CN120842348A - 一种低温响应转录因子及在调控番荔枝果实淀粉降解上的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物领域，具体涉及一种低温响应转录因子及在调控番荔枝果实淀粉降解上的应用。本发明提供了首次从番荔枝中克隆获得转录因子AaHATL，研究显示该转录因子基因定位于细胞核，在转录和蛋白水平均受低温诱导。将该基因在番茄中过表达可以显著提高果实淀粉含量，有利于提升成熟番茄果实中可溶性固形物含量，有利于提升番茄的品质。在番荔枝瞬时表达该基因，可以显著提升番荔枝果实中淀粉含量，延缓番荔枝后熟软化，延长番荔枝保存期限。本发明为番茄和番荔枝等品种的改良以及延缓淀粉贮藏型果实保质期和货架期等方面的研究提供新的候选基因。

Description

一种低温响应转录因子及在调控番荔枝果实淀粉降解上的 应用

技术领域

本发明属于生物领域，具体涉及一种低温响应转录因子及在调控番荔枝果实淀粉降解上的应用。

背景技术

番荔枝（学名：Annona squamosa Linn.）番荔枝科、番荔枝属落叶小乔木。番荔枝含丰富的维生素C，具有降血糖的功效，是最佳的抗氧化水果，能够有效延缓肌肤衰老，美白肌肤；番荔枝纤维含量较高，能有效地促进肠蠕动，排走积存在肠内的宿便。番荔枝正常生长需要温暖的气候和适当的降水，不耐霜冻和阴冷天气。普通番荔枝最适生长温度平均最高为25-32℃，平均最低为15-25℃，果实成熟最适平均温度为25-30℃。遇上低温，特别是13℃以下的低温，果实会出现生理病害，经常会出现锈斑病，推迟成熟时间。因此，温度对于番荔枝植株的生长至关重要，开展番荔枝温度相关基因的开发，以及相关基因的调控作用研究对于番荔枝新品种的选育具有重要的意义。

发明内容

本发明提供了一种低温响应转录因子及在调控番荔枝果实淀粉降解上的应用，为番荔枝品种选育提供了候选基因。

本发明的技术方案是这样实现的：

本发明的第一个方面是提供一种低温响应转录因子AaHATL，其是由核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的基因编码的蛋白质。

本发明的第二个方面是提供一种编码如本发明第一个方面所述的低温响应转录因子AaHATL的转录因子基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明的第三个方面是提供含有本发明第一个方面所述的转录因子AaHATL编码区基因的重组载体。

其中，所述重组载体原始载体可以采用基因重组领域中常用的载体，例如病毒、质粒等。本发明对此不进行限定。在本发明的一个具体实施方式中，所述原始载体采用pET30a质粒，但应当理解的是，本发明还可以采用其他质粒、或者病毒等。

优选地，所述重组载体的原始载体为pET30a质粒，所述转录因子AaHATL基因编码区位于pCAMBIA1304表达载体的NcoI和SpeI两限制性内切酶位点之间。

本发明的第四个方面是提供含有第二个方面所述的转录因子AaHATL编码区基因的宿主菌。

本发明的第五个方面是提供含有本发明第二个方面所述转录因子AaHATL编码区基因的表达盒。

本发明的第六个方面是提供如本发明第一个方面所述的转录因子AaHATL、或者如本发明第二个方面所述的转录因子基因、或者如本发明第三个方面所述的重组载体、或者本发明第四个方面所述的宿主菌、或者本发明第五个方面所述的表达盒在提高酵母在含有300 ng/mLAbA抑制浓度的SD/-Leu培养基上生长活性中的应用。

本发明的第七个方面是提供如本发明第一个方面所述的转录因子AaHATL、或者如本发明第二个方面所述的转录因子基因、或者如本发明第三个方面所述的重组载体、或者本发明第四个方面所述的宿主菌、或者本发明第五个方面所述的表达盒在提高植物果实淀粉含量中的应用。

其中过表达转录因子基因提高番茄和/或番荔枝果实淀粉含量。

本发明的第八个方面是提供如本发明第一个方面所述的转录因子AaHATL、或者如本发明第二个方面所述的转录因子基因、或者如本发明第三个方面所述的重组载体、或者本发明第四个方面所述的宿主菌、或者本发明第五个方面所述的表达盒在抑制番荔枝AaBAM3基因表达中的应用，番荔枝AaBAM3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明的第九个方面是提供如本发明第一个方面所述的转录因子AaHATL、或者如本发明第二个方面所述的转录因子基因、或者如本发明第三个方面所述的重组载体、或者本发明第四个方面所述的宿主菌、或者本发明第五个方面所述的表达盒在提高番茄果实可溶性糖含量和/或不降低番茄果实中可溶性固形物含量上的应用。

本发明的第十个方面是提供如本发明第一个方面所述的转录因子AaHATL、或者如本发明第二个方面所述的转录因子基因、或者如本发明第三个方面所述的重组载体、或者本发明第四个方面所述的宿主菌、或者本发明第五个方面所述的表达盒在延缓番荔枝后熟软化和/或延长番荔枝保存期限中的应用。

