CN120866578A

CN120866578A - 一种提高熔解曲线稳定性的方法

Info

Publication number: CN120866578A
Application number: CN202511041701.4A
Authority: CN
Inventors: 彭盼; 张汇钎; 潘煦; 王明
Original assignee: Guangzhou City Biotron Biotechnology Co ltd
Current assignee: Guangzhou City Biotron Biotechnology Co ltd
Priority date: 2025-07-28
Filing date: 2025-07-28
Publication date: 2025-10-31

Abstract

本发明涉及分子诊断技术领域，尤其涉及一种提高熔解曲线稳定性的方法。本发明通过优化探针设计，有效避免了引物探针间错配或探针发卡结构而导致的熔解曲线不稳定的问题；同时通过进一步引入硫代修饰解决了仅通过碱基和碱基数量不能解决的熔解曲线不稳定的问题，同时通过PCR buffer等实验条件的优选，有效减少了探针被DNA聚合酶非特异剪切的概率，显著提高了熔解曲线的稳定性。

Description

一种提高熔解曲线稳定性的方法

技术领域

本发明涉及分子诊断技术领域，尤其涉及一种提高熔解曲线稳定性的方法。

背景技术

在实时荧光定量PCR(qPCR)实验中，双链DNA受热时，其互补碱基之间的氢键会逐渐断裂，导致双链分离成两条单链，这一过程称为DNA的“熔解”。总的DNA双螺旋结构降解一半的温度称为熔解温度(Tm)。随着温度的升高，DNA的荧光强度会发生变化，通过监测这种变化，绘制出的图即为DNA的熔解曲线。基于不同序列的DNA的Tm值不同的特性，分子诊断领域学者开发了多种熔解曲线分析技术。

早期的熔解曲线分析技术是通过染料法进行基因检测，染料(如SYBR Green I等)可以嵌入DNA双链中，当双链DNA逐渐解链时，染料也随之脱落，荧光信号减弱，直至双链DNA完全解链，荧光信号减弱至最低，通过监测这一信号变化过程得到熔解曲线和Tm值，并根据Tm值来鉴定基因型别。染料法特异性较差，且只能在一个通道内检测，无法满足复杂多重PCR检测需求。

近年来相关学者开发了多色熔解曲线分析技术，该技术利用荧光探针代替染料与目的基因相结合，分析探针与目的片段的解链温度，即可达到基因分型的目的。探针可选择不同波长的荧光标记，充分利用荧光PCR仪的多个通道，实现多基因多位点的并行性检测。同时，探针可以特异性识别目的基因，提高了PCR检测结果的准确性。目前已有多种多色熔解曲线分析技术。CN104245959A专利公布了一种基于探测和标记寡核苷酸切割及延伸的多色熔解曲线技术，该技术利用DNA聚合酶切割探测和标记寡核苷酸(PTO)，切割下的片段再与捕捉和模板化寡核苷酸(CTO)延伸，得到特定Tm值的二聚体，二聚体解链后信号发生变化，通过监测信号变化过程得到熔解曲线。CN117230250A专利公布了一种基于U探针和B探针的双探针组合的多色熔解曲线技术，该技术中U探针在DNA聚合酶的作用下酶切，产生游离的3端区，B探针在DNA聚合酶的作用下酶切，留下与U探针互补结合5端区，两者延伸得到特定Tm值的二聚体，二聚体解链后信号发生变化，通过监测信号变化过程得到熔解曲线。这两种技术都需要先切割探针，再延伸得到二聚体，设计上相对复杂。文献MultiplexDetection and SNP Genotyping in a Single Fluorescence Channel报道了一种多重探针扩增(Multiplex Probe Amplification，MPA)技术，该技术中THO探针与PCO探针杂交得到特定Tm值的二聚体，无阳性模板(阴性对照)时THO探针不会被剪切，二聚体解链后得到熔解峰；有阳性模板时，THO探针被剪切，无法与PCO探针杂交得到二聚体或者得到二聚体的量明显减少，无法形成熔解峰或熔解峰信号值很低；利用阳性模板与阴性对照熔解峰信号值的差异来进行分型检测。MPA技术设计简单，比较适合推广使用，但在实际应用中发现，即使无阳性模板，THO探针也可能被DNA聚合酶剪切，产生假阳性熔解峰。有鉴于此，有必要对MPA技术进行改进研究，以提高熔解曲线的稳定性，进而确保检测结果的准确性。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种提高熔解曲线稳定性的方法。

本发明提供了探针，所述探针具有如下所述特征中的至少一种：

(1)任意一条引物与所述探针存在连续6个及以上碱基配对，且所述任意一条引物与另一条任意引物存在连续6个及以上碱基配对，则所述探针具有硫代修饰；

(2)所述探针自身具有发卡结构且发夹结构的自由能(△G)低于-2.0，并且探针的3’端与任意一条引物存在连续6个及以上碱基配对，则所述探针具有硫代修饰。

进一步的，所述硫代修饰包括如下所示中的至少一种：

(1)任意一条引物与所述探针存在连续6个及以上碱基配对，且所述任意一条引物与另一条任意引物存在连续6个及以上碱基配对，则所述探针的硫代修饰包括：以探针5’端到3’端为方向，从配对碱基5^’端开始的3～5个连续碱基具有硫代修饰；

(2)所述探针自身具有发卡结构且发夹结构的自由能(△G)低于-2.0，并且探针的3’端与任意一条引物存在连续6个及以上碱基配对，则所述探针的硫代修饰包括：以探针5’端到3’端为方向，从发夹结构的3^’端开始的3～5个连续碱基具有硫代修饰。

本发明中，所述任意引物，任意一条引物或另一条任意引物，为不限定具体核苷酸序列和/或针对靶标的引物；他们可以是某一对上游/下游引物组中的上游引物或下游引物；它们用于具体的一次检测中，在与它们构成引物组的上游引物或下游引物，以及对应的探针的配合下，在同一个反应体系可完成对不同靶标的同时检测。

