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CN120924600A - 一种以烟草by-2细胞为底盘生物合成人参皂苷的方法 - Google Patents

一种以烟草by-2细胞为底盘生物合成人参皂苷的方法

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CN120924600A
CN120924600A CN202511454424.XA CN202511454424A CN120924600A CN 120924600 A CN120924600 A CN 120924600A CN 202511454424 A CN202511454424 A CN 202511454424A CN 120924600 A CN120924600 A CN 120924600A
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CN
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ginsenoside
cells
tobacco
gene
vector
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Application number
CN202511454424.XA
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潘如雪
杨靖宇
曾设民
姚睿
袁博潇
张梦南
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Zhejiang Findyou Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Zhejiang Findyou Biotechnology Co ltd
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Application filed by Zhejiang Findyou Biotechnology Co ltd filed Critical Zhejiang Findyou Biotechnology Co ltd
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Abstract

本申请公开了一种以烟草BY‑2细胞为底盘生物合成人参皂苷的方法，属于生物工程技术领域。该方法包括以下步骤：首先，构建含有人参皂苷合成通路关键基因集的重组表达载体，所述基因集包括来源于人参的tHMGR、SE、SS等基因及来源于三七的Pn1‑31、Pn3‑31基因；其次，将重组载体导入烟草BY‑2细胞，通过固体培养基筛选获得纯系阳性细胞系；最后，将阳性细胞系在液体或固体培养基中培养，获得人参皂苷Rh2和/或Rg3。本发明利用烟草BY‑2细胞生长快、培养稳定的优势，成功重构了稀有人参皂苷合成通路，实现了稀有人参皂苷的高效异源合成，为其工业化生产提供了可重复的技术方案。

Description

一种以烟草BY-2细胞为底盘生物合成人参皂苷的方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及基因工程、植物细胞培养及天然产物生物合成技术，尤其涉及一种以烟草BY-2细胞为底盘生物合成人参皂苷的方法。
背景技术
人参皂苷是五加科人参属植物（如人参、三七、西洋参等）的主要活性次生代谢产物，具有显著的药理活性，包括抗肿瘤、免疫调节、心脑血管保护、神经保护等多种功效，在医药、保健品及化妆品领域具有广泛的应用价值。其中，稀有人参皂苷（如Rh2、Rg3、CK等）因具有更高的生物利用度和更强的药理活性，成为近年来天然产物研究的热点。
