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CN120936877A - 用于前列腺癌筛查的基于侧流免疫测定的精胺快速检测 - Google Patents

用于前列腺癌筛查的基于侧流免疫测定的精胺快速检测

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CN120936877A
CN120936877A CN202480018610.6A CN202480018610A CN120936877A CN 120936877 A CN120936877 A CN 120936877A CN 202480018610 A CN202480018610 A CN 202480018610A CN 120936877 A CN120936877 A CN 120936877A
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CN
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spermine
pad
conjugate
liquid sample
sample
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Application number
CN202480018610.6A
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曾铭乔
黄婉婷
何嘉乐
黄嘉良
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New Life Medicine Technology Co ltd
Original Assignee
New Life Medicine Technology Co ltd
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Abstract

本发明涉及一种用于检测液体样品中精胺的测试装置和其使用方法，其中所述测试装置按顺序包括：样品垫、结合垫、膜和吸收垫，其中：所述结合垫包含精胺检测抗体偶联物，所述精胺检测抗体偶联物包含经由一个或多个第一接头偶联至一个或多个精胺检测抗体的金纳米颗粒，其中所述一个或多个精胺检测抗体选择性地结合至精胺，并且所述精胺检测抗体偶联物是可移动的；所述膜从所述结合垫开始按顺序包括：测试区和对照区，其中所述测试区包含精胺载体蛋白偶联物，所述精胺载体蛋白偶联物包含经由第二接头偶联至载体蛋白的精胺，并且所述对照区包含二级抗体，其中所述二级抗体被固定在所述膜上，并且所述二级抗体结合至所述精胺检测抗体。

Description

用于前列腺癌筛查的基于侧流免疫测定的精胺快速检测
相关申请的交叉引用
本申请要求2023年3月21日提交的美国临时专利申请号63/453,491的优先权，该美国临时专利申请在此以引用方式整体并入。
背景技术
日益增长的前列腺癌(prostate cancer,PC)发病率已引起广泛关注，其位列男性常见癌症第二位1。由于人口老龄化和经济增长，预计该数字将继续增长2。尽管PC是一种缓慢扩散型癌症，但它在早期阶段不显示症状。目前针对PC的诊断方法大多是侵入性的方法。直肠指检是一种简单的测试，其涉及医生插入戴手套的手指。通过感觉异常肿块或增大来检查患者的直肠3,4。活检也被认为是PC诊断的可靠方法5,6。医生将针状探针插入前列腺中并收集组织用于显微镜检查。或者，开发了前列腺抗原(PSA)测试7作为一种侵入性较小的PC诊断方法。血液中的PSA水平被用作评估PC风险的参考。尽管上述测试方法被医生广泛使用，但它们会给患者带来可能的伤口、出血和疼痛。
最近的研究建议使用小分子作为癌症诊断的生物标志物8-13。其中，Spm是生物胺家族中的重要生物标志物之一。它还已被证明可用于PC的检测。已开发出一种基于石墨烯量子点和有机染料的荧光传感器用于Spm检测14。该传感器能够检测到人尿液样品中亚微摩尔水平的Spm。在另一份报告中，胃蛋白酶功能化的金纳米簇的猝灭被用作Spm检测的报告信号15。除了光学传感，Spm还可以通过电化学方法检测。最近关于使用塑料电极对Spm进行阻抗传感的工作呈现了用于PC的即时(point-of-care,POC)传感的可行性16。Spm的选择性归因于电极上的硼酸。尽管付出了努力，但已开发的传感器要么需要先进的仪器进行示值读数，要么需要电力供电。因此，开发低成本、便携且简单的传感器用于POC测试应用至关重要。