本发明所述的探针，其为根据上述(1)或(2)所示探针具有硫代修饰的规则设计的探针，所述规则在具体如本发明所述的实施例中进行了验证，表明：根据所述规则设计的探针可在保证检测灵敏度的情况下，保持熔解峰的稳定性。同时，本发明的设计规则也在其他具有与图2和/或图3所示情况的探针中进行了大量的尝试验证，实验结果表明，本发明所述的规则具有通用性，其可用于具有优异的检测灵敏度但出现图2和/或图3所示情况的探针的设计中，用于提高熔解峰的稳定性。

本发明的具体实施例中，所述探针是在具有最佳的检测人乳头瘤病毒检测灵敏度和准确度的引物探针组合间发现部分探针和引物之间仍存在非特异性结合配对，影响熔解峰的稳定性；所以对怎样的结合配对会造成检测熔解峰的不稳定性进行了探讨，发现：探针与扩增引物之间具有连续6个及以上碱基配对、或探针自身具有发卡结构且自身发夹结构的自由能(△G)低于-2.0时会影响扩增熔解曲线的稳定性；通过降低配对碱基数量或提高发夹结构自由能高于-2.0可以提高熔解曲线的稳定性，但会影响检测的灵敏度；所以，在此基础上，以探针为靶标进行了进一步的探究，结果发现硫代修饰和锁核酸修饰中，硫代修饰可以在维持高检测的灵敏性的同时可以保持高的熔解曲线稳定性；随后对最佳硫代修饰模式进行了大量探索(以实施例以及其他具有类似情况的探针)，发现：引物探针间形成附图2的结构，所述探针从配对碱基5^’端开始的3～5个连续碱基具有硫代修饰；或引物探针间形成附图3的结构，所述探针从配对碱基3^’端开始的3～5个连续碱基具有硫代修饰；这些模式进行修饰后的检测结果最好。

本发明中，所述探针包括探针1和/或探针2；所述探针1的核苷酸序列如SEQ IDNO.51和/或SEQ ID NO.60所示；所述探针2的核苷酸序列如SEQ ID NO.62所示。

本发明的具体实施例中，未改进前具有非特异性结合的探针的核苷酸序列如SEQID NO.15、SEQ ID NO.30或SEQ ID NO.63所示；改进后的探针的核苷酸序列分别如SEQ IDNO.51、SEQ ID NO.60或SEQ ID NO.62所示；探针经改进后，可在不影响检测的灵敏度的同时提高熔解峰的稳定性。

进一步的，本发明提供了引物探针组合，其包括本发明所述的探针和其他用于检测感染性病原体的引物探针组合；所述感染性病原体包括人乳头瘤病毒和/或星状病毒。

进一步的，其他用于检测所述人乳头瘤病毒的引物探针组合的核苷酸序列如SEQID NO.1～SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16～SEQ ID NO.29和/或SEQ ID NO.31～SEQ IDNO.45所示；其与探针1组成检测不同分型的人乳头瘤病毒的引物探针组合；

其他用于检测所述星状病毒检测的引物探针组合的核苷酸序列如SEQ ID NO.64所示。其与探针2和其他现有的用于星状病毒检测的引物探针一起组成星状病毒检测的引物探针组合。

本发明提供了组合物，其包括：

本发明所述的探针和DNA聚合酶组合物；和/或

本发明所述的引物探针组合和DNA聚合酶组合物；

所述DNA聚合酶组合物包括DNA聚合酶和稳定剂。

所述稳定剂包括糖类、表面活性剂和/或金属离子；所述糖类包括但不限于蔗糖、甘油和/海藻糖；所述表面活性剂包括但不限于吐温–20和/或吐温-80等；所述金属离子包括但不限于Mg²⁺、Ca²⁺和/或Zn²⁺等；本发明对此不作限定。

进一步的，所述DNA聚合酶包括Tth DNA聚合酶、pfu DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶和/或Vent DNA聚合酶中的至少一种；

本发明的具体实施例中，所述DNA聚合酶包括：Taq DNA聚合酶、pfu DNA聚合酶和Tth DNA聚合酶；

所述Taq DNA聚合酶、pfu DNA聚合酶和Tth DNA聚合酶的酶活力比为(2～4)：(0.05～1.5：(1～3)；具体的，所述Taq DNA聚合酶、pfu DNA聚合酶和Tth DNA聚合酶的酶活力2.5:0.1:1.5；所述甘油的浓度为1vt％～10vt％；本发明的具体实施例中，所述甘油在所述DNA聚合酶中的浓度为5vt％；

本发明的具体实施例中，所述DNA聚合酶由所述Taq DNA聚合酶、pfu DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶和50％的甘油按体积比5:1:3:1混合制备而成。混合前，所述Taq DNA聚合酶的单位活力浓度为5U/μL；所述pfu DNA聚合酶的单位活力浓度为1U/μL；所述Tth DNA聚合酶的单位活力浓度为5U/μL；

本发明的具体测试中，所述DNA聚合酶的在20μL反应体系中的用量为4U～6U。

本发明中，1个酶活力单位(U)是指在特定反应条件下(如最适pH、温度、底物饱和状态)，每分钟催化1微摩尔(μmol)底物转化(或生成1μmol产物)所需的酶量；U/μL，是指的是在特定条件下，单位体积(每微升)酶液中所含有的酶活力单位数。

本发明提供了试剂盒，其包括PCR Buffer和如下I)～III)所示中的至少一种：

I)、本发明所述的探针；

II)、本发明所述的引物探针组合；

III)、本发明所述的组合物。

进一步的，本发明所述的试剂盒中，所述PCR Buffer(PCR缓冲液)包括：MgCl₂、KCl、dNTPs、(NH₄)₂SO₄、BSA、海藻糖、DMSO、Tween-20和DTT。

更进一步的，所述PCR缓冲液包括：3mM～5mM MgCl₂、50mM～100mM KCl、150μM～300μM dNTPs、10mM～30mM(NH₄)₂SO₄、0.05mg/mL～0.15mg/mL BSA、100mM～500mM海藻糖，1vt％～3vt％DMSO、0.1vt％～0.3vt％Tween-20和1mM～5mM DTT。