然而，稀有人参皂苷在天然人参属植物中的含量极低，通常仅为万分之一至十万分之一，且受植物生长周期长（3-5年）、栽培环境（土壤、气候）影响大、资源稀缺等因素限制，通过直接提取天然植物获取稀有人参皂苷的传统方法存在效率低下、成本高昂、资源依赖严重等问题，难以满足工业化生产和市场需求。
为突破天然来源限制，研究者们尝试通过化学合成、微生物异源合成或植物细胞工程等技术手段生产稀有人参皂苷。化学合成方法虽能实现部分皂苷的人工制备，但存在反应步骤繁琐、立体选择性差、有机溶剂污染严重、产物毒性残留等问题，难以应用于药用级产物的生产。微生物异源合成（如利用大肠杆菌、酵母菌等微生物作为底盘）通过引入关键合成基因构建代谢通路，虽在一定程度上提高了合成效率，但微生物作为原核或低等真核生物，缺乏植物特有的复杂post-翻译修饰系统，导致代谢通路兼容性差、产物积累量低，且难以合成结构复杂的稀有人参皂苷。
植物细胞培养技术因植物细胞具有完整的真核代谢系统，能够精准实现皂苷合成所需的羟基化、糖基化等修饰反应，成为稀有人参皂苷生物合成的理想平台。目前已报道的植物细胞底盘（如人参悬浮细胞、三七毛状根）虽能合成部分人参皂苷，但存在生长缓慢、遗传转化效率低、产物稳定性差、规模化培养难度大等问题，限制了其工业化应用。
因此，开发一种通过基因工程构建高效、稳定的稀有人参皂苷生物合成体系的方法，对于突破天然资源限制、降低生产成本、实现稀有人参皂苷的工业化生产具有重要意义。
发明内容
本发明目的在于针对背景技术中稀有人参皂苷天然来源稀缺、现有合成方法效率低、稳定性差等问题，通过基因工程手段在烟草 BY-2 细胞中重构完整的人参皂苷合成通路，提供一种高效、稳定，以烟草BY-2细胞为底盘生物合成人参皂苷的方法。
为了实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
一种以烟草BY-2细胞为底盘生物合成人参皂苷的方法，包括以下步骤：
（1）构建重组表达载体：将人参皂苷合成通路关键基因集导入基础载体pYLTAC380GW，获得重组表达载体
pYLTAC380GW-tHMGR-SE-SS-PgPPDs-PgDDS-Pn1-31-Pn3-31-FPS-IDI；所述关键基因集包括来源于人参的截断型3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因tHMGR、角鲨烯环氧酶基因SE、角鲨烯合酶基因SS、达马烯二醇合酶基因PgDDS、细胞色素P450基因PgPPDs、法尼基焦磷酸合酶基因FPS、异戊烯基焦磷酸异构酶基因IDI，以及来源于三七的基因Pn1-31和Pn3-31；
（2）转化烟草BY-2细胞：将步骤（1）所述重组表达载体导入烟草BY-2细胞，加入侵染液，暗培养2天；收集细胞，使用液体培养基洗涤细胞；
（3）阳性细胞系筛选：将洗涤后的细胞平铺于固体培养基上，暗培养2周后，挑愈伤组织转移至固体培养基进行筛选，获得纯系转基因阳性细胞系；
（4）人参皂苷合成培养：将阳性细胞系接种至烟草BY-2细胞液体或固体培养基中培养，收集培养物并检测获得人参皂苷。
进一步的，步骤（2）重组表达载体通过农杆菌介导法导入烟草BY-2细胞。
进一步的，所述的人参皂苷是人参皂苷Rh2和/或Rg3。
进一步的，步骤（1）中所述重组表达载体的构建包括：
（1）基因获取：从NCBI数据库获取FPS、IDI、SS、SE、PgDDS、PgPPDs、Pn1-31、Pn3-31及HMGR的原始基因序列，通过信号肽预测获得tHMGR，扩增并回收上述9个基因片段；
（2）中间载体构建：
①用限制性核酸内切酶KpnI和SalI双酶切供体质粒pYL322d1，将tHMGR、SS、Pn3-31-Pn1-31基因片段与酶切后的pYL322d1进行同源重组，获得pYL322d1-A供体载体；
②用限制性核酸内切酶KpnI和PstI双酶切供体质粒pYL322d2，将SE、PgDDS-PgPPDs基因片段与酶切后的pYL322d2进行同源重组，获得pYL322d2-B供体载体；
③用限制性核酸内切酶NcoI和HindIII双酶切供体质粒pYLMF-H，将FPS-IDI基因片段与酶切后的pYLMF进行同源重组，获得pYLMF-FPS-IDI供体载体；
