CN120831473A - 用于电化学免疫分析的检测试剂、装置及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别涉及用于电化学免疫分析的检测试剂、装置及检测方法。本发明充分考虑并应对了血细胞对磁珠的干扰，通过提高盐浓度使细胞皱缩以减小血细胞的体积；通过将电极倒置，利用血细胞和血浆的密度差，降低了电极周围血细胞的含量；在体系中加入抗红细胞抗体标记的微球，使血细胞聚集在微球周围以快速沉降，同时减少了游离的红细胞数量，从而达到降低血液对电极表面的污染和提高磁珠的通过率的目的。

Description

用于电化学免疫分析的检测试剂、装置及检测方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及用于电化学免疫分析的检测试剂、装置及检测方法。

背景技术

全血作为生物液体中一个的重要角色，承载着丰富的与身体健康状态有关的信息，对健康管理和疾病监测起到了至关重要的作用。大多数起病急、症状重且病情复杂多样的患者往往首诊于急诊科，使急诊科成为急危重症聚集的科室。急诊检验是急救医疗辅诊的重要组成部分，急诊检验项目的种类、检验结果的准确性和及时性，能够为急诊患者在黄金时间窗内得到有效救治提供重要保障。如果能无需进行额外的离心分离，直接进行全血即时检测，能有效缩短样本到结果的时间，将会大大提高患者在黄金救治期获得即时诊断和后续治疗的可能性。

目前主流的免疫检测方法，主要是利用磁珠进行捕获抗体的富集，再将发光体或过氧化物酶（HRP）等信号分子标记在检测抗体上，通过夹心法进行抗原的捕获和检测。然而，在全血检测中，数量庞大的血细胞会阻碍磁珠被磁吸附到磁铁附近，这会导致检测信号的下降。更重要的是，在HRP-TMB体系中，由于血液中的红细胞也含有过氧化物酶，当红细胞粘附在磁珠或电极表面时，一旦清洗不干净，就会由于血液的污染提高背景信号，导致在全血中的灵敏度大大降低。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了用于电化学免疫分析的检测试剂、装置及检测方法，在利用免疫检测法测定分析物，特别是测定血液样品时，能减少血细胞对磁珠干扰，特别适用于解决磁珠-过氧化物酶（HRP）-3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）体系在全血检测时出现的背景信号高和检测信号低导致的灵敏度不足的问题。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了用于对含有细胞的待测样本进行电化学免疫分析的检测试剂，所述电化学免疫分析包括对靶标物质进行定性分析和/或定量分析，所述检测试剂所含化合物的总浓度使所述细胞失水皱缩；

所述化合物包括有机化合物和无机化合物；

所述无机化合物包括盐；

所述待测样本包括血液样本。

在本发明的一些具体实施方案中，上述检测试剂里，以50 µL所述待测样本计，所述化合物的物质的量为0.01毫摩尔、0.05毫摩尔、0.1毫摩尔、0.15毫摩尔、0.2毫摩尔或0.25毫摩尔。

在本发明的一些具体实施方案中，上述检测试剂里，所述盐包括钾盐、钙盐、钠盐、镁盐、铁盐、锌盐或氯盐中的一种或者多种。

在本发明的一些具体实施方案中，上述检测试剂里，所述盐为氯化钠。

在本发明的一些具体实施方案中，上述检测试剂里，以50 µL所述待测样本计，还包括10 µg、15 µg、20 µg、25 µg、30 µg、35 µg、40 µg、45 µg或50 µg的微球；

所述微球标记有能够与所述细胞结合的蛋白；

所述蛋白包括抗体。

在本发明的一些具体实施方案中，上述检测试剂里，所述微球包括直径在0.2 µm、0.3 µm、0.4 µm、0.5 µm、0.6 µm、0.7 µm、0.8 µm、0.9 µm、1.0 µm、1.1 µm、1.2 µm、1.3 µm、1.4 µm、1.5 µm、1.6 µm、1.7 µm、1.8 µm、1.9 µm或2 µm的羧基乳胶微球。