LFIA在COVID-19暴发中以夹心型式被用作用于快速筛查患者的POC装置17-19。该测试使用硝酸纤维素膜(NCM)上的浇铸线条在几十分钟内提供了简单的读出结果。LFIA的选择性归因于物种特异性抗体在纳米探针上的偶联。AuNP被用于读出结果，因为它们由于等离体激元吸收特性而呈现出强的光吸收，这使它们能够成为用于比色检测的有前景的候选物20-22。
因此，存在对用于检测液体样品中精胺的测试装置的需求。
发明内容
本文提供了一种用于检测液体样品中精胺的测试装置，所述测试装置按顺序包括：样品垫、结合垫、膜和吸收垫，其中：所述结合垫包含精胺检测抗体偶联物，所述精胺检测抗体偶联物包含经由一个或多个第一接头偶联至一个或多个精胺检测抗体的金纳米颗粒，其中所述一个或多个精胺检测抗体选择性地结合至精胺，并且所述精胺检测抗体偶联物是可移动的；所述膜从所述结合垫开始按顺序包括：测试区和对照区，其中所述测试区包含精胺载体蛋白偶联物，所述精胺载体蛋白偶联物包含经由第二接头偶联至载体蛋白的精胺，并且所述对照区包含二级抗体，其中所述二级抗体被固定在所述膜上，并且所述二级抗体结合至所述精胺检测抗体。
在某些实施方案中，所述金纳米颗粒是柠檬酸盐封端的金纳米颗粒。
在某些实施方案中，所述一个或多个第一接头中的每一个具有式：*-S(CH2)m(C＝O)NH**-，其中m是1-16，*表示所述金纳米颗粒的表面，并且N**表示存在于所述一个或多个精胺检测抗体中的氮。
在某些实施方案中，m是6-12。
在某些实施方案中，所述载体蛋白包括牛血清白蛋白、人血清白蛋白、钥孔血蓝蛋白、似鲍罗螺(Concholepas concholepas)血蓝蛋白或免疫球蛋白Fc结构域。
在某些实施方案中，所述二级抗体是免疫球蛋白G(IgG)抗体。
在某些实施方案中，所述样品垫还包含牛血清白蛋白和非离子表面活性剂，并且所述结合垫还包含非离子表面活性剂。
在某些实施方案中，所述第二接头是其中n是选自2-6的整数；表示存在于所述精胺中的氮，并且N#表示存在于所述载体蛋白中的氮。
在某些实施方案中，所述金纳米颗粒是柠檬酸盐封端的金纳米颗粒，所述载体蛋白是牛血清白蛋白，所述第二接头是其中n是选自2-5的整数；表示存在于所述精胺中的氮，并且N#表示存在于所述载体蛋白中的氮，所述一个或多个第一接头中的每一个具有式：*-S(CH2)m(C＝O)NH**-，其中m是8-12，*表示所述金纳米颗粒的表面，并且N**表示存在于所述一个或多个精胺检测抗体各自中的氮。
在某些实施方案中，通过沉积包含浓度为0.5-1.0mg/mL的所述精胺-载体蛋白的溶液来制备所述测试区。
在某些实施方案中，通过沉积包含浓度为至少0.05mg/mL的免疫球蛋白G(IgG)抗体的溶液来制备所述对照区。
在某些实施方案中，通过沉积包含浓度为0.5-1.0mg/mL的所述精胺-载体蛋白的溶液来制备所述测试区；并且通过沉积包含浓度为至少0.05mg/mL的免疫球蛋白G(IgG)抗体的溶液来制备所述对照区。
在某些实施方案中，m是10并且n是3。
在第二方面，本文提供了一种检测液体样品中精胺的方法，所述方法包括：提供本文所述的测试装置；将所述液体样品施加在所述样品垫上，使得所述液体样品从所述样品垫流动经过所述结合垫和所述膜到达所述吸收垫；检测所述测试区处视觉信号的存在或不存在；以及任选地检测所述对照区处视觉信号的存在或不存在，其中对所述测试区处视觉信号的存在或不存在的所述检测指示所述液体样品中的精胺。
在某些实施方案中，对所述测试区处视觉信号的存在或不存在的所述检测指示所述液体样品中高于阈值浓度的精胺。
在某些实施方案中，所述液体样品包含从受试者获得的尿液样品。
在某些实施方案中，所述液体样品还包含磷酸盐缓冲盐水。
在某些实施方案中，所述液体样品还包含牛血清白蛋白和非离子表面活性剂。
在某些实施方案中，所述样品垫还包含牛血清白蛋白和非离子表面活性剂，并且所述结合垫还包含非离子表面活性剂。
