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CN120924506A - 酶突变体的组合物及其在制备二（月桂酰胺谷氨酰胺）赖氨酸盐中的应用 - Google Patents

酶突变体的组合物及其在制备二（月桂酰胺谷氨酰胺）赖氨酸盐中的应用

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CN120924506A
CN120924506A CN202511163991.XA CN202511163991A CN120924506A CN 120924506 A CN120924506 A CN 120924506A CN 202511163991 A CN202511163991 A CN 202511163991A CN 120924506 A CN120924506 A CN 120924506A
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CN
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mutant
enzyme
ligase
lysine
peptide
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CN202511163991.XA
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陈淋转
于铁妹
胡婉蓉
孔令辉
雷洪
刘建
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Shenzhen Readline Biotechnology Co ltd
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Shenzhen Readline Biotechnology Co ltd
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Abstract

本发明涉及酶工程技术领域，具体涉及酶突变体的组合物及其在制备二（月桂酰胺谷氨酰胺）赖氨酸盐中的应用。本发明提供了一种全酶法合成二（月桂酰胺谷氨酰胺）赖氨酸盐或其钠盐的工艺，该工艺充分发挥酶法催化的高效性和底物特异性，避免了传统化学合成中复杂的化学反应及保护基操作，显著减少了副产物的生成，同时实现了对目标产物的定点修饰与精准组装。这一技术为化妆品级高纯度二（月桂酰胺谷氨酰胺）赖氨酸盐或其钠盐的连续化生产提供了高效、绿色的解决方案，具有重要的工业应用价值。

Description

酶突变体的组合物及其在制备二（月桂酰胺谷氨酰胺）赖氨酸 盐中的应用
技术领域
本发明涉及酶工程技术领域，具体涉及酶突变体的组合物及其在制备二（月桂酰胺谷氨酰胺）赖氨酸盐中的应用。
背景技术
二（月桂酰胺谷氨酰胺）赖氨酸钠是二（月桂酰胺谷氨酰胺）赖氨酸盐中的一种，其是一种由天然氨基酸（谷氨酸与赖氨酸）通过月桂酸酯化合成的双阳离子型氨基酸表面活性剂，兼具优异的乳化稳定性与温和的皮肤亲和力。其分子结构中融合了亲水与疏水基团，使其在水包油及油包水型乳剂体系中表现出良好的相容性与稳定性。作为新型生物活性乳化剂，其不仅具备温和清洁、低刺激性与良好皮肤相容性，还能通过调节皮肤表面电荷平衡，温和去除多余油脂与污垢，同时维持角质层水合状态，避免过度脱脂引发的屏障损伤。其分子中的双阳离子结构可有效中和阴离子杂质，提升清洁力与泡沫稳定性。此外，该成分还可模拟天然磷脂膜结构，增强乳剂与皮肤的亲和力，促进活性成分渗透与吸收；其三肽结构单元更可温和调节皮肤微生态，增强肌肤屏障功能，缓解干燥、泛红等敏感问题。在配方应用中，二（月桂酰胺谷氨酰胺）赖氨酸钠不仅可作为高效乳化剂使用，还可协同抗老、舒缓、保湿等活性成分，提升产品整体功效与使用感。其低致敏性、高生物相容性及环保可降解特性，使其成为高端护肤、敏感肌护理及绿色配方开发中的理想选择。
目前市面上二（月桂酰胺谷氨酰胺）赖氨酸钠的制备方法主要是化学合成法。由于其作为一种两亲性氨基酸衍生物，通常通过多步化学反应实现，主要有三种典型合成工艺。第一种基于专利WO2004/020394，通过N-月桂酰谷氨酸酐与赖氨酸在水或水/有机溶剂中反应，生成目标化合物后转化为钠盐。第二种为两步法，首先在碱性条件下将L-谷氨酸与月桂酸酰化生成二月桂酰谷氨酸，再在脱水剂存在下与赖氨酸缩合形成酰胺键，最后中和成钠盐。第三种是一锅法，将月桂酸、L-谷氨酸和L-赖氨酸在催化剂和加热条件下直接缩合，通过移除反应生成的水推动反应进行，并最终中和得到产物。然而，这些传统化学合成方法通常涉及复杂的多步反应和保护基操作，限制了其在高纯度化妆品级产品中的应用。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供酶突变体的组合物及其在制备二（月桂酰胺谷氨酰胺）赖氨酸盐中的应用，本发明提供了以L-赖氨酸盐、L-谷氨酸盐和月桂酸为原料，经定向进化改造的酯化酶与连接酶协同催化体系，实现月桂酰谷氨酸与赖氨酸的高效、选择性偶联，从而制备二（月桂酰胺谷氨酰胺）赖氨酸盐或其钠盐的技术方案。
本发明提供了酶突变体的组合物，所述组合物包括包括谷赖二肽连接酶、谷赖谷三肽连接酶、月桂酰谷赖三肽合成酶和ATP再生酶，其中：
所述谷赖二肽连接酶来源于嗜鱼发光杆菌Photobacterium piscicola，所述谷赖二肽连接酶的突变位点包括D75E、A177S、Y186T、E315H和N424D中的至少一个；
所述谷赖谷三肽连接酶来源于肠杆菌Enterobacillus tribolii，所述谷赖谷三肽连接酶的突变位点包括D77Q、M79I、R84H、N186K、S201V、I204L、P302Q、G322L和E325N中的至少一个；
所述月桂酰谷赖三肽合成酶来源于拟分枝杆菌Mycobacteroides abscessus，所述月桂酰谷赖三肽合成酶的突变位点包括L18A、E91D E93K、L100F、V172S、L173G、R194E、V198I、T288S、I423W和T424H中的至少一个；
