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CN120898001A - 重组人2Ig-B7-H3蛋白编码基因、重组载体、宿主细胞、药物组合物及其应用 - Google Patents

重组人2Ig-B7-H3蛋白编码基因、重组载体、宿主细胞、药物组合物及其应用

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CN120898001A
CN120898001A CN202380090952.4A CN202380090952A CN120898001A CN 120898001 A CN120898001 A CN 120898001A CN 202380090952 A CN202380090952 A CN 202380090952A CN 120898001 A CN120898001 A CN 120898001A
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CN
China
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vector
protein
gene
recombinant
cells
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Pending
Application number
CN202380090952.4A
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English (en)
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黄海东
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Renyousheng Gene Technology Co ltd
Original Assignee
Shanghai Renyousheng Gene Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Renyousheng Gene Technology Co ltd filed Critical Shanghai Renyousheng Gene Technology Co ltd
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Pending legal-status Critical Current

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Abstract

一种重组人2Ig‑B7‑H3蛋白编码基因、重组载体、宿主细胞、药物组合物及其应用。该重组人2Ig‑B7‑H3蛋白编码基因包含长度为3095bp的核苷酸序列，其中第1722位的碱基C定点替换为T。慢病毒载体包装的重组人2Ig‑B7‑H3蛋白编码基因与慢病毒载体包装的野生型人2Ig‑B7‑H3蛋白编码基因以一定比例组合制备的药物，在治疗或预防癌症方面取得了预料不到的效果。

Description

重组人2Ig-B7-H3蛋白编码基因、重组载体、宿主细胞、药物组合物及其应用 技术领域
本发明涉及基因工程领域，特别涉及一种人2Ig-B7-H3蛋白编码基因、包含其的重组载体、宿主细胞、药物组合物及应用。
背景技术
T细胞的活化需要两个不同的信号。第一信号来自TCR与抗原肽-MHC复合物相互作用，第二信号来自APC上的B7家族分子与其在T细胞上的配体CD28家族分子相结合产生的协同刺激信号，如B7-1B7-2与CD28，CTLA-4结合，该途径被称为经典的B7途径。
人B7-H3基因首先是由Chapoval等在人类树突状细胞的cDNA文库中发现的，由于其结构类似B7家族的基因，因此命名为B7Homolog 3，简称B7-H3。它是一种Ⅰ型跨膜糖蛋白，属于免疫球蛋白超家族，在氨基酸序列上与B7家族的其他成员在细胞外有20-27％的同源性。