在某些实施方案中，所述液体样品包含从人受试者获得的尿液样品，并且所述方法还包括基于所述样品是否含有高于所述阈值浓度的精胺来确定所述人受试者罹患前列腺癌。
附图简单说明
当结合附图时，通过参考以下详细描述，本发明的前述方面和许多伴随的优点将变得更容易领会和理解。
图1用于Spm检测的LFIA装置的示意图
图2(a)合成后原样的Cit-AuNP的TEM图像(插图的比例尺为10nm)，(b)Cit-AuNP和MUA-AuNP的UV-vis吸收，(c)每个改性阶段AuNP的DLS大小，以及(d)AuNP的凝胶电泳。
图3使用0.125、0.25、0.5、0.75和1mg/mL对BSA-Spm浓度优化。
图4对运行缓冲液(RB)中2、1、0.2、0.1和0.02ppm的加标Spm的检测。
图5使用PUT和1,6-二氨基己烷作为干扰物对LFIA特异性测试，两个靶标均为0.2ppm。
图6显示在对照区对0.05、0.125、0.25和0.5mg/mL的抗兔IgG抗体浓度优化的测试结果。
图7显示使用48个临床尿液样品的LFIA结果。*指示PCa尿液样品。
具体实施方式
定义
在整个本公开中，除非上下文另有要求，否则词语“包含”或变化形式(诸如“包括”)应理解为暗示包括所述整数或整数的组，但不排除任何其他整数或整数的组。还应注意，在本公开中，特别是在权利要求和/或段落中，诸如“包含”等术语可具有美国专利法中赋予其的含义；例如，它们可意指“包括”；并且诸如“基本上由……组成””的术语具有美国专利法中赋予它们的含义，例如，它们允许未明确叙述的要素，但排除在现有技术中发现的或影响本发明的基本或新颖特征的要素。
此外，在整个本公开和权利要求中，除非上下文另有要求，否则词语“包括”或变化形式(诸如“包含”或“含有”)应理解为暗示包括所述整数或整数的组，但不排除任何其他整数或整数的组。
除非另有明确说明，否则本文中单数的使用包括复数，反之亦然。此外，除非另有明确说明，否则当在定量值之前使用术语“约”时，本教导还包括具体的定量值本身。如本文所用，除非另外指明或推断，否则术语“约”是指与标称值有±10％、±7％、±5％、±3％、±1％或±0％变化。
如本文所用，术语“抗体”涵盖来源于任何产生抗体的哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、兔和包括人在内的灵长类动物)的特异性地结合至目的抗原的抗体和其抗体片段。示例性抗体包括多克隆抗体、单克隆抗体和重组抗体；多特异性抗体(例如，双特异性抗体)；人源化抗体；鼠抗体；嵌合的小鼠-人、小鼠-灵长类、灵长类-人单克隆抗体；和抗独特型抗体。抗原结合分子可以是任何完整的抗体分子或其片段(例如，具有功能性抗原结合结构域)。
抗体片段是来源于全长抗体或与全长抗体相关的部分，优选包括其互补决定区(CDR)、抗原结合区或可变区。可用于本公开中的抗体片段的说明性示例包括Fab、Fab′、F(ab)2、F(ab′)2和Fv片段、scFv片段、双价抗体(diabody)、线性抗体、单链抗体分子、由抗体片段形成的多特异性抗体等。“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单个多肽链中。Fv多肽还可包含VH和VL结构域之间的多肽接头，这使得scFv能够形成用于抗原结合的期望结构。抗体片段可重组或通过酶消化产生。
本文提供了一种用于检测液体样品中精胺的测试装置，所述测试装置按顺序包括：样品垫、结合垫、膜和吸收垫，其中：所述结合垫包含精胺检测抗体偶联物，所述精胺检测抗体偶联物包含经由一个或多个第一接头偶联至一个或多个精胺检测抗体的金纳米颗粒，其中所述一个或多个精胺检测抗体选择性地结合至精胺，并且所述精胺检测抗体偶联物是可移动的；所述膜从所述结合垫开始按顺序包括：测试区和任选的对照区，其中所述测试区包含精胺载体蛋白偶联物，所述精胺载体蛋白偶联物包含经由第二接头偶联至载体蛋白的精胺，并且所述任选的对照区包含二级抗体，其中所述二级抗体被固定在所述膜上，并且所述二级抗体结合至所述精胺检测抗体。
图1中示出了示例性测试装置。测试装置(100)具有安装在任选的背衬卡(105)上的样品垫(101)、结合垫(102)、包含测试区(103A)和对照区(103B)的膜(103)以及吸收垫(104)。所有这些组件都是连续的和/或重叠的(例如，重叠2mm)，允许液体样品经由毛细管作用移动通过测试条。