（3）重组表达载体组装：
①取pYLTAC380GW骨架载体与pYL322d1-A供体载体共转化大肠杆菌NS3529，经卡那霉素和氯霉素双抗性筛选、I-SceI酶切及NotI酶切验证，获得pYLTAC380GW-tHMGR载体；
②取pYLTAC380GW-tHMGR载体与pYL322d2-B供体载体共转化大肠杆菌NS3529，经卡那霉素和氨苄青霉素双抗性筛选、PI-SceI酶切及NotI酶切验证，获得pYLTAC380GW-tHMGR-SE-SS-PgPPDs-PgDDS-Pn1-31-Pn3-31载体；
③取步骤②获得的载体与pYLMF-FPS-IDI供体载体，加入GatewayBPClonaseIIEnzymeMIX进行重组反应，经卡那霉素抗性和5%蔗糖筛选、酶切验证，获得最终重组表达载体pYLTAC380GW-tHMGR-SE-SS-PgPPDs-PgDDS-Pn1-31-Pn3-31-FPS-IDI。
进一步的，所述的侵染液：10mM MES, 10mM MgCl2, 115℃20分钟高温高压灭菌，冷却后加入150μM AS。
进一步的，所述的烟草BY-2细胞液体培养基：MS Salt4.4g/L，蔗糖30g/L，磷酸二氢钾0.255g/L，调节pH至5.0，115℃高压灭菌20分钟，冷却至65℃后添加1000×无菌激素母液，所述激素母液含0.2mg/mL2,4-D、1mg/mL硫胺素（Thiamine）、100mg/mL肌醇（Myo-inositol）。
进一步的，烟草BY-2细胞固体培养基：MS Salt4.4g/L，蔗糖30g/L，磷酸二氢钾0.255g/L，调节pH至5.8，加入7g/L植物凝胶，115℃高压灭菌20分钟，冷却至65℃后添加1000×无菌激素母液，所述激素母液含0.2mg/mL2,4-D、1mg/mL硫胺素（Thiamine）、100mg/mL肌醇（Myo-inositol）。
进一步的，所述的固体培养基中含有50mg/L潮霉素（Hygr）和200mg/L特美汀。
进一步的，步骤（4）所述液体培养条件为25℃、130rpm摇床培养7-14天，所述固体培养条件为25℃暗培养14天。
进一步的，所述的步骤（2）中所述侵染液与BY-2细胞的体积比例为3:50，离心收集条件为180g离心2分钟。
进一步的，步骤（3）中所述阳性细胞系经PCR鉴定，需包含完整的tHMGR、SE、SS、PgPPDs、PgDDS、Pn1-31、Pn3-31、FPS、IDI基因集。
一种以烟草BY-2细胞为底盘生物合成人参皂苷的方法获得的人参皂苷。
本申请通过以烟草BY-2细胞为底盘生物合成稀有人参皂苷的技术方案，取得了以下核心技术效果：
1.突破天然资源限制，实现稀有人参皂苷异源合成
成功在烟草BY-2细胞中重构了从基础代谢前体到稀有人参皂苷Rh2、Rg3的完整合成通路，摆脱了对天然人参属植物的依赖，解决了天然皂苷含量极低、获取困难的问题。
2.利用底盘优势提升合成效率与稳定性
依托烟草BY-2细胞生长速度快、悬浮培养状态稳定、遗传转化效率高的特性，经筛选获得的阳性细胞系可稳定合成目标皂苷。
3.优化培养与筛选体系，保障产物可控生产
通过明确培养基配方和培养条件，实现了转基因细胞系的高效筛选与稳定继代，解决了异源合成中产物积累不稳定的问题，为工业化放大生产提供了可重复的技术方案。
附图说明
图1：人参皂苷合成通路关键基因PCR扩增电泳图；
图2：pYL322d1-tHMGR、-SS、-Pn3-31-Pn1-31菌液PCR阳性鉴定结果；
图3：pYL322d2-SE、PgDDS-PgPPDs菌液PCR阳性鉴定结果；
图4：pYLMF-FPS-IDI菌液PCR阳性鉴定结果；
图5：pYLTAC380GW-tHMGR-SE-SS-PgPPDs-PgDDS-Pn3-31-Pn1-31菌液PCR阳性鉴定结果；
图6：pYLTAC380GW-tHMGR-SE-SS-PgPPDs-PgDDS-Pn3-31-Pn1-31NotI酶切电泳图；
