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CN120936627A - Muc1抗体及使用方法 - Google Patents

Muc1抗体及使用方法

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Publication number
CN120936627A
CN120936627A CN202480015951.8A CN202480015951A CN120936627A CN 120936627 A CN120936627 A CN 120936627A CN 202480015951 A CN202480015951 A CN 202480015951A CN 120936627 A CN120936627 A CN 120936627A
Authority
CN
China
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seq
variable region
chain variable
antibody
amino acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202480015951.8A
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English (en)
Inventor
刘琦
陈欣
陈运
薛柳
李仁柯
李沛祺
邵婷
汪文捷
潘洁
李卓
唐晓燕
黄骐骐
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beigene Guangzhou Biologics Manufacturing Co Ltd
Original Assignee
Beigene Guangzhou Biologics Manufacturing Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beigene Guangzhou Biologics Manufacturing Co Ltd filed Critical Beigene Guangzhou Biologics Manufacturing Co Ltd
Publication of CN120936627A publication Critical patent/CN120936627A/zh
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Abstract

本公开提供了结合至人MUC1的抗体及其抗原结合片段，以及包含所述抗体的药物组合物。

Description

MUC1抗体及使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2023年3月12日提交的标题为“MUC1 Antibodies and Methods ofUse”的PCT申请号PCT/CN2023/080961、2023年3月3日提交的标题为“MUC1 and CD16AAntibodies and Methods of Use”的PCT申请号PCT/CN2023/079507和2023年7月17日提交的标题为“MUC1 and CD16AAntibodies and Methods of Use”的PCT申请号PCT/CN2023/107724的优先权权益，所述申请特此以引用的方式整体并入。
序列表
本申请与电子格式的序列表一起提交。序列表以创建于2024年2月27日的标题为“01368-0023-00PCT_SL.xml”的文件提供，所述文件大小为121,339字节。电子格式的序列表中的信息以引用的方式整体并入本文。
技术领域
本文公开了结合至人MUC1的抗体或其抗原结合片段及其使用方法。
背景技术
粘蛋白1(MUC1；也称为CA15-3、EMA、MCD、PEM、PUM、KL-6、MAM6、MCKD、PEMT、CD227、H23AG、MCKD1、ADMCKD、ADTKD2)是属于粘蛋白家族的单次跨膜糖蛋白。MUC1是高度糖基化的，并且在内衬包括肺、乳腺、胃、胰腺和子宫的各种正常组织的粘膜表面的上皮细胞的顶端表面表达。MUC1在这些上皮表面形成保护性粘液屏障方面起着至关重要的作用。
MUC1被翻译为单一多肽，其细胞外部分在SEA(海胆精子蛋白、肠激酶和集聚蛋白)结构域处经历自我切割为两个亚基。含有20-125个20个氨基酸序列的重复序列(可变数目串联重复序列(variable number tandem repeat)，VNTR)的切割的细胞外膜远端亚基，经由强非共价相互作用与膜近端亚基形成异二聚体复合物；膜近端亚基由58个氨基酸(aa)细胞外结构域、28个aa跨膜结构域和72个aa细胞质尾组成，所述细胞质尾与多个致癌信号传导通路相交。
MUC1在多种高发性人癌症，包括肺癌、乳腺癌、结肠癌、胃癌、食道癌和卵巢癌中异常过表达。除了表达上调之外，MUC1低糖基化和细胞定位的变化也与癌症相关。此外，切割的膜远端亚基具有从癌细胞表面脱落的趋势，并伴随血浆水平的增加。
考虑到其在多种人癌症中的过表达，MUC1是有吸引力的肿瘤相关抗原。然而，靶向膜远端(MUC1 N末端)亚基(诸如AS1402(huHMFG-1)和BrevaRex(AR-20.5))的先前尝试均未成功。此是部分由于脱落的MUC1的循环池阻止了抗体靶向表达MUC1的肿瘤细胞的表面。相反，未脱落的MUC1膜近端(MUC1 C末端)亚基(其作为癌蛋白发挥作用)代表开发基于抗体的治疗剂的有吸引力的靶标。
本公开提供了靶向MUC1膜近端区域(特别是MUC1-SEA结构域，其与MUC1-C末端的跨膜区相邻)的抗MUC1抗体，受脱落的MUC1的干扰最小。
发明内容
本公开涉及抗MUC1抗体及其抗原结合片段。
在实施方案中，本公开涉及抗MUC1抗体及其抗原结合片段，所述抗MUC1抗体及其抗原结合片段特异性结合至癌细胞并且不结合至正常细胞。
在实施方案中，本公开涉及一种抗MUC1抗体或其抗原结合片段，所述抗MUC1抗体或其抗原结合片段包括在氨基酸1036至1155(SEQ ID NO:2)处特异性结合至人MUC1的SEA结构域(SEQ ID NO:1)的抗体或其结合片段。
在实施方案中，本公开涉及一种特异性结合至人MUC1的抗MUC1抗体或抗原结合片段，所述抗MUC1抗体或抗原结合片段包含：
(i).重链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:4的HCDR1(重链互补决定区1)、(b)SEQ IDNO:5的HCDR2和(c)SEQ ID NO:6的HCDR3，以及轻链可变区，其包含：(d)SEQ ID NO:7的LCDR1(轻链互补决定区1)、(e)SEQ ID NO:8的LCDR2和(f)SEQ ID NO:9的LCDR3；
(ii).重链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:4的HCDR1、(b)SEQ ID NO:5的HCDR2和(c)SEQ ID NO:6的HCDR3，以及轻链可变区，其包含：(d)SEQ ID NO:7的LCDR1、(e)SEQ IDNO:56的LCDR2和(f)SEQ ID NO:9的LCDR3；
(iii).重链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:14的HCDR1、(b)SEQ ID NO:15的HCDR2和(c)SEQ ID NO:16的HCDR3，以及轻链可变区，其包含：(d)SEQ ID NO:17的LCDR1、(e)SEQID NO:18的LCDR2和(f)SEQ ID NO:19的LCDR3；
(iv).重链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:78的HCDR1、(b)SEQ ID NO:79的HCDR2和(c)SEQ ID NO:16的HCDR3，以及轻链可变区，其包含：(d)SEQ ID NO:17的LCDR1、(e)SEQ IDNO:18的LCDR2和(f)SEQ ID NO:19的LCDR3；
(v).重链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:24的HCDR1、(b)SEQ ID NO:25的HCDR2和(c)SEQ ID NO:26的HCDR3，以及轻链可变区，其包含：(d)SEQ ID NO:27的LCDR1、(e)SEQ IDNO:28的LCDR2和(f)SEQ ID NO:29的LCDR3；
(vi).重链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:24的HCDR1、(b)SEQ ID NO:25的HCDR2和(c)SEQ ID NO:26的HCDR3，以及轻链可变区，其包含：(d)SEQ ID NO:27的LCDR1、(e)SEQ IDNO:65的LCDR2和(f)SEQ ID NO:29的LCDR3；或
(vii).重链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:24的HCDR1、(b)SEQ ID NO:74的HCDR2和(c)SEQ ID NO:26的HCDR3，以及轻链可变区，其包含：(d)SEQ ID NO:27的LCDR1、(e)SEQID NO:65的LCDR2和(f)SEQ ID NO:29的LCDR3。
在实施方案中，抗MUC1抗体或其抗原结合片段包含：
(i).包含与SEQ ID NO:10至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的重链可变区(VH)和包含与SEQ ID NO:11至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的轻链可变区(VL)；
(ii).包含与SEQ ID NO:20至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的重链可变区(VH)和包含与SEQ ID NO:21至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的轻链可变区(VL)；
(iii).包含与SEQ ID NO:30至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的重链可变区(VH)和包含与SEQ ID NO:31至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的轻链可变区(VL)；
(iv).包含与SEQ ID NO:57至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的重链可变区(VH)和包含与SEQ ID NO:59至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的轻链可变区(VL)；
(v).包含与SEQ ID NO:57至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的重链可变区(VH)和包含与SEQ ID NO:60至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的轻链可变区(VL)；
(vi).包含与SEQ ID NO:58至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的重链可变区(VH)和包含与SEQ IDNO:59至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的轻链可变区(VL)；
(vii).包含与SEQ ID NO:58至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的重链可变区(VH)和包含与SEQ ID NO:60至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的轻链可变区(VL)；
(viii).包含与SEQ ID NO:61至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的重链可变区(VH)和包含与SEQ ID NO:62至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的轻链可变区(VL)；
(ix).包含与SEQ ID NO:61至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的重链可变区(VH)和包含与SEQ ID NO:66至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的轻链可变区(VL)；
(x).包含与SEQ ID NO:61至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的重链可变区(VH)和包含与SEQ ID NO:68至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的轻链可变区(VL)；
(xi).包含与SEQ ID NO:71至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的重链可变区(VH)和包含与SEQ ID NO:72至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的轻链可变区(VL)；
(xii).包含与SEQ ID NO:75至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的重链可变区(VH)和包含与SEQ ID NO:76至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的轻链可变区(VL)；或
(xiii).包含与SEQ ID NO:80至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的重链可变区(VH)和包含与SEQ ID NO:81至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
在实施方案中，抗MUC1抗体或其抗原结合片段包含：
(i).包含SEQ ID NO:10的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO:11的轻链可变区(VL)；
(ii).包含SEQ ID NO:20的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO:21的轻链可变区(VL)；
(iii).包含SEQ ID NO:30的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO:31的轻链可变区(VL)；
(iv).包含SEQ ID NO:57的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO:59的轻链可变区(VL)；
(v).包含SEQ ID NO:57的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO:60的轻链可变区(VL)；
(vi).包含SEQ ID NO:58的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO:59的轻链可变区(VL)；
(vii).包含SEQ ID NO:58的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO:60的轻链可变区(VL)；
(viii).包含SEQ ID NO:61的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO:62的轻链可变区(VL)；
(ix).包含SEQ ID NO:61的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO:66的轻链可变区(VL)；
(x).包含SEQ ID NO:61的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO:68的轻链可变区(VL)；
(xi).包含SEQ ID NO:71的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO:72的轻链可变区(VL)；
(xii).包含SEQ ID NO:75的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO:76的轻链可变区(VL)；或
(xiii).包含SEQ ID NO:80的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO:81的轻链可变区(VL)。
在实施方案中，在抗MUC1抗体或其抗原结合片段中，SEQ ID NO:10、11、20、21、30、31、57、58、59、60、61、62、66、68、71、72、75、76、80或81内的一、二、三、四、五、六、七、八、九或十个氨基酸已被插入、缺失或取代。
在实施方案中，抗MUC1抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人工程化抗体、单链抗体(scFv)、Fab片段、Fab'片段或F(ab')2片段。
在实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含scFv，所述scFv包含含有与SEQ IDNO:57、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:75或SEQ ID NO:80的氨基酸至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的重链可变区(VH)和含有与SEQ IDNO:60、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:76或SEQ ID NO:81至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的VL。