所述ATP再生酶来源于指孢囊菌Clostridium thailandense，所述ATP再生酶的突变位点包括G70N、D72N、I75M、V134T和R211E中的至少一个。
在一些实施例中，所述组合物包括谷赖二肽连接酶的突变体、谷赖谷三肽连接酶的突变体、月桂酰谷赖三肽合成酶的突变体和ATP再生酶的突变体，其中：
所述谷赖二肽连接酶的突变体具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述谷赖谷三肽连接酶的突变体具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，所述月桂酰谷赖三肽合成酶的突变体具有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，所述ATP再生酶的突变体具有如SEQ IDNO:4所示的氨基酸序列。
本发明提供了固定化酶，包括所述的酶突变体的组合物。
本发明提供了编码如下（1）和/或（2）中至少一项的核酸分子：
（1）、所述的酶突变体的组合物；
（2）、所述的固定化酶。
在一些实施例中，包括编码谷赖二肽连接酶的突变体的核酸分子、编码谷赖谷三肽连接酶的突变体的核酸分子、编码月桂酰谷赖三肽合成酶的突变体的核酸分子和编码ATP再生酶的突变体的核酸分子，其中：
所述编码谷赖二肽连接酶的突变体的核酸分子具有如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，所述编码谷赖谷三肽连接酶的突变体的核酸分子具有如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列，所述编码月桂酰谷赖三肽合成酶的突变体的核酸分子具有如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列，所述编码ATP再生酶的突变体的核酸分子具有如SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列。
本发明提供了表达载体或宿主细胞，所述表达载体包含所述的核酸分子；
所述宿主细胞转染或转化所述表达载体。
本发明提供了如下①~④中至少一项在制备二（月桂酰胺谷氨酰胺）赖氨酸盐中的应用：
①、所述的酶突变体的组合物；
②、所述的固定化酶；
③、所述的核酸分子；
④、所述的表达载体或宿主细胞。
在一些具体实施例中，所述二（月桂酰胺谷氨酰胺）赖氨酸盐为二（月桂酰胺谷氨酰胺）赖氨酸钠。
本发明提供了二（月桂酰胺谷氨酰胺）赖氨酸盐的制备方法，其特征在于，以L-赖氨酸盐、L-谷氨酸盐和月桂酸为原料，经如下Ⅰ~Ⅳ中至少一项转化制得二（月桂酰胺谷氨酰胺）赖氨酸盐；
Ⅰ、所述的酶突变体的组合物；
Ⅱ、所述的固定化酶；
Ⅲ、所述的核酸分子；
Ⅳ、所述的表达载体或宿主细胞。
在一些实施例中，所述制备方法包括分步制备或一次性制备：
所述分步制备包括：
以L-赖氨酸盐和L-谷氨酸盐为原料，经所述谷赖二肽连接酶的突变体和所述ATP再生酶的突变体催化生成谷氨酸-赖氨酸二肽；
所述谷氨酸-赖氨酸二肽经所述谷赖谷三肽连接酶的突变体和所述ATP再生酶的突变体催化生成谷氨酸-赖氨酸-谷氨酸三肽；
所述谷氨酸-赖氨酸-谷氨酸三肽经所述月桂酰谷赖三肽合成酶的突变体和所述ATP再生酶的突变体催化、除蛋白后，所得溶液在氢氧化钠的作用下生成所述二（月桂酰胺谷氨酰胺）赖氨酸盐。
所述一次性制备包括取L-赖氨酸盐、L-谷氨酸盐、月桂酸、谷赖二肽连接酶的突变体、谷赖谷三肽连接酶的突变体、月桂酰谷赖三肽合成酶的突变体和ATP再生酶的突变体，经混合反应、除蛋白后，所得溶液在氢氧化钠的作用下生成所述二（月桂酰胺谷氨酰胺）赖氨酸盐。
在一些实施例中，其特征在于，
所述L-赖氨酸盐、L-谷氨酸盐、月桂酸、谷赖二肽连接酶的突变体、谷赖谷三肽连接酶的突变体、月桂酰谷赖三肽合成酶的突变体和ATP再生酶的突变体的比例为（20~50mM）:（50~80mM）：（20~50mM）：（500~1500U）：（500~1500U）：（500~1500U）：（3000~5000U）。
在一些具体实施例中，所述L-赖氨酸盐、L-谷氨酸盐、月桂酸、谷赖二肽连接酶的突变体、谷赖谷三肽连接酶的突变体、月桂酰谷赖三肽合成酶的突变体和ATP再生酶的突变体的比例为30mM:66mM：36mM：1000U：1000U：1000U：4500U。
在一些具体实施例中，所述二（月桂酰胺谷氨酰胺）赖氨酸盐为二（月桂酰胺谷氨酰胺）赖氨酸钠，所述L-赖氨酸盐为L-赖氨酸钠盐，所述L-谷氨酸盐为L-谷氨酸钠盐。
本发明提供了一种全酶法合成二（月桂酰胺谷氨酰胺）赖氨酸盐或其钠盐的工艺，以L-谷氨酸盐或其钠盐（L-Glu）和L-赖氨酸盐或其钠盐（L-Lys）为起始原料，通过液体酶PpLigase高效制备谷氨酸-赖氨酸二肽；在此基础上，利用液体酶EtLigase将二肽与谷氨酸连接，生成谷氨酸-赖氨酸-谷氨酸三肽；最终，以三肽与月桂酸为原料，借助液体酶LauEKEMaLigase精准合成二（月桂酰胺谷氨酰胺）赖氨酸盐或其钠盐。该工艺充分发挥酶法催化的高效性和底物特异性，避免了传统化学合成中复杂的化学反应及保护基操作，显著减少了副产物的生成，同时实现了对目标产物的定点修饰与精准组装。这一技术为化妆品级高纯度二（月桂酰胺谷氨酰胺）赖氨酸盐或其钠盐的连续化生产提供了高效、绿色的解决方案，具有重要的工业应用价值。
附图说明
图1示本发明全酶法合成二（月桂酰胺谷氨酰胺）赖氨酸钠的合成路线；
图2示本发明所制备的酶的SDS-PAGE凝胶检测图，其中M：蛋白标准marker，1为CtPPK，2为LauEKEMaSyn，3为EtLigase，4为PpLigase；
图3示实施例2的合成反应式；
图4示实施例3的合成反应式；
图5示实施例4的合成反应式；
图6示实施例5的合成反应式；
图7示实施例5制备获得的二（月桂酰胺谷氨酰胺）赖氨酸钠HPLC检测结果；
图8示实施例5制备获得的二（月桂酰胺谷氨酰胺）赖氨酸钠1H-NMR检测结果；
图9示实施例6的合成反应式；
图10示对比例的合成反应式。
具体实施方式
本发明提供了酶突变体的组合物及其在制备二（月桂酰胺谷氨酰胺）赖氨酸钠中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
