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CN120813703A - 通过lpho辅助pto切割和延伸测定检测靶核酸 - Google Patents

通过lpho辅助pto切割和延伸测定检测靶核酸

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CN120813703A
CN120813703A CN202480015282.4A CN202480015282A CN120813703A CN 120813703 A CN120813703 A CN 120813703A CN 202480015282 A CN202480015282 A CN 202480015282A CN 120813703 A CN120813703 A CN 120813703A
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CN
China
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target nucleic
cto
signal
nucleic acid
lpho
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Application number
CN202480015282.4A
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金政优
李韩伟
河礼圣
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Original Assignee
Seegene Inc
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Publication date
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Abstract

本公开涉及通过LPHO辅助PTO切割和延伸(L‑PTOCE)测定以检测靶核酸。本公开的方法和组合物确保能以更高的准确性和便利性检测一种或多种靶核酸。

Description

通过LPHO辅助PTO切割和延伸测定检测靶核酸
技术领域
本公开涉及通过LPHO辅助PTO切割和延伸(L-PTOCE)测定以检测靶核酸。
背景技术
为了检测靶核酸，广泛使用能够以实时方式监测靶标扩增以检测靶核酸的实时检测方法。实时检测方法通常使用与靶核酸特异性杂交的标记探针或引物。
使用标记探针与靶核酸之间杂交的方法的实例包括：使用具有发夹结构的双标记探针的分子信标方法(Tyagi等人，Nature Biotechnology v.14MARCH 1996)、HyBeacon方法(French D J等人，Mol.Cell Probes,15(6):363-374(2001))、使用分别被标记为供体和受体的两种探针的杂交探针方法(Bernard等人，147-148Clin.Chem.2000；46)和使用单一标记寡核苷酸的Lux方法(美国专利号7,537,886)。利用通过DNA聚合酶的5’-核酸酶活性切割双标记探针的TaqMan方法(美国专利号5,210,015和5,538,848)也广泛用于本技术领域。
使用标记引物的方法的实例包括日出引物(Sunrise primer)方法(Nazarenko等人，2516-2521Nucleic Acids Research,1997,v.25no.12和美国专利号6,117,635)、蝎子引物(Scorpion primer)方法(Whitcombe等人，804-807,Nature Biotechnologyv.17AUGUST 1999和美国专利号6,326,145)和TSG引物方法(WO 2011/078441)。
由于上述传统实时检测技术只能每个标记检测单个靶核酸，因此在单个反应中可以同时检测的靶核酸数量受到可以使用的标记数量的限制(例如，5种或更少)。
尽管熔融分析可用于通过使用单一标记来检测多种靶核酸，但是其缺陷是与实时检测技术相比，需要更长的操作时间，并且随着靶核酸数量的增加，设计具有不同Tm值的探针变得越来越具有挑战性。
因此，在检测多种靶核酸时，传统的实时检测技术或熔融分析方法存在局限性。
因此，需要一种实时检测方法，该方法能够在一个反应中同时检测多种靶核酸，即使使用的标记数量有限。
本申请通篇引用了各种专利和出版物，并在括号中提供了引用出处。为了更全面地描述本发明和本发明所涉及的技术领域的现状，在此将这些专利和出版物的公开内容通过引用整体并入本公开。
发明内容
本公开的技术问题
本发明人致力于开发一种使用单一类型标记实时检测多种靶核酸的方法。因此，我们建立了一种新的靶核酸检测方案，该方案涉及探针杂交、酶促反应(如5’核酸切割和延伸)以及使用标记部分杂交寡核苷酸(Labeled Portion Hybridizing Oligonucleotide，LPHO)检测延伸的双链体。本方案确保能以更高的准确性和便利性检测一种或多种靶核酸。
因此，本公开的一个目的是提供一种通过LPHO辅助PTO切割和延伸(L-PTOCE)测定检测样品中的靶核酸的方法。
本公开的另一个目的是提供一种用于检测样品中的靶核酸的组合物。
本公开的另一个目的是提供一种用于检测样品中的n种靶核酸的方法。
本公开的另一个目的是提供一种使用标记部分杂交寡核苷酸(LPHO)检测样品中的靶核酸的方法。
结合所附权利要求和附图，通过以下详细说明，本发明的其他目的和优点将变得更为明显。
技术方案
根据本公开的一个方面中，提供了一种用于通过LPHO辅助PTO切割和延伸(L-PTOCE)测定在样品中检测靶核酸的方法，其包括：
(a)将引物以及探测和标记寡核苷酸(Probing and Tagging Oligonucleotide，PTO)与靶核酸杂交；
其中所述引物包含与所述靶核酸的第一区域杂交的核苷酸序列，
其中在5’至3’方向所述PTO包含：(i)5’标记(tagging)部分，和(ii)3’靶向(targeting)部分，
其中所述3’靶向部分包含与所述靶核酸的第二区域杂交的核苷酸序列，以及当所述3’靶向部分与所述靶核酸的第二区域杂交时，所述5’标记部分包含不与所述靶核酸杂交的核苷酸序列，
其中所述引物位于PTO上游；
(b)在切割PTO的条件下，将步骤(a)的所得物与具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶接触；
其中将所述引物延伸以诱导通过具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶切割所述PTO，以使得切割释放包含PTO的5’标记部分的片段；
(c)将从所述PTO释放的片段与捕获和模板寡核苷酸(Capturing and TemplatingOligonucleotide，CTO)杂交；
其中在3’至5’方向所述CTO包含：(i)捕获部分，其包含与所述PTO的5’标记部分杂交的核苷酸序列，和(ii)模板部分，其包含不与所述PTO的5’标记部分和3’靶向部分杂交的核苷酸序列，
其中所述CTO具有限定标记部分的报告分子和淬灭分子，
其中将所述片段与CTO的捕获部分杂交；
(d)在存在标记部分杂交寡核苷酸(LPHO)的情况下，使用步骤(c)的所得物和具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶进行延伸反应；
其中所述LPHO包含与所述CTO的标记部分杂交的核苷酸序列，
其中当在所述样品中存在靶核酸时，与所述CTO的捕获部分杂交的所述片段被延伸以产生与所述CTO互补的延伸链，从而在所述延伸链和所述CTO之间产生延伸的双链体，其中所述延伸的双链体的产生阻止在所述CTO的标记部分和所述LPHO之间形成CTO/LPHO杂交体，
其中当在样品中不存在靶核酸时，不产生延伸链，而是替代地形成所述CTO/LPHO杂交体，
其中所述延伸的双链体具有与CTO/LPHO杂交体的熔融温度(Tm)不同的Tm；以及
(e)检测延伸的双链体的存在；
其中通过测量由延伸的双链体提供的信号检测所述延伸的双链体，
其中在由延伸的双链体提供的信号强度不同于由CTO/LPHO杂交体提供的信号强度时的温度下进行所述测量，以及
其中存在所述延伸的双链体指示存在所述靶核酸。
在一个实施方案中，通过以下方式产生延伸的双链体：(i)在CTO的标记部分与LPHO杂交之前延伸与CTO的捕获部分杂交的片段，(ii)在CTO的标记部分和LPHO之间杂交时延伸与CTO的捕获部分杂交的片段从而切割LPHO，或者(iii)(i)和(ii)二者。
在一个实施方案中，通过优先在延伸链和CTO之间的杂交，而不是CTO的标记部分和LPHO之间的杂交，延伸的双链体的产生阻止了CTO/LPHO杂交体的形成。
在一个实施方案中，通过在步骤(d)的延伸期间切割LPHO，延伸的双链体的产生阻止形成CTO/LPHO杂交体。
在一个实施方案中，当CTO未与延伸链或LPHO杂交时，在CTO上的报告分子和淬灭分子彼此之间非常接近，从而使淬灭分子淬灭来自报告分子的信号。
在一个实施方案中，当CTO与延伸链或LPHO杂交时，在CTO上的报告分子和淬灭分子是分离的，从而使淬灭分子不淬灭来自报告分子的信号。
在一个实施方案中，(i)报告分子和淬灭分子两者连接至CTO的捕获部分，(ii)报告分子和淬灭分子两者连接至CTO的模板部分，或者(iii)报告分子和淬灭分子中的一个连接至CTO的捕获部分，另一个连接至CTO的模板部分。
在一个实施方案中，LPHO与CTO的标记部分的完整或部分序列杂交，以及在CTO上的报告分子和淬灭分子被分离，从而使得淬灭分子不能淬灭来自报告分子的信号。
在一个实施方案中，延伸的双链体的Tm比CTO/LPHO杂交体的Tm高至少3℃。
在一个实施方案中，可以通过以下方式调节延伸的双链体的Tm：(i)片段的序列和/或长度，(ii)CTO的序列和/或长度，或(iii)片段的序列和/或长度和CTO的序列和/或长度，以及可通过LPHO的序列和/或长度调节CTO/LPHO杂交体的Tm。
在一个实施方案中，LPHO包含与CTO杂交的片段竞争的核苷酸序列。
在一个实施方案中，LPHO不被片段或其延伸产物切割。
在一个实施方案中，LPHO包含不与CTO杂交的片段竞争的核苷酸序列。
在一个实施方案中，LPHO被片段或其延伸产物切割。
在一个实施方案中，用于测量的温度依赖于延伸的双链体的Tm和CTO/LPHO杂交体的Tm。
在一个实施方案中，在存在多个PTO、多个CTO和多个LPHO的情况下进行该方法，以及重复步骤(a)-(e)，在重复循环之间变性。
在一个实施方案中，用于测量的温度允许(i)至少一个延伸的双链体保持其双链状态和(ii)至少一个CTO/LPHO杂交体解离成单链状态。
根据本公开的另一方面，提供了用于检测样品中靶核酸的组合物，其包含：
(a)引物；
其中所述引物包含与所述靶核酸的第一区域杂交的核苷酸序列，
(b)探测和标记寡核苷酸(PTO)；
其中在5’至3’方向所述PTO包含：(i)5’标记部分，和(ii)3’靶向部分，
其中所述3’靶向部分包含与所述靶核酸的第二区域杂交的核苷酸序列，以及当所述3’靶向部分与所述靶核酸的第二区域杂交时，所述5’标记部分包含不与所述靶核酸杂交的核苷酸序列，
其中所述引物位于所述PTO上游，
其中将所述引物延伸以诱导通过具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶切割所述PTO，以使得所述切割释放包含PTO的5’标记部分的片段；
(c)捕获和模板寡核苷酸(CTO)；
其中在3’至5’方向所述CTO包含：(i)捕获部分，其包含与所述PTO的5’标记部分杂交的核苷酸序列，和(ii)模板部分，其包含不与所述PTO的5’标记部分和3’靶向部分杂交的核苷酸序列，
其中所述CTO具有限定标记部分的报告分子和淬灭分子，
其中将所述片段与所述CTO的捕获部分杂交；以及
(d)标记部分杂交寡核苷酸(LPHO)；
其中所述LPHO包含与所述CTO的标记部分杂交的核苷酸序列，
其中当在所述样品中存在靶核酸时，与所述CTO的捕获部分杂交的片段被延伸以产生与所述CTO互补的延伸链，从而在所述延伸链和所述CTO之间产生延伸的双链体，其中所述延伸的双链体的产生阻止在所述CTO的标记部分和所述LPHO之间形成CTO/LPHO杂交体，
其中当在样品中不存在靶核酸时，不产生延伸链，而是替代地形成所述CTO/LPHO杂交体，
其中所述延伸的双链体的熔融温度(Tm)不同于所述CTO/LPHO杂交体的Tm。
在一个实施方案中，当CTO未与延伸链或LPHO杂交时，在CTO上的报告分子和淬灭分子彼此之间非常接近，从而使淬灭分子淬灭来自报告分子的信号。
在一个实施方案中，当CTO与延伸链或LPHO杂交时，在CTO上的报告分子和淬灭分子分离，从而使淬灭分子不淬灭来自报告分子的信号。
在一个实施方案中，(i)报告分子和淬灭分子两者连接至CTO的捕获部分，(ii)报告分子和淬灭分子两者连接至CTO的模板部分，或者(iii)报告分子和淬灭分子中的一个连接至CTO的捕获部分，另一个连接至CTO的模板部分。
在一个实施方案中，LPHO与CTO的标记部分的完整或部分序列杂交，以及在CTO上的报告分子和淬灭分子被分离，从而使得淬灭分子不淬灭来自报告分子的信号。
在一个实施方案中，LPHO包含与CTO杂交的片段竞争的核苷酸序列。
在一个实施方案中，LPHO包含不与CTO杂交的片段竞争的核苷酸序列。
在一个实施方案中，组合物提供依赖于靶核酸的存在的信号。
在一个实施方案中，依赖于靶核酸的存在的信号是由延伸的双链体提供的信号。
在一个实施方案中，组合物具有信号变化温度范围(SChTR)，其中信号变化依赖于靶核酸的存在，以及两个信号恒定温度范围(SCoTR)，其中即使在存在靶核酸的情况下，信号也是恒定的。