B7-H3有着广泛的表达：在转录水平B7-H3表达于大多数组织，在蛋白水平上仅表达于少数组织如人体肝、肺、膀胱、睾丸、前列腺、乳房、胎盘和淋巴样器官等；B7-H3在基因(mRNA)水平和蛋白水平上表达的差异可能与分子的转录后调控有关。
B7-H3除了在抗原特异性的体液免疫过程中能够调控淋巴细胞增殖，是一个免疫调控分子，近年来又发现它在许多肿瘤细胞中也有着重要的临床意义：即它可能是一个肿瘤抗性的调控因子。
人B7-H3基因定位在15号染色体上，蛋白在体内有两种不同形式的剪切体：2IgB7-H3和4IgB7-H3。2IgB7-H3胞外段由IgV-IgC两个免疫球蛋白结构域组成。
现有技术中尚未报道2IgB7-H3基因的定点替换与肿瘤抗性的相关性。本申请旨在研究2IgB7-H3基因的定点替换与肿瘤抗性的相关性，从而为癌症的基因治疗提供新途径。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种人2Ig-B7-H3蛋白编码基因、重组载体、包含其的宿主细胞及药物组合物及应用，所述人2Ig-B7-H3蛋白编码基因对癌症的基因治疗提供了新的途径。
一方面，本发明提供了一种重组人2Ig-B7-H3蛋白编码基因，所述基因包含长度为3095bp的核苷酸序列，其中第1722位的碱基C定点替换为T。
优选地，所述重组人2Ig-B7-H3蛋白编码基因具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。
另一方面，本发明提供了一种重组载体，包括载体以及由所述载体包装的如上所述的重组人2Ig-B7-H3蛋白编码基因。
优选地，在目的基因为DNA的情况下，所述载体选自由慢病毒载体和腺相关病毒载体所组成的组，在目的基因为mRNA的情况下，所述载体为纳米微粒载体。
再一方面，本发明提供了一种宿主细胞，其含有如上所述的重组载体。
优选地，所述宿主细胞选自293T细胞、SHG44细胞中的一种或两种。
又一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含慢病毒载体包装的如上所述的重组人2Ig-B7-H3蛋白编码基因和慢病毒载体包装的野生型人2Ig-B7-H3蛋白编码基因，以及药学上可接受的赋形剂。
优选地，所述药物组合物中，慢病毒载体包装的重组人2Ig-B7-H3蛋白编码基因与野生型人2Ig-B7-H3蛋白编码基因的比例为1:2至2.0:1，优选为1:1.5至1.5:1，更优选为1:1.25至1.25:1，最优选为1:1。
优选地，所述药物组合物为注射液。
本发明还提供了如上所述的药物组合物在制备预防或治疗癌症的药物中的应用。
优选地，所述癌症为肝癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、小肠癌、结肠癌以及宫颈癌。
与现有技术相比，本发明提供了一种重组人2Ig-B7H3蛋白编码基因药物，其在肿瘤免疫应答过程中起着极其重要的作用，为预防和治疗癌症提供了有 利的新途径。与单独的野生型人2Ig-B7-H3蛋白编码基因相比，本发明的慢病毒载体包装的重组人2Ig-B7-H3蛋白编码基因与野生型人2Ig-B7-H3蛋白编码基因以一定比例混合，制备成药物，在治疗和预防癌症方面取得了预料不到的技术效果。
附图说明
图1示出了本申请的重组人2Ig-B7-H3蛋白编码基因的DNA序列的合成过程；
图2示出了本发明的携带重组人2Ig-B7-H3蛋白编码基因的重组2IgB7H3质粒载体；
图3A示出了APC细胞感染前的图片；
图3B示出了APC细胞感染后的图片；
图3C示出了细胞共培养前的图片；
图3D示出了细胞共培养后(24h)的图片；
图3E示出了共培养后(72h)的图片；以及
图4A-4C分别示出了导入本发明的携带重组人2Ig-B7-H3蛋白编码基因的质粒载体后，抗原呈递细胞293细胞和SHG44细胞的白介素6(IL-6)，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和γ-干扰素(IFN-γ)的分泌量。
具体实施方式
下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施例。虽然附图中显示了本公开的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。