现有技术中，传统酯化法合成二（月桂酰胺谷氨酰胺）赖氨酸盐或其钠盐需在高温高压下进行，依赖强酸强碱催化剂，反应条件苛刻，能耗高且副产物多，难以满足绿色生产要求；而分步缩合法需多次纯化中间体，工艺流程长，成本高且产率不稳定；固相合成法则受限于树脂负载与洗脱条件，易引入杂质，影响最终产物纯度。本专利创新性地采用全酶法合成策略（制备路线如图1所示），通过定向进化改造的酯化酶与连接酶协同催化体系，实现月桂酰谷氨酸与赖氨酸的高效、选择性偶联；反应在常温常压下进行，无需有毒溶剂与催化剂，显著降低能耗与污染；同时，通过多酶级联反应设计，实现反应路径的连续化与高通量，大幅提升产物得率与纯度。该方法不仅简化了合成流程、降低了生产成本，更为化妆品级二（月桂酰胺谷氨酰胺）赖氨酸盐或其钠盐的绿色、高效、规模化生产提供了可行路径，有效解决了传统工艺中反应条件苛刻、污染严重、成本高昂的核心问题。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明。
实施例1 四种液体酶的制备
本实施例提供了四种液体酶，包括谷赖二肽连接酶 (PpLigase)、谷赖谷三肽连接酶(EtLigase)、月桂酰谷赖三肽合成酶(LauEKEMaSyn)和ATP再生酶 (CtPPK)。
1、酶的具体信息：
谷赖二肽连接酶 (PpLigase): 来源于嗜鱼发光杆菌(Photobacteriumpiscicola, Uniprot ID: A0A1T5I2V4),该天然酶(WTPpLigase)对L-谷氨酸及L-赖氨酸具有一定的活性，通过定点改造后(PpLigase)其活力及稳定性都有所提高，具体突变位点是：D75E、A177S、Y186T、E315H 、N424D。
PpLigase的氨基酸序列：
MTFSERLQQVAKNPEALTQLGRGLERESLRITEDLQVSSLPHPTALGSALTNKWITTDFAESLLEFITPVSRDVEDLLAQLDDIHKFSLSHMAGERLWPMSMPCFVGDQDEIELAQYGSSNTGQMKTLYREGLKRRYGSVMQIISGVHFNFSFPDTFWDSLFGDQTEQQRQDSVSDSYFGLIRNYTRFGWLIPYLFGSSPALCGSFIQNEALKASFEKVGKGTYFLENATALRLSDLGYTNHAQSSLKIGFNSIDQYLTGLNSAIHTPSEEFSELGVMVDGKRQQLNSNVLQIENELYAPIRPKRVAKSGEKPSHALKRAGVEYIEVRSLDVNPFSPIGIDEDQVRFLDLFLIWATLTPSPDMTDCELACWRENWNKVVVDGRNPELLLKIGCHGEELLLKAWGRRVFAELEQVAITLDGLYGDDKYQQTHQRLLTWIEDPQLTFSAKLLDQIKTYQGIGPLGDYYATAHAKQLAQQAFRFYDQATFEQEVAASVIKQHQIEQSDTLSFDEFLADYFADVDVEIPMLTK（SEQ ID NO:1）
PpLigase的核苷酸序列：
atgacctttagcgaacgcctgcagcaggtggcgaaaaacccggaagcgctgacccagctgggccgcggcctggaacgcgaaagcctgcgcattaccgaagatctgcaggtgagcagcctgccgcatccgaccgcgctgggcagcgcgctgaccaacaaatggattaccaccgattttgcggaaagcctgctggaatttattaccccggtgagccgcgatgtggaagatctgctggcgcagctggatgatattcataaatttagcctgagccatatggcgggcgaacgcctgtggccgatgagcatgccgtgctttgtgggcgatcaggatgaaattgaactggcgcagtatggcagcagcaacaccggccagatgaaaaccctgtatcgcgaaggcctgaaacgccgctatggcagcgtgatgcagattattagcggcgtgcattttaactttagctttccggataccttttgggatagcctgtttggcgatcagaccgaacagcagcgccaggatagcgtgagcgatagctattttggcctgattcgcaactatacccgctttggctggctgattccgtatctgtttggcagcagcccggcgctgtgcggcagctttattcagaacgaagcgctgaaagcgagctttgaaaaagtgggcaaaggcacctattttctggaaaacgcgaccgcgctgcgcctgagcgatctgggctataccaaccatgcgcagagcagcctgaaaattggctttaacagcattgatcagtatctgaccggcctgaacagcgcgattcataccccgagcgaagaatttagcgaactgggcgtgatggtggatggcaaacgccagcagctgaacagcaacgtgctgcagattgaaaacgaactgtatgcgccgattcgcccgaaacgcgtggcgaaaagcggcgaaaaaccgagccatgcgctgaaacgcgcgggcgtggaatatattgaagtgcgcagcctggatgtgaacccgtttagcccgattggcattgatgaagatcaggtgcgctttctggatctgtttctgatttgggcgaccctgaccccgagcccggatatgaccgattgcgaactggcgtgctggcgcgaaaactggaacaaagtggtggtggatggccgcaacccggaactgctgctgaaaattggctgccatggcgaagaactgctgctgaaagcgtggggccgccgcgtgtttgcggaactggaacaggtggcgattaccctggatggcctgtatggcgatgataaatatcagcagacccatcagcgcctgctgacctggattgaagatccgcagctgacctttagcgcgaaactgctggatcagattaaaacctatcagggcattggcccgctgggcgattattatgcgaccgcgcatgcgaaacagctggcgcagcaggcgtttcgcttttatgatcaggcgacctttgaacaggaagtggcggcgagcgtgattaaacagcatcagattgaacagagcgataccctgagctttgatgaatttctggcggattattttgcggatgtggatgtggaaattccgatgctgaccaaataa（SEQ ID NO:5）
