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CN120905186A - BhrPETase突变体及其应用 - Google Patents

BhrPETase突变体及其应用

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Publication number
CN120905186A
CN120905186A CN202511394534.1A CN202511394534A CN120905186A CN 120905186 A CN120905186 A CN 120905186A CN 202511394534 A CN202511394534 A CN 202511394534A CN 120905186 A CN120905186 A CN 120905186A
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CN
China
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amino acid
acid sequence
mutated
seq
mutant
Prior art date
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Pending
Application number
CN202511394534.1A
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English (en)
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齐崴
尤生萍
林伟
郑昀欣
张嘉兴
王梦凡
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Yuantian Biotechnology Tianjin Co ltd
Original Assignee
Yuantian Biotechnology Tianjin Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Yuantian Biotechnology Tianjin Co ltd filed Critical Yuantian Biotechnology Tianjin Co ltd
Priority to CN202511394534.1A priority Critical patent/CN120905186A/zh
Publication of CN120905186A publication Critical patent/CN120905186A/zh
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    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
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Abstract

本发明属于酶工程技术领域，公开了一种BhrPETase突变体及其应用。本发明提供了一种BhrPETase突变体，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，记为突变体F208I，该突变体较突变体野生型BhrPETase而言，其PET降解活性提高了1.39倍。在突变体F208I基础上，本发明对其氨基酸进一步理性突变设计，提供了21种BhrPETase突变体。本发明提供的BhrPETase突变体在热稳定性与野生型BhrPETase基本相当的情况下，将PET降解活性提高了1.39倍‑4.24倍。本发明提供的BhrPETase突变体可应用于降解PET、回收PET降解产物或制备PET降解剂等领域。

Description

BhrPETase突变体及其应用
技术领域
本发明属于酶工程技术领域，涉及一种PET降解酶，具体涉及一种BhrPETase突变体及其应用。
背景技术
塑料是现代生活中不可或缺的材料，其中聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）因其轻质、耐腐蚀和可塑性强等优点，广泛应用于包装和纺织行业。然而，PET的高结晶度和稳定的化学结构使其难以自然降解，导致大量塑料废弃物堆积，对生态环境和人类健康构成严重威胁。
利用酶法降解PET展现出巨大潜力。与传统的化学回收方法相比，酶法降解具有反应条件温和、无污染、产物可回收等优势。近年来，科学家发现多种微生物能够分泌可特异性断裂PET分子中的酯键的PET水解酶，为生物酶法在PET废物管理和PET可持续回收中的应用提供了启示。其中，通过人工智能辅助的蛋白质工程策略，研究人员开发的BhrPETase突变体（命名为TurboPETase）将PET解聚效率推至新高度，在200g/kg这一高底物浓度负载下，仅需8小时即可实现近99%的转化率，显著优于此前最优的LCC-ICCG。TurboPETase产物最大生成速率达61.3g水解PET L-1h-1，且反应在水溶液中即可进行，无需昂贵缓冲体系。这一突破为可持续回收塑料提供了创新解决方案，推动绿色化学和循环经济的发展。