在一种实施方式中，本发明提供了一种重组人2Ig-B7-H3蛋白编码基因，所述基因为3095bp长的核苷酸序列，其中第1722位的碱基C定点替换为T。
与野生型人2Ig-B7-H3蛋白编码基因相比，位于人2Ig-B7-H3蛋白编码基因5’端第121至124位的四个连续的T碱基缺失，和/或3’端第3036-3040位的四个连续的C碱基缺失。
优选地，所述重组人2Ig-B7-H3蛋白编码基因具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。
在一种实施方式中，本发明提供了一种重组载体，所述重组载体包括载体及其包装的目的基因，所述目的基因是上述技术方案所述的重组人2Ig-B7-H3蛋白编码基因。
优选地，所述目的基因还可以包括调控序列，例如所述一种或几种目的基因表达的启动子、终止子和增强子。所述目的基因也可以包括标记基因(例如，编码β-半乳糖苷酶、绿色荧光蛋白或其它荧光蛋白的基因)或其产物调节其它基因表达的基因。
所述目的基因除可以是DNA外，还可以是mRNA、tRNA或rRNA，还可以包括通常与转录序列相关的相关转录调控序列，例如转录终止信号、聚腺苷酸化位点和下游增强子元件。
所述载体可以是本领域常用的各种能包装目的基因的载体以及技术发展改进的可用的各种能携带目的基因的载体。所述载体例如，质粒(裸DNA)、脂质体、分子耦联体、多聚物、纳米微粒载体和病毒。
术语“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，该重组核苷酸含有可操作地连接到待表达核苷酸序列的表达控制序列。表达载体包括本领域已知的所有表达载体，包括引入重组多核苷酸中的粘粒、质粒(例如，裸露的或包含在脂质体中的质粒)、纳米微粒载体(在目的基因为mRNA的情况下)和病毒(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
在一种实施方式中，在目的基因为DNA的情况下，所述载体选自由慢病毒载体和腺相关病毒载体所组成的组，在目的基因为mRNA的情况下，所述载体为纳米微粒载体。
术语“慢病毒”属于逆转录病毒科。慢病毒能够感染分裂期细胞和非分裂期细胞。慢病毒感染后，可以将大量的遗传信息递送到宿主细胞，并长时间持续稳定地表达，同时能够随细胞分裂稳定遗传下去。因此慢病毒是导入外源基因的最有效工具之一。慢病毒的实例包括人类免疫缺陷病毒(HIV)、猴免疫缺陷病毒(SIV)、马传染性贫血(EIA)、猫免疫缺陷病毒(FIV)。
慢病毒载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久 性表达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的基因治疗效果。
优选地，本发明采用慢病毒载体。
本发明还提供了一种宿主细胞，其中，所述宿主含有本发明所述的重组载体。将含有本发明的重组人2Ig-B7-H3蛋白编码基因的重组载体转化到宿主体内，可以用于研究其与肿瘤细胞表达的关系。优选所述宿主选自大肠杆菌、293细胞和SHG44细胞中的一种或几种。
本发明的实施例公开了一种药物组合物，所述药物组合物包括慢病毒载体包装的如上所述的重组人2Ig-B7-H3蛋白编码基因和慢病毒载体包装的野生型人2Ig-B7-H3蛋白编码基因，以及药学上可接受的赋形剂。
在本发明的药物组合物中，慢病毒载体包装的重组人2Ig-B7-H3蛋白编码基因与野生型人2Ig-B7-H3蛋白编码基因的比例为1:2至2.0:1，优选为1:1.5至1.5:1，更优选为1:1.25至1.25:1，最优选为1:1。
所述药物接受的赋形剂指无毒固态、半固态或液态填充剂、稀释剂、包囊材料或其他制剂辅料，例如，包括但不限于盐水、缓冲盐液、葡萄糖、水、甘油、乙醇及其混合物。所述药物组合物适于胃肠外、舌下、脑池内、阴道内、腹膜内、直肠内、颊内或表皮给药。
胃肠外给药包括静脉内、肌内、腹膜内、胸骨内、皮下、关节内注射和输注。适于胃肠外给药的药物组合物包括无菌水溶液或非水溶液、分散液、悬浮液或乳液，以及用于在临使用前在无菌可注射溶液或分散液中配制的粉末。适宜的水性或非水性载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、甘油、丙二醇、聚乙二醇、羧甲基纤维素、植物油和可注射的有机酯如油酸乙酯。这些组合物还可以含有防腐剂、润湿剂、乳化剂、保护剂和分散剂佐剂，例如肌醇、山梨醇和蔗糖。优选加入渗透压调节剂如糖类、氯化钠、氯化钾。