在本发明的一些具体实施方案中，上述检测试剂里，以50 µL所述待测样本计，还包括：

（i）、2～5 µg可与所述靶标物质结合的酶标记蛋白；和

（ii）、10～50 µg偶联有可与所述靶标物质结合的蛋白的磁珠；

所述酶标记蛋白包括酶标记抗体；

所述蛋白包括抗体。

在本发明的一些具体实施方案中，上述检测试剂里，所述酶标记抗体为辣根过氧化物酶标记的抗体。

在本发明的一些具体实施方案中，上述检测试剂里，所述蛋白包括链霉亲和素。

在本发明的一些具体实施方案中，上述检测试剂里，所述抗体或其他生物分子为抗人红细胞膜抗体、小鼠、兔、羊等非人源抗体、小鼠、兔、羊等非人源血清、抗人白细胞抗体中一种或多种。

在本发明的一些具体实施方案中，上述检测试剂还包括所述酶标记蛋白中的酶的底物。

在本发明的一些具体实施方案中，上述检测试剂里，所述底物为TMB。

在本发明的一些具体实施方案中，上述检测试剂里，所述的磁珠为羧基修饰的直径为0.1 µm、0.15 µm、0.2 µm、0.25 µm或3 µm的磁性微球。

本发明还提供了电化学免疫分析装置，包括上述检测试剂，以及可接受的辅料或助剂。

在本发明的一些具体实施方案中，上述电化学免疫分析装置包括液包（2）、气囊（3）、电极（4）、上基板（5）、夹胶层（6）、下基板（7）；

所述上基板（5）设有进样口（8）、气道孔、电极孔、气囊孔、液包孔、能连接气道（9）和液体流道（12）并贴有双面胶的封口（10）；

所述夹胶层（6）设有废液仓（15）、气道孔、气囊孔、液包孔、样本检测通道（13）、孵育仓（11）；

所述下基板设有气道（9）、液体流道（12）、气孔（16）、废液流道、突刺（17）；

所述气囊、所述气道、所述气道孔、所述样本检测通道依次连通；

所述液体流道中设有所述突刺；

所述刺突可通过所述气囊孔接触所述气囊；

所述进样口、所述孵育仓、所述液体流道连通、所述样本检测通道依次连通；

所述样本检测通道、所述废液流道、所述废液仓、所述气孔依次连通。

在本发明的一些具体实施方案中，上述电化学免疫分析装置里，所述电极包括绝缘基板（18）、两面贯穿并用于连接仪器的金属接触点（19）以及阵列金属电极（20）。

在本发明的一些具体实施方案中，上述电化学免疫分析装置里，所述电极包括工作电极。

在本发明的一些具体实施方案中，上述电化学免疫分析装置里，所述电极还包括参比电极。

在本发明的一些具体实施方案中，上述电化学免疫分析装置里，所述液包包括底物；

所述底物包括TMB。

本发明还提供了对含有细胞的待测样本进行电化学免疫分析的方法，所述电化学免疫分析包括对靶标物质进行定性分析和/或定量分析，其基于上述电化学免疫分析装置，获得结果。

在本发明的一些具体实施方案中，上述方法包括如下步骤：

步骤（1）：混合所述待测样本、所述盐、所述微球、所述酶标记蛋白和所述磁珠，使得所述待测样本渗透压升高，孵育，获得混合物；

步骤（2）：使电极与所述混合物接触，所述电极与所述混合物的相对位置关系为：竖直方向上，所述电极在上，所述混合物在下；

步骤（3）：竖直方向上，在所述电极上方施加磁场，吸引所述磁珠使所述磁珠与所述电极接触；

步骤（4）：使所述底物与所述磁珠接触，分析通过所述电化学免疫分析装置获得的信号。

在本发明的一些具体实施方案中，上述方法中所述电极设置在所述电化学免疫分析装置中。

在本发明的一些具体实施方案中，上述方法包括如下步骤：

混合所述待测样本、所述盐、所述微球、所述酶标记蛋白和所述磁珠，使得所述待测样本渗透压升高，通过所述进样口注入所述孵育仓，孵育，获得混合物；

翻折所述封口，连通所述气道和所述液体流道；

压迫所述气囊，使气体通过气道、气道孔、孵育仓，把所述混合物推进所述样本检测通道，所述电极与所述混合物接触，所述电极与所述混合物的相对位置关系为：竖直方向上，所述电极在上，所述混合物在下；

