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CN120904358A - 一种新型il-15融合蛋白及其应用 - Google Patents

一种新型il-15融合蛋白及其应用

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Publication number
CN120904358A
CN120904358A CN202511440001.2A CN202511440001A CN120904358A CN 120904358 A CN120904358 A CN 120904358A CN 202511440001 A CN202511440001 A CN 202511440001A CN 120904358 A CN120904358 A CN 120904358A
Authority
CN
China
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cells
sdt
cancer
car
fusion protein
Prior art date
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Pending
Application number
CN202511440001.2A
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English (en)
Inventor
闫忠辉
古松海
何丽花
刘维春
岳晁民
何雨柔
蔡珍珍
张益丽
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Saidete Biopharmaceutical Co ltd
Original Assignee
Saidete Biopharmaceutical Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Saidete Biopharmaceutical Co ltd filed Critical Saidete Biopharmaceutical Co ltd
Priority to CN202511440001.2A priority Critical patent/CN120904358A/zh
Publication of CN120904358A publication Critical patent/CN120904358A/zh
Pending legal-status Critical Current

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Abstract

本发明涉及免疫领域，特别涉及一种新型IL‑15融合蛋白及其应用。本发明提供了IL‑15跨膜融合蛋白，将该结构应用于NK细胞或CAR‑NK细胞上，能够显著增强NK细胞和CAR‑NK细胞的肿瘤杀伤功能，而且能够有效促进NK细胞和CAR‑NK细胞的增殖。为开发不依赖于任何肿瘤靶点的、经过所述IL‑15跨膜融合蛋白装甲的NK细胞产品提供了重要依据，从而降低CAR‑NK开发的周期和成本。同时本发明分别在表达CD19的血液瘤和表达CD276的实体瘤中进行了功能研究，其结果预示着该结构的在肿瘤中的广谱性应用前景。

Description

一种新型IL-15融合蛋白及其应用
技术领域
本发明涉及免疫领域，特别涉及一种新型IL-15融合蛋白及其应用。
背景技术
嵌合抗原受体修饰的免疫效应细胞（CAR-T/NK）疗法在近年来发展迅猛、备受期待。NK细胞被认为有替代T细胞的潜力。与CAR-T细胞治疗相比，CAR-NK细胞具备一些显著优势，包括：（1）安全性更好，毒副作用小；（2）免疫原性更低，适宜开发异体/现货产品；（3）有多种抗肿瘤激活机制，除了CAR依赖性激活外，CAR-NK还能通过非CAR依赖的癌细胞特异性激活。
早期研究发现，IL-2能刺激杀伤细胞（包括NK细胞和T细胞）在体外扩增，并在回输患者后表现出一定的抗肿瘤活性，为之后的细胞免疫疗法提供了依据。随着近些年CAR-T、CAR-NK治疗的快速发展，除IL-2外，IL-15的治疗潜力也不断被开发。现有技术中，NK细胞/CAR-NK细胞的中IL-15的作用有待进一步提升。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种新型IL-15融合蛋白及其应用。本发明引入了跨膜结构，形成新型的IL-15融合蛋白（tmbIL-15）。该跨膜结构一方面能够发挥IL-15的促增殖功能，另一方面通过跨膜结构实现向NK胞内进行激活信号的传导，从而进一步激活NK细胞。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
第一方面，本发明提供了IL-15跨膜融合蛋白，包括：IL-15编码区、铰链区和截短的2B4受体；所述截短的2B4受体具有如SEQ ID NO.23所示的氨基酸序列；
所述IL-15编码区具有如SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列；
所述铰链区包括CD28 hinge；所述CD28 hinge具有如SEQ ID NO.13所示的氨基酸序列。
在本发明的一些具体实施方案中，所述IL-15跨膜融合蛋白具有如SEQ ID NO.31所示的氨基酸序列。
第二方面，本发明还提供了融合蛋白，包括所述IL-15跨膜融合蛋白，还包括信号肽、抗原结合域、铰链&跨膜区、信号传导区或剪切肽中的一种或多种；
所述信号肽选自CD8a SP；
所述抗原结合域选自CD276 scFV、CD276 VHH或FMC63；
所述铰链&跨膜区选自CD8a hinge&TM或CD28 hinge；和/或
所述信号传导区选自BBz；
所述剪切肽选自P2A。
在本发明的一些具体实施方案中，所述信号肽CD8a SP的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示；
所述CD276 scFV的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示、所述CD276 VHH的氨基酸序列如SEQ ID NO.32所示或所述FMC63的氨基酸序列如SEQ ID NO.34所示；
所述铰链&跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；
所述信号传导区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；
所述剪切肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。
第三方面，本发明还提供了编码所述IL-15跨膜融合蛋白，或编码所述融合蛋白的核酸分子。
第四方面，本发明还提供了表达载体，包括所述的核酸分子。
第五方面，本发明还提供了病毒颗粒，包括所述的表达载体。
第六方面，本发明还提供了宿主，包括如下任意项：
（I）、表达所述IL-15跨膜融合蛋白；或
（II）、表达所述融合蛋白；或
（III）、转染所述表达载体；或
（IV）、转导所述病毒颗粒。
在本发明的一些具体实施方案中，所述宿主包括NK细胞、NKT细胞、T细胞或诱导生成的NK细胞、NKT细胞、T细胞。
第七方面，本发明还提供了如下任意项在制备维持免疫细胞的活性、促进免疫细胞的存活或增殖、制备增强肿瘤杀伤功能的免疫细胞的药物中的应用：
（I）、所述IL-15跨膜融合蛋白；或
（II）、所述融合蛋白；或
（III）、所述表达载体；或
（IV）、所述病毒颗粒；或
（V）、所述宿主。
在本发明的一些具体实施方案中，所述肿瘤包括血液瘤和/或实体瘤。
作为优选，所述实体瘤表达CD276；更优选的，所述实体瘤包括卵巢癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、头颈癌、肾癌、子宫颈癌、乳腺癌、结直肠癌、神经母细胞瘤、垂体瘤、食管癌、口腔癌、胃癌、胰腺癌、子宫内膜癌、皮肤癌、骨髓瘤、膀胱癌、骨肉瘤或神经胶质瘤中的一种或多种。
作为优选，所述血液瘤表达CD19；更优选的，所述血液瘤包括淋巴瘤或B细胞白血病。
在本发明的一些具体实施方案中，所述增强肿瘤杀伤功能包括提高靶细胞的杀伤力和/或促进杀伤因子释放；
作为优选，所述杀伤因子包括IFN-γ或TNF-α。
第八方面，本发明还提供了如下任意项在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用：
（I）、所述IL-15跨膜融合蛋白；或
（II）、所述融合蛋白；或
（III）、所述的表达载体；或
（IV）、所述的病毒颗粒；或
（V）、所述的宿主。
在本发明的一些具体实施方案中，所述肿瘤包括血液瘤和/或实体瘤。
作为优选，所述实体瘤表达CD276；更优选的，所述实体瘤包括卵巢癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、头颈癌、肾癌、子宫颈癌、乳腺癌、结直肠癌、神经母细胞瘤、垂体瘤、食管癌、口腔癌、胃癌、胰腺癌、子宫内膜癌、皮肤癌、骨髓瘤、膀胱癌、骨肉瘤或神经胶质瘤中的一种或多种。
作为优选，所述血液瘤表达CD19；更优选的，所述血液瘤包括淋巴瘤或B细胞白血病。
第九方面，本发明还提供了药物/药物组合，其特征在于，所述药物以如下任意项为原料，以及药学上可接受的辅料或助剂：
（I）、所述IL-15跨膜融合蛋白；或
（II）、所述融合蛋白；或
（III）、所述表达载体；或