在一个实施方案中，信号变化温度范围高于两个信号恒定温度范围的第一信号恒定温度范围并且低于两个信号恒定温度范围的第二信号恒定温度范围。
在一个实施方案中，在靶核酸存在时，在信号变化温度范围内的温度下，延伸的双链体保持其双链状态，CTO/LPHO杂交体解离成单链状态。
根据本公开的另一方面，提供了一种检测样品中n种靶核酸的方法，包括：
(a)在n种检测温度下检测信号，同时在反应容器中孵育用于检测n种靶核酸的n种组合物与疑似含有n种靶核酸中的至少一个的样品；
其中n是2或更大的整数，
其中孵育包括多个反应循环，并且在多个反应循环的至少一个中进行信号检测，
其中在存在相应靶核酸时，用于检测靶核酸的n种组合物中的每一种在n种检测温度中的相应检测温度下提供信号变化，所述信号变化表明存在相应靶核酸，
其中在用于检测n种靶核酸的n种组合物中，在存在第i靶核酸时，用于检测第i靶核酸的组合物在n种检测温度中的第i检测温度下提供信号变化，并在其他检测温度下提供恒定信号，所述信号变化表明存在第i靶核酸，
其中i表示从1至n的整数，以及第i检测温度低于第(i+1)检测温度，
其中在覆盖全部n种检测温度的温度范围内，用于检测第i靶核酸的组合物具有信号变化温度范围(SChTR)，其中信号变化依赖于第i靶核酸的存在，以及一个或两个信号恒定温度范围(SCoTR)，其中即使存在第i靶核酸，信号也是恒定的，
其中用于检测第i靶核酸的组合物是以下任一种：
(i)Under信号变化型(UnderSC型)组合物，其具有信号变化温度范围低于信号恒定温度范围的熔融特征，
(ii)Inter信号变化型(InterSC型)组合物，其具有信号变化温度范围高于两个信号恒定温度范围中的一个并且低于两个信号恒定温度范围中的另一个的熔融特征，以及
(iii)Over信号变化型(OverSC型)组合物，其具有信号变化温度范围高于信号恒定温度范围的熔融特征，以及
其中用于检测n种靶核酸的n种组合物的至少一种是(ii)根据上文所述的L-PTOCE测定产生信号的InterSC型组合物，以及
(b)根据在步骤(a)中检测到的信号确定n种靶核酸的存在，其中通过在第i检测温度下检测到的信号变化确定第i靶核酸的存在。
在一个实施方案中，第i检测温度选自用于检测第i靶核酸的组合物的信号变化温度范围，其中第i检测温度不包含在在用于检测其他靶核酸的组合物的信号变化温度范围内。
在一个实施方案中，用于检测第i靶核酸的组合物的信号变化温度范围部分地与用于检测具有相邻检测温度的靶核酸的组合物的信号变化温度范围重叠，而不与用于检测具有不与其相邻的检测温度的靶核酸的组合物的信号变化温度范围重叠。
在一个实施方案中，当n是2时，用于检测第一靶核酸的组合物是UnderSC型组合物或InterSC型组合物，并且用于检测第二靶核酸的组合物是InterSC型组合物或OverSC型组合物。
在一个实施方案中，当n是3或更大时，用于检测第一靶核酸的组合物是UnderSC型组合物或InterSC型组合物，用于检测第n靶核酸的组合物是InterSC型组合物或OverSC型组合物，并且用于检测第一靶核酸和第n靶核酸以外的靶核酸的各组合物是InterSC型组合物。
在一个实施方案中，用于检测第i靶核酸的组合物包含提供依赖于第i靶核酸存在的信号的标记。
在一个实施方案中，在孵育过程中，标记与寡核苷酸连接或并入寡核苷酸中。
在一个实施方案中，用于检测第i靶核酸的组合物提供双链体，所述双链体提供信号变化。
在一个实施方案中，提供信号变化的双链体最初已经包含于用于检测第i靶核酸的组合物中。
在一个实施方案中，提供信号变化的双链体通过标记的寡核苷酸和可与标记的寡核苷酸杂交的寡核苷酸之间的杂交而产生。
在一个实施方案中，提供信号变化的双链体在孵育期间产生。
在一个实施方案中，提供信号变化的双链体通过标记的寡核苷酸和相应靶核酸之间的杂交而产生。
在一个实施方案中，提供信号变化的双链体通过依赖于相应靶核酸的存在的切割反应而产生。
在一个实施方案中，提供信号变化的双链体包含标记。
在一个实施方案中，用于检测第i靶核酸的组合物提供双链体，所述双链体提供信号变化，并且用于检测第i靶核酸的组合物的信号变化温度范围依赖于双链体的长度和/或序列而变化。
在一个实施方案中，在多个反应循环中的至少两个循环进行信号检测。
在一个实施方案中，使用在多个反应循环中的至少两个循环检测到的信号来测量信号变化。
在一个实施方案中，使用在多个反应循环中的至少一个反应循环检测到的信号和参考信号值来测量在第i检测温度下的信号变化。
在一个实施方案中，在不存在第i靶核酸时从反应中获得参考信号值。
在一个实施方案中，使用单一类型的检测器在n种检测温度的每一种下进行信号检测。
在一个实施方案中，在n种检测温度下通过单一类型的检测器检测到的信号不会彼此不同。
在一个实施方案中，孵育包含核酸扩增反应。
根据本公开的另一个方面，提供一种使用标记部分杂交寡核苷酸(LPHO)检测样品中的靶核酸的方法，包括：
(a)依赖于在样品中靶核酸的存在，提供通过寡核苷酸的酶切割反应产生的片段；
(b)将所述片段与捕获和模板寡核苷酸(CTO)杂交；
其中在3’至5’方向CTO包含：(i)捕获部分，其包含与所述片段杂交的核苷酸序列，和(ii)模板部分，其包含不与所述片段杂交的核苷酸序列，
其中所述CTO具有限定标记部分的报告分子和淬灭分子，
其中将所述片段与CTO的捕获部分杂交；
(c)在LPHO存在时使用步骤(b)的所得物和具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶进行延伸反应；
其中所述LPHO包含与所述CTO的标记部分杂交的核苷酸序列，
其中当在所述样品中存在靶核酸时，与所述CTO的捕获部分杂交的所述片段被延伸以产生与所述CTO互补的延伸链，从而在所述延伸链和所述CTO之间产生延伸的双链体，其中所述延伸的双链体的产生阻止在所述CTO的标记部分和所述LPHO之间形成CTO/LPHO杂交体，
其中当在样品中不存在靶核酸时，不产生延伸链，而是替代地形成所述CTO/LPHO杂交体，
其中所述延伸的双链体具有与CTO/LPHO杂交体的熔融温度(Tm)不同的Tm；以及
(d)检测延伸的双链体的存在；
其中通过测量由延伸的双链体提供的信号检测所述延伸的双链体，
其中在来自延伸的双链体的信号强度不同于来自CTO/LPHO杂交体的信号强度的温度下进行测量，以及
其中存在延伸的双链体指示存在靶核酸。
发明的有利效果
本公开的特征和优点将总结如下:
(a)本公开的第一个特征是利用(i)与靶核酸杂交的PTO，(ii)具有限定标记部分的报告分子和猝灭分子的CTO，该CTO能够在靶核酸存在时生成延伸的双链体，以及(iii)包含与CTO的标记部分杂交的核苷酸序列的LPHO，用于检测靶核酸。特别地，在CTO与另一寡核苷酸(如LPHO或延伸链)杂交之前，CTO上的报告分子和淬灭分子彼此非常接近，淬灭分子淬灭来自报告分子的信号。然而，当CTO与另一寡核苷酸(如LPHO或延伸链)杂交时，CTO上的报告分子和淬灭分子被分离，导致淬灭分子不淬灭来自报告分子的信号。
(b)本公开的第二个特征是CTO/LPHO杂交体具有可由LPHO的序列和/或长度调节的Tm，以及延伸的双链体具有可由(i)片段的序列和/或长度，(ii)CTO的序列和/或长度或(iii)片段的序列和/或长度和CTO的序列和/或长度调节的Tm。通过使用该特征，CTO/LPHO杂交体的Tm和延伸的双链体的Tm可以预先确定为彼此不同。这两个不同的Tm值允许根据本公开的用于检测靶核酸的组合物具有信号变化温度范围(在其中信号依赖于靶核酸的存在而变化)和两个信号恒定温度范围(在其中即使在存在靶核酸的情况下，信号也是恒定的)。
(c)根据本公开的组合物，作为InterSC型组合物，能够在单个反应容器中使用单一类型的标记检测一种或多种靶核酸。具体而言，当使用多种组合物检测多种靶核酸时，通过调节用于检测多种靶核酸的组合物中的每种的信号变化温度范围，特别是通过调节信号变化温度范围使其不相互重叠，可以使用单一类型的标记实时检测多种靶核酸。此外，与使用单一类型标记检测多种靶核酸的靶扩增后的常规熔融分析相比，本公开的方法具有显著减少其分析时间的优点。
(d)此外，根据本公开的方法在检测核苷酸变异方面的有效的，其假阳性发生率低。
附图说明
图1显示了本公开的L-PTOCE测定。
图2A显示了各种实施方案，其中与CTO标记部分杂交的LPHO和与CTP的捕获部分杂交的PTO片段完全(ii、iii、iv或vi)或部分(i或v)重叠。
图2B显示了各种实施方案，其中与CTO标记部分杂交的LPHO不和与CTO的捕获部分杂交的PTO片段重叠。
图3显示了在没有靶核酸的情况下或在靶核酸与L-PTOCE组合物反应之前，CTO和LPHO(即，CTO/LPHO杂交体)在(i)第一信号恒定温度范围、(ii)信号变化温度范围以及(iii)第二信号恒定温度范围的构象变化；
图4显示了靶核酸和L-PTOCE组合物反应后，CTO和延伸链(即，延伸的双链体)在(i)第一信号恒定温度范围、(ii)信号变化温度范围以及(iii)第二信号恒定温度范围的构象变化。
图5A显示了在L-PTOCE测定的步骤(a)-(e)的初始、中间和后期循环中CTO/LPHO杂交体和延伸的双链体的量(或丰度)的比率，以及其熔融曲线。
图5B表示图5A中的三条熔融曲线重叠的图。
图6显示了实施例1的组合1的实时PCR结果。
图7显示了实施例1的组合2的实时PCR结果。
图8显示了实施例1的组合3的实时PCR结果。
图9显示了实施例1的组合4的实时PCR结果。
图10显示了在实施例2中针对核苷酸变异检测的实时RT-PCR结果。
图11示意性地显示了在实施例3中使用的两种组合物(UnderSC型组合物和InterSC型组合物)的信号生成机制。
图12显示了在实施例3中的多重实时PCR结果。
具体实施方式
本发明人致力于开发一种使用单一类型标记实时检测多种靶核酸的方法。因此，我们建立了一种新的靶核酸检测方案，涉及探针杂交、酶促反应(如5’核酸切割和延伸)以及使用标记部分杂交寡核苷酸(LPHO)检测延伸的双链体。本方案确保能以更高的准确性和便利性检测一种或多种靶核酸。
I.用于通过L-PTOCE测定检测靶核酸的方法
在本公开的第一个方面中，提供了一种用于通过LPHO辅助PTO切割和延伸(L-PTOCE)测定在样品中检测靶核酸的方法，其包括：
(a)将引物以及探测和标记寡核苷酸(PTO)与靶核酸杂交；
其中所述引物包含与所述靶核酸的第一区域杂交的核苷酸序列，
其中在5’至3’方向所述PTO包含：(i)5’标记部分，和(ii)3’靶向部分，
其中所述3’靶向部分包含与所述靶核酸的第二区域杂交的核苷酸序列，以及当所述3’靶向部分与所述靶核酸的第二部分杂交时，所述5’标记部分包含不与所述靶核酸杂交的核苷酸序列，
其中所述引物位于所述PTO上游；
(b)在切割PTO的条件下，将步骤(a)的所得物与具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶接触；
其中将所述引物延伸以诱导通过具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶切割所述PTO，以使得切割释放包含PTO的5’标记部分的片段；
(c)将从所述PTO释放的片段与捕获和模板寡核苷酸(CTO)杂交；
其中在3’至5’方向所述CTO包含：(i)捕获部分，其包含与所述PTO的5’标记部分杂交的核苷酸序列，和(ii)模板部分，其包含不与所述PTO的5’标记部分和3’靶向部分杂交的核苷酸序列，
其中所述CTO具有限定标记部分的报告分子和淬灭分子，
其中将所述片段与CTO的捕获部分杂交；
(d)在存在标记部分杂交寡核苷酸(LPHO)的情况下，使用步骤(c)的所得物和具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶进行延伸反应；
其中所述LPHO包含与所述CTO的标记部分杂交的核苷酸序列，
其中当在所述样品中存在靶核酸时，与所述CTO的捕获部分杂交的所述片段被延伸以产生与所述CTO互补的延伸链，从而在所述延伸链和所述CTO之间产生延伸的双链体，其中所述延伸的双链体的产生阻止在所述CTO的标记部分和所述LPHO之间形成CTO/LPHO杂交体，
其中当在样品中不存在靶核酸时，不产生延伸链，而是替代地形成所述CTO/LPHO杂交体，
其中所述延伸的双链体具有与CTO/LPHO杂交体的熔融温度(Tm)不同的Tm；以及
(e)检测延伸的双链体的存在；
其中通过测量由延伸的双链体提供的信号检测所述延伸的双链体，
其中在由延伸的双链体提供的信号强度不同于由CTO/LPHO杂交体提供的信号强度时的温度下进行所述测量，以及
其中存在所述延伸的双链体指示存在所述靶核酸。
在描述本公开的组成部分时，可以使用诸如“第一”、“第二”、“A”、“B”、“(a)、“(b)”、“(i)”和“(ii)”的表示法。提供这些表示法仅是为了将一个组成部分与另一个组成部分区分开来，组成部分的本质不受表示顺序或序列的限制。
根据本公开的方法采用探针杂交发生的连续事件，即，PTO的切割和延伸；产生延伸的双链体；以及使用LPHO检测延伸的双链体，将其称为“LPHO辅助的PTO切割和延伸(L-PTOCE)”测定。
图1中示意性地示出了本公开的L-PTOCE测定。L-PTOCE测定将更详细地描述如下：
步骤(a)：引物和PTO与靶核酸的杂交
根据本公开，将在样品中的靶核酸与引物和PTO(探测和标记寡核苷酸)杂交。
如本文所用，术语“靶核酸”、“靶核酸序列”或“靶序列”是指待检测或待定量的核酸序列。靶核酸序列包括单链以及双链。靶核酸序列不仅包括在反应中新产生的序列，还包括最初存在于核酸样品中的序列。
靶核酸包括任何DNA(gDNA和cDNA)和RNA分子及其杂交体(嵌合核酸)。序列可以是双链或单链形式。