样品垫包含能够接收待测定的液体样品并允许液体样品迁移至结合垫的材料。样品可包含选自以下的材料：纤维纸；由纤维素材料组成的微孔膜、纤维素、纤维素衍生物(诸如醋酸纤维素、硝酸纤维素)、玻璃纤维、纺织品(诸如天然棉和尼龙)、多孔凝胶和其组合。在某些实施方案中，样品垫还包含另外的试剂，诸如蛋白质、非离子表面活性剂和缓冲盐。在某些实施方案中，样品垫还包含一种或多种选自以下的另外的试剂：牛血清白蛋白、20、TritonTM X-100、甘油和聚乙二醇。
结合垫包含精胺检测抗体偶联物(通常为干燥和固定化形式)。当包含液体样品的RB流入结合垫中时，精胺检测抗体偶联物被移动，即，其从结合垫材料上升并与RB一起迁移至膜中，在此期间，如果液体样品中存在精胺，则形成精胺-精胺检测抗体偶联物复合物。
精胺检测抗体偶联物包含经由一个或多个第一接头偶联至一个或多个精胺检测抗体的金纳米颗粒。
一个或多个精胺检测抗体可相同或不同。一个或多个精胺检测抗体选择性地结合至精胺。在本文所述的测试装置和方法中使用的精胺检测抗体的类型没有特别限制，并且本公开涵盖能够选择性结合精胺的所有类型的精胺检测抗体。精胺检测抗体可来源于任何宿主物种。在某些实施方案中，宿主物种是大鼠物种、小鼠物种、豚鼠物种、仓鼠物种、兔物种、山羊物种、绵羊物种、鸡物种、驴物种、马物种、牛物种、犬物种、猫物种、猪物种、猴物种、人物种或任何其他物种。在某些实施方案中，宿主物种是兔物种。
在某些实施方案中，金纳米颗粒是通过一个或多个第一接头偶联至一个或多个精胺检测抗体的经柠檬酸盐封端的金纳米颗粒，其中一个或多个第一接头中的每一个具有式：*-S(CH2)m(C＝O)NH**-，其中m是1-16，*表示金纳米颗粒的表面，并且N**表示存在于一个或多个精胺检测抗体各自中的氮。
在某些实施方案中，m是1-16、2-16、3-16、4-16、5-16、6-16、7-16、8-16、8-14、10-16、10-15、10-14、10-13、10-12、6-14、7-13、8-12或9-11。在某些实施方案中，m是10。偶联至一个或多个具有式*-S(CH2)10CO2H、可用于制备本文所述的精胺检测抗体偶联物的接头的柠檬酸盐封端的金纳米颗粒，其合成描述于美国专利申请号15/929,495，其在此以引用方式整体并入。
膜可包含液体样品可通过毛细管作用扩散通过的任何材料。例如，膜可包含选自以下的材料：天然存在的材料、合成材料或通过合成变形的天然存在的材料，例如，多糖(例如，纤维素材料、纸、纤维素衍生物，诸如醋酸纤维素和硝酸纤维素)；聚醚砜；聚乙烯；尼龙；聚偏二氟乙烯；聚酯；聚丙烯；二氧化硅；与氯乙烯、氯乙烯-丙烯共聚物和氯乙烯-乙酸乙烯酯共聚物一起均匀分散在多孔聚合物基质中的无机材料，例如灭活的氧化铝、硅藻土、MgSO4或其他无机细粉材料；天然存在的纺织品(例如，棉)和合成的纺织品(例如，尼龙或人造丝)；多孔凝胶，例如，硅胶、琼脂糖、葡聚糖和明胶；聚合物膜，例如，聚丙烯酰胺；等。在某些实施方案中，膜包含硝酸纤维素、聚醚砜、聚乙烯、尼龙、聚偏二氟乙烯、聚酯、聚丙烯或其组合。
膜从结合垫开始按顺序包括测试区和对照区。
测试区包含精胺载体蛋白偶联物，所述精胺载体蛋白偶联物包含经由第二接头偶联至载体蛋白的精胺。载体蛋白有助于将精胺固定在测试区中。本公开对载体蛋白没有特别限制。因此，本公开涵盖了本领域中用于将分析物固定在LFIA测试装置中的任何载体蛋白。在某些实施方案中，载体蛋白是牛血清白蛋白、KLH、甲状腺球蛋白、似鲍罗螺血蓝蛋白(CCH)或卵清蛋白。在某些实施方案中，载体蛋白是牛血清白蛋白。
第二接头没有特别限制，并且可以是本领域中已知的能够将精胺共价偶联至载体蛋白的任何双功能接头。在某些实施方案中，第二接头是其中n是选自2-5、2-4、2-3或3-4的整数；表示存在于精胺中的氮，并且N#表示存在于载体蛋白中的氮。在某些实施方案中，n是3。
如图3中的稀释研究结果所示，当通过沉积浓度低于0.5mg/mL的精胺载体蛋白偶联物来制备测试区时，未观察到视觉信号。因此，可通过沉积浓度为至少0.5mg/mL的精胺载体蛋白偶联物的溶液来制备测试区。在某些实施方案中，可通过沉积浓度为0.5-1.0mg/mL的精胺载体蛋白偶联物的溶液来制备测试区。在某些实施方案中，可通过沉积浓度为约0.75mg/mL的精胺载体蛋白偶联物的溶液来制备测试区。