本发明的具体实施例中，所述PCR缓冲液为：4mM MgCl₂、50mM KCl、200μM dNTPs、20mM(NH₄)₂SO₄、0.1mg/mL BSA、200mM海藻糖、2vt％DMSO、0.2vt％Tween-20和2mM DTT，pH为8.0～9.0之间时最优。

本发明对PCR缓冲液进行了筛选，从PCR Buffer A、PCR Buffer B和PCR Buffer C中筛选获得本发明所述的PCR Buffer(本发明的PCR缓冲液)；所述PCR缓冲液用于样品的扩增中，熔解峰稳定且扩增灵敏度高。

本发明提供了如下i)～iv)所示中的至少一种在提高熔解曲线稳定性中的应用：

i)、本发明所述的探针；

ii)、本发明所述的引物探针组合；

iii)、本发明所述的组合物；

iv)、本发明所述的试剂盒。

本发明中，所述的PCR扩增，包括高灵敏度的PCR扩增，本发明的具体实施例中，为实时定量荧光PCR扩增；具体的为多重实时定量荧光PCR扩增。

本发明提供了一种提高熔解曲线稳定性的方法，其包括利用如下A)～D)所示中的任意一种进行PCR扩增：

A)、本发明所述的探针；

B)、本发明所述的引物探针组合；

C)、本发明所述的组合物；

D)、本发明所述的试剂盒。

进一步的，本发明所述的方法包括如下步骤：

步骤1：将样本、权利要求4或5所述的引物探针组合、权利要求6～8任一项所述的组合物中的DNA聚合酶组合物和权利要求9～11任一项所述的试剂盒中的PCR缓冲液混合，获得的混合物；

步骤2：对所述混合物进行PCR扩增。

进一步的，所述PCR扩增包括：热启动、扩增和熔解；所述熔解中的退火阶段的程序为25℃～30℃，45s～75s。

所述熔解包括变性阶段、退火阶段和信号收集阶段；本发明中，所述熔解的整体程序为：95℃15s；27℃60s；70℃收集信号。

所述热启动的程序为：50℃2min；95℃3min；

所述扩增的程序为：95℃3s，60℃33s，72℃15s，39个循环；

本发明所述的方法，还包括试剂稳定性质控；所述试剂稳定性质控为将所述混合物37℃避光放置1小时后进行所述PCR扩增。

本发明所述的方法的具体方案如下：

a.采用软件设计引物探针，引物和探针长度为20～40个碱基对(bp)，引物与引物间、引物与探针间无连续6个及以上碱基配对，且探针无发卡结构或发卡结构的自由能(△G)高于-2.0；

b.若引物探针无法满足a项要求，则对探针进行硫代修饰。当任意一条引物与所述探针存在连续6个及以上碱基配对，且所述任意一条引物与另一条任意引物存在连续6个及以上碱基配对，则以所述探针的5’端到3’端为方向，从配对碱基5^’端开始，对探针进行连续3个及其以上碱基硫代修饰；或所述探针自身具有发卡结构且发夹结构的自由能(△G)低于-2.0，并且探针的3’端与任意一条引物存在连续6个及以上碱基配对，则以所述探针5’端到3’端为方向，从探针发夹结构的3^’端开始进行连续3个及其以上碱基硫代修饰。

本发明的另一目的在于提供了一种提高熔解曲线稳定性的检测方法，通过优选DNA聚合酶来降低其非特异剪切，通过搭配优化后的PCR缓冲液来进一步抑制DNA聚合酶的非特异活性，通过使用优化后的PCR扩增程序来提高熔解曲线分型特异性，具体技术方案如下：

a.采用上述引物探针设计方法设计引物探针；

b.制备DNA聚合酶，将不同的DNA聚合酶按一定比例进行混合，并通过实验验证，确定检测所需的DNA聚合酶组成和比例；对筛选到的DNA聚合酶用量进行优化，确定DNA聚合酶用量为4.1U/测试；

c.优化PCR缓冲液(PCR buffer)，对MgCl₂、KCl和dNTPs浓度进行优化，确定MgCl₂浓度为4mM，KCl浓度为50mM，dNTPs浓度为200μM；筛选添加剂并对添加剂用量进行优化，确定PCR缓冲液中添加20mM的(NH₄)₂SO₄、0.1mg/mL的牛血清白蛋白(BSA)、2vt％的二甲基亚砜(DMSO)、200mM的海藻糖、0.2vt％的Tween-20以及2mM的二硫苏糖醇(DTT)；用Tris-HCl调整PCR缓冲液的pH值为8.8；

d.优化PCR扩增程序，对熔解曲线阶段的退火温度进行优化，确定退火温度为27℃；对熔解曲线阶段的退火时间进行优化，确定退火时间为60秒。

本发明的另一目的还在于提供了一种监控熔解曲线稳定性的方法，将探针置于极端条件下来监控其稳定性，具体技术方案如下：

a.按确定的检测方法配制PCR试剂，将试剂分装到PCR八联管中，至少分装30测试，37℃避光保存1小时；

b.采用优化后的PCR扩增程序扩增试剂；

c.统计熔解曲线出现非特异熔解峰的概率。

本发明对MPA技术进行了多方面的改进设计，探针出现非特异熔解峰概率由16.67％降至0％，显著提升了熔解曲线稳定性。同时，本发明构建了一套完整的熔解曲线稳定性监控方法，有效地监控了熔解曲线的稳定性。本发明为MPA技术的临床应用提供了更可靠的技术保障。

本发明通过优化探针设计，有效避免了引物探针间错配或探针发卡结构而导致的熔解曲线不稳定的问题；同时通过进一步引入硫代修饰解决了仅通过碱基和碱基数量不能解决的熔解曲线不稳定的问题，同时通过DNA聚合酶和PCR buffer等的优化，有效减少了探针被DNA聚合酶非特异剪切的概率，显著提高了熔解曲线的稳定性。

