件，可提高转基因整合率，进而增强ARSA酶的表达，最终为MLD患者提供了一种有效的治疗方法。

为全面且清晰地呈现本发明的技术方案及其显著优势，下面结合详细的具体实施例，对本发明展开深入细致的阐述。

1、实验方法

1.1、脐带血样本和体内实验

脐带血（CB）样本从健康婴儿中采集，由广东省脐带血造血干细胞库合作采集，采集前均已获得母亲的书面知情同意。

造血干细胞（CD34⁺细胞）的纯化遵循标准程序：首先使用Ficoll梯度离心法分离血液中的单核细胞，再使用CD34微珠试剂盒（Miltenyi Biotech, Paris, France）通过免疫磁珠分选法纯化CD34⁺细胞，即为造血干细胞。处理后的造血干细胞可直接用于实验，或在含10% DMSO的血清中冷冻保存（置于液氮中），待解冻后供后续实验使用。

1.2、细胞培养

Bohemine与造血干细胞共孵育阶段，用于细胞转导的完全培养基，由BIT培养基（STEMCELL Technologies）添加100ng/mL干细胞因子（SCF）、100ng/mL FMS样酪氨酸激酶3配体（FLT3L）、60ng/mL白细胞介素- 3（IL-3）和10nM促血小板生成素（TPO）（均购自PeproTech，USA）配制而成。在后续长期造血干细胞（HSC）培养实验中，则以StemSpan SFEM培养基（STEMCELL Technologies）替代BIT培养基。

药物与处理：

实验所用药物及使用浓度如下：Bohemine（300µM）、过氧化氢（H₂O₂，100µM）、血管内皮生长因子A（VEGFA，50ng/mL）、ZM32388（10nM）、Brivanib（Brivanib，50nM）。在长期培养开始前，需用300µM Bohemine预处理造血干细胞，即将Bohemine与造血干细胞共孵育2天。

1mM Bohemine母液的配制方法为：将1mg Bohemine溶解于2.9375mL二甲基亚砜（DMSO）中。母液需分装后保存于- 80℃冰箱，以避免反复冻融；使用时稀释至工作液浓度即可。

1.3、流式细胞分析

细胞表面染色操作在室温避光条件下进行，染色后用PBS洗涤并重悬细胞，该染色采用Hoescht和ZombiAqua（Biolegend）作为活力标记物。

细胞内p38MAPK染色采用磷流染色法（BD Biosciences），具体操作遵循制造商说明：首先用Fix Buffer I（BD Biosciences）在37℃条件下固定细胞10分钟，随后用PermBuffer II（BD Biosciences）在冰上对细胞进行透化处理1小时；之后在含BSA和EDTA的PBS中进行细胞内染色。

细胞分析通常在BD Canto II或BD LSRII SORP流式细胞仪上完成，细胞分选则通过BD Influx或BD Aria III SORP流式细胞分选仪进行。所有实验结果均使用FlowJo软件进行分析。

1.4、菌落形成单位细胞（CFU-C）试验

CFU-C培养以500个经磁珠分选的造血干细胞（HSC）为起始，这些HSC已经在37℃，CO₂培养箱条件下，利用Bohemine预培养2天（以无预处理为对照），每组实验设置3个重复。具体操作如下：将上述HSC接种到甲基纤维素培养基H4435（H4435，STEMCELLTechnologies）中，培养12-14天后，对形成的菌落进行识别和计数。随后将菌落数量和类型相近的培养板用25℃预热的PBS缓冲液重悬，取总回收细胞的1%接种至二次培养体系中。

1.5、长期培养起始细胞（LTC-IC）试验

利用Bohemine预培养2天（以无预处理为对照）后，将造血干细胞（HSC）以有限稀释法接种到预先铺有MS5基质细胞的96孔板（使用Myelocult培养基，H5100，STEMCELLTechnologies）中，采用Myelocult培养基进行长期集落计数-免疫共培养实验（LTC-IC实验），具体步骤为：细胞持续培养5周，期间每周更换一半体积的培养基；培养结束后回收细胞，接种到500µL甲基纤维素培养基（H4435）中，10-12天后观察并评估菌落生长情况。

对于延长的长期培养（LTC）实验，造血干/祖细胞（HSPC）在6孔板中培养5周，同样每周更换一半体积的培养基；前5周培养结束后分选CD34 ⁺细胞（HSC细胞），再以不同浓度的有限稀释法接种到96孔板中。