（IV）、所述病毒颗粒；或
（V）、所述宿主；
所述药物组合包括所述药物以及其他任意有效成分。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示IL-15跨膜蛋白慢病毒在核心质粒CAR结构1组CAR-NK细胞的感染效率；
图2示核心质粒CAR结构1组CAR-NK细胞在培养过程中添加PANC-1细胞进行刺激培养后CAR+比例变化；
图3示核心质粒CAR结构1组CAR-NK细胞在培养过程中不添加PANC-1细胞进行刺激培养后CAR+比例变化；
图4示未用PANC-1预处理组，不同效靶比（E:T）条件下SDT-NK003 CAR-NK和SDT-NK045 CAR-NK细胞对PANC-1细胞的杀伤（lysis）；
图5示PANC-1预处理组，不同效靶比（E:T）条件下SDT-NK003 CAR-NK和SDT-NK045CAR-NK细胞对PANC-1细胞的杀伤（lysis）；
图6示细胞上清液组γ干扰素（IFN-γ）的释放；
图7示细胞共孵育组γ干扰素（IFN-γ）的释放；
图8示UTD-NK对照组与SDT-NK076组流式细胞仪检测IL-15表达结果；
图9示培养过程中UTD-NK与SDT-NK076 NK的细胞活率（cell viability）以及NK细胞总量(total number of NK cells）；
图10示添加IL-2的培养条件下得到的SDT-NK076 NK细胞不同效靶比（E:T）条件下对PANC-1细胞的杀伤率（lysis）；
图11示添加IL-2的培养条件下得到的SDT-NK076 NK细胞不同效靶比（E:T）条件下对Huh-7细胞的杀伤率（lysis）；
图12示添加IL-2的培养条件下得到的SDT-NK076 NK细胞不同效靶比（E:T）条件下对HePG2-CD276细胞的杀伤率（lysis）；
图13示添加IL-2的培养条件下得到的SDT-NK076 NK细胞不同效靶比（E:T）条件下对Raji细胞的杀伤率（lysis）;
图14示添加IL-2的培养条件下得到的SDT-NK076 NK细胞不同效靶比（E:T）条件下对HCT116细胞的杀伤率（lysis）；
图15示添加IL-2的培养条件下得到的SDT-NK076 NK细胞不同效靶比（E:T）条件下对HCC827细胞的杀伤率（lysis）；
图16示添加IL-2的培养条件下得到的SDT-NK076 NK细胞不同效靶比（E:T）条件下对SKOV-3细胞的杀伤率（lysis）；
图17示没有添加IL-2的条件下培养得到的SDT-NK076 NK细胞不同效靶比（E:T）条件下对PANC-1细胞的短期杀伤（lysis）；
图18示添加IL-2的条件下培养得到的SDT-NK076 NK细胞与PANC-1细胞共培养后γ干扰素（IFN-γ）释放量；
图19示添加IL-2的条件下培养得到的SDT-NK076 NK细胞与Huh-7细胞共培养后γ干扰素（IFN-γ）释放量；
图20示添加IL-2的条件下培养得到的SDT-NK076 NK细胞与Raji细胞共培养后γ干扰素（IFN-γ）释放量；
图21示添加IL-2的条件下培养得到的SDT-NK076 NK细胞与PANC-1细胞共培养后肿瘤坏死因子α（TNF-α）释放量；
图22示添加IL-2的条件下培养得到的SDT-NK076 NK细胞与Huh-7细胞共培养后肿瘤坏死因子α（TNF-α）释放量；
图23示添加IL-2的条件下培养得到的SDT-NK076 NK细胞与Raji细胞共培养后肿瘤坏死因子α（TNF-α）释放量；
图24示没有添加IL-2的条件下培养得到的SDT-NK076 NK细胞与PANC-1细胞共培养后γ干扰素（IFN-γ）释放量；
图25示没有添加IL-2的条件下培养得到的SDT-NK076 NK细胞与PANC-1细胞共培养后肿瘤坏死因子α（TNF-α）释放量；
图26示PANC-1细胞刺激后SDT-NK076 NK细胞的CD107a表达比例；
图27示Raji细胞刺激后SDT-NK076 NK细胞的CD107a表达比例；
图28示SDT-NK076 NK细胞培养过程中CD56、CD16表达水平；
图29示SDT-NK076 NK细胞培养过程中NKp30表达水平；
图30示SDT-NK076 NK细胞培养过程中NKp44表达水平；
图31示SDT-NK076 NK细胞培养过程中NKG2D表达水平；
图32示STD-NK076给药后荷瘤小鼠胰腺癌细胞PANC-1 luc活体成像结果；
图33示STD-NK076给药后荷瘤小鼠胰腺癌细胞PANC-1 luc定量表达结果；
图34 示STD-NK076给药后荷瘤小鼠眼眶外周血NK细胞存活比例；
图35示SDT-NK078 CAR-NK和SDT-NK066 CAR-NK的NK细胞活率；
图36示SDT-NK078 CAR-NK和SDT-NK066 CAR-NK的NK细胞数量；
图37示SDT-NK078 CAR-NK和SDT-NK066 CAR-NK的CAR+比例；
图38示添加IL-2的培养条件下得到的SDT-NK078 NK细胞不同效靶比（E:T）条件下对PANC-1细胞的短期杀伤（lysis）；
图39示添加IL-2的培养条件下得到的SDT-NK078 NK细胞不同效靶比（E:T）条件下对Huh-7细胞的短期杀伤（lysis）；
图40示添加IL-2的培养条件下得到的SDT-NK078 NK细胞不同效靶比（E:T）条件下对HepG2-CD276细胞的短期杀伤（lysis）；
图41示培养基包含细胞因子IL-2时，SDT-NK078 CAR-NK和SDT-NK066 CAR-NK细胞对HCT116细胞的杀伤；
图42示培养基包含细胞因子IL-2时，SDT-NK078 CAR-NK和SDT-NK066 CAR-NK细胞对HCC827细胞的杀伤；
图43示培养基包含细胞因子IL-2时，SDT-NK078 CAR-NK和SDT-NK066 CAR-NK细胞对SKOV-3细胞的杀伤；
图44示培养基不包含细胞因子IL-2时，SDT-NK078 CAR-NK和SDT-NK066 CAR-NK细胞对PANC-1细胞的杀伤；
图45示培养基中添加有IL-2，SDT-NK078 CAR-NK和SDT-NK066 CAR-NK细胞与PANC-1细胞共培养后IFN-γ的释放量；
图46示培养基中添加有IL-2，SDT-NK078 CAR-NK和SDT-NK066 CAR-NK细胞与Huh-7细胞共培养后IFN-γ的释放量；
图47示培养基中添加有IL-2，SDT-NK078 CAR-NK和SDT-NK066 CAR-NK细胞与PANC-1细胞共培养后TNF-α释放；
图48示培养基中添加有IL-2，SDT-NK078 CAR-NK和SDT-NK066 CAR-NK细胞与Huh-7细胞共培养后TNF-α释放；
图49示培养基中没有添加有IL-2，SDT-NK078 CAR-NK和SDT-NK066 CAR-NK细胞与PANC-1细胞共培养后IFN-γ的释放；
图50示培养基中没有添加有IL-2，SDT-NK078 CAR-NK和SDT-NK066 CAR-NK细胞与PANC-1细胞共培养后TNF-α的释放；
图51示SDT-NK078 CAR-NK和SDT-NK066 CAR-NK细胞与PANC-1细胞共培养后CD107a释放；
图52示PANC-1细胞刺激过程中SDT-NK078 CAR-NK和SDT-NK066 CAR-NK细胞CAR+比例变化；
图53示PANC-1细胞刺激过程中，SDT-NK078 CAR-NK和SDT-NK066 CAR-NK细胞IFN-γ的释放；
图54示PANC-1细胞刺激过程中，SDT-NK078 CAR-NK和SDT-NK066 CAR-NK细胞TNF-α的释放；
图55示SDT-NK078 CAR-NK和SDT-NK066 CAR-NK细胞培养过程中CD56、CD16表达水平；
图56示SDT-NK078 CAR-NK和SDT-NK066 CAR-NK细胞培养过程中NKp30表达水平；
图57示SDT-NK078 CAR-NK和SDT-NK066 CAR-NK细胞培养过程中NKp44表达水平；
图58示SDT-NK078 CAR-NK和SDT-NK066 CAR-NK细胞培养过程中NKG2D表达水平；
图59示STD-NK066、STD-NK078给药后荷瘤小鼠胰腺癌细胞PANC-1 luc活体成像结果；
图60示STD-NK078给药后荷瘤小鼠胰腺癌细胞PANC-1 luc定量表达结果；
图61示STD-NK066、STD-NK078给药后荷瘤小鼠眼眶外周血NK细胞存活比例；
图62示培养基包含细胞因子IL-2时，SDT-NK079 CAR-NK和SDT-NK004 CAR-NK细胞对RAJI细胞的杀伤；
图63示培养基不包含细胞因子IL-2时，SDT-NK079 CAR-NK和SDT-NK004 CAR-NK细胞对RAJI细胞的杀伤；
图64示培养基中添加有IL-2，SDT-NK079 CAR-NK和SDT-NK004 CAR-NK细胞与Raji细胞共培养后IFN-γ的释放；
图65示培养基中添加有IL-2，SDT-NK079 CAR-NK和SDT-NK004 CAR-NK细胞与Raji细胞共培养后TNF-α的释放；
图66示培养基中没有添加有IL-2，SDT-NK079 CAR-NK和SDT-NK004 CAR-NK细胞与Raji细胞共培养后IFN-γ的释放；
图67示培养基中没有添加有IL-2，SDT-NK079 CAR-NK和SDT-NK004 CAR-NK细胞与Raji细胞共培养后TNF-α的释放；
图68示SDT-NK079 CAR-NK和SDT-NK004 CAR-NK细胞与Raji细胞共培养后CD107a释放；