在高温环境下，PET的结晶度显著提高，分子结构更加致密，这一特性导致现有PET水解酶难以高效作用于底物，进而制约了PET生物降解技术的工业化推进。BhrPETase作为嗜热PET降解酶，虽然在热稳定性（Tm≈97℃）和PET催化活性方面展现出一定的优势，但其催化效率仍存在较大提升空间。因此，探索在适度降低或不降低BhrPETase热稳定性的情况下，通过分子改造获得PET降解活性增强的BhrPETase突变体，从而进一步提升催化效能，对满足工业规模化生产的实际应用需求具有重要意义。
发明内容
鉴于现有技术中存在的上述问题，本发明在野生型BhrPETase的基础上进行改造，提供一种PET降解活性显著提高的BhrPETase突变体及其应用。
为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：
第一方面，本发明提供了一种BhrPETase突变体，其是将野生型BhrPETase的氨基酸序列中的第208位的苯丙氨酸定点突变为异亮氨酸，其他位置的氨基酸残基不变，所得氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，所得BhrPETase突变体记为突变体F208I。
本发明提供了一种BhrPETase突变体即突变体F208I，其是将野生型BhrPETase的氨基酸序列中第208位的苯丙氨酸定点突变为异亮氨酸所得。突变体F208I较野生型BhrPETase而言，其PET降解活性提高了1.39倍。
其中，野生型BhrPETase的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，突变体F208I的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
第二方面，本发明在突变体F208I的基础上进一步单点突变，提供了11种BhrPETase突变体，其氨基酸序列为如下（1）~（11）中的任一项：
（1）将SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第27位的丝氨酸定点突变为缬氨酸，其他位置的氨基酸残基不变，所得突变体记为突变体I-S27V；
（2）将SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第28位的缬氨酸定点突变为异亮氨酸，其他位置的氨基酸残基不变，所得突变体记为突变体I-V28I；
（3）将SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第113位的丝氨酸定点突变为脯氨酸，其他位置的氨基酸残基不变，所得突变体记为突变体I-S113P；
（4）将SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第142位的谷氨酰胺定点突变为亮氨酸，其他位置的氨基酸残基不变，所得突变体记为突变体I-Q142L；
（5）将SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第142位的谷氨酰胺定点突变为色氨酸，其他位置的氨基酸残基不变，所得突变体记为突变体I-Q142W；
（6）将SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第157位的苏氨酸定点突变为脯氨酸，其他位置的氨基酸残基不变，所得突变体记为突变体I-T157P；
（7）将SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第160位的苏氨酸定点突变为酪氨酸，其他位置的氨基酸残基不变，所得突变体记为突变体I-T160Y；
（8）将SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第167位的谷氨酰胺定点突变为蛋氨酸，其他位置的氨基酸残基不变，所得突变体记为突变体I-Q167M；
（9）将SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第183位的组氨酸定点突变为酪氨酸，其他位置的氨基酸残基不变，所得突变体记为突变体I-H183Y；
（10）将SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第211位的天冬酰胺定点突变为蛋氨酸，其他位置的氨基酸残基不变，所得突变体记为突变体I-N211M；
（11）将SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第212位的丝氨酸定点突变为蛋氨酸，其他位置的氨基酸残基不变，所得突变体记为突变体I-S212M。
本发明经实验发现，相较于野生型BhrPETase，上述11种突变体的PET降解活性提高了1.48倍-2.78倍。相较于突变体F208I，上述11种突变体的PET降解活性提升了4%-58%。与突变体F208I（Tm值为91.5℃）相比，上述11种突变体的热稳定性与之基本相当，Tm值在88.26℃-96.61℃，其中，突变体I-Q142W的Tm值为96.43℃，突变体I-N211M的Tm值为96.61℃。突变体I-H183Y的Tm值为92.36℃，其PET降解活性为野生型BhrPETase的3.78倍。