图7：pYLTAC380GW-tHMGR-SE-SS-PgPPDs-PgDDS-Pn3-31-Pn1-31-FPS-IDI菌液PCR阳性鉴定电泳图；
图8：pYLTAC380GW-tHMGR-SE-SS-PgPPDs-PgDDS-Pn3-31-Pn1-31-FPS-IDINotI酶切电泳图；
图9：BY-2细胞转化后阳性克隆PCR鉴定结果（泳道标注：阳性CK为重组质粒对照，阴性CK为野生型BY-2细胞，1-6为候选阳性细胞系）；
图 10：阳性细胞系液体培养中 Rh2（上）和 Rg3（下）含量；
图 11：阳性细胞系继代后目的基因 PCR 鉴定结果（泳道 T1-T3和T7 为不同继代次数的阳性细胞系）。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本申请做进一步的说明。
实施例1：人参皂苷合成载体
pYLTAC380GW-tHMGR-SE-SS-PgPPDs-PgDDS-Pn1-31-Pn3-31-FPS-IDI的构建：
一、实验材料
供体质粒：pYL322d1、pYL322d2、pYLMF-H、pYLTAC380GW；
限制性核酸内切酶：KpnI、SalI、PstI、NcoI、HindIII、I-SceI、PI-SceI、NotI（购自NEB公司）；
工具酶：Gateway BP ClonaseII Enzyme MIX（购自Thermo Fisher公司）、高保真DNA聚合酶（购自Takara公司）；
大肠杆菌菌株：NS3529感受态细胞、NEB-10β感受态细胞（购自天根生化科技公司）；
培养基：LB固体培养基（含25mg/L卡那霉素Kan、15mg/L氯霉素ChI或15mg/L氨苄青霉素Amp）、LB液体培养基。
关键目的基因重组引物及PCR程序：
表1 关键目的基因同源重组引物
使用Takara 高保真酶PrimeSTAR进行PCR反应：
配制50μL PCR反应体系（模板2μL，上下游引物各1μL，2×Taq Mix 25μL，ddH2O补足至50μL）；
反应条件：98℃预变性2min；98℃变性10s，退火温度和延伸时间见表2，72℃延伸1min，共35个循环；72℃终延伸3min。
表2 目的基因扩增PCR程序
多片段构建过程中验证引物及PCR程序：
1：多片段构建过程中所涉及到的验证引物序列见表3：
表3 pYLTAC380GW各轮次验证引物
2：多片段构建过程中各轮验证的PCR程序：
94℃预变性2min；94℃变性30s，55-65℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃终延伸2min。
二、关键基因的获取与扩增
1.从NCBI数据库检索并获取人参皂苷合成通路关键基因序列：黄花蒿法尼基焦磷酸合酶基因（AaFPS）、拟南芥异戊烯基焦磷酸异构酶基因（AtIDI）、人参角鲨烯合酶基因（PgPSS，即SS）、人参角鲨烯环氧酶基因（PgSE，即SE）、人参达马烯二醇合酶基因（PgDDS）、人参细胞色素P450基因（PgPPDS）、三七基因Pn1-31、Pn3-31，以及人参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因（HMGR）。
2.使用在线信号肽预测软件SignalP5.0对HMGR基因的N端信号肽进行预测，截断信号肽编码序列后获得无细胞定位的截断基因tHMGR。
3.以人参和三七cDNA为模板，设计特异性引物，通过PCR扩增上述8个关键基因（tHMGR、SE、SS、PgDDS、PgPPDs、Pn1-31、Pn3-31、FPS-IDI），PCR产物经琼脂糖凝胶电泳验证，结果显示扩增片段大小与预期一致，见图1人参皂苷合成通路关键基因PCR扩增电泳图，回收目的片段备用。
三、中间供体载体的构建
1：供体载体pYL322d1-A的构建
（1）取供体质粒pYL322d1，用限制性核酸内切酶KpnI和SalI进行双酶切（37℃反应2h），酶切产物经琼脂糖凝胶电泳回收线性化载体骨架；