靶核酸包括任何天然存在的原核核酸、真核(例如原生动物和寄生虫、真菌、酵母、高等植物、低等动物和高等动物，包括哺乳动物和人)核酸或病毒(例如，疱疹病毒、HIV、流感病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、肝炎病毒、脊髓灰质炎病毒等)核酸或类病毒核酸。此外，核酸分子可以是通过重组产生的或通过重组可产生的任何核酸分子，或者是化学合成的或可以化学合成的任何核酸分子。这样，核酸序列可以存在或不存在于自然界中。靶核酸序列可以是已知的或未知的。
如在本文中所使用的，术语“样品”是指来自生物来源的细胞、组织或液体，或可以证明对本发明有用的任何其他介质，并且包括病毒、细菌、组织、细胞、血液、血清、血浆、淋巴液、乳汁、尿液、粪便、眼内液体、唾液、精液、脑提取物、脊髓液、阑尾、脾和扁桃体组织提取物、羊水、腹水和非生物样品(例如，食物和水)。此外，样品包括从生物来源分离的天然存在的核酸分子以及合成的核酸分子。
如在本文中所使用的，术语“引物”是指一种寡核苷酸，当放置在诱导合成与靶核酸链(模板)互补的引物延伸产物的条件下时，即，在存在核苷酸和聚合剂(如DNA聚合酶)时，并在合适的温度和pH下，所述寡核苷酸能够作为合成的起点。引物必须足够长，以便在存在聚合剂时引发(prime)合成延伸产物。引物的合适长度依赖于多种因素，包括温度、应用领域和引物的来源。
如在本文中所使用的术语“探针”指包含靶核酸序列的一个或多个杂交部分的单链核酸分子。在此处，PTO作为探针。
特别地，探针和引物是单链脱氧核糖核苷酸分子。在本发明中使用的探针或引物可以包含天然存在的dNMP(即，dAMP、dGM、dCMP和dTMP)、修饰的核苷酸或非天然存在的核苷酸。探针或引物还可以包括核糖核苷酸。
如在本文中所使用的术语“退火”或“引发(priming)”指寡脱氧核苷酸或核酸与模板核酸的并置，由此并置使聚合酶能够将核苷酸聚合成与模板核酸或其一部分互补的核酸分子。
如在本文中所使用的术语“杂交(hybridize)”、“杂交(hybridizing)”或“杂交(hybridization)”指在某些杂交条件或严格条件下，两个互补的单链多核苷酸之间通过非共价键结合形成双链。
杂交可以发生在两条完全匹配或基本匹配但存在一些错配(例如，1-4个错配)的核酸链之间。杂交的互补性可能依赖于杂交条件，特别是温度。
靶核酸与引物和PTO的杂交可以在通过优化程序常规确定的合适杂交条件下进行。温度、组分浓度、杂交和洗涤时间、缓冲液组分及其pH值和离子强度等条件可能因各种因素而异，包括寡核苷酸(引物和PTO)以及靶核苷酸序列的长度和GC含量。例如，当使用相对较短的寡核苷酸时，优选采用低严格条件。杂交的详细条件可以参见Joseph Sambrook等人，Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2001)；和M.L.M.Anderson,Nucleic Acid Hybridization,Springer-Verlag New York Inc.(1999)。
术语“退火”和“杂交”之间没有明显区别，这些术语可以互换使用。
在一个实施方案中，在本公开中使用的引物包括与靶核酸的第一区域杂交的核苷酸序列。
特别地，本文中一种寡核苷酸(例如，引物或PTO)包含与另一种寡核苷酸(如靶核酸)“杂交的核苷酸序列”的表述意味着一种寡核苷酸的全部或部分具有与另一个寡核苷酸的全部或者部分杂交所需的互补核苷酸序列。此外，当提及一种寡核苷酸的一部分与另一种寡核苷酸杂交时，可以将一种寡核苷酸的该部分认为是单个寡核苷酸。
术语“互补”在本文中用于表示引物或探针在指定的退火条件或严格条件下具有足够的互补性，可以选择性地与靶核酸杂交，其包括术语“基本互补”和“完全互补”，特别是完全互补。
相比之下，术语“非互补”在本文中用于表示引物或探针足够非互补，在指定的退火条件或严格条件下不会选择性地与靶核酸杂交，其包括术语“基本非互补”和“完全非互补”，特别是完全非互补。
如在本文中所使用的，术语“探测和标记寡核苷酸(PTO)”指一种寡核苷酸，其在5’至3’方向上包含：(i)5’标记部分和(ii)3’靶向部分，以及其中3’靶向部分包含与靶核苷酸的第二区域杂交的核苷酸序列，和当3’靶向部分与靶核酸的第二区域杂交时，5’标记部分包含不与靶核酸杂交的核苷酸序列。
在一个实施方案中，PTO在5’至3’方向上包含：(i)5’标记部分，其包含不与靶核酸杂交的核苷酸序列和(ii)3’靶向部分，其包含与靶核酸的第二区域杂交的核苷酸序列；其中PTO的5’标记部分不与靶核酸杂交，但是PTO的3’靶向部分与靶核苷酸杂交。换言之，PTO包含如下所示的两部分：(i)作为探针的3’靶向部分和(ii)5’标记部分，其在与靶核酸杂交后从PTO中核酸断裂(nucleolytically)释放出来。PTO中的5’标记部分和3’靶向部分必须按照5’至3’的顺序定位。
在本文中一种寡核苷酸(例如，PTO的5’标记部分)包含不与另一种寡核苷酸(例如，靶核酸)“杂交的核苷酸序列”的表述意味着一种寡核苷酸具有不与另一种寡核苷酸杂交所需的非互补核苷酸序列。
在一个实施方案中，步骤(a)中的杂交在严格条件下进行，以使得PTO的3’靶向部分与靶核酸的第二区域杂交，以及PTO的5’标记部分不与靶核酸杂交。
PTO不需要任何特定长度。例如，PTO的长度可以是15-150个核苷酸、15-100个核苷酸、15-80个核苷酸、15-60个核苷酸、15-40个核苷酸、20-150个核苷酸、20-100个核苷酸、20-80个核苷酸、20-60个核苷酸、20-50个核苷酸、30-150个核苷酸、30-100个核苷酸、30-80个核苷酸、30-60个核苷酸、30-50个核苷酸、35-100个核苷酸、35-80个核苷酸、35-60个核苷酸或35-50个核苷酸。
PTO的3’靶向部分可以是任何长度，只要其与靶核酸序列特异性杂交即可。例如，PTO的3’靶向部分的长度可以是10-100个核苷酸、10-80个核苷酸、10-50个核苷酸、10-40个核苷酸、10-30个核苷酸、15-100个核苷酸、15-80个核苷酸、15-50个核苷酸、15-40个核苷酸、15-30个核苷酸、20-100个核苷酸、20-80个核苷酸、20-50个核苷酸、20-40个核苷酸或20-30个核苷酸。
5’标记部分可以是任何长度，只要其与CTO的模板部分特异性杂交，然后延伸即可。例如，PTO的5’标记部分的长度可以是5-50个核苷酸、5-40个核苷酸、5-30个核苷酸、5-20个核苷酸、10-50个核苷酸、10-40个核苷酸、10-30个核苷酸、10-20个核苷酸、15-50个核苷酸、15-40个核苷酸、15-30个核苷酸或15-20个核苷酸。
在一个实施方案中，PTO的3’末端可以具有3’-OH末端。特别地，PTO的3’末端被“封闭(blocked)”以禁止其延伸。
封闭可以根据常规方法实现。例如，封闭可以通过向最后一个核苷酸的3’羟基基团添加化学部分进行，如添加生物素、标记、磷酸基团、烷基、非核苷酸接头、硫代磷酸酯或烷二醇。或者，封闭可以通过去除最后一个核苷酸的3’羟基或使用没有3’羟基的核苷酸如双脱氧核苷酸来进行。
或者，可以将PTO设计为具有发夹结构。
PTO的5’标记部分和靶核酸之间的非杂交指在某些杂交条件下，它们之间没有形成稳定的双链。在一个实施方案中，PTO的5’标记部分不参与与靶核酸的杂交，形成单链。
在本公开中使用的引物指位于PTO上游的上游引物。当靶核酸是双链时，引物和PTO与双链靶核酸的一条链杂交，PTO位于引物下游。引物与靶核酸链中相对于与PTO杂交的靶核酸链的部分(即，靶核酸的第二区域)在3’方向上的特定部分(即，靶核酸的第一区域)杂交。
在一个实施方案中，当靶核酸是双链时，双链靶核酸的一条链包含靶核酸的第一区域和第二区域。特别地，双链靶核酸的一条链在3’至5’方向上包含：(i)与引物杂交的第一区域；和(ii)与PTO杂交的第二区域。
在一个实施方案中，在存在附加引物的情况下进行该方法。附加引物另外产生与PTO杂交的靶核酸，提高了靶点检测的灵敏度。也可以将附加引物称为下游引物。
在一个实施方案中，当使用引物和附加引物时，另外使用模板依赖性核酸聚合酶来延伸引物。也可以将引物和附加引物分别称为正向引物和反向引物。
在一个实施方案中，PTO的引物、附加引物和/或5’标记部分具有双重引发寡核苷酸(dual priming oligonucleotide,DPO)结构。与常规引物和探针相比，具有DPO结构的寡核苷酸显示出显著提高的靶特异性(参见WO 2006/095981；Chun等人，Dual primingoligonucleotide system for the multiplex detection of respiratory viruses andSNP genotyping of CYP2C19 gene,Nucleic Acid Research,35:6e40(2007))。
在一个实施方案中，PTO的3’靶向部分具有修饰的双特异性寡核苷酸(mDSO)结构。与常规探针相比，修饰的双特异性寡核苷酸(mDSO)结构显示出显著改善的靶特异性(参见WO 2011/028041)。
步骤(b)：从PTO切割释放片段
然后，在PTO切割条件下，将步骤(a)的所得物与具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶接触。将引物延伸以通过具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶诱导PTO切割，以使得该切割释放包含PTO的5’标记部分的片段。
在一个实施方案中，引物的延伸通过具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶诱导PTO切割。特别地，引物与靶核酸的第一区域杂交，其位于远离PTO的位置，具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶促进引物延伸，以及与延伸产物结合的具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶切割PTO。
在另一个实施方案中，引物与靶核酸的第一区域杂交，其位于PTO附近，以使得其足以通过具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶诱导PTO切割，以及与引物结合的具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶切割PTO，而没有延伸反应。
因此，诱导PTO切割可以通过两种不同方式实现：引物延伸依赖性切割诱导；和(ii)不依赖于引物延伸的切割诱导。
根据所选的切割诱导方式，引物可以相对于PTO定位。引物可以远离PTO，以使得其足以以延伸依赖性的方式诱导PTO切割。换言之，靶核酸的第一区域和第二区域可以彼此分开。或者，引物可以位于PTO附近，以使得其足以凭借不依赖于延伸的方式诱导PTO切割。换言之，靶核酸的第一区域和第二区域可以彼此非常接近。
如在本文中所使用的涉及位置或地点的术语“邻近”，是指位于与PTO的3’靶向部分邻近的引物，以形成缺口。此外，该术语指位于与PTO的3’靶向部分距离1-30个核苷酸、1-20个核苷酸或1-15个核苷酸的引物。
如在本文中所使用的，涉及位置或地点的术语“处于远离位置”，包括足以确保延伸反应的任何位置或地点。
在一个实施方案中，引物位于远离PTO的位置，其足以以延伸依赖性方式诱导PTO切割。
在一个实施方案中，用于引物切割反应的常规技术可以应用于本发明，只要与靶核酸的第一区域杂交的引物诱导与靶核酸的第二区域杂交的PTO切割，以释放包含PTO的5’标记部分或5’标记部分的一部分的片段。例如，可以将美国专利号5,210,015、5,487,972、5,691,142、5,994,069和7,381,532以及美国申请公开号2008-0241838应用于本发明。
如在本文中所使用的，短语“PTO切割条件”指足以通过具有5’核酸酶活性的酶(例如，具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶)消化与靶核酸杂交的PTO的条件，如温度、pH、离子强度、缓冲液、寡核苷酸的长度和序列以及酶。例如，当将Taq DNA聚合酶用作具有5’核酸酶活性的酶时，用于切割PTO的条件包括Tris-HCl缓冲液、KCl、MgCl2和温度。
当PTO与靶核酸杂交时，其3’靶向部分参与杂交，并且其5’标记部分形成不与靶核酸杂交的单链(参见图1)。这样，包含单链结构和双链结构两者的寡核苷酸可以通过本领域公知的各种技术使用具有5’核酸酶活性的酶消化。
PTO的切割位点因引物类型、引物的杂交位点和切割条件而异(参见美国专利号5,210,015、5,487,972、5,691,142、5,994,069和7,381,532以及美国申请公开号2008-0241838)。
多种常规技术可用于PTO的切割反应，释放包含5’标记部分或5’标记部分的一部分的片段。
简言之，在步骤(b)中可能有三个切割位点。第一个切割位点是PTO的杂交部分(3’靶向部分)和非杂交部分(5’标记部分)之间的连接位点(junction site)。第二个切割位点是位于在3’方向上距PTO的5’标记部分的3’末端几个核苷酸的位点。第二个切割位点位于PTO的3’靶向部分的5’末端部分。第三个切割位点是位于在5’方向上距PTO的5’标记部分的3’末端几个核苷酸的位点。
在一个实施方案中，引物延伸后，具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶切割PTO的初始位点是PTO和靶核酸之间双链的起点，或者是距离起点1-3个核苷酸的位点。