图69示Raji细胞刺激过程中SDT-NK079 CAR-NK和SDT-NK004 CAR-NK细胞CAR+比例变化；
图70示Raji细胞刺激过程中，SDT-NK079 CAR-NK和SDT-NK004 CAR-NK细胞IFN-γ的释放；
图71示Raji细胞刺激过程中，SDT-NK079 CAR-NK和SDT-NK004 CAR-NK细胞TNF-α的释放；
图72示SDT-NK079CAR-NK和SDT-NK004 CAR-NK细胞培养过程中CD56、CD16表达水平；
图73示SDT-NK079CAR-NK和SDT-NK004 CAR-NK细胞培养过程中NKp30、表达水平；
图74示SDT-NK079CAR-NK和SDT-NK004 CAR-NK细胞培养过程中NKp44、表达水平；
图75示SDT-NK079CAR-NK和SDT-NK004 CAR-NK细胞培养过程中NKG2D表达水平。
具体实施方式
本发明公开了一种新型IL-15融合蛋白及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
术语解释：
PBMC：外周血单个核细胞
NK细胞：自然杀伤细胞
CAR-NK细胞：嵌合抗原受体NK细胞
IL-15：白介素15
IFN-γ：干扰素-γ
TNF-α：肿瘤坏死因子α
2B4：自然杀伤细胞受体2B4
KIRS2：NK细胞表面的免疫检查点受体
NKp30：天然细胞毒性触发受体3
NKp46：天然细胞毒性触发受体1
NKp44：天然细胞毒性触发受体2
DAP10：DNAX相关蛋白10
DAP12：DNAX活化蛋白12
CD16a：具有独特胞质结构域的跨膜分子
本发明提供了tmbIL-15结构及其在NK或CAR-NK的应用，以及在血液瘤和实体瘤的治疗应用。本发明分别在NK和CAR-NK上进行研究，发现tmbIL-15能够显著增强NK或CAR-NK的功能，尤其是对NK功能的增强非常显著，该结果预示着有可能开发一种不依赖于任何肿瘤靶点的、经过tmbIL-15装甲的NK细胞产品，从而降低CAR-NK开发的周期和成本。
同时本发明分别在表达CD19的血液瘤和表达CD276的实体瘤中进行了功能研究，其结果预示着该结构的在肿瘤中的广谱性应用前景。
如无特殊说明，本发明提供的一种新型IL-15融合蛋白及其应用中所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1 IL-15跨膜融合蛋白结构的筛选
1.1、CAR-NK细胞的制备
1.1.1实验方法
（1）病毒制备：病毒包装前一天接种293T细胞，保证病毒制备时293T细胞汇合度在80%-90%之间；病毒制备当天将表达不同CAR结构的核心质粒（CAR结构见表1）、包膜质粒（BaEVTR-PR12，参考CN118005808A）、辅助质粒（psPAX2）按4：1：2比例混合后加入3倍PEI(YESEN，40820ES10)助转剂，静置15 min后逐滴添加到293T细胞中进行产毒，收取48 h和72h的病毒原液，在4000 g、4℃、升9降9的条件下过夜离心进行浓缩，用浓缩后的病毒感染Jurkat细胞，72 h后检测感染效率，并计算病毒滴度冻于-80℃备用。
表1 核心质粒CAR结构1组
CD8a SP的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：
MALPVTALLLPLALLLHAARP
CD8a SP的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：
atggccctgcccgtgaccgccctgctgctgccactggccctgctgctgcatgccgctagacct
CD276 scFV的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示：
QVQLVQSGAEVVKPGASVKLSCKTSGYTFTNYDINWVRQRPGQGLEWIGWIFPGDGSTQYNEKFKGKATLTTDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYFCARQTTATWFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVMTQSPATLSVSPGERVTLSCRASQSISDYLYWYQQKSHESPRLLIKYASQSISGIPARFSGSGSGSEFTLTINSVEPEDVGVYYCQNGHSFPLTFGQGTKLELKR
CD276 scFV的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示：
caggtgcagctggtgcagtcaggagctgaagtggtgaaacctggcgcctctgtgaagctgagttgtaagacatctggctatacattcactaattatgatattaattgggtgagacagagacctggacagggactggagtggattggctggatctttccaggagacggctctacacagtataatgaaaagttcaagggcaaagctacactgacaaccgacaccagcaccagcaccgcctacatggagctgtccagcctgaggtccgaggataccgccgtgtacttctgcgctaggcagaccaccgccacctggttcgcctactggggccagggcaccctggtgaccgtgagcagcggcggcggcggaagcggcggcggcggcagcggcggcgggggctccgagatcgtgatgacccagtcccccgccaccctgagcgtgagccctggcgagagggtgaccctgagctgcagagcatctcagagcatctccgactacctgtactggtaccagcagaagagccacgaaagccccagactgctgatcaagtacgccagccagagcatcagcggcatccctgccaggttctccggcagcggctctggcagcgagttcaccctgaccattaatagcgtggaaccagaagatgttggagtgtattattgtcagaatggacactcttttccactgacatttggacagggcacaaaactggagctgaaaaga
CD8a hinge&TM的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示（下划线部分为CD8a hinge对应的氨基酸序列，其余部分为CD8a TM对应的氨基酸序列）：
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT
CD8a hinge&TM的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示：
accacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcacc
BBz表示4-BB共刺激域+CD3ζ信号转导域,氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示：
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
BBz的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示：
aaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgcagagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc
P2A的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示：
GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP
P2A的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示：
ggctccggtgctaccaacttttcacttctgaagcaggccggcgacgtggaggagaatccaggccct
IL-15的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示：
NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS
IL-15的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示：
aactgggtcaacgtgatcagcgatctcaagaagattgaggacctgatccagagcatgcatattgacgccactctgtacacggagagtgatgtgcacccctcttgtaaagtgacggccatgaagtgcttcctgctggagttgcaagttatctcgctggagtctggggacgcatccatccatgacaccgtggagaacctgatcatcctggccaacaactccctttcgtctaatggcaacgtgactgagagcgggtgcaaagaatgtgaggagctggaagagaagaacatcaaggagttcctacagtccttcgtccacatcgtccagatgtttattaacacgtcc
CD28 hinge的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示：
IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP
CD28 hinge的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示：
attgaggtgatgtaccctcccccgtacctggacaacgagaaatcgaacggcaccatcatccacgttaaaggcaagcacctgtgcccaagccctctttttcccgggccgtccaagccc
truncated KIRS2的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示：
NPRHLHVLIGTSVVKIPFTILLFFLLHRWCSNKK
truncated KIRS2的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示：
aatccacgtcacttgcatgtcctcatcggtacttccgtggtgaagattcccttcaccatcctgctgttcttcctgctacaccgctggtgttctaacaagaag
truncated NKp30的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示：
EHPQLGAGTVLLLRAGFYAVSFLSVAVGSTVYYQG
truncated NKp30的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示：
gagcacccccagttgggtgctggcaccgtgctgctgctccgcgccggcttttacgcggtgtccttcctgagcgtcgccgtggggtctactgtttattaccaggga
truncated NKp46的氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示：
AQNLLRMGLAFLVLVALVWFLVEDWLSRKRTRERA
truncated NKp46的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示：
gcccagaacctgctgcgtatgggcctggcgttcctggtgctggtggctcttgtctggtttttggtggaggactggctctcccgcaagcgcacccgcgagcgggcc
truncated NKp44的氨基酸序列如SEQ ID NO.21所示：
PAAPIALVPVFCGLLVAKSLVLSALLVWWGDIWWK
truncated NKp44的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示：
cctgccgctcccatcgcgctggttccggtgttctgcggtctgctggtggccaagtccttggtgctgagcgcacttctcgtctggtggggcgacatttggtggaag
truncated 2B4的氨基酸序列如SEQ ID NO.23所示：
EFRFWPFLVIIVILSALFLGTLACFCVWRRKRKEK
truncated 2B4的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示：
gagttccgcttctggcccttcctggtgatcatcgtgattttgtccgctctcttcctgggcaccctggcctgcttttgcgtgtggcggcgtaagcgcaaggagaaa
truncated DAP10的氨基酸序列如SEQ ID NO.25所示：
GSLSLPLLAGLVAADAVASLLIVGAVFLCARPRRS
truncated DAP10的核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示：
ggctccctttctctgcccctgctggccggtctggtggcagcggacgccgtcgctagcttgctcatcgtgggcgccgtgttcctgtgcgctcgtccgcgccgctcg
truncated DAP12的氨基酸序列如SEQ ID NO.27所示：
CSTVSPGVLAGIVMGDLVLTVLIALAVYFLGRLVP
truncated DAP12的核苷酸序列如SEQ ID NO.28所示：
tgcagcaccgtgtcccccggggttcttgctggcatcgtgatgggcgacctggtgctgaccgtcctcattgcgctggccgtgtacttcctgggtcgcttggtccct
truncated CD16a的氨基酸序列如SEQ ID NO.29所示：
FPPGYQVSFCLVMVLLFAVDTGLYFSVKTNIRSST
truncated CD16a的核苷酸序列如SEQ ID NO.30所示：
ttccctcccggctaccaggtctccttctgcctggtgatggtgctgttgttcgccgttgacaccggtctctacttttctgtgaagaccaacatccgcagctcgact
（2）CAR-NK细胞制备：购买自妙顺生物的PBMC复苏之后，使用CytoSinct™ CD3Nanobeads（GenScript，L00896）磁珠分选NK细胞，分选得到的NK细胞按1：1加入K562滋养层细胞共培养到第四天（Day 4）后，按照MOI为5进行病毒转导制备CAR-NK细胞，培养基用KBM581+10%FBS+500 IU/mL IL-2；
（3）CAR-NK阳性细胞检测：病毒转导后第三天，用APC anti-human CD56 (NCAM)Antibody（Biolegend，362504）和MonoRab™ Rabbit Anti-Humanized VHH Antibody [PE]（GenScript，A02171-200）4℃染色20 min后上机检测，UTD-NK为未进行病毒转导的NK细胞。
1.1.2 实验结果
图1的结果显示，各实验组病毒均能感染NK细胞，制备对应的CAR-NK细胞。由于结构设计的不同，各组对NK细胞的感染效率不同。
1.2、靶细胞刺激过程中CAR+比例变化情况
1.2.1 实验方法
按照1.1.1的实验方法制备各种CAR-NK细胞。根据计数结果以及流式检测结果，调整CAR+及细胞总数一致，将CAR-NK细胞分为两组，每组2.0×106细胞量，在培养基KBM581+10%FBS中进行培养。一组每隔两天添加5.0×105靶细胞人胰腺癌细胞系PANC-1刺激，一组不添加靶细胞刺激而正常生长；每2天检测CAR+比例以及进行细胞计数，CAR+<20%后停止处理。
1.2.2 实验结果
图2、图3的结果显示，调整CAR及细胞量一致的情况下，随着培养时间增长情况下，SDT-NK003、SDT-NK045的CAR+比例逐渐增长，Day 12增长至>50%，其余各组CAR+比例持续降低，直至CAR+比例<20%后停止处理。图3显示在培养过程中不添加PANC-1细胞进行刺激培养后，SDT-NK045组CAR+比例高于SDT-NK003。表明SDT-NK045、SDT-NK003的CAR+细胞持续增殖的能力很强，其中SDT-NK045的CAR+细胞持续增殖的能力最强。选取SDT-NK045、SDT-NK003进一步进行功能验证。
1.3 体外短期杀伤验证
1.3.1 实验方法
选用人胰腺癌细胞系PANC-1细胞作为靶细胞。
选用SDT-NK045 CAR-NK细胞和SDT-NK003 CAR-NK细胞作为效应细胞，并进行两组不同的处理，选用NK细胞（UTD-NK）作为对照。
PANC-1预处理组：使用PANC-1细胞分别与SDT-NK045 CAR-NK细胞和SDT-NK003CAR-NK细胞共培养12天后，分别收集SDT-NK045 CAR-NK细胞和SDT-NK003 CAR-NK细胞作为效应细胞。
未用PANC-1预处理组：分别将SDT-NK045 CAR-NK细胞和SDT-NK003 CAR-NK细胞培养12天后，分别收集SDT-NK045 CAR-NK细胞和SDT-NK003 CAR-NK细胞作为效应细胞。
①将靶细胞按每孔10000cell/100 μL加入96孔白板；
②按照设定的6个效靶比（2:1、1:1、0.5:1、0.25:1、0.125:1、0.0625:1）计算效应细胞用量，将效应细胞在透明96孔板中进行稀释到对应的浓度；
③取100 μL稀释后的效应细胞接种到步骤①的靶细胞中；
④靶细胞和效应细胞接种后，放入二氧化碳培养箱培养；
⑤20小时后，加入ONE-Glo底物（Promega，#E6120）后，酶标仪进行检测；
⑥按照以下公式计算杀伤效率：
效应细胞杀伤率%=（1-样品组读值/靶细胞读值）%
靶细胞读值表示只接种10000cell/孔的靶细胞后酶标仪检测的数值。
1.3.2 实验结果
图4、图5的结果显示，SDT-NK003 CAR-NK和SDT-NK045 CAR-NK细胞对PANC-1靶细胞均有显著性杀伤。图4显示，未用PANC-1预处理时，SDT-NK003与SDT-NK045杀伤均很强且没有差异；图5显示用PANC-1进行预处理反复刺激时，SDT-NK045的杀伤能力强于SDT-NK003。
1.4 细胞因子释放检测
1.4.1 实验方法
分别制备SDT-NK045 、SDT-NK003 、UTD-NK细胞，将细胞进行两组处理：