第三方面，本发明在突变体F208I的基础上进一步双点突变，提供了10种BhrPETase突变体，其氨基酸序列为如下（12）~（21）中的任一项，具体为：
（12）将SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第183位的组氨酸定点突变为酪氨酸、第28位的缬氨酸定点突变为异亮氨酸，其他位置的氨基酸残基不变，所得突变体记为突变体IY-V28I；
（13）将SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第183位的组氨酸定点突变为酪氨酸、第113位的丝氨酸定点突变为脯氨酸，其他位置的氨基酸残基不变，所得突变体记为突变体IY-S113P；
（14）将SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第183位的组氨酸定点突变为酪氨酸、第142位的谷氨酰胺定点突变为亮氨酸，其他位置的氨基酸残基不变，所得突变体记为突变体IY-Q142L；
（15）将SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第183位的组氨酸定点突变为酪氨酸、第142位的谷氨酰胺定点突变为色氨酸，其他位置的氨基酸残基不变，所得突变体记为突变体IY-Q142W；
（16）将SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第183位的组氨酸定点突变为酪氨酸、第157位的苏氨酸定点突变为脯氨酸，其他位置的氨基酸残基不变，所得突变体记为突变体IY-T157P；
（17）将SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第183位的组氨酸定点突变为酪氨酸、第160位的苏氨酸定点突变为酪氨酸，其他位置的氨基酸残基不变，所得突变体记为突变体IY-T160Y；
（18）将SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第183位的组氨酸定点突变为酪氨酸、第167位的谷氨酰胺定点突变为蛋氨酸，其他位置的氨基酸残基不变，所得突变体记为突变体IY-Q167M；
（19）将SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第183位的组氨酸定点突变为酪氨酸、第201位的谷氨酸定点突变为亮氨酸，其他位置的氨基酸残基不变，所得突变体记为突变体IY-E201L；
（20）将SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第183位的组氨酸定点突变为酪氨酸、第211位的天冬酰胺定点突变为蛋氨酸，其他位置的氨基酸残基不变，所得突变体记为突变体IY-N211M；
（21）将SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第183位的组氨酸定点突变为酪氨酸、第212位的丝氨酸定点突变为蛋氨酸，其他位置的氨基酸残基不变，所得突变体记为突变体IY-S212M。
经本发明实验发现，相较于野生型BhrPETase，上述10种突变体的PET降解活性提高了2.03倍-4.24倍。相较于突变体F208I，上述10种突变体的PET降解活性提升了27.0%-120%，与突变体F208I（Tm值为91.5℃）相比，上述10种突变体的热稳定性与之基本相当，Tm值在85.1℃-97.2℃。其中，突变体IY-Q142L的Tm值为92.99℃，其PET降解活性较野生型BhrPETase提高了4.24倍。
第四方面，本发明提供了一种核酸，该核酸可编码第一方面至第三方面所述的BhrPETase突变体。
第五方面，本发明提供了一种重组载体，其包含第四方面所述的核酸。
第六方面，本发明提供了一种重组菌株，其包含第五方面所述的重组载体。
示例性地，所述重组菌株的宿主细胞为大肠杆菌。
第七方面，本发明提供了一种生产PET水解酶的方法，具体方法包括：将如第六方面所述的重组菌株扩大培养，诱导表达，得PET水解酶。
优选地，所述诱导表达采用的培养基为ZYM自诱导培养基。
示例性地，ZYM自诱导培养基包括如下组分：以1L计，包括8g-12g胰蛋白胨，4g-6g酵母粉，20mM-30mM Na2HPO4·12H2O，20mM-30mM KH2PO4，45mM-mM NH4Cl，4 mM-6mM Na2SO4，1.5mM-2.5mM MgSO4·7H2O，4g-6g甘油，0.3g-0.6g无水葡萄糖，1.5g-2.5g乳糖单水合物。
第八方面，本发明提供了第四方面提供的核酸、第五方面提供的的重组载体、第六方面提供的重组菌株在制备PET水解酶中的应用。
第九方面，本发明提供了第一方面至第三方面所述的BhrPETase突变体在降解PET、回收PET降解产物或制备PET降解剂中的应用。
本发明在野生型BhrPETase基础上进行单点突变或组合突变，提供了一系列在热稳定性方面与野生型BhrPETase基本相当、而PET降解活性比野生型BhrPETase提高了1.39倍-4.24倍的BhrPETase突变体。其中，突变体IY-Q142L的Tm值为92.99℃，其PET降解活性较野生型BhrPETase提高了4.24倍。本发明提供的BhrPETase突变体可应用于降解PET、回收PET降解产物或制备PET降解剂等领域。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1中重组质粒pET-22b-BhrPETase的质粒图谱示意图；