表皮给药包括在皮肤、黏膜上以及在肺和眼表面给药。这样的药物组合物包括粉剂、软膏、滴剂、透皮贴剂、离子电渗疗法装置以及吸入剂等。直肠或阴道给药的组合物优选为栓剂，它可以通过将本发明的重组载体与适宜的非刺激性赋形剂如可可脂、聚乙二醇或栓剂蜡混合制备，所述赋形剂或载 体在室温为固态，在体温下为液态，因此在直肠或阴道腔内熔化并释放出活性化合物。
优选地，所述药物组合物为注射液，所述注射液包括药学上可接受的赋形剂以及选自本发明所述的重组人2Ig-B7H3蛋白编码基因和本发明所述的重组载体中的一种或几种。
本发明的实施例还提供了上述技术方案所述的药物组合物在制备预防或治疗癌症的药物中的应用。
在鼠的几种肿瘤细胞株异位表达后可以诱导肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞活化，从而延缓癌细胞的生长甚至完全消除肿瘤，转染的癌细胞株植入小鼠后，可以明显延长小鼠的生存期。
下面通过实施例来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本公开，不应视为对本公开的具体限制。
为使本领域具有普通知识的人员可了解本公开的特点及效果，以下谨就说明书及申请专利范围中提及的术语及用语进行一般性的说明及定义。
除非另有指明，否则文中使用的所有技术及科学上的字词，皆具有本领域技术人员对于本公开所了解的通常意义，当有冲突情形时，应以本说明书的定义为准。
实施例
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
重组人2Ig-B7-H3蛋白编码基因的制备
根据SEQ ID NO：2所示的重组人2Ig-B7-H3蛋白编码基因的核苷酸序列，对其进行限制性内切酶图谱分析，获得三段用于分步合成的序列，前往https://hpcwebapps.cit.nih.gov/dnaworks/网站输入序列，可以得到推荐的寡核苷酸片段合成方案，并通过商业合成公司化学合成核苷酸片段，再进行片段拼接，获得完整的基因序列，并测序验证，用于构建质粒载体。
基因序列合成用到的技术：
PCR，即聚合酶链式反应，能将少量DNA进行大量复制的技术。在容器 (通常是PCR管)中加入目标DNA、引物、酶、缓冲液、DNA合成的原材料(dNTP)并控制其温度，即可将目标DNA大量复制，从少变多。
“搭桥”PCR，基本原理同普通PCR，但并不需加入目标DNA。这项技术是为了将预先设计好的引物拼接成目标DNA。本实验完成后进行“普通”PCR，将目标DNA大量复制，从少变多。
如图1所示，将“搭桥”PCR和“普通”PCR联合使用，将多个重组2IgB7H3基因片段合成为序列。在本次质粒构建过程中，将“搭桥”PCR作为两步法合成基因序列的第一步，将“普通”PCR作为两步法合成基因序列的第二步，两步骤合称“基因合成”。
在此基础上，进行PCR扩增，进行定点重组，获得重组2IgB7H3基因片段，测序验证后，用于构建质粒载体。
合成本发明的重组人2Ig-B7-H3蛋白编码基因(以下称为“muB7H3基因”)所用的寡核苷酸片段如下：
寡核苷酸片段重叠PCR
1.第1步PCR
采用具有互补末端的寡核苷酸片段，使PCR产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，无模板扩增。
PCR反应体系
PCR反应程序
2.第2步PCR
以寡核苷酸片段融合PCR反应的产物(muB7H3-I,muB7H3-II,muB7H3-III)为模板配制反应体系，充分混匀并瞬时离心后进行PCR，得到目的片段3095。反应体系和程序详见下表。
PCR反应体系
PCR反应程序
实施例2质粒载体的构建
在pLV.CBh.WPRE载体的AgeI+EcoRII酶切位点之间插入实施例1制备的SEQ ID NO：2所示的重组人2Ig-B7-H3蛋白编码基因的核苷酸序列，得到重组质粒pLV.CBh.T1912(MUT).WPRE，如图2所示。