细胞上清液组：SDT-NK045、SDT-NK003、UTD-NK细胞平均分两组，一组细胞正常培养，另一组按4：1比例添加PANC-1细胞，隔天补加相同数量的PANC-1细胞，共培养12天后收集细胞上清液进行IFN-γ细胞因子检测，具体检测方法参考IFN-γ（ACRO CRS-A017）因子检测试剂盒说明书。
细胞共孵育组：SDT-NK045、SDT-NK003、UTD-NK细胞平均分两组，一组细胞正常培养，另一组按4：1比例添加PANC-1细胞，隔天补加相同数量的PANC-1细胞，共培养12天后收集各组细胞，取1.0×105 CAR-NK细胞与1.0×105 PANC-1靶细胞共孵育18h后，离心收集上清进行IFN-γ细胞因子检测，具体检测方法参考IFN-γ（ACRO CRS-A017）因子检测试剂盒说明书。
1.4.2实验结果
图6的结果显示，PANC-1靶细胞预处理12天后，上清液中SDT-NK045中IFN-γ的释放量均高于SDT-NK003；PANC-1靶细胞处理组上清中IFN-γ的释放量显著高于未用PANC-1靶细胞处理组。
图7的结果显示，SDT-NK045、SDT-NK003细胞与PANC-1靶细胞共孵育后，SDT-NK045上清液中IFN-γ释放量显著高于SDT-NK003；预先用PANC-1处理6天的CAR-NK细胞，由于靶细胞长期刺激状态下，对PANC-1靶细胞的敏感度降低，所以未用PANC-1处理组中IFN-γ的释放量高于预先用PANC-1处理组。
以上实验结果显示，SDT-NK045结构在CAR+表达、杀伤能力以及IFN-γ释放等方面显著优于其他结构。将该结构中的跨膜融合蛋白CD8a SP+IL-15+CD28 hinge+truncated2B4简称为tmbIL-15，氨基酸序列如SEQ ID NO.31所示：
MALPVTALLLPLALLLHAARPNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPEFRFWPFLVIIVILSALFLGTLACFCVWRRKRKEK
实施例2 tmbIL-15结构对NK功能的影响
2.1 NK细胞中tmbIL-15的表达
2.1.1 实验方法：
按照1.1的方法制备tmbIL-15 NK（SDT-NK076）细胞作为实验组，其中核心质粒上的tmbIL-15结构见表2。
表2 核心质粒tmbIL-15结构
IL-15检测：SDT-NK076制备后3天，计数收取1.0×106细胞，用Biotin anti-humanIL-15 Antibody(BioLegend，515104)和APC anti-human CD56 (NCAM) Antibody（Biolegend，362504）4℃染色20 min后使用流式细胞仪进行检测；以没有进行转导的NK细胞（UTD-NK）作为对照组。
2.1.2实验结果
图8的结果显示，与对照组UTD-NK相比，实验组SDT-NK076成功在NK细胞过表达IL-15。
2.2 tmbIL-15对NK细胞活性以及增殖的影响；
2.2.1实验方法：
CAR-NK阳性细胞检测CAR-NK细胞数量≥2×107，将SDT-NK076细胞在KBM581+10%FBS基础培养基进行培养，不添加促进NK增殖的细胞因子IL-2，在培养的第2天、第5天检测NK活率和增殖变化。
2.2.2实验结果：
图9的结果显示，在实验组和对照组细胞起始量一致（1.0×107）和细胞活率接近的情况下，SDT-NK076在培养过程中活率稳定保持在80%以上，且细胞数量持续增长，直至Day 5细胞数量达到6.0×107以上；而对照组UTD-NK，培养过程中细胞活率持续降低，且细胞数量显示负增长趋势。表明tmbIL-15促进了NK的活率维持和增殖。
2.3 添加IL-2的培养条件下得到的tmbIL-15 NK对多种靶细胞的短期杀伤
2.3.1实验方法
①按照实施例2.1的方法制备tmbIL-15 NK细胞，以培养基（KBM581+10%FBS+500IU/mL IL-2）进行培养。
②选取7种癌细胞，即人胰腺癌（PANC-1）、人肝癌（Huh-7/HepG2-CD276）、人淋巴瘤（Raji）、人结肠癌（HCT116）、人非小细胞肺癌（HCC827）、人卵巢癌（SKOV-3）分别作为靶细胞。将靶细胞按每孔10000cell/100 μL加入96孔白板；
③按照设定的6个效靶比（2:1、1:1、0.5:1、0.25:1、0.125:1、0.0625:1）计算效应细胞用量，将效应细胞在透明96孔板中进行稀释到对应的浓度；
④将稀释后的效应细胞取100 μL转移到靶细胞中（96孔白板）；
⑤靶细胞和效应细胞接种后，将96孔白板放入二氧化碳培养箱培养；20小时后，加入ONE-Glo底物（Promega，#E6120）后，酶标仪进行检测；
2.3.2实验结果：
表3 SDT-NK076和UTD-NK对PANC-1的杀伤率统计表(添加IL-2)
表4 SDT-NK076和UTD-NK对Huh-7的杀伤率统计表(添加IL-2)
表5 SDT-NK076和UTD-NK对HePG2-CD276的杀伤率统计表(添加IL-2)
表6 SDT-NK076和UTD-NK对RAJI的杀伤率统计表(添加IL-2)
表7 SDT-NK076和UTD-NK对HCT116的杀伤率统计表(添加IL-2)
表8 SDT-NK076和UTD-NK对HCC827的杀伤率统计表(添加IL-2)
表9 SDT-NK076和UTD-NK对SKOV-3的杀伤率统计表(添加IL-2)
图10到图16、表3到表9的结果显示，不同效靶比条件下，SDT-NK076对7种靶细胞的杀伤能力均显著高于对照组UTD-NK，表明tmbIL-15结构加强了NK细胞对靶细胞的杀伤能力。
2.4 没有添加IL-2的条件下培养得到的tmbIL-15 NK对靶细胞的短期杀伤
2.4.1 实验方法
按照实施例2.3.1的方法进行，区别在于以培养基KBM581+10%FBS进行培养，靶细胞为PANC-1。
2.4.2 试验结果
表10 SDT-NK076和UTD-NK对PANC-1的杀伤率统计表(不添加IL-2)
图17，表10的结果显示，实验组SDT-NK076杀伤显著强于对照组UTD-NK。与表3的结果相比，SDT-NK076对PANC-1靶细胞的杀伤能力没有减弱，而UTD-NK在撤掉IL-2培养的条件下，显著降低了对PANC-1靶细胞的杀伤能力，表明即使在没有IL-2培养的条件下，tmbIL-15仍然能够维持NK细胞较高的体外杀伤功能。
2.5 添加IL-2的条件下培养得到的细胞因子释放检测
2.5.1 实验方法
分别将tmbIL-15 NK细胞在培养基为KBM581+10%FBS+500 IU/mL IL-2中进行培养，选取3种癌细胞，即人胰腺癌（PANC-1）、人肝癌（Huh-7）、人淋巴瘤（Raji）分别作为靶细胞。
将1.0×105 tmbIL-15 NK细胞与1.0×105靶细胞共孵育18 h，离心收集上清进行IFN-γ和TNF-α的检测；具体实验步骤参考IFN-γ（ACRO CRS-A017）、TNF-α(ACRO CRS-A002)因子检测试剂盒说明书：
实验结果
表11 IFN-γ释放量统计表（添加IL-2）
表12 TNF-α释放量统计表（添加IL-2）
图18至图23、表11、表12的结果显示，tmbIL-15 NK细胞在有IL-2的培养基的条件下，与对照组UTD-NK相比，实验组tmbIL-15 NK（SDT-NK076）释放更高水平的IFN-γ和TNF-α。
2.6 没有添加IL-2的条件下培养得到的细胞因子释放检测
2.6.1 实验方法
按照实施例2.5.1的方法进行，区别在于以培养基KBM581+10%FBS进行培养，靶细胞为PANC-1。
2.6.2 实验结果
表13 IFN-γ释放量统计表（不添加IL-2）
表14 TNF-α释放量统计表（不添加IL-2）
图24、图25、表13、表14的结果显示，在没有添加IL-2的培养条件下获得的tmbIL-15 NK细胞（SDT-NK076），与PANC-1靶细胞按1：1效靶比共培养18h后，具有较高的IFN-γ和TNF-α释放水平，对照组UTD-NK的IFN-γ和TNF-α释放几乎检测不到。与表11、表12的结果相比，释放水平有显著升高，表明tmbIL-15增强了NK细胞杀伤因子的释放，且可以在培养时不加入IL-2就可以实现较高的杀伤因子释放。
2.7 CD107a检测
2.7.1 实验方法
将tmbIL-15 NK细胞在培养基为KBM581+10%FBS中进行培养，选取2种癌细胞，即人胰腺癌（PANC-1）、人淋巴瘤（Raji）分别作为靶细胞。
将效应细胞 100 μL（1.0×105），靶细胞100 μL（1.0×105），加入96孔板；
加入2 μL PE anti-human CD107a (LAMP-1) Antibody(BioLenged，328608)，37℃孵育1 h；
将2 μL GolgiStop™ Protein Transport Inhibitor（BD，554724）加入3 mL完全培养基中，取20 μL加入细胞中混匀，孵育2.5 h-3 h后，加入0.5 μL APC anti-human CD56(NCAM) Antibody（Biolegend，362504），37 ℃孵育30 min，FACS buffer 清洗一遍，进行上机检测CD107a分子的表达。
2.7.2 实验结果
CD107a分子的表达上调与穿孔素的分泌一致，其表达水平与NK细胞的杀伤活性显著相关。CD107a分子阳性表达的NK细胞可代表具有杀伤活性的NK细胞。图26、图27的结果显示，与对照组UTD-NK相比，在不同类别的靶细胞刺激后，tmbIL-15 NK（SDT-NK076）均释放出较高水平的CD107a。
2.8 NK细胞杀伤表型的检测
2.8.1实验方法