（2）将线性化pYL322d1与回收的tHMGR、SS、Pn3-31-Pn1-31基因片段通过同源重组酶连接，反应体系为：线性化载体50ng，各基因片段共100ng，重组酶2μL，ddH2O补足至10μL，37℃反应30min；
（3）将重组产物转化至大肠杆菌NEB-10 β感受态细胞，涂布于含Kan（25mg/L）的LB固体培养基，37℃过夜培养。挑取单菌落进行菌液PCR鉴定，结果显示阳性克隆扩增出与目的基因大小一致的条带，见图2 pYL322d1-tHMGR、-SS、-Pn3-31-Pn1-31菌液PCR阳性鉴定结果，提取质粒即为pYL322d1-A供体载体。
2.供体载体pYL322d2-B的构建
（1）取供体质粒pYL322d2，用限制性核酸内切酶KpnI和PstI双酶切（37℃反应2h），回收线性化载体骨架；
（2）将线性化pYL322d2与回收的SE、PgDDS-PgPPDs基因片段通过同源重组连接，反应条件同供体载体pYL322d1-A的构建；
（3）转化大肠杆菌NEB-10β感受态细胞，涂布于含Kan（25mg/L）的LB固体培养基，37℃过夜培养。菌液PCR鉴定显示阳性克隆扩增出目标条带，见图3pYL322d2-SE、PgDDS-PgPPDs菌液PCR阳性鉴定结果，提取质粒即为pYL322d2-B供体载体。
3.供体载体pYLMF-FPS-IDI的构建
（1）取供体质粒pYLMF-H，用限制性核酸内切酶NcoI和HindIII双酶切（37℃反应2h），回收线性化载体骨架。
（2）将线性化pYLMF-H与回收的FPS-IDI基因片段通过同源重组连接，反应条件同供体载体pYL322d1-A的构建。
（3）转化大肠杆菌NEB-10β感受态细胞，涂布于含Kan（25mg/L）的LB固体培养基，37℃过夜培养。菌液PCR鉴定显示阳性克隆扩增出目标条带，见图4pYLMF-FPS-IDI菌液PCR阳性鉴定结果，提取质粒即为pYLMF-FPS-IDI供体载体。
四、重组表达载体的多轮组装
1.第一轮组装：pYLTAC380GW-tHMGR的构建
（1）取300ng pYLTAC380GW质粒与500ng pYL322d1-A质粒混合，共同转化至大肠杆菌NS3529感受态细胞，涂布于含Kan（25mg/L）和ChI（15mg/L）的LB固体培养基，37℃培养72h；
（2）收集菌落并提取质粒，取50ng质粒加入1μLI-SceI酶和1μLBuffer，ddH2O补足至10μL，37℃反应5h；反应产物转化至大肠杆菌NEB-10β感受态细胞，涂布于含Kan（25mg/L）的LB固体培养基，37℃过夜培养；
（3）挑取单菌落进行PCR筛选，阳性克隆扩繁后提取质粒，用NotI酶切验证（37℃反应30min），琼脂糖凝胶电泳（150V，2-3h，冰上电泳）显示预期片段，见图5pYLTAC380GW-tHMGR-SE-SS-PgPPDs-PgDDS-Pn3-31-Pn1-31菌液PCR阳性鉴定结果，获得质粒pYLTAC380GW-tHMGR。
2.第二轮组装：pYLTAC380GW-tHMGR-SE-SS-PgPPDs-PgDDS-Pn1-31-Pn3-31的构建
（1）取300ngpYLTAC380GW-tHMGR质粒与500ngpYL322d2-B质粒混合，转化至大肠杆菌NS3529感受态细胞，涂布于含Kan（25mg/L）和Amp（15mg/L）的LB固体培养基，37℃培养48h。
（2）收集菌落并提取质粒，取50ng质粒加入1μL PI-SceI酶和1μL Buffer，ddH2O补足至10μL，37℃反应5h；反应产物转化至大肠杆菌NEB-10β感受态细胞，涂布于含Kan（25mg/L）的LB固体培养基，37℃过夜培养。
（3）阳性克隆经PCR筛选和NotI酶切验证，见图6，获得质粒pYLTAC380GW-tHMGR-SE-SS-PgPPDs-PgDDS-Pn1-31-Pn3-31。
3.最终组装：
pYLTAC380GW-tHMGR-SE-SS-PgPPDs-PgDDS-Pn1-31-Pn3-31-FPS-IDI的构建