竖直方向上，在所述电极上方施加磁场，吸引所述磁珠使所述磁珠与所述电极接触；

可选地，压迫所述气囊，使气体通过气道、气道孔、孵育仓、所述样本检测通道，把液体排除出样本检测通道至废液仓；

压迫所述液包，使所述底物通过所述液体流道推入样本检测通道，所述底物与所述磁珠接触；

将所述电极接入电化学工作站，并向所述电极施加电位；

所述底物在所述电极上发生电化学反应产生信号，分析所述信号。

在本发明的一些具体实施方案中，上述方法的所述待测样本为血液样本。

本发明的检测试剂、装置及检测方法的有益效果在于：

（1）提高盐浓度使细胞皱缩，减小血细胞的体积，从而降低血细胞对磁珠的物理阻隔；

（2）通过将电极倒置，利用血细胞和血浆的密度差，在孵育过程中血细胞由于自然沉降会远离电极，从而提高电极周围血浆含量，降低电极周围血细胞的含量；

（3）在体系中加入抗红细胞抗体（RBC）标记的微球，利用红细胞和RBC之间的特异性识别，使红细胞聚集在微球周围以快速沉降，同时大大降低游离血细胞的数量。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示原理图；

图2示全血改善后电化学对比；

图3示本发明涉及的测试卡，其中，1示测试卡主体部分，2示TMB液包，3示气囊，4示电极；

图4示本发明涉及的测试卡的分解视图；其中，5示上基板，6示夹胶层，7示下基板，8示进样口，9示气道，10示封口，11示孵育仓，12示液体流道，13示样本检测通道，15示废液仓，16示气孔，17示突刺；

图5示电极的正面、反面结构，其中，18示绝缘基板，19示金属接触点，20示阵列金属电极；

图6示图5圆圈区域的剖面图，其中，7示下基板，21示参比电极；

图7示不同处理组的信号强度；

图8示磁珠在不同盐浓度的全血样本中的回收情况；

图9示加入微球前后血细胞的团聚情况。

具体实施方式

本发明公开了一种电化学免疫测试卡及其测试方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

应该理解，表述“……中的一种或多种”单独地包括每个在所述表述后叙述的物体以及所述叙述的物体中的两者或更多者的各种不同组合，除非从上下文和用法中另有理解。与三个或更多个叙述的物体相结合的表述“和/或”应该被理解为具有相同的含义，除非从上下文另有理解。

术语“包括”、“具有”或“含有”，包括其语法同义语的使用，通常应该被理解为开放性和非限制性的，例如不排除其他未叙述的要素或步骤，除非另有具体陈述或从上下文另有理解。

应该理解，只要本发明仍可操作，步骤的顺序或执行某些行动的顺序并不重要。此外，两个或更多个步骤或行动可以同时进行。

本文中的任何和所有实例或示例性语言如“例如”或“包括”的使用，仅仅打算更好地说明本发明，并且除非提出权利要求，否则不对本发明的范围构成限制。本说明书中的任何语言都不应解释为指示任何未要求保护的要素对于本发明的实践是必不可少的。

此外，用以界定本发明的数值范围与参数皆是约略的数值，此处已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。然而，任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所致的标准偏差。因此，除非另有明确的说明，应当理解本公开所用的所有范围、数量、数值与百分比均经过“约”的修饰。在此处，“约”通常是指实际数值在一特定数值或范围的正负10%、5%、1%或0.5%之内。

如无特殊说明，本发明涉及的原料、试剂、耗材以及仪器皆为普通市售品，均可由市场购得。

如图1所示，在血浆环境中，标记抗体的磁珠由于磁吸附的作用会富集在电极周围，然而在全血环境中，由于血细胞和血浆的密度差，在孵育过程中血细胞会自然沉降到电极附近，此时，标记抗体的磁珠由于血细胞的物理阻隔，难以在磁吸附的作用下到达电极周围，少数到达电极周围的磁珠也容易被血细胞粘附，从而提高背景信号。