在这方面，如本文所用，在具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶切割PTO的背景下，短语“包含PTO的5’标记部分的PTO片段”用于涵盖(i)5’标记部分，(ii)5’标记部分和3’靶向部分的5’末端(例如，在3’靶向部分的5’末端处的第一个核苷酸、在3’靶向部分的5’末端处的第一至第二个核苷酸、在3’靶向部分的5’末端处的第一至第三个核苷酸、在3’靶向部分的5’末端处的第一至第四个核苷酸或者在3’靶向部分的5’末端处的第一至第五个核苷酸)，以及(iii)5’标记部分的一部分。短语“包含PTO的5’标记部分的片段”在本文中可缩写为“PTO片段”或“片段”。
与PTO或CTO结合使用的术语“部分”，如PTO的5’标记部分的一部分，PTO的3’靶向部分的5’末端部分和CTO的捕获部分的5’末端部分指包含1-40个、1-30个、1-20个、1-15个、1-10个或1-5个核苷酸(特别是，1、2、3或4个核苷酸)的核苷酸序列。
PTO具有封闭子(blocker)，其抵抗具有5’核酸酶活性的酶切割，并且封闭子用于控制起始切割位点和/或随后的切割。例如，PTO的3’靶向部分的5’末端部分可以用封闭子封闭，以诱导在PTO的杂交部分(3’靶向部分)和非杂交部分(5’标记部分)之间的连接位点处的切割。
在一个实施方案中，具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶是具有5’核酸酶活性的热稳定性DNA聚合酶。或者，本公开可以使用具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶，其被修饰为具有降低的聚合酶活性。
在本公开中，具有5’核酸酶活性的合适DNA聚合酶是从各种细菌物种中获得的热稳定DNA聚合酶，包括水生栖热菌(Thermus aquaticus,Taq)、嗜热栖热菌(Thermusthermophilus,Tth)、丝状栖热菌(Thermus filiformis)、黄色栖热菌(Thermis flavus)、海滨嗜热球菌(Thermococcus literalis)、安氏栖热菌(Thermus antranikianii)、嗜热栖热菌(Thermus caldophilus)、喜盐栖热菌(Thermus chliarophilus)、黄色栖热菌(Thermus flavus)、火地栖热菌(Thermus igniterrae)、乳白栖热菌(Thermus lacteus)、大岛栖热菌(Thermus oshimai)、红色栖热菌(Thermus ruber)、深红栖热菌(Thermusrubens)、暗管栖热菌(Thermus scotoductus)、森林栖热菌(Thermus silvanus)、栖热株Z05(Thermus species Z05)、栖热株17(Thermus species sps 17)、嗜热栖热菌(Thermusthermophilus)、海栖热袍菌(Thermotoga maritima)、阿波罗栖热袍菌(Thermotoganeapolitana)、非洲栖热腔菌(Thermosipho africanus)、海滨嗜热球菌(Thermococcuslitoralis)、巴罗斯氏嗜热球菌(Thermococcus barossi)、戈尔贡嗜热球菌(Thermococcusgorgonarius)、海栖热袍菌(Thermotoga maritima)、阿波罗栖热袍菌(Thermotoganeapolitana)、非洲栖热腔菌(Thermosiphoafricanus)、沃氏火球菌(Pyrococcuswoesei)、堀越氏火球菌(Pyrococcus horikoshii)、深海火球菌(Pyrococcus abyssi)、隐蔽热网菌(Pyrodictium occultum)、嗜火产水菌(Aquifex pyrophilus)和风神产液菌(Aquifex aeolieus)。特别地，热稳定DNA聚合酶是Taq聚合酶。
在另一个实施方案中，可以使用具有5’核酸酶活性的酶和模板依赖性聚合酶代替具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶。例如，可以将FEN(flap核酸内切酶)用作具有5’核酸酶活性的酶。
FEN是5’flap特异性核酸酶。
在本公开内容中的合适FEN包括从各种细菌物种中获得的FEN，包括硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)、耐超高温热棒菌(Pyrobaculum aerophilum)、海滨嗜热球菌(Thermococcus litoralis)、毒害古球菌(Archaeaglobus veneficus)、深海古球菌(Archaeaglobus profundus)、布氏酸菌(Acidianus brierlyi)、双效酸菌(Acidianusambivalens)、解淀粉脱硫球菌(Desulfurococcus amylolyticus)、运动脱硫球菌(Desulfurococcus mobilis)、布氏热网菌(Pyrodictium brockii)、戈尔贡嗜热球菌(Thermococcus gorgonarius)、齐氏嗜热球菌(Thermococcus zilligii)、坎氏甲烷嗜热菌(Methanopyrus kandleri)、火源甲烷球菌(Methanococcus igneus)、堀越氏火球菌(Pyrococcus horikoshii)、敏捷气热菌(Aeropyrum pernix)和毒害古球菌(Archaeaglobus veneficus)。
模板依赖性核酸聚合酶可以包括任何核酸聚合酶，例如，大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段、热稳定DNA聚合酶和噬菌体T7 DNA聚合酶。优选地，聚合酶是热稳定DNA聚合酶，其可以从各种细菌物种获得，包括水生栖热菌(Thermus aquaticus,Taq)、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus,Tth)、丝状栖热菌(Thermus filiformis)、黄色栖热菌(Thermisflavus)、海滨嗜热球菌(Thermococcus literalis)、安氏栖热菌(Thermusantranikianii)、嗜热栖热菌(Thermus caldophilus)、喜盐栖热菌(Thermuschliarophilus)、黄色栖热菌(Thermus flavus)、火地栖热菌(Thermus igniterrae)、乳白栖热菌(Thermus lacteus)、大岛栖热菌(Thermus oshimai)、红色栖热菌(Thermusruber)、深红栖热菌(Thermus rubens)、暗管栖热菌(Thermus scotoductus)、森林栖热菌(Thermus silvanus)、栖热株Z05(Thermus species Z05)、栖热株17(Thermus speciessps 17)、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)、海栖热袍菌(Thermotoga maritima)、阿波罗栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)、非洲栖热腔菌(Thermosipho africanus)、海滨嗜热球菌(Thermococcus litoralis)、巴罗斯氏嗜热球菌(Thermococcus barossi)、戈尔贡嗜热球菌(Thermococcus gorgonarius)、海栖热袍菌(Thermotoga maritima)、阿波罗栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)、非洲栖热腔菌(Thermosipho africanus)、激烈火球菌(Pyrococcus furiosus，Pfu)、沃氏火球菌(Pyrococcus woesei)、堀越氏火球菌(Pyrococcus horikoshii)、深海火球菌(Pyrococcus abyssi)、隐蔽热网菌(Pyrodictiumoccultum)、嗜火产水菌(Aquifex pyrophilus)和风神产液菌(Aquifex aeolieus)。更特别地，模板依赖性核酸聚合酶是Taq聚合酶。
在一个实施方案中，用于切割PTO的条件包括引物的延伸反应。
在一个实施方案中，将模板依赖性聚合酶用于引物的延伸，以及模板依赖性聚合酶与具有5’核酸酶活性的酶相同。或者，模板依赖性聚合酶用于引物的延伸，以及模板依赖性聚合酶与具有5’核酸酶活性的酶不同。
步骤(c)：片段与CTO的杂交
将从PTO释放的片段与捕获和模板寡核苷酸(CTO)杂交。
CTO在3’至5’方向上包含：(i)捕获部分，其包含与PTO的5’标记部分杂交的核苷酸序列，以及(ii)模板部分，其包含不与PTO的5’标记部分和3’靶向部分杂交的核苷酸序列。
特别地，在本公开中使用的CTO具有限定标记部分的报告分子和淬灭分子(参见图2A和图2B)。换言之，标记部分可以由报告分子和淬灭分子连接的位置来限定。
如在本文中所使用的，术语“标记部分”指核苷酸序列，其包含与报告分子连接的核苷酸，与淬灭分子连接的核苷酸和介于中间的核苷酸。例如，当报告分子和淬灭分子分别连接至CTO的5’末端的第3个核苷酸和第15个核苷酸时，标记部分可能总共有13个核苷酸，包括从报告分子连接的第3个核苷酸至淬灭分子连接的第15个核苷酸。
在一个实施方案中，报告分子和淬灭分子位于这样的位置(i)在CTO与另一寡核苷酸(例如，LPHO或延伸链)杂交之前，报告分子和淬灭分子彼此之间非常接近，从而使淬灭分子淬灭来自报告分子的信号(参见图3(ii)至(iii)和图4(iii))以及(ii)当CTO与另一寡核苷酸杂交时，报告分子和淬灭分子彼此之间分离，从而使淬灭分子不淬灭来自报告分子的信号(参见图3(i)和图4(i)至(ii))。
在一个实施方案中，在CTO上的报告分子和淬灭分子中的一个位于其5’末端或与其5’末端相距1-5个核苷酸处，以及另一个位于淬灭或不淬灭来自报告分子的信号，具体依赖于CTO的构象。
在一个实施方案中，在CTO上的报告分子和淬灭分子中的一个位于其3’末端或与其3’末端相距1-5个核苷酸处，以及另一个位于淬灭或不淬灭来自报告分子的信号，具体依赖于CTO的构象。
在一个实施方案中，报告分子和淬灭分子位于彼此之间相距不超过80个核苷酸、不超过60个核苷酸、不超过30个核苷酸或不超过25个核苷酸。在一个实施方案中，报告分子和淬灭分子被至少4个核苷酸、至少6个核苷酸、至少10个核苷酸或至少15个核苷酸所分隔。
在某些实施方案中，报告分子和淬灭分子被10-25个核苷酸、10-20个核苷酸或10-15个核苷酸所分隔。
应考虑稍后描述的LPHO的核苷酸序列，确定报告分子和淬灭分子的位置。
本文中的表述“报告分子和淬灭分子彼此之间非常接近”指(i)具有报告分子和淬灭分子两者的寡核苷酸形成特定的构象结构，例如，随机卷曲或发夹结构，以使得报告分子和淬灭分子在三维上彼此相邻，或者(ii)具有报告分子的寡核苷酸和具有淬灭分子的寡核苷酸形成双链，以使得报告分子和淬灭分子彼此紧密接近。
在一个实施方案中，在CTO与另一个寡核苷酸杂交之前，CTO形成随机卷曲或发夹结构，从而允许淬灭分子分子内淬灭来自报告分子的信号。
本文中的表述“报告分子和淬灭分子彼此分离”指(i)具有报告分子和淬灭分子两者的寡核苷酸与另一个寡核苷酸形成双链，以经历其构象变化，如发夹结构破坏，以使得报告分子和淬灭分子分离，或者(ii)在双链态中具有报告分子的寡核苷酸和具有淬灭分子的寡核苷酸彼此之间解离，以使得报告分子和淬灭分子分离。
在一个实施方案中，CTO在与另一个寡核苷酸杂交时形成双链，从而允许淬灭分子不淬灭来自报告分子的信号。
在一个实施方案中，(i)报告分子和淬灭分子两者可以连接至CTO的捕获部分，(ii)报告分子和淬灭分子两者可以连接至CTO的模板部分，或者(iii)报告分子和淬灭分子中的一个可以连接至CTO的捕获部分以及另一个可以连接至CTO的模板部分。
在本公开中使用的报告分子和淬灭分子是相互作用的标记。
作为相互作用的标记系统的代表，FRET(荧光共振能量转移)标记系统包括荧光报告分子(供体分子)和淬灭分子(受体分子)。在FRET中，能量供体是荧光的，但能量受体可以是荧光的或非荧光的。在相互作用的标记系统的另一种形式中，能量供体是非荧光的，例如，发色团，以及能量受体是荧光的。在相互作用的标记系统的又一种形式中，能量供体是发光的，例如，生物发光、化学发光、电化学发光，以及受体是荧光的。供体分子和受体分子在本公开中可以分别描述为报告分子和淬灭分子。相互作用的标记系统包括基于“接触介导的淬灭”的标记对(Salvatore等人，Nucleic Acids Research,2002(30)no.21e122和Johansson等人，J.AM.CHEM.SOC 2002(124)pp 6950-6956)。相互作用的标记系统包括通过至少两个分子(例如，染料)之间的相互作用诱导信号变化的任何标记系统。