在实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含scFv，所述scFv包含具有SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:75或SEQ ID NO:80的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:76或SEQ ID NO:81的氨基酸序列的VL。
在实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含scFv，所述scFv包含：
(i).包含与SEQ ID NO:57至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的VH和包含与SEQ ID NO:60至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的VL；
(ii).包含与SEQ ID NO:71至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的VH和包含与SEQ ID NO:72至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的VL；
(iii).包含与SEQ ID NO:75至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的VH和包含与SEQ ID NO:76至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的VL；或
(iv).包含与SEQ ID NO:80至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的VH和包含与SEQ ID NO:81至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的VL。
在实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含scFv，所述scFv包含：
(i).具有SEQ ID NO:57的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:60的氨基酸序列的VL；
(ii).具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:72的氨基酸序列的VL；
(iii).具有SEQ ID NO:75的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:76的氨基酸序列的VL；或
(iv).具有SEQ ID NO:80的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:81的氨基酸序列的VL。
在实施方案中，在抗MUC1抗体或其抗原结合片段中，SEQ ID NO:57、60、71、72、75、76、80或81内的一、二、三、四、五、六、七、八、九或十个氨基酸已被插入、缺失或取代。
在实施方案中，抗MUC1抗体或其抗原结合片段的scFv的VH和VL经由氨基酸接头连结。氨基酸接头可具有SEQ ID NO:83或84的氨基酸序列。
在实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:77或SEQ ID NO:82的氨基酸序列的scFv。
在实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQ ID NO:70、73、77或82至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的scFv。
在实施方案中，在抗MUC1抗体或其抗原结合片段中，SEQ ID NO:70、73、77或82内的一、二、三、四、五、六、七、八、九或十个氨基酸已被插入、缺失或取代。
在实施方案中，抗MUC1抗体或其抗原结合片段表现抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)。在实施方案中，ADCC是针对表达MUC1的靶细胞。
在实施方案中，抗MUC1抗体或其抗原结合片段具有降低的糖基化或无糖基化或低岩藻糖基化。
在实施方案中，抗MUC1抗体或其抗原结合片段包含增加的二等分GlcNac结构。
在实施方案中，抗MUC1抗体或其抗原结合片段是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型。在实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的亚类的重链恒定区和/或κ或λ类型的轻链恒定区。在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含野生型人IgG1(也称为人IgG1wt或huIgG1)或IgG2的Fc结构域。在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含IgG1 Fc结构域。
在实施方案中，本公开涉及一种药物组合物，其包含抗MUC1抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载剂。
在实施方案中，本公开涉及一种分离的核酸，其编码本文所公开的抗MUC1抗体或其抗原结合片段。
在实施方案中，本公开涉及一种载体，其包含本文所公开的核酸。
在实施方案中，本公开涉及一种宿主细胞，其包含本文所公开的核酸或本文所公开的载体。
在实施方案中，本公开涉及一种用于产生抗MUC1抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括培养本文所公开的宿主细胞以及从培养物中回收抗体或抗原结合片段。
在一个实施方案中，抗MUC1抗体或其抗原结合片段包含一个或多个互补决定区(CDR)，所述CDR包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:14、SEQ IDNO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:78、SEQ IDNO:79、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:29和SEQ ID NO:65。
在另一实施方案中，抗MUC1抗体或其抗原结合片段包含：(a)包含一个或多个互补决定区的重链可变区(HCDR)，所述HCDR包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:78或SEQ ID NO:79；和/或(b)包含一个或多个互补决定区的轻链可变区(LCDR)，所述LCDR具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:65。
在另一实施方案中，抗MUC1抗体或其抗原结合片段包含：(a)包含三个互补决定区的重链可变区(HCDR)，所述HCDR是包含SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:24或SEQID NO:78的氨基酸序列的HCDR1；包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:25、SEQ IDNO:74或SEQ ID NO:79的氨基酸序列的HCDR2；以及包含SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:16或SEQID NO:26的氨基酸序列的HCDR3，和/或(b)包含三个互补决定区的轻链可变区(LCDR)，所述LCDR是包含SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:27的氨基酸序列的LCDR1；包含SEQID NO:8、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:56或SEQ ID NO:65的氨基酸序列的LCDR2；以及包含SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:29的氨基酸序列的LCDR3。
在另一实施方案中，抗MUC1抗体或其抗原结合片段包含：
(a)包含三个互补决定区的重链可变区(HCDR)，所述HCDR是
包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HCDR1，
包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HCDR2，以及
包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HCDR3；或
包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HCDR1，
包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的HCDR2，以及
包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的HCDR3；或
包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的HCDR1，
包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的HCDR2，以及
包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的HCDR3；或
包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的HCDR1，
包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的HCDR2，以及
包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的HCDR3；或
包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列的HCDR1，
包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列的HCDR2，以及
包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的HCDR3；和/或
(b)包含三个互补决定区的轻链可变区(LCDR)，所述LCDR是
包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的LCDR1，
包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的LCDR2，以及
包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的LCDR3；或
包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的LCDR1，
包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的LCDR2，以及
包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的LCDR3；或
包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的LCDR1，
包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的LCDR2，以及
包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的LCDR3；或
包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的LCDR1，
包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列的LCDR2，以及
包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的LCDR3；或
包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的LCDR1，
包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列的LCDR2，以及
包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的LCDR3。
在另一实施方案中，抗MUC1抗体或其抗原结合片段包含：重链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:4的HCDR1、(b)SEQ ID NO:5的HCDR2和(c)SEQ ID NO:6的HCDR3，以及轻链可变区，其包含：(d)SEQ ID NO:7的LCDR1、(e)SEQ ID NO:8的LCDR2和(f)SEQ ID NO:9的LCDR3。
在另一实施方案中，抗MUC1抗体或其抗原结合片段包含：重链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:4的HCDR1、(b)SEQ ID NO:5的HCDR2和(c)SEQ ID NO:6的HCDR3，以及轻链可变区，其包含：(d)SEQ ID NO:7的LCDR1、(e)SEQ ID NO:56的LCDR2和(f)SEQ ID NO:9的LCDR3。
在另一实施方案中，抗MUC1抗体或其抗原结合片段包含：重链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:14的HCDR1、(b)SEQ ID NO:15的HCDR2和(c)SEQ ID NO:16的HCDR3，以及轻链可变区，其包含：(d)SEQ ID NO:17的LCDR1、(e)SEQ ID NO:18的LCDR2和(f)SEQ ID NO:19的LCDR3。
在另一实施方案中，抗MUC1抗体或其抗原结合片段包含：重链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:78的HCDR1、(b)SEQ ID NO:79的HCDR2和(c)SEQ ID NO:16的HCDR3，以及轻链可变区，其包含：(d)SEQ ID NO:17的LCDR1、(e)SEQ ID NO:18的LCDR2和(f)SEQ ID NO:19的LCDR3。
在另一实施方案中，抗MUC1抗体或其抗原结合片段包含：重链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:24的HCDR1、(b)SEQ ID NO:25的HCDR2和(c)SEQ ID NO:26的HCDR3，以及轻链可变区，其包含：(d)SEQ ID NO:27的LCDR1、(e)SEQ ID NO:28的LCDR2和(f)SEQ ID NO:29的LCDR3。
在另一实施方案中，抗MUC1抗体或其抗原结合片段包含：重链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:24的HCDR1、(b)SEQ ID NO:25的HCDR2和(c)SEQ ID NO:26的HCDR3，以及轻链可变区，其包含：(d)SEQ ID NO:27的LCDR1、(e)SEQ ID NO:65的LCDR2和(f)SEQ ID NO:29的LCDR3。
在另一实施方案中，抗MUC1抗体或其抗原结合片段包含：重链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:24的HCDR1、(b)SEQ ID NO:74的HCDR2和(c)SEQ ID NO:26的HCDR3，以及轻链可变区，其包含：(d)SEQ ID NO:27的LCDR1、(e)SEQ ID NO:65的LCDR2和(f)SEQ ID NO:29的LCDR3。
在一个实施方案中，抗MUC1抗体或其抗原结合片段包含：(a)具有SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:75或SEQ ID NO:80的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:20、SEQID NO:30、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:75或SEQ ID NO:80中的任一个至少95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的重链可变区，和/或(b)包含SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:76或SEQ IDNO:81的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:76或SEQ ID NO:81中的任一个至少95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的轻链可变区。