对照区包含固定在对照区表面上的二级抗体。二级抗体可以是对精胺检测抗体特异的物种特异性抗免疫球蛋白抗体。二级抗体可属于任何抗体类别(例如，IgG、IgA、IgD、IgE和IgM)或同种型。在某些实施方案中，二级抗体是IgG抗体，诸如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
如图6中的稀释研究结果所示，当通过沉积浓度低于0.05mg/mL的二级抗体来制备对照区时，未观察到视觉信号。可通过沉积浓度为至少0.05mg/mL、至少0.125mg/mL、至少0.25mg/mL或至少0.5mg/mL的二级抗体的溶液来制备对照区。在某些实施方案中，通过沉积浓度为0.05mg/mL至0.5mg/mL的二级抗体的溶液来制备对照。在某些实施方案中，通过沉积浓度为约0.25mg/mL的二级抗体的溶液来制备对照。
通常，测试区和对照区可具有任何形状，包括矩形形状、非矩形形状、圆形形状、半月形形状、椭圆形形状、加号形状、减号形状、一条线、多条线、符号、几何形状、字母数字形状或其任何组合。在某些实施方案中，测试区和对照区可以线的形式存在。因此，它们在本文中也可分别被称为“测试线”和“对照线”。
在某些实施方案中，测试装置还包括背衬卡，其中样品垫、结合垫、膜和吸收垫被设置在背衬卡的表面上。背衬卡可包含任何材料，只要背衬卡能够支撑样品垫、结合垫、膜和吸收垫。通常，优选背衬卡是液体不可渗透的，使得扩散通过膜的液体样品流体不会泄漏。用于背衬卡的材料可包括但不限于玻璃；聚合物材料，例如，聚苯乙烯、聚丙烯、聚酯、聚丁二烯、聚氯乙烯、聚酰胺、聚碳酸酯、环氧化物、甲基丙烯酸酯和聚三聚氰胺。
本公开还提供了一种检测液体样品中精胺的方法，所述方法包括：提供本文所述的测试装置；将所述液体样品施加在所述样品垫上，使得所述液体样品从所述样品垫流动经过所述结合垫和所述膜到达所述吸收垫；检测所述测试区处视觉信号的存在或不存在；以及任选地检测所述对照区处视觉信号的存在或不存在，其中对所述测试区处所述视觉信号的存在或不存在的检测指示所述液体样品中的精胺。
测试装置以竞争性测试测定模式操作，其涉及如果存在精胺，精胺与结合垫中的精胺检测抗体偶联物结合，从而形成精胺-精胺检测抗体偶联物复合物，该复合物与RB一起移动，即迁移。一旦RB中的液体样品接触测试区，液体样品中的任何游离精胺检测抗体偶联物就会形成精胺检测抗体偶联物-精胺载体蛋白偶联物复合物，这导致在测试区处产生视觉信号。一旦RB中的液体样品接触对照区，固定在对照区表面上的二级抗体就会与游离精胺检测抗体偶联物和/或精胺-精胺检测抗体偶联物复合物形成复合物，从而导致无论液体样品中是否存在精胺，都会在对照区处产生视觉信号。如图1中所示，当视觉信号存在于对照区但不存在于测试区时，这指示存在精胺(或高于阈值浓度的精胺浓度)，并且当视觉信号存在于对照区和测试区两者时，这指示不存在精胺(或低于阈值浓度的精胺浓度)。
在某些实施方案中，所述液体样品包含从人受试者获得的尿液样品，并且所述方法还包括基于液体样品是否含有高于阈值浓度的精胺来确定人受试者罹患前列腺癌、罹患前列腺癌的可能性增加和/或应接受另外的测试(例如，直肠指检、前列腺活检等)以确定人受试者是否罹患前列腺癌。
液体样品可包括生物样品、环境样品、食品样品等。示例性生物样品包括体液，诸如尿液、全血、唾液、汗液、血浆和血清。在某些实施方案中，液体样品包含尿液。
液体样品可还包含磷酸盐缓冲盐水，以及任选地牛血清白蛋白和非离子表面活性剂，诸如20、TritonTM X-100等。
可选地，液体样品可在添加至样品垫之前被稀释。在某些实施方案中，通过用稀释缓冲液以1:1-100(样品:稀释缓冲液)的体积比稀释样品来制备液体样品。示例性稀释缓冲液可包括磷酸盐缓冲盐水。
在下面的示例中，用BSA和20预处理样品垫和结合垫，以确保平稳流动并抑制非特异性结合。最佳BSA含量设定为1m/v％。LFIA中Spm的竞争性检测由结合垫处的AuNP-Spm-Ab和测试线处的BSA-Spm偶联物促进。AuNP-Spm-Ab首先结合至RB中的Spm，然后未反应的AuNP-Spm-Ab结合至测试线处的BSA-Spm偶联物。最后，流体通过带有IgG的对照线并被吸收垫吸收。阳性结果对应于两条线的出现，指示液体样品中Spm浓度不足和PC的风险。