可用于本发明的报告分子和淬灭分子可以包括本领域已知的任何分子。此类分子的实例包括，但不限于：Cy2TM(506)、YO-PROTM-1(509)、YOYOTM-1(509)、钙黄绿素(517)、FITC(518)、FluorXTM(519)、AlexaTM(520)、罗丹明110(520)、Oregon GreenTM 500(522)、OregonGreenTM 488(524)、RiboGreenTM(525)、Rhodamine GreenTM(527)、罗丹明123(529)、Magnesium GreenTM(531)、Calcium GreenTM(533)、TO-PROTM-1(533)、TOTO1(533)、JOE(548)、BODIPY530/550(550)、Dil(565)、BODIPY TMR(568)、BODIPY558/568(568)、BODIPY564/570(570)、Cy3TM(570)、AlexaTM 546(570)、TRITC(572)、Magnesium OrangeTM(575)、藻红素R&B(575)、罗丹明鬼笔环肽(575)、Calcium OrangeTM(576)、派洛宁Y(580)、罗丹明B(580)、TAMRA(582)、Rhodamine RedTM(590)、Cy3.5TM(596)、ROX(608)、CalciumCrimsonTM(615)、AlexaTM 594(615)、德克萨斯红(615)、尼罗红(628)、YO-PROTM-3(631)、YOYOTM-3(631)、藻蓝蛋白(642)、C-藻蓝蛋白(648)、TO-PROTM-3(660)、TOTO3(660)、DiDDilC(5)(665)、Cy5TM(670)、硫杂二羰花青(671)、Cy5.5(694)、HEX(556)、TET(536)、Biosearch Blue(447)、CAL Fluor Gold540(544)、CAL Fluor Orange 560(559)、CALFluor Red 590(591)、CAL Fluor Red 610(610)、CAL Fluor Red 635(637)、FAM(520)、荧光素(520)、荧光素-C3(520)、Pulsar 650(566)、Quasar 570(667)、Quasar 670(705)和Quasar 705(610)。括号中的数字是以纳米为单位的最大发射波长。优选地，报告分子和淬灭分子包括JOE、FAM、TAMRA、ROX和基于荧光素的标记。
在如下所示的各种出版物中公开了合适的报告分子-淬灭分子对：Pesce等编辑，Fluorescence Spectroscopy(Marcel Dekker,New York,1971)；White等人，FluorescenceAnalysis:A Practical Approach(Marcel Dekker,New York,1970)；Berlman,Handbookof Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules，第2版(Academic Press,New York,1971)；Griffiths,Color AND Constitution of Organic Molecules(Academic Press,New York,1976)；Bishop编辑，Indicators(Pergamon Press,Oxford,1972)；Haugland,Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals(Molecular Probes,Eugene,1992)；Pringsheim,Fluorescence and Phosphorescence(IntersciencePublishers,New York,1949)；Haugland,R.P.,Handbook of Fluorescent Probes andResearch Chemicals，第6版(Molecular Probes,Eugene,Oreg.,1996)；美国专利号3,996,345和4,351,760。
在本公开中可以使用能够淬灭宽波长范围或特定波长荧光的非荧光黑色淬灭分子。那些的实例是BHQ和DABCYL。
在本公开所采用的FRET标记中，报告分子涵盖FRET的供体，以及淬灭分子涵盖FRET的其他伴侣(受体)。例如，将荧光素染料用作报告分子和将罗丹明染料作为淬灭分子。
将CTO用作PTO释放的片段延伸的模板。将作为引物的片段与CTO杂交并延伸以产生延伸的双链体。
CTO的模板部分可以包含任何序列，只要其不与PTO的5’标记部分和3’靶向部分互补即可。此外，CTO的模板部分可以包含任何序列，只要其可以作为PTO释放的片段延伸的模板即可。
如上文所述，当包含PTO的5’标记部分的片段被释放时，优选CTO的捕获部分被设计为包含与5’标记部分杂交的核苷酸序列。当包含PTO的5’标记部分和3’靶向部分的5’末端的片段被释放时，优选CTO的捕获部分被设计为包含与5’标记部分和3’靶向部分的5’末端部分杂交的核苷酸序列。当包含PTO的5’标记部分的一部分的PTO片段被释放时，优选CTO的捕获部分被设计为包含与5’标记部分的一部分杂交的核苷酸序列。
此外，可以设计具有预期PTO切割位点的CTO的捕获部分。例如，其中CTO的捕获部分被设计为包含与5’标记部分杂交的核苷酸序列，包含5’标记部分的一部分的片段或包含5’标记部分的片段可以与CTO的捕获部分杂交，然后延伸。
在一个实施方案中，可以根据PTO的3’靶向部分上的预期切割位点来选择与3’靶向部分的切割的5’末端部分杂交的CTO的捕获部分的5’末端部分的核苷酸序列。与3’靶向部分的切割的5’末端部分杂交的CTO的捕获部分的5’末端部分的核苷酸序列的长度是1-10个核苷酸、1-5个核苷酸或1-3个核苷酸。
本文使用术语“包含与5’标记部分或5’标记部分的一部分互补的核苷酸序列的捕获部分”，描述涵盖如上文所讨论的CTO的捕获部分的各种设计和组成。
在一个实施方案中，CTO可以被设计为具有发夹结构或不具有发夹结构。
CTO的长度可以很大的范围变化。例如，CTO的长度是5-1000个核苷酸、5-500个核苷酸、5-300个核苷酸、5-100个核苷酸、5-80个核苷酸、5-60个核苷酸、5-40个核苷酸、7-1000个核苷酸、7-500个核苷酸、7-300个核苷酸、7-100个核苷酸、7-80个核苷酸、7-60个核苷酸、7-40个核苷酸、15-1000个核苷酸、15-500个核苷酸、15-300个核苷酸、15-100个核苷酸、15-80个核苷酸、15-60个核苷酸、15-40个核苷酸、20-1000个核苷酸、20-500个核苷酸、20-300个核苷酸、20-100个核苷酸、20-80个核苷酸、20-60个核苷酸、20-40个核苷酸、30-1000个核苷酸、30-500个核苷酸、30-300个核苷酸、30-100个核苷酸、30-80个核苷酸、30-60个核苷酸或30-40个核苷酸。
CTO的捕获部分可以具有任何长度，只要其特异性与片段杂交即可。例如，CTO的捕获部分的长度是5-100个核苷酸、5-60个核苷酸、5-40个核苷酸、5-30个核苷酸、5-20个核苷酸、10-100个核苷酸、10-60个核苷酸、10-40个核苷酸、10-30个核苷酸、10-20个核苷酸、15-100个核苷酸、15-60个核苷酸、15-40个核苷酸、15-30个核苷酸或15-20个核苷酸。
CTO的模板部分可以具有任何长度，只要其能够在片段的延伸中作为模板即可。例如，CTO的模板部分的长度是1-900个核苷酸、1-400个核苷酸、1-300个核苷酸、1-100个核苷酸、1-80个核苷酸、1-60个核苷酸、1-40个核苷酸、1-20个核苷酸、2-900个核苷酸、2-400个核苷酸、2-300个核苷酸、2-100个核苷酸、2-80个核苷酸、2-60个核苷酸、2-40个核苷酸、2-20个核苷酸、5-900个核苷酸、5-400个核苷酸、5-300个核苷酸、5-100个核苷酸、5-80个核苷酸、5-60个核苷酸、5-40个核苷酸、5-30个核苷酸、10-900个核苷酸、10-400个核苷酸、10-300个核苷酸、15-900个核苷酸、15-100个核苷酸、15-80个核苷酸、15-60个核苷酸、15-40个核苷酸或15-20个核苷酸。
在一个实施方案中，CTO的3’末端可以具有3’-OH末端。或者，CTO的3’末端被封闭，以阻止其延伸。CTO的封闭可以参考上述PTO封闭的描述进行详细描述。
片段与CTO杂交，以提供适合该片段延伸的形式。尽管未切割的PTO也通过其5’标记部分与CTO的捕获部分杂交，但是其3’靶向部分不与CTO杂交，这阻止了延伸的双链体的产生。
步骤(c)中的杂交可以参考步骤(a)中的描述进行详细描述。
步骤(d)：片段的延伸和延伸的双链体的产生
在标记部分杂交寡核苷酸(LPHO)存在时，使用步骤(c)的所得物与具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶进行延伸反应。将与CTO的捕获部分杂交的片段延伸，以产生延伸链，其包含与CTO的模板部分互补的延伸的序列。这导致在延伸链和CTO之间产生延伸的双链体。而相比之下，与CTO的捕获部分杂交的未切割的PTO没有延伸，因此不会产生延伸的双链体。
在步骤(d)中，与CTO的捕获部分杂交的片段通过具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶沿着作为模板的CTO的模板部分延伸。
与步骤(d)中片段的延伸反应相结合的所使用的术语“延伸的序列”、“延伸链”和“延伸的双链体”具有以下含义：
如在本文中所使用的，术语“延伸的序列”指在步骤(d)中通过片段延伸而新产生的序列。换言之，延伸的序列指延伸链的一部分，如下面将描述的，不包括该片段。
如在本文中所使用的，术语“延伸链”指涵盖该片段和延伸的序列的序列。换言之，延伸链指延伸的双链体的一部分，如下面将描述的，不包括CTO。
如在本文中所使用的，术语“延伸的双链体”指延伸链和CTO之间的杂交体或双链体(通过互补)。换言之，延伸的双链体指由该片段和延伸的序列组成的延伸链和CTO之间的双链体。
在一个实施方案中，延伸的双链体的Tm可以通过以下方式调节：(i)片段的序列和/或长度，(ii)CTO的序列和/或长度或(iii)片段的序列和/或长度和CTO的序列和/或长度。
本文使用的术语“Tm”指一半的双链核酸分子解离成单链分子的熔融温度。Tm值由杂交核苷酸的长度和G/C含量决定。Tm值可以由常规方法计算，如Wallace规则(R.B.Wallace等人，Nucleic Acids Research,6:3543-3547(1979))和最邻近方法(SantaLucia J.Jr.等人，Biochemistry,35:3555-3562(1996)；Sugimoto N.等人，NucleicAcids Res.,24:4501-4505(1996))。
在某些实施方案中，Tm值指在反应条件下的实际Tm值。
在标记部分杂交寡核苷酸(LPHO)存在时，进行步骤(d)。
如在本文中所使用的，术语“标记部分杂交寡核苷酸(LPHO)”指一种寡核苷酸，其包含与标记部分杂交的核苷酸序列，并且根据其是否与标记部分杂交而提供不同强度的信号。例如，当LPHO与CTO的标记部分杂交时，CTO上的报告分子和淬灭分子被分离，从而引起淬灭分子不淬灭来自报告分子的信号，而当LPHO不与CTO的标记部分杂交以及CTO不与任何寡核苷酸杂交时，在CTO上的报告分子和淬灭分子彼此之间非常接近，从而使淬灭分子淬灭来自报告分子的信号。
在一个实施方案中，LPHO可以与CTO的标记部分的完整或部分序列杂交，只要LPHO提供不同强度的信号即可，这依赖于LPHO是否与CTO的标记部分杂交。
在一个实施方案中，LPHO与CTO的标记部分的完整或部分序列杂交，以及在CTO上的报告分子和淬灭分子被分离，从而引起淬灭分子不淬灭来自报告分子的信号。
LPHO包含与CTO的标记部分杂交的核苷酸序列。例如，在报告分子和淬灭分子两者连接至CTO的捕获部分(或模板部分)的情况下，LPHO应被设计为包含与报告分子和淬灭分子连接的CTO的捕获部分(或模板部分)杂交的核苷酸序列。在这种情况下，本领域技术人员应理解的是，除了上述与CTO标记部分杂交的核苷酸序列以外，LPHO可以具有其他核苷酸序列。
在某些实施方案中，当报告分子连接至距离CTO的5’末端的第12个核苷酸以及淬灭分子连接至距离CTO的5’末端的第25个核苷酸时，LPHO可以包含与CTO上限定为标记部分的5’末端第12个核苷酸至第25个核苷酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
LPHO的长度可以变化很大。例如，LPHO的长度是5-100个核苷酸、5-80个核苷酸、5-60个核苷酸、5-40个核苷酸、5-20个核苷酸、5-10个核苷酸、7-100个核苷酸、7-80个核苷酸、7-60个核苷酸、7-40个核苷酸、7-20个核苷酸、7-10个核苷酸、10-100个核苷酸、10-80个核苷酸、10-60个核苷酸、10-40个核苷酸、10-30个核苷酸、10-20个核苷酸、10-15个核苷酸、15-100个核苷酸、15-80个核苷酸、15-60个核苷酸、15-40个核苷酸、15-30个核苷酸、15-20个核苷酸、20-100个核苷酸、20-80个核苷酸、20-60个核苷酸、20-40个核苷酸或20-30个核苷酸。
本公开的特征之一是，当靶核酸存在于样品中时，在延伸链和CTO之间产生延伸的双链体，从而阻止在CTO的标记部分和LPHO之间形成CTO/LPHO杂交体；当在样品中不存在靶核酸时，不产生延伸链(即，不产生延伸的双链体)，以及替代地形成CTO/LPHO杂交体。
在一个实施方案中，当在样品中存在靶核酸时，与CTO的捕获部分杂交的片段被延伸，以产生包含与CTO的模板部分互补的延伸的序列的延伸链，从而在延伸链和CTO之间产生延伸的双链体。
在一个实施方案中，当在样品中存在靶核酸时，可以通过以下方式产生延伸的双链体：(i)在CTO的标记部分与LPHO杂交之前延伸与CTO的捕获部分杂交的片段，(ii)在CTO的标记部分和LPHO之间杂交时，延伸与CTO的捕获部分杂交的片段从而切割LPHO，或者(iii)(i)和(ii)两者。
LPHO可以在片段延伸之前与CTO杂交，并参与延伸反应。在一个实施方案中，当LPHO在片段延伸之前与CTO杂交时，片段的延伸会切割或置换来自CTO的LPHO。例如，随着片段的延伸，与CTO杂交的LPHO可以通过链置换从CTO释放(置换)或者可以被切割。
在一个实施方案中，通过片段的延伸对LPHO的切割和/或链置换依赖于酶的类型(例如，DNA聚合酶)或反应条件。