本发明的第十一个方面是提供一种引物对，所述引物对为F:CCATTCTTCTATGGGCTTCC和R: TGGCTTGAACTATGGTGGA。

本发明的有益效果：

本发明提供了首次从番荔枝中克隆获得转录因子AaHATL，研究显示该转录因子基因定位于细胞核，在转录和蛋白水平均受低温诱导，其与β-淀粉酶基因AaBAM3启动子部位直接结合，抑制AaBAM3基因的表达，抑制淀粉降解，从而提升淀粉含量。将该基因在番茄中过表达可以抑制β-淀粉酶基因的表达，显著提高果实淀粉含量，有利于提升成熟番茄果实中可溶性固形物含量，有利于提升番茄的品质。在番荔枝瞬时表达该基因，可以显著提升番荔枝果实中淀粉含量，延缓番荔枝后熟软化，延长番荔枝保存期限，可以应用于延缓果实成熟软化等品质的改良上，有利于番荔枝的贮藏和运输，也有利于延长番荔枝货架期，为番荔枝的生产销售过程中经济效益的提升提供保障。本发明为番茄和番荔枝等品种的改良以及延缓淀粉贮藏型果实保质期和货架期等方面的研究提供新的候选基因。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为不同温度贮藏期间AaHATL基因表达分析。

图2为不同温度贮藏期间AaHATL蛋白表达分析。

图3 为AaHATL蛋白在烟草叶片细胞的亚细胞定位。

图4为AaHATL与AaBAM3酵母单杂交互作验证实验

图5为AaHATL与AaBAM3启动子互作荧光素酶互补实验。

图6为番茄中异源超表达AaHAT22转基因株系基因表达量(A图和B图)、淀粉含量(C图)及可溶性固形物含量（D图）检测结果。

图7 为番荔枝果实中瞬时超表达AaHATL基因后果实淀粉含量检测结果。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

AaHATL基因的获得

（1）AaHATL克隆引物：

采集AP番荔枝(Annona atemoya Hort.) 约八成熟果实, 此时番荔枝果皮呈黄绿色, 鳞目间鳞沟展开。采后立即运回实验室, 挑选大小和色泽相近、无机械伤、无病虫害的果实，放置15℃人工气候箱处理4d，取果肉部位，参照华越洋RNA 提取试剂盒中的方法进行总RNA提取，采用TaKaRa公司PrimeScript™RT reagent Kit进行反转录，按照其说明书进行逆转录成第一链cDNA。设计克隆引物通过PCR反应扩增基因序列。

（2）PCR体系

做2个50μL体系并按照以下程序进行扩增反应:

（3）PCR 程序

（4）跑胶及测序

用1%琼脂糖凝胶电泳，5v/cm电压，20分钟，将电泳片段在紫外灯下切取出来，用PCR回收试剂盒将 PCR 扩增产物回收，产物纯化后连接 pMD-19T 载体，阳性菌液送广州艾基生物公司测序。AaHATL的CDS序列如SEQ ID NO:1所示。

实施例2

AaHATL基因功能验证

（1）AaHATL基因果实贮藏期间的表达分析

番荔枝果实放置28℃和15℃处理0d，2d，4d，6d，8d后，分析AaHATL基因在转录水平和蛋白水平的表达模式。

结果如图1和图2所示：对常温（28℃）和低温（15℃）处理0d-6d的果实中转录因子进行表达分析。发现AaHATL基因在低温下2d，4d均受到诱导表达，在2d，4d的表达低温处理高于常温。同时对AaHATL蛋白在常温（28℃）和低温（15℃）处理0d-8d的表达进行分析，同样AaHATL在15℃处理下蛋白表达水平高于28℃处理同时间段下的表达。表明在转录和蛋白水平AaHATL均在低温下被诱导表达。

方法步骤：

1）RT-qPCR分析

用华越洋RNA提取试剂盒提取果肉RNA，采用TaKaRa公司PrimeScript™RTreagent Kit with gDNA Eraser（用于定量PCR）反转录试剂盒，按照其说明书进行逆转录成第一链cDNA。

采用SYBR Green I 染料法，根据前期工作克隆得到番荔枝的管家基因 AaActin设计一对内参定量引物 qActin-F：GACACCATCCCCAGAATCC，qActin-R：CCCCAGAAGAACACCCTGT，PCR 产物扩增长度为 189 bp。定量 RT-PCR 反应体系为 2×DyNAmo color Flash SYBR Green master mix 10 μL、模板cDNA 0.5 μL，上下游引物各0.6 μL（qAaHATLF2：CCATCTTGTGAGAGGATTG；qAaHATLR2：GGTTGAAGAACTGGTGAG），dd H₂O补至20 μL。PCR 反应程序为95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，59℃20 s，72 ℃ 25 s（real time 荧光采集），40 cycles；95 ℃ 5 s，65 ℃ 1 min，97 ℃ continue，40 ℃ 30 s Melt（溶解曲线）。基因表达采用 2-^△△Ct方法计算。

2）Western blot分析

蛋白纯化及抗体制备：用 RT-PCR 方法扩增出AaHATL基因的完整编码框，将 PCR产物回收后，双酶切目的片段和 pET30a质粒，连接，构建重组表达载体，然后转化大肠杆BL21（DE3）感受态细胞，诱导蛋白表达后对重组蛋白进行纯化，之后将纯化蛋白送到专业的抗体制作公司，转到兔子中获得一抗，选择二抗山羊抗兔-HRP。