金纳米颗粒的合成、改性和偶联
所制备的Cit-AuNP在TEM图像中呈现约13nm的大小和球形形态(图2(a)和插图)。通过MUA的硫醇-金化学吸附实现了从柠檬酸盐到羧酸的配体交换。图2(b)通过监测吸收最大值的位移指示成功的配体交换。曲线没有变宽，表明MUA交换没有引起聚集到AuNP。通过硼酸盐缓冲液中的一锅EDC/NHS偶联，Spm-Ab偶联至羧酸基团，靶向分子上的胺基。此后，将所制备的AuNP-Spm-Ab分散在含有蔗糖和20的PB中以防止沉淀。为了更深入地了解AuNP-Spm-Ab在缓冲液中的实际大小，在图2(c)中显示了每个改性步骤中AuNP的DLS大小。AuNP大小的增加与偶联步骤一致，大小分布也没有显著变宽。此外，图2(d)中的凝胶电泳图像提供了Spm-Ab成功偶联在AuNP上的更多证据。前两个泳道对应于Cit-AuNP和MUA-AuNP，而用AuNP-Anti标记的泳道由Spm-Ab组成。很明显，与Cit-AuNP和MUA-AuNP相比，AuNP-Spm-Ab迁移的距离更短。这归因于Spm-Ab的负载增加。
对照区和测试区的优化
测试线和对照线处BSA-spm和IgG的浓度对于可见信号至关重要。浓度不足会导致固定的受体对流的响应缓慢，因此没有可观察到的信号。
IgG直到浓度>0.05mg/mL时才产生清晰的信号，并且在0.25mg/mL显示与AuNP-Spm-Ab的强相互作用(图6)。因此，在整个实验中维持该浓度。
另一方面，直到BSA-Spm的浓度达到0.5mg/mL才观察到信号。1mg/mL BSA-Spm在测试线处提供了清晰的信号，因此选择该浓度用于后续LFIA的制造和测试。
使用侧流免疫测定检测精胺
将精胺以不同浓度(2、1、0.2、0.1和0.02ppm)加标至RB中，以测试用于筛查正常和潜在PC患者的截止浓度。测试进行10分钟，图3显示了各浓度条带的图像。在1和2ppm下，LFIA的对照线处显示单条红线。该观察结果归因于RB中反应的AuNP-Spm-ab与加标的Spm。结果，在测试线处没有结合。当Spm浓度降低至0.2ppm时，观察到两条线。测试线处出现微弱的红线是由于未反应的AuNP-Spm-ab与测试线处的BSA-Spm结合，这也指示了液体样品中Spm的量不足。由于未反应的AuNP-Spm-Ab的量增加，因此在0.1和0.02ppm的Spm下，测试线的强度进一步增强。
侧流免疫测定的特异性
用不同的胺对LFIA进行测试以研究其特异性。图5显示了用腐胺(PUT)和1,6-二氨基己烷进行的特异性测试的结果。PUT是生物胺家族中与Spm相似的生物胺25-27，而1,6-二氨基己烷具有与Spm相似的结构。将胺的浓度维持在0.2ppm，以便与Spm检测结果进行比较。LFIA均指示液体样品中Spm的量不足，这指示了LFIA的良好选择性。
结论
使用AuNP-Spm-Ab作为生物探针和BSA-Spm作为载体蛋白-偶联物，开发了用于Spm的竞争性LFIA检测。对AuNP-Spm-Ab、对照和测试线进行了优化，以提供0.2ppm的截止浓度，用于快速筛查潜在的PC患者。此外，用不同浓度的加标Spm液体样品对LFIA进行了测试。阳性结果指示低Spm浓度并暗示PC的风险。该传感器能够在大约10分钟内以高特异性确定液体样品的正常Spm浓度。所开发的用于Spm的LFIA有望用于未来的临床PC筛查应用。
实施例
材料
三水合氯化金(III)(HAuCl4)、柠檬酸三钠(Na3-Cit)、11-巯基十一酸(MUA)、蔗糖、20(聚氧乙烯(20)山梨聚糖单月桂酸酯)、硼酸盐缓冲液粉末和盐酸购自Sigma-Aldrich。1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)、磺基-NHS(N-羟基磺基琥珀酰亚胺)(S-NHS)、BSA粉末和磷酸盐缓冲液(PB,pH 7.4)粉末获自Thermofisher。抗精胺兔多克隆IgG(Spm-Ab)和山羊抗兔多克隆IgG(HRP)购自Abcam。BSA-Spm偶联物(精胺经由戊二醛接头偶联至BSA)购自Creative Diagnostics。化学品的纯度为分析级，且未经纯化即使用。使用来自MilliQ水纯化系统的超纯水制备所有稀释液和液体样品。对于LFIA装置组件，背衬卡购自Kenosha Tapes，而玻璃纤维液体样品和结合垫获自Millipore。吸收垫购自Whatman，并且NCM、Hi-Flow Plus、HF180购自Merck。