1.6、移植实验

NOD.Cg-Prkdc（scid）Il2rg（tm1Wjll）/SzJ（NSG）小鼠饲养于无病原体动物设施中。选取8-12周龄的成年NSG小鼠，采用GSRD1-辐照器对其进行2.5 Gy 亚致死剂量照射，随后在静脉注射人源细胞前用异氟醚麻醉。所有实验操作均严格遵循动物伦理规范，并符合当地伦理委员会的要求。

造血干细胞（CD34⁺细胞）经预处理（或未预处理）后，在转导培养基中大量培养2天（处理组采用终浓度300µM的Bohemine处理，对照组不处理）。对细胞进行计数后，将造血干细胞通过静脉注射到经照射的小鼠体内，每只小鼠的注射量为1-2.5×10⁴个细胞。

小鼠在移植16周后被处死，随后取出4根长骨用于骨髓分析，并采集血液样本进行相关检测。

1.7、微阵列转录分析

转录组分析采用Affymetrix人类Clariom D芯片，每种实验条件下均使用3个来自不同脐带血的分选造血干细胞（HSC）样本。

数据分析通过TAC软件、GSEA（基因集富集分析）及分子特征分析软件完成。差异表达基因的判定标准为：基因表达变化倍数≥2且P值≤0.05。热图绘制借助http://shinyheatmap.com/平台完成。相关实验数据已上传至Array Express数据库（编号：E-MTAB-12121）。

1.8、ROS水平和线粒体活化测量

ROS水平检测于Bohemine处理（即Bohemine与造血干细胞共孵育2天）后的第0天（D0）、第1天（D1）和第2天（D2）进行，具体操作如下：

细胞经表面抗体染色后，加入CellRox DeepRED染料，在37℃条件下孵育 30分钟；洗涤后用BD细胞固定缓冲液固定，随后在BD Canto II流式细胞仪上分析。为验证高ROS水平的阳性对照，部分细胞需先与TBHP孵育30分钟，再加入CellRox DeepRED探针孵育。

细胞经表面抗体染色后，改用CellRox Orange染料在37℃下孵育30分钟；洗涤后置于冰上孵育，立即通过BD Canto II流式细胞仪分析。若需诱导ROS，需预先用Bohemine处理细胞1小时：ROS可在CellRox Orange染色前用TBHP孵育30分钟制备，或在CellRoxOrange染色的最后15分钟加入100µM H₂O₂制备。

线粒体活化测量流程为：细胞经表面抗体染色后，与50µM TMRE（四甲基罗丹明乙酯）和50nM MTG（线粒体绿色荧光探针）在PBS中混合，37℃孵育 30分钟，随后立即在BDCanto II或LSR-SORP流式细胞仪上分析。

1.9、抗氧化基因或抗氧化图谱的表达

抗氧化图谱通过实时定量PCR技术检测21个关键抗氧化基因的转录本相对表达量来定义（检测方法参照文献：Picou F, Vignon C, Debeissat C, et al. Bone marrowoxidative stress and specific antioxidant signatures in myelodysplasticsyndromes. Blood Adv. 2019; 3(24):4271-4279. https://doi.org/10.1182/bloodadvances.2019000677.）。实验采用罗氏应用科学公司LightCycler 480微孔板循环仪平台，结合探针发现软件设计的通用探针库进行实时荧光定量PCR分析。抗氧化基因的相对表达量通过2^-ΔΔCt法计算分析，最终呈现抗氧化图谱的整体轮廓。

1.10、慢病毒载体ARSA LV制备

本研究中使用的ARSA LV是通过293T细胞瞬时转染四种质粒（质粒由GeneArt公司（ThermoFisher Scientific）体外合成制备）制备的。首先，将293T细胞接种于T162培养瓶在Dulbecco’s modified Eagle’s medium培养基 （DMEM；Biochrom））中扩增，随后转移至10孔板Opti-MEM培养基（Thermo Fisher Scientific））的细胞工厂中进行培养。接着加入JetPEI转染试剂（Polyplus transfection，Thermo Fisher Scientific）转染四种质粒，四种质粒分别是编码两种核心包装构建体（pKLGag/pol和pKRev）、包膜构建体（pK.G）以及转移载体构建体（pARSA）。在Opti-MEM培养基中共孵育转染293T细胞24小时后，收集293T细胞上清液并置于4℃保存。然后更换293T细胞的培养基（先使用DMEM培养基润洗贴壁的293T细胞，随后加入添加了10%胎牛血清（Gibco）和1%L-谷氨酸（Biochrom）的DMEM培养基），继续培养293T细胞24小时，进行第二次293T细胞上清液收集。将两次收集的上清液混合后，置于4℃超速离心机中以280,000×g离心4小时进行病毒浓缩。浓缩之后的病毒沉淀重悬于Opti-MEM培养基中，混匀之后进行0.2 μm滤膜过滤灭菌及无菌灌装，最后将纯化的慢病毒载体保存于-80℃超低温环境中。