附图说明

图1示本发明实施例1中扩增灵敏度和熔解曲线稳定性评价结果；

图2示本发明实施例1中引物探针间错配导致非特异剪切的碱基错配情况图和示意图，其中A为碱基错配情况图，B为示意图；

图3示本发明实施例1中探针发卡结构导致非特异剪切的示意图，碱基错配情况图和示意图，其中A为碱基错配情况图，B为示意图；

图4示本发明实施例2中扩增灵敏度和组1和组2的熔解曲线稳定性评价结果；

图5示本发明实施例2中组3～5的熔解曲线稳定性评价结果；

图6示本发明实施例3中扩增灵敏度和组1、组6和组7的熔解曲线稳定性评价结果；

图7示本发明实施例3中组8～11熔解曲线稳定性评价结果；

图8示本发明实施例4中扩增灵敏度和熔解曲线稳定性评价结果；

图9示本发明实施例5中扩增灵敏度和熔解曲线稳定性评价结果；

图10示本发明实施例6中扩增灵敏度和熔解曲线稳定性评价结果；

图11示本发明实施例7中扩增灵敏度评价结果；

图12示本发明实施例7中熔解曲线稳定性评价结果；

图13示本发明实施例8扩增灵敏度评价结果；

图14示本发明实施例8中熔解曲线稳定性评价结果；

图15示本发明实施例9扩增灵敏度和中熔解曲线稳定性评价结果；

图16示本发明实施例10中熔解曲线稳定性评价结果；

图17示本发明实施例12中探针发卡结构导致非特异剪切的碱基错配情况图；

图18示本发明实施例12中熔解曲线稳定性评价结果。

具体实施方式

本发明提供了一种提高熔解曲线稳定性的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

病原体(如病毒)在进化过程中表现出显著的序列同源性，不同毒株间保留有高度保守的功能性结构域(如RdRp或衣壳蛋白编码区)。然而，其固有的高变异特性使得兼具序列保守性和型别特异性的检测靶区选择面临显著挑战。目前，多重PCR技术被广泛用于同时检测多种病原体并进行分型，但病原体的高同源性和高变异特性导致即使经过优化筛选的引物探针组合仍难以完全避免非特异性结合。在MPA技术应用中，这种非特异性结合易导致非特异熔解峰的出现；而在传统PCR检测中，则表现为非特异扩增曲线。因此，当引物探针序列已为最优且无法完全规避非特异性结合时，开发有效方法防止探针的非特异性剪切至关重要。

本发明以人乳头瘤病毒(HPV)基因分型检测为例，将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。

因此，旨在本发明覆盖落入所附权利要求的范围及其等同范围中的此类修改和变化。本发明的其它对象、特征和方面公开于以下详细描述中或从中是显而易见的。本领域普通技术人员应理解本讨论仅是示例性实施方式的描述，而非意在限制本发明更广阔的方面。

本发明的一些实施例提供了一种提高熔解曲线稳定性的引物探针设计方法，其包括针对靶基因设计引物探针，所述引物探针长度为20～40bp；优选地，所述引物探针间应避免连续6个及以上碱基配对；进一步优选地，当所述引物探针间无法避开任意一条引物与所述探针存在连续6个及以上碱基配对，且所述任意一条引物与另一条任意引物存在连续6个及以上碱基配对时，需对探针进行硫代修饰或锁核酸修饰；进一步优选地，所述探针修饰方式应为硫代修饰；所述探针硫代修饰需从配对碱基的5'端开始；进一步优选地，所述硫代修饰碱基数需不低于3个。

在其中一些实施例中上述提高熔解曲线稳定性的引物探针设计方法还包括所述探针应避免发卡结构或发卡结构的自由能(△G)需高于-2.0；优选地，所述探针自身具有发卡结构且发夹结构的自由能(△G)低于-2.0，并且探针的3’端与任意一条引物存在连续6个及以上碱基配对，需对探针进行硫代修饰或锁核酸修饰；进一步优选地，所述探针修饰方式应为硫代修饰；进一步优选地，所述探针硫代修饰需从配对碱基的3'端开始；进一步优选地，所述硫代修饰碱基数需不低于3个。

本发明的一些实施例还提供了一种提高熔解曲线稳定性的检测方法，其包括使用优化后的DNA聚合酶；优选地，所述DNA聚合酶包括Tth DNA聚合酶、pfu DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶和/或Vent DNA聚合酶中的一种或多种；进一步优选地，所述DNA聚合酶应包括Taq DNA聚合酶、pfu DNA聚合酶和Tth DNA聚合酶；进一步优选地，所述DNA聚合酶由Taq DNA聚合酶、pfu DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶和50％甘油按体积比5:1:3:1混合制备而成；进一步优选地，所述DNA聚合酶在20μL反应体系中的用量为4.1U/测试。

在其中一些实施例中上述提高熔解曲线稳定性的检测方法还包括使用优化后的PCR buffer；优选地，所述PCR buffer应包括MgCl₂、KCl、dNTPs、(NH4)₂SO₄、Tris-HCl、BSA、DMSO、海藻糖、Tween-20、DTT；进一步优选地，所述PCR buffer中MgCl₂浓度为4mM，KCl浓度为50mM，dNTPs浓度为200μM，(NH4)₂SO₄浓度为20mM，BSA浓度为0.1mg/mL，DMSO浓度为2vt％，海藻糖浓度为200mM，Tween-20浓度为0.2vt％，DTT浓度为2mM，并用Tris-HCl调整PCR缓冲液的pH值为8.8。

在其中一些实施例中，上述提高熔解曲线稳定性的检测方法还包括使用优化后的PCR扩增程序；优选地，所述PCR扩增程序中熔解曲线阶段的退火温度为25℃～30℃，退火时间为45s～75s；进一步优选地，所述熔解曲线阶段的退火温度为27℃，退火时间为60s。