蛋白提取与Western Blot分析：分别称取果肉材料1 g，加入一定体积的提取缓冲液( 0.1 mol/LTris-HCl，25 mmol/L EDTA，pH7.5)，匀浆后，12，000 r/min离心10 min，上清液中的蛋白先定量，然后取适当体积的蛋白样品与等体积的 2×SDS 上样缓冲液混匀，100 ℃ 处理 5 min 后进行 SDS-PAGE 电泳．电泳结束后将蛋白电转移至硝酸纤维膜(NC) 上，并按照常规方法进行 Western blot。

（2）AaHATL蛋白亚细胞定位分析

利用烟草瞬时表达系统研究AaHATL蛋白的亚细胞定位，结果如图3所示，红色荧光蛋白（mKATE）在未融合其他蛋白的情况下，普遍分散在细胞中。N端融合了AaHATL蛋白的mKATE荧光信号定位于细胞核，表明AaHATL定位于细胞核。

方法步骤：

表达载体的构建与鉴定：根据AaHATL的CDS区设计引物（D5035_0S1(+): AACACGGGGGACTTTGCAACatgggcttccaagacttgtcctgc； D5035_0S1(-): CCTGAAGCGGCCGCTGTACAgcactttgtgggtgaacgattgaagg），PCR扩增后，用1%琼脂糖凝胶电泳跑胶后，切胶回收DNA（回收产物标记为：rDNAH1)，检测无误后与载体进行重组。

载体酶切、连接：pBWA(V)HS-CCDB-LK-mKATE载体（购自武汉伯远生物科技有限公司）用BsaI/Eco31I进行酶切，将载体酶切物用PCR纯化试剂盒纯化，用EasyClone Mix将rDNAH1连接到pBWA(V)HS-CCDB-LK-mKATE 载体上，将获得的连接产物转化到 DH5α 感受态细胞，经 PCR 扩增、酶切筛选和测序验证正确后，筛选阳性克隆并提取质粒，获得mKATE与目的基因的融合表达载体pBWA(V)HS-AaHATL-LK-mKATE。

烟草叶片的瞬时转化及激光共聚焦显微观察：将构建好的载体质粒电转化法转入农杆菌EHA105，30 ℃培养2 d；将农杆菌从固体接于10 mL YEB液体培养基中悬浮培养，悬浮液重悬菌体，调OD600至0.6 左右；注射烟草下表皮，弱光培养2 d，取标记的农杆菌注射的烟草叶片制作成玻片，用Nikon C2-ER激光共聚焦显微镜观察并拍照。

[pBWA(V)HS-AaHATL-LK-mKATE ]亚细胞定位载体构建流程如下：

1）合成如下目标基因扩增引物

D5035_0S1引物

D5035_0S1(+): AACACGGGGGACTTTGCAACatgggcttccaagacttgtcctgc

D5035_0S1(-): CCTGAAGCGGCCGCTGTACAgcactttgtgggtgaacgattgaagg

2）PCR体系及程序

做1个50uL体系并按照以下程序进行扩增反应:

PCR 程序

用1%琼脂糖凝胶电泳，5v/cm电压，20分钟，将AaHATL的电泳片段在紫外灯下切取出来，放在一个体系中进行溶胶回收，回收程序见具体厂家的试剂盒说明书，用总体积40uL的水溶解回收DNA（回收产物标记为：rDNAH1)，检测无误后与载体进行重组。

3）载体酶切

酶切链接体系和反应条件

将载体酶切物用PCR纯化试剂盒纯化(纯化产物标记pBWA(V)HS-CCDB-LK-mKATE(D))用于下一步的体外或者体内重组反应。

4）重组反应

将连接产物转化感受态细胞。

5）转化

将5-10uL连接产物转化大肠杆菌感受态， 转化涂Kan抗性平皿，37℃培养12小时，进行菌斑PCR鉴定。

6）菌斑PCR鉴定

挑取10个菌斑同时进行1.5mL EP管接菌和PCR鉴定，引物：pBWA(V)HS-CCDB-LK-mKATE鉴定引物 Pbw2+:GCAACGCTCTGTCATCGTTACAAT(10236bp) ；D5035(405C):caaggtcttgagctcatgcaa(3503bp).

PCR体系

做10个25uL体系的PCR反应:

PCR体系

PCR程序

目标条带为6753bp左右的片段。取1-3个阳性条带对应的菌液，取100uL送样测序，其余400uL菌液接种到含有5-10mlKan抗性LB中，试管摇菌，待测序结果出来后，对应测序正确的取一管提取质粒。

（3）AaHATL与AaBAM3酵母单杂交互作验证

通过基因合成方法，合成AaBAM3基因（核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示）启动子中预测含有冷响应顺式作用元件的区段pAaBAM3-B（其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示），长度为146bp，用ClonExpress II One Step Cloning Kit同源重组酶将pAbAi载体与pAaBAM3-B进行连接，构建诱饵载体pAbAi-BAM3-B。pGADT7-AaHATL质粒来源于单杂筛库后的阳性克隆。进一步将含pGADT7-AaHATL的质粒和pAbAi-BAM3-B的质粒共转化酵母，涂布于SD/-Leu/AbA300ng/ml平板上进行选择培养，若在平板上生长，则表明转录因子识别结合靶基因启动子序列。