设备
使用透射电子显微镜(JEM-2100F,Jeol,Japan)检查金纳米颗粒的形态和大小。通过使用Agilent 8453二极管阵列分光光度计(Agilent Technologies,USA)记录UV-vis吸收光谱，并通过Zetasizer(Malvern,UK)监测每个改性阶段AuNP的流体动力学大小。使用侧流打印机(Agismart RP-2000,Rega Biotechnology Inc)在NC-M上分配测试线和对照线。使用侧流条带切割器(LFST0007,Lateral Flow Strip Cutter,China)切割LFIA。
实施例1-柠檬酸盐稳定的AuNP(Cit-AuNP)的制备
根据我们之前的工作合成Cit-AuNP22,24。简单地说，在磁力搅拌下，将1mL 2wt％Na3-Cit溶液添加至125mL锥形瓶中的25mL MilliQ中。此后，在剧烈搅拌下，将1.25mL 10mMHAuCl4溶液迅速移液至沸腾的柠檬酸盐溶液中。无色混合物逐渐变为黑色、紫色和红色，这归因于AuNP的形成。将柠檬酸盐-AuNP胶体溶液冷却至室温并储存在4℃用于进一步改性。
实施例2 -AuNP-Spm-Ab的制备
在室温搅拌下，将200μL 25mM MUA溶液添加至Cit-AuNP胶体中保持24h。将MUA-AuNP胶体保持在4℃直至进一步使用。然后，经由碳化二亚胺化学将Spm-Ab偶联至MUA-AuNP。简单地说，在振荡下，将2.5μL EDC·HCl(50mM)和S-NHS(50mM)添加至10mM硼酸盐缓冲液(pH 8)中的200uL MUA-AuNP中。然后，将5μL 100倍稀释的Spm-Ab添加至混合物中并反应2小时。通过离心纯化所得的Au-Spm-Ab，并将其分散在PB(5％蔗糖和0.5％20)中。
实施例3-LFIA的制备
在组装至背衬卡上之前，对液体样品和结合垫进行预处理。将样品垫用由1％ BSA和0.5％20组成的10mM PB缓冲液浸泡1h，而将结合垫用含有5％蔗糖和0.5％20的10mM PB处理1h。将预处理的垫在37℃干燥4h。另一方面，将1nM AuNP-Spm-Ab喷雾在结合垫上并在37℃干燥过夜。将分配速率设定为0.100μL/mm来制造条带。将BSA-Spm偶联物(1mg/mL)和山羊抗兔IgG(0.25mg/mL)分别作为测试区和对照区分配至硝酸纤维素膜上。将组件以1mm的重叠组装至背衬卡上，并在37℃干燥过夜。此后，将LFIA切割成3mm宽并储存在干燥箱中。
实施例4-用加标Spm液体样品进行侧流测定
将Spm溶液以2、1、0.5、0.2和0.1ppm添加至含有10mM PB、1％BSA和0.5％20的RB中。添加至LFIA的总体积为60μL，并且进行10分钟完成测定。
实施例5–临床尿液样品测试和前列腺癌的诊断
从男性患者获得总共48份临床尿液样品，15份被诊断为患有前列腺癌(PCa)，其余33份样品被评估为没有恶性肿瘤(NEM)的迹象。通过液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)定量这些临床样品中的Spm水平。来自PCa的Spm水平的范围为18.64–2287.08ppb，中位数为156.19ppb，而来自NEM的Spm水平的范围为54.20–2790.33ppb，中位数为366.11ppb。
通过将25μL临床尿液样品与25μL运行缓冲液(10mM磷酸盐缓冲液(PB),1％ BSA,0.5％20,pH 7.4)充分混合来制备用于LFIA的样品。LFIA通过快速感测Spm被用作筛查前列腺癌的工具。将样品施加至样品垫上，并经过15分钟以确保对照区和/或测试区的稳定可视化。结果示于图7中，并且试剂盒具有86.7％的灵敏度和36.3％的特异性。
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Claims (20)