谷赖谷三肽连接酶(EtLigase):来源于肠杆菌(Enterobacillus tribolii,Uniprot ID: A0A370Q8C0)，该天然酶(WTEtLigase)对L-谷氨酸及L-谷氨酸-赖氨酸二肽有很微弱的活性，通过系统改造后(EtLigase)其表达及活力都有所提高，具体突变位点是：D77Q、M79I、R84H、N186K、S201V、I204L、P302Q、G322L、E325N。
EtLigase的氨基酸序列：
MIPDVSKALTWLEAHPDALNGIRRGIERETLRVTPDGHLAQTGHPAVLGKAFTHPWITTDFAETLLEFITPVDASIQHILAFLHDIHRYVARNLGNERMWPMSMPCFIGKEEDIVLAQYGTSNQGRFKTLYREGLKNRYGALMQTISGVHYNFSLPIEFWQAWAGVTDAESGKEKISAGYFRLIRKYYRFGWVIPYLFGAVPALCSSFLNGRETNLPFERSGKGMLYLPYATSLRLSDLGYTNKSQSNLGITFNDLDGYVTALKKAIHTPSPEFARLGVNVDGHYRQLNANVLQIENELYAQIRPKRVTKGSESPSDALLRLGINYIEVRSLDINPFTAIGVNAEQSRFLDLFLIWCVLADAPEMSSEELMCTRKNWNRVILEGRKPGQTIGIGCDSAREPLDKVGKSLFADLYRVAEVLDSINGNEQYQRVCTKLVTFFDDVSQTYSARVLEAMKSQGIGGFGLSLAEGYREALCHEPFEVLTPAMLDEQQKKSVEKQAMLEAQDTISFEEYLALHAGR（SEQID NO:2）
EtLigase的核苷酸序列：
atgattccggatgtgagcaaagcgctgacctggctggaagcgcatccggatgcgctgaacggcattcgccgcggcattgaacgcgaaaccctgcgcgtgaccccggatggccatctggcgcagaccggccatccggcggtgctgggcaaagcgtttacccatccgtggattaccaccgattttgcggaaaccctgctggaatttattaccccggtggatgcgagcattcagcatattctggcgtttctgcatgatattcatcgctatgtggcgcgcaacctgggcaacgaacgcatgtggccgatgagcatgccgtgctttattggcaaagaagaagatattgtgctggcgcagtatggcaccagcaaccagggccgctttaaaaccctgtatcgcgaaggcctgaaaaaccgctatggcgcgctgatgcagaccattagcggcgtgcattataactttagcctgccgattgaattttggcaggcgtgggcgggcgtgaccgatgcggaaagcggcaaagaaaaaattagcgcgggctattttcgcctgattcgcaaatattatcgctttggctgggtgattccgtatctgtttggcgcggtgccggcgctgtgcagcagctttctgaacggccgcgaaaccaacctgccgtttgaacgcagcggcaaaggcatgctgtatctgccgtatgcgaccagcctgcgcctgagcgatctgggctataccaacaaaagccagagcaacctgggcattacctttaacgatctggatggctatgtgaccgcgctgaaaaaagcgattcataccccgagcccggaatttgcgcgcctgggcgtgaacgtggatggccattatcgccagctgaacgcgaacgtgctgcagattgaaaacgaactgtatgcgcagattcgcccgaaacgcgtgaccaaaggcagcgaaagcccgagcgatgcgctgctgcgcctgggcattaactatattgaagtgcgcagcctggatattaacccgtttaccgcgattggcgtgaacgcggaacagagccgctttctggatctgtttctgatttggtgcgtgctggcggatgcgccggaaatgagcagcgaagaactgatgtgcacccgcaaaaactggaaccgcgtgattctggaaggccgcaaaccgggccagaccattggcattggctgcgatagcgcgcgcgaaccgctggataaagtgggcaaaagcctgtttgcggatctgtatcgcgtggcggaagtgctggatagcattaacggcaacgaacagtatcagcgcgtgtgcaccaaactggtgaccttttttgatgatgtgagccagacctatagcgcgcgcgtgctggaagcgatgaaaagccagggcattggcggctttggcctgagcctggcggaaggctatcgcgaagcgctgtgccatgaaccgtttgaagtgctgaccccggcgatgctggatgaacagcagaaaaaaagcgtggaaaaacaggcgatgctggaagcgcaggataccattagctttgaagaatatctggcgctgcatgcgggccgctaa（SEQ ID NO:6）
月桂酰谷赖三肽合成酶(LauEKEMaSyn): 来源于拟分枝杆菌(Mycobacteroidesabscessus Uniprot ID: B1MCS0), 该酶具有三个结构域, 此转化利用其中的AMP-结合域(1~540aa);天然酶(WTLauEKEMaSyn)具有较弱的合成能力，其催化效率以及稳定性不太理想；通过对该酶全面改造(LauEKEMaSyn)，其两方面性能都有显著提升，具体突变位点是：L18A、E91D E93K、L100F、V172S、L173G、R194E、V198I、T288S、I423W、T424H。
