CN120829924A - 基因CsPOD7在黄瓜单倍体育种中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了基因CsPOD7在黄瓜单倍体育种中的应用，属于分子育种技术领域。本发明从黄瓜中克隆出孤雌生殖单倍体诱导基因CsPOD7，通过CRISPR‑Cas9基因编辑技术对CsPOD7进行敲除，将cspod7突变体作为父本与作为母本的其它黄瓜材料进行杂交能够产生孤雌生殖单倍体。本发明是基因CsPOD7在双子叶植物中开发出孤雌生殖单倍体诱导系的首次应用，实现基于基因CsPOD7的单倍体诱导系在黄瓜遗传育种中的应用，加速黄瓜育种进程，具有巨大的潜在应用价值和市场前景。

Description

基因CsPOD7在黄瓜单倍体育种中的应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域和植物遗传育种领域，具体地说，涉及基因CsPOD7在黄瓜单倍体育种中的应用。

背景技术

黄瓜（CucumissativusL.）是全球广泛种植的蔬菜作物之一，具有较高的经济价值和营养价值，深受消费者的喜爱。同时，黄瓜也是我国重要的蔬菜作物之一，在我国的农业生产中具有重要地位，根据联合国粮食及农业组织（FAO）发布的数据，2022年中国的黄瓜种植面积约为1.31×106hm2，总产量达到7731万吨，分别占到了全球黄瓜种植总面积的60.3%和总产量的81.6%，因此，培育高产、高抗且优质的黄瓜新品种是市场需求的主要目标。然而，黄瓜育种仍以传统的经历多世代获得稳定遗传材料的方式为主，漫长的过程严重阻碍了黄瓜遗传育种的进展，而只需要两个世代就可以获得稳定遗传的纯和材料的单倍体育种技术，是现代育种的重要技术手段之一。到目前为止，黄瓜单倍体育种技术仅仅只被少量采用，且以体外单倍体诱导方式为主，这种方式容易受到基因型、培养条件等因素的影响，导致单倍体诱导效率非常低。此外，我们先前利用基因CsDMP开发了黄瓜体内孤雌生殖单倍体诱导的单倍体诱导系，为了提高黄瓜单倍体诱导系的推广和应用效率，需要进一步开发更多的基于不同基因的体内孤雌生殖单倍体诱导的单倍体诱导系。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供基因CsPOD7在黄瓜单倍体育种中的应用。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供基因CsPOD7在黄瓜单倍体育种中的应用。

本发明中，黄瓜CsPOD7基因的核苷酸序列为：

（a）SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；或

（b）SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；

（c）在严格条件下与SEQ ID NO:1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1% SDS的0.1×SSPE或含0.1% SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或（d）与（a）、（b）或（c）的核苷酸序列具有80%以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。

黄瓜CsPOD7基因编码蛋白质的氨基酸序列为：

（a）SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；或

（b）SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸具有同等功能活性的氨基酸序列。

（c）与（a）或（b）中任一所限定的氨基酸序列具有80%以上同一性且来源于黄瓜的具有相同功能的氨基酸序列。

进一步地，所述应用包括：利用诱变、定点突变、同源重组等中的至少一种手段对黄瓜基因CsPOD7进行改造，使得该基因功能缺失或减弱。

第二方面，本发明提供一种黄瓜孤雌生殖单倍体诱导系的构建方法，利用基因工程手段，敲除黄瓜基因CsPOD7，或者沉默或抑制黄瓜基因CsPOD7的表达，获得阳性转基因植株，即为黄瓜孤雌生殖单倍体诱导系。

进一步地，基因敲除、沉默或抑制的方法可选自CRISPR/Cas9、TALEN基因编辑技术，EMS诱变，T-DNA插入，RNAi干扰，启动子突变和VIGS干扰等中的至少一种。

所述敲除CsPOD7基因为使黄瓜基因组中CsPOD7的表达水平降低或使黄瓜基因组中的CsPOD7基因发生碱基插入、缺失或替换突变。

优选地，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除黄瓜基因CsPOD7。

所述方法包括：以基因CsPOD7为靶标，设计基于CRISPR/Cas9的sgRNA序列，将含有编码所述sgRNA序列的DNA片段连接到携带CRISPR/Cas9的载体（如pKSE402载体）中，转化黄瓜。