在另一实施方案中，抗MUC1抗体或其抗原结合片段包含：(a)包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:75或SEQ ID NO:80的氨基酸序列，或者在SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:20、SEQID NO:30、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:75或SEQ ID NO:80的氨基酸序列中包含一个、两个或三个氨基酸取代的氨基酸序列的重链可变区，和/或(b)包含SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:76或SEQ IDNO:81的氨基酸序列，或者在SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:76或SEQ ID NO:81的氨基酸中包含一个、两个、三个、四个或五个氨基酸取代的氨基酸序列的轻链可变区。在另一实施方案中，氨基酸取代是保守氨基酸取代。
在一个实施方案中，抗MUC1抗体以1x 10-6M至1x 10-10M或至1x 10-11M的结合亲和力(KD)结合至MUC1。在另一实施方案中，抗MUC1抗体以约1x 10-6M、约1x 10-7M、约1x 10-8M、约1x 10-9M、约1x 10-10M或约1x10-11M的KD结合至MUC1。
在另一实施方案中，抗人MUC1抗体或其抗原结合片段显示出针对食蟹猴MUC1的跨物种结合活性。
在一些实施方案中，本公开涉及分离的核酸，其包含编码抗MUC1抗体或抗原结合片段的氨基酸序列的核苷酸序列。在一个实施方案中，分离的核酸包含SEQ ID NO:12、SEQID NO:22、SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:63的VH核苷酸序列，或者包含与SEQ ID NO:12、SEQID NO:22、SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:63至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列，并且编码本公开的抗体或抗原结合片段的VH区。在一个实施方案中，分离的核酸包含SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:67或SEQ IDNO:69的VL核苷酸序列，或者包含与SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:33、SEQ IDNO:64、SEQ ID NO:67或SEQ ID NO:69至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列，并且编码本公开的抗体或抗原结合片段的VL区。
在一些实施方案中，本公开提供了抗人MUC1抗体或其抗原结合片段，所述抗人MUC1抗体或其抗原结合片段对人MUC1表现出特异性结合和高亲和力。
附图说明
图1是MUC1-SEA-mIgG2a(顶部图)和MUC1-SEA-huIgG1(底部图)的示意图，其中“N”是N末端，并且“C”是C末端。
图2A-2F显示了通过FACS测定进行的纯化的MUC1抗体与人和食蟹猴MUC1过表达细胞的结合亲和力，以人IgG1作为阴性对照。图2A和2B显示了嵌合抗MUC1单克隆抗体BG138P与过表达MUC1的人和食蟹猴细胞的结合亲和力。图2C和2D显示了嵌合BG346P与过表达MUC1的人和食蟹猴细胞的结合亲和力。图2E和2F显示了嵌合BG219P与过表达MUC1的人和食蟹猴细胞的结合亲和力。
图3A-3C显示了通过竞争性SPR测定进行的表位分箱测定，其中纯化的人MUC1-mFc抗原流过芯片表面并被抗小鼠IgG抗体捕获。
图4A-4F显示了可溶性MUC1对MUC1抗体与MUC1表达细胞的结合的效应。图4A-C显示了在存在可溶性MUC1的情况下，不同浓度(分别为30、3和0.3μg/ml)的chBG138P和chBG219P的结合概况，以HMFG1作为阳性对照，并且mIgG和hIgG1作为阴性对照。图4D-F显示了在存在可溶性MUC1的情况下，不同浓度(分别为30、3和0.3μg/ml)的chBG138P和chBG346P的结合概况，以HMFG1作为阳性对照，并且mIgG和hIgG1作为阴性对照。
图5A-5C显示了靶向MUC1膜近端区域的抗MUC1单克隆抗体chBG138P结合至MUC1阳性癌细胞系。图5A-5C显示了chBG138P以剂量依赖性方式结合至表达MUC1的肿瘤细胞系HCC827(图5A)、H1975(图5B)和T-47D(图5C)(以人IgG1作为阴性对照)。
图6显示了T细胞结合测定的FACS门控策略的示意图。虚线框显示抗体结合的T细胞的比例。
图7A-7H显示了靶向MUC1膜近端区域的嵌合抗MUC1单克隆抗体chBG138P(图7A、7B、7E和7F)、chBG219P(图7E和7F)或chBG346P(图7E和7F)并不结合至活化的T细胞，而靶向MUC1膜远端部分的抗体HMFG1(图7C和7D)和16A(图7G和7H)可结合至正常T细胞。
图8A-8D绘示了chBP138P以及人源化MUC1抗体BG138P-hz2和BG138P-hz4(图8A和8B)并不结合至正常T细胞，而靶向MUC1膜远端部分的抗体HMFG1(图8C和8D)结合至正常活化的T细胞。
图9A-9C是显示chBG138P诱导的癌细胞系中MUC1的内化的条形图。
图10A和10B显示了嵌合BG138P及其人源化抗体huBG138P-Hz1至huBG138P-Hz4与过表达MUC1的人和食蟹猴细胞的FACS结合。
图11显示了人源化抗体huBG219P-Bz0、huBG219P-E39和huBG219P-E43相当地结合至MUC1过表达细胞系ZR-75-1与嵌合抗体chBG219P相比相当。
图12显示了scFv1-78P、scFv2(scFv2-14P、scFv2-57P)和scFv3-20P之间的结合竞争测定的结果。
定义
除非本文件中下文或其他地方有明确定义，否则本文所用的所有其他技术和科学术语都具有本领域普通技术人员通常所理解的含义。
如本文(包括所附权利要求书中)所用，除非上下文另有清楚地规定，否则词语的单数形式诸如“一(a)”，“一(an)”和“所述(the)”包括其对应的复数指代物。
除非上下文另有清楚地规定，否则术语“或”用于意指术语“和/或”，并且与术语“和/或”可互换使用。
除非特别说明或从上下文明显可知，如本文所用，术语“约”是指如本领域普通技术人员所确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其部分视如何测量或确定所述值或组成，即测量系统的局限性而定。例如，“约”可意指按照本领域的实践在一个或多于一个标准差内。“约”可意指高达10％(即±10％)的范围。因此，“约”可理解为大于或小于规定值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％、0.01％或0.001％以内。例如，约5mg可包括4.5mg至5.5mg之间的任何量。此外，特别是对于生物系统或过程而言，所述术语可意指值的高达一个数量级或高达5倍。当本公开中提供特定值或组成时，除非另有说明，否则“约”的含义应假定为在所述特定值或组成的可接受误差范围内。
术语“MUC1”或“粘蛋白1”，也称为CA 15-3、EMA、MCD、PEM、PUM、KL-6、MAM6、MCKD、PEMT、CD227、H23AG、MCKD1、ADMCKD或ADTKD2，是粘蛋白家族的一个成员。人MUC1的氨基酸序列列为SEQ ID NO:1，并且也可在登录号P15941中找到。
如本文所用，当应用于动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体时，术语“施用(administration)”和“施用(administering)”意指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物与动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体的接触。细胞的处理涵盖试剂与细胞的接触，以及试剂与流体的接触，其中所述流体与细胞接触。
术语“受试者”或“患者”在本文中包括任何生物体，优选动物，更优选哺乳动物(例如大鼠、小鼠、狗、猫、兔、灵长类动物)，并且最优选人(例如包括或有风险患有本文所述的病症的患者)。
在一个方面，“治疗”任何疾病或病症是指改善疾病或病症(即减缓或阻止或减少疾病或其临床症状中的至少一者的发展)。在另一方面，“治疗(treat)”、“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指减轻或改善至少一个身体参数，包括患者可能无法辨别的那些参数。在又另一方面，“治疗(treat)”、“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指在身体上(例如，可辨别的症状的稳定)、生理上(例如，身体参数的稳定)或两者上调节疾病或病症。
如本文所用，术语“亲和力”是指抗体与抗原之间的相互作用的强度。在抗原内，抗体的可变区透过非共价力在许多位点与抗原相互作用。通常，相互作用越多，亲和力越强。
如本文所用，术语“抗体”(“Ab”)是指免疫球蛋白家族的多肽，其可非共价、可逆并且以特定方式结合对应抗原。例如，天然存在的IgG抗体是包含通过二硫键相互连结的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的四聚体。每条重链由重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区构成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3构成。每条轻链由轻链可变区(本文缩写为VL或Vκ)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域CL构成。VH和VL区可进一步细分为称为互补决定区(CDR)的高变区，其中散布着称为框架区(FR)的更保守的区。每个VH和VL由从氨基末端至羧基末端按以下次序排列的三个CDR和四个框架区(FR)构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)的结合。
CDR和框架区的位置可使用本领域各种熟知的定义来确定，例如Kabat、Chothia、AbM和IMGT(参见例如，Johnson等人,Nucleic Acids Res.,29:205-206(2001)；Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.,196:901-917(1987)；Chothia等人,Nature,342:877-883(1989)；Chothia等人,J.Mol.Biol.,227:799-817(1992)；Al-Lazikani等人,J.Mol.Biol.,273:927-748(1997)；Lefranc,M.-P.,The Immunologist,7,132-136(1999)；Lefranc,M.-P.等人,Dev.Comp.Immunol.,27,55-77(2003))。
术语“抗体”包括但不限于单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、抗独特型(抗Id)抗体和人工程化抗体。抗体可以是任何同种型/类别(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)或亚类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。
术语“嵌合抗体”意指由来自不同物种的结构域制成的分子，即将来自一个宿主物种(例如小鼠、兔、骆驼等)的抗体的可变结构域与来自不同物种(例如人)的抗体的恒定结构域融合。
在一些实施方案中，抗MUC1抗体包含至少一个抗原结合位点。在一些实施方案中，抗MUC1抗体包含来自本文所述的MUC1抗体的抗原结合片段。在一些实施方案中，抗MUC1抗体是分离的或重组的。在一些实施方案中，抗MUC1抗体还涵盖靶向MUC1作为至少一个臂以及靶向其他抗原作为另一臂的多特异性抗体。
术语“单克隆抗体”或“mAb”或“Mab”在本文中意指基本上同质的抗体的群体，即所述群体中的抗体分子在氨基酸序列上是相同的，除了可以少量存在的可能的天然存在的突变。相反，常规(多克隆)抗体制剂通常包括多种不同的抗体，所述抗体在其可变结构域，特别是其CDR中具有不同的氨基酸序列，所述氨基酸序列通常对不同的表位具有特异性。修饰语“单克隆”指示抗体从抗体的基本上同质的群体获得的特征，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。单克隆抗体(mAb)可通过本领域技术人员已知的方法获得。参见例如，Kohler等人,Nature 1975 256:495-497；美国专利号4,376,110；Ausubel等人,CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY 1992；Harlow等人,ANTIBODIES:A LABORATORYMANUAL,Cold spring Harbor Laboratory 1988；以及Colligan等人,CURRENT PROTOCOLSIN IMMUNOLOGY 1993。本文公开的抗体可以是任何免疫球蛋白类别，包括IgG、IgM、IgD、IgE、IgA以及它们的任何亚类，诸如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。产生单克隆抗体的杂交瘤可在体外或体内培养。通过体内生产可获得高滴度的单克隆抗体，其中将来自个体杂交瘤的细胞腹膜内注射到小鼠中，诸如原始致敏(pristine-primed)的Balb/c小鼠中，以产生含有高浓度的所需抗体的腹水。同种型IgM或IgG的单克隆抗体可使用本领域技术人员熟知的柱色谱方法从这种腹水或从培养物上清液中纯化。
通常，基本抗体结构单元包括四聚体。每个四聚体包括两对相同的多肽链，每对具有一条“轻链”(约25kDa)和一条“重链”(约50-70kDa)。每条链的氨基末端部分包括主要负责抗原识别的约100至110或更多个氨基酸的可变区。重链的羧基末端部分可限定主要负责效应功能的恒定区。通常，人轻链分类为κ和λ轻链。此外，人重链通常分类为α、δ、ε、γ或μ，并且分别将抗体的同种型定义为IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。
在轻链和重链中，可变区和恒定区通过约12或更多个氨基酸的“J”区连接，其中重链还包括约10个以上氨基酸的“D”区。
每个轻链/重链(VL/VH)对的可变区形成抗体结合位点。因此，通常，完整抗体具有两个结合位点。除了在双功能或双特异性抗体中，两个结合位点在初级序列中通常是相同的。
通常，重链和轻链两者的可变结构域都包含三个高变区，也称为“互补决定区(CDR)”，其位于相对保守的框架区(FR)之间。CDR通常通过框架区排列，使得能够结合至特定表位。通常，从N末端至C末端，轻链可变结构域和重链可变结构域都包含FR-1(或FR1)、CDR-1(或CDR1)、FR-2(FR2)、CDR-2(CDR2)、FR-3(FR3)、CDR-3(CDR3)和FR-4(FR4)。CDR和框架区的位置可使用本领域各种熟知的定义来确定，例如Kabat、Chothia、AbM和IMGT(参见例如，Johnson等人,Nucleic Acids Res.,29:205-206(2001)；Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.,196:901-917(1987)；Chothia等人,Nature,342:877-883(1989)；Chothia等人,J.Mol.Biol.,227:799-817(1992)；Al-Lazikani等人,J.Mol.Biol.,273:927-748(1997)ImMunoGenTics(IMGT)编号(Lefranc,M.-P.,The Immunologist,7,132-136(1999)；Lefranc,M.-P.等人,Dev.Comp.Immunol.,27,55-77(2003)(“IMGT”编号方案))。抗原组合位点的定义也描述于以下中：Ruiz等人,Nucleic Acids Res.,28:219-221(2000)；和Lefranc,M.P.,Nucleic Acids Res.,29:207-209(2001)；MacCallum等人,J.Mol.Biol.,262:732-745(1996)；和Martin等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:9268-9272(1989)；Martin等人,Methods Enzymol.,203:121-153(1991)；和Rees等人,In Sternberg M.J.E.(编),Protein Structure Prediction,Oxford University Press,Oxford,141-172(1996)。例如，在Kabat下，重链可变区(VH)中的CDR氨基酸残基编号为31-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)；并且轻链可变区(VL)中的CDR氨基酸残基编号为24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。在Chothia下，VH中的CDR氨基酸编号为26-32(HCDR1)、52-56(HCDR2)和95-102(HCDR3)；并且VL中的氨基酸残基编号为26-32(LCDR1)、50-52(LCDR2)和91-96(LCDR3)。通过组合Kabat和Chothia的CDR定义，CDR由人VH中的氨基酸残基26-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)以及人VL中的氨基酸残基24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)组成。在IMGT下，VH中的CDR氨基酸残基编号为大致26-35(HCDR1)、51-57(HCDR2)和93-102(HCDR3)，并且VL中的CDR氨基酸残基编号为大致27-32(LCDR1)、50-52(LCDR2)和89-97(LCDR3)(根据Kabat编号)。在IMGT下，可使用程序IMGT/DomainGapAlign确定抗体的CDR区。