LauEKEMaSyn的氨基酸序列：
MTIDATADNTKEARRQRAGDRIRRLFTDDEQFRAAKPDTAVDTAVAQPGLRLAQVVATIMNGYADRPALGHRVQELVADAAGRSTLRPLPDFKTVTYGEFWGMARALASTWYHDPAAPVRAGDFVAMLGFTSVDYTAVDLACIHLGAVAVPLQTSASASNWTAILAESEPASGAVSAELLDTAMESVLATPSLEHITIFDYHPGVDVQRESLESAQHRIAEAGLPISVDPIPLAIGHGRALPDAPLFTAEEGTDPLALVIYTSGSTGTPKGATYSEKMVAKPWLRADSLSSKAEIPLINLNFMPMSHVMGRGSLVTALACGGLAYFAASSDMSTLFEDITLTRPTVVTLVPRVCDMLFQRYRNEVERRTGLDPAADLATLDADVKTDIRENLFGGRVLTIVCGSAPLSEELAAFIESCLDARWHDGYGSTEAGVIVRNGRIQRPPVIDYKLVDVPELGYFSTDKPHPRGELLVKAESVFGGYFKRPDVTADVFDPDGYYKTGDIVAELEPDKIQIVDRRNNVIKLSQGEFVAIANLEAEF（SEQ ID NO:3）
LauEKEMaSyn的核苷酸序列：
atgaccattgatgcgaccgcggataacaccaaagaagcgcgccgccagcgcgcgggcgatcgcattcgccgcctgtttaccgatgatgaacagtttcgcgcggcgaaaccggataccgcggtggataccgcggtggcgcagccgggcctgcgcctggcgcaggtggtggcgaccattatgaacggctatgcggatcgcccggcgctgggccatcgcgtgcaggaactggtggcggatgcggcgggccgcagcaccctgcgcccgctgccggattttaaaaccgtgacctatggcgaattttggggcatggcgcgcgcgctggcgagcacctggtatcatgatccggcggcgccggtgcgcgcgggcgattttgtggcgatgctgggctttaccagcgtggattataccgcggtggatctggcgtgcattcatctgggcgcggtggcggtgccgctgcagaccagcgcgagcgcgagcaactggaccgcgattctggcggaaagcgaaccggcgagcggcgcggtgagcgcggaactgctggataccgcgatggaaagcgtgctggcgaccccgagcctggaacatattaccatttttgattatcatccgggcgtggatgtgcagcgcgaaagcctggaaagcgcgcagcatcgcattgcggaagcgggcctgccgattagcgtggatccgattccgctggcgattggccatggccgcgcgctgccggatgcgccgctgtttaccgcggaagaaggcaccgatccgctggcgctggtgatttataccagcggcagcaccggcaccccgaaaggcgcgacctatagcgaaaaaatggtggcgaaaccgtggctgcgcgcggatagcctgagcagcaaagcggaaattccgctgattaacctgaactttatgccgatgagccatgtgatgggccgcggcagcctggtgaccgcgctggcgtgcggcggcctggcgtattttgcggcgagcagcgatatgagcaccctgtttgaagatattaccctgacccgcccgaccgtggtgaccctggtgccgcgcgtgtgcgatatgctgtttcagcgctatcgcaacgaagtggaacgccgcaccggcctggatccggcggcggatctggcgaccctggatgcggatgtgaaaaccgatattcgcgaaaacctgtttggcggccgcgtgctgaccattgtgtgcggcagcgcgccgctgagcgaagaactggcggcgtttattgaaagctgcctggatgcgcgctggcatgatggctatggcagcaccgaagcgggcgtgattgtgcgcaacggccgcattcagcgcccgccggtgattgattataaactggtggatgtgccggaactgggctattttagcaccgataaaccgcatccgcgcggcgaactgctggtgaaagcggaaagcgtgtttggcggctattttaaacgcccggatgtgaccgcggatgtgtttgatccggatggctattataaaaccggcgatattgtggcggaactggaaccggataaaattcagattgtggatcgccgcaacaacgtgattaaactgagccagggcgaatttgtggcgattgcgaacctggaagcggaattttaa（SEQ ID NO:7）
ATP再生酶 (CtPPK): 指孢囊菌(Clostridium thailandense, Uniprot ID:A0A949X149), 该天然酶(WTCtPPK)对ATP再生活性较好，但表达量与稳定性不是很理想；通过改造后突变酶(CtPPK)性能提高不少, 其具体突变位点是：G70N、D72N、I75M、V134T、R211E。
CtPPK的氨基酸序列：
MNVSEFRVTNKSKFKLNDIKTSYTGDFNSKEDAQKHLIKNIEQMSEIQSKLYAQGKYGILIIFQAMDTGNKNSAMKHVMSGLNPQGTKVYSFKEPSAEELSHDYLWKAHKHIPERGQIGIFNRSYYEELLVVRTHNLIKNQRIPEEFITDSIWKKRFEQIKNFEKYLYENGIIPIKIFLHISKEEQKKRLLERINDKTKNWKFSESDIKEESHWDKYQQFYEEAIRETSSKSIPWFVVPADKKWFARLVISQIIIDKLEELKLEYPTLSKEQYDGLEECRKKLIEE（SEQ ID NO:4）