1.11、流式分析

使用磁激活细胞分选系统（CliniMACS system；Miltenyi Biotec）富集CD34⁺HSC。所有分离样本中，来自健康供体和骨髓移植后淋巴细胞病（MLD）患者的富集HSC纯度均>90%。28个CD34⁺HSC置于StemMACS 造血干细胞扩增培养基（Miltenyi Biotec）中培养，该培养基补充了人干细胞因子（SCF；100 ng/ mL)和白细胞介素-3（IL-3，100 ng/mL；Miltenyi Biotec)，在37℃、5%CO₂条件下培养前3天。

随后，采用两阶段髓系分化方案。在第一阶段（第3-6天），向培养基中额外添加GM-CSF（50 ng/ mL；Miltenyi Biotec）和M-CSF（50 ng/mL；Miltenyi Biotec）。从第6至9天（第二阶段），仅添加M-CSF（50 ng/ mL），最终通过流式细胞术监测髓系细胞的成熟过程。第10天时，使用FITC偶联的抗CD33（Miltenyi Biotec）、PE偶联的抗CD14（Miltenyi Biotec）、PerCP偶联的抗CD45（Miltenyi Biotec）、APC偶联的抗CD11b（Miltenyi Biotec）和APC偶联的抗CD66b（Miltenyi Biotec）进行细胞分析（BD FACSCalibur）。

1.12、qPCR和ddPCR

病毒滴度通过定量聚合酶链式反应（qPCR）和液滴数字PCR（ddPCR）进行测定。为获取LV衣壳破裂后的病毒DNA，取2 mL浓缩病毒上清液，加入2IU DNase I（NEB，ThermoFisher Scientific）进行酶切，最终反应体积为40 μL。样品先在37℃孵育30分钟，随后在75℃下处理15分钟，使用蛋白酶K（1 μL；Qiagen)加入到5 μL的DNase I消化产物中进行检测，使最终体积为20 μL，并在50℃和98℃下分别孵育30分钟和10分钟。

使用CFX实时PCR仪（Bio-Rad）进行qPCR，反应体系包含2 μL蛋白酶K消化产物、12.5 μL的KAPA Probe FAST（Bio-Rad）、各1 μL ITR引物（5 μM）和ITR Probe（5 μM），以及2.5 μL水，程序设置为：95℃预变性3分钟，随后进行40个循环的95℃ 3秒和60℃ 20秒。

ddPCR反应体系（Bio-Rad）的配制方法如下：ddPCR反应体系总体积为20 μL，具体组分如下：ddPCR多重预混液（13 μL）、950 nM引物（1 μL）、250 nM Probe（1 μL）及350 ngDNA模板（5 μL）。同时，在C1000 Touch热循环仪（Bio-Rad）上进行ddPCR：95℃ 10分钟，40个循环的95℃ 30秒、57℃ 1分钟和72℃ 2分钟，最后在98℃酶灭活10分钟。引物和探针信息详见表1。

表1 用于qPCR和ddPCR的寡核苷酸序列

注：[1].Mern DS, Thome´ C. Identification and characterization ofhuman nucleus pulposus cell specific serotypes of adeno-associated virus forgene therapeutic approaches of intervertebral disc disorders. BMCMusculoskelet Disord 2015;16:341. DOI: 10.1186/s12891-015-0799-4；[2].Lamsfus-Calle A, Daniel-Moreno A, Uren˜a-Baile´n G, et al. Universal genecorrection approaches for b-hemoglobinopathies using CRISPR-Cas9 and adeno-associated virus serotype 6 donor templates. CRISPR J 2021;4:207–222. DOI:10.1089/crispr.2020.0141。

具体实验流程如下：

（1）采用QX200微滴式数字PCR（ddPCR）生成仪（Bio-Rad）将DNA样本分割为约20,000个微滴，随后转移至96孔板；

（2）使用PX1 PCR板热封仪（Bio-Rad）对96孔板进行密封，以防止反应过程中液体蒸发；

（3）将密封后的96孔板置于C1000 Touch热循环仪（Bio-Rad）上进行PCR反应，反应程序为：95℃初始变性10分钟，之后进行40个循环（95℃ 30秒、61℃ 1分钟、72℃ 2分钟），最后以98℃酶灭活10分钟结束；