术语“高变区”意指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。高变区包含来自“CDR”(例如轻链可变结构域中的LCDR1、LCDR2和LCDR3以及重链可变结构域中的HCDR1、HCDR2和HCDR3)的氨基酸残基。参见Kabat等人,(1991)Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(通过序列定义抗体的CDR区)；另外参见Chothia和Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917(通过结构定义抗体的CDR区)。术语“框架”或“FR”残基意指除本文定义为CDR残基的高变区残基之外的那些可变结构域残基。
除非另有指示，否则“抗原结合片段”意指抗体的抗原结合片段，即保留特异性结合至与全长抗体所结合的抗原的能力的抗体片段，例如保留一个或多个CDR区的片段。抗原结合片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双体抗体；线性抗体；单链抗体分子，例如单链Fv(ScFv)；纳米抗体(或VHH抗体)；由抗体片段形成的多特异性抗体；和双环肽(Hurov,K.等人,2021.Journal for ImmunoTherapy of Cancer,9(11))。
如本文所用，抗体或抗原结合抗体片段“特异性结合至”抗原(例如蛋白质)意指与其他蛋白质相比，抗体表现出与所述靶标的优先结合，但此特异性不需要绝对结合特异性。“特异性”或“选择性”结合反应决定了抗原在蛋白质的异质群体和其他生物制剂中，例如在生物样品、血液、血清、血浆或组织样品中的存在。因此，在某些指定的免疫测定条件下，当与背景水平相比时，抗体或其抗原结合片段特异性结合至特定抗原至少两倍，并且不会以显著量特异性结合至样品中存在的其他抗原。在一个方面，在指定的免疫测定条件下，当与结合的背景水平相比时，抗体或其抗原结合片段特异性结合至特定抗原至少十倍，并且不会以显著量特异性结合至样品中存在的其他抗原。
如本文所用，“抗原结合结构域”包含至少六个CDR(或就单一结构域抗体而言为三个CDR)并且特异性结合至表位。多特异性抗体(例如双特异性抗体)的“抗原结合结构域”包含特异性结合至第一表位的第一抗原结合结构域和特异性结合至第二表位的第二抗原结合结构域。多特异性抗体可为双特异性、三特异性、四特异性等，其抗原结合结构域针对每个特定表位。多特异性抗体可为多价的(例如双特异性四价抗体)，其包含多个抗原结合结构域，例如特异性结合至第一表位的2、3、4个或更多个抗原结合结构域和特异性结合至第二表位的2、3、4个或更多个抗原结合结构域。
术语“人抗体”在本文中意指仅包含人免疫球蛋白蛋白质序列的抗体。如果在小鼠、小鼠细胞或来源于小鼠细胞的杂交瘤中产生，则人抗体可含有鼠碳水化合物链。相似地，“小鼠抗体”或“大鼠抗体”意指分别仅包含小鼠或大鼠免疫球蛋白蛋白质序列的抗体。
术语“人源化”或“人源化抗体”意指含有来自非人(例如，鼠、兔、骆驼等)抗体以及人抗体的序列的抗体形式。此类抗体含有来源于非人免疫球蛋白的最小序列。一般而言，人源化抗体会包含基本上所有的至少一个并且通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有的高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，并且所有或基本上所有的FR区是人免疫球蛋白序列的FR区。人源化抗体还将任选地包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白恒定区的至少一部分。当需要区分人源化抗体与亲本(例如啮齿动物)抗体时，将前缀“hum”、“hu”、“Hu”或“h”添加至抗体克隆名称中。啮齿动物抗体的人源化形式将通常包含与亲本啮齿动物抗体相同的CDR序列，尽管可包括某些氨基酸取代以增加亲和力、增加人源化抗体的稳定性、去除翻译后修饰或出于其他原因。
术语“对应人种系序列”是指编码人可变区氨基酸序列或亚序列的核酸序列，所述核酸序列与由人种系免疫球蛋白可变区序列所编码的所有其他已知可变区氨基酸序列相比与参考可变区氨基酸序列或亚序列共享最高的确定氨基酸序列同一性。对应人种系序列也可指与所有其他评价的可变区氨基酸序列相比，与参考可变区氨基酸序列或亚序列具有最高氨基酸序列同一性的人可变区氨基酸序列或亚序列。对应人种系序列可为仅框架区、仅互补决定区、框架和互补决定区、可变区或序列或亚序列的其他组合。序列同一性可使用本文所述的方法来确定，例如，使用BLAST、ALIGN或本领域已知的另一比对算法来比对两个序列。对应人种系核酸或氨基酸序列可与参考可变区核酸或氨基酸序列具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。另外，如果抗体含有恒定区，则所述恒定区也来源于此类人序列，例如人种系序列或人种系序列的突变版本或含有来源于人框架序列分析的共有框架序列的抗体，例如，如Knappik等人,J.Mol.Biol.296:57-86,2000中所述。
术语“平衡解离常数”或“KD”或“M”是指解离速率常数(kd，时间-1)除以缔合速率常数(ka，时间-1，M-l)。可使用本领域任何已知的方法测量平衡解离常数。本公开的抗体通常将具有小于约10-7或10-8M，例如小于约10-9M或10-10M，在一些方面，小于约10-11M、10-12M或10-13M的平衡解离常数。
本文使用的术语“癌症”或“肿瘤”具有如本领域所理解的最广含义，并且是指哺乳动物中通常以失调的细胞生长为特征的生理疾患。在本公开的上下文中，癌症不限于某种类型或部位。
在本公开的上下文中，当提及氨基酸序列时，术语“保守取代”意指由新氨基酸取代原始氨基酸，所述新氨基酸基本上不改变抗体或片段的化学、物理和/或功能性质，例如其与MUC1的结合亲和力。常见的氨基酸保守取代是本领域熟知的。
如本文所用，术语“杵臼(knob-into-hole)”技术是指通过在两个多肽相互作用的界面处将空间凸起(杵)引入一个多肽中，并且将一个窝或腔(臼)引入另一多肽中，来指导两个多肽一起在体外或体内配对的氨基酸。例如，已在抗体的Fc:Fc结合界面、CL:CHI界面或VH/VL界面中引入了杵臼(参见例如US 2011/0287009、US2007/0178552、WO 96/027011、WO98/050431和Zhu等人,1997,Protein Science,6:781-788)。在一些实施方案中，杵臼确保在多特异性抗体的制造期间两条不同重链的正确配对。例如，Fc区中具有杵臼氨基酸的多特异性抗体可进一步包含连接至每个Fc区的单一可变结构域或可进一步包含与相似或不同的轻链可变结构域配对的不同重链可变结构域。杵臼技术也可用于VH或VL区，以另外确保正确配对。
适合于确定序列同一性百分比和序列相似性的算法的实例是BLAST算法，其分别描述于Altschul等人,Nuc.Acids Res.25:3389-3402,1977；和Altschul等人,J.Mol.Biol.215:403-410,1990中。用于进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)公开获得。这种算法涉及首先通过鉴定查询序列中长度为W的短单词来鉴定高评分序列对(HSP)，当与数据库序列中相同长度的单词比对时，这些短词匹配或满足某个正值阈值分数T。T被称为邻近单词分数阈值。这些初始的邻近单词命中充当开始搜索的值，以找到含有它们的更长的HSP。单词命中沿着每个序列在两个方向上延伸，直到累积比对分数可以增加。对于核苷酸序列，累积分数是使用参数M(一对匹配残基的奖励分数；总是>0)和N(错配残基的惩罚分数；始终<0)计算。对于氨基酸序列，使用评分矩阵来计算累积分数。当：累积比对分数从其达到的最大值下降了数量X时，单词命中在每个方向上的延伸停止；由于一个或多个负评分残基比对的累积，累积分数变为零或更低；或到达任一序列的结尾。BLAST算法参数W、T和X决定了比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)默认使用单词长度(W)11、期望值(E)10、M＝5、N＝-4和两条链的比较。对于氨基酸序列，BLAST程序默认使用单词长度3，和期望值(E)10，和BLOSUM62评分矩阵(参见，Henikoff和Henikoff,(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915)比对(B)50、期望值(E)10、M＝5、N＝-4和两条链的比较。
BLAST算法还对两个序列之间的相似性进行统计分析(参见，例如，Karlin和Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5787,1993)。由BLAST算法提供的相似性的一个度量是最小和概率(P(N))，其提供了两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果测试核酸与参考核酸的比较中的最小和概率小于约0.2，更优选小于约0.01，最优选小于约0.001，则认为该核酸与参考序列相似。
也可以使用E.Meyers和W.Miller,Comput.Appl.Biosci.4:11-17,(1988)的算法(其已并入ALIGN程序(2.0版)中)，使用PAM120权重残基表、间隙长度罚分12和间隙罚分4来确定两个氨基酸序列之间的百分比同一性。另外，可使用Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.48:444-453,(1970)(已并入GCG软件包的GAP程序中的算法)，使用BLOSUM62矩阵或PAM250矩阵以及间隙权重16、14、12、10、8、6或4和长度权重1、2、3、4、5或6来确定两个氨基酸序列之间的百分比同一性。
术语“核酸”在本文中可与术语“多核苷酸”互换使用，并且是指呈单链形式或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。所述术语涵盖含有已知核苷酸类似物或修饰的主链残基或键联的核酸，其为合成的、天然存在的和非天然存在的，具有与参考核酸相似的结合性质，并且以与参考核苷酸相似的方式代谢。此类类似物的实例包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、膦酸甲酯、手性膦酸甲酯、2-O-甲基核糖核苷酸和肽-核酸(PNA)。
在核酸的上下文中，术语“可操作地连接”是指两个或更多个多核苷酸(例如，DNA)区段之间的功能关系。通常，其是指转录调控序列与所转录的序列的功能关系。例如，如果启动子或增强子序列在适当的宿主细胞或其他表达系统中刺激或调节编码序列的转录，则该启动子或增强子序列与编码序列可操作地连接。通常，与所转录的序列可操作地连接的启动子转录调控序列与转录序列物理上连续，即它们是顺式作用的。然而，一些转录调控序列诸如增强子不需要与它们增强转录的编码序列物理上连续或位于紧密接近所述编码序列。
在一些方面，本公开提供了组合物，例如药学上可接受的组合物，其包含与至少一种药学上可接受的赋形剂一起配制的如本文所述的抗MUC1抗体。如本文所用，术语“药学上可接受的赋形剂”包括生理上相容的任何和所有溶剂、分散介质、等渗剂和吸收延迟剂等。赋形剂可适合于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、直肠、脊柱或表皮施用(例如，通过注射或输注)。
本文公开的组合物可呈多种形式。这些形式包括例如液体、半固体和固体剂型，诸如液体溶液(例如，可注射和输注溶液)、分散体或悬浮液、脂质体和栓剂。合适的形式视预期的施用模式和治疗性应用而定。一种合适的施用模式是肠胃外(例如，静脉内、皮下、腹膜内、肌内)。在一些实施方案中，抗体通过静脉内输注或注射来施用。在某些实施方案中，抗体通过肌内或皮下注射来施用。
如本文所用的术语“治疗有效量”是指当施用于受试者以治疗疾病，或疾病或病症的至少一种临床症状时，足以影响针对疾病、病症或症状的这种治疗的抗体的量。“治疗有效量”可随抗体、疾病、病症和/或疾病或病症的症状、疾病、病症和/或疾病或病症的症状的严重程度、待治疗的受试者的年龄和/或待治疗的受试者的体重而变化。在任何给定情况下，适当量对于本领域技术人员来说可为显而易见的或可通过常规实验来确定。在组合疗法的情况下，“治疗有效量”是指组合组分的总量。
术语“组合疗法”是指施用两种或更多种治疗剂以治疗治疗性疾患或病症。此类施用涵盖以基本上同时的方式共施用这些治疗剂。此类施用还涵盖每种活性成分在多个或单独的容器或配制剂(例如胶囊、粉末和液体)中共施用。粉末和/或液体可在施用前重构或稀释至所需剂量。另外，“组合疗法”涵盖在大致相同时间或在不同时间以依序方式使用每种类型的治疗剂。在任一情况下，治疗方案将在治疗本文所述的疾患或病症中提供药物组合的有益效应。
如本文所用，短语“与......组合”意指在施用额外治疗剂的同时、施用之前或刚施用之后，向受试者施用抗MUC1抗体。在某些实施方案中，抗MUC1抗体作为与额外治疗剂的共同配制剂施用。
具体实施方式
本公开提供了抗人MUC1抗体及其抗原结合片段。本公开还提供了具有合需的结合亲和力、合需的细胞内化和其他合需的属性的抗体。抗人MUC1抗体可用于构建具有额外功能性诸如结合第二人肿瘤相关抗原(TAA)、免疫检查点抑制或免疫刺激的多特异性抗体，以构建抗体药物缀合物(ADC)或与其他结构域融合以形成融合蛋白。此外，抗人MUC1抗体及其构建体或包含其的药物组合物可用于治疗表达MUC1的癌症和相关病症。
抗MUC1抗体
本公开提供了特异性结合至人MUC1的抗体或其抗原结合片段。在实施方案中，抗体或其抗原结合片段特异性结合至人MUC1蛋白的SEA结构域，其为膜近端部分。在实施方案中，与靶向MUC1的N末端的抗体相比，抗体或其抗原结合片段不具有或具有显著减少的可溶性MUC1的干扰。本公开的抗体或抗原结合片段包括但不限于由下文所述的方法产生的抗体或其抗原结合片段。
在实施方案中，本文所公开的抗体或抗原结合片段特异性结合至MUC1，并且包含具有SEQ ID NO:10、20、30、57、58、61、71、75或80的氨基酸序列的VH结构域。在实施方案中，抗体或抗原结合片段特异性结合至MUC1，并且包含具有下文表2、7、14、16、22和23中列出的HCDR中的任一个的氨基酸序列的HCDR。在一个方面，抗体或抗原结合片段特异性结合至MUC1，并且抗体包含一个、两个、三个或更多个HCDR(或者由其组成)，所述HCDR具有本文表2、7、14、16、22和23中列出的HCDR中的任一个的氨基酸序列。
在实施方案中，本文所公开的抗体或抗原结合片段特异性结合至MUC1，并且包含具有SEQ ID No:11、21、31、59、60、62、66、68、72、76或81的氨基酸序列的VL结构域。在实施方案中，抗体或抗原结合片段特异性结合至MUC1，并且包含具有表2、7、14、16、22和23中列出的LCDR中的任一个的氨基酸序列的LCDR。在实施方案中，抗体或抗原结合片段特异性结合至MUC1，并且包含一个、两个、三个或更多个LCDR(或者由其组成)，所述LCDR具有表2、7、14、16、22和23中列出的LCDR中的任一个的氨基酸序列。
在实施方案中，本文所公开的抗体或抗原结合片段包含已变化，但在CDR区中与表2、7、14、16、22和23中所公开的CDR区具有至少60％、70％、80％、90％、95％或99％同一性的氨基酸。在一些方面，其包括氨基酸序列变化，其中当与表2、7、14、16、22和23中的序列中所描绘的CDR区相比时，CDR区中不超过1、2、3、4或5个氨基酸已变化。
在实施方案中，本文所公开的抗体或抗原结合片段包括其中氨基酸或编码氨基酸的核酸已变化，但与表2、7、14、16、22和23中所公开的序列具有至少60％、70％、80％、90％、95％或99％同一性的抗体或抗原结合片段。在一些方面，其包括氨基酸序列的变化，其中当与表2、7、14、16、22和23中所公开的序列中所描绘的可变区相比时，可变区中不超过1、2、3、4或5个氨基酸已变化，同时保留基本上相同的治疗活性。
本公开还提供了核酸序列，其编码特异性结合至MUC1的抗体的VH、VL、全长重链和全长轻链。可优化此类核酸序列以在哺乳动物细胞中表达。
在实施方案中，本文所公开的抗体或其抗原结合片段对人和食蟹猴(cynomolgus)MUC1(食蟹猴(cyno)MUC1，SEQ ID NO:3)均具有交叉反应性。在实施方案中，抗体或抗原结合片段靶向MUC1膜近端区域，其中脱落的MUC1的干扰最小。在实施方案中，抗体或抗原结合片段可用于治疗表达MUC1的癌症。
本公开还提供了抗体及其抗原结合片段，所述抗体及其抗原结合片段与表2、7、14、16、22和23中所述的抗MUC1抗体结合至相同的表位。因此，可基于额外抗体及其抗原结合片段在结合测定中与其他抗体交叉竞争(例如，以统计学上显著的方式竞争性抑制结合)的能力来鉴定额外抗体及其抗原结合片段。测试抗体抑制本公开的抗体及其抗原结合片段与MUC1的结合的能力证明测试抗体可与所述抗体或其抗原结合片段竞争与MUC1的结合。不受任一种理论的束缚，此种抗体可与同其竞争的抗体或其抗原结合片段结合至MUC1上相同或相关(例如结构上相似或空间上接近)的表位。在某个方面，与本公开的抗体或其抗原结合片段结合至MUC1上的相同的表位的抗体是人或人源化单克隆抗体。此类人或人源化单克隆抗体可如本文所述制备并分离。
在一个实施方案中，如本文所公开的抗MUC1抗体或其抗原结合片段可用于构建具有额外功能性诸如结合第二人肿瘤相关抗原(TAA)、免疫检查点抑制或免疫刺激的多特异性抗体。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体、人工程化抗体、单链抗体(scFv)、Fab片段、Fab'片段或F(ab')2片段。