CtPPK的核苷酸序列：
atgaacgtgagcgaatttcgcgtgaccaacaaaagcaaatttaaactgaacgatattaaaaccagctataccggcgattttaacagcaaagaagatgcgcagaaacatctgattaaaaacattgaacagatgagcgaaattcagagcaaactgtatgcgcagggcaaatatggcattctgattatttttcaggcgatggataccggcaacaaaaacagcgcgatgaaacatgtgatgagcggcctgaacccgcagggcaccaaagtgtatagctttaaagaaccgagcgcggaagaactgagccatgattatctgtggaaagcgcataaacatattccggaacgcggccagattggcatttttaaccgcagctattatgaagaactgctggtggtgcgcacccataacctgattaaaaaccagcgcattccggaagaatttattaccgatagcatttggaaaaaacgctttgaacagattaaaaactttgaaaaatatctgtatgaaaacggcattattccgattaaaatttttctgcatattagcaaagaagaacagaaaaaacgcctgctggaacgcattaacgataaaaccaaaaactggaaatttagcgaaagcgatattaaagaagaaagccattgggataaatatcagcagttttatgaagaagcgattcgcgaaaccagcagcaaaagcattccgtggtttgtggtgccggcggataaaaaatggtttgcgcgcctggtgattagccagattattattgataaactggaagaactgaaactggaatatccgaccctgagcaaagaacagtatgatggcctggaagaatgccgcaaaaaactgattgaagaataa（SEQ ID NO:8）
2、酶的发酵生产：
本专利所用酶都是实验室自己发酵生产而来，以下是制备该酶的基本操作流程。首先通过基因公司(安徽通用生物)合成该酶所对应的基因序列，然后通过NdeI/XhoI酶切位点亚克隆到pET28a质粒上，并将该质粒转入E. coli (BL21) (擎科生物)细胞进行平板培养，最后挑单克隆进行液体逐级放大培养。以下是细胞逐级放大培养的基本流程，首先将平板上的单菌落转入5 ml含50 μM卡那霉素的LB培养液中(37oC)进行培养，当细胞生长至对数期后接种到250 ml含同样抗菌素的LB培养液中，最后再转入5 L培养发酵罐里进行培养；当细胞OD~25时加入0.5 mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG) 25oC诱导蛋白表达10小时，然后离心(4000 rpm, 15min)收集湿细胞20-35g。为验证酶的表达，首先取少量细胞与三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)缓冲液(50 mM, pH 8.0)混合均匀，随后利用冻融法破碎细胞，高速离心后取上清液跑SDS-PAGE蛋白凝胶(十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶)确定蛋白可溶表达；确认正确的剩余细胞先与缓冲液混匀(10克湿细胞与约200 ml上述缓冲液混合)，然后进行高压破碎细胞、高速离心(16000 rpm,10 min)除细胞壁，最后所获得含酶清液直接进行后续使用(该液体酶活力在250~1200U/ml，U是室温一分钟转化1 μmol的底物所需酶量)或进一步纯化后固定化使用(固体酶反应时)。LB培养基构成为：1%胰蛋白胨、0.5% 酵母粉，1% NaCl，1% 磷酸氢二钾、1%磷酸氢二钾以及5%甘油。将获得的含谷赖二肽连接酶(PpLigase)、谷赖谷三肽连接酶(EtLigase)、月桂酰谷赖三肽合成酶(LauEKEMaSyn)以及ATP再生酶(CtPPK)粗酶液进行SDS-PAGE凝胶检测，结果如图2所示。
3、酶的混合固定：
向上述收集的谷赖二肽连接酶(PpLigase)、谷赖谷三肽连接酶(EtLigase)、月桂酰谷赖三肽合成酶(LauEKEMaSyn)以及ATP再生酶(CtPPK)粗酶液中逐量加入硫酸铵固体直至酶析出(40%-60%, w/v 硫酸铵/缓冲液)。该酶固体随后通过离心收集(10000 rpm,15min)，并缓慢溶入25 mM pH 8.0的Tris缓冲液中，最后经G25尺寸排阻色谱柱脱盐(购于Sigma)以及利用DEAE Seplite FF(西安蓝晓公司)阴离子交换柱分离得到初纯化液体酶PpLigase、EtLigase、LauEKEMaSyn和CtPPK。在固定化混合酶中，上述初纯化酶利用LX-1000EP环氧树脂(西安蓝晓公司)按照活性单位1:1:1:4.5进行混合固定。固定的基本方法是：按以上活力单位比例混合的8000U混合酶溶解在2L 50 mM pH 8.0的磷酸钾溶液中，随后加入60 mM苯氧乙酸以及900克LX-1000 EP环氧树脂至缓冲液，室温搅拌8小时后过滤出固定化酶，最后用清水以及25 mM pH 8.0磷酸缓冲液各洗涤三次后低温干燥待用；PpLigase/EtLigase/LauEKEMaSyn/CtPPK固定化混合酶具有对应液体酶的75-92%的活性。
实施例2 以L-Glu、L-Lys作为原料，液体酶(PpLigase, CtPPK)制备谷氨酸-赖氨酸二肽(L-Glu-Lys)