（1）取150ngpYLTAC380GW-tHMGR-SE-SS-PgPPDs-PgDDS-Pn1-31-Pn3-31质粒、100ngpYLMF-FPS-IDI质粒与1μL Gateway BP ClonaseII Enzyme MIX混合，ddH2O补足至5μL，25℃反应5h；加入2μL Proteinase K，37℃反应15min终止反应。
(2)反应产物转化至大肠杆菌NEB-10β感受态细胞，涂布于含Kan（25mg/L）和5%蔗糖的LB固体培养基，37℃过夜培养。
(3)挑取单菌落进行菌液PCR鉴定，电泳显示阳性条带，见图7；提取质粒经NotI酶切验证，结果显示各基因片段均正确插入，见图8，最终获得重组表达载体pYLTAC380GW-tHMGR-SE-SS-PgPPDs-PgDDS-Pn1-31-Pn3-31-FPS-IDI。
实施例2：烟草BY-2细胞的转化及阳性细胞系筛选
一、试验材料
烟草BY-2细胞：实验室保存的野生型BY-2细胞系；
重组表达载体：实施例1构建的
pYLTAC380GW-tHMGR-SE-SS-PgPPDs-PgDDS-Pn1-31-Pn3-31-FPS-IDI；
农杆菌菌株：GV3101（含vir辅助质粒，实验室保存）；
培养基：BY-2液体标准培养基、BY-2固体筛选培养基（含50mg/L潮霉素（Hygr）和200mg/L特美汀（TM）），配方参照实施例1；
试剂：无菌水、ddH2O、DNA提取试剂盒（购自天根生化科技公司）、PCR试剂（购自Takara公司）；侵染液配方：10mM MES，10mM MgCl2，115℃高压灭菌20分钟，冷却后添加150μM AS（乙酰丁香酮）。
二、烟草BY-2细胞的悬浮培养与预处理
1.取平板上正常生长的野生型BY-2细胞1-2g，用镊子轻轻夹碎，分散至含50mLBY-2液体标准培养基的250mL广口锥形瓶中，无菌透气膜封口后置于25℃摇床，以130rpm转速培养7天；
2.按继代方案进行传代：取5mL培养至第7天的BY-2悬浮细胞，加入含45mL新鲜BY-2液体标准培养基的250mL广口锥形瓶中，25℃、130rpm继续培养3-5天，获得状态良好的BY-2细胞系。
三、农杆菌介导的重组载体转化烟草BY-2细胞
1.农杆菌预处理：将含重组表达载体的农杆菌GV3101接种至含50mg/L Kan的LB液体培养基，30℃、220rpm培养至OD600=0.5-0.8，5000rpm离心5分钟收集菌体，用上述侵染液重悬至OD600=0.6，备用；
2.侵染处理：取培养3-5天的BY-2细胞系，按细胞与农杆菌侵染液体积比3:50的比例混合，转移至250mL广口锥形瓶，无菌透气膜封口后置于25℃、130rpm摇床暗培养2天；
3.细胞洗涤：48h后，将混合液转移至50mL离心管，以180g离心2分钟收集细胞，弃上清；用BY-2液体标准培养基洗涤细胞3次（每次洗涤后180g离心2分钟），彻底去除残留农杆菌。
四、阳性细胞系的筛选与纯化
1.将洗涤后的细胞均匀平铺于BY-2固体筛选培养基（含50mg/LHygr和200mg/LTM）上，无菌透气膜封口后置于25℃暗培养；
2.培养2周后，挑选培养基上状态良好的亮黄色愈伤组织，转移至新的BY-2固体筛选培养基上进行第二轮筛选，25℃暗培养2周；
3.重复筛选步骤1-2次，获得形态均一、生长稳定的纯系转基因阳性细胞系。
五、阳性细胞系的PCR鉴定
1.分别取野生型BY-2细胞（阴性对照）和筛选获得的阳性细胞系，采用DNA提取试剂盒提取基因组DNA，调整浓度至200ng/μL；
2.以提取的DNA为模板，设计tHMGR、SE、SS、PgPPDs、PgDDS、Pn1-31、Pn3-31、FPS、IDI基因的特异性引物，配制50μL PCR反应体系（模板2μL，上下游引物各1μL，2×Taq Mix25μL，ddH2O补足至50μL），反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃终延伸10min；