在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段呈scFv格式，其包含N末端至C末端方向上的VH-VL或N末端至C末端方向上的VL-VH。在一些实施方案中，VH和VL经由氨基酸接头诸如本文所述的氨基酸接头连结。在一些实施方案中，VH或VL是表2、7、14、16、22和23中所述的VH或VL中的任一者。本公开的其他scFv包含已变化，但在CDR区中与表2、7、14、16、22和23中所公开的CDR区具有至少60％、70％、80％、90％、95％或99％同一性的氨基酸。在一些方面，其包括氨基酸序列变化，其中当与表2、7、14、16、22和23中的序列中所描绘的CDR区相比时，CDR区中不超过1、2、3、4或5个氨基酸已变化。
氨基酸接头
在实施方案中，本文所公开的抗MUC1抗体或其抗原结合片段用于构建多特异性抗体，其可为例如双特异性四价抗体。双特异性四价抗体的多肽链的结构域和/或区域可由各种长度的接头区域分离。在一些实施方案中，抗原结合结构域通过接头区域彼此分离(CL、CH1、铰链、CH2、CH3或整个Fc区)。例如，多肽链可包含序列VL1-CL-(接头)VH2-CH1、VH-接头-VL。此类接头区域可包含随机分类的氨基酸或氨基酸的限制性集合。此类接头区域可为柔性的或刚性的(参见US2009/0155275)。
多特异性抗体已通过遗传融合两个单链Fv(scFv)或Fab片段(使用或不使用柔性接头)(Mallender等人,J.Biol.Chem.1994 269:199-206；Mack等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1995 92:7021-5；Zapata等人,Protein Eng.19958.1057-62)；经由二聚化装置诸如亮氨酸拉链(Kostelny等人,J.Immunol.1992148:1547-53；deKruifetal J.Biol.Chem.1996 271:7630-4)和Ig C/CH1结构域(Muller等人,FEBSLett.422:259-64)；通过双体抗体(Holliger等人,(1993)Proc.Nat.Acad.Sci.USA.199890:6444-8；Zhu等人,Bio/Technology(NY)1996 14:192-6)；Fab-scFv融合(Schoonjans等人,J.Immunol.2000 165:7050-7)；和微型抗体格式(Pack等人,Biochemistry 1992.31:1579-84；Pack等人,Bio/Technology 1993 11:1271-7)来构建。
二聚化特异性氨基酸
在一个实施方案中，多价抗体包含至少一个二聚化特异性氨基酸变化。二聚化特异性氨基酸变化可导致“杵臼”相互作用，并且可增加所需多价抗体正确组装的可能性。二聚化特异性氨基酸可在CH1结构域或CL结构域或其组合内。用于将CH1结构域与其他CH1结构域(CH1-CH1)以及CL结构域与其他CL结构域(CL-CL)配对的合适的二聚化特异性氨基酸至少可在WO2014082179、WO2015181805和WO2017059551的公开内容中找到。二聚化特异性氨基酸也可在Fc结构域内，并且可与CH1或CL结构域内的二聚化特异性氨基酸组合。在一个实施方案中，本公开提供了一种双特异性抗体，其包含至少一个二聚化特异性氨基酸对。
Fc区的框架的进一步改变
在各个方面，通过用不同的氨基酸残基替换至少一个氨基酸残基来改变Fc区以改变抗体的效应功能。例如，可用不同的氨基酸残基替换一个或多个氨基酸，使得抗体对效应配体具有改变的亲和力，但保留亲本抗体的抗原结合能力。对其亲和力改变的效应配体可以是例如Fc受体或补体的C1组分。该方法描述于例如Winter等人的美国专利号5,624,821和5,648,260两者中。
在另一方面，一个或多个氨基酸残基可以被一个或多个不同的氨基酸残基替换，使得抗体具有改变的C1q结合和/或降低的或消除的补体依赖性细胞毒性(CDC)。此方法描述于例如Idusogie等人的美国专利号6,194,551中。
在又另一方面，变化一个或多个氨基酸残基，从而改变抗体固定补体的能力。此方法描述于例如Bodmer等人的公开WO 94/29351中。在具体方面，对于IgG1亚类和κ同种型，本公开的抗体或其抗原结合片段的一个或多个氨基酸被一个或多个同种异型氨基酸残基替换。同种异型氨基酸残基还包含但不限于IgG1、IgG2和IgG3亚类的重链的恒定区以及如Jefferis等人,MAbs.1:332-338(2009)所述的κ同种型的轻链的恒定区。
在另一方面，通过修饰一个或多个氨基酸来修饰Fc区以增加抗体介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的能力和/或增加抗体对Fcγ受体的亲和力。此方法描述于例如Presta的公开WO00/42072中。此外，已绘制人IgG1上对FcγRI、FcγRII、FcγRIII和FcRn的结合位点，并且已描述具有改良的结合的变体(参见Shields等人,J.Biol.Chem.276:6591-6604,2001)。
在再另一方面，抗体的糖基化被修饰。例如，可制备无糖基化抗体(即，抗体缺乏或具有降低的糖基化)。可以改变糖基化以例如增加抗体对“抗原”的亲和力。此类碳水化合物修饰可通过例如改变抗体序列内的一个或多个糖基化位点来实现。例如，可进行一个或多个氨基酸取代，导致消除一个或多个可变区框架糖基化位点，从而消除所述位点的糖基化。此种无糖基化可增加抗体对抗原的亲和力。此种方法描述于例如Co等人的美国专利号5,714,350和6,350,861中。
另外地或可替代地，可以制备具有改变的糖基化类型的抗体，诸如具有减少量的岩藻糖残基的低岩藻糖基化抗体或具有增加的二等分GlcNac结构的抗体。已证明此类改变的糖基化模式增加抗体的ADCC能力。此类碳水化合物修饰可通过例如在具有改变的糖基化通路的宿主细胞中表达抗体来实现。具有改变的糖基化通路的细胞已在本领域中描述，并且可用作宿主细胞，其中表达重组抗体从而产生具有改变的糖基化的抗体。例如，Hang等人的EP 1,176,195描述了具有功能性破坏的FUT8基因的细胞系，所述基因编码岩藻糖基转移酶，使得在此种细胞系中表达的抗体表现出低岩藻糖基化。Presta的公开WO 03/035835描述了变体CHO细胞系，即Lecl3细胞，其具有将岩藻糖附接至Asn(297)-连接的碳水化合物的降低的能力，也导致在所述宿主细胞中表达的抗体的低岩藻糖基化(另外参见Shields等人,(2002)J.Biol.Chem.277:26733-26740)。Umana等人的WO99/54342描述了经工程化以表达糖蛋白修饰的糖基转移酶(例如，β(1,4)-N乙酰氨基葡萄糖转移酶III(GnTIII))的细胞系，使得在工程化细胞系中表达的抗体表现出增加的二等分GlcNac结构，这导致抗体的ADCC活性增加(另外参见Umana等人,Nat.Biotech.17:176-180,1999)。
在另一方面，如果需要降低ADCC，许多先前报告显示人抗体亚类IgG4仅具有适度的ADCC，并且几乎无CDC效应功能(Moore G L等人,2010MAbs,2:181-189)。然而，发现天然IgG4在应激条件，诸如在酸性缓冲液中或在增加的温度下较不稳定(Angal,S.1993MolImmunol,30:105-108；Dall'Acqua,W.等人,1998Biochemistry,37:9266-9273；Aalberse等人,2002Immunol,105:9-19)。降低的ADCC可通过将抗体可操作地连接至IgG4 Fc来实现，所述IgG4 Fc用降低FcγR结合或C1q结合活性的改变的组合工程化，从而降低或消除ADCC和CDC效应功能。考虑到抗体作为生物药物的物理化学性质，IgG4的不太合需的固有性质中的一种是其两条重链在溶液中动态分离以形成半抗体，这导致经由称为“Fab臂交换”的过程在体内产生双特异性抗体(Vander Neut Kolfschoten M等人,2007Science,317:1554-157)。位置228(EU编号系统)处的丝氨酸突变为脯氨酸似乎对IgG4重链分离具有抑制性(Angal,S.1993Mol Immunol,30:105-108；Aalberse等人,2002Immunol,105:9-19)。据报告铰链区和γFc区中的一些氨基酸残基对抗体与Fcγ受体的相互作用具有影响(Chappel SM等人,1991Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:9036-9040；Mukherjee,J.等人,1995FASEB J,9:115-119；Armour,K.L.等人,1999Eur J Immunol,29:2613-2624；Clynes,R.A.等人,2000Nature Medicine,6:443-446；Arnold J.N.,2007Annu Rev immunol,25:21-50)。此外，人群体中一些罕见的IgG4同工型也可引起不同的物理化学性质(Brusco,A.等人,1998Eur J Immunogenet,25:349-55；Aalberse等人,2002Immunol,105:9-19)。为了产生具有低ADCC和CDC但具有良好稳定性的抗体，可能修饰人IgG4的铰链区和Fc区并引入许多改变。这些经修饰的IgG4 Fc分子可发现于Li等人的美国专利号8,735,553的SEQ ID NO:83-88中。
抗体产生
抗体及其抗原结合片段可通过本领域已知的任何手段，包括但不限于重组表达、化学合成和抗体四聚体的酶促消化来产生，而全长单克隆抗体可通过例如杂交瘤或重组产生来获得。重组表达可来自本领域已知的任何适当的宿主细胞，例如哺乳动物宿主细胞、细菌宿主细胞、酵母宿主细胞、昆虫宿主细胞等。
本公开进一步提供了编码本文所述的抗体的多核苷酸，例如编码包含如本文所述的互补决定区的重链或轻链可变区或区段的多核苷酸。
本公开的多核苷酸可编码抗MUC1抗体的可变区序列。它们还可编码抗体的可变区和恒定区两者。一些序列编码包含例示的抗MUC1抗体的重链和轻链两者的可变区的多肽。
本公开还提供了用于产生抗MUC1抗体的表达载体和宿主细胞。表达载体的选择视载体将在其中表达的预期宿主细胞而定。表达载体可含有启动子和其他调控序列(例如，增强子)，其可操作地连接至编码抗MUC1抗体链或抗原结合片段的多核苷酸。在一些方面，除了在诱导条件控制下的情况，采用诱导型启动子来阻止所插入序列的表达。诱导型启动子包括例如阿拉伯糖、lacZ、金属硫蛋白启动子或热休克启动子。转化生物体的培养物可在非诱导条件下扩增，而不偏离其表达产物被宿主细胞更好耐受的编码序列的群体。除启动子外，也可包括高效表达抗MUC1抗体或其抗原结合片段的其他调控元件。这些元件可包括ATG起始密码子和相邻的核糖体结合位点或其他序列。另外，表达效率可通过包含适于所用细胞系统的增强子而增强(参见例如，Scharf等人,Results Probl.Cell Differ.20:125,1994；以及Bittner等人,Meth.Enzymol.,153:516,1987)。例如，SV40增强子或CMV增强子可用于增加哺乳动物宿主细胞中的表达。
用于携带和表达抗MUC1抗体载体的宿主细胞可为原核或真核的。大肠杆菌(E.coli)是一种可用于克隆和表达本公开的多核苷酸的原核宿主。其他适合使用的微生物宿主包括杆菌，诸如枯草芽孢杆菌，和其他肠杆菌科，诸如沙门氏菌属、沙雷氏菌属和各种假单胞菌属的种。在这些原核宿主中，还可制备表达载体，其通常含有与宿主细胞相容的表达控制序列(例如，复制起点)。另外，可存在任何数目的多种熟知的启动子，诸如乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统、β-内酰胺酶启动子系统或来自噬菌体λ的启动子系统。启动子通常任选地与操纵子序列控制表达，并且具有核糖体结合位点序列等，以用于启动和完成转录和翻译。其他微生物，诸如酵母也可用以表达抗MUC1抗体。也可使用昆虫细胞与杆状病毒载体的组合。
在其他方面，哺乳动物宿主细胞用于表达并产生本公开的抗MUC1抗体。实例包括表达内源性免疫球蛋白基因的杂交瘤细胞系或携带外源性表达载体的哺乳动物细胞系。这些细胞包括任何正常死亡或正常或异常永生动物或人细胞。例如，已开发了若干种能够分泌完整免疫球蛋白的合适的宿主细胞系，包括CHO细胞系、各种COS细胞系、HEK 293细胞、骨髓瘤细胞系、转化的B细胞和杂交瘤。使用哺乳动物组织细胞培养物来表达多肽通常在例如，Winnacker,From Genes to Clones,VCH Publishers,NY,N.Y.,1987中讨论。用于哺乳动物宿主细胞的表达载体可包括表达控制序列，诸如复制起点、启动子和增强子(参见例如Queen等人,Immunol.Rev.89:49-68,1986)，以及必要的加工信息位点，诸如核糖体结合位点、RNA剪接位点、聚腺苷酸化位点和转录终止子序列。这些表达载体通常含有来源于哺乳动物基因或哺乳动物病毒的启动子。合适的启动子可以是组成型的、细胞类型特异性的、阶段特异性的和/或可调节的或可调控的。有用的启动子包括但不限于金属硫蛋白启动子、组成型腺病毒主要晚期启动子、地塞米松诱导型MMTV启动子、SV40启动子、MRP polIII启动子、组成型MPSV启动子、四环素诱导型CMV启动子(诸如人立即早期CMV启动子)、组成型CMV启动子和本领域已知的启动子-增强子组合。
检测和诊断的方法
本公开的抗体或抗原结合片段可用于多种应用，包括但不限于用于检测MUC1的方法。在一个方面，抗体或抗原结合片段可用于检测生物样品中MUC1的存在。如本文所用，术语“检测”包括定量或定性检测。在某些方面，生物样品包括细胞或组织。在其他方面，此类组织包括相对于其他组织以更高水平表达MUC1的正常和/或癌性组织。
在一个方面，本公开提供了一种检测生物样品中MUC1的存在的方法。在某些方面，方法包括在允许抗体与抗原结合的条件下使生物样品与抗MUC1抗体接触以及检测抗体与抗原之间是否形成复合物。生物样品可包括但不限于尿、组织、唾液或血液。
还包括诊断与MUC1的表达相关的病症的方法。在某些方面，方法包括使测试细胞与抗MUC1抗体接触；通过检测抗MUC1抗体与MUC1多肽的结合来确定由测试细胞表达的MUC1的表达水平(定量或定性)；以及将测试细胞的表达水平与对照细胞(例如，与测试细胞具有相同组织来源的正常细胞或非MUC1表达细胞)中的MUC1表达水平进行比较，其中与对照细胞相比，测试细胞中较高的MUC1表达水平指示与MUC1表达相关的病症的存在。
药物组合物和配制剂
还提供了包含抗MUC1抗体或其抗原结合片段或多核苷酸的组合物，包括药物配制剂，所述多核苷酸包含编码抗MUC1抗体或抗原结合片段的序列。这些组合物可进一步包含合适的载剂，诸如药学上可接受的赋形剂，包括本领域熟知的缓冲液。
如本文所述的抗MUC1抗体或抗原结合片段的药物配制剂通过将具有所需纯度程度的此种抗体或抗原结合片段与一种或多种任选的药学上可接受的载剂以冻干配制剂或水溶液的形式混合来制备(Remington's Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编(1980))。药学上可接受的载剂在所采用的剂量和浓度下通常对接受者无毒，并且包括但不限于：缓冲液诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂诸如EDTA；糖诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子诸如钠；金属络合物(例如Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂诸如聚乙二醇(PEG)。本文中示例性药学上可接受的载剂进一步包括间质药物分散剂，诸如可溶性中性活性的透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如，人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，诸如rHuPH20(Baxter International,Inc.)。某些示例性sHASEGP(包括rHuPH20)和使用方法描述于美国专利号US 7,871,607和2006/0104968中。在一个方面，sHASEGP与一种或多种额外糖胺聚糖酶诸如软骨素酶组合。
示例性冻干抗体配制剂描述于美国专利号6,267,958中。水性抗体制剂包括美国专利号6,171,586和WO2006/044908中描述的那些，后者的配制剂包括组氨酸-乙酸盐缓冲液。
可制备缓释制剂。缓释制剂的合适实例包括含有抗体的固体疏水性聚合物的半透过性基质，所述基质呈成形制品形式，例如膜或微胶囊。
待用于体内施用的配制剂通常是无菌的。无菌性可容易地实现，例如通过透过无菌过滤膜过滤。
等效物
应理解，虽然抗人4Ig-B7H3抗体及其抗原结合片段已结合其详细描述进行了描述，但是前述描述旨在说明而不是限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求的范围来限定。其他方面、优点和修改在以下权利要求的范围内。
应理解，本文所公开的各种实施方案中的一个、一些、任何或所有特征均可组合以形成本公开的进一步实施方案。本公开的这些和其他方面将对于本领域技术人员显而易见。
实施例
实施例1.靶向MUC1膜近端区域的抗MUC1单克隆抗体的产生
用于免疫和结合测定的MUC1重组蛋白
编码全长人MUC1(SEQ ID NO:1)的cDNA由Genewiz(Suzhou,China)基于其Uniprot序列(UniProtKB：P15941)合成并且从其购买。将由全长MUC1的氨基酸(AA)1036-1155组成的全长人MUC1的SEA结构域(海胆精子蛋白、肠激酶和集聚蛋白)(SEQ ID NO:2)的编码区经PCR扩增并且克隆至基于pcDNA3.4的表达载体(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)中，其C末端融合至小鼠IgG2a的Fc结构域或人IgG1重链的Fc结构域，这产生两个重组融合蛋白表达质粒，分别为MUC1-SEA-mIgG2a和MUC1-SEA-huIgG1。MUC1融合蛋白的示意图显示于图1中。对于重组融合蛋白的产生，将MUC1-SEA-mIgG2a和MUC1-SEA-huIgG1质粒瞬时转染至Expi293细胞(Thermo Fisher,Waltham,MA,USA)中，并且在配备有旋转振荡器的CO2孵育箱中培养6天。收集含有重组蛋白的上清液并通过离心澄清。使用蛋白质A柱(目录：17549852，CytivaLife Sciences)纯化MUC1-SEA-mIgG2a和MUC1-SEA-huIgG1，随后用HiLoad 16/600Superdex 200pg尺寸排阻柱((目录：28989335，Cytiva Life Sciences)纯化。MUC1-SEA-mIgG2a和MUC1-SEA-huIgG1蛋白均用磷酸盐缓冲盐水(PBS)透析，并且以小等分试样储存于-80℃冷冻箱中。