① 在CAR-NK培养的Day0、Day5、Day7分别收取1.0×106 tmbIL-15 NK（SDT-NK076）和UTD-NK细胞，离心去掉上清；
② FACS buffer清洗一遍，然后每个样品加入1 μL的CD56（Biolenged，362508）、CD16（Biolenged，360716）、NKp30（Biolenged，325234）、NKp44（Biolenged，325112）、NKG2D（Biolenged，320824）抗体4℃染色20 min；
③ FACS buffer清洗一遍，200 μL FACS buffer重悬之后进行流式检测CD56、CD16、NKp30、NKp44、NKG2D表达水平；
2.8.2实验结果
图28至图31的结果显示，与对照组UTD-NK相比，tmbIL-15 NK细胞(SDT-NK076)的NKp30、NKp44和NKG2D等NK激活受体随着培养时间的延长表达逐渐增加；同时CD56+CD16+双阳的NK表型增加的趋势更明显，预示着NK的成熟度增加。表明tmbIL-15能够促进对NK杀伤受体的表达，从而促进NK细胞的激活和成熟。
以上实验表明，tmbIL-15能够显著促进NK细胞的存活和增殖，且对多个肿瘤细胞具有显著的体外杀伤和杀伤因子释放。在无IL-2的培养基长期处理条件下，tmbIL-15能够显著维持NK细胞的功能和增殖，不受IL-2的影响。
2.9 对动物体内肿瘤的影响
2.9.1实验方法
肿瘤动物模型选择重度免疫缺陷小鼠NCG模型，肿瘤细胞选择胰腺癌细胞PANC-1luc，进行尾静脉荷瘤，荷瘤剂量为1.0×106细胞/只,在荷瘤后第D28和第D42天按1.0×107/只剂量进行两次给药，并设置对照组DPBS组和UTD-NK细胞组。所有实验样品均来自从妙顺生物购买的PBMC经磁珠分选获得NK细胞，NK细胞病毒感染后获得CAR-NK样品。给药后通过活体成像定期检测肿瘤负荷的变化，同时观察小鼠体重变化。在D49、D56和D63分别采集小鼠眼眶外周血，通过流式检测NK细胞在其中的比例。
2. 实验结果：
（1）活体成像结果
表15 CAR-NK对胰腺癌细胞PANC-1 luc的抑制作用的统计学分析
图32、图33、表15的结果显示，相比对照组DPBS和NK组，tmbIL-15装甲的NK细胞组SDT-NK076具有显著的抑瘤效果。
（2）NK细胞在小鼠体内的持久性观察。
表16 CAR-NK细胞在小鼠体内的持久性观察
“-” 表示小鼠死亡；
表17 CAR-NK细胞在小鼠体内的持久性观察的统计学分析
表16、表17、图34的结果显示，在D49、D56和D63分别采集的小鼠眼眶外周血中，tmbIL-15-NK组仍然有较高的NK细胞存活比例，而NK组几乎检测不到，预示着tmbIL-15-NK在体内具有显著的持久存活能力。
实施例3 tmbIL-15结构对CD276 VHH-CAR-NK功能的影响
3.1 tmbIl-15对CAR+活率和增殖的影响
3.1.1实验方法
（1）CAR-NK细胞的制备：按照1.1的方法制备SDT-NK066与SDT-NK078细胞，其中核心质粒上的CAR结构见表3。以没有进行转导的NK细胞（UTD-NK）作为对照组。
表18 核心质粒CAR结构2组
CD276 VHH为CD276单域抗体，抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.32所示：
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCSASGFTPSIYTMGWYRQAPGKGREFVASIVNEGIPGYAGSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAFATYYGLGDPRYWGQGTLVTVSS
CD276 VHH的核苷酸序列如SEQ ID NO.33所示：
caggtgcaactggtggagagcggaggtggattggtgcagccagggggttccctacgcctgtcatgctccgcctccggctttacaccctctatctacaccatgggctggtaccgccaggcccccgggaagggccgagagttcgtcgcttccattgtcaacgagggcatccctggctacgcggggtccgtaaaaggccgcttcaccatctctcgggacaactccaagaacacgctttacctgcagatgaactccctgcgcgccgaagacaccgccgtgtactactgtgccttcgccacttattacggcctcggtgatccgcgttattggggccagggcaccctggttactgtgagctcg
CAR检测：CAR-NK制备后3天，计数收取1.0×106细胞，病毒转导后第三天，用APCanti-human CD56 (NCAM) Antibody（Biolegend，362504）和MonoRab™ Rabbit Anti-Humanized VHH Antibody [PE]（GenScript, A02171-200）4 ℃染色20 min后上机检测；
调整CAR-NK细胞起始总数以及CAR表征一致，将制备的各种CAR-NK细胞按照1.0×107接种在基础培养基KBM581+10%FBS中进行培养，不加入常用的促进NK细胞增殖的细胞因子IL-2。在培养过程中使用细胞计数仪记录NK活率和增殖变化。
3.1.2 实验结果
图35、图36的结果显示，SDT-NK078在培养过程中活率稳定保持没有下降，且细胞数量持续增长，而对照组UTD-NK和CAR-NK(SDT-NK066)，培养过程中细胞活率持续降低，且细胞数量显示负增长趋势。
图37的结果显示，对比SDT-NK078与SDT-NK066之间CAR变化，发现随着培养时间变化，带tmbIL-15的（SDT-NK078）CAR+在培养后期逐渐上升，而不带tmbIL-15结构的（SDT-NK066）CAR+在培养过程中持续下降；表明tmbIL-15促进了CAR-NK的活率维持和增殖，进一步影响CAR表达。
3.2 tmbIL-15-CD276 VHH-CAR-NK短期杀伤实验
3.2.1实验方法
选取表达CD276的6种癌细胞，即人胰腺癌（PANC-1）、人肝癌（Huh-7）、人肝癌（HepG2-CD276）、人结肠癌（HCT116）、人非小细胞肺癌（HCC827）以及人卵巢癌（SK-OV-3）作为靶细胞。
将制备好的SDT-NK066、SDT-NK078细胞、UTD-NK细胞分别在培养基为KBM581+10%FBS+500 IU/mL IL-2或KBM581+10%FBS中进行培养7天后作为效应细胞。
按照1.3的方法进行短期杀伤实验。
3.2.2 实验结果
表19 SDT-NK066、SDT-NK078和UTD-NK对PANC-1的杀伤率统计表(添加IL-2)
表20 SDT-NK066、SDT-NK078和UTD-NK对Huh-7的杀伤率统计表(添加IL-2)
表21 SDT-NK066、SDT-NK078和UTD-NK对HepG2-CD276的杀伤率统计表(添加IL-2)
表22 SDT-NK066、SDT-NK078和UTD-NK对HCC827的杀伤率统计表(添加IL-2)
表23 SDT-NK066、SDT-NK078和UTD-NK对HCT116的杀伤率统计表(添加IL-2)
表24 SDT-NK066、SDT-NK078和UTD-NK对SKOV-3的杀伤率统计表(添加IL-2)
表25 SDT-NK066、SDT-NK078和UTD-NK对PANC-1的杀伤率统计表(不添加IL-2)
图38至图43，表19至表24的结果显示，当CAR-NK细胞的培养基包含细胞因子IL-2时，在相同效靶比下，含有tmbIL-15结构的SDT-NK078对6种癌细胞的杀伤能力显著高于不含有tmbIL-15结构的SDT-NK066。表明tmbIL-15结构能够显著提高CAR-NK对实体瘤靶细胞的杀伤能力。
图44、表25的结果显示：当CAR-NK细胞的培养基不包含细胞因子IL-2时，含有tmbIL-15结构的SDT-NK078对人胰腺癌细胞（PANC-1）杀伤能力仍显著高于不含有tmbIL-15结构的对照组SDT-NK066。表明含tmbIL-15结构的CAR-NK细胞可以在没有IL-2的条件仍保持非常强的体外杀伤功能。
3.3 细胞因子释放检测：
3.3.1实验方法
将制备好的SDT-NK066、SDT-NK078细胞、UTD-NK细胞分别在培养基为KBM581+10%FBS+500 IU/mL IL-2或KBM581+10%FBS中进行培养7天后作为效应细胞。
分别将两种癌细胞，即人胰腺癌细胞（PANC-1）、人肝癌细胞（Huh-7）作为靶细胞。
将1.0×105效应细胞与1.0×105靶细胞共孵育18 h，离心收集上清进行细胞因子检测；具体实验步骤参考IFN-γ（ACRO CRS-A017）/TNF-α(ACRO CRS-A002)因子检测试剂盒说明书：
3.3.2 实验结果
表26 IFN-γ释放量统计表（添加IL-2）
表27 TNF-α释放量统计表（添加IL-2）
表28 IFN-γ释放量统计表（不添加IL-2）
表29 TNF-α释放量统计表（不添加IL-2）
图45至图48、表26、表27的结果显示，培养基中添加有IL-2，与靶细胞共培养后，含有tmbIL-15结构的SDT-NK078释放出的IFN-γ和TNF-α量均显著高于不含有tmbIL-15结构的对照组SDT-NK066。表明tmbIL-15结构能够增强CAR-NK细胞杀伤因子的释放。
图49、图50、表28、表29的结果显示，培养基中没有添加有IL-2，与靶细胞共培养后，含有tmbIL-15结构的SDT-NK078释放出的IFN-γ和TNF-α量均显著高于不含有tmbIL-15结构的对照组SDT-NK066。表明tmbIL-15结构在没有IL-2的刺激下仍能够增强CAR-NK细胞杀伤因子的释放。