而本发明通过提高盐浓度、将电极倒置以及在体系中加入抗红细胞抗体（RBC）标记的微球三种策略的组合，不仅可以降低游离血细胞的数量和体积，而且可以提高电极周围血浆的含量，从而降低血细胞对磁珠粘附及物理阻隔，最终达到降低血液对电极表面的污染和提高磁珠在血液中通过率的目的，将全血中的背景信号及电化学响应恢复到血浆水平（图2）。

本发明的测试卡如图3、图4所示，1示装置部分，主要组成包括TMB液包2、气囊3、电极4、上基板5、夹胶层6、下基板7，其他结构和组成还包括进样口8，气道9，连接气道和液体流道并贴有双面胶的封口10，孵育仓11，液体流道12，样本检测通道13，废液仓15，气孔16以及突刺17。电极通过夹胶层贴于样本检测通道上方，电极的正反面结构如图5所示，包括绝缘基板18、两面贯穿并用于连接仪器的金属接触点19、以及阵列金属电极20，金电极阵列包含工作电极、参比电极、对电极、对照电极、用于判断红细胞压积的电极以及判断液流到位的到位电极。图6为图5圆圈区域的剖面图，可以看出当测试卡水平放置时，金属电极方向朝下位于流道上方形成倒置，电极阵列中也设置有参比电极21，金属电极上方有磁场对液体当中的磁珠进行指定位置的聚集。

本发明提供一种利用上述降低血细胞对磁珠干扰策略的电极测试卡，以HRP-TMB体系为例，所述测试卡结构包括：气囊，TMB液包，磁珠，电极和废液仓等。其中一种具体测试操作步骤如下所示：

1. 血液流经孵育仓，将固定在卡上的磁珠冲刷下来；

2. 混合磁珠的血液通过流道进入电极内的反应区，在磁场的作用下将磁珠富集在工作电极附近；

3. 通过夹心法进行抗原和标记抗体的捕获后，将反应液排出；

4. 首次按压TMB液包，在电极反应区进行充分冲洗并排出；

5. 再次按压TMB液包，使TMB充满电极反应区，孵育一定时间后，施加一定的电位进行后续的电化学检测；

所述测试卡基板的材质包括铝合金、PET、PC、玻璃和亚克力、PDMS中的一种或多种；

所述测试卡加工方式包括CNC机加工、激光加工、注塑、3D打印、倒模、模切、软刻蚀中的一种或多种；

电极金属层通过丝网印刷或电镀或磁控溅射或激光雕刻附着在所述绝缘基板上；

所述金属层由金属材料制成，所述金属至少包括Cu、Ti、Ag、Pt、Pd、Gu和Au中的一种；

所述参比电极通过丝网印刷或电镀或点胶的方式覆盖在金属电极表面；

所述磁场形成方式通过电磁体、钕铁硼磁铁、铝镍钴磁铁、钐钴磁铁中的一种或多种，磁场面积大小为金属电极直径的0.5～2倍；

所述TMB液包中包含一种辣根过氧化物酶（HRP）底物显色液（单组份TMB溶液），主要成分是3,3',5,5'–四甲基联苯胺和过氧化物混合物；

所述单组份TMB溶液为商业性试剂，可取自碧云天、Sigma-Aldrich、Merck、ThermoFisher Scientific、Neogen中的一种或多种；