优选地，sgRNA作用位点的核苷酸序列为5’-TCGGTTATTACCAAAAAAC-3’和5’-TGCTAAGACCAACCTCGAA-3。

第三方面，本发明提供按照所述方法获得的转基因植物在黄瓜育种中的应用。育种方法包括但不限于转基因、杂交、回交、自交或无性繁殖。

第四方面，本发明提供一种黄瓜单倍体制备及鉴定的方法。黄瓜单倍体诱导系的制备方法包括：利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除黄瓜CsPOD7基因，获得稳定携带绿色荧光的纯和编辑植株，即为黄瓜单倍体诱导系。将利用上述方法获得的黄瓜单倍体诱导系或其自交后代作为父本，与作为母本的其它黄瓜材料进行杂交，对得到的杂交后代进行单倍体表型鉴定或荧光标记鉴定或倍型鉴定，选取至少一种方法鉴定为单倍体的杂交后代植株，即为所述黄瓜孤雌生殖单倍体。

本发明的有益效果：

本发明首次揭示了基因CsPOD7的生物学功能，其为黄瓜孤雌生殖单倍体诱导基因，并利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除CsPOD7基因进而创制出黄瓜孤雌生殖单倍体诱导系，进一步通过杂交试验成功证明CsPOD7基因的突变能够诱导黄瓜产生孤雌生殖单倍体。本发明首次成功的在双子叶植物黄瓜中开发出基于敲除CsPOD7基因的体内单倍体诱导系，为POD基因在双子叶植物单倍体育种中的应用提供依据，为提高黄瓜单倍体育种效率提供材料，在加速黄瓜育种进程方面意义重大，具有巨大的应用价值和市场前景。

附图说明

图1为本发明中野生型黄瓜材料长春密刺和cspod7突变体的果实和种子表型图。其中，A和B为野生型的成熟黄瓜果实及种子；C和D为cspod7突变体的成熟黄瓜果实及种子；E和F为野生型和cspod7突变体种子数目统计。***表示不同处理组之间的差异具有统计学意义，***表示P<0.001。其中夭折种子是指没有形成正常种胚的种子，是一种正常的表型统计。

图2为黄瓜单倍体种子荧光筛选结果图，其中图A为正常光照下的实体图，图B为荧光图。

图3是二倍体黄瓜和单倍体黄瓜植株和叶片对比表型图。

图4是黄瓜二倍体植株和单倍体植株流式细胞检测结果图。

具体实施方式

本发明提供一种利用基因编辑技术创制黄瓜孤雌生殖单倍体诱导系的方法，特别的cspod7基因的突变植株作为孤雌生殖单倍体诱导系在诱导黄瓜产生孤雌生殖单倍体的应用。

本发明采用技术方案如下：

本发明提供一种黄瓜孤雌生殖单倍体诱导系的制备方法，所述方法包括：敲除CsPOD7基因或沉默或抑制CsPOD7的表达，获得阳性转基因植株，即为黄瓜孤雌生殖单倍体诱导系。

所述方法中，所述敲除为使黄瓜基因组中CsPOD7基因发生碱基插入或缺失或替换突变，或沉默或抑制为使黄瓜基因组中的CsPOD7基因表达水平降低。

所述方法中，所述敲除黄瓜基因组中的CsPOD7的方法包括CRISPR/Cas9、EMS诱变、T-DNA插入或TALEN。

所述方法中，所述沉默或抑制黄瓜基因组中CsPOD7表达水平降低的方式包括RNAi干扰、启动子突变或VIGS干扰。

进一步地，所述使黄瓜基因组中CsPOD7发生碱基插入或缺失或替换的方法为CRISPR/Cas9基因编辑技术。

更进一步地，所述CRISPR/Cas9的靶目标序列为SEQ ID NO:1的第86-104位和/或第 324-342位。

在本发明的一个具体实施方案中，所述为使黄瓜基因组中CsPOD7基因发生碱基插入或缺失或替换突变的方法为如下步骤：将CsPOD7靶目标序列导入CRISPR/Cas9载体，随后利农杆菌通过侵染黄瓜子叶的方法将该载体导入黄瓜基因组中，利用绿色荧光筛选获得阳性转基因植株。