（4）反应产物通过QX200微滴分析仪检测，数据采用QuantaSoft v1.6.6分析软件（Bio-Rad）进行处理。

1.13、qRT-PCR

HSC转染后第10天，采用RNeasy Mini Kit（Qiagen）提取总RNA，随后使用QuantiTect Reverse Transcription Kit（Qiagen）合成cDNA。qRT-PCR检测通过CFX96™实时荧光定量PCR系统（Bio-Rad）进行，配合KAPA SYBR FAST 2×MasterMix（KAPABiosystems）完成cDNA的扩增与定量。

实验结果以β2微球蛋白（β2M）的表达量作为内参进行标准化处理，未知样本的交叉点（CP）值通过公式2（CP_β2M-CP_{target gene}）计算。本实验使用的qRT-PCR引物具有特异性（引物来源参考文献：Johnson RL, Milenkovic L, Scott MP. In vivo functions of thepatched protein: requirement of the C terminus for target gene inactivationbut not hedgehog sequestration. Mol Cell 2000;6:467–478. DOI: https://doi.org/10.1016/S1097-2765(00)00045-9.），仅检测ARSA转录本（转基因特异性），不会与内源性ARSA的表达产生交叉反应。

对于未进行转基因转导的样本（即对照组），qRT-PCR分析中未检测到信号，因此将其Ct值设定为实验的最大循环数（本实验为40），以计算倍数变化。这种处理方式与多个分析软件（如Applied Biosystems DataAssist v3.0和 Integromics RealTime StatMiner）的方法一致，即对未检出值采用最大Ct值赋值。需注意的是，该方法可能导致实际倍数变化存在偏差（即被高估），但可用于绘制Bohemine +慢病毒（LV）处理样本中mRNA相对于对照组的相对表达量。

1.14、ARSA酶活性检测

ARSA（芳基硫酸酯酶A）酶活性的定量检测采用人工底物对硝基儿茶酚硫酸盐（pNCS；Merck）进行功能实验，具体方法参照厂家说明书，步骤如下：

（1）样本制备：制备细胞裂解液，浓度为2.5×10⁶个细胞/毫升。

（2）反应体系：将细胞裂解液与底物溶液混合，底物溶液成分包括：10mM pNCS、0.5mM焦磷酸钠（sodium pyrophosphate）、10% NaCl，溶解于0.5M乙酸钠缓冲液（pH 5.0）中。

（3）孵育反应：混合后的反应体系在8℃条件下孵育48小时。

（4）终止与检测：反应结束后，加入0.5M NaOH终止反应，通过分光光度法在514nm波长处测定吸光度值，以此反映底物的转化率，进而定量ARSA酶活性。

该方法通过检测人工底物的转化效率，直接反映ARSA酶的功能活性，是评估该酶生物学功能的关键实验手段。

1.15、统计学分析

数据以均数±标准差表示。统计显著性通过两组间的t检验或Fisher精确检验以及三组间的单因素方差分析确定。，，，和被认为具有统计学意义。统计分析使用GraphPad Prism 6.01版本进行。体内和体外限制稀释分析使用L-Calc软件进行。

2、实验结果

2.1、体外培养引起HSC特性和HSC基因表达功能的变化

为了了解体外培养对HSC功能特性的影响，进行了限制稀释的LTC-IC（一种评估HSC未成熟功能的实验模型）实验。实验结果如图1所示，其中，A为实验设计流程图，展示从HSC分选，到“未培养（D0-HSC）”与“培养2天（D2-HSC）”分组，再到功能实验（LTC-IC）和分子实验（微阵列）的研究框架；B为LTC-IC实验功能验证，通过限制稀释法统计“生成菌落的细胞频率”，量化D0/D2-HSC的干细胞活性差异（D2活性更低）；C为主成分分析，D0/D2-HSC聚类分离，说明两组基因表达谱“整体不同”；D为火山图，筛选差异基因，红蓝点代表显著上下调基因，量化“培养2天”引发的基因表达变化规模（5476个差异基因）；E-F（热图+GSEA分析）聚焦“干细胞特性相关基因集”，热图可视化HSC/祖细胞特征基因的表达差异，GSEA进一步统计“干性基因集在D0中富集、分化基因集在D2中富集”；G为表观调控基因热图，展示培养对HSC干性/分化关键调控因子的影响；H为通路GSEA分析，D0富集“缺氧、抑癌（P53）”等干性维持通路，D2富集“细胞周期、氧化磷酸化”等分化/代谢通路。