抗体标记磁珠用到的试剂包括：羧基修饰的磁珠、活化缓冲液、活化试剂、抗体或其他生物分子、淬灭溶液和含有阻断分子的储存缓冲液；

所述的磁珠为羧基修饰的直径在0.1～3 µm之间的磁性微球；

所述的活化缓冲液为MES（2-Morpholinoethanesulphonic acid），pH在4.5～7.5之间；

所述的活化试剂为5～20 mM碳二亚胺（EDC、CMC等）或与5～20 mM N-羟基丁二酰亚胺（NHS）混合使用；

所述抗体或其他生物分子为相关免疫球蛋白、相关抗原、DNA、RNA、酶、适配体、链霉亲和素中的一种或者多种；

所述的淬灭溶液为10～30 mM的伯胺源和0.01～0.1％（w/v）的阻断分子混合溶液；

所述阻断分子为牛血清白蛋白、酪蛋白、非离子表面活性剂、聚乙二醇、商业性阻断剂中的一种或者多种；

所述储存缓冲液为具有0.01～0.1％（w/v）阻断分子的储存缓冲液（pH 7.0～7.5）。

抗体标记磁珠的具体制备步骤以一实际案例为例：取1 mg磁珠充分悬浮于含有20mg/mL EDC的活化缓冲液中，避光混匀孵育50分钟。之后将活化的磁珠与5 µg心肌肌钙蛋白I抗体室温避光混匀孵育8～16小时。反应完成后将磁珠用淬灭溶液反复清洗3～8次，再在淬灭溶液中孵育2小时以上，随后洗涤并重悬于存储缓冲液中至所需的存储浓度（通常为10mg / mL），存放在4℃直到使用；

抗体标记微球的试剂方法除微球和抗体或其他生物分子外其余试剂和步骤相同；所述微球为直径在0.2～2 µm的羧基乳胶微球；所述抗体或其他生物分子为抗人红细胞膜抗体、小鼠、兔、羊等非人源抗体、小鼠、兔、羊等非人源血清、抗人白细胞抗体中一种或多种；

抗体-HRP复合物通过过碘酸钠法或戊二醛标记法或和亲和素抗体-生物素化过氧化物酶复合物法或生物素化抗体-亲和素过氧化物酶复合物法进行偶联。偶联的抗体-HRP复合物存放于商业化稳定剂中长期存放。

本发明的一种使用方案如下：

1）将50 µL含有抗原的血样与10～50 µg抗体标记磁珠复合物、2～5 µg抗体-HRP复合物、0.01～0.025毫摩尔盐、10～50 µg抗RBC抗体标记微球等混合然后通过注射器或者移液器从进样口注入孵育仓，并翻折封口通过胶层与测试卡上基板粘合，使气道与液体流道形成通路；

2）按压气囊驱动血样，将血样从孵育仓推进到样本检测流道中，通过到位电极使样本停留在样本检测区，静置孵育3～5分钟；

3）孵育完成后，磁铁靠近工作电极，距离工作电极0～2 mm时停住，通过磁场吸引，磁珠逐步从血液中脱离并吸附在电极表面，此步骤耗时1～3分钟；

4）通过交替下压液包和气囊的方式，不断向样本检测流道注入TMB溶液和空气，循环2～4次后，样本检测流道充满TMB溶液，TMB溶液孵育一分钟后，将所述传感装置连入电化学工作站，在电极上施加-0.2 V的电压，持续60秒，并记录第60秒时的电流值；

当电极表面形成抗体标记磁珠-抗原-抗体-HRP复合物的夹心复合物时，TMB溶液中的有效成分在酶的催化下被氧化，当施加负电压后，氧化物被还原并产生电流，产生的电流的绝对值与形成的夹心复合物的数量成正比；

上述的盐包括K⁺、Ca²⁺、Na⁺、Mg⁺、Fe³⁺、Zn²⁺、Cl^-中的一种或者多种。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例

1）将50 µL含有抗原（华鼎重组人心肌肌钙蛋白复合物，货号为60005，含量为0ng/mL、0.1 ng/mL、1 ng/mL或10 ng/mL）的血样与2.5 µL检测试剂混合然后通过注射器或者移液器从进样口注入孵育仓，并翻折封口通过胶层与测试卡上基板粘合，使气道与液体流道形成通路。

2）按压气囊驱动血样，将血样从孵育仓推进到样本检测流道中，通过到位电极使样本停留在样本检测区，静置孵育3～5分钟。

3）孵育完成后，磁铁靠近工作电极，距离工作电极0～2 mm时停住，通过磁场吸引，磁珠逐步从血液中脱离并吸附在电极表面，此步骤耗时1～3分钟。

4）通过交替下压液包和气囊的方式，不断向样本检测流道注入TMB溶液和空气，循环2～4次后，样本检测流道充满TMB溶液，TMB溶液孵育1分钟后，将电极与电化学工作站连接，并在电极上施加-0.2 V的电压，持续60秒，并读取60秒时的电流信号。