2.1采用LipofectamineTM2000阳离子脂质体转染试剂盒并按试剂盒说明书操作，将重组质粒pLV.CBh.T1912(MUT).WPRE导入293T细胞，得到重组细胞。
2.2将步骤1得到的重组细胞接种至含5％(体积比)新生牛血清的DMEM/F12培养基，然后在37℃、5％CO2的培养箱中培养48小时，然后收集上清液。
2.3取步骤2得到的上清液，用0.45μm滤膜过滤并收集滤液，然后调pH至7.4。
2.4将步骤3得到的滤液进行亲和层析纯化。
平衡缓冲液：含0.5M NaCl的pH7.4、0.5M的Tris-HCl缓冲液；
洗脱液：pH3.0、0.1M的Gly-HCl缓冲液。
先用平衡缓冲液洗涤3个柱体积，然后用洗脱液洗涤目标物，流速均为5mL/min。
A280nm检测紫外吸收峰。
采用收集管收集目标峰，然后将收集管中的溶液转移至透析袋中，在pH7.4、0.01M PBS缓冲液中进行透析，得到Lenti-reB7H3慢病毒原液。
实施例3药物制备
根据实施例1的方法，获得野生型人2IgB7-H3基因序列，根据实施例2的方法构建载体，包装获得携带野生型人2IgB7-H3基因序列的慢病毒颗粒，Lenti-wtB7H3慢病毒原液
3.3上述两种原液定标并调整浓度至，1E+8TU/mL，如下表1所示的颗粒数比例混合成组合型Lenti-combiB7H3原液，每种配置的原液，其终浓度均为1E+8TU/mL。
表1
将液氮冻存的人肝癌SMMC7721细胞于37.0℃水浴锅中快速解冻，细胞密度调至1X 10 7/mL，皮下接种2只BALB/c nude小鼠，每只0.2mL。待裸鼠成瘤，瘤体最小径不小于1.0cm。无菌操作，取出瘤体并分割成最大径不超过3mm的团块，皮下接种21只裸鼠。
第1组，3只，不做任何处理；
第2组，3只，吉西他滨药物对照，120mg/Kg体重；
第3组，3只，循环系统给药，尾静脉注射配置1，0.2mL，隔天5次给药；
第4组，3只，循环系统给药，尾静脉注射配置2，0.2mL，隔天5次给 药；
第5组，3只，循环系统给药，尾静脉注射配置3，0.2mL，隔天5次给药；
第6组，3只，循环系统给药，尾静脉注射配置4，0.2mL，隔天5次给药；
第7组，3只，循环系统给药，尾静脉注射配置5，0.2mL，隔天5次给药。
从第4天开始每天观察肿瘤生长情况，记录肿瘤大小，按以下公式计算肿瘤体积:V＝ab 2/2(V-体积，a-肿瘤长径，b-肿瘤短径)。各组肿瘤体积变化见下表2(均值)。
表2
表2的结果显示：
第1组，裸鼠在无药物干预情况下，27天后，瘤体体积增加了170倍；
第2组，阳性药物吉西他滨干预下，27天后，瘤体体积增加了105倍，显示阳性药物的治疗效果；
第3组，配置1(重组：野生＝1:2)，27天后，瘤体体积增加了86倍，优于阳性药物；
第4组，配置2(重组：野生＝1:2.5)，27天后，瘤体体积增加了121倍，效果欠佳；
第5组，配置3(重组：野生＝2:1)，27天后，瘤体体积增加了80倍，优于阳性药物；
第6组，配置4(重组：野生＝2.5:1)，27天后，瘤体体积增加了137倍，效果欠佳。
第7组，配置5(重组：野生＝1:1)，27天后，瘤体体积增加了18倍，优于上述所有组的药物。
由此得出结论，重组型B7H3和野生型B7H3组合物的最佳配置比例为1:1，其比例在2:1至1:2之间，均能表现出良好的治疗效果，超过上述比例，则组合物的治疗效果不佳。
实施例4细胞实验病毒感染的抗原呈递细胞(APC)与CD3或CD11B+单核细胞共培养后ELSIA检测完成)
病毒感染的APC细胞与CD3或CD11B+单核细胞共培养后ELISA检测上清中的细胞因子。
4.1实验材料
1)目的细胞：抗原呈递细胞293T细胞、SHG44细胞；培养基：DMEM+10％FBS+1％P/S+1％Gln。培养基生产公司：江苏凯基，产品编号KGM12800-500；CD11B+单核细胞培养基：1640+10％FBS+1％P/S+1％Gln。培养基生产公司：TRANSGEN BIOTECH，货号：M20301
2)FBS生产公司：Gemini，货号：9001-108
3)药物名称：CD3抗体abcam货号：ab5690母液浓度：0.2mg/ml；CD28抗体abcam货号：ab213043母液浓度：1mg/ml；LPS，母液浓度1mg/ml
4)病毒原液：
Lenti-wtB7H3
Lenti-reB7H3