本发明还提供黄瓜孤雌生殖单倍体制备的方法，步骤如下：由上述方法获得的黄瓜孤雌生殖单倍体诱导系作为父本与作为母本的其它黄瓜材料进行杂交，得到的杂交后代，利用绿色荧光标记筛选或流式细胞仪倍型检测或表型观察对杂交后代单株进行鉴定，选取至少一种方法鉴定为单倍体的杂交后代植株，即为黄瓜孤雌生殖单倍体。

所述绿色荧光标记筛选单倍体的方法按照如下进行：在所述含有CsPOD7靶目标序列的CRISPR/Cas9载体上包含荧光蛋白EGFP表达框，利用荧光照射对刚收获的杂交后代种子进行初步的单倍体筛选。若杂交后代种子无绿色荧光，且整体较小较瘪，则视为候选单倍体；若待测种子呈现绿色荧光，且整体正常饱满，则为杂合二倍体。

所述单倍体倍型鉴定方法包括如下步骤：将上述候选单倍体播种，待其生长至合适大小，取其0.5平方厘米的幼嫩叶片（约小拇指甲盖大小）提取细胞核，以野生型二倍体黄瓜材料长春密刺幼嫩叶片的细胞核作为对照，首先使用流式细胞仪检测对照 材料的细胞核信号，设置100为二倍体细胞核信号峰值，随后使用流式细胞仪对候选 单倍体的细胞核信号进行检测，若检测的信号峰值位于50处，则表明该植株为单倍体 植株；若检测的信号峰位于100处，则表明该植株为二倍体植株。

所述单倍体表型鉴定方法参考以下方法：若杂交后代单株植株长势较弱，整体表现为矮小、叶片和花器官等各种器官变小、雄性不育等特征，则该单株为候选或单倍 体植株；若杂交后代植株长势较强，植株高度正常、叶片及花器官等各种器官正常发育、花粉活性正常等特征，则视为正常二倍体植株。

本发明进一步提供含有上述黄瓜CsPOD7基因的表达盒。

本发明进一步提供含有上述黄瓜CsPOD7基因的重组表达载体。

本发明进一步提供含有上述黄瓜CsPOD7基因或重组表达载体的工程菌或转基因细胞。

本发明提供上述黄瓜CsPOD7基因或该基因编码的蛋白在创制黄瓜孤雌生殖单倍体诱导系方面的应用。

本发明进一步提供上述黄瓜CsPOD7基因或该基因编码蛋白突变体在黄瓜孤雌生殖单倍体诱导方面的应用。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（Sambrook J & Russell DW,Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2001），或按照制造厂商说明书建议的条件。

以下实施例所用黄瓜材料为长春密刺、2073-1和2073-2，，来源于中国农业大学黄瓜遗传改良课题组，参见Plant Physiology (Chen eta1.,2016,171:1156-1168)，Horticulture Research (Zhai et a1.,2022, doi.org/10.1093/hr/uhac146)，公众可公开获取(仅用于科研和 教学目的)。

pKSE402载体由中国农业科学院深圳农业基因组研究所黄三文教授馈赠。

实施例1 获得黄瓜 CsPOD7 基因的编辑植株

1、sgRNA序列的靶点序列设计

利用CRISPR-P v2.0在线网站（http://cbi.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR2/CRISPR）对CsPOD7基因的核苷酸序列进行预测并选择两个长度为19bp的特异性靶位点序列。

第1靶位点序列位于SEQ ID NO:1的第86-104位，sgRNA1靶位点的序列为5’-TCGGTTATTACCAAAAAAC-3’。

第2靶位点序列位于SEQ ID NO:1的第324-342位，sgRNA2靶位点的序列为5’-TGCTAAGACCAACCTCGAA-3’。

2、CRISPR/Cas9介导的CsPOD7基因敲除载体的构建

CRISPR/Cas9载体为将第1靶位点sgRNA1序列和第2靶位点sgRNA2序列连接到pKSE402载体上得到的重组载体。

3、获得CsPOD7转基因植株

将上一步构建成功的CRISPR/Cas9载体质粒采用化学转化的方法递送至GV3101农杆菌感受态细胞中，获得重组菌株GV3101（CRISPR/Cas9）。具体操作步骤按照生物公司提供的农杆菌感受态转化说明书进行。随后选用9长春密刺9作为材料，利用重组农杆菌采用侵染黄瓜子叶的方法递送至黄瓜中，通过绿色荧光标记筛选对培养出的新生芽初步鉴定阳性转基因黄瓜植株。