上述检测试剂包括检测试剂1、检测试剂2、检测试剂3或检测试剂4，组分及配比如表1所示：

表1

设立4种不同的处理方法，分别为：

（1）：对照：50 µL血样与检测试剂1混合，测试卡的电极正置；

（2）：正置：50 µL血样与检测试剂1混合，测试卡的电极正置；

（3）：正置+盐：50 µL血样与检测试剂2混合，测试卡的电极正置；

（4）：倒置+盐+微球：50 µL血样与检测试剂3混合，测试卡的电极倒置。

结果：1. 表2和图7显示出，与正置全血信号相比，信号在正置加盐全血样本中得到很大提升，说明磁珠在有更多盐的全血中能更好的对磁场做出响应，在金属电极表面形成更多夹心结构，使得分析性能得到提升，但与对照组（全血浆）还有一定的差距。当在血样中加入盐、微球并倒置电极后，信号响应得到进一步的提升。对比正置全血样本和倒置样本在10 ng/mL中产生的信号，信号提升了243%。另一方面，如表3所示，通过加入盐、微球、倒置等措施，传感器的背景信号的到了逐步的降低，从104.4（-nA）降低到57.7（-nA），CV（%）从9.1降低到5.7，提高了分析性能，降低了假阳假阴的概率。

表2

表3

2. 基于上述（4）的试验条件，通过对比磁珠在不同盐浓度的全血样本中的回收情况可以看出，在全血中添加100～250 mM的盐可以使磁珠的回收情况和全血浆相当（图8），根据结果分析主要原因是提高的盐浓度可以使血细胞皱缩，从而使得磁珠更容易在磁场的作用下在血液样本中转移。

通过在全血中加入微球，微球上的抗体等生物分子可以使血细胞在很短的时间团聚，如图9所示，团聚的血细胞能更快速的在重力的作用下迅速沉降，使得磁珠的通过率进一步提高并且避免了血细胞在电极表面的黏附，从而使得背景信号进一步下降。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.用于对含有细胞的待测样本进行电化学免疫分析的检测试剂，所述电化学免疫分析包括对靶标物质进行定性分析和/或定量分析，其特征在于，所述检测试剂所含化合物的总浓度使所述细胞失水皱缩；

所述化合物包括盐；

所述待测样本包括血液样本。

2.如权利要求1所述的检测试剂，其特征在于，以50 µL所述待测样本计，所述盐的物质的量为0.01～0.25毫摩尔。

3.如权利要求1或2所述的检测试剂，其特征在于，以50 µL所述待测样本计，还包括10～50 µg的微球；

所述微球标记有能够与所述细胞结合的蛋白。

4.如权利要求3所述的检测试剂，其特征在于，以50 µL所述待测样本计，还包括：

（i）、2～5 µg可与所述靶标物质结合的酶标记蛋白；和

（ii）、10～50 µg偶联有可与所述靶标物质结合的蛋白的磁珠；

所述酶标记蛋白包括酶标记抗体；

所述蛋白包括抗体。

5.如权利要求4所述的检测试剂，其特征在于，还包括所述酶标记蛋白中的酶的底物。

6.电化学免疫分析装置，其特征在于，包括如权利要求1-5任意一项所述的检测试剂，以及可接受的辅料、助剂和/或部件。

7.电化学免疫分析的方法，所述电化学免疫分析包括对靶标物质进行定性分析和/或定量分析，其特征在于，基于如权利要求6所述的电化学免疫分析装置，获得结果。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤（1）：混合待测样本、所述化合物、所述微球、所述酶标记蛋白和所述磁珠，使得所述待测样本渗透压升高，孵育，获得混合物；

步骤（2）：使电极与所述混合物接触，所述电极与所述混合物的相对位置关系为：竖直方向上，所述电极在上，所述混合物在下；

步骤（3）：竖直方向上，在所述电极上方施加磁场，吸引所述磁珠使所述磁珠与所述电极接触；

步骤（4）：使所述底物与所述磁珠接触，分析通过所述电化学免疫分析装置获得的信号。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述待测样本为血液样本。