本发明的一些实施例还提供了一种监控熔解曲线稳定性的方法，所述监控方法为将含有探针的试剂至少分装30测试，并在20℃～40℃条件下避光放置1～4小时后进行扩增，统计熔解曲线出现非特异熔解峰的概率；优选地，所述含有探针的试剂分装后在37℃条件下避光放置1小时后进行扩增，统计熔解曲线出现非特异熔解峰的概率；进一步优选地，熔解曲线出现非特异熔解峰的概率为0时，代表熔解曲线稳定。

硫代修饰是指核酸(DNA/RNA)磷酸骨架中氧原子被硫原子取代的化学修饰，在寡核苷酸链中，磷酸基团的非桥连氧原子被硫原子取代，将磷酸二酯键修饰为硫代磷酸酯键；行业内通常用*表示硫代修饰；

锁核酸(Locked Nucleic Acid，LNA)是通过在核糖的2’氧原子和4’碳原子之间引入亚甲基桥键，形成双环结构的核苷酸衍生物，行业内通常用+表示锁核酸修饰。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：实施例1

本实施例针对15种人乳头瘤病毒(HPV)基因，设计多套引物探针，并通过大量引物探针筛选实验，确定了各自最优的引物探针序列，序列信息见表1。

表1.引物探针序列

接着，将设计的引物探针混合制备成工作液(组合1)，再与PCR buffer、DNA聚合酶和纯化水进行混合，混合体积比为2:4:1:8，按15μL/孔进行分装。

然后，依次加入15种HPV的检测限参考品各5μL，纯化水5μL(30个复孔)，并按下表2程序1进行PCR扩增。

表2.PCR扩增程序1

最后，评价扩增灵敏度和熔解曲线稳定性，评价结果见图1。

图1评价结果显示，15种HPV的检测限参考品均能准确检出，说明引物探针扩增灵敏度合格，但是HPV35型和HPV56型均出现非特异熔解峰(掉峰)，30个复孔中有5个孔出现掉峰，掉峰概率为16.67％。进一步分析非特异熔解峰产生原因，发现：

HPV35型的探针(SEQ ID NO.15)+HPV56的引物(SEQ ID NO.28)+HPV16的引物(SEQID NO.2)或HPV51型的引物(SEQ ID NO.23)会非特异结合，其中SEQ ID NO.28相当于模板序列，SEQ ID NO.15结合在SEQ ID NO.28的3^’端，SEQ ID NO.2(或SEQ ID NO.23)结合在SEQ ID NO.28的5^’端，在DNA聚合酶的作用下，SEQ ID NO.2(或SEQ ID NO.23)延伸至SEQID NO.15结合处，DNA聚合酶将SEQ ID NO.15剪切掉，产生非特异熔解峰。具体非特异剪切示意图见图2。

HPV56型的探针(SEQ ID NO.30)自身存在发卡结构，其3^，端会与HPV58引物(SEQID NO.32)非特异结合，引物在DNA聚合酶的作用下进行延伸并剪切SEQ ID NO.30，产生非特异熔解峰。具体非特异剪切示意图见图3。

实施例2

为降低非特异结合的概率，本实施例对SEQ ID NO.28的序列进行调整，减少错配碱基数。其中SEQ ID NO.46～SEQ ID NO.47减少5^，端的错配碱基数依次至5个和3个，SEQID NO.48～SEQ ID NO.49减少3^’端的错配碱基数依次至5个和3个，调整后的序列如下：

SEQ ID NO.46：gggtaatcaattatttgttactgttgaagatac；

SEQ ID NO.47：gtaatcaattatttgttactgttgaagatac；

SEQ ID NO.48：ggggtaatcaattatttgttactgtgaaga；

SEQ ID NO.49：ggggtaatcaattatttgttactgtgaa；

SEQ ID NO.28：ggggtaatcaattatttgttactgttgaagatac(对照组)；

将SEQ ID NO.46～SEQ ID NO.49分别与表1中除SEQ ID NO.28的引物探针序列进行混合，命名为组合2～5，对照组为实施例1制备的工作液(组合1)。

接着，将制备的工作液与PCR buffer、DNA聚合酶和纯化水进行混合，混合体积比为2:4:1:8，按15μL/孔进行分装。

然后，依次加入15种HPV的检测限参考品各5μL，纯化水5μL(30个复孔)，并表2程序1进行PCR扩增。

最后评价扩增灵敏度和熔解曲线稳定性，评价结果见图4和图5。

图4和图5评价结果显示，组合2～5的HPV35型未再出现非特异熔解峰(只有56型出现非特异熔解峰)，说明连续错配碱基数不高于5个时，引物探针间无法稳定形成图2的结构，探针不会被非特异剪切。但组合2～5的扩增灵敏度均出现不同程度滞后(仅展示滞后的型别的扩增曲线)，扩增Ct值由原来的27.55(组1)，依次滞后为28.46(组2)、30.59(组3)、29.19(组4)和31.53(组5)，说明调整引物序列会影响扩增灵敏度。因此，采用MPA技术进行熔解曲线分型时，在不影响扩增灵敏度的前提下，应避免引物探针间出现连续6个及以上碱基的配对。

实施例3

实施例2结果显示，当减少错配碱基时，引物的扩增灵敏度下降，说明针对HPV多重扩增体系，表1的引物探针序列已经是最优，无法避开连续6个碱基及以上配对的情况，需要对探针进行修饰，以降低探针被非特异剪切的概率。

首先，将实施例1中的HPV35(SEQ ID NO.15)的探针进行硫代修饰(用*表示)，修饰后分别得到序列SEQ ID NO.50～SEQ ID NO.55，修饰情况如下：

SEQ ID NO.50：tctgctgtgt*cttctagtgacagtac(硫代修饰是指核酸(DNA/RNA)磷酸骨架中氧原子被硫原子取代的化学修饰，t*c表示以c碱基为起始，对c碱基和t碱基连接的磷酸二酯键进行修饰)；