表1.MUC1的序列
产生稳定表达人或食蟹猴MUC1的细胞系，以用于抗体产生、筛选和验证
产生并且验证了稳定表达人MUC1的细胞系，包括PT67/人MUC1细胞系(内部产生的细胞系)、HEK293/人MUC1细胞系(HEK293是从ATCC CRL-1573获得)和HCT116/人MUC1细胞系(ATCC CCL-247)。
产生并且验证了稳定表达食蟹猴MUC1(SEQ ID NO:3)的细胞系，包括HEK293/食蟹猴MUC1、L929/食蟹猴MUC1细胞系(L929是从ATCC CCL-1获得)、HCT116/食蟹猴MUC1细胞系和Daudi/食蟹猴MUC1细胞系(Daudi是从ATCC CCL-213获得)。
为了产生稳定表达人或食蟹猴MUC1的细胞系，使用逆转录病毒构建体PFBneo(STRATAGENE，目录号217561-51)构建了外营养载体。根据制造商的说明，使用Lipofectamine 2000(Invitrogen，参考号52758)将逆转录病毒构建体转染至PLAT-E细胞(Cyagen，目录号IPMPC-01001)中。转染后24、48和72小时收集病毒上清液，并且在使用前过滤(0.45μm)。上述产生的外营养病毒用于在存在聚凝胺(最终浓度：8μg/ml)的情况下转导双嗜性包装细胞系PT67。3轮转导后，PT67细胞在G418(最终浓度：1mg/ml)中选择7天。为了收集由PT67细胞产生的双嗜性病毒，当细胞变得100％汇合时，将培养基更换为不含G418的新鲜DMEM完全培养基。每天收集病毒一次，持续3天。细胞系感染了含有人或食蟹猴MUC1的病毒。3轮转导后，感染的细胞在G418(最终浓度：1mg/ml)中选择7天。
免疫
为了产生针对MUC1的抗体，用不同的MUC1抗原对30只BALB/C、MRL品系的近交系小鼠队列进行免疫，每个队列均经受免疫策略，所述策略包括MUC1抗原(包括来自实施例1的蛋白质和细胞系)、剂量、注射途径、佐剂和免疫时间的独特组合。对6个队列中的总共5只动物进行了免疫。动物在0至90天之间的不同时段内接受免疫。为了监测免疫反应，通常在2-6次免疫的30-90天后通过ELISA和FACS筛选滴定的血清。筛选血清中结合至MUC1抗原的抗体。测量每只动物中的MUC1特异性抗体反应，并选择具有足够的抗MUC1 Ig滴度的动物进行4天最终加强。
杂交瘤融合和筛选
从如上所述免疫的小鼠中分离淋巴器官，包括脾脏和淋巴结。杂交瘤是通过与基于PEG的融合而从SP2/0衍生的永生化小鼠骨髓瘤细胞融合而产生。使用补充有HAT的常规1640培养基将所得细胞铺种于96孔细胞培养板中以供选择杂交瘤。10-13天的培养和生长培养基替换后，从各个孔中收集杂交瘤培养上清液并进行筛选，以鉴定具有分泌的MUC1特异性抗体的孔。所有上清液最初针对重组蛋白huMUC1-SEA-huIgG1(来自实施例1)进行筛选。透过ELISA测量重组蛋白huMUC1-SEA-huIgG1上的抗体结合。对来自3个杂交瘤融合中的培养孔的上清液进行MUC1抗体筛选。简而言之，将2μg/mL huMUC1-SEA-huIgG1涂覆于96孔ELISA板中，并且将50μl杂交瘤培养上清液共孵育30-60min，洗涤，并且与缀合至HRP的抗小鼠IgG Fc二次Ab一起孵育。孵育和洗涤后，用HRP底物对板进行显影，并且测量吸光度。
将来自阳性孔中的杂交瘤转移至具有新鲜培养基的24孔板中，生长2-3天，然后通过流式细胞术再次筛选，以确认抗体与人MUC1和食蟹猴MUC1过表达细胞系的结合。
透过FACS测量结合至人MUC1和食蟹猴MUC1过表达细胞系的抗体(Ab)。简而言之，将100μl杂交瘤培养上清液和人MUC1过表达细胞或食蟹猴MUC1过表达细胞共孵育30-60min，洗涤，并且与缀合至APC的抗小鼠IgG Fc二次Ab一起孵育。孵育和洗涤后，通过流式细胞术测量荧光。
亚克隆和序列分析
将所选抗MUC1 Ab分泌杂交瘤亚克隆一次或两次，以确保单克隆性。简而言之，通过有限稀释对阳性杂交瘤克隆进行亚克隆。7-10天后，如先前所述通过ELISA和流式细胞术筛选培养上清液，以确认人和食蟹猴MUC1 Ab结合。体外培养稳定的杂交瘤亚克隆，以进行细胞冷冻保存以及抗体VH和VL基因克隆和测序。
将亚克隆后的抗MUC1 Ab分泌杂交瘤通过裂解缓冲液裂解。随后将含有mRNA的裂解物转移至96孔深孔板中，以用于mRNA分离、cDNA合成和通过标准测序技术(桑格测序(Sanger sequencing))进行DNA测序。通常，根据制造商的说明，制备细胞裂解物的总RNA，并且使用Super Script III第一链合成SuperMix(Invitrogen)通过逆转录mRNA产生cDNA。BG138P抗体的序列列于表2中。
单次B筛选
处死免疫小鼠并且收获脾脏。将富集的血浆细胞加载至14K芯片上。使用hMUC1珠、食蟹猴MUC1珠和HEK293-食蟹猴MUC1细胞进行芯片上筛选。选择命中并将其导出至裂解缓冲液中。根据制造商的说明，使用BLI cDNA合成试剂盒(BERKELEY LIGHTS)纯化单一细胞RNA并且回收Ig序列。BG219P和BG346P的序列列于表2中。
表2.针对人MUC1的鼠抗体序列
嵌合BG219P、BG138P和BG346P的大规模表达和纯化
嵌合抗体chBG219P、chBG138P和chBG346P是通过将内部产生的含有重链和轻链的质粒瞬时转染至ExpiCHO-s细胞中产生。收获条件培养基并且使用MabSelect SuRe柱(Cytiva)、随后POROSTM50 HS柱(Thermofisher Scientific)和G-25脱盐柱(Cytiva)纯化抗体。所有纯化的抗体以小等分试样储存于-80℃冷冻箱中。
实施例2.通过SPR对抗MUC1抗体的结合动力学和亲和力测定
使用BIAcoreTMT-200(GE Life Sciences)通过SPR测定对嵌合抗MUC1抗体的结合动力学进行了表征。简而言之，将小鼠抗人IgG Fc抗体固定在活化的CM5生物传感器芯片(目录号BR100530，GE Life Sciences)上。纯化的嵌合抗MUC1抗体流过芯片表面并且被抗人IgG抗体捕获。然后将人或食蟹猴MUC1-SEA蛋白的连续稀释液流过芯片表面，并且分析表面等离子体共振信号的变化，以通过使用一对一朗缪尔结合模型(Langmuir bindingmodel)(BIA评价软件，GE Life Sciences)计算缔合速率(kon)和解离速率(koff)。平衡解离常数(KD)计算为koff/kon的比率。嵌合抗MUC1抗体chBG138P、chBG346P和chBG219P的结合亲和力概况显示于下表3中。ChBG138P、chBG346P和chBG219P对人和食蟹猴MUC1-SEA均展现出高亲和力。
表3.chBG138P、chBG346P和chBG219P的抗原结合亲和力
实施例3.确定抗MUC1抗体与在稳定表达细胞系中表达的MUC1的结合亲和力
通过FACS测定了嵌合抗MUC1抗体与人和食蟹猴MUC1过表达细胞系(HEK293/人MUC1和HEK293/食蟹猴MUC1)的结合亲和力。简而言之，将人或食蟹猴MUC1过表达细胞与连续稀释的纯化的抗体一起孵育，洗涤，并且与缀合至APC的抗人IgG二抗一起孵育。孵育和洗涤后，通过流式细胞术测量荧光。嵌合抗MUC1抗体的结合亲和力概况显示于下表4和图2A-2F(以hIgG1作为阴性对照)中。结果证明，所有三种嵌合抗MUC1抗体对在稳定表达细胞系中表达的人和食蟹猴MUC1均具有良好的结合亲和力。
表4.chBG138P、chBG346P和chBG219P的细胞结合亲和力
实施例4.抗MUC1抗体的表位分箱
通过竞争性SPR测定确定嵌合抗MUC1抗体的表位分箱。简而言之，将抗小鼠IgG Fc抗体固定在活化的CM5生物传感器芯片上。纯化的huMUC1-SEA-mIgG2a(人MUC1与小鼠IgG2aFc连接)抗原流过芯片表面并被抗小鼠IgG抗体捕获。首先在饱和抗原结合条件下注射参考MUC1-SEA Ab5F3(Cancer Immunol Immunother.2020年7月；69(7):1337-1352)，随后注射chBG138P(图3A)、chBG219P(图3B)或chBG346P(图3C)。表位分箱的传感图显示于图3A-3C中。如下表5所示，三种嵌合MUC1抗体被分为MUC1-SEA结构域中的两个表位箱。ChBG138P和chBG219P结合至MUC1-SEA上的相同表位，5F3也是如此，其为与chBG346P不同的MUC1表位。更具体地，chBG138P和chBG219P结合至表位A，而chBG346P结合至表位B。
表5.chBG138P、chBG346P和chBG219P的表位箱
Ab编号 箱
chBG138P A
chBG346P B
chBG219P A
实施例5.嵌合抗MUC1抗体chBG138P、chBG219P和chBG346P显示出降低的可溶性MUC1的干扰
通过竞争性FACS测定确定了可溶性MUC1在MUC1抗体与MUC1表达细胞的特异性结合中的存在。简而言之，将人MUC1表达细胞与30、3和0.3μg/ml MUC1抗体在存在连续稀释的可溶性MUC1(Shanghai Linc-Bio Science Co.LTD)的情况下一起孵育。洗涤并且与抗人IgG二抗孵育后，通过流式细胞术测量荧光。可溶性MUC1阻断MUC1抗体与MUC1表达细胞结合的IC50值显示于表6中，并且阻断曲线显示于图4A-4F中，其中HMFG1是阳性对照，并且mIgG和hIgG1是阴性对照。所述概况指示，在高、中和低抗体浓度(即30、3、0.3μg/ml)下，HMFG与表达MUC1的细胞的结合可很容易受到干扰，但在低抗体浓度(即0.3μg/ml)下，chBG138P、chBG219P和chBG346P结合仅受到轻微干扰(图4A-F)。总之，图4中的概况指示，与靶向MUC1N末端的HMFG1(Abcam)相比，MUC1抗体与表达MUC1的细胞的结合显示出显著降低的可溶性MUC1的干扰。
表6.可溶性MUC1阻断活性的IC50
(N.A.：不可用。由于干扰极低，IC50数据不能很好地拟合和检索，如图4A、4B、4E和4F中的结合曲线所示。)
实施例6.靶向MUC1膜近端区域的抗MUC1单克隆抗体结合至癌细胞系，但不结合至正常T细胞，而靶向MUC1 N末端的抗体HMFG1或16A可结合至正常T细胞。
为了评价靶向MUC1膜近端区域的抗MUC1单克隆抗体是否可差异结合至表达MUC1的肿瘤细胞与表达MUC1的正常细胞(如活化的T细胞)，进行了FACS结合测定。对于肿瘤细胞系结合实验，收集用抗人MUC1抗体chBG138P或对照(人IgG1)染色1小时的细胞。然后将细胞洗涤两次，并且随后用二抗(Alexa647抗人IgG Fc)染色30分钟。洗涤细胞并且用1％多聚甲醛(PFA)的DPBS溶液固定，然后进行FACS分析。所有流式细胞术数据均使用NovoCyte流式细胞仪(ACEA Biosciences,Inc.)获取，并且使用NovoExpress软件分析数据。如图5A-5C所示，靶向人MUC1膜近端区域的嵌合抗体chBG138P以剂量依赖性方式结合至表达MUC1的肿瘤细胞系HCC827(图5A)、H1975(图5B)和T-47D(图5C)(人IgG1作为阴性对照)，这指示靶向MUC1膜近端区域的抗体可用于靶向癌细胞，并因此应用于治疗表达或过表达MUC1的癌症。
为了评价靶向MUC1膜近端区域的单克隆抗体是否可避免结合至表达MUC1的正常细胞，进行了活化的T细胞结合测定。简而言之，将从Allcells或Stemcell购买的六名健康供体的人外周血单核细胞(PBMC)用1μg/ml PHA-L刺激3天。然后使用刺激的PBMC进行FACS染色。将细胞悬浮液与LIVE/DEADTM可固定死细胞染色试剂盒(Invitrogen，参考号L34964)和Fc受体阻断溶液(100μg/mL人IgG在FACS缓冲液中)一起预孵育，然后用抗人抗体染色。将细胞洗涤两次，并且与10μg/mL靶向MUC1膜近端区域的抗MUC1单克隆抗体或靶向MUC1 N末端的抗体HMFG1(作为阳性对照，Abcam，目录号ab215670)或16A(作为阳性对照，Biolegend，目录号355608)一起孵育1小时。然后洗涤细胞并且用PE-CY7抗人αβTCR(eBioscience，目录号25-9986-42)、AF647抗人IgG Fc(Biolegend，参考号409320)染色30分钟。洗涤细胞并且用1％ PFA的DPBS溶液固定，然后进行FACS分析。所有流式细胞术数据均使用NovoCyte流式细胞仪(ACEA Biosciences,Inc.)获取，并且使用NovoExpress软件分析数据。如图6和7A-7H所示，嵌合抗体chBG138P(图7A、7B、7E和7F)、chBG219P(图7E和7F)或chBG346P(图7E和7F)均不结合至表达MUC1的正常活化的人T细胞。然而，靶向MUC1-N末端的抗体HMFG1(图7C和7D)和16A(图7G和7H)结合至活化的T细胞的显著部分。图8A-8D显示了抗体BG138P的嵌合(chBG138P)和人源化(huBG138P-Hz2和huBG138P-Hz4)版本保留与BG138P相似的结合性质，不结合至表达MUC1的正常活化的人T细胞(图8A和8B)，而靶向MUC1-N末端的抗体HMFG1(图8C和8D)结合至正常活化的T细胞。
结果指示，与结合至癌细胞和正常T细胞两者的靶向MUC1-N末端的抗体相比，靶向MUC1膜近端区域的抗体特异性靶向癌细胞，同时保留正常T细胞，并且因此在用作人中的抗肿瘤疗法时可赋予优化的安全性概况。
实施例7.ChBG138P诱导癌细胞系中MUC1的内化。
遵循制造商的说明，使用pHrodo iFL STP酯(胺反应染料，Invitrogen，参考号P36013)标记chBG138P和人IgG。将癌细胞系T-47D、HCC827和H1975与pHrodo标记的chBG138P(最终浓度10μg/ml)或作为阴性对照的人IgG(来自Hualan的用于静脉内注射的人免疫球蛋白)在4℃避光孵育60分钟。在4℃下用DPBS洗涤细胞两次。将一半的细胞保持在4℃下，并且将另一半转移至37℃。将细胞在4℃或37℃下孵育5小时。将1μl/孔7-AAD(7-氨基-放线菌素D)添加至所有组中。将细胞在黑暗中在冰上孵育30分钟。洗涤细胞并且用1％多聚甲醛(PFA)的DPBS溶液固定，然后进行FACS分析。所有流式细胞术数据均使用NovoCyte流式细胞仪(ACEA Biosciences,Inc.)获取，并且使用NovoExpress软件分析数据。根据制造商的说明(Invitrogen，参考号P36013)，计算pHrodo阳性细胞的百分比。
如图9A-9C所示，对于所有三种癌细胞系T-47D(9A)、HCC827(9B)和H1975(9C)，在37℃下孵育5小时后，约有10-20％的细胞呈pHrodo阳性。结果指示，靶向MUC1膜近端区域的抗体chBG138P诱导表达MUC1的人癌症衍生的细胞系的内化，而阴性对照hIgG几乎不诱导内化。内化性质可有利于单克隆抗体疗法或双特异性抗体疗法的设计，以避免膜上靶标的损失和药物抗性。另外，内化的潜力保留了开发抗体-药物缀合物的可能性，其中包括本文所公开的MUC1抗体，以用于治疗表达MUC1的癌症。
实施例8.鼠抗人MUC1抗体BG138P和BG219P的人源化
BG138P的人源化
对于鼠抗人MUC1 BG138P抗体的人源化，采用了CDR移植策略。将鼠BG138P抗体重链和轻链可变结构域序列(分别缩写为VH和VL)通过Ig blast工具与人抗体种系序列进行比对，并且选择具有最高同源性的人种系框架作为CDR移植的受体框架。为了维持CDR规范结构，鼠版本BG138P抗体结构通过Schrodinger软件建模，并且用于选择潜在的回复突变位点以维持结合亲和力。通过构建不具有所述突变的多个变体来筛选每个回复突变位点，以评价所述位点在人源化版本中保持的必要性。然后，组合已鉴定的关键回复突变位点，以构建第二轮人源化变体以进行亲和力表征。
具体地，对于BG138P VH序列，选择IGHV1-3*01和J区H4(JH4)种系序列作为受体框架。并且对于BG138P VL序列，选择Vκ1-27*01和J区κ2作为受体框架。将仅CDR移植版本(以后缀“Hz0”命名)、具有所有回复突变位点的版本(以后缀“Bz0”命名)以及具有减少每个回复突变位点的多个变体(以后缀“Bz1”-“Bz16”命名)的抗体变体用内部IgG1/Cκ真核表达载体构建，用Expi293TM表达系统(Thermofisher Scientific)产生，并且用MabSelectPrismATM蛋白质A色谱树脂(Cytiva)纯化。此轮筛选的抗体变体列表和对应VH/VL序列总结于表7(其中“X”指示用于移植的CDR位置)中。
表7.BG138P的回复突变位点筛选的人源化设计
所有产生的抗体变体均使用Biacore 2000(Cytiva)系统通过对人和食蟹猴MUC1SEA结构域蛋白(SEQ ID NO:2)的SPR亲和力进行表征。选择与嵌合BG138P相比亲和力损失大于2倍(通过单一浓度结合动力学的Kd计算)的变体作为第1层回复突变位点，并且选择亲和力损失1.5-2倍的变体作为第2层回复突变位点。SPR结合亲和力数据总结于表8和表9中。
表8.BG138P人源化变体与人MUC1 SEA蛋白的SPR结合亲和力
表9.BG138P人源化变体与食蟹猴MUC1 SEA蛋白的SPR结合亲和力
基序分析显示，CDRL2和FR3边界中的氨基酸“DG”(Kabat编号56-57)是天冬氨酸异构化基序，并且构建了若干种突变变体以去除此翻译后修饰(PTM)风险。设计了四种突变(DG至EG、AG、TG、SG，所述变体在表10和表11中被命名为BG138P-PTM-m1至m4)并且引入嵌合BG138P中以去除此异构化基序。如上进行对人和食蟹猴MUC1 SEA蛋白的SPR结合表征，并且结果显示于表10和表11中。所有变体均显示出与嵌合BG138P抗体相当的结合。最终选择突变m4(DG至SG)用于人源化BG138P抗体。
表10.BG138P PTM去除变体与人MUC1 SEA蛋白的SPR结合亲和力