结果分析：利用酵母单杂交技术，经过酵母转化将各个组合的转化产物涂布在SD/-Leu营养缺陷型培养基（缺少亮氨酸成分的SD培养基）及含有300 ng/mL 金担子系A(Aureobasidin A，也称为短梗霉素A，AbA)的SD/-Leu营养缺陷型培养基上。30 ℃培养3 d后观察酵母的生长情况。从各个板上随机挑取单菌落，稀释到不同倍数，取5 μL点于酵母缺陷型培养基（SD/-Leu）及含有300 ng/mLAbA抑制浓度的SD/-Leu培养基上，结果如图4所示。除阴性对照外，阳性对照和转录因子与AaBAM3启动子组合均可在含有300 ng/mLAbA抑制浓度的SD/-Leu培养基上正常生长，说明转录因子AaHATL与AaBAM3的启动子（其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示）存在互作。

方法步骤：

诱饵载体构建（pAbAi -pBAM3-B）

1）载体构建过程

2) 使用BstBI 或 BbsI 限制性内切酶将2 μg pBait-AbAi 重组质粒线性化，参照以下酶切体系:

3) 将1 μg 线性化 pBait-AbAi 质粒整合到Y1HGold 菌株中，涂布 SD/-Ura 平板，培养3 - 5天；

4) 挑选 4 -5个SD/-Ura板上的单克隆，使用 Matchmaker® Insert Check PCRMix 1 进行鉴定。通过电泳，确定插入条带大小是否正确，即载体是否正确整合到酵母基因组中。鉴定正确的克隆可以进行保菌。

猎物载体构建（pGADT7-AaHATL）

质粒来源于pGADT7-AaHATL，单杂筛库后的阳性克隆。

1) 挑取 PCR 鉴定阳性的克隆，接种于2 ml 液体培养基SD/-Leu中，在30°C 摇床振荡培养 2 天， 利用酵母质粒小抽试剂盒抽提酵母质粒；

2) 取 1 - 5 ml 酵母培养物，12000 rpm 离心1 min， 尽量吸除上清；

3) 向菌体中加入300 μl山梨醇缓冲液，加入50 U 溶壁酶，充分混匀，并在30°C摇床200 rpm 振荡处理1 h ；4000 rpm 离心10 min，弃去上清，收集沉淀；加入250 μl 溶液YP1；

4) 向管中加入250 μl 溶液 YP2， 温和地上下翻转6-8次使菌体充分混匀，室温放置5 - 10 min；注意：温柔混匀，不要剧烈震荡，以免污染基因组DNA ；此时菌液应变得清亮粘稠；

5) 向管中加入350 μl 溶液YP3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀；12000 rpm 离心20 min；注意：YP3加入后应立即混匀， 避免产生局部沉淀；如果上清中还 有微小白色沉淀，可再次离心后取上清；

6) 小心地将上清液加入吸附柱CP2中，12000 rpm 离心1 min，倒掉废液，将吸附柱放到收集管中；

7) 向吸附柱中加入500 μl的缓冲液PD，12000 rpm离心1 min，倒掉废液；

8) 向吸附柱中加入600 μl漂洗液 PW，12000 rpm离心1 min，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中；

9) 重复步骤8）

10) 将吸附柱放入收集管中12000 rpm空离2 min，目的是去除吸附柱中残余的漂洗液；注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应实验，建议将吸附柱开盖，室温放置数分钟；

11) 将吸附柱CP2置于一个干净的离心管中， 向吸附膜的中间部位滴加50- 100μl 洗脱缓冲液EB， 室温放置2 min 12000 rpm离心2 min将质粒溶液收集到离心管中；注意：洗脱液太少影响回收效率；洗脱液pH值低于7.0会降低洗脱效率；

12) 得到质粒预备扩增。

质粒（pGADT7-AaHATL）与质粒（ pAbAi -pBAM3-B）一对一互作验证:

1）将Y1HGold (pAbAi-BAM3-B) 酵母菌株在SD/-Ura固体培养基上划线，30°C 培养箱倒置培养 2 - 3天；

2）挑取直径2-3 mm 的单克隆于3 ml YPDA 培养液中，在30°C摇床250 rpm振荡培养8 h ；

3）吸取2-5 μl至50 ml YPDA中(250 ml三角瓶)， 在30°C 摇床230-250 rpm振荡培养16 - 20 h， 直至OD600 = 0.15 - 0.3 ；

4）室温700 g离心5 min，去除上清，用新鲜的100 ml 培养液重新悬浮菌体；在30°C摇230 -250 rpm振荡培养3-5 h，至OD600 = 0.4-0.5；