3.PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示阳性细胞系均扩增出与目标基因大小一致的条带，而野生型细胞无对应条带，见图9，表明目的基因集已整合至烟草BY-2细胞基因组中。
实施例3：烟草BY-2阳性细胞系合成人参皂苷的培养与检测
一、试验材料
阳性细胞系：实施例2筛选获得的阳性细胞系1、2、3、7；
培养基：BY-2液体标准培养基、BY-2固体标准培养基（配方同实施例2）；
试剂：人参皂苷Rh2、Rg3、Rd标准品（购自Sigma公司）、甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）、超纯水。
二、阳性细胞系的扩大培养
1.液体培养：取阳性细胞系1、2、3、7的愈伤组织各1-2g，分别接种至含50mLBY-2液体标准培养基的250mL广口锥形瓶中，25℃、130rpm摇床培养，每7天继代一次，分别收集培养5d、7d、14d的细胞样品；
2.固体培养：取阳性细胞系1、2、3、7的愈伤组织各0.5g，分别接种至BY-2固体标准培养基上，25℃暗培养14天，收集愈伤组织样品。
三、人参皂苷的提取与检测
①样品预处理：取收集的细胞或愈伤组织样品，冷冻干燥后研磨成粉末，精确称取100mg粉末，加入1mL70%甲醇溶液，超声提取30min（功率300W，温度40℃）；4℃、12000rpm离心10min，取上清过0.22μm有机滤膜，待测；
②HPLC检测条件：色谱柱为C18柱（250×4.6mm，5μm）；流动相为乙腈：水=30:70（v/v）；流速1mL/min；检测波长203nm；柱温30℃；进样量10μL；
③标准曲线绘制：分别配制0.1μg/mL、1μg/mL、10μg/mL、50μg/mL、100μg/mL的Rh2、Rg3、Rd标准品溶液，按上述色谱条件检测，以标准品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线（R²均>0.999）。
四、检测结果分析
①液体培养样品：阳性细胞系1、2、3在培养14d时Rh2含量最高（约10μg/g），Rg3含量约5μg/g；随着培养时间延长，Rd含量逐渐减少，Rh2含量在14d达到峰值，见图10；
②固体培养样品：阳性细胞系的愈伤组织中Rg3含量显著高于液体培养细胞，其中细胞系2的愈伤组织中Rg3含量达150μg/g，Rh2和Rd未检出或含量极低；
表 4：烟草 BY-2 愈伤组织中人参皂苷 Rh2、Rg3、Rd 的检测结果
③稳定性验证：阳性细胞系继代5次后，PCR鉴定仍显示完整基因集，见图11，HPLC检测显示Rg3和Rh2含量波动<10%，表明合成体系具有良好的稳定性。
以上均为本申请的较佳实施例，并非依此限制本申请的保护范围，依本发明申请专利范围所述特征及原理所做的等效变化或修饰，均应包括于本发明申请专利范围内。

Claims (10)

1.一种以烟草BY-2细胞为底盘生物合成人参皂苷的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）构建重组表达载体：将人参皂苷合成通路关键基因集导入载体pYLTAC380GW，获得重组表达载体pYLTAC380GW-tHMGR-SE-SS-PgPPDs-PgDDS-Pn1-31-Pn3-31-FPS-IDI；
（2）转化烟草BY-2细胞：将步骤（1）所述重组表达载体导入烟草BY-2细胞，加入侵染液，暗培养，收集细胞；
（3）阳性细胞系筛选；
（4）人参皂苷合成培养：将阳性细胞系接种至烟草BY-2细胞液体或固体培养基中培养，收集培养物获得人参皂苷。
2.根据权利要求1所述的一种以烟草BY-2细胞为底盘生物合成人参皂苷的方法，其特征在于，所述的所述人参皂苷合成通路关键基因集包括来源于人参的截断型3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因tHMGR、角鲨烯环氧酶基因SE、角鲨烯合酶基因SS、达马烯二醇合酶基因PgDDS、细胞色素P450基因PgPPDs、法尼基焦磷酸合酶基因FPS、异戊烯基焦磷酸异构酶基因IDI，以及来源于三七的基因Pn1-31和Pn3-31。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（1）中所述重组表达载体的构建包括：