图2为本发明实施例1中重组质粒pET-22b-F208I的质粒图谱示意图；
图3为本发明实施例1中野生型BhrPETase及其突变体的PET降解活性测定结果；
图4为本发明实施例1中野生型BhrPETase及其突变体的T m值测定结果；
图5为本发明实施例2中重组质粒pET-22b-F208I-H183Y的质粒图谱示意图；
图6为本发明实施例2中野生型BhrPETase及其突变体的PET降解活性测定结果；
图7为本发明实施例2中野生型BhrPETase及其突变体的T m值测定结果；
图8为本发明实施例3中重组质粒pET-22b-F208I-H183Y-Q142L的质粒图谱示意图；
图9为本发明实施例3中野生型BhrPETase及其突变体的PET降解活性测定结果；
图10为本发明实施例3中野生型BhrPETase及其突变体的T m值测定结果。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明所述的突变体命名，按照本领域技术人员常规命名方式，例如：突变体F208I表示将野生型BhrPETase的氨基酸序列中的第208位的苯丙氨酸（F）定点突变为异亮氨酸（I），其他位置的氨基酸残基不变；
突变体I-H183Y表示将突变体F208I氨基酸序列的第183位的组氨酸（H）定点突变为酪氨酸（Y），其他位置的氨基酸残基不变。
实施例1
本实施例提供了基于野生型BhrPETase单点突变体的制备方法、表达纯化及活性检测方法，包括通过聚合酶链式反应（PCR，Polymerase Chain Reaction）获得突变后的目的基因，并导入大肠杆菌表达载体，采用DMT酶（全式金公司，GD111）、无缝克隆等分子生物学方法制备重组质粒，并转化到大肠杆菌BL21(DE3)（全式金，CD601）感受态细胞中，经培养获得异源表达目的蛋白的重组大肠杆菌。具体内容如下：
一、BhrPETase突变体的获得
1.单点突变体重组质粒及重组菌株的构建
野生型BhrPETase的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，经密码子优化获得其编码基因，其编码基因序列如SEQ ID No.3所示。
委托苏州金唯智生物科技有限公司合成重组质粒pET-22b-BhrPETase，具体过程如下：扩增核苷酸序列如SEQ ID No.3所示的基因后，通过NcoⅠ和XhoⅠ限制性内切酶酶切后连接至pET-22b载体上，得到重组质粒pET-22b-BhrPETase，其质粒图谱示意图如图1所示。
利用定点突变技术，以重组质粒pET-22b-BhrPETase为模板，用表1所示的引物，分别进行PCR，获得相应线性化的质粒片段。其中PCR反应体系为20μL，包括模板（质粒）1μL，正向引物（F）1μL，反向引物（R）1μL，高保真扩增试剂10μL，其余为无酶水。本步中PCR反应条件：预变性98℃，3min；随后进行30个循环，每个循环包括：变性98℃、15s，退火68℃、15s，延伸72℃、3min；终延伸72℃，5min。
将PCR得到的产物使用DMT酶（全式金公司，GD111）消化模板，通过无缝克隆等分子生物学方法获得包含pET-22b-S27V、pET-22b-V28I、pET-22b-S29F以及pET-22b-F208I在内的18种单点突变的重组质粒。其中重组质粒pET-22b-F208I的质粒图谱示意图如图2所示。
表1
随后通过热激方式（42℃水浴热激45s），将上述18种单点突变的重组质粒以及重组质粒pET-22b-BhrPETase分别导入大肠杆菌BL21(DE3)（全式金，CD601）感受态细胞，热激后快速转移到冰浴中2分钟，加入500 μL无菌LB培养基(不含抗生素)，混匀后置于37℃，200rpm培养1小时使细菌复苏。结束后，6000rpm离心90秒，吸取450μL上清去掉，剩余加到LB琼脂培养基上，将细胞均匀涂开至液体被吸收，倒置平板，37℃培养12h。然后，挑选阳性单克隆菌株，转移至5mL小试管LB培养基（含100mg/L氨苄青霉素）中，37℃培养12h并通过Sanger测序来保证突变体构建的正确性，构建获得相应的包括重组菌株S27V、V28I、S29F、S113P、Q142L、Q142W、T153A、T157P、T160Y、N162S、H183Y等在内的18种单点突变的重组菌株以及重组菌株BhrPETase。
2.野生型BhrPETase及其单点突变体的制备
将上述18种单点突变的重组菌株以及重组菌株BhrPETase分别接种于在5mL的LB培养基中，在37℃、220rpm培养12h后，以1%接种量接种于含有80mL ZYM自诱导培养基的摇瓶中进行发酵，于21℃、160rpm中诱导表达20h，得到富含相应BhrPETase突变体的发酵液。
其中，每1L ZYM自诱导培养基含有:10g胰蛋白胨、5g酵母粉、25mM Na2HPO4·12H2O、25mM KH2PO4、50mM NH4Cl、5mM Na2SO4、2mM MgSO4·7H2O、5g甘油、0.5g无水葡萄糖、2g乳糖单水合物。