3.4 CD107a检测
3.4.1实验方法
将制备好的SDT-NK066、SDT-NK078细胞、UTD-NK细胞作为效应细胞。
将人胰腺癌细胞（PANC-1）作为靶细胞。
将效应细胞 100 μL（1.0×105），靶细胞100 μL（1.0×105），加入96孔板；
加入2 μL PE anti-human CD107a (LAMP-1) Antibody(BioLenged，328608)，37℃孵育1 h；
将2 μL GolgiStop™ Protein Transport Inhibitor（BD，554724）加入3mL完全培养基中，取20 μL加入细胞中混匀，孵育2.5 h-3 h后，加入0.5 μL APC anti-human CD56(NCAM) Antibody（Biolegend，362504），37℃孵育30 min，FACS buffer清洗一遍，进行上机检测CD107a的表达。
（2）实验结果
图51的结果显示，与靶细胞共培养后，含有tmbIL-15结构的SDT-NK078、相对于不含有tmbIL-15结构的对照组SDT-NK06，能够释放大量的CD107a。
3.5 tmbIL-15-CD276 VHH-CAR-NK长期杀伤实验
3.5.1 实验方法：
将制备好的SDT-NK066、SDT-NK078细胞、UTD-NK细胞分别在培养基为KBM581+10%FBS中进行培养6天后作为效应细胞。
将PANC-1细胞作为靶细胞。
靶细胞的接种量为1.0×105，按照效靶比1：5，将效应细胞与靶细胞共培养2天后，半换液，补充靶细胞(2.0×105)，继续共培养2~3天，分别在共培养后第0天，第4天、第6天检测CAR+变化以及第6天收集细胞培养上清检测细胞因子IFN-γ和TNF-α的释放情况。
3.5.2实验结果：
表30 与PANC-1共培养后CAR+比例统计表
表31 IFN-γ释放量统计表
表32 TNF-α释放量统计表
图52，表30的结果显示，随着靶细胞的反复刺激，含有tmbIL-15结构的SDT-NK078的CAR+比例持续升高，不含有tmbIL-15结构的对照组SDT-NK066 CAR-NK细胞的CAR+比例持续下降。表明在NK杀伤肿瘤细胞的过程中，tmbIL-15结构能够长期促进CAR-NK细胞的克隆性增殖。
图53、图54，表31，表32的结果显示，经过靶细胞的反复刺激，含有tmbIL-15结构的SDT-NK078释放出的IFN-γ和TNF-α量均显著高于不含有tmbIL-15结构的对照组SDT-NK066。表明tmbIL-15结构能够长期增强CAR-NK细胞杀伤因子的释放。
3.6 tmbIL-15-CD276 VHH-CAR-NK细胞杀伤表型的检测
3.6.1实验方法
将制备好的SDT-NK066、SDT-NK078细胞、UTD-NK细胞按照2.8的方法检测NKp30、NKp44、NKG2D、CD56、CD16的表达；
3.6.2实验结果
图55至图58的结果显示，含有tmbIL-15结构的SDT-NK078相比不含有tmbIL-15结构的对照组SDT-NK066，其NKp30、NKp44和NKG2D等NK激活受体随着培养时间的延长表达逐渐增加；同时CD56+CD16+双阳的NK表型增加的趋势更明显，预示着NK的成熟度增加。表明在肿瘤细胞的持续刺激过程中，tmbIL-15结构能够促进对CAR-NK细胞杀伤受体的表达，从而促进CAR-NK细胞的激活和成熟。
3.7 tmbIL-15-CD276 VHH-CAR-NK对动物体内肿瘤的影响
1. 实验方法：
肿瘤动物模型选择重度免疫缺陷小鼠NCG模型，肿瘤细胞选择胰腺癌细胞PANC-1luc，进行尾静脉荷瘤，荷瘤剂量为1.0×106细胞/只,荷瘤后在D14天CAR-NK单次给药,tmbIL15 CD276-CAR-NK(SDT-NK078)设置两个剂量组，1.0×106 CAR-NK/只和2.0×106CAR-NK/只，CD276 CAR-NK (SDT-NK066)样品按2.0×106 CAR-NK/只剂量给药，同时设置对照组UTD-NK细胞。所有实验样品均来自从妙顺生物购买的PBMC经磁珠分选获得NK细胞，NK细胞病毒感染后获得CAR-NK样品。给药后通过活体成像定期检测肿瘤负荷的变化，同时观察小鼠体重变化。在D25、D32、D39和D46分别采集小鼠眼眶外周血，通过流式检测NK细胞在其中的比例变化
2. 实验结果：
（1）活体成像结果
表33 tmbIL-15-CD276 VHH-CAR-NK对胰腺癌细胞PANC-1 luc的抑制作用的统计学分析
表33、图59、图60的结果显示，相比对照组NK组，SDT-NK078细胞组的两个剂量组均具有显著的抑瘤效果。
（2）NK细胞在小鼠体内的持久性观察。
表34 CD276 VHH-CAR-NK细胞在小鼠体内的持久性观察
“-” 表示小鼠死亡；
表35 CD276 VHH-CAR-NK细胞在小鼠体内的持久性观察的统计学分析
表34、表35、图61的结果显示，SDT-NK078组的两个剂量组均具有较高的存活比例，而NK组和SDT-NK066组几乎检测不到，表明tmbIL-15装甲的 CD276 VHH-CAR-NK在体内具有显著的持久存活能力。
实施例4 tmbIL-15结构对CD19-CAR-NK功能的影响
4.1 tmbIL-15-CD19 VHH-CAR-NK短期杀伤实验
4.1.1实验方法
CAR-NK细胞的制备：按照1.1的方法制备SDT-NK079与SDT-NK004细胞，其中核心质粒上的CAR结构见表3。以没有进行转导的NK细胞（UTD-NK）作为对照组。
表36 核心质粒CAR结构3组
FMC63为抗CD19单链抗体，抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.34所示：
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS
FMC63的核苷酸序列如SEQ ID NO.35所示：
gacatccagatgacccagacgaccagctccctctcggcatccctgggggatcgcgtgactatttcatgccgggcttcccaggacatctctaagtacctcaactggtaccagcagaagcccgacggcaccgtgaaactgctgatctaccataccagccgtcttcacagcggtgtcccttccaggttttcaggatcggggtcgggcaccgactactctctgaccatctccaacctggagcaggaggacatcgcgacctatttctgtcaacagggcaacacgttgccctacaccttcggcggcgggaccaagctggagatcaccggcggaggcggttcgggaggcggaggctctggcggtggcggctctgaggtgaagctgcaggagagcgggcctgggctggtggctccctctcagagcctgtccgtcacctgcacagtgtctggcgtgtctctgccggactacggcgttagttggattcgccagccaccgcgcaagggcctggaatggctaggtgtaatctggggctccgagaccacctactacaactccgccctcaaatcgcgccttactatcatcaaggacaactccaaatcacaggtgttcctgaagatgaatagcttgcagactgatgacaccgccatttactactgtgccaagcactactattacggtggtagctacgcgatggattattggggccagggtactagtgtcacagtgtcctcc
选取表达CD19的人淋巴瘤细胞系（Raji）作为靶细胞。
将制备好的SDT-NK079、SDT-NK004细胞、UTD-NK细胞分别在培养基为KBM581+10%FBS+500 IU/mL IL-2或KBM581+10%FBS中进行培养7天后作为效应细胞。
按照1.3的方法进行短期杀伤实验。
4.1.2 实验结果
表37 SDT-NK004、SDT-NK079和UTD-NK对RAJI的杀伤率统计表(添加IL-2)
表38 SDT-NK004、SDT-NK079和UTD-NK对RAJI的杀伤率统计表(不添加IL-2)
图62，表37的结果显示，当CAR-NK细胞的培养基包含细胞因子IL-2时，在相同效靶比下，含有tmbIL-15结构的SDT-NK079对Raji细胞的杀伤能力显著高于不含有tmbIL-15结构的SDT-NK004。表明tmbIL-15结构能够显著提高CAR-NK对实体瘤靶细胞的杀伤能力。
图63，表38的结果显示，当CAR-NK细胞的培养基不包含细胞因子IL-2时，含有tmbIL-15结构的SDT-NK079对人胰腺癌细胞（PANC-1）杀伤能力仍显著高于不含有tmbIL-15结构的对照组SDT-NK004。表明含tmbIL-15结构的 CAR-NK细胞可以在没有IL-2的条件仍保持非常强的体外杀伤功能。
4.2细胞因子释放检测：
4.2.1实验方法
将制备好的SDT-NK079、SDT-NK004细胞、UTD-NK细胞分别在培养基为KBM581+10%FBS+500 IU/mL IL-2或KBM581+10%FBS中进行培养7天后作为效应细胞。
将人淋巴瘤细胞系（Raji）作为靶细胞。
将1.0×105 效应细胞与1.0×105靶细胞共孵育18h，离心收集上清进行细胞因子检测；具体实验步骤参考IFN-γ（ACRO CRS-A017）/TNF-α(ACRO CRS-A002)因子检测试剂盒说明书：