首先，根据CD34⁺CD38^-CD45RA^-CD90⁺表型通过细胞分选纯化人HSC，不培养直接在LTC-IC条件下（D0-HSC（未培养HSC））接种，或者培养2天后将D2-HSC（培养第2天的HSC，图1中的A）接种到LTC-IC条件下。随后，比较了D2-HSC与未培养的HSC（D0-HSC）在LTC-IC条件下的生成菌落的细胞频率。在LTC-IC条件下，D2-HSC在LTC-IC条件下的频率为（1/9，95% CI[1/11-1/8]），而D0-HSC在LTC-IC条件下的频率为（1/4，95% CI [1/5-1/4]），D2-HSC在5周后能够生成菌落的细胞频率比D0-HSC低2.25倍，这表明D2-HSC在培养期间失去了HSC干细胞特性（图1中的B）。为了进一步了解这些功能变化的分子机制，使用CLARIOM D微阵列技术进行了转录组分析，并比较了D2-HSC和D0-HSC之间的转录谱。主成分分析显示，D2-HSC和D0-HSC分别聚类（图1中的C），揭示了不同的转录组图谱。总共在两种条件下有5476个基因受到差异调控，其中1868个基因在D2-HSC中下调，而3608个基因在D2-HSC中上调（图1中的D）。首先，使用https://www.gsea-msigdb. org/gsea/msigdb/index.jsp中的某些C2-CGPHSC和祖细胞特异性基因集进行了基因集富集分析（GSEA）（图1中的E-F）；HSC特征在D0-HSC中富集。发现与D0-HSC相比，D2-HSC中的HSC和祖细胞基因特征分别下调和上调，证实了体外2天培养期诱导HSC分化并导致HSC功能丧失（图1中的E-F）。此外，发现一些参与表观遗传修饰的基因，如TET2、DNMT3B、EZH1和EZH2，在比较D2-HSC和D0-HSC条件时，这些基因的表达存在差异，具体表现为D2-HSC中的EZH2的表达增加，这与HSC的激活和分化有关；而EZH1的表达减少，这与HSC的干性特征相关。同样地，TET2的表达在D2-HSC中也低于D0-HSC（图1中的G）。最后，这项分析显示，在HSC中，培养诱导的细胞周期/分化程序和氧化应激持续了2天。当使用GSEA软件进行基因本体分析时，培养2天后富集的标志性通路与细胞周期和氧化磷酸化有关。相反，D0-HSC中富集的特征与缺氧相关（图1中的H）。事实上，据报道，无论氧气浓度如何，HSC表现出的分子特征都与缺氧有关。因此，体外培养不仅驱动了HSC功能性的变化，还引发了代谢转换。

2.2、Bohemine降低ROS和氧化应激反应

为验证Bohemine是否能在为期两天的应激培养期间保持HSC的潜能。首先在造血干细胞（HSC）中检测了Bohemine的抗氧化作用。实验流程为：在诱导氧化应激前，先用Bohemine对HSC进行预处理，随后使用叔丁基过氧化氢（TBHP）诱导氧化应激，再通过CellRox橙色探针检测活性氧（ROS）水平。结果显示，Bohemine可抑制TBHP介导的人HSC中ROS水平升高，表明其具有抗氧化作用。因此，进一步在D0（未培养）和培养第2天（D2）测量了经Bohemine处理或未处理的HSC中的ROS水平。实验结果如图2所示，其中，A为直接测ROS水平，左侧用CellROX深红色探针的流式结果，对比“Bohemine处理组（浅紫峰）”与“未处理D2-HSC 组（灰峰）”的荧光强度（MFI），直观体现Bohemine降低ROS，右侧散点图量化“ROS水平倍数增长”，进一步验证Bohemine对ROS的抑制效果；B利用“抗氧化基因表达谱”间接佐证，对比D0-HSC（虚线，代表未受氧化应激的基准）、D2-HSC（黑粗线，代表氧化应激下的状态）、Bohemine处理D2-HSC（蓝线）的抗氧化基因表达，Bohemine处理后曲线向D0靠拢，说明其通过调控抗氧化基因，缓解氧化应激；C的左侧流式直方图对比Bohemine处理组（浅紫峰）与未处理D2-HSC组（灰峰）的磷酸化p38MAPK水平；右侧柱状图量化差异，证明Bohemine降低p38MAPK磷酸化，间接说明其减少ROS生成、抵御氧化应激。