在一个实施方案中，延伸的双链体的产生通过优先延伸链和CTO之间的杂交(即形成延伸的双链体)而不是CTO的标记部分和LPHO之间的杂交(即，形成CTO/LPHO杂交体)，阻止了CTO/LPHO杂交体的形成。换言之，CTO与延伸链杂交产生延伸的双链体，这导致CTO的消耗以及CTO和LPHO之间杂交的较低可能性。
在一个实施方案中，延伸的双链体的产生通过在步骤(d)的延伸期间切割LPHO阻止形成CTO/LPHO杂交体。换言之，LPHO被切割和去除，导致CTO和LPHO之间杂交的可能性较低。
在一个实施方案中，延伸的双链体具有与CTO/LPHO杂交体的Tm不同的熔融温度(Tm)。
特别地，通过延伸的双链体和CTO/LPHO杂交体的稳定性的差异，如Tm值的差异，可以实现与形成CTO/LPHO杂交体相比优先形成延伸的双链体。
在本公开中，延伸的双链体可以比CTO/LPHO杂交体更稳定。例如，延伸的双链体的Tm高于CTO/LPHO杂交体的Tm。特别地，延伸的双链体的Tm比CTO/LPHO杂交体的Tm高至少2℃、3℃、4℃、5℃、7℃、10℃、15℃或20℃。
在一个实施方案中，将LPHO的3’末端封闭，以阻止其延伸。LPHO的封闭可以参考上述PTO封闭的描述进行详细描述。
与CTO标记部分杂交的LPHO可以以两种方式中的任何一种相对于与CTO的捕获部分杂交的PTO片段定位：(i)LPHO与PTO片段完全或部分重叠；和(ii)LPHO不与PTO片段重叠。
将参考图2A和图2B描述上述方面(i)和(ii)。
(i)与CTO的标记部分杂交的LPHO与CTO的捕获部分杂交的PTO片段完全或部分重 叠
在这种情况下，LPHO包含与CTO杂交的片段竞争的核苷酸序列。例如，包含与CTO的捕获部分的全部或部分杂交的核苷酸序列的LPHO可以与片段竞争与CTO杂交。
本文中的表述“LPHO包含与CTO杂交的片段竞争的核苷酸序列”指LPHO包含可与片段杂交相同部分的核苷酸序列。相同部分用于涵盖与片段杂交的部分是部分的或完全相同的部分。换言之，LPHO可以包含与PTO的5’标记部分完全或部分重叠的核苷酸序列(参见图2A)。
在本文中与LPHO序列结合使用的术语“能够与CTO的捕获部分杂交的核苷酸序列”指LPHO的一部分，其通过与CTO的捕获部分杂交形成双链。能够与CTO的捕获部分杂交的LPHO的核苷酸序列可以是LPHO的完整序列或部分序列。能够与CTO的捕获部分杂交的核苷酸序列对应于LPHO的完整或部分序列(例如，10％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％)。
在一个实施方案中，在LPHO包含与片段竞争与CTO杂交的核苷酸序列的情况下，LPHO在延伸反应期间不会被片段或其延伸产物切割或置换。
在一个实施方案中，在LPHO包含与片段竞争与CTO杂交的核苷酸序列的情况下，在与CTO杂交方面，LPHO比片段(特别是，片段的延伸链)具有更小的竞争性，并且比未切割的PTO的5’标记部分具有更大的竞争性。
在某些实施方案中，步骤(d)在与LPHO和CTO之间的杂交相比更有利于片段和CTO之间杂交的条件下进行。这种有利的条件可以通过各种方法来实现。例如，为了有利条件，可以将LPHO的3’末端封闭。将具有封闭的3’末端的LPHO与CTO杂交，但不进行延伸，这增加了由于与片段竞争而从CTO解离的可能性。将与CTO杂交的片段延伸，以产生延伸链，这可以更稳定地维持。因此，在步骤(d)中，延伸的双链体比CTO/LPHO杂交体更普遍。因此，相较于不存在靶核酸的情况，在存在靶核酸的情况下，由于延伸的双链体，因而使得CTO/LPHO杂交体的数量(或量)相对减少。
在靶核酸不存在的情况下，PTO不会发生切割，PTO以未切割的PTO存在。在同时存在未切割PTO和LPHO的情况下，未切割PTO的5’标记部分与LPHO竞争与CTO的杂交，因为其彼此之间具有重叠的序列。在靶核酸不存在的情况下，LPHO应该比未切割的PTO的5’标记部分更有利于与CTO杂交，因为本公开的基本原理要求LPHO与CTO杂交。例如，在片段的Tm值高于LPHO的情况下，片段比LPHO更有利于与CTO杂交。
在一个实施方案中，LPHO可以包含与CTO的完整序列杂交的序列(参见图2A，(vi))。换言之，LPHO可以与延伸链具有相同长度。在这种情况下，可以将LPHO设计为具有非天然碱基或者与CTO具有一些错配，因此与LPHO相比CTO更有利于与延伸链杂交。
考虑到上述因素或问题，应对LPHO进行适当设计。在一个实施方案中，CTO/LPHO杂交体和CTO/片段杂交体的Tm值之间的差异在±40℃、±30℃、±20℃、±15℃、±10℃、±5℃、±3℃或±1℃内。
在一个实施方案中，CTO/LPHO杂交体和CTO/未切割PTO的5’标记部分杂交体的Tm值之间的差异在±40℃、±30℃、±20℃、±15℃、±10℃、±5℃、±3℃或±1℃内。
在一个实施方案中，在LPHO与未切割的PTO竞争与CTO杂交的情况下，CTO/LPHO杂交体的Tm值可能比CTO/未切割PTO杂交体的Tm值更高(例如，至少高2℃、4℃、6℃、8℃、10℃、15℃或20℃)。
CTO/未切割PTO杂交体的Tm值由与CTO杂交的PTO的一部分确定。例如，在未切割PTO的5’标记部分与CTO杂交的情况下，5’标记部分的Tm值是CTO/未切割PTO杂交体的Tm值的决定因素。
除非另有说明，否则如在本文中所使用的术语“未切割PTO的Tm值”指由与CTO杂交的未切割PTO序列的一部分确定的Tm值。
在一个实施方案中，延伸链具有高于LPHO的Tm值，LPHO具有高于PTO的5’标记部分的Tm值。
在一个实施方案中，考虑到与CTO杂交，延伸链的Tm值高于LPHO，而LPHO的Tm值又高于未切割PTO的Tm值。
(ii)与CTO的标记部分杂交的LPHO不与CTO的捕获部分杂交的PTO片段重叠
在一个实施方案中，可以将LPHO设计为包含与片段所杂交的部分不同的部分杂交的核苷酸序列。例如，LPHO包含与CTO的模板部分杂交的核苷酸序列，并且片段和LPHO与CTO上的不同部分杂交，如在图2B(i)至(iii)中所示。在这种情况下，在与CTO杂交方面，LPHO可能不与片段(或未切割PTO)竞争。
在一个实施方案中，LPHO和CTO之间的杂交可能比不杂交更有利，也可能更不利，这依赖于与CTO杂交的片段延伸的条件。
在一个实施方案中，在CTO的标记部分和LPHO杂交之前，可以将与CTO杂交的片段延伸。
在一个实施方案中，在CTO的标记部分和LPHO之间杂交时，可以将与CTO杂交的片段延伸。在这种情况下，与CTO的标记部分杂交的LPHO被片段或其延伸产物从CTO释放(分离)或切割。
步骤(e)：检测延伸的双链体的存在
最后，检测延伸的双链体的存在。存在延伸的双链体表明存在靶核酸。
步骤(e)可以通过检测指示存在延伸的双链体的信号来实现。
如在本文中所使用的，术语“信号”指能够指示延伸的双链体的存在的任何信号。例如，信号包括来自标记的信号变化(信号产生或消失或者信号增加或减少)、熔融曲线、熔融模式和熔融温度(或Tm值)。
在一个实施方案中，由延伸的双链体提供信号，并通过测量从延伸的双链体提供的信号来检测延伸的双链体。在由延伸的双链体提供的信号强度不同于由CTO/LPHO杂交体提供的信号强度的温度下进行测量。例如，在用于测量的温度下，来自报告分子的信号不被淬灭或被淬灭，这依赖于其是延伸的双链体还是CTO/LPHO杂交体，这两个提供不同强度的信号。
在一个实施方案中，由延伸的双链体提供的信号是CTO和延伸链结合成延伸的双链体或延伸的双链体解离成CTO和延伸链的信号。特别地，由延伸的双链体提供的信号是CTO和延伸链结合成延伸的双链体的信号。
术语“结合(association)”或“解离(dissociation)”分别与术语“杂交”或“变性”具有相同含义。
在另一个实施方案中，由CTO/LPHO杂交体提供信号，并且通过测量由CTO/LPHO杂交体提供的信号检测延伸的双链体。如上文所述，延伸的双链体的产生阻止CTO/LPHO杂交体形成，这改变了由CTO/LPHO杂交体提供的信号。因此，可以通过测量由CTO/LPHO杂交体提供的这种信号改变检测延伸的双链体的存在。
在一个实施方案中，可以通过以下方式调节延伸的双链体的Tm：(i)片段的序列和/或长度，(ii)CTO的序列和/或长度，或(iii)片段的序列和/或长度和CTO的序列和/或长度，以及可通过LPHO的序列和/或长度调节CTO/LPHO杂交体的Tm。
在一个实施方案中，用于测量的温度依赖于延伸的双链体的Tm和CTO/LPHO杂交体的Tm。
在一个实施方案中，在存在多个PTO、多个CTO和多个LPHO的情况下进行该方法，以及重复步骤(a)-(e)，在重复循环之间变性。
在根据本公开的方法中，依赖于靶核酸的存在而产生延伸的双链体，并且延伸的双链体的量随着反应进行而增加。另一方面，CTO/LPHO杂交体的量随着依赖于靶核酸的存在而产生的延伸的双链体而减少。延伸的双链体或CTO/LPHO杂交体的量的这种改变提供了指示靶核酸存在的信号的变化。换言之，延伸的双链体和CTO/LPHO杂交体的量的比率依赖于靶核酸的存在而变化，从而改变信号。
当提及延伸的双链体或CTO/LPHO杂交体时，如在本文中所使用的术语“量(amount)”指组成双链体或杂交体的两条核酸链的量。在一个实施方案中，构成双链体的两条核酸链可以依赖于温度而解离或结合。在这种情况下，双链体的量指解离形式的双链体的量和结合形式的双链体的量之和。
在一个实施方案中，当存在靶核酸时，CTO可以与延伸链杂交以形成延伸的双链体，或者与LPHO杂交以形成CTO/LPHO杂交体。在这种情况下，基于延伸链的量计算延伸的双链体的量，然后基于排除与延伸链杂交的CTO以后剩余的CTO的量计算CTO/LPHO杂交体的量。例如，在与靶核酸反应之前，可以基于用于检测靶核酸的组合物中的所有CTO都参与形成CTO/LPHO杂交体的假设来计算CTO/LPHO杂交体的量。另一方面，当依赖于靶核酸的存在产生延伸链时，可以基于以下假设计算延伸的双链体的量和CTO/LPHO杂交体的量：用于检测靶核酸的组合物中的大多数CTO优先与延伸链杂交以形成延伸的双链体，其余CTO与LPHO杂交以形成CTO/LPHO杂交体。
检测在步骤(e)中延伸的双链体的存在可以通过以下方式进行：(i)测量在预定温度下的信号，或(ii)通过熔融分析或熔融后的杂交分析测量信号。
(i)在预定温度下测量信号
在预定温度下通过测量指示延伸的双链体存在的信号进行步骤(e)中的检测。例如，预定温度是由延伸的双链体提供的信号强度不同于由CTO/LPHO杂交体提供的信号强度的温度。
例如，在预定温度下，在延伸的双链体上的淬灭分子不淬灭来自在延伸的双链体上的报告分子的信号，而在CTO/LPHO杂交体上的淬灭分子淬灭来自在CTO/LPHO杂交体上的报告分子的信号，反之亦然。也就是说，信号不被淬灭或被淬灭依赖于在预定温度下淬灭分子是在延伸的双链体上还是在CTO/LPHO杂交体上，从而提供不同强度的信号。
在一个实施方案中，用于测量的温度允许(i)至少一个延伸的双链体保持其双链状态和(ii)至少一个CTO/LPHO杂交体解离成单链状态。
特别地，在某一温度范围内的温度下测量信号，在该温度范围内，全部或部分CTO/LPHO杂交体以解离形式存在，以及全部或部分延伸的双链体以结合形式存在。换言之，在全部CTO/LPHO杂交体和延伸的双链体以结合形式存在的温度(例如，比CTO/LPHO杂交体的Tm值低至少2℃、3℃、4℃、6℃、8℃或10℃的温度)下或在全部CTO/LPHO杂交体和延伸的双链体以解离形式存在的温度(例如，比延伸的双链体的Tm值高至少2℃、3℃、4℃、6℃、8℃或10℃的温度)下，未检测到指示存在延伸的双链体的信号。
关于表述“全部或部分双链体(例如，CTO/LPHO杂交体或延伸的双链体)在特定温度范围内(或在特定温度下)以解离形式(或结合形式)存在”，术语“全部”用于指在特定温度范围内的全部或基本上全部双链体，如显著数量的双链体或大多数双链体。例如，表述“全部延伸的双链体在比延伸的双链体的Tm值高4℃或更高的温度下以解离形式存在”可以指大多数延伸的双链体在比延伸的双链体的Tm值高4℃或更高的温度下是解离的。
关于表述“全部或部分双链体(例如，CTO/LPHO杂交体或延伸的双链体)在特定温度范围内(或在特定温度下)以解离形式(或结合形式)存在”，术语“部分”指双链体总量的一部分，如双链体总量的至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％或至少80％。
在一个实施方案中，全部或部分CTO/LPHO杂交体是解离形式以及全部或部分延伸的双链体是结合形式的温度范围是：比CTO/LPHO杂交体的Tm值低10℃至比延伸的双链体的Tm值高10℃。
在一个实施方案中，全部或部分CTO/LPHO杂交体是解离形式的温度相对于CTO/LPHO杂交体的Tm值在±2℃、±3℃、±4℃、±6℃、±8℃或±10℃内。
在一个实施方案中，全部或部分延伸的双链体是结合形式的温度相对于延伸的双链体的Tm值在±2℃、±3℃、±4℃、±6℃、±8℃或±10℃内。
在一个实施方案中，在高于CTO/LPHO杂交体的Tm值且低于延伸的双链体的Tm值的温度范围内的温度下测量指示延伸的双链体的存在的信号。
在某些实施方案中，在全部CTO/LPHO杂交体是解离形式且全部延伸的双链体是结合形式的温度范围内的温度下测量信号。该温度范围是从相对于CTO/LPHO杂交体的Tm值高4℃至相对于延伸的双链体的Tm值低4℃。
在某些实施方案中，在全部CTO/LPHO杂交体是解离形式且部分延伸的双链体是结合形式的温度范围内的温度下测量信号。该温度范围是相对于CTO/LPHO杂交体的Tm值高4℃并且在相对于延伸的双链体Tm值±4℃内。
在某些实施方案中，在部分CTO/LPHO杂交体是解离形式且部分延伸的双链体是结合形式的温度范围内的温度下测量信号。该温度范围是在相对于CTO/LPHO杂交体的Tm值±4℃体内以及是相对于延伸的双链体的Tm值低4℃。