SEQ ID NO.51：tctgctgtgt*c*t*tctagtgacagtac；

SEQ ID NO.52：tctgctgtgt*c*t*t*c*tagtgacagtac；

SEQ ID NO.53：tctgctgtgtcttcta*gtgacagtac；

SEQ ID NO.54：tctgctgtgtcttc*t*a*gtgacagtac；

SEQ ID NO.55：tctgctgtgtct*t*c*t*a*gtgacagtac；

将SEQ ID NO.50～SEQ ID NO.55分别与表1中除SEQ ID NO.15外的引物探针序列进行混合，命名为组合6～11，对照组为实施例1的表1所示引物探针序列制备的工作液(组合1)。

最后评价扩增灵敏度和熔解曲线稳定性，评价结果见图6和图7。

图6和图7评价结果显示，组合6～11的扩增灵敏度同组合1的无明显差异(只展示HPV35的扩增曲线)，说明未改变序列的情况下，增加硫代修饰不会降低扩增灵敏度。但是，只有组合7和组合8没有出现HPV35型的非特异熔解峰(只有56型有非特异熔解峰)，剩余组合都有出现HPV35非特异熔解峰，说明当多重体系出现图2的非特异结构时，探针从错配碱基的5^’端开始连续硫代修饰3个及以上碱基时可以阻止探针被非特异剪切。

实施例4

采用硫代修饰可以阻止探针被非特异剪切，为探索更多的探针修饰方式，本实施例将修饰方式更换为锁核酸修饰(用+表示)，HPV35(SEQ ID NO.15)的探针锁核酸修饰后得到的序列如下：

SEQ ID NO.56：tctgctgtgt+c+t+tctagtgacagtac(+c+t+t表示从碱基c开始进行锁核酸修饰，锁核酸是通过在核糖的2’氧原子和4’碳原子之间引入亚甲基桥键实现)；

SEQ ID NO.57：tctgctgtgt+c+t+t+c+tagtgacagtac；

将SEQ ID NO.57～SEQ ID NO.58分别与表1中除SEQ ID NO.15外的引物探针序列进行混合，命名为组合12～13，对照组为实施例1制备的工作液(组合1)。

最后评价扩增灵敏度和熔解曲线稳定性，评价结果见图8。

图8评价结果显示，组合12～13的扩增灵敏度与组合1无明显差异，说明未改变序列的情况下，增加锁核酸修饰不会降低扩增灵敏度。但是组合12和13依然会出现HPV35型的非特异熔解峰，说明当多重体系出现图2的非特异结构时，锁核酸修饰无法阻断探针被非特异剪切。

结合实施例3可知，引物探针设计时若无法避开连续6个碱基及以上配对，需要选择硫代修饰而不是锁核酸修饰。

实施例5

为降低探针的非特异剪切，本实施例对HPV56(SEQ ID NO.30)的探针序列进行调整，依次提高探针发卡结构的自由能，调整后探针的序列和发卡结构自由能如下：

SEQ ID NO.30：actattagtactgctacagaacagttaagta(△G＝-2.24，对照组)；

SEQ ID NO.58：actattagtactgctacagaacagataagta(△G＝-1.84)；

SEQ ID NO.59：actattagtacagctacagaacagttaagta(△G＝-0.9)；

首先，将表1中的SEQ ID NO.15更换为实施例3中的SEQ ID NO.51，SEQ ID NO.30依次替换为SEQ ID NO.58～SEQ ID NO.59，与表1中其他引物探针一起混合制备成工作液，命名组合14～15，对照组为组合1。

接着，制备的工作液与PCR buffer、DNA聚合酶和纯化水进行混合，混合体积比为2:4:1:8，按15μL/孔进行分装。

最后评价扩增灵敏度和熔解曲线稳定性，评价结果见图9。

图9评价结果显示，组合14和15未再出现HPV56的非特异熔解峰，但组合14和15的扩增灵敏度均差于组合1，说明调整探针序列后虽能降低探针被非特异剪切概率，但会影响扩增灵敏度，扩增Ct值由原来的29.35(组1)，依次滞后为30.23(组14)和31.47(组合15)。因此，采用MPA技术进行熔解曲线分型时，在不影响扩增灵敏度的前提下，应避免出现发卡结构，或者发卡结构的自由能需高于-2.0。

实施例6

实施例5结果显示，当调整探针序列从而提高探针发卡结构自由能时，探针的扩增灵敏度下降，说明针对HPV多重扩增体系，表1的引物探针序列已经是最优，无法避开自由能低于-2.0的发卡结构，需要对探针进行修饰，以降低探针被非特异剪切的概率。

参考实施例3和实施例4可知，探针选择硫代修饰，且修饰碱基数不低于3个较合适。本实施例对SEQ ID NO.30的探针进行硫代修饰，修饰后分别得到序列SEQ ID NO.60～SEQ ID NO.61，修饰情况如下：

SEQ ID NO.60：actattagtactgctacagaaca*g*t*taagta；

SEQ ID NO.61：actattagt*a*c*tgctacagaacagttaagta；

首先，将表1中的SEQ ID NO.15更换为实施例3中的SEQ ID NO.51，SEQ ID NO.30依次替换为SEQ ID NO.60～SEQ ID NO.61，与表1中其他引物探针一起混合制备成工作液，命名组合16～17，对照组为组合1。

接着，将制备的工作液与PCRbuffer、DNA聚合酶和纯化水进行混合，混合体积比为2:4:1:8，按15μL/孔进行分装。

最后评价扩增灵敏度和熔解曲线稳定性，评价结果见图10。

图10评价结果显示，组合16～17的扩增灵敏度与组合1无明显差异，说明探针序列不变的情况下，硫代修饰不影响扩增灵敏度。组合16未再出现HPV56非特异熔解峰，组合17和组合1都有随机出现HPV56非特异熔解峰，说明当多重体系出现图3的结构时，探针从配对碱基的3^，端开始连续硫代修饰3个及以上碱基时可以阻止探针被非特异剪切。