5）室温700 g离心5 min以收集菌体，倒去上清并用60 ml无菌去离子水重悬酵母；

6）室温700 g离心5min以收集菌体，倒去上清并用3 ml 1.1 x TE/LiAc溶液重悬酵母；同时将Carrier DNA预变性两次；

7）高速离心15 s， 去除上清，加入600 μl 1.1 x TE/LiAC溶液吹打均匀，备用；

8）取步骤7中酵母重悬液50 μl，在菌液中加入10 μl 预变性的Carrier DNA和200ng Prey质粒pGADT7-AaHATL，轻轻混匀；

9）加入300 μl 1 x PEG/LiAc，混匀；

10）30°C水浴30 min，每10 min摇匀一次；

11）每管加入20 μl DMSO，轻轻混匀；

12) 42°C水浴热激15 min，每5 min上下颠倒混匀一次；

13）高速离心15 s，弃上清；用1 ml YPD Plus重悬菌体，在30°C摇床250 rpm振荡复苏1 h；

14）高速离心15 s，弃上清；

15）100 μl 0.9 % NaCl；

16）30°C培养箱培养。重悬菌体，涂布于 SD/-Leu/300 ng/mL AbA平板上 3 - 5天。预计有阳性克隆长出。

（4）双荧光素酶分析(LUC实验)

将转录因子基因AaHATL构建到表达载体pGreenII-62-SK上得到[pGreenII-62-SK-AaHATL ]载体，将AaBAM3启动子（pAaBAM3-J3）构建到pGreenⅡ080-LUC载体上得到[pGreenII0800-LUC-pAaBAM3-J3（723bp）]载体，载体pGreenⅡ0800含有35S::REN和目标启动子驱动的LUC 荧光标签。pAaBAM3-J3核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。将构建成功的上述两个载体共转入到农杆菌 GV3101菌株中。挑选生长状况良好的烟草植株，用去枪头的1mL注射器从烟草叶片下表皮注射，并做好标注；将注射完成的烟草植株弱光培养2天，注射1mM荧光素，黑暗放置7min即可检测。收集注射的烟草叶片，液氮冷冻研磨，加入适量（100 μL）的1×Cell Lysis Buffer，室温静置或振摇裂解5 min，吹打并吸取细胞裂解产物至1.5 mL离心管中，12000 g常温离心2 min，取上清用于后续检测测定烟草叶片的 LUC 荧光和 REN荧光发光信号。

结果分析：从图5可以看出，AaHATL可负向调控AaBAM3启动子的活性，抑制AaBAM3的表达。

[pGreenII0800-LUC-pAaBAM3-J3（723bp）]载体构建流程如下:

1.合成如下1对引物

1:BAM3-J3引物

BAM3-J3(+):ggccccccctcgaggtcgacggtatcgatagatagccattaaccaatctaggtag

BAM3-J3(-):tatgtttttggcgtcttccatggtcccccgttttcctgagcaatgaagtaaaaat

2.PCR体系

做1个50μL体系并按照以下程序进行扩增反应：

PCR体系

PCR 程序

用1%琼脂糖凝胶电泳，5v/cm电压，20分钟，将BAM3-J3(723bp)的电泳片段在紫外灯下切取出来，放在一个体系中进行溶胶回收，回收程序见具体厂家的试剂盒说明书，用总体积40μL的水溶解回收DNA（回收产物标记为：rDNAG1)，检测无误后与载体进行重组。

3.载体酶切

酶切链接体系：

反应条件：温度37℃，时间1 h

将载体酶切物用PCR纯化试剂盒纯化(纯化产物标记为pGreenII 0800-LUC-ccdb(D)用于下一步的体外或者体内重组反应。

重组反应体系

重组反应程序：温度37℃，时间30 h

将连接产物转化感受态细胞。

转化

将5-10μL连接产物转化大肠杆菌感受态，转化涂卡纳霉素抗性平皿，37℃培养12小时，进行菌斑PCR鉴定。

6.菌斑PCR鉴定

挑取10个菌斑同时进行1.5ml EP管接菌和PCR鉴定；引物：pGreenII 0800-LUC-ccdb鉴定引物P1（F:gttgtaaaacgacggccagt），P2（R:caattgttccaggaaccagg）。

PCR体系

做10个25μL体系的PCR反应：

PCR 体系

PCR 程序

目标条带为823bp左右的片段。取1-3个阳性条带对应的菌液，取100μL送样测序，其余400μL菌液接种到含有5-10ml卡纳霉素抗性LB中，试管摇菌，待测序结果出来后，对应测序正确的取一管提取质粒。

[pGreenII-62-SK-AaHATL ]载体构建流程如下:

1.合成如下1对引物

1:HATL引物

HATL(+):cagtTTTCGCAGCATCTAACGAGCTCTTCGcaccgtagagtgacatgcggataa

HATL(-):cagtTTTCGCAGCATCTAACGAGCTCTTCGagcgggcttgaactatggtggatc

2.PCR体系

做1个50μL体系并按照以下程序进行扩增反应:

PCR体系

用1%琼脂糖凝胶电泳，5v/cm电压，20分钟，将：AaHATL(965bp)的电泳片段在紫外灯下切取出来，放在一个体系中进行溶胶回收，回收程序见具体厂家的试剂盒说明书，用总体积30μL的水溶解回收DNA（回收产物标记为：rDNAH1)，检测无误后与载体进行连接。