（1）基因获取：从NCBI数据库获取FPS、IDI、SS、SE、PgDDS、PgPPDs、Pn1-31、Pn3-31及HMGR的原始基因序列，通过信号肽预测获得tHMGR，扩增并回收上述9个基因片段；
（2）中间载体构建：
①用限制性核酸内切酶KpnI和SalI双酶切供体质粒pYL322d1，将tHMGR、SS、Pn3-31-Pn1-31基因片段与酶切后的pYL322d1进行同源重组，获得pYL322d1-A供体载体；
②用限制性核酸内切酶KpnI和PstI双酶切供体质粒pYL322d2，将SE、PgDDS-PgPPDs基因片段与酶切后的pYL322d2进行同源重组，获得pYL322d2-B供体载体；
③用限制性核酸内切酶NcoI和HindIII双酶切供体质粒pYLMF-H，将FPS-IDI基因片段与酶切后的pYLMF进行同源重组，获得pYLMF-FPS-IDI供体载体；
（3）重组表达载体组装：
①取pYLTAC380GW骨架载体与pYL322d1-A供体载体共转化大肠杆菌NS3529，经卡那霉素和氯霉素双抗性筛选、I-SceI酶切及NotI酶切验证，获得pYLTAC380GW-tHMGR载体；
②取pYLTAC380GW-tHMGR载体与pYL322d2-B供体载体共转化大肠杆菌NS3529，经卡那霉素和氨苄青霉素双抗性筛选、PI-SceI酶切及NotI酶切验证，获得pYLTAC380GW-tHMGR-SE-SS-PgPPDs-PgDDS-Pn1-31-Pn3-31载体；
③取步骤②获得的载体与pYLMF-FPS-IDI供体载体，加入GatewayBPClonaseIIEnzymeMIX进行重组反应，经卡那霉素抗性和5%蔗糖筛选、酶切验证，获得最终重组表达载体pYLTAC380GW-tHMGR-SE-SS-PgPPDs-PgDDS-Pn1-31-Pn3-31-FPS-IDI。
4.根据权利要求1所述的一种以烟草BY-2细胞为底盘生物合成人参皂苷的方法，其特征在于，所述的侵染液：10mM MES,10mM MgCl2，115℃20分钟高温高压灭菌，冷却后加入150μMAS。
5.根据权利要求1所述的一种以烟草BY-2细胞为底盘生物合成人参皂苷的方法，其特征在于，所述的烟草BY-2细胞液体培养基：MS Salt4.4g/L，蔗糖30g/L，磷酸二氢钾0.255g/L，调节pH至5.0，115℃高压灭菌20分钟，冷却至65℃后添加1000×无菌激素母液，所述激素母液含0.2mg/mL2,4-D、1mg/mL硫胺素、100mg/mL肌醇。
6.根据权利要求1所述的一种以烟草BY-2细胞为底盘生物合成人参皂苷的方法，其特征在于，烟草BY-2细胞固体培养基：MS Salt4.4g/L，蔗糖30g/L，磷酸二氢钾0.255g/L，调节pH至5.8，加入7g/L植物凝胶，115℃高压灭菌20分钟，冷却至65℃后添加1000×无菌激素母液，所述激素母液含0.2mg/mL2,4-D、1mg/mL硫胺素、100mg/mL肌醇。
7.根据权利要求6所述的一种以烟草BY-2细胞为底盘生物合成人参皂苷的方法，其特征在于，所述的固体培养基中含有50mg/L潮霉素和200mg/L特美汀。
8.根据权利要求1所述的一种以烟草BY-2细胞为底盘生物合成人参皂苷的方法，其特征在于，步骤（4）液体培养条件为25℃、130rpm摇床培养7-14天，固体培养条件为25℃暗培养14天。
9.根据权利要求1所述的一种以烟草BY-2细胞为底盘生物合成人参皂苷的方法，其特征在于，所述的步骤（2）中所述侵染液与BY-2细胞的体积比例为3:50，离心收集条件为180g离心2分钟。
10.根据权利要求1-9任何一项所述的一种以烟草BY-2细胞为底盘生物合成人参皂苷的方法获得的人参皂苷。
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