1.一种用于检测液体样品中精胺的测试装置，所述测试装置按顺序包括：样品垫、结合垫、膜和吸收垫，其中：
所述结合垫包含精胺检测抗体偶联物，所述精胺检测抗体偶联物包含经由一个或多个第一接头偶联至一个或多个精胺检测抗体的金纳米颗粒，其中所述一个或多个精胺检测抗体选择性地结合至精胺，并且所述精胺检测抗体偶联物是可移动的；
所述膜从所述结合垫开始按顺序包括：测试区和对照区，其中所述测试区包含精胺载体蛋白偶联物，所述精胺载体蛋白偶联物包含经由第二接头偶联至载体蛋白的精胺，并且所述对照区包含二级抗体，其中所述二级抗体被固定在所述膜上，并且所述二级抗体结合至所述精胺检测抗体。
2.根据权利要求1所述的测试装置，其中所述金纳米颗粒是柠檬酸盐封端的金纳米颗粒。
3.根据权利要求1所述的测试装置，其中所述一个或多个第一接头中的每一个具有式：*-S(CH2)m(C＝O)NH**-，其中m是1-16，*表示所述金纳米颗粒的表面，并且N**表示存在于所述一个或多个精胺检测抗体中的氮。
4.根据权利要求3所述的测试装置，其中m是6-12。
5.根据权利要求1所述的测试装置，其中所述载体蛋白包括牛血清白蛋白、人血清白蛋白、钥孔血蓝蛋白、似鲍罗螺(Concholepas concholepas)血蓝蛋白或免疫球蛋白Fc结构域。
6.根据权利要求1所述的测试装置，其中所述二级抗体是免疫球蛋白G(IgG)抗体。
7.根据权利要求1所述的测试装置，其中所述样品垫还包含牛血清白蛋白和非离子表面活性剂，并且所述结合垫还包含非离子表面活性剂。
8.根据权利要求1所述的测试装置，其中所述第二接头是其中n是选自2-6的整数；表示存在于所述精胺中的氮，并且N#表示存在于所述载体蛋白中的氮。
9.根据权利要求1所述的测试装置，其中所述金纳米颗粒是柠檬酸盐封端的金纳米颗粒，所述载体蛋白是牛血清白蛋白，所述第二接头是其中n是选自2-5的整数；表示存在于所述精胺中的氮，并且N#表示存在于所述载体蛋白中的氮，所述一个或多个第一接头中的每一个具有式：*-S(CH2)m(C＝O)NH**-，其中m是8-12，*表示所述金纳米颗粒的表面，并且N**表示存在于所述一个或多个精胺检测抗体各自中的氮。
10.根据权利要求9所述的测试装置，其中通过沉积包含浓度为0.5-1.0mg/mL的所述精胺-载体蛋白的溶液来制备所述测试区。
11.根据权利要求9所述的测试装置，其中通过沉积包含浓度为至少0.05mg/mL的免疫球蛋白G(IgG)抗体的溶液来制备所述对照区。
12.根据权利要求9所述的测试装置，其中通过沉积包含浓度为0.5-1.0mg/mL的所述精胺-载体蛋白的溶液来制备所述测试区；并且通过沉积包含浓度为至少0.05mg/mL的免疫球蛋白G(IgG)抗体的溶液来制备所述对照区。
13.根据权利要求12所述的测试装置，其中m是10并且n是3。
14.一种检测液体样品中精胺的方法，所述方法包括：
提供根据权利要求1所述的测试装置；
将所述液体样品施加在所述样品垫上，使得所述液体样品从所述样品垫流动经过所述结合垫和所述膜到达所述吸收垫；
检测所述测试区处视觉信号的存在或不存在；以及
任选地检测所述对照区处视觉信号的存在或不存在，
其中对所述测试区处所述视觉信号的存在或不存在的所述检测指示所述液体样品中的精胺。
15.根据权利要求14所述的方法，其中对所述测试区处所述视觉信号的存在或不存在的所述检测指示所述液体样品中高于阈值浓度的精胺。
16.根据权利要求14所述的方法，其中所述液体样品包含从受试者获得的尿液样品。
17.根据权利要求14所述的方法，其中所述液体样品还包含磷酸盐缓冲盐水。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述液体样品还包含牛血清白蛋白和非离子表面活性剂。
19.根据权利要求17所述的方法，其中所述样品垫还包含牛血清白蛋白和非离子表面活性剂，并且所述结合垫还包含非离子表面活性剂。
20.根据权利要求15所述的方法，其中所述液体样品包含从人受试者获得的尿液样品，并且所述方法还包括基于所述样品是否含有高于所述阈值浓度的精胺来确定所述人受试者罹患前列腺癌。
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