在一个实施方案中，用于信号测量的温度依赖于延伸的双链体的Tm和CTO/LPHO杂交体的Tm。
如上文所述，延伸的双链体的Tm和CTO/LPHO杂交体的Tm是彼此之间不同的。特别地，延伸的双链体的Tm值高于CTO/LPHO杂交体的Tm值。Tm值的差异允许仅在特定温度范围内根据靶核酸的存在提供信号变化。在低于或高于特定温度范围的温度下，即使存在靶核酸，信号也是恒定的。
在这方面，更多细节参见本公开的第二个方面“用于检测靶核酸的组合物”和本公开的第三个方面“用于在样品中检测n种靶核酸的方法”。
(ii)通过熔融分析或熔融后的杂交分析测量信号
在一个实施方案中，通过熔融分析或熔融后的杂交分析测量指示延伸的双链体存在的信号在步骤(e)中进行检测。
在一个实施方案中，在某个温度范围内熔融或杂交延伸的双链体和/或CTO/LPHO杂交体，然后通过测量来自延伸的双链体的信号和/或来自CTO/LPHO杂交体的信号检测在步骤(e)中延伸的双链体的存在。特别地，将步骤(d)的所得物(例如，延伸的双链体和/或CTO/LPHO杂交体)熔融以提供信号，或者熔融后杂交以提供信号，然后通过测量信号检测延伸的双链体的存在。
在一个实施方案中，通过熔融分析在步骤(e)中进行延伸的双链体的存在的检测，其中将延伸的双链体熔融以给出指示靶核酸存在的信号。
如在本文中所使用的，术语“熔融分析”指通过熔融延伸的双链体来获得指示延伸的双链体存在的信号的方法，包括熔融曲线分析、熔融模式分析和熔融峰分析。特别地，熔融分析是熔融曲线分析。
在一个实施方案中，通过熔融后的杂交分析在步骤(e)中进行延伸的双链体的检测。特别地，在步骤(e)中检测延伸的双链体是通过熔融延伸的双链体和/或CTO/LPHO杂交体并且在某一温度下将所得物杂交以给出指示延伸的双链体的信号来进行的。
如在本文中所使用的，术语“熔融后的杂交分析”指熔融延伸的双链体，然后再将熔融的延伸的双链体杂交以给出指示延伸的双链体的信号的方法。特别地，熔融后的杂交分析是熔融曲线分析。
可以通过常规技术获得熔融曲线或杂交曲线，例如，如描述见于在美国专利号6,174,670和5,789,167，Drobyshev等人，Gene 188:45(1997)；Kochinsky和MirzabekovHuman Mutation 19:343(2002)；Livehits等人，J.Biomol.Structure Dynam.11:783(1994)；以及Howell等人，Nature Biotechnology 17:87(1999)。例如，熔融曲线或杂交曲线可以由输出信号随杂交严谨性参数变化的图形图或显示组成。可以直接针对杂交参数绘制输出信号。通常，熔融曲线或杂交曲线将在Y轴上具有输出信号，例如荧光，其指示双链体结构的程度(即，杂交的程度)，以及在X轴上为杂交参数。
荧光对温度的一阶导数的图，即，荧光对温度变化率的图(dF/dT vs.T或dF/dTvs.T)提供了熔融峰。
在一个实施方案中，本公开的方法可以进一步包括重复步骤(a)-(e)的全部或一部分，在重复循环之间进行变性。重复导致靶核酸的扩增和/或指示靶核酸存在的信号的扩增。
在一个实施方案中，涉及变性的重复步骤至少可以包括使延伸的双链体变性。其他组成部分(例如，引物、下游引物和酶)可以以足够的量使用，以免成为限制因素。
在一个实施方案中，根据本公开用于检测靶核酸的组合物包含的LPHO的量等于或大于CTO的量。这是为了确保组合物中的全部CTO形成CTO/LPHO杂交体，从而不存在单链CTO。特别地，最初包含在L-PTOCE组合物中的CTO/LPHO杂交体的量随着依赖于靶核酸存在的延伸的双链体的产生而减少，并提供指示延伸的双链体的存在的信号。在一个实施方案中，LPHO以CTO的1、2、3、4、5倍或更多倍的量包含在L-PTOCE组合物中。
变性可以通过常规技术进行，包括但不限于加热、碱、甲酰胺、脲和糖醛处理、酶法(例如，解旋酶作用)和结合蛋白。例如，变性可以通过在范围从80℃至105℃的温度下加热来实现。Joseph Sambrook等人，Molecular Cloning,ALaboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2001).中提供了用于实现这种处置的一般方法。(2001)中。
步骤(e)的检测可以以实时方式、终点(end-point)方式或预计时间间隔方式进行。在本公开进一步包括重复步骤(a)-(e)的情况下，优选的是，对于重复的每个循环在预定温度下(即，实时方式)、在重复结束时在预定温度下(即，终点方式)、或在重复期间在预定温度下的每个预定时间间隔进行信号检测。优选地，可以以实时方式对重复的每个循环进行检测，以改进检测准确度和定量。
在重复中，在存在下游引物的情况下进行本公开的方法，特别是通过实时PCR方法。
在一个实施方案中，步骤(a)-(e)在反应容器中进行，或者步骤(a)-(e)的一些在单独的反应容器中进行。
本公开不要求待检测和/或扩增的靶核酸具有任何特定序列或长度，包括任何DNA(gDNA和cDNA)和RNA分子。
当使用mRNA作为初始原料时，在进行退火步骤之前，需要进行逆转录步骤，其细节参见Joseph Sambrook等人，Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2001)；和Noonan,K.F.等人，Nucleic Adds Res.16:10366(1988)。对于逆转录，可以使用可与mRNA杂交的随机六聚体或寡核苷酸dT引物。
在一个实施方案中，在本公开中使用的靶核酸是预扩增核酸。预扩增核酸的利用允许显著提高本公开的靶检测的灵敏度和特异性。
本公开在检测核苷酸变异方面也是有用的。特别地，靶核酸包含核苷酸变异。如在本文中所使用的，术语“核苷酸变异”指序列相似的连续DNA区段中特定位置的DNA序列中的任何单个或多个核苷酸取代、缺失或插入。此类连续DNA区段包括基因或染色体的任何其他部分。这些核苷酸变异可以是突变变异或多态性等位基因变异。例如，在本公开中检测到的核苷酸变异包括SNP(单核苷酸多态性)、突变、缺失、插入、取代和易位。示例性核苷酸变异包括在人类基因组中的很多变异(例如，在MTHFR(亚甲基四氢叶酸还原酶)基因的变异)、与病原体耐药性有关的变异和导致肿瘤发生的变异。如在本文中所使用的，术语“核苷酸变异”包括在核酸序列中的特定位置处的任何变异。换言之，术语“核苷酸变异”包括在核酸序列中的特定位置处的野生型和任何突变型。
II.用于检测靶核酸的组合物
在本公开的第二个方面中，提供了一种用于在样品中检测靶核酸的组合物，其包含：
(a)引物；
其中所述引物包含与所述靶核酸的第一区域杂交的核苷酸序列，
(b)探测和标记寡核苷酸(PTO)；
其中在5’至3’方向所述PTO包含：(i)5’标记(tagging)部分，和(ii)3’靶向(targeting)部分，
其中所述3’靶向部分包含与所述靶核酸的第二区域杂交的核苷酸序列，以及当所述3’靶向部分与所述靶核酸的第二区域杂交时，所述5’标记部分包含不与所述靶核酸杂交的核苷酸序列，
其中所述引物位于所述PTO上游，
其中将所述引物延伸以诱导通过具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶切割所述PTO，以使得所述切割释放包含PTO的5’标记部分的片段；
(c)捕获和模板寡核苷酸(CTO)；
其中在3’至5’方向所述CTO包含：(i)捕获部分，其包含与所述PTO的5’标记部分杂交的核苷酸序列，和(ii)模板部分，其包含不与所述PTO的5’标记部分和3’靶向部分杂交的核苷酸序列，
其中所述CTO具有限定标记部分的报告分子和淬灭分子，
其中将所述片段与所述CTO的捕获部分杂交；以及
(d)标记部分杂交寡核苷酸(LPHO)；
其中所述LPHO包含与所述CTO的标记部分杂交的核苷酸序列，
其中当在所述样品中存在靶核酸时，与所述CTO的捕获部分杂交的所述片段被延伸以产生与所述CTO互补的延伸链，从而在所述延伸链和所述CTO之间产生延伸的双链体，其中所述延伸的双链体的产生阻止在所述CTO的标记部分和所述LPHO之间形成CTO/LPHO杂交体，
其中当在样品中不存在靶核酸时，不产生延伸链，而是替代地形成所述CTO/LPHO杂交体，
其中所述延伸的双链体的熔融温度(Tm)不同于所述CTO/LPHO杂交体的Tm。
由于本公开第二个方面遵循上述本公开第一个方面的原则，因而省略了其之间的共同描述，以避免过度冗余导致本说明书的复杂性。
构建根据本公开的组合物以进行上文所述的用于通过L-PTOCE测定检测靶核酸的方法，将其称为“LPHO辅助PTO切割和延伸(L-PTOCE)组合物”。
在一个实施方案中，当CTO未与延伸链或LPHO杂交时，在CTO上的报告分子和淬灭分子彼此之间非常接近，从而使淬灭分子淬灭来自报告分子的信号。
在一个实施方案中，当CTO与延伸链或LPHO杂交时，在CTO上的报告分子和淬灭分子是分离的，从而使淬灭分子不淬灭来自报告分子的信号。
在一个实施方案中，(i)报告分子和淬灭分子两者连接至CTO的捕获部分，(ii)报告分子和淬灭分子两者连接至CTO的模板部分，或者(iii)报告分子和淬灭分子中的一个连接至CTO的捕获部分，另一个连接至CTO的模板部分。
在一个实施方案中，LPHO与CTO的标记部分的完整或部分序列杂交，以及在CTO上的报告分子和淬灭分子被分离，从而使得淬灭分子不能淬灭来自报告分子的信号。
在一个实施方案中，LPHO包含与CTO杂交的片段竞争的核苷酸序列。
在一个实施方案中，LPHO包含不与CTO杂交的片段竞争的核苷酸序列。
在一个实施方案中，用于检测靶核酸的组合物与靶核酸反应以提供依赖于靶核酸存在的信号。特别地，当靶核酸扩增时，所述组合物提供信号变化。
在一个实施方案中，依赖于靶核酸存在的信号是由延伸的双链体提供的信号。
在一个实施方案中，组合物和靶核酸之间的反应可以包括扩增反应，并且可以包括例如信号扩增反应和/或核酸扩增反应。
WO 2022-265463公开了本领域公知的用于检测靶核酸的各种信号产生机制具有信号变化温度范围(SChTR)，其中信号变化依赖于靶核酸的存在，以及一个或两个信号恒定温度范围(SCoTR)，其中即使在存在靶核酸的情况下，信号也是恒定的。
此外，WO 2022-265463公开了根据这些信号变化温度范围和信号恒定温度范围的数量和/或顺序，各种常规信号产生机制可以分为三种类型：
(i)Under信号变化型(UnderSC型)信号产生机制，其具有信号变化温度范围低于信号恒定温度范围的熔融特征，
(ii)Inter信号变化型(InterSC型)信号产生机制，其具有信号变化温度范围高于两个信号恒定温度范围中的一个并且低于两个信号恒定温度范围中的另一个的熔融特征，以及
(iii)Over信号变化型(OverSC型)信号产生机制，其具有信号变化温度范围高于信号恒定温度范围的熔融特征。
用于实现三种类型的信号产生机制的组合物可以分别分类为UnderSC型组合物、InterSC型组合物和OverSC型组合物。
通过根据本公开的用于检测靶核酸的组合物与靶核酸之间的反应产生的延伸的双链体具有不同于CTO/LPHO杂交体的熔融温度(Tm)的Tm。通过使用具有这样不同的Tm值的延伸的双链体和CTO/LPHO杂交体，根据本公开的组合物具有信号变化温度范围(SChTR)，其中信号变化依赖于靶核酸的存在，以及两个信号恒定温度范围(SCoTR)，其中即使在存在靶核酸的情况下，信号也是恒定的。
因此，根据本公开的L-PTOCE测定和组合物可以分类为根据WO 2022-265463的InterSC型信号产生方法和InterSC型组合物。
在一个实施方案中，L-PTOCE组合物具有信号变化温度范围(SChTR)，其中信号变化依赖于靶核酸的存在，以及两个信号恒定温度范围(SCoTR)，其中即使在存在靶核酸的情况下，信号也是恒定的。
在一个实施方案中，信号变化温度范围高于两个信号恒定温度范围的第一信号恒定温度范围并且低于两个信号恒定温度范围的第二信号恒定温度范围。
在一个实施方案中，在靶核酸存在时，在信号变化温度范围内的温度下，延伸的双链体保持其双链状态，CTO/LPHO杂交体解离成单链状态。
在一个实施方案中，在靶核酸存在时，在第一信号恒定温度范围内的温度下，延伸的双链体和CTO/LPHO杂交体两者均保持其双链状态。
在一个实施方案中，在靶核酸存在时，在第二信号恒定温度范围内的温度下，延伸的双链体和CTO/LPHO杂交体两者解离成单链状态。
在这一点上，将参考以下附图更详细地描述L-PTOCE测定：
图3和图4显示了寡核苷酸的主要构象，其依赖于靶核酸的存在和温度。
在本公开中，在不存在靶核酸的情况下或者靶核酸与用于检测靶核酸的组合物之间反应之前，不产生延伸的双链体。图3(i)至图3(iii)显示了在不存在靶核酸的情况下或者靶核酸与L-PTOCE组合物之间反应之前在(i)第一信号恒定温度范围，(ii)信号变化温度范围以及(iii)第二信号恒定温度范围内CTO和LPHO(即，CTO/LPHO杂交体)的构象。特别地，在第一信号恒定温度范围内的温度下CTO与LPHO杂交，在CTO上的报告分子和淬灭分子分离，从而导致淬灭分子不淬灭来自报告分子的信号(参见图3(i))。另一方面，CTO在信号变化温度范围以及在第二信号恒定温度范围内的温度下不与LPHO杂交，在CTO上的报告分子和淬灭分子之间彼此之间非常接近，从而导致淬灭分子淬灭来自报告分子的信号(参见图3(ii)和图3(iii))。
同时，当存在靶核酸时，L-PTOCE组合物与靶核酸反应以产生延伸的双链体。图4(i)至图4(iii)显示了在靶核酸与L-PTOCE组合物反应后，CTO和延伸链(即，延伸的双链体)在(i)第一信号恒定温度范围，(ii)信号变化温度范围和(iii)第二信号恒定温度范围内的构象。特别地，CTO在第一信号恒定温度范围和信号变化温度范围内的温度下与延伸链杂交，在CTO上的报告分子和淬灭分子分离，从而导致淬灭分子不淬灭来自报告分子的信号(参见图4(i)和图4(ii))。另一方面，CTO在第二信号恒定温度范围内的温度下不与延伸链杂交，在CTO上的报告分子和淬灭分子彼此之间非常接近，从而导致淬灭分子淬灭来自报告分子的信号(参见图4(iii))。这里，可能存在不参与反应的CTO以及不参与反应且未被切割(或分离)的LPHO。不参与反应的LPHO和CTO可能以图3(i)至图3(iii)的构象存在。