实施例7

酶剪切活性会影响扩增灵敏度和熔解曲线特异性，本实施例将Tth DNA聚合酶、pfu DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶中的一种或者几种进行混合，制备得到3组酶，命名酶A、酶B和酶C。

酶A由Taq DNA聚合酶、pfu DNA聚合酶和50％的甘油按体积比5:4:1混合制备而成；

酶B由Taq DNA聚合酶、pfu DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶和50％的甘油按体积比5:2:2:1混合制备而成；

酶C由Taq DNA聚合酶、pfu DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶和50％的甘油按体积比5:1:3:1混合制备而成。

将酶A、酶B和酶C分别与实施例1的表1所示引物探针序列制备的工作液(组合1)、PCR buffer、和纯化水进行混合，混合体积比为1:2:4:8，得到三组混合液，命名组18、组19和组20。

然后15μL/孔进行分装，并依次加入15种HPV的检测限参考品各5μL，纯化水5μL(30个复孔)，并表2程序1进行PCR扩增。

最后评价扩增灵敏度和熔解曲线稳定性，评价结果见图11和图12。

图11和图12评价结果显示，扩增灵敏度最优的是组18(代表型别HPV35型扩增Ct值为28.10，HPV56型扩增Ct值为29.04)，其次是组20(代表型别HPV35型扩增Ct值为28.76，HPV56型扩增Ct值为29.78)，最差是组19(代表型别HPV35型扩增Ct值为30.05，HPV56型扩增Ct值为32.06)；熔解曲线特异性最优的是组20(无HPV35和HPV56掉峰)，其次是组19(出现一个HPV56掉峰)，最差的是组18(HPV35出现2个非特异熔解峰，HPV56出现一个非特异熔解峰)；综合考虑扩增灵敏度和熔解曲线稳定性，选择酶C较合适。

实施例8

PCR扩增时，选择合适的buffer可以有效降低酶的非特异剪切活性。本实施例针对实施例7中的酶C进行buffer组分和配比优化，具体实施步骤如下。

首先，按表3配方依次配制3组buffer，命名buffer A、buffer B、buffer C。

表3.PCR buffer优化配方

然后，取buffer A、buffer B、buffer C分别与实施例1中的表1所示引物探针序列的工作液(组合1)、酶C和纯化水进行混合，混合体积比为4:2:1:8，得到三组混合液，命名组21、组22和组23。

最后评价扩增灵敏度和熔解曲线稳定性，评价结果见图13和图14。

图13和图14评价结果显示，组21的扩增灵敏度最低(代表型别HPV35型扩增Ct值为29.46，HPV56型扩增Ct值为31.92)，组22和23扩增灵敏度相当(代表型别HPV35型扩增Ct值为28.18和28.14，HPV56型扩增Ct值为29.28和29.32)，说明buffer A的配方不利于PCR扩增；组22出现一个HPV35型掉峰，组21和组23均无掉峰，说明buffer B不利于熔解曲线稳定性；综合看酶C搭配buffer C可以确保扩增灵敏度和熔解曲线特异性同时满足要求。

实施例9

PCR扩增时，选择合适的PCR扩增程序可以有效提升熔解曲线稳定性。本实施例对熔解曲线步骤进行优化。由于扩增步骤未改变，不会影响扩增灵敏度，仅评估熔解曲线特异性。具体实施步骤如下。

取实施例8的组23的混合液，按15μL/孔进行分装，并依次加入纯化水5μL(30个复孔)。分别按表2的程序1和表4的程序2进行PCR扩增，命名组24和组25。

表4.PCR扩增程序2

最后进行熔解曲线稳定性评价，评价结果见图15。

图15评价结果显示，组24未出现非特异熔解峰，组25出现一个HPV35型非特异熔解峰，说明需要搭配合适的扩增程序(程序1)才能提高熔解曲线稳定性。

实施例10

采用MPA技术进行熔解曲线分型时，可能会存在非特异熔解峰。为确保市场使用的试剂的分型特异性，需要建立合适的监控手段。本实施例对熔解曲线稳定性监控方法进行了优化，具体实施步骤如下。

首先，根据实施例2～9的优化结果，确定引物探针组合为SEQ ID NO.1～SEQ IDNO.14、SEQ ID NO.16～SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.31～SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.51、SEQID NO.60，将引物探针混合，与酶C、buffer C和纯化水进行混合，混合体积比为2:1:4:8，按15μL/孔进行分装，共分装60孔，分为2组(组26和组27)，每组30孔，然后依次加入纯化水5μL。对照组为实施例1的组1的混合液，同样的方法进行分装，命名组28和组29。

然后，将组26和组28在37℃避光放置1小时，组27和组29在25℃避光放置4小时。

接着，将放置后的组26～组29按表2的程序1进行PCR扩增。

最后，分析检测结果，检测结果见图16。

图16检测结果显示，未改进优化的组28和组29均出现非特异熔解峰，且组28非特异熔解峰概率(10％)高于组29(3.33％)，说明37℃条件下更容易激发酶的剪切活性，如果存在非特异，更容易发现问题。改进优化后的组26和组27均无非特异熔解峰，说明两种监控条件均能达到监控效果。由于37℃避光放置1小时，温度更极端，时间更短，能够实现在极端条件下尽快发现问题的目的，本发明选择37℃避光放置1小时来监控熔解曲线稳定性。

实施例11

为验证本发明的实用价值，本实施例采用优化后的组合和优化前的组合分别检测30例HPV临床样本(涵盖试剂盒检测范围内的15种型别)，对比检测临床样本的性能。具体实施过程如下。

取SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16～SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.31～SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.51、SEQ ID NO.60进行混合，与酶C、buffer C和纯化水进行混合，混合体积比为2:1:4:8，得到的混合液命名为组30。对照组为实施例1的组1。