Lenti-combiB7H3颗粒数比值为1:1的Lenti-wtB7H3和Lenti-reB7H3
5)检测因子：IL-2，IFN-γ(CD3+和APC细胞孵育组)；IL-6，TNF-α(CD11b+和APC孵育组)
4.2实验步骤
4.2.1细胞培养：
5％CO 2，37℃二氧化碳培养箱中培养。
4.2.2药物作用于目的细胞：
1)用胰酶消化APC细胞，计数，接入到6孔培养板中，每孔2×10 5个细胞。37℃5％CO 2培养箱培养过夜。
2)第二天按照预实验摸索好的APC细胞的MOI值(100-200)添加相应颗粒数的病毒，培养8H后换上新鲜的完全培养基，继续培养48H。
3)将APC细胞(293T和SHG44)悬液接种于48孔培养板中(10000个细胞/孔)，37℃5％CO 2培养箱培养，第二天拍照记录，然后将抗体和CD3或CD11b细胞分别加入细胞培养板，分组如下表3：
表3
i)病毒感染细胞与CD3+T细胞共孵育72小时，ELISA检测细胞因子IL-2，IFN-γ的含量变化。
备注：两株细胞，一共8组，细胞比例选取1:30，CD3和CD28的浓度为1ug/ml。
ii)病毒感染APC细胞与CD11b+单核细胞(比例为1:30)共孵育24小时，Elisa检测细胞因子IL-6，TNF-α的含量变化。
备注：两株细胞，一共8组，细胞比例为1:30，LPS浓度为2ug/ml。
5)CD11b+细胞和APC细胞共培养24小时后拍照记录收集上清；CD3处理和APC细胞共培养72小时后拍照记录收集上清。
6)收集的上清1000转离心后，去除沉淀，收集上清。
4.2.3准备试剂与收集细胞培养上清
1)收集标本；
2)标准品液配制参见说明书。
3)10×标本稀释液用蒸馏水作1:10倍稀释(示例：1ml浓稀释液+9ml 蒸馏水)。
4)洗涤液：用重蒸水1:20稀释(示例：1ml浓缩洗涤液加入19ml的重蒸水)。
4.2.4检测程序
1)加样：每孔各加入标准品或待测样品50ul，加酶标抗体工作液50ul。将反应板充分混匀后置37℃120分钟。
2)洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，向滤纸上印干。
3)每孔加入底物工作液100ul，置37℃暗处反应15分钟。
4)每孔加入100ul终止液混匀。
5)30分钟内用酶标仪在450nm处测吸光值。
4.3结果计算与判断
1)以标准品为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上作图，画出标准曲线。
2)根据样品OD值在该曲线图上查出相应样本中待测因子蛋白含量。(所有OD值都应减除空白值后再行计算)。
图3A示出了APC细胞感染前的图片；图3B示出了APC细胞感染后的图片；图3C示出了细胞共培养前的图片；图3D示出了细胞共培养后(24h)的图片；图3E示出了共培养后(72h)的图片。
表4a-4c至表6a-6c以及图4A-4C分别示出了抗原呈递细胞293细胞和SHG44细胞的白介素6(IL-6)，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和γ-干扰素(IFN-γ)的分泌量。
表4a-4b抗原呈递细胞293细胞和SHG44细胞的TNF-α分泌量
表5a-5b抗原呈递细胞293细胞和SHG44细胞的IL-6分泌量
表6a-6b抗原呈递细胞293细胞和SHG44细胞的IFN-γ分泌量
4.4结论
由以上结果可知
经由Lenti-wtB7H3，Lenti-mtB7H3，及Lenti-combiB7H3(1:1)感染293T细胞后，并且与CD3+T细胞、CD11b+单核细胞共孵育后：
Lenti-wtB7H3组相比对照组，肿瘤坏死因子(TNF-α)升高了8％；Lenti-mtB7H3组相比对照组，肿瘤坏死因子(TNF-α)升高了3％；Lenti-combiB7H3组相对照组，肿瘤坏死因子(TNF-α)升高了11％。
Lenti-wtB7H3组相比对照组，白介素6(IL-6)升高了199％；Lenti-mtB7H3组相比对照组，白介素6(IL-6)升高了194％；Lenti-combiB7H3组相对照组，白介素6(IL-6)升高了255％。