3.载体酶切

酶切连接体系和反应条件：

4.rDNAH1酶切

酶切连接体系和反应条件：

将载体酶切物和回收片段酶切产物合并一起用PCR纯化试剂盒纯化(纯化产物标记为P-rDNAH1)用于下一步的连接反应。

5.连接反应

DNA 连接体系和反应条件：

将连接产物转化感受态细胞。

6.转化

将5-10μL连接产物转化大肠杆菌感受态(见大肠杆菌感受态转化标准方法) ，转化涂卡纳霉素抗性平皿，37℃培养12小时，进行菌斑PCR鉴定。

7.菌斑PCR鉴定

挑取10个菌斑同时进行1.5ml EP管接菌和PCR鉴定，引物：pGreenII-62-SK-ccdb鉴定引物62sk-F（tctccactgacgtaagggat），62sk-R（caacacatgagcgaaaccc）。

PCR体系

做10个25μL体系的PCR反应:

目标条带为1065bp左右的片段。取1-3个阳性条带对应的菌液，取100μL送样测序，其余400μL菌液接种到含有卡纳霉素抗性LB中，试管摇菌，待测序结果出来后，对应测序正确的取一管提取质粒。

烟草瞬时转化方法步骤：

1、烟草培养：播种烟草种子若干，12 h光照培养，培养一个月即可用于实验；

2、农杆菌培养：将构建好的载体质粒电转化法转入农杆菌（GV3101），30℃培养2天；

3、悬浮农杆菌：用接种环将农杆菌从固体培养皿上刮下，接于10 mL YEB液体培养基中，170 rpm/min培养1 h；

4、收集菌体：4000 rpm/min，离心4 min，去上清；

5、重悬：用10 mM MgCl₂（含120 uM AS）悬浮液重悬菌体，调OD600至0.6左右；

6、注射：挑选生长状况良好的烟草植株，用去枪头的1mL注射器从烟草叶片下表皮注射，并做好标注；

7、培养：将注射完成的烟草植株弱光培养2天，注射1mM荧光素，黑暗放置7 min即可检测；

8、荧光值检测

（1）裂解细胞：将烟草叶片收集烟草叶片，液氮冷冻研磨，加入适量（100 μL）的1×Cell Lysis Buffer，室温静置或振摇裂解5 min，吹打并吸取细胞裂解产物至1.5 mL离心管中，12000 g常温离心2 min，取上清用于后续检测。

（2）Firefly luciferase反应检测：将100 μL平衡至室温的LuciferaseSubstrate加入检测管或酶标板中，小心吸取20 μL细胞裂解上清至检测管或酶标板孔中，迅速混匀后立即于荧光检测仪（Luminometer）或酶标仪中检测Firefly luciferase报告基因活性。

（3）Renilla luciferase反应检测：在以上反应液中加入100 μL新鲜配制的Renilla底物工作液，迅速混匀后立即于荧光检测仪或酶标仪中检测Renilla luciferase报告基因活性，每个检测做3个重复。

（5）番茄转基因

1）AaHATL超表达载体构建:

根据AaHATL的CDS区设计带有同源重组序列的引物（40547_0(+):aacacgggggactttgcaacatgggcttccaagacttgtcctgc；40547_0(-):gatctaccatgcactttgtgggtgaacgattgaagg），经PCR扩增，用1%琼脂糖凝胶电泳跑胶后，切胶回收DNA（回收产物标记为：rDNAHG2)，检测无误后与载体进行重组。

载体酶切、连接：pBWA(V)HS载体（pBWA(V)HS-ccdB）用BsaI/Eco31I 进行酶切，将载体酶切物用PCR纯化试剂盒纯化，用2*EasyClone Mix将rDNAHG2连接到pBWA(V)HS 载体上，将获得的连接产物转化到DH5α感受态细胞，经PCR扩增、酶切筛选和测序验证正确后，筛选阳性克隆并提取质粒，获得AaHATL与目的基因的融合表达载体pBWA(V)HS-AaHATL。

2）农杆菌介导的遗传转化：灭菌的种子均匀播种在MS固体培养基上，放置在光照培养箱内等待发芽。将预培养的子叶浸泡在MS液体培养基重悬的农杆菌菌液中共培养2d。再将子叶转移到分化固体培养基上。25℃（16 h）光照，20℃（8 h黑暗）培养。之后每三周更换一次培养基，直至形成愈伤组织。愈伤组织形成后，将其转移到生长固体培养基上诱导出芽成苗。待愈伤组织分化出生长点后，将生长点周围的愈伤组织去除干净，并将其转移到MS固体培养基进行生根筛选。

3）转基因番茄阳性苗筛选：SDS法提取基因组，将提取的基因组进行PCR鉴定，利用抗生素标记筛选出阳性植株。

（一）[pBWA(V)HS-AaHATL超表达-GUS融合]载体构建流程如下：

1. 合成如下引物

40547_0(+):aacacgggggactttgcaacatgggcttccaagacttgtcctgc

40547_0(-):gatctaccatgcactttgtgggtgaacgattgaagg

2. PCR体系

做2个50μL体系并按照以下程序进行扩增反应:

用1%琼脂糖凝胶电泳，5v/cm电压，20分钟，将：AaHATL(810bp)GUS(2053bp)的电泳片段在紫外灯下切取出来，放在一个体系中进行溶胶回收，回收程序见具体厂家的试剂盒说明书，用总体积40μL的水溶解回收DNA（回收产物标记为：rDNAHG2)，检测无误后与载体进行重组。

3. 载体酶切

酶切连接体系和反应条件

将载体酶切物用PCR纯化试剂盒纯化(纯化产物标记为pBWA(V)HS-ccdB(D))用于下一步的体外或者体内重组反应。

4. 重组反应

将连接产物转化感受态细胞。

5. 转化

将5-10μL连接产物转化大肠杆菌感受态，转化涂(卡纳霉素)抗性平皿，37℃培养12小时，进行菌斑PCR鉴定。

6. 菌斑PCR鉴定

挑取10个菌斑同时进行1.5mL EP管接菌和PCR鉴定，引物：pBWA(V)HS-ccdB鉴定引物：

HS)35seq:tTCATTTGGAGAGAACACGGGggac(2861bp)

M40547(573C):gtgagggtggctgcagga(3553bp).