在第一信号恒定温度范围内，其中靶核酸是不存在的(图3(i))或其中靶核酸是存在的(图4(i))时，CTO与LPHO或延伸链杂交，并且在CTO上的报告分子和淬灭分子分离，从而导致淬灭分子不淬灭来自报告分子的信号。换言之，即使在存在靶核酸的情况下，L-PTOCE组合物在第一信号恒定温度范围内提供恒定信号。
在第二信号恒定温度范围内，其中靶核酸是不存在的(图3(iii))或其中靶核酸是存在的(图4(iii))时，CTO不与LPHO或延伸链杂交，并且在CTO上的报告分子和淬灭分子彼此之间非常接近，从而导致淬灭分子淬灭来自报告分子的信号。换言之，即使在存在靶核酸的情况下，在第二信号恒定温度范围内，L-PTOCE组合物提供恒定信号。
在信号变化温度范围内，其中靶核酸是不存在的(图3(ii))时，CTO不与LPHO杂交，并且在CTO上的报告分子和淬灭分子彼此之间非常接近，从而导致淬灭分子淬灭来自报告分子的信号。另一方面，在信号变化温度范围内，在靶核酸是存在的(图4(ii))时，CTO与延伸链杂交，并且在CTO上的报告分子和淬灭分子分离，从而导致淬灭分子不淬灭来自报告分子的信号。换言之，L-PTOCE组合物根据在信号变化温度范围内靶核酸的存在提供信号变化。
图5A显示了在L-PTOCE测定的步骤(a)-(e)的初始、中间和后期循环中CTO/LPHO杂交体和延伸的双链体的量(或丰度)的比率，以及其熔融曲线。
图5B表示图5A中的三条熔融曲线重叠的图。
具体而言，在图5A中，在第(i)行中的数值“100”、“50”和“0”表示CTO/LPHO的量的比率，CTO/LPHO可以图3(i)至图3(iii)中的任何形式存在，以及第(ii)行中的数值“0”、“50”和“100”表示延伸的双链体的量的比率，延伸的双链体可以图4(i)至图4(iii)中的任何形式存在。第(i)行和第(ii)行的量的比率随着循环增加而变化，即，随着靶核酸的扩增而变化。特别地，通过合并初始、中间和后期循环的熔融曲线可以获得如图5B中所示的图。
如图5B中所示，根据本公开的L-PTOCE组合物具有信号变化温度范围(SChTR)，其中信号变化依赖于靶核酸的存在，以及两个信号恒定温度范围(SCoTR)，第一和第二信号恒定温度范围，其中即使在靶核酸存在时，信号也是恒定的。此外，信号变化温度范围高于第一信号恒定温度范围并低于第二信号恒定温度范围。
可以通过调节延伸的双链体的Tm值和CTO/LPHO杂交体的Tm值控制InterSC型组合物的信号变化温度范围和信号恒定温度范围。
在一个实施方案中，通过(i)片段的序列和/或长度，(ii)CTO的序列和/或长度或者(iii)片段的序列和/或长度和CTO的序列和/或长度可以调整延伸的双链体的Tm。
在一个实施方案中，通过LPHO的序列和/或长度可以调整CTO/LPHO杂交体的Tm。
在一个实施方案中，所述组合物进一步包含具有5’核酸酶活性的酶。
在某些实施方案中，具有5’核酸酶活性的酶可以是具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶。
在一个实施方案中，所述组合物进一步包含附加引物。
如本文所述的组合物可以任选地包含用于进行靶核酸扩增反应(例如，PCR反应)所需的试剂，如缓冲剂、DNA聚合酶辅因子和脱氧核糖核苷酸-5-三磷酸。任选地，组合物还可以包含各种多聚核苷酸分子、逆转录酶、各种缓冲剂和试剂以及抑制DNA聚合酶活性的抗体。组合物还可以包含进行阳性和阴性对照反应所需的试剂。有了本公开的益处，本领域普通技术人员可以容易地确定将用于给定反应的试剂的最佳量。组合物的上述组分可以存在于单独的容器中，或者多个组分可以存在于单一容器中。
III.用于使用L-PTOCE测定检测多种靶核酸的方法
在本公开的第三个方面中，提供了一种用于在样品中检测n种靶核酸的方法，其包括：
(a)在n种检测温度下检测信号，同时在反应容器中孵育用于检测n种靶核酸的n种组合物与疑似含有n种靶核酸中的至少一种的样品；
其中n是2或更大的整数，
其中孵育包括多个反应循环，并且在多个反应循环的至少一个中进行信号检测，
其中在存在相应靶核酸时，用于检测n种靶核酸的n种组合物中的每一种在n种检测温度中的相应检测温度下提供信号变化，所述信号变化表明存在相应靶核酸，
其中在存在第i靶核酸时，在用于检测n种靶核酸的n种组合物中，用于检测第i靶核酸的组合物在n种检测温度中的第i检测温度下提供信号变化，并在其他检测温度下提供恒定信号，所述信号变化指示存在第i靶核酸，
其中i表示从1至n的整数，以及第i检测温度低于第i+1检测温度，
其中在覆盖全部n种检测温度的温度范围内，用于检测第i靶核酸的组合物具有信号变化温度范围(SChTR)，其中信号变化依赖于第i靶核酸的存在，以及一个或两个信号恒定温度范围(SCoTR)，其中即使第i靶核酸存在时信号也是恒定的，
其中用于检测第i靶核酸的组合物是以下任一种：
(i)Under信号变化型(UnderSC型)组合物，其具有信号变化温度范围低于信号恒定温度范围的熔融特征，
(ii)Inter信号变化型(InterSC型)组合物，其具有信号变化温度范围高于两个信号恒定温度范围中的一个并且低于两个信号恒定温度范围中的另一个的熔融特征，以及
(iii)Over信号变化型(OverSC型)组合物，其具有信号变化温度范围高于信号恒定温度范围的熔融特征，以及
其中用于检测n种靶核酸的n种组合物的至少一种是(ii)根据上文所述的方法产生信号的InterSC型组合物，以及
(b)根据在步骤(a)中检测到的信号确定n种靶核酸的存在，其中通过在第i检测温度下检测到的信号变化确定第i靶核酸的存在。
由于本公开第三个方面使用了上文所述的本公开的第一个方面的方法和本公开的第二个方面的组合物，因而省略了它们之间的共性描述，以避免过度冗余导致本说明书复杂。
根据本公开的用于检测n种靶核酸的方法使用(i)多个L-PTOCE组合物，其是InterSC型组合物和/或(ii)L-PTOCE组合物的各种组合，具有UnderSC型、InterSC型和OverSC型组合物中的一个或多个，其采用本领域公知的各种信号产生机制来检测靶核酸。本公开的方法可以在单个反应容器中使用单一类型的标记和单一类型的检测器来检测多种靶核酸。
特别地，通过调节用于检测n种靶核酸的n种组合物的信号变化温度范围，使得在每个检测温度下仅提供指示相应靶核酸存在的信号，可以仅通过在特定检测温度下测量的信号变化来确定特定靶核酸的存在。
在下文中，将如下所示详细地描述本公开。
步骤(a)：孵育和信号检测
首先，在n种检测温度下检测信号，同时在反应容器中孵育n种用于检测n种靶核酸的组合物与疑似含有n种靶核酸的至少一种的样品。
在一个实施方案中，n种靶核酸可以包括核苷酸变异(variation)。例如，n种靶核酸中的一种可以包含一种类型的核苷酸变异，以及n种靶核酸中的另一种可以包含不同类型的核苷酸变异。
本文中的n种靶核酸可以是来自n种不同生物体的基因，来自同一生物体的n种不同基因或者其组合。
本文中的孵育是指在相应的检测温度下依赖于相应的靶核酸的存在而诱导信号变化的任何反应，因为每种靶核酸与用于检测靶核酸的相应组合物发生反应。
在一个实施方案中，孵育包括多个循环。
在一个实施方案中，孵育可以包括扩增反应，并且可以包括例如信号扩增反应和/或核酸扩增反应。
在一个实施方案中，扩增反应包括多个循环。
在一个实施方案中，孵育在允许靶标扩增和用于检测靶核酸的组合物的信号变化的条件下进行。此类条件包括反应的温度、盐浓度和pH。
在一个实施方案中，孵育在没有核酸扩增的信号扩增过程中进行。
在一个实施方案中，可以在靶标扩增的同时扩增信号。可替选地，可以在没有靶标扩增的情况下扩增信号。
在一个实施方案中，信号变化在包括信号扩增和靶标扩增的过程期间发生。
在一个实施方案中，可以通过聚合酶链式反应(PCR)进行靶核酸的扩增。PCR在本领域中广泛用于扩增靶核酸，并且包括以下循环：靶核酸的变性、靶核酸和引物之间的退火(杂交)、以及引物的延伸(Mullis等人，美国专利号4,683,195,4,683,202,和4,800,159；Saiki等人,(1985)Science 230,1350-1354)。
在扩增反应中可以使用各种DNA聚合酶，并且包括大肠杆菌DNA聚合酶I的“Klenow”片段、热稳定DNA聚合酶和噬菌体T7 DNA聚合酶。特别是，聚合酶是从各种细菌可获得的热稳定DNA聚合酶，所述细菌包括水生栖热菌(Thermus aquaticus，Taq)、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus，Tth)、丝状栖热菌(Thermus filiformis)、黄色栖热菌(Thermis flavus)、海滨嗜热球菌(Thermococcus literalis)和激烈火球菌(Pyrococcusfuriosus，Pfu)。大多数聚合酶可以从细菌分离，或者可以商购。
上述扩增方法可以通过在温度变化或不变化的情况下重复一系列反应来扩增靶核酸和/或信号。扩增的单元包括此类系列反应的重复，被称为“循环”。循环可以表示为重复次数或持续时间，依赖于使用的扩增方法。
在一个实施方案中，系列反应可以顺序进行。例如，对于PCR，在靶核酸(即模板)的变性之后，引物退火，随后可以顺序进行引物的延伸。在这种情况下，循环可以表示为重复次数。
在一个实施方案中，孵育可以进行多个循环，其允许测量依赖于靶核酸的存在的信号变化。例如，多个循环可以包括2至100个循环、2至90个循环、2至80个循环、2至70个循环、2至60个循环、2至50个循环、2至40个循环、2至30个循环、2至20个循环、2至10个循环、5至100个循环、5至90个循环、5至80个循环、5至70个循环、5至60个循环、5至50个循环、5至40个循环、5至30个循环、5至20个循环、5至10个循环、10至100个循环、10至90个循环、10至80个循环、10至70个循环、10至60个循环、10至50个循环、10至40个循环、10至30个循环、10至20个循环、20至100个循环、20至90个循环、20至80个循环、20至70个循环、20至60个循环、20至50个循环、20至40个循环或20至30个循环，并且特别是，可以包括10个循环、15个循环、20个循环、25个循环、30个循环、35个循环、40个循环、45个循环或50个循环。
在一个实施方案中，可以在包括多个循环的孵育反应的每个循环、所选择的几个循环或在终点循环进行信号检测。
在一个实施方案中，扩增反应可以是用于多种靶核酸的扩增反应。
本文中使用的术语“用于多种靶核酸的扩增反应”是指在单一反应容器中扩增两种或多种靶核酸的反应。用于多种靶核酸的扩增反应是指一起扩增两个或多个核酸的反应。例如，用于多种靶核酸的扩增反应可以在单个反应中一起扩增2种或更多种、3种或更多种、4种或更多种、5种或更多种、6种或更多种、7种或更多种、8种或更多种、9种或更多种、10种或更多种、20种或更多种、30种或更多种、40种或更多种、或50种或更多种的靶核酸。
在一个实施方案中，本发明的方法可以通过在单个反应容器中使用单一类型的标记检测2至50、2至40、2至30、2至20、2至15、2至12、2至10、2至9、2至8、2至7、2至6、2至5、3至50、3至40、3至30、3至20、3至15、3至12、3至10、3至9、3至8、3至7、3至6、3至5、4至50、4至40、4至30、4至20、4至15、4至12、4至10、4至9、4至8、4至7、4至6或4至5种靶核酸。
根据本公开的方法用于确定样品中是否存在n种靶核酸中的至少一种。例如，当n是2时，本公开的方法可以用于确定样品中是否存在第一靶核酸和第二靶核酸中的至少一种。作为另一实例，当n是3时，本公开的方法可以用于确定样品中是否存在第一靶核酸、第二靶核酸和第三靶核酸中的至少一种。
在一个实施方案中，n是2或更大的整数。例如，n可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45或50，但不限于此。
本公开中，用于检测n种靶核酸的组合物的组合用于检测n种靶核酸中的每一种，其中n是2或更大的整数。换言之，用于检测第一至第n靶核酸的组合物的组合用于检测第一靶核酸至第n靶核酸。
如在本文中所使用的，术语“用于检测第一至第n靶核酸的组合物的组合”指特异性针对第一至第n靶核酸的每一个的组合物的组合(compilation)或混合物。在这里，用于检测一种靶核酸的组合物对同一靶核酸具有特异性。表述“用于检测靶核酸的组合物对同一靶核酸具有特异性”指用于检测靶核酸的组合物参与同一靶核酸的检测，但是不参与其他靶核酸的检测。换言之，该表述指用于检测靶核酸的组合物与同一靶核酸相互作用，但是不与其他靶核酸相互作用。
在这里，用于检测第n靶核酸的组合物对同一靶核酸具有特异性。例如，用于检测第一靶核酸的组合物对第一靶核酸具有特异性，用于检测第二靶核酸的组合物对第二靶核酸具有特异性，以及用于检测第三靶核酸的组合物对第三靶核酸具有特异性。
如在本文中所使用的用于检测第一至第n靶核酸的组合物的组合在单一反应中使用。换言之，用于检测第一至第n靶核酸的组合物共同存在于单一反应溶液或反应容器中。
如在本文中所使用的，术语“用于检测靶核酸的组合物”指包含用于检测靶核酸的组分的组合物。
根据本公开的方法，用于检测第一至第n靶核酸的组合物的每一个都包含一个标记，该标记依赖于同一靶核酸的存在提供信号，并且从用于检测第一至第n靶核酸的组合物的每一个提供的信号不能通过单个信号检测通道彼此之间区分。
用于检测靶核酸的组合物可以包含参与扩增和/或检测靶核酸的各种寡核苷酸。
本文中的标记可以连接至寡核苷酸或者可以以游