Lenti-wtB7H3组相比对照组，伽马干扰素(IFN-γ)升高了2％；Lenti-mtB7H3组相比对照组，伽马干扰素(IFN-γ)升高了44％；Lenti-combiB7H3组相对照组，伽马干扰素(IFN-γ)升高了130％。
经由Lenti-wtB7H3，Lenti-mtB7H3，及Lenti-combiB7H3(1:1)感染SHG44细胞后，并且与CD3+T细胞、CD11b+单核细胞共孵育后：
Lenti-wtB7H3组相比对照组，肿瘤坏死因子(TNF-α)降低了2％；Lenti-mtB7H3组相比对照组，肿瘤坏死因子(TNF-α)降低了4％；Lenti-combiB7H3组相对照组，肿瘤坏死因子(TNF-α)升高了5％。
Lenti-wtB7H3组相比对照组，白介素6(IL-6)升高了250％；Lenti-mtB7H3组相比对照组，白介素6(IL-6)升高了181％；Lenti-combiB7H3组相对照组，白介素6(IL-6)升高了261％。
Lenti-wtB7H3组相比对照组，伽马干扰素(IFN-γ)升高了13％；Lenti-mtB7H3组相比对照组，伽马干扰素(IFN-γ)升高了62％；Lenti-combiB7H3组相对照组，伽马干扰素(IFN-γ)升高了112％。
由于细胞实验中，是采用添加抗体的方法，令抗原呈递细胞向免疫细胞输出信号，实验体系中只存在抗原呈递细胞(293T和SHG44)和免疫细胞，没有免疫细胞攻击的靶细胞存在(肿瘤细胞)，缺少免疫系统攻击靶细胞之后形成的协同刺激作用。
因此，免疫细胞所分泌的免疫因子的强度远远无法达到在荷瘤动物和志愿者(肿瘤患者)所检测到的水平。这是因为在体内实验中，免疫系统可以定位并攻击实际存在的肿瘤细胞，协同刺激免疫因子的分泌。在实践中，动物和志愿者体内测得的免疫因子水平通常可以达到基础值的5-10倍。
特别值得注意的是，肿瘤坏死因子在细胞实验中增幅并不明显，这是因为，细胞实验体系中，没有肿瘤细胞存在，实验细胞为保护自己的存活，会抑制肿瘤坏死因子的分泌，以免本身受到肿瘤坏死因子的影响。因此细胞实验中，肿瘤坏死因子的促分泌效用受到影响。
由以上结果可知，经2lgB7-H3I的WT和MU病毒感染293T和SHG44细胞后，与CD11b+单核细胞共孵育，相比于NC，WT和MU，MU+WT组中IL-6的表达均增高，其中293T细胞中MU+WT组高于WT和MU组，SHG44细胞中WT和WT+MU组高于MU组；相比于NC，WT和MU，MU+WT组中TNF-α的表达变化不明显；与CD3+T细胞共孵育，相比于NC，WT和MU，MU+WT组中IFN-γ的表达均增高，其中MU+WT组高于WT和MU组。
实施例5动物实验
将液氮冻存的人肝癌SMMC7721细胞于37.0℃水浴锅中快速解冻，细胞密度调至1X 10 7/mL，皮下接种2只BALB/c nude小鼠，每只0.2mL。待裸鼠成瘤，瘤体最小径不小于1.0cm。无菌操作，取出瘤体并分割成最大径不超过3mm的团块，皮下接种25只裸鼠。
第一组，5只，不做任何处理；
第二组，5只，吉西他滨药物对照，120mg/Kg体重；
第三组，5只，循环系统给药，尾静脉注射野生型Lenti-wtB7H3,0.2mL，1E+8TU/mL，隔天5次给药；
第四组，5只，循环系统给药，尾静脉注射重组型Lenti-reB7H3,0.2mL，1E+8TU/mL隔天5次给药；
第五组，5只，循环系统给药，尾静脉注射组合型Lenti-combiB7H3(1：1)，0.2mL，1E+8TU/mL隔天5次给药；
从第4天开始每天观察肿瘤生长情况，记录肿瘤大小，按以下公式计算肿瘤体积:V＝ab 2/2(V-体积，a-肿瘤长径，b-肿瘤短径)。各组肿瘤体积变化见下表7(均值±标准差)。
从表7的结果可以看出，裸鼠荷瘤后，无干预组，38天后，瘤体体积增加了350倍；阳性药物吉西他滨组，38天后，瘤体体积增加了184倍，显示阳性药物的治疗效果。野生型Lenti-wtB7H3组，38天后，瘤体体积增加了223倍，与无干预组相比显示了抑制肿瘤生长的效果，重组型Lent-reB7H3组，38天后，瘤体体积增加了201倍，与无干预组相比显示了抑制肿瘤生长的效果，同时重组型Lenti-reB7H3的抑瘤效果与化药吉西他滨类似，组合型Lenti-combiB7H3组，38天后，瘤体体积仅增加了38倍，其效果远远优于化药组，野生型组和重组型组。此动物实验结果远远优于前面的细胞实验结果，原因如前面细胞实验所述。