结果显示，在未处理条件下，从D0到D2，HSC的ROS水平呈上升趋势。此外，当细胞用Bohemine处理时，ROS水平趋于降低（图2中的A）。为了加强这些结果，使用“抗氧化图”试验，在培养2天后评估了Bohemine对HSC的抗氧化效果。“抗氧化图”测试通过追踪关键抗氧化基因转录本的表达水平，提供了一个综合视角，展示了细胞内ROS水平增加时多种抗氧化途径的激活情况。与未培养的细胞（D0-HSC）相比，D2-HSC中许多抗氧化基因显著过表达，证实了与D0-HSC相比，D2-HSC确实受到了氧化应激的影响（图2中的B，D2-HSC，D2-HSC以黑色粗线显示，D0-HSC以虚线显示，二者对比可见此差异）。相反，Bohemine处后理的D2-HSC中抗氧化基因表达曲线（图2中的B，Bohemine D2-HSC，蓝线）向D0-HSC移动，表明许多分析的基因在Bohemine存在下被下调。为了进一步证明Bohemine在抑制培养中ROS生成方面的作用，研究了氧化应激的次级信使p38MAPK（p38 mitogen-activated protein kinase，促分裂素原活化蛋白激酶）的磷酸化状态。培养两天后，与未处理的D2-HSC相比，预处理Bohemine的D2-HSC中p38MAPK的磷酸化显著降低，但仍然存在（图2中的C），这表明Bohemine处理后ROS水平有所下降。上述这些结果表明，Bohemine可以降低D2-HSC中的ROS水平，Bohemine预处理能够在2天的培养期内保护HSC免受氧化应激的影响。

2.3、Bohemine处理培养的HSC在体内具有更好的造血重建作用，保留了长期体外和体内HSC的功能

研究了Bohemine处理对HSC功能的影响；使用D2-HSC进行了CFU-C实验，并通过其再培养能力（连续CFU-C检测）进一步探究其未成熟功能。简而言之，预先用或不用Bohemine处理的HSC被分选后，在完全培养基中培养2天，然后接种到CFU-C培养基中。实验结果如图3所示，其中，A为“原代CFU-C实验”，证明Bohemine不影响HSC初始克隆形成；B为“次级CFU-C实验”，显示Bohemine处理组菌落更多，说明其能维持HSC克隆形成潜力，防止培养导致的功能丢失。C（5 周）、D（10 周）通过限制稀释法，统计“长期培养起始细胞（LTC-IC）频率”，Bohemine处理组LTC-IC频率更高（接近D0-HSC），证明其能保护HSC未成熟功能，延长培养也能维持效果；E统计“人源细胞嵌合率”，Bohemine处理组嵌合率更高、异质性更低，说明其提升D2-HSC体内重建效率；F分析“髓系/淋巴系分化比例”，无明显偏差，证明Bohemine不影响HSC分化方向；G检测“HSC表型细胞比例”，处理组有升高趋势，间接支持其保护HSC功能。

结果显示，在原代培养中，两种条件下形成的菌落数量相当（图3中的A），而在次级CFU-C培养中，与未处理的D2-HSC相比，Bohemine预处理过的D2-HSC显示出显著增加的菌落数量（图3中的B）。对于两份独立的脐带血样本，测量了HSC的克隆形成能力，分别使用D2-HSC（未处理的D2-HSC和经Bohemine处理的D2-HSC）和未培养的D0-HSC进行比较。与未培养的D0-HSC相比，未处理的D2-HSC的二次克隆形成能力下降，而Bohemine预处理的D2-HSC能防止这种功能损失。在一次实验中，进行了三级CFU-C检测，发现经Bohemine预处理的D2-HSC生成了更多的克隆。这表明要么是未成熟祖细胞得到了更好的保存，要么是HSC的自我更新能力得到了增强，在Bohemine预处理的情况下，二次（及三次）重铺时形成的CFU克隆数量更多。此外，未观察到CFU-C类型的偏差，证明Bohemine并未影响HSC的分化。为了进一步确认Bohemine对HSC的影响，评估了Bohemine对D2-HSC自我更新潜能的潜在影响，通过限制稀释试验量化了LTC-IC（长期培养起始细胞，即最不成熟的细胞）的频率。结果显示，与未处理的D2-HSC相比，Bohemine预处理促进了D2-HSC中LTC-IC的维持，LTC-IC的频率接近于D0-HSC（1/5，95% CI [1/6-1/5]，图3中的C）。为了评估Bohemine维持更多未成熟HSC细胞的功能，进行了类似的实验，包括延长（10周）的培养期。在批量培养的前5周结束后，分选获得LTC中持续存在的CD34^⁺细胞，并以限制稀释法接种5周，之后评估其克隆形成能力。培养10周后，未处理的D2-HSC（1/98，95% CI [1/81-1/118]；图3中的D）相比，Bohemine处理的D2-HSC中LTC-IC频率高出50%（1/66，95% CI [1/55-1/79]），与这表明Bohemine具有保护HSC未成熟功能的潜能。