合成反应式如图3所示。在1L 25 mM pH 8.0三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris. HCl)溶液加入4.4克L-Lys钠盐(30 mM)、5.3克L-Glu钠盐(36 mM)、3.0克六水氯化镁(15 mM)、6.7克六偏磷酸钠(11 mM)以及0.6克ATP(1 mM)后将溶液pH值调至8.0，然后一次性加入1000U PpLigase粗酶液和1500U CtPPK粗酶液启动反应，38oC轻微搅拌，反应过程中用酸碱将反应体系pH维持在7.5-8.5之间；反应2小时后加入盐酸终止反应，沉淀、离心除去蛋白，然后将溶液调至pH 7.0后利用D201阴离子交换树脂除去含磷酸杂质，含产品的流出液再利用D101非极性树脂纯化收集，最后粗产品利用反渗透膜除盐、浓缩、结晶(乙醇:H2O=1:1,V:V)得7.6克L-Glu-Lys二肽白色固体(最终收率92%)。
实施例3 以谷氨酸-赖氨酸二肽及谷氨酸为原料，液体酶(EtLigase、CtPPK)制备谷氨酸-赖氨酸-谷氨酸三肽 (Glu-Lys-Glu)
合成反应式如图4所示。在1L 25 mM pH 8.0三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris. HCl)溶液加入6.9克L-Glu-Lys(25 mM)、4.4克L-Glu(30 mM)、3.0克六水氯化镁(15 mM)、6.1克六偏磷酸钠(10 mM)以及0.6克ATP(1 mM)后将溶液pH值调至8.0，然后一次性加入1000UEtLigase粗酶液和1500U CtPPK粗酶液启动反应，38oC轻微搅拌，反应过程中用酸碱将反应体系pH维持在7.5-8.5之间；反应2小时后加入盐酸终止反应，沉淀、离心除去蛋白，然后将溶液调至pH 7.0后利用D201阴离子交换树脂除去含磷酸杂质，含产品的流出液再利用D101非极性树脂纯化收集，最后粗产品利用反渗透膜除盐、浓缩、结晶(乙醇:H2O=1:1, V:V)得9.0克Glu-Lys-Glu三肽白色固体(最终收率89%)。
实施例4 以谷氨酸-赖氨酸-谷氨酸三肽 (Glu-Lys-Glu)及月桂酸为原料，液体酶(LauEKEMaLigase、CtPPK)制备二（月桂酰胺谷氨酰胺）赖氨酸钠
合成反应式如图5所示。在1L 25 mM pH 8.0三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris. HCl)溶液加入8.1克Glu-Lys-Glu(20 mM)、4.8克月桂酸(24 mM)、3.0克六水氯化镁(15 mM)、4.9克六偏磷酸钠(8 mM)以及0.6克ATP(1 mM)后将溶液pH值调至8.0，然后一次性加入1000ULauEKEMaLigase粗酶液和1500U CtPPK粗酶液启动反应，30oC轻微搅拌，反应过程中用酸碱将反应体系pH维持在7.5-8.5之间；反应2小时后，向反应液缓慢加入盐酸调节反应液pH至4析出固体，离心除去蛋白沉淀，收集目标固体于水/乙腈体系（乙醇:H2O=1:1, V:V）打浆，再次过滤后将其加入到纯化水中，搅拌均匀后，向其中缓慢滴加1摩尔每升氢氧化钠水溶液至pH=7.6，经冷冻干燥得13.6克二（月桂酰谷氨酰胺）赖氨酸钠白色固体(最终收率89%)。
实施例5 以赖氨酸、谷氨酸、月桂酸为原料，液体酶(PpLigase、EtLigase、LauEKEMaSyn、CtPPK)一次性转化制备二（月桂酰胺谷氨酰胺）赖氨酸钠
合成反应式如图6所示。在1L 25 mM pH 8.0三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris. HCl)溶液加入4.4克L-Lys钠盐(30 mM)、9.7克L-Glu钠盐(66 mM)、7.2克月桂酸(36 mM)、6.1克六水氯化镁(30 mM)、22.0克六偏磷酸钠(36 mM)以及1.7克ATP(3 mM)后将溶液pH值调至8.0，然后一次性加入1000U PpLigase粗酶液、1000U EtLigase粗酶液、1000ULauEKEMaLigase粗酶液和4500U CtPPK粗酶液启动反应，30oC轻微搅拌，反应过程中用酸碱将反应体系pH维持在7.5-8.5之间；反应6小时后，向反应液缓慢加入盐酸调节反应液pH至4析出固体，离心除去蛋白沉淀，收集目标固体于水/乙腈体系（乙醇:H2O=1:1, V:V）打浆，再次过滤后将其加入到纯化水中，搅拌均匀后，向其中缓慢滴加1摩尔每升氢氧化钠水溶液至pH=7.6，经冷冻干燥得18.8克二（月桂酰谷氨酰胺）赖氨酸钠白色固体(最终收率81%)。
并分别采用核磁共振氢谱以及HPLC进行产物的验证，结果依次如图7和图8所示，终产物中二（月桂酰谷氨酰胺）赖氨酸钠的纯度为97%。
实施例6 以赖氨酸、谷氨酸、月桂酸为原料，固定化酶一次性转化制备二（月桂酰胺谷氨酰胺）赖氨酸钠
反应与上述实施例5类似，但采用的是固定化酶，因此可以回收利用多次。
合成反应式如图9所示。在1L 25 mM pH 8.0三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris. HCl)溶液加入4.4克L-Lys钠盐(30 mM)、9.7克L-Glu钠盐(66 mM)、7.2克月桂酸(36 mM)、6.1克六水氯化镁(30 mM)、22.0克六偏磷酸钠(36 mM)以及1.7克ATP(3 mM)后将溶液pH值调至8.0，然后一次性加入8000U 固定化酶液启动反应，30oC轻微搅拌，反应过程中用酸碱将反应体系pH维持在7.5-8.5之间；反应8小时后，向反应液缓慢加入盐酸调节反应液pH至4析出固体，离心除去蛋白沉淀，收集目标固体于水/乙腈体系（乙醇:H2O=1:1, V:V）打浆，再次过滤后将其加入到纯化水中，搅拌均匀后，向其中缓慢滴加1摩尔每升氢氧化钠水溶液至pH=7.6，经冷冻干燥得19.6克二（月桂酰谷氨酰胺）赖氨酸钠白色固体(最终收率85%)。
对比例 以赖氨酸、谷氨酸、月桂酸为原料，液体酶(WTPpLigase、WTEtLigase、WTLauEKEMaSyn、WTCtPPK)一次性转化制备二（月桂酰胺谷氨酰胺）赖氨酸钠
与上述实施例5类似，各酶替换成天然酶WT。