利用高速冷冻离心机（8000g、5 min）分别处理上述不同的发酵液，收集菌体，分别加入10mL破菌缓冲液（每1L破菌缓冲液含有50mM Tris-HCl、150 mM NaCl和10 mM 咪唑，pH=7.5）重悬菌体，然后使用高压破碎仪对细胞进行破碎。破碎完成后于10000rpm转速下离心1h去除细胞碎片，所得上清液即为含BhrPETase及其突变体的全蛋白液。将上述全蛋白液过0.45μm滤膜去杂，然后使用Ni-NTA填充柱进行梯度洗脱纯化得目的蛋白。纯化具体的步骤包括：使用破菌缓冲液平衡2min，然后将过膜后的全蛋白液重复挂柱3次，使用洗杂缓冲液（每1L洗杂缓冲液含有50mM Tris-HCl、150mM NaCl和40mM 咪唑，pH=7.5）洗3次以去除杂蛋白；最后使用洗脱液（每1L洗脱液含有50mM mM Tris-HCl、300mM NaCl和300mM咪唑，pH=7.5）洗脱得蛋白洗脱液；进一步将蛋白浓缩、去除高浓度咪唑，从而得到浓缩后的野生型BhrPETase及其突变体酶液。
二、性能表征方法
1.PET降解活性的测定
本发明以无定形PET薄膜（购自Goodfellow、结晶度约为8%）作为PET底物，将该模式底物依次用1%SDS、无水乙醇以及双蒸水进行清洗，然后使用打孔器将其打成直径为6 mm的圆片（重量为8mg），每次测定3次重复。
将分别上述浓缩后的野生型BhrPETase及其突变体酶液按相应浓度（500 nM）置于300μL反应液中（100mM磷酸钾缓冲液，pH=8），取一片PET圆片加入上述体系中，并在70℃水浴锅中反应5h。反应结束后，加入乙腈终止反应，并通过高效液相色谱分析反应产生的TPA、MHET和BHET。以TPA、MHET和BHET的浓度之和作为评价PET降解活性的指标。
2.Tm的测定方法
使用差示扫描荧光法进行蛋白质熔化温度的测定。DSF实验使用实时荧光定量PCR系统，使用465nm激发和580nm发射滤波器。样品以0.3℃/s的速率从25℃加热到100℃，每0.03s测量一次荧光。T m由一阶导数曲线确定。
三、实验结果
测定本实施例中野生型BhrPETase及其突变体的PET降解活性和T m值。野生型BhrPETase及其突变体的PET降解活性测定结果如图3所示，野生型BhrPETase及其突变体的T m值测定结果如图4所示。图中Bhr代表野生型BhrPETase。
由图3-4可知，在18个单点突变体中，除突变体S29F和突变体T153A的PET降解活性较野生型略微降低外，其余16个突变体的PET降解活性较野生型BhrPETase提高了15.8%~138.6%。其中，突变体F208I对PET底物的降解效果最优，是野生型BhrPETase的PET降解活性的2.39倍。在热稳定性方面，较野生型BhrPETase（Tm值为95.05℃），突变体Q142W的Tm提升了4.95℃，突变体N211M提升了2.53℃。较野生型BhrPETase，突变体F208I（其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示）的热稳定性略有下降，Tm为91.5℃，但仍可满足PET降解的常规需求。
实施例2
在相较于野生型BhrPETase的PET降解活性提升显著的突变体F208I的基础之上，本实施例进一步突变得到15种基于野生型BhrPETase的双点组合突变体，依次记为突变体I-S27V（F208I-S27V）、I-V28I（F208I-V28I）、I-S113P（F208I-S113P）、I-Q142L（F208I-Q142L）、I-Q142W（F208I-Q142W）、I-T157P（F208I-T157P）、I-T160Y（F208I-T160Y）、I-N162S（F208I-N162S）、I-Q167M（F208I-Q167M）、I-V170I（F208I-V170I）、I-H183Y（F208I-H183Y）、I-E201L（F208I-E201L）、I-N211M（F208I-N211M）、I-S212M（F208I-S212M）和I-T233L（F208I-T233L）。
在本实施例中，构建上述双点组合突变体的重组质粒时所用到的定点突变引物如表2所示。
表2
利用定点突变技术，以实施例1构建的重组质粒pET-22b-F208I为模板，用表2所示的引物，按照实施例1记载的PCR条件分别进行PCR，制备包括重组质粒pET-22b-F208I-H183Y等在内的15种BhrPETase突变体重组质粒，构建相应重组质粒的方法与实施例1相同。其中重组质粒pET-22b-F208I-H183Y的质粒图谱示意图如图5所示。
在构建的上述15种重组质粒基础上，进一步以实施例1记载的方法构建相应的突变体重组菌株，制备、纯化制得相应突变体I-S27V、I-V28I、I-S113P、I-Q142L、I-Q142W、I-T157P、I-T160Y、I-N162S、I-Q167M、I-V170I、I-H183Y、I-E201L、I-N211M、I-S212M和I-T233L，并测定不同BhrPETase突变体的PET降解活性和Tm。其中，野生型BhrPETase及其突变体的PET降解活性测定结果如图6所示，野生型BhrPETase及其突变体的T m值测定结果如图7所示。