表11.BG138P PTM去除变体与食蟹猴MUC1 SEA蛋白的SPR结合亲和力
注射变量捕获1溶液 分析物1溶液 1:1结合ka kd KD(M)
BG138P-嵌合 食蟹猴MUC1 SEA 1.07E+06 7.12E-03 6.63E-09
BG138P-PTM-m1 食蟹猴MUC1 SEA 1.19E+06 7.51E-03 6.32E-09
BG138P-PTM-m2 食蟹猴MUC1 SEA 1.02E+06 6.99E-03 6.85E-09
BG138P-PTM-m3 食蟹猴MUC1 SEA 9.47E+05 6.62E-03 6.99E-09
BG138P-PTM-m4 食蟹猴MUC1 SEA 9.64E+05 6.50E-03 6.75E-09
将VH和VL的第1层和第2层回复突变位点组合用于构建第二轮人源化变体，所述变体的全部均包括“DG”至“SG”的PTM去除突变。最终组合人源化变体(称为huBG138P-Hz1至Hz4或缩写为Hz1至Hz4)总结于表12中，所述变体的序列列于表14中。
表12.具有第1层和第2层回复突变位点的组合的Hz1-Hz4
然后进行SPR测定以评价huBG138P-Hz1至Hz4与人和食蟹猴MUC1SEA的结合亲和力。SPR测定显示，所有变体均维持与嵌合BG138P相当的结合，数据总结于表13中。
表13.BG138P人源化变体Hz1至Hz4与人和食蟹猴MUC1 SEA蛋白的SPR结合亲和力
然后使用HEK293-hMUC1和HEK293-食蟹猴MUC1进行FACS结合(iQue3TMFACS，Sartorius)测定，以确定Hz1至Hz4的基于细胞的结合活性。嵌合BG138P及其人源化抗体huBG138P-Hz1至Hz4(以hIgG1为对照)的FACS结合数据通过GraphPad Prism软件处理并且显示于图10A和10B中。结果指示，BG138P-Hz2和BG138P-Hz4对人和食蟹猴MUC1的基于细胞的结合活性与嵌合BG138P的基于细胞的结合活性保持相似，并且BG138P-Hz1和BG138P-Hz3对人MUC1的基于细胞的结合活性与嵌合BG138P的基于细胞的结合活性保持相似，但对食蟹猴MUC1的基于细胞的结合活性低于嵌合BG138P的基于细胞的结合活性。
huBG138P-Hz2的HCDR、LCDR、VH和VL氨基酸序列提供于表14中。
表14.BG138P的人源化变体的序列表
BG219P的人源化
对于BG219P的人源化，通过针对IMGT中的人免疫球蛋白基因数据库的序列比较，搜索人种系IgG基因中与BG219P可变区的蛋白质序列共享高度同源性的序列。选择以高频率存在于人抗体库中并且与鼠BG219P高度同源的人IGHV和IGKV基因作为人源化的模板。
人源化是通过CDR移植随后并入关键的回复突变来进行。人源化抗体通过使用内部开发的表达载体工程化为人IgG1野生型格式。在人源化的初始轮次中，通过3D结构分析指导框架区中从鼠至人氨基酸残基的突变，并且在第一轮人源化设计中保留了对维持CDR的规范结构具有结构重要性的鼠框架残基。BG219P-Bz0(其是产生的所有19个变体中，具有所有回复突变位点的CDR移植版本的抗体变体)是理论结合能力与亲本鼠抗体BG219P接近的变体。
具体地，BG219P-Bz0是如本文所述产生的。选择人种系可变基因IGKV1-39*01和IGKJ2*01以及人种系可变基因IGHV3-23*01和IGHJ6*01作为BG219P VL和VH序列的受体框架。将鼠BG219P的LCDR移植至人种系可变基因IGKV1-39*01和IGKJ2*01的框架中，并且具有D17E、A43S、I48V、T69P和F71Y鼠框架残基。所得BG219P-Bz0 VL的氨基酸序列和DNA序列显示于表16中。将鼠BG219P的HCDR移植至人种系可变基因IGHV3-23*01和IGHJ6*01的框架中，并且保留S30N、S49A、A93T和K94R鼠框架残基。所得BG219P-Bz0 VH的氨基酸序列和DNA序列显示于表16中。
从人源化BG219P抗体huBG219P-Bz0开始，在VH和VL的CDR区中进行了若干种额外氨基酸变化，以进一步改良在人治疗性用途中的生物物理性质。考虑因素包括去除翻译后修饰和改良热稳定性(Tm)，同时维持结合活性。
用内部IgG1/Cκ真核表达载体构建了超过三十种人源化BG219P(也称为huBG219P)变体，所述表达载体分别含有人野生型IgG1和κ链的恒定区，并具有易于适应的亚克隆位点。所述变体是通过将质粒瞬时转染至ExpiCHO-s细胞(Thermofisher Scientific)中产生。收获条件培养基并使用MabSelectTMSuRe柱(Cytiva)纯化变体，随后通过UF/DF更换缓冲液。所有纯化的抗体以小等分试样储存于-80℃冷冻箱中。
对于亲和力测定，抗体被抗人Fc表面捕获，并且用于基于表面等离子体共振(SPR)技术的亲和力测定。SPR测定的抗MUC1抗体的结合概况的结果总结于表15中。huBG219P-E39和huBG219P-E43具有相似的结合亲和力，解离常数分别为35.2pM和30.3pM，其与嵌合BG219P的解离常数(39.8pM)相当。huBG219P-E39和huBG219P-E43的序列提供于表16中。
表15.通过SPR进行的huBG219P与MUC1 SEA-Fc的结合亲和力的比较
抗体 kon(M-1s-1) koff(s-1) KD(nM)
chBG219P 1.44E+06 5.74E-05 3.98E-011
huBG219P-E39 1.40E+06 4.92E-05 3.52E-011
huBG219P-E43 1.61E+06 4.86E-05 3.03E-011
表16.序列表
为了评价抗MUC1抗体结合活细胞上的原生MUC1的结合活性，使用ZR-75细胞进行基于FACS的结合测定。将活ZR-75细胞接种于96孔板中，并且与嵌合或人源化BG219P的一系列稀释液一起孵育。使用山羊抗人IgG作为二抗来检测抗体与细胞表面的结合。通过用GraphPad Prism将剂量-反应数据拟合至四参数逻辑模型，确定了与人原生MUC1的剂量依赖性结合的EC50值。如图11和表17所示，人源化BG219P抗体huBG219P-Bz0、E39和E43与嵌合BG219P相比，对原生MUC1保留了相当的结合亲和力。
表17.通过FACS进行的chBG219P和huBG219P与原生MUC1的结合亲和力的比较
Ab编号 ZR-75结合EC50(nM)
chBG219P 12.3
huBG219P-bz0 20.9
huBG219P-E39 14.0
huBG219P-E43 15.7
实施例9.鼠抗人MUC1 mAb BG138P、BG219P和BG346P的scFv的产生
为了产生scFv构建体，重链和轻链可变区(VH、VL)经由人工氨基酸接头连接。对于克隆BG138P，来自BG138P-Hz2的VH和VL通过(GGGGS)4接头(SEQ ID NO:83)连接，并且在C末端融合组氨酸标签(即HHHHHH(SEQ ID NO:85))，形成最终构建体VH-(GGGGS)4-VL-HHHHHH，命名为scFv1-78P。对于克隆BG219P，鼠BG219P的VH和VL用于产生VH-(GGGGS)4-VL-HHHHHH，并且基于此格式进行额外人源化工作，其细节公开于下文。对于克隆BG346P，鼠BG346P的VH和VL最初通过(GGGGS)3接头(SEQ ID NO:84)连接以产生VH-(GGGGS)3-VL-HHHHHH，并且基于此构建体的额外工程化工作公开于下文。
BG138P scFv人源化和工程化
为了测试scFv1-78P的物理性质是否有进一步改良的空间，对四十个在VL或VH中具有额外单一突变的构建体进行了产率、纯度和热稳定性测试。对于实验，scFv1-78P融合在C末端Fc标签上，产生scFv-Fc(称为scFv野生型-Fc)，并且一系列scFv1-78P突变体也融合在C末端Fc标签上，产生scFv-Fc(称为scFv突变体-Fc)。蛋白质在Expi293TM细胞(Thermo Fisher)中过表达，并且使用MabSelect SuReTM柱(Cytiva)进行纯化。将所得scFv突变体-Fc的产率和纯度与scFv野生型-Fc进行比较。二十一个scFv突变体-Fc与scFv野生型-Fc相比显示出较好的产率。两种scFv突变体-Fc均显示出较好的产率和纯度；然而，与scFv野生型-Fc相比，它们均未显示出较好的热稳定性。
BG219P scFv人源化和工程化
将鼠BG219P的VH和VL连接起来以产生如上所述的scFv构建体。对于人源化，将鼠VH和VL的框架与人种系数据库进行了比较。选择最接近的人种系IGHV3-21*01+IGHJ4和IGKV1-33*01+IGKJ2进行人源化。将鼠scFv中的六个CDR直接移植至所选人种系中，而无需在框架中进行额外突变，从而产生构建体scFv2-14P。亲和力和物理性质表征公开于下文。
为了去除scFv2-14P的CDR-H2区中潜在的翻译后脱酰胺位点而不影响scFv的亲和力，将易受攻击的Asp突变为Glu以模拟scFv2-14P的CDR-H2环的结构。与scFv2-14P相比，所得突变体scFv2-57P在Expi293TM细胞中显示出相当的产率，并且对可溶性重组MUC1蛋白和MUC1+细胞系具有相似的亲和力。数据显示于表18中。
表18.scFv2-14P的翻译后位点去除
(N.A.：不适用。不再添加突变。)
BG346P scFv人源化和工程化
经由人工接头(GGGGS)3(SEQ ID NO:84)将来自鼠BG346P的VH和VL连接起来以产生鼠scFv BG346P。使用框架交换策略进行鼠BG346P scFv的人源化。将BG346P的CDR残基移植至表19中所列的一系列框架中，并且在框架上进行了如所列的额外突变。
表19.BG346P scFv的人源化中所用的框架
(N.A.：不适用。不再添加突变。)
上文列出的人源化scFv构建体在Expi293TM细胞(Thermo Fisher)中过表达。为了选择稳定的scFv构建体，将过表达scFv蛋白的Expi293tm细胞的上清液在60℃下保持两小时。测试了加热的scFv蛋白与重组MUC1 SEA结构域结合的能力。热应激实验后，选择稳定的scFv scFv3-65P以进行进一步工程化。将更长的人工接头(GGGGS)4(SEQ ID NO:83)引入scFv3-65P中，取代原始(GGGGS)3(SEQ ID NO:84)接头，从而允许更好的scFv表达。所得scFv被命名为scFv3-96P。在scFv3-96P背景中，将具有潜在翻译后修饰风险的氨基酸取代为具有相似侧链的氨基酸，以产生构建体scFv3-98P、scFv3-99P和scFv3-00P至scFv3-07P。另外，为了最小化免疫原性，在scFv3-65P中引入的鼠回复突变在scFv3-96P的背景中突变回人氨基酸，产生构建体\scFv3-08P至scFv3-19P。将scFv3-98P、scFv3-99P和scFv3-00P至scFv3-19P的相对亲和力与scFv3-96P进行比较，并且然后选择任何有益的突变。数据呈现于表20中。
表20.在人源化BG346P中测试的额外突变
在测试每个单独的突变对亲和力的效应后，挑选出对scFv亲和力无害的突变并进行组合。对于具有PTM风险的氨基酸，目标是在不影响亲和力的情况下尽可能地去除它们。对于鼠突变，目标是将其尽可能多地转移回人氨基酸，以最小化免疫原性。最终，挑选出PTM风险最小且维持亲和力的鼠突变数目最少的构建体作为最终scFv，其为BG346P-scFv3-20P(或缩写为scFv3-20P)，如表21所示。
表21.在人源化BG346P中测试的组合突变
四种scFv的序列列于表22中。
表22.所选scFv片段的序列
表23.scFv的氨基酸接头的序列
SEQ ID NO 注释 序列
SEQ ID NO:83 AA接头 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
SEQ ID NO:84 AA接头 GGGGSGGGGSGGGGS
scFv1-78P、scFv2-14P、scFv2-57P和scFv3-20P的亲和力测定
通过表面等离子体共振(Biacore 8K)在25℃下测定纯化的scFv片段的结合亲和力和动力学常数。MUC1-SEA-mIgG2a偶联至CM5 Biocore传感器上，所述传感器经由与单克隆兔抗小鼠Fc抗体(目录号29215281)进行胺偶联而衍生化。然后经由30μl/min的速率流过scFv片段scFv1-78P、scFv2-14P、scFv2-57P和scFv3-20P。监测scFv与MUC1蛋白的缔合2分钟，并且监测scFv片段在缓冲液1x HBS(Cytiva，目录号：BR100669)中的解离持续10min。
Ka和Kd是通过使用BiacoreTMInsight评价软件将实时传感图拟合至1:1结合模型来确定。结合解离平衡常数(KD)由动力学速率计算为：KD(M)＝kd/ka。scFv蛋白与MUC1蛋白的结合动力学参数显示于表24中。
表24.25℃下scFv的Biacore结合亲和力
抗体 Ka(Ms-1) Kd(S-1) KD(摩尔)
scFv1-78P 1.85e+6 2.60e-3 1.40e-9
scFv2-14P 8.15e+5 4.25e-4 5.22e-10
scFv2-57P 3.97e+5 4.35e-4 1.10e-9
scFv3-20P 3.01e+5 2.02e-2 6.71e-8
实施例10.scFv片段与原生MUC1的结合活性
为了评价抗MUC1 scFv与活细胞表面上的MUC1的结合能力，将HEK293细胞工程化以过表达MUC1全长蛋白，如上所述。对于测定，将1x106个HEK293-MUC1细胞接种至96孔板中。为了产生scFv剂量反应曲线，将连续稀释的scFv蛋白(4.2pm至250nm)添加至细胞中，并且使用His标签抗体ifluor 488(目录号A01800)检测结合的scFv。使用流式细胞术仪器- 3(Sartorius)测量每个细胞群体的MFI(中位荧光强度)，并且使用四参数逻辑模型确定每个scFv的EC50和Emax。结果显示于表25中。
结果指示，所有scFv均维持了对细胞表面上的MUC1全长蛋白的亲和力。scFv1-78P、scFv2-14P和scFv2-57P与scFv3-20P相比，显示出较好的亲和力。
表25.scFv片段对原生MUC1的剂量依赖性结合的FACS和MFI
抗体 EC50(nM) MFI
scFv1-78P 3.873 309523
scFv2-14P 5.083 401851
scFv2-57P 5.247 402602
scFv3-20P 16.15 226489
实施例11.人源化scFv片段的表位定位
为了评估三个scFv片段scFv1-78P、scFv2(scFv2-14P和scFv2-57P在此实施例中统称为“scFv2”，因为它们具有相同的表位箱)和scFv3-20P是否能够彼此竞争与MUC1上相应的表位结合，使用串联方法进行了结合竞争测定。简而言之，MUC1-SEA-mIgG2a固定在CM5Biocore传感器上，所述传感器经由与单克隆兔抗小鼠Fc抗体(目录号29215281)进行胺偶联而衍生化。然后以10μl/min的速率流过第一scFv片段。监测MUC1-SEA-mIgG2a对第一scFv的捕获，持续1.5min。然后，以10μl/min的速率流过第二scFv片段，并且监测捕获，持续2min。scFv1-78P与scFv2(scFv2-14P、scFv2-57P)之间的竞争显示于图12中，而scFv3-20P属于另一分箱。
结果指示，scFv1-78P、scFv2-14P和scFv2-57P的表位至少部分重叠，而scFv3-20P的表位与其他三个表位不同。
实施例12.人源化scFv片段的物理性质
人源化scFv片段的疏水性、热稳定性和聚集倾向评估如下。
疏水性评估
为了使用HIC测定scFv1-78P、scFv2-14P、scFv2-57P和scFv3-20P的疏水性，将1mg/ml的50μg的样品用流动相A溶液(1.5M硫酸铵、50mm磷酸钠，pH 7.0)稀释，以实现在分析前约1M的最终硫酸铵浓度。使用来自Thermo Fisher的mabpac HIC-10柱，流动相A和流动相B溶液(50mm磷酸钠，pH 7.0)在29min内以0.5mg/min的流速的线性梯度。在A280吸光度处监测峰保留时间。结果总结于表26中。scFv1-78P(RT，14.2min)和scFv3-20P(RT，9.7min)比scFv2-14P(RT，20.5min)和scFv2-57P(RT，20.6min)显示出更高的亲水性。所有四个scFv结构域均显示出可接受的疏水性。
表26.HIC柱的保留时间
样品名称 保留时间(min)
scFv1-78P 14.2
scFv2-14P 20.5
scFv2-57P 20.6
scFv3-20P 9.7
热稳定性评估
通过外源荧光测量scFv1-78P、scFv2-14P、scFv2-57P和scFv3-20P的热稳定性，通过热展开转变中点Tm(℃)(熔化温度)来描述。使用来自Applied Biosystems的QuantStudioTM6Flex系统测定Tm。将20μl的1mg/ml样品与20μl的40XSYPRO橙色混合。以0.9℃/min的速率将板从25℃扫描至95℃。使用来自QuantStudioTM6 Flex系统分析软件的原始数据的一阶导数来分配Tm。结果总结于表27中。scFv1-78P(70.0℃)和scFv3-20P(69.8℃)显示出比scFv2-14P(60.0℃)和scFv2-57P(60.2℃)高约10℃的Tm。所有四个scFv结构域均显示出可接受的热稳定性。
表27.来自热位移测定的Tm值
样品名称 Tm(℃)
scFv1-78P 70.0
scFv2-14P 60.0
scFv2-57P 60.2
scFv3-20P 69.8
聚集倾向评估
为了确定scFv1-78P、scFv2-14P、scFv2-57P和scFv3-20P的聚集倾向，使用UncleTM系统(Unchained Labs)测量静态光散射强度。测量期间，将1mg/ml的约8.8μl的蛋白质样品加载至比色皿中；将样品在25℃下保持120s，并且然后以0.3℃/min的速率升温至95℃。散射数据以90°的角度收集，激光波长为266nm。通过Uncle分析软件对Tagg(聚集温度)进行分析和计算。结果总结于表28中。scFv3-20P(63.8℃)显示出比scFv1-78P(56.3℃)、scFv2-14P(54.5℃)和scFv2-57P(53.1℃)更高的Tagg。所有四个scFv结构域显示可接受的Tagg。