实施例6临床试验
试验对象为胆管细胞癌患者，II期，无家族史，57岁，女性。化疗不耐受，特瑞普利单抗治疗后出现严重心肌炎，采用白蛋白+紫杉醇，结合吉西他滨联合用药，用药22周后肿瘤标志物升高，反应较重，CT报告显示肝脏病变明显进展，有腹水。因此，采用本发明的基因药物进行治疗。
采用本发明的Lenti-combiB7H3(1:1)制剂，静脉给药3次，每次3.0mL，1E+8TU/mL静脉滞留针推注，推注时间15秒。患者接受Lenti-combiB7H3制剂前进行了两项生化指标肿瘤坏死因子-α和γ-干扰素的检测。接受该制剂给药后12天，复测两项指标，结果如下表8所示。
表8注射Lenti-combiB7H3制剂前及注射后12天肿瘤坏死因子-α和γ-干扰素的水平
生化指标 注射前 注射后12天 升高倍数
TNF-α 0.87pg/mL 4.19pg/mL 4.8
γ-干扰素 0.27pg/mL 3.44pg/mL 12.7
患者于接受Lenti-combiB7H3(1:1)制剂注射后1个月和3个月随访的CT检查结果如下：
接受Lenti-combiB7H3(1:1)制剂1个月后，CT报告与未接受Lenti-combiB7H3(1:1)制剂的前次CT报告相比，病灶部位无明显进展。
接受Lenti-combiB7H3(1:1)制剂3个月后，CT报告显示腹水吸收，病 灶部位无明显进展。
从上述实施例6可以看出，患者接受Lenti-combiB7H3(1:1)制剂注射后，肿瘤坏死因子和γ干扰素上升显著，说明该制剂提高了患者的免疫水平，并且CT报告显示肿瘤病灶部位无明显进展，证明在Lenti-combiB7H3制剂的作用下，肿瘤生长受到抑制。
由此可见，本发明的由重组Lenti-B7H3和野生型Lenti-B7H3(1:1)制成的制剂，其抑制肿瘤生长的效果远远优于现有的化学药物及单独使用重组型Lenti-B7H3或野生型Lenti-B7H3。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (10)

  1. 一种重组人2Ig-B7H3蛋白编码基因，包含长度为3095bp的核苷酸序列，其中第1722位的碱基C定点替换为T。
  2. 根据权利要求1所述的重组人2Ig-B7-H3蛋白编码基因，其中，所述重组人2Ig-B7-H3蛋白编码基因具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。
  3. 一种重组载体，包含载体以及由所述载体包装的权利要求1或2所述的重组人2Ig-B7-H3蛋白编码基因。
  4. 根据权利要求3所述的重组载体，其中，在目的基因为DNA的情况下，所述载体选自由慢病毒载体和腺相关病毒载体所组成的组，在目的基因为mRNA的情况下，所述载体为纳米微粒载体。
  5. 一种宿主细胞，其含有权利要求1或2所述的重组载体。
  6. 根据权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞选自293T细胞、SHG44细胞中的一种或两种。
  7. 一种药物组合物，其包含慢病毒载体包装的权利要求1或2所述的重组人2Ig-B7-H3蛋白编码基因和慢病毒载体包装的野生型人2Ig-B7-H3蛋白编码基因以及药学上可接受的赋形剂。
  8. 根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中，慢病毒载体包装的重组人2Ig-B7-H3蛋白编码基因与野生型人2Ig-B7-H3蛋白编码基因的比例为1:2至2.0:1，优选为1:1.5至1.5:1，更优选为1:1.25至1.25:1，最优选为1:1。
  9. 根据权利要求7或8所述的药物组合物在制备预防或治疗癌症的药物中的应用。
  10. 根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述癌症为肝癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、小肠癌、结肠癌以及宫颈癌。
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