PCR体系

做10个25μL体系的PCR反应:

目标条带为712bp左右的片段。取1-3个阳性条带对应的菌液，取100μL送样测序，其余400μL菌液接种到含有5-10mL(卡纳霉素)抗性LB中，试管摇菌，待测序结果出来后，对应测序正确的取一管提取质粒。

（二）农杆菌转化操作步骤如下：

1. 农杆菌准备

1.1 质粒转化

取1µL质粒加入50µL GV3101农杆菌感受态细胞中，充分混匀后吸取至电转杯中，电转后加1mL LB液体培养基，充分混匀后吸取至1.5mL离心管中，于摇床30℃、180rpm振荡培养30min，将活化好的农杆菌菌液吸取50µL接种于LB固体培养基上，30℃暗培养48h。

1.2 农杆菌检测

1.2.1 合成相应检测引物；

1.2.2 如下表所示，配制PCR扩增体系，完成配制后充分混匀，使用PCR仪进行扩增，扩增程序根据引物信 息等进行相应设置；

1.2.3 凝胶电泳检测，制备1％琼脂糖凝胶（称取1.5g琼脂糖粉末溶于150mL 1×TAE缓冲液中，微波炉加热约3分钟，至液体呈透明状态即可。在制胶板中加入EB，将溶好的琼脂糖液体倒入制胶板中，混匀，插上梳子，静置40分钟，当胶变成乳白色即可），点样，完成电泳过程。

1.2.4 PCR扩增结果查看，阳性对照及样品的电泳条带清晰、大小正确，且阴性对照均无条带的情况下，表明该样品可进入下一步骤。

2. 番茄遗传转化

2.1种子消毒

无菌水清洗2min，75%的酒精消毒40S，84消毒液清洗7min，无菌水清洗3次，无菌水浸泡1h。

2.2播种

将消毒后的番茄种子播种于萌发培养基上，先暗培养3-4d，待种子露白发芽后置于光照组培箱内生长4～5d。

2.3外植体的制备及预培养

萌发的番茄苗，待子叶完全展开，用手术刀切除子叶柄及子叶尖，留中间部分切为2～3段接种于预培养基，23±2 ℃ 预培养2～3d。

2.4农杆菌侵染及共培

挑取农杆菌于侵染液中，制备OD600= 0.1的农杆菌重悬液；侵染10～15min，将晾干的外植体接于共培培养基中，23±2 ℃暗培养2d。

2.5筛选及分化生根

将恢复培养的愈伤接种于筛选培养基，23℃、16h/8h光照/黑暗培养15-30天；筛选出的愈伤接种于分化培养基，23℃、16h/8h光照/黑暗培养30-40d。待分化的幼苗生长至2-3cm左右，将其从愈伤上切除，接种于生根培养基，23℃、16h/8h光照/黑暗培养10-15d。

2.6检测

采用CTAB法提取番茄基因组DNA，进行PCR检测。

（6）番荔枝果实瞬时转化

选取花后120天的成熟番荔枝，没有病虫害和机械损伤的‘AP’番荔枝果实摘下备用。将含有空载体和pGreenII-62-SK-AaHATL 质粒转化根癌农杆菌（GV3101-pSoup-p19菌株），涂布LB培养皿（含50 mg/L 卡那霉素 和 34 mg/L 利福平），28℃培养2天，挑选单个菌落进行PCR鉴定，挑取阳性克隆于3 mL LB培养液（含50 mg/L 卡那霉素 和 34 mg/L 利福平），28℃ 200rpm过夜，取1 mL菌液于20 ml相同培养液中，28℃ 200rpm摇菌6-8 小时，至OD600 ≈ 0.8，用等体积侵染液（10 mM MES（2-吗啉乙磺酸），10 mM MgCl₂，150 μM AS（乙酰丁香酮）重悬，28℃黑暗静置1-3小时。

用1 mL注射器注射到番荔枝果实中，每个果注射空载对照和pGreenII-62-SK-AaHATL 各5处，每处注射0.2 mL。注射5-10个果实，将果实置于28℃培养箱中放置5天，切取果肉进行淀粉含量测定。

（7）转基因番茄株系果实中AaHATL和SIBAM基因表达分析

采用“（1）AaHATL基因果实贮藏期间的表达分析”中的RT-qPCR方法分析AaHATL和SIBAM在转基因株系果实中的表达量，内参SITUA-F：ATGAGATTTGCCATCAGGG，SlTUA-R：ATTGCATGACAAGGACCG。SIBAM1-1260，SIBAM3-3650，SIBAM3-5160引物见表1。