为了验证这些结果，将CD34⁺细胞预先用Bohemine处理或不处理，在完全培养基中培养2天（D2-CD34⁺细胞），然后在免疫缺陷NSG小鼠（NOD-PrkdcscidIl2rgem1/Smoc）体内注射。移植后16周，小鼠被处死，并使用特异性抗人CD45抗体检测人类嵌合体，评估其长期重建潜力。结果显示，D2-CD34⁺细胞在体内生成了人类造血祖细胞，但效率不如新鲜的CD34⁺细胞（D0-CD34⁺），因为在NSG小鼠骨髓中移植D2-CD34⁺细胞时检测到了hCD45⁺细胞水平的高度异质性（图3中的E)，这种异质性在用Bohemine预处理的D2-CD34⁺条件下得到了减少。事实上，注射了Bohemine预处理的D2-CD34⁺细胞的小鼠中，86%表现出人类嵌合体，比例>10%，而注射未处理的D2-CD34⁺细胞的小鼠中，这一比例为57%（图3中的E）。既没有检测到髓系细胞偏向，也没有检测到淋巴系细胞偏向（图3中的F）。然而，使用经典的HSC标志物，在接受Bohemine预处理的D2-CD34⁺细胞的小鼠骨髓中观察到了较高的HSC表型水平的趋势（尽管不显著；图3中的G)。此外，进行了一次连续移植实验。在初次受体小鼠中，两种条件下的嵌合体百分比没有差异，但在二次受体中，Bohemine预处理的D2-CD34⁺细胞更有效，这表明当HSC在培养过程中受到Bohemine处理时，其功能得到更好的维持。综上所述，这些数据表明Bohemine可能在2天培养期间保留HSC的造血重建功能（图3中的G）。

2.4、Bohemine通过限制HSC细胞分化来维持HSC的体外功能，保障HSC的体外静息状态并延缓线粒体活性

为了了解Bohemine如何维持HSC的体外功能，监测了多个参数，如增殖、未成熟细胞表面标志物的表达以及不同培养时间点的细胞分裂率。实验结果如图4所示，其中，A为测HSC生长曲线，证明Bohemine对“细胞数量增长”无显著影响；B分析“未成熟表面标志物（CD34⁺CD90⁺）”，随培养时间延长标志物流失，但Bohemine处理组与未处理组无差异；C通过CFSE染色看分化率，Bohemine处理组分化率更低，证明其能“延缓HSC分化”；D-E通过观察细胞周期，Bohemine处理组更多HSC处于静息期（G₀期）。F-G研究线粒体状态，F显示线粒体质量无明显差异；G通过TMRE探针，发现Bohemine处理组线粒体膜电位更低（激活延迟），说明其具有保护HSC功能。

结果显示，未发现Bohemine对HSC细胞生长有显著影响（图4中的A）。如预期，随着培养时间的延长，HSC表型（CD34⁺CD90⁺）逐渐丧失，且未观察到未处理和经Bohemine预处理的D2-CD34⁺细胞之间的差异（图4中的B）。然而，与未处理的D2-HSC相比，经Bohemine预处理的HSC细胞的分化率（CFSE（羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯）染色）有所下降（图4中的C）。因此，在培养两天后检查了HSC细胞的周期状态。经Bohemine预处理的D2-HSC显然更处于静息状态，这解释了CFSE细胞分化实验中观察到的延迟（图4中的D-4E）。最后，通过TMRE探针测量线粒体膜电位、MTG探针检测线粒体质量，分析了经Bohemine预处理与未经预处理的D2-HSC中的线粒体激活情况。可以观察到，尽管Bohemine对线粒体质量的影响非常有限（图4中的F），在用Bohemine预处理的HSC中培养2、4和7天后，线粒体激活延迟（图4中的G）。总之，本发明证明Bohemine通过限制细胞分化率和代谢激活来保护HSC体外功能的维持。