由图6可知，除突变体I-N162S、I-V170I和I-T233L外，其余12种突变体的PET降解活性均有不同程度的提升，具体为：其余12种突变体相较于突变体F208I的PET降解活性提升了3.80%~58.5%，相较于野生型BhrPETase的PET降解活性提升了1.48倍-2.78倍。其中，突变体I-T157P、I-H183Y和I-E201L对PET底物的降解活性较F208I突变体分别提高了39.4%、58.5%和53.5%，较野生型BhrPETase分别提高了2.32倍、2.78倍和2.66倍。由图7可知，在除突变体I-N162S、I-V170I和I-T233L外的12种突变体中，除突变体I-E201L的Tm值降为78.87℃热稳定性明显降低外，其余11种突变体的Tm值在88.26℃-96.61℃，与野生型BhrPETase的热稳定性基本相当。其中，突变体I-H183Y的降解活性最佳，其Tm为92.36℃。
实施例3
本实施例在实施例2提供的突变体I-H183Y基础上进一步与突变位点进行叠加，分别得到10种基于野生型BhrPETase的三点组合突变体，即突变体IY-V28I（F208I-H183Y-V28I）、IY-S113P（F208I-H183Y-S113P）、IY-Q142L（F208I-H183Y-Q142L）、IY-Q142W（F208I-H183Y-Q142W）、IY-T157P（F208I-H183Y-T157P）、IY-T160Y（F208I-H183Y-T160Y）、IY-Q167M（F208I-H183Y-Q167M）、IY-E201L（F208I-H183Y-E201L）、IY-N211M（F208I-H183Y-N211M）及IY-S212M（F208I-H183Y-S212M）。
构建上述相应重组质粒时所用到的定点突变引物如上表3所示。
表3
利用定点突变技术，以实施例2构建的重组质粒pET-22b-F208I-H183Y为模板，用表3所示的相应引物，分别进行PCR，制备相应重组质粒。其中，制备重组质粒的方法与实施例1相同。其中，重组质粒pET-22b-F208I-H183Y-Q142L的质粒图谱示意图如图8所示。
进一步地，以实施例1记载的方法构建相应的重组菌株后，制备相应突变体，并测定不同BhrPETase突变体的PET降解活性和Tm。其中，野生型BhrPETase及其突变体的PET降解活性测定结果如图9所示，野生型BhrPETase及其突变体的T m值测定结果如图10所示。
由图9-10可知，相较于野生型BhrPETase，本实施例提供的10种三点组合突变体的PET降解活性提高了2.03倍-4.24倍。相较于突变体F208I，本实施例提供的10种三点组合突变体的PET降解活性提升了27.0%-120%，热稳定性与突变体F208I（Tm值为91.5℃）基本相当，Tm值在85.1℃-97.2℃。其中，突变体IY-Q142L的PET降解活性最佳，该突变体的PET降解活性较野生型BhrPETase提高了4.24倍、较突变体F208I提高了1.20倍、较突变体I-H183Y提高了38.6%；且该突变体的Tm值为92.99℃，与野生型BhrPETase的热稳定性基本相当。此外，突变体IY-S113P、IY-T160Y、IY-T157P、IY-N211M及IY-S212M的PET降解活性较野生型BhrPETase提高了3.13倍-3.9倍，其中，突变体IY-N211M的PET降解活性较野生型BhrPETase提高了3.13倍且Tm值较野生型BhrPETase提高了2.12℃。综上所述，本发明通过对野生型BhrPETase基础上进行单点突变或组合突变，提供了一系列在热稳定性方面与野生型BhrPETase基本相当、而PET降解活性比野生型BhrPETase提高了1.39倍-4.24倍的BhrPETase突变体。其中，突变体IY-Q142L的PET降解活性最佳，该突变体的PET降解活性较野生型BhrPETase提高了4.24倍、较突变体F208I提高了1.20倍、较突变体I-H183Y提高了38.6%；且该突变体热稳定性与野生型BhrPETase基本相当，对工业高效降解PET具有重要意义。
鉴于本发明提供的BhrPETase突变体在PET降解活性方面的显著优势，且热稳定性良好，可将其应用于降解PET、回收PET降解产物或制备PET降解剂等领域。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种BhrPETase突变体，其特征在于：其是将野生型BhrPETase的氨基酸序列中第208位的苯丙氨酸定点突变为异亮氨酸，其他位置的氨基酸残基不变，所得氨基酸序列如SEQID No.2所示。
2.一种BhrPETase突变体，其特征在于：其氨基酸序列由SEQ ID No.2所示氨基酸序列中一个位置的氨基酸残基替换得到，其氨基酸序列为如下（1）~（11）中的任一项：
（1）将SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第27位的丝氨酸定点突变为缬氨酸，其他位置的氨基酸残基不变；
（2）将SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第28位的缬氨酸定点突变为异亮氨酸，其他位置的氨基酸残基不变；
（3）将SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第113位的丝氨酸定点突变为脯氨酸，其他位置的氨基酸残基不变；