将组30和组1均按15μL/孔进行分装，依次加入30例临床样本，每个样本5μL。按表2的程序1进行PCR扩增。统计检测结果见表5。

表5.样本检测对比结果

评价结果显示，优化后试剂检测单重和多重HPV感染的样本，检测结果同优化前一致，且扩增Ct值无明显差异，说明优化后试剂检测灵敏度不受影响。结合实施例10可以发现，优化后试剂在极端条件下(37℃避光放置1小时)未出现非特异熔解峰，而优化前的试剂有非特异熔解峰。因此，本发明在灵敏度不改变的前提下，明显提高了熔解曲线特异性。

实施例12

多重PCR中引物探针间的错配和探针自身的发卡结构通常是难以避免的，熔解曲线非特异熔解峰比较常见。本实施例选择感染性病原体核酸检测项目来进一步说明本发明的实用价值。感染性病原体核酸检测项目同样采用MPA技术实现一管内检测11种病原体核酸，其中星状病毒核酸的熔解峰存在非特异熔解峰，采用本发明的方法对其探针进行修饰从而解决问题。具体实施过程如下。

取星状病毒核酸探针，分析探针结构，发现其探针自身存在发卡结构，且与其他病原体核酸的引物形成了图3的结构，具体的序列结构见附图17。对其探针进行修饰，修饰后得到序列SEQ ID NO.62，未修饰的序列为SEQ ID NO.63，与探针形成图3的结构的引物序列为SEQ ID NO.64，具体序列及修饰结果如下：

SEQ ID NO.62：catttggaggggaggac*c*a*a*a*gaagtgtgat；

SEQ ID NO.63：catttggaggggaggaccaaagaagtgtgat；

SEQ ID NO.64：cttttcaaaaatttttgctttcaaaatcaca；

首先，将SEQ ID NO.62、SEQ ID NO.64与其他10种病原体核酸的引物探针进行混合，得到工作液命名为组31，将SEQ ID NO.63、SEQ ID NO.64与其他10种病原体核酸的引物探针进行混合，得到工作液命名为组32(对照组)。将工作液31和工作液32分别与酶C、buffer C和纯化水进行混合，混合体积比为2:1:4:8，得到各自的混合液。

然后，将组31和组32的混合液均按15μL/孔进行分装，依次加入纯化水5μL，在37℃避光放置1小时。

接着，按表6的PCR扩增程序进行扩增。

表6.感染性腹泻病原体项目扩增程序

最后进行熔解曲线稳定性评价，评价结果见图18。

图18评价结果显示，组31未出现非特异熔解峰，组32出现一个非特异熔解峰，说明本发明的优化方法同样适用于其他多重PCR项目，本发明具备广泛的适用性。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.探针，其特征在于，具有如下所示特征中的至少一种：

2.根据权利要求1所述的探针，其特征在于，所述硫代修饰包括如下所示中的至少一种：

3.根据权利要求1或2所述的探针，其特征在于，所述探针包括探针1和/或探针2；所述探针1的核苷酸序列如SEQ ID NO.51和/或SEQ ID NO.60所示；所述探针2的核苷酸序列如SEQ ID NO.62所示。

4.引物探针组合，其特征在于，包括权利要求1～3任一项所述的探针和其他用于检测感染性病原体的引物探针组合；所述感染性病原体包括人乳头瘤病毒和/或星状病毒。

5.根据权利要求4所述的引物探针组合，其特征在于，其他用于检测所述人乳头瘤病毒的引物探针组合的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16～SEQ IDNO.29和/或SEQ ID NO.31～SEQ ID NO.45所示；

其他用于检测所述星状病毒检测的其他引物探针组合的核苷酸序列如SEQ ID NO.64所示。

6.组合物，其特征在于，包括：

权利要求1～3任一项所述的探针和DNA聚合酶组合物；和/或

权利要求4或5所述的引物探针组合和DNA聚合酶组合物；

所述DNA聚合酶组合物包括DNA聚合酶和稳定剂。

7.根据权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述DNA聚合酶包括Tth DNA聚合酶、pfuDNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶和/或Vent DNA聚合酶中的至少一种；

所述稳定剂包括甘油。

8.根据权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述DNA聚合酶组合物包括Taq DNA聚合酶、pfu DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶和甘油；所述Taq DNA聚合酶、pfu DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶的酶活力比为(2～4)：(0.05～1.5)：(1～3)。

9.试剂盒，其特征在于，包括PCR缓冲液和如下I)～III)所示中的至少一种：

I)、权利要求1～3任一项所述的探针；

II)、权利要求4或5所述的引物探针组合；

III)、权利要求6～8任一项所述的组合物。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR缓冲液包括：MgCl₂、KCl、dNTPs、(NH₄)₂SO₄、BSA、海藻糖、DMSO、Tween-20和DTT。

11.根据权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR缓冲液包括：3mM～5mM MgCl₂、50mM～100mM KCl、150μM～300μM dNTPs、10mM～30mM(NH₄)₂SO₄、0.05mg/mL～0.15mg/mLBSA、100mM～500mM海藻糖，1vt％～3vt％DMSO、0.1vt％～0.3vt％Tween-20和1mM～5mMDTT。

12.如下i)～iv)所示中的至少一种在提高熔解曲线稳定性中的应用：

i)、权利要求1～3任一项所述的探针；

ii)、权利要求4或5所述的引物探针组合；

iii)、权利要求6～8任一项所述的组合物；

iv)、权利要求9～11任一项所述的试剂盒。

13.一种提高熔解曲线稳定性的方法，其特征在于，包括利用如下A)～D)所示中的任意一种进行PCR扩增：

A)、权利要求1～3任一项所述的探针；

B)、权利要求4或5所述的引物探针组合；

C)、权利要求6～8任一项所述的组合物；

D)、权利要求9～11任一项所述的试剂盒。

14.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤2：对所述混合物进行PCR扩增。

15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增包括：热启动、扩增和熔解；所述熔解中的退火阶段的程序为25℃～30℃，45s～75s。

16.根据权利要求14或15所述的方法，其特征在于，还包括试剂稳定性质控；所述试剂稳定性质控为将所述混合物37℃避光放置1小时后进行所述PCR扩增。