表1引物序列

选择3个超表达转基因番茄株系（OE#1、OE#2、OE#3）和一个野生型株系（WT）为对照，对花后35d（破色期，开始转红）果实进行取样，每个株系取10个果实，进行淀粉含量和可溶性固形物含量（可溶性糖含量）测定。淀粉含量测定采用蒽酮比色法（苏州格锐思生物公司试剂盒测，货号：G0507W）。可溶性固形物含量采用手持式折光仪（便携式糖度计）直接测定。

结果如图6中的A所示，野生型番茄中无法扩增到AaHAL基因，3个转基因株系中AaHAL呈现不同程度的高表达，表明番茄中超表达AaHAL基因，表达效果良好。在番茄基因组中查找获得1个SIBAM1基因，2个SIBAM3基因，分析其在3个转基因株系果实中的表达，发现转基因株系果实中3个β-淀粉酶基因（BAM）相较野生型均有不同的抑制表达（图6中的B）。说明AaHAL基因的超表达能够抑制BAM基因的表达。

番茄果实中的淀粉含量测定结果（图6中的C）显示，三个转基因株系淀粉均显著高于野生型，而可溶性固形物含量不仅没有降低，反而有一定程度的提升（图6中的D）。说明转基因株系番茄通过抑制BAM表达，在有效提升了番茄果实中淀粉含量的同时，并没有降低番茄果实中可溶性固形物含量（可溶性糖含量）。

（8）瞬时转化番荔枝果实淀粉含量测定

如图7所示，番荔枝果实中瞬时超表达AaHATL基因后，番荔枝果实淀粉含量显著提升。

淀粉含量在果实生长发育期慢慢积累并在成熟过程中降解为可溶性糖，使果实甜度上升。果实成熟发育过程分为细胞分裂期、淀粉积累期和果实成熟期3个阶段。果实在细胞分裂期结束后开始积累淀粉，进入成熟期后淀粉开始降解，直至果实完全成熟，淀粉几乎完全转变为可溶性糖。成熟前，果实内大量的淀粉是果肉保持硬度的重要因素。淀粉对细胞起支撑作用，可维持组织整体膨压，果实采后成熟软化与淀粉的降解有关。因此在前期果实中淀粉含量的积累，更有利于果实糖含量的提高，而后期调控淀粉的降解，可以使果实保持一定的硬度，则有利于果实采后的运输与贮藏。

番茄果实成熟一般分为4个时期，绿熟期、破色期（转色期）、成熟期和完熟期。在绿熟期番茄果实内的淀粉开始降解，直至番茄果实完全成熟时，所有淀粉转化为可溶性糖。本发明中，超表达AaHATL基因可以提高番茄未完全成熟的果实中淀粉含量，而此时果实中可溶性固形物含量（可溶性糖含量）并未降低，反而有不同程度的提升。因此超表达AaHATL基因在不影响果实可溶性固形物含量（可溶性糖含量）的基础上，可以提高番茄果实中淀粉的积累，在后续番茄成熟过程中能够提供更多的淀粉转化为可溶性糖，能够实现提高成熟番茄果实含糖量，提升番茄的口感和品质。而对于成熟的番荔枝，采后果实中淀粉含量的提高，可以延缓番荔枝后熟软化，有利于延长番荔枝的保质期和货架期，更有利于果实采后运输和贮藏。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种低温响应转录因子AaHATL，其特征在于，其是由核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的基因编码的蛋白质。

2.一种编码如权利要求1所述的低温响应转录因子AaHATL的转录因子基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

3.含有权利要求1所述转录因子AaHATL编码区基因的重组载体或宿主菌或表达盒。

4.如权利要求1所述的转录因子AaHATL、或者权利要求2所述的转录因子基因、或者权利要求3所述的重组载体或宿主菌或表达盒在提高酵母在含有300 ng/mLAbA抑制浓度的SD/-Leu培养基上生长活性中的应用。

5.如权利要求1所述的转录因子AaHATL、或者权利要求2所述的转录因子基因、或者权利要求3所述的重组载体或宿主菌或表达盒在提高植物果实淀粉含量中的应用，其特征在于，过表达所述的转录因子基因提高植物果实淀粉含量，所述的植物为番茄和/或番荔枝。

6.如权利要求1所述的转录因子AaHATL、或者权利要求2所述的转录因子基因、或者权利要求3所述的重组载体或宿主菌或表达盒在抑制番荔枝AaBAM3基因表达中的应用，所述的番荔枝AaBAM3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

7.如权利要求1所述的转录因子AaHATL、或者权利要求2所述的转录因子基因、或者权利要求3所述的重组载体或宿主菌或表达盒在提高番茄果实可溶性糖含量和/或不降低番茄果实中可溶性固形物含量中的应用。

8.如权利要求1所述的转录因子AaHATL、或者权利要求2所述的转录因子基因、或者权利要求3所述的重组载体或宿主菌或表达盒在延缓番荔枝后熟软化和/或延长番荔枝保存期限中的应用。

9.一种引物对，其特征在于，所述引物对为F: CCATTCTTCTATGGGCTTCC和R:TGGCTTGAACTATGGTGGA。