（4）将SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第142位的谷氨酰胺定点突变为亮氨酸，其他位置的氨基酸残基不变；
（5）将SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第142位的谷氨酰胺定点突变为色氨酸，其他位置的氨基酸残基不变；
（6）将SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第157位的苏氨酸定点突变为脯氨酸，其他位置的氨基酸残基不变；
（7）将SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第160位的苏氨酸定点突变为酪氨酸，其他位置的氨基酸残基不变；
（8）将SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第167位的谷氨酰胺定点突变为蛋氨酸，其他位置的氨基酸残基不变；
（9）将SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第183位的组氨酸定点突变为酪氨酸，其他位置的氨基酸残基不变；
（10）将SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第211位的天冬酰胺定点突变为蛋氨酸，其他位置的氨基酸残基不变；
（11）将SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第212位的丝氨酸定点突变为蛋氨酸，其他位置的氨基酸残基不变。
3.一种BhrPETase突变体，其特征在于：其氨基酸序列由SEQ ID No.2所示氨基酸序列中两个位置的氨基酸残基替换得到，其氨基酸序列为如下（12）~（21）中的任一项：
（12）将SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第183位的组氨酸定点突变为酪氨酸、第28位的缬氨酸定点突变为异亮氨酸，其他位置的氨基酸残基不变；
（13）将SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第183位的组氨酸定点突变为酪氨酸、第113位的丝氨酸定点突变为脯氨酸，其他位置的氨基酸残基不变；
（14）将SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第183位的组氨酸定点突变为酪氨酸、第142位的谷氨酰胺定点突变为亮氨酸，其他位置的氨基酸残基不变；
（15）将SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第183位的组氨酸定点突变为酪氨酸、第142位的谷氨酰胺定点突变为色氨酸，其他位置的氨基酸残基不变；
（16）将SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第183位的组氨酸定点突变为酪氨酸、第157位的苏氨酸定点突变为脯氨酸，其他位置的氨基酸残基不变；
（17）将SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第183位的组氨酸定点突变为酪氨酸、第160位的苏氨酸定点突变为酪氨酸，其他位置的氨基酸残基不变；
（18）将SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第183位的组氨酸定点突变为酪氨酸、第167位的谷氨酰胺定点突变为蛋氨酸，其他位置的氨基酸残基不变；
（19）将SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第183位的组氨酸定点突变为酪氨酸、第201位的谷氨酸定点突变为亮氨酸，其他位置的氨基酸残基不变；
（20）将SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第183位的组氨酸定点突变为酪氨酸、第211位的天冬酰胺定点突变为蛋氨酸，其他位置的氨基酸残基不变；
（21）将SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第183位的组氨酸定点突变为酪氨酸、第212位的丝氨酸定点突变为蛋氨酸，其他位置的氨基酸残基不变。
4.一种核酸，其特征在于：其编码权利要求1~3任一项所述的BhrPETase突变体。
5.一种重组载体，其特征在于：其包含权利要求4所述的核酸。
6.一种重组菌株，其特征在于：其包含权利要求5所述的重组载体。
7.一种生产PET水解酶的方法，其特征在于：将如权利要求6所述的重组菌株扩大培养，诱导表达，得PET水解酶。
8.如权利要求7所述的生产PET水解酶的方法，其特征在于：所述诱导表达采用的培养基为ZYM自诱导培养基。
9.权利要求4所述的核酸、权利要求5所述的重组载体或权利要求6所述的重组菌株在制备PET水解酶中的应用。
10.权利要求1~3任一项所述的BhrPETase突变体在降解PET、制备PET降解剂或回收PET降解产物中的应用。
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