表28.来自SLS的Tagg值
样品名称 Tagg(℃)
scFv1-78P 56.3
scFv2-14P 54.5
scFv2-57P 53.1
scFv3-20P 63.8

Claims (22)

1.一种抗MUC1抗体或其抗原结合片段，所述抗MUC1抗体或其抗原结合片段特异性结合至人MUC1，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(i).重链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:4的HCDR1(重链互补决定区1)、(b)SEQ ID NO:5的HCDR2和(c)SEQ ID NO:6的HCDR3，以及轻链可变区，其包含：(d)SEQ ID NO:7的LCDR1、(e)SEQ ID NO:8的LCDR2和(f)SEQ ID NO:9的LCDR3；
(ii).重链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:4的HCDR1、(b)SEQ ID NO:5的HCDR2和(c)SEQID NO:6的HCDR3，以及轻链可变区，其包含：(d)SEQ ID NO:7的LCDR1、(e)SEQ ID NO:56的LCDR2和(f)SEQ ID NO:9的LCDR3；
(iii).重链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:14的HCDR1、(b)SEQ ID NO:15的HCDR2和(c)SEQ ID NO:16的HCDR3，以及轻链可变区，其包含：(d)SEQ ID NO:17的LCDR1、(e)SEQ IDNO:18的LCDR2和(f)SEQ ID NO:19的LCDR3；
(iv).重链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:78的HCDR1、(b)SEQ ID NO:79的HCDR2和(c)SEQ ID NO:16的HCDR3，以及轻链可变区，其包含：(d)SEQ ID NO:17的LCDR1、(e)SEQ IDNO:18的LCDR2和(f)SEQ ID NO:19的LCDR3；
(v).重链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:24的HCDR1、(b)SEQ ID NO:25的HCDR2和(c)SEQ ID NO:26的HCDR3，以及轻链可变区，其包含：(d)SEQ ID NO:27的LCDR1、(e)SEQ IDNO:28的LCDR2和(f)SEQ ID NO:29的LCDR3；
(vi).重链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:24的HCDR1、(b)SEQ ID NO:25的HCDR2和(c)SEQ ID NO:26的HCDR3，以及轻链可变区，其包含：(d)SEQ ID NO:27的LCDR1、(e)SEQ IDNO:65的LCDR2和(f)SEQ ID NO:29的LCDR3；或
(vii).重链可变区，其包含(a)SEQ ID NO:24的HCDR1、(b)SEQ ID NO:74的HCDR2和(c)SEQ ID NO:26的HCDR3，以及轻链可变区，其包含：(d)SEQ ID NO:27的LCDR1、(e)SEQ IDNO:65的LCDR2和(f)SEQ ID NO:29的LCDR3。
2.如权利要求1所述的抗MUC1抗体或其抗原结合片段，所述抗MUC1抗体或其抗原结合片段包含：
(i).包含与SEQ ID NO:10至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的重链可变区(VH)和包含与SEQ ID NO:11至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的轻链可变区(VL)；
(ii).包含与SEQ ID NO:20至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的重链可变区(VH)和包含与SEQ ID NO:21至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的轻链可变区(VL)；
(iii).包含与SEQ ID NO:30至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的重链可变区(VH)和包含与SEQ ID NO:31至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的轻链可变区(VL)；
(iv).包含与SEQ ID NO:57至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的重链可变区(VH)和包含与SEQ ID NO:59至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的轻链可变区(VL)；
(v).包含与SEQ ID NO:57至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的重链可变区(VH)和包含与SEQ IDNO:60至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的轻链可变区(VL)；
(vi).包含与SEQ ID NO:58至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的重链可变区(VH)和包含与SEQ ID NO:59至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的轻链可变区(VL)；
(vii).包含与SEQ ID NO:58至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的重链可变区(VH)和包含与SEQ ID NO:60至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的轻链可变区(VL)；
(viii).包含与SEQ ID NO:61至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的重链可变区(VH)和包含与SEQ ID NO:62至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的轻链可变区(VL)；
(ix).包含与SEQ ID NO:61至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的重链可变区(VH)和包含与SEQ ID NO:66至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的轻链可变区(VL)；
(x).包含与SEQ ID NO:61至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的重链可变区(VH)和包含与SEQ ID NO:68至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的轻链可变区(VL)；
(xi).包含与SEQ ID NO:71至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的重链可变区(VH)和包含与SEQ ID NO:72至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的轻链可变区(VL)；
(xii).包含与SEQ ID NO:75至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的重链可变区(VH)和包含与SEQ ID NO:76至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的轻链可变区(VL)；或
(xiii).包含与SEQ ID NO:80至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的重链可变区(VH)和包含与SEQ ID NO:81至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
3.如权利要求2所述的抗MUC1抗体或其抗原结合片段，所述抗MUC1抗体或其抗原结合片段包含：
(i).包含SEQ ID NO:10的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO:11的轻链可变区(VL)；
(ii).包含SEQ ID NO:20的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO:21的轻链可变区(VL)；
(iii).包含SEQ ID NO:30的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO:31的轻链可变区(VL)；
(iv).包含SEQ ID NO:57的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO:59的轻链可变区(VL)；
(v).包含SEQ ID NO:57的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO:60的轻链可变区(VL)；
(vi).包含SEQ ID NO:58的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO:59的轻链可变区(VL)；
(vii).包含SEQ ID NO:58的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO:60的轻链可变区(VL)；
(viii).包含SEQ ID NO:61的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO:62的轻链可变区(VL)；
(ix).包含SEQ ID NO:61的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO:66的轻链可变区(VL)；
(x).包含SEQ ID NO:61的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO:68的轻链可变区(VL)；
(xi).包含SEQ ID NO:71的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO:72的轻链可变区(VL)；
(xii).包含SEQ ID NO:75的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO:76的轻链可变区(VL)；或
(xiii).包含SEQ ID NO:80的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO:81的轻链可变区(VL)。
4.如权利要求3所述的抗MUC1抗体或其抗原结合片段，其中SEQ ID NO:10、11、20、21、30、31、57、58、59、60、61、62、66、68、71、72、75、76、80或81内的一、二、三、四、五、六、七、八、九或十个氨基酸已被插入、缺失或取代。
5.如权利要求1至4中任一项所述的抗MUC1抗体或其抗原结合片段，所述抗MUC1抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人工程化抗体、单链抗体(scFv)、Fab片段、Fab'片段或F(ab')2片段。
6.如权利要求5所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含scFv，所述scFv包含含有与SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:75或SEQ ID NO:80至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的VH和含有与SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:76或SEQ ID NO:81至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的VL。
7.如权利要求6所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含scFv，所述scFv包含含有SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:75或SEQ ID NO:80的VH和含有SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:76或SEQ ID NO:81的VL。
8.如权利要求7所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含scFv，所述scFv包含：
(i).包含与SEQ ID NO:57至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的VH和包含与SEQ ID NO:60至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的VL；
(ii).包含与SEQ ID NO:71至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的VH和包含与SEQ ID NO:72至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的VL；
(iii).包含与SEQ ID NO:75至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的VH和包含与SEQ ID NO:76至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的VL；或
(iv).包含与SEQ ID NO:80至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的VH和包含与SEQ ID NO:81至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的VL。
9.如权利要求8所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含scFv，所述scFv包含：
(i).包含SEQ ID NO:57的VH和包含SEQ ID NO:60的VL；
(ii).包含SEQ ID NO:71的VH和包含SEQ ID NO:72的VL；
(iii).包含SEQ ID NO:75的VH和包含SEQ ID NO:76的VL；或
(iv).包含SEQ ID NO:80的VH和包含SEQ ID NO:81的VL。
10.如权利要求9所述的抗体或其抗原结合片段，其中SEQ ID NO:57、60、71、72、75、76、80或81内的一、二、三、四、五、六、七、八、九或十个氨基酸已被插入、缺失或取代。
11.如权利要求10所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述scFv的所述VH和VL经由氨基酸接头连结。
12.如权利要求11所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述氨基酸接头包含SEQ IDNO:83或84。
13.如权利要求12所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述scFv包含SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:77或SEQ ID NO:82。
14.如权利要求1至13中任一项所述的抗MUC1抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段具有抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)。
15.如权利要求1至13中任一项所述的抗MUC1抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段具有降低的糖基化或无糖基化或低岩藻糖基化。
16.如权利要求1至13中任一项所述的抗MUC1抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含增加的二等分GlcNac结构。
17.如权利要求1至13中任一项所述的抗MUC1抗体或其抗原结合片段，其中Fc结构域是IgG1。
18.一种药物组合物，其包含如权利要求1至17中任一项所述的抗MUC1抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载剂。
19.一种分离的核酸，其编码如权利要求1至17中任一项所述的抗MUC1抗体或其抗原结合片段。
20.一种载体，其包含如权利要求19所述的核酸。
21.一种宿主细胞，其包含如权利要求19所述的核酸或如权利要求20所述的载体。
22.一种用于产生抗MUC1抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括培养如权利要求21所述的宿主细胞以及从培养物中回收所述抗体或抗原结合片段。
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