4、转基因植株打靶鉴定

使用T0代转基因植株的幼嫩叶片提取植物基因组DNA，设计CsPOD7转基因打靶鉴定克隆和测序引物：CRCsPOD7-Seq-F：ATAGATAAGGAGGAAGCCATTAAG和CRCsPOD7-Seq-R：CCATGAAAGAGGTGTGATGGGAAATAT。随后，利用该对引物对获得的T0代转基因植株的DNA进行克隆、产物纯化后连接pToPo载体，转化DH5α大肠感受态，孵育后涂含有氨苄抗性的LB固体培养基，挑取单克隆于含有氨苄抗性的LB液体培养基，利用该引物对挑取的单克隆进行PCR验证，选取含有正确目的条带的单克隆菌液进行Sanger测序，测序结果与比野生型CsPOD7基因序列进行比对。参照以下原则鉴定CsPOD7转基因植株的基因型：若测序结果只有野生型序列，则认为该株系没有打靶编辑，即野生型植株；若测序结果同时出现野生型序列和具有突变的序列，则认为该株系为杂合突变植株；若测序结果只出现突变序列而没有野生型序列，则认为株系为纯合突变植株。

依照上述鉴定原则，对4株T0代黄瓜转基因植株进行鉴定，其中，2株发生杂合突变，2株产生双等位突变，结果如表1所示。

表1 黄瓜CsPOD7转基因植株T0代打靶鉴定结果

测序结果表明，在4株T0代转基因植株中，T0-3突变株系与黄瓜基因组野生型CsPOD7基因序列相比，其具体的突变类型为：两条染色体第一个靶点中的碱基G替换为碱基T，碱基替换位置为SEQIDNO:1的第89位。

此外，经过对测序结果分析，另外一个转基因植株T0-4突变株系与黄瓜基因组野生型CsPOD7基因序列相比，其具体突变类型为：两条染色体的第二个靶点中的12bp碱基AAGACCAACCTC替换为CACGCTCAGCT，其位置为SEQIDNO:1的第328位和第339位之间。

5、T2代CsPOD7转基因植株编辑类型的鉴定

将步骤4中获得的T0代突变植株T0-3和T0-4进行自交，待黄瓜果实成熟后收获T1代种子并通过绿色荧光标记筛选带有绿色荧光的种子，继续播种后进行编辑类型鉴定（鉴定方法同步骤4中方法），将打靶植株继续进行自交并收获T2代种子，同样通过绿色荧光标记筛选种子全部携带绿色荧光且纯合突变的株系（绿色荧光用于后续单倍体筛选，靶点突变鉴定方式同步骤4中的方法）作为黄瓜孤雌生殖单倍体诱导系。

经过筛选，最终确定T1-3-6、T1-3-8和T1-4-3、T1-4-5、T1-4-12株系为种子全部携带绿色荧光标记且纯合编辑的株系。各株系的编辑类型如下：

经测序鉴定分析：与野生型黄瓜CsPOD7基因序列相比，T1-3-6、T1-3-8纯合编辑株系的编辑类型为：两条染色体第一个靶点中的碱基G替换为碱基T，碱基替换位置

为SEQIDNO:1的第89位。

经测序鉴定分析：与野生型黄瓜CsPOD7基因序列相比，T1-4-3、T1-4-5、T1-4-

12纯合突变株系的突变类型为：两条染色体的第二个靶点中的12bp碱基

AAGACCAACCTC替换为CACGCTCAGCT，其位置为SEQIDNO:1的第328位和第339位之间。

实施例2T2代CsPOD7基因纯和编辑植株在黄瓜孤雌生殖单倍体诱导中的应用

1、黄瓜CsPOD7纯和编辑植株的果实种子结实率和发育情况

相较于野生型黄瓜材料长春密刺，CsPOD7基因纯和编辑植株的果实种子数目显著减少，且编辑植株的未发育种子数量明显增加（图1）。这表明CsPOD7的突变会影响编辑植株种子的正常发育，导致结实率降低。