2.5、Bohemine预处理HSC用于治疗异染性脑白质营养不良（MLD）

慢病毒载体ARSA LV以不同感染复数（MOI分别为2000、1000和500）DMEM培养基中转染健康供体来源造血干细胞（HSC），持续14小时，接着在基因编辑后立即培养于髓系分化培养基（StemMACS）中，培养10小时。基因编辑与慢病毒转导完成10天后，通过ddPCR、qPCR及ARSA酶活性检测等多种分子分析方法，评估HSC的基因校正效率；同时，对转导eGFP（GenBank：NG_009260.2）和ARSA（GenBank：U55762.1）供体模板的细胞进行流式细胞术分析。需要特别指出的是，eGFP表达仅在成功整合至内源性ARSA基因座后才会被诱导，该过程受内源性ARSA启动子调控。实验结果如图5所示，其中，A为通过流式散点图，直观展示“Bohemine+LV组”的eGFP⁺细胞比例远高于对照组；B为量化不同MOI下的eGFP⁺比例，证明MOI=1000时整合率超47%，验证策略有效性；C为ddPCR检测HDR（同源定向修复）的信号图，D-E为量化不同处理组的HDR比例，与流式结果呼应，证明Bohemine预处理组整合率更高；F为通过qPCR检测“ARSA mRNA”，Bohemine处理组表达量比对照组高220倍，证明整合基因能有效转录；G为ARSA 酶活性，说明基因编辑/Bohemine处理不破坏HSC原有功能；H为髓系分化分析，分析CD33/CD11b/CD66b等髓系标志物，各组比例相似，证明Bohemine+LV处理不影响HSC分化方向。

引人注目的是，结果显示本发明的策略能在感染复数（MOI）为1000时，将eGFP整合至超过47%的转导细胞（HSC）中（图5中的A-B）。其他测试的MOI值（500和2000）分别实现了37%和39%的eGFP转基因整合率。通过微滴式数字PCR（ddPCR）对同批样本的分析验证了流式细胞术（FACS）获得的结果：经Bohemine预处理并体外培养的HSC，在经LV-eGFP（MOI 1000）转导后显示出40.6%的转基因整合率；而未经 Bohemine预处理的HSC，以及仅接受LV处理的HSC，均未检测到阳性信号（图5中的C-D）。在使用LV载体转导ARSA cDNA的Bohemine预处理HSC中，感染复数（MOI）2000显示出最佳整合效率（32.7%；图5中的E），而MOI 500的则表现出显著降低的整合率（25.8%；p < 0.01）。为评估整合ARSA cDNA的内源性转录情况，设计了qPCR引物和探针，这些探针仅与Bohemine预处理组的ARSA mRNA结合，而不与内源性野生型ARSA mRNA结合。在此qPCR 实验中，可以观察到：经Bohemine处理的HSC中，ARSA mRNA的表达量比仅用LV处理的细胞或健康供体的未处理样本高出220倍以上（图5中的F）。生成的数据证实，所设计的探针未与经典ARSA mRNA发生杂交。此外，由于这些细胞源自健康供体，其ARSA酶活性无论是否经过基因编辑和校正，均保持不变（图5中的G）。另外，为测试Bohemine+LV载体处理是否影响HSC细胞的分化，分析了特定髓系标志物。结果显示，无论采用何种处理方式，表达CD33（范围98.6-99.5%）、CD11b（37.0-39.7%）或CD66b（23.0-28.1%）的细胞分布比例相似（图5中的H），说明Bohemine+LV载体处理能够提高转基因整合效率，从而维持HSC细胞的分化。

以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

Claims (3)

1.Bohemine在维持人造血干细胞体外培养功能特性静息状态中的应用，其特征在于，在人造血干细胞长期培养前，先将人造血干细胞接种至转导培养基中，添加Bohemine预培养2天，所述Bohemine的工作浓度为200-500µM；所述转导培养基由BIT培养基添加80-150ng/mL干细胞因子、90-130ng/mL FMS样酪氨酸激酶3配体、50-70ng/mL白细胞介素- 3和7-15nM促血小板生成素配制而成；

在人造血干细胞长期培养中，以StemSpan SFEM培养基替代BIT培养基，所述人造血干细胞来源于脐带血。

2.一种维持人造血干细胞体外培养功能特性静息状态的方法，其特征在于，在人造血干细胞长期培养前，先将人造血干细胞接种至转导培养基中，添加Bohemine预培养2天，所述Bohemine的工作浓度为200-500µM；所述转导培养基由BIT培养基添加80-150ng/mL干细胞因子、90-130ng/mL FMS样酪氨酸激酶3配体、50-70ng/mL白细胞介素- 3和7-15nM促血小板生成素配制而成；

在人造血干细胞长期培养中，以StemSpan SFEM培养基替代BIT培养基，所述人造血干细胞来源于脐带血。

3.根据权利要求2所述的一种维持人造血干细胞体外培养功能特性静息状态的方法，其特征在于，使用Ficoll梯度离心法分离脐带血中的单核细胞，再使用CD34微珠试剂盒通过免疫磁选法纯化CD34⁺细胞，即得到人造血干细胞。