4.2.2实验结果
表39 IFN-γ释放量统计表（添加IL-2）
表40 TNF-α释放量统计表（添加IL-2）
表41 IFN-γ释放量统计表（不添加IL-2）
表42 TNF-α释放量统计表（不添加IL-2）
图64、图65、表39，表40的结果显示，培养基中添加有IL-2，与靶细胞共培养后，含有tmbIL-15结构的SDT-NK079释放出的IFN-γ和TNF-α量均显著高于不含有tmbIL-15结构的对照组SDT-NK004。表明tmbIL-15结构能够增强CAR-NK细胞杀伤因子的释放。
图66、图67，表41，表42的结果显示，培养基中没有添加有IL-2，与靶细胞共培养后，含有tmbIL-15结构的SDT-NK079释放出的IFN-γ和TNF-α量均显著高于不含有tmbIL-15结构的对照组SDT-NK004。表明tmbIL-15结构在没有IL-2的刺激下仍能够增强CAR-NK细胞杀伤因子的释放。
4.3 CD107a检测
4.3.1实验方法
将制备好的SDT-NK079、SDT-NK004细胞、UTD-NK细胞作为效应细胞，将人淋巴瘤细胞（Raji）作为靶细胞。
按照3.4.1的方法检测CD107a的表达。
4.3.2实验结果
图68的结果显示，与靶细胞共培养后，含有tmbIL-15结构的SDT-NK079相对于不含有tmbIL-15结构的对照组SDT-NK004，能够释放大量的CD107a。
4.4 tmbIL-15-CD276 VHH-CAR-NK长期杀伤实验
4.4.1 实验方法：
将制备好的SDT-NK066、SDT-NK078细胞、UTD-NK细胞分别在培养基为KBM581+10%FBS中进行培养6天后作为效应细胞。
将Raji细胞作为靶细胞。
按照3.5.4的实验方法CAR+变化以及细胞因子IFN-γ和TNF-α的释放情况。
4.4.2实验结果：
图69的结果显示，随着靶细胞的反复刺激，含有tmbIL-15结构的SDT-NK079的CAR+比例持续升高，不含有tmbIL-15结构的对照组SDT-NK004 CAR-NK细胞的CAR+比例持续下降。表明在NK杀伤肿瘤细胞的过程中，tmbIL-15结构能够长期促进CAR-NK细胞的克隆性增殖。
图70、图71的结果显示，经过靶细胞的反复刺激，含有tmbIL-15结构的SDT-NK079释放出的IFN-γ和TNF-α量均显著高于不含有tmbIL-15结构的对照组SDT-NK004。表明tmbIL-15结构能够长期增强CAR-NK细胞杀伤因子的释放。
3.5 tmbIL-15-CD276 VHH-CAR-NK细胞杀伤表型的检测
3.5.1实验方法
将制备好的SDT-NK079、SDT-NK004细胞、UTD-NK细胞按照2.8的方法检测NKp30、NKp44、NKG2D、CD56、CD16的表达；
3.5.2实验结果
图72至图75的结果显示，含有tmbIL-15结构的SDT-NK079相比不含有tmbIL-15结构的对照组SDT-NK004，其NKp30、NKp44和NKG2D等NK激活受体随着培养时间的延长表达逐渐增加；同时CD56+CD16+双阳的NK表型增加的趋势更明显，预示着NK的成熟度增加。表明在肿瘤细胞的持续刺激过程中，tmbIL-15结构能够促进对CAR-NK细胞杀伤受体的表达，从而促进CAR-NK细胞的激活和成熟。
以上实施例的结果显示，tmbIL-15结构能够显著促进CAR-NK细胞的存活和增殖，对多种实体肿瘤细胞和血液肿瘤细胞具有显著的体外杀伤和杀伤因子释放。另外在无IL-2的培养基长期处理条件下，tmbIL-15能够显著维持NK细胞的功能和增殖，不受IL-2的影响。在肿瘤细胞反复刺激的长期杀伤实验中，tmbIL-15装甲的CAR-NK仍然能够保持较高的CAR+维持和克隆性增殖，且表现出较高的杀伤因子释放和杀伤受体表达。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (19)

1.IL-15跨膜融合蛋白，其特征在于，包括：IL-15编码区、铰链区和截短的2B4受体；所述截短的2B4受体具有如SEQ ID NO.23所示的氨基酸序列；
所述IL-15编码区具有如SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列；
所述铰链区包括CD28 hinge；所述CD28 hinge具有如SEQ ID NO.13所示的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的IL-15跨膜融合蛋白，其特征在于，所述IL-15跨膜融合蛋白具有如SEQ ID NO.31所示的氨基酸序列。
3.融合蛋白，其特征在于，包括如权利要求1或2所述的IL-15跨膜融合蛋白，还包括信号肽、抗原结合域、铰链&跨膜区、信号传导区或剪切肽中的一种或多种；
所述信号肽选自CD8a SP；
所述抗原结合域选自CD276 scFV、CD276 VHH或FMC63；
所述铰链&跨膜区选自CD8a hinge&TM；
所述信号传导区选自BBz；
所述剪切肽选自P2A。
4.如权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述信号肽CD8a SP的氨基酸序列如SEQID NO.1所示；
所述CD276 scFV的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示、所述CD276 VHH的氨基酸序列如SEQ ID NO.32所示或所述FMC63的氨基酸序列如SEQ ID NO.34所示；
所述铰链&跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；
所述信号传导区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；
所述剪切肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。
5.编码如权利要求1或2所述IL-15跨膜融合蛋白，或编码如权利要求3或4所述融合蛋白的核酸分子。
6.表达载体，其特征在于，包括如权利要求5所述的核酸分子。
7.病毒颗粒，其特征在于，包括如权利要求6所述的表达载体。
8.宿主，其特征在于，包括如下任意项：
（I）、表达如权利要求1或2所述的IL-15跨膜融合蛋白；或
（II）、表达如权利要求3或4所述的融合蛋白；或
（III）、转染如权利要求6所述的表达载体；或
（IV）、转导如权利要求7所述的病毒颗粒。
9.如权利要求8所述的宿主，其特征在于，所述宿主包括NK细胞、NKT细胞、T细胞或诱导生成的NK细胞、NKT细胞、T细胞。
10.如下任意项在制备维持免疫细胞的活性、促进免疫细胞的存活或增殖、制备增强肿瘤杀伤功能的免疫细胞的药物中的应用：
（I）、如权利要求1或2所述的IL-15跨膜融合蛋白；或
（II）、如权利要求3或4所述的融合蛋白；或
（III）、如权利要求6所述的表达载体；或
（IV）、如权利要求7所述的病毒颗粒；或
（V）、如权利要求8或9所述的宿主。
11.如权利要求10所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括血液瘤和/或实体瘤。
12.如权利要求11所述的应用，其特征在于，所述实体瘤表达CD276；所述实体瘤包括卵巢癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、头颈癌、肾癌、子宫颈癌、乳腺癌、结直肠癌、神经母细胞瘤、垂体瘤、食管癌、口腔癌、胃癌、胰腺癌、子宫内膜癌、皮肤癌、骨髓瘤、膀胱癌、骨肉瘤或神经胶质瘤中的一种或多种。
13.如权利要求11所述的应用，其特征在于，所述血液瘤表达CD19；所述血液瘤包括淋巴瘤或B细胞白血病。
14.如权利要求10所述的应用，其特征在于，所述增强肿瘤杀伤功能包括提高靶细胞的杀伤力和/或促进杀伤因子释放；
所述杀伤因子包括IFN-γ或TNF-α。
15.如下任意项在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用：
（I）、如权利要求1或2所述的IL-15跨膜融合蛋白；或
（II）、如权利要求3或4所述的融合蛋白；或
（III）、如权利要求6所述的表达载体；或
（IV）、如权利要求7所述的病毒颗粒；或
（V）、如权利要求8或9所述的宿主。
16.如权利要求15所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括血液瘤和/或实体瘤。
17.如权利要求16所述的应用，其特征在于，所述实体瘤表达CD276；所述实体瘤包括卵巢癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、头颈癌、肾癌、子宫颈癌、乳腺癌、结直肠癌、神经母细胞瘤、垂体瘤、食管癌、口腔癌、胃癌、胰腺癌、子宫内膜癌、皮肤癌、骨髓瘤、膀胱癌、骨肉瘤或神经胶质瘤中的一种或多种。
18.如权利要求16所述的应用，其特征在于，所述血液瘤表达CD19；所述血液瘤包括淋巴瘤或B细胞白血病。
19.药物/药物组合，其特征在于，所述药物以如下任意项为原料，以及药学上可接受的辅料或助剂：
（I）、如权利要求1或2所述的IL-15跨膜融合蛋白；或
（II）、如权利要求3或4所述的融合蛋白；或
（III）、如权利要求6所述的表达载体；或
（IV）、如权利要求7所述的病毒颗粒；或
（V）、如权利要求8或9所述的宿主；
所述药物组合包括所述药物以及其他任意有效成分。
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