2、单倍体植株的鉴定及CsPOD7基因纯和编辑植株诱导黄瓜单倍体产生的概率

以CsPOD7T2代纯合编辑植株T1-3-6、T1-3-8和T1-4-3、T1-4-5、T1-4-12为父本分别与作为母本的不同黄瓜材料进行杂交（长春密刺、2073-1和2073-2），通过以下方法对获得的杂交后代进行单倍体筛选和倍型鉴定：

（1）利用绿色荧光标记初步筛选单倍体

上述描述中使用CsPOD7基因纯和编辑植株作为父本与作为母本的不同黄瓜材料进行杂交，鉴于CRISPR/Cas载体上带有独立表达的EGFP绿色荧光蛋白标签，即来源于父本的染色体携带有绿色荧光蛋白标签，因此，利用绿色荧光对收获的杂交一代种子初步进行单倍体筛选。杂交后代若带有绿色荧光则为杂合二倍体，若杂交后代没有绿色荧光则初步认为是单倍体（图3）。

（2）利用流式细胞仪进行倍型鉴定

将上述步骤（1）中筛选的不含绿色荧光的种子播种，待其长至合适大小取0.5平方厘米（约小拇指甲盖大小）的幼嫩叶片提取细胞核，以野生型二倍体黄瓜材料长春密刺幼嫩叶片的细胞核作为对照，首先使用流式细胞仪检测二倍体黄瓜材料长春密刺的细胞核信号峰值，并设置100为二倍体信号峰值。然后使用流式细胞仪依次检测上述步骤（1）中初步筛选的植株，若检测的信号峰值出现在50附近，则该植株为单倍体植株；若检测的信号峰值出现在100左右，则该植株为二倍体植株（图4）。

（3）植株表型的观察与鉴定

对上述步骤（1）和（2）中鉴定出的单倍体植株进行表型观察，相对于二倍体植株，单倍体植株的整体植株呈现矮小，无论是叶片还是各种器官都呈现出变小的特征（图2）。

（4）CsPOD7敲除植株的单倍体诱导率统计结果

根据上述鉴定结果统计CsPOD7敲除植株的单倍体诱导率（表2）：

单倍体诱导率（%）=（单倍体数目/杂交种子总数目）×100

表 2 cspod7 单倍体诱导率统计

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (6)

1.黄瓜CsPOD7基因在单倍体育种中的应用，其特征在于，所述黄瓜CsPOD7基因的核苷酸序列为：

（a）SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；或

（b）SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸 且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；

（c）与（a）或（b）的核苷酸序列具有80%以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。

2.权利要求1所述黄瓜CsPOD7基因编码的蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列为：

（a）SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；或

（b）SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸且具有同等功能活性的氨基酸序列；

（c）与（a）或（b）中任一所限定的氨基酸序列具有80%以上同一性且来源于黄瓜的具有相同功能的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用包括：利用诱变、定点突变、同源重组中的至少一种手段对黄瓜基因CsPOD7进行改造，使得该基因功能缺失或减弱。

4.黄瓜孤雌生殖单倍体诱导系的构建方法，其特征在于，具体步骤是利用基因工程手段，敲除黄瓜基因CsPOD7，或者沉默或抑制黄瓜基因CsPOD7的表达，获得阳性转基因植株，即为黄瓜孤雌生殖单倍体诱导系；

所述基因敲除、沉默或抑制的方法选自CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除黄瓜基因CsPOD7；

具体是以基因CsPOD7为靶标，设计基于CRISPR/Cas9的sgRNA序列，将含有编码所述sgRNA序列的DNA片段连接到携带CRISPR/Cas9的载体中转化黄瓜；

sgRNA作用位点的核苷酸序列为5’-TCGGTTATTACCAAAAAAC-3’和5’-TGCTAAGACCAACCTCGAA-3’。

5.按照权利要求4所述方法获得的转基因植物在黄瓜育种中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，育种方法包括转基因、杂交、回交、自交或无性繁殖。