合成反应式如图10所示。在1L 25 mM pH 8.0三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris. HCl)溶液加入4.4克L-Lys钠盐(30 mM)、9.7克L-Glu钠盐(66 mM)、7.2克月桂酸(36 mM)、6.1克六水氯化镁(30 mM)、22.0克六偏磷酸钠(36 mM)以及1.7克ATP(3 mM)后将溶液pH值调至8.0，然后一次性加入1000U WTPpLigase粗酶液、1000U WTEtLigase粗酶液、1000UWTLauEKEMaLigase粗酶液和4500U WTCtPPK粗酶液启动反应，30oC轻微搅拌，反应过程中用酸碱将反应体系pH维持在7.5-8.5之间；反应6小时后，向反应液缓慢加入盐酸调节反应液pH至4析出固体，离心除去蛋白沉淀，收集目标固体于水/乙腈体系（乙醇:H2O=1:1, V:V）打浆，再次过滤后将其加入到纯化水中，搅拌均匀后，向其中缓慢滴加1摩尔每升氢氧化钠水溶液至pH=7.6，经冷冻干燥得2.0克二（月桂酰谷氨酰胺）赖氨酸钠白色固体(最终收率9%)。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.酶突变体的组合物，其特征在于，所述组合物包括谷赖二肽连接酶、谷赖谷三肽连接酶、月桂酰谷赖三肽合成酶和ATP再生酶，其中：
所述谷赖二肽连接酶来源于嗜血发光杆菌Photobacterium piscicola，所述谷赖二肽连接酶的突变位点包括D75E、A177S、Y186T、E315H和N424D中的至少一个；
所述谷赖谷三肽连接酶来源于肠杆菌Enterobacillus tribolii，所述谷赖谷三肽连接酶的突变位点包括D77Q、M79I、R84H、N186K、S201V、I204L、P302Q、G322L和E325N中的至少一个；
所述月桂酰谷赖三肽合成酶来源于拟分枝杆菌Mycobacteroides abscessus，所述月桂酰谷赖三肽合成酶的突变位点包括L18A、E91D E93K、L100F、V172S、L173G、R194E、V198I、T288S、I423W和T424H中的至少一个；
所述ATP再生酶来源于指孢囊菌Clostridium thailandense，所述ATP再生酶的突变位点包括G70N、D72N、I75M、V134T和R211E中的至少一个。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物包括谷赖二肽连接酶的突变体、谷赖谷三肽连接酶的突变体、月桂酰谷赖三肽合成酶的突变体和ATP再生酶的突变体，其中：
所述谷赖二肽连接酶的突变体具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述谷赖谷三肽连接酶的突变体具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，所述月桂酰谷赖三肽合成酶的突变体具有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，所述ATP再生酶的突变体具有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
3.固定化酶，其特征在于，包括权利要求1或2所述的酶突变体的组合物。
4.编码如下（1）和/或（2）中至少一项的核酸分子：
（1）、权利要求1或2所述的酶突变体的组合物；
（2）、权利要求3所述的固定化酶。
5.根据权利要求4所述的核酸分子，其特征在于，包括编码谷赖二肽连接酶的突变体的核酸分子、编码谷赖谷三肽连接酶的突变体的核酸分子、编码月桂酰谷赖三肽合成酶的突变体的核酸分子和编码ATP再生酶的突变体的核酸分子，其中：
所述编码谷赖二肽连接酶的突变体的核酸分子具有如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，所述编码谷赖谷三肽连接酶的突变体的核酸分子具有如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列，所述编码月桂酰谷赖三肽合成酶的突变体的核酸分子具有如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列，所述编码ATP再生酶的突变体的核酸分子具有如SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列。
6.表达载体或宿主细胞，其特征在于，
所述表达载体包含权利要求4或5所述的核酸分子；
所述宿主细胞转染或转化所述表达载体。
7.如下①~④中至少一项在制备二（月桂酰胺谷氨酰胺）赖氨酸盐中的应用：
①、权利要求1或2所述的酶突变体的组合物；
②、权利要求3所述的固定化酶；
③、权利要求4或5所述的核酸分子；
④、权利要求6所述的表达载体或宿主细胞。
8.二（月桂酰胺谷氨酰胺）赖氨酸钠的制备方法，其特征在于，以L-赖氨酸盐、L-谷氨酸盐和月桂酸为原料，经如下Ⅰ~Ⅳ中至少一项转化制得二（月桂酰胺谷氨酰胺）赖氨酸盐；
Ⅰ、权利要求1或2所述的酶突变体的组合物；
Ⅱ、权利要求3所述的固定化酶；
Ⅲ、权利要求4或5所述的核酸分子；
Ⅳ、权利要求6所述的表达载体或宿主细胞。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
以L-赖氨酸盐和L-谷氨酸盐为原料，经所述谷赖二肽连接酶的突变体和所述ATP再生酶的突变体催化生成谷氨酸-赖氨酸二肽；
所述谷氨酸-赖氨酸二肽经所述谷赖谷三肽连接酶的突变体和所述ATP再生酶的突变体催化生成谷氨酸-赖氨酸-谷氨酸三肽；
所述谷氨酸-赖氨酸-谷氨酸三肽经所述月桂酰谷赖三肽合成酶的突变体和所述ATP再生酶的突变体催化、除蛋白后，所得溶液在氢氧化钠的作用下生成所述二（月桂酰胺谷氨酰胺）赖氨酸盐。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，
所述L-赖氨酸盐、L-谷氨酸盐、月桂酸、谷赖二肽连接酶的突变体、谷赖谷三肽连接酶的突变体、月桂酰谷赖三肽合成酶的突变体和ATP再生酶的突变体的比例为（20~50mM）:（50~80mM）：（20~50mM）：（500~1500U）：（500~1500U）：（500~1500U）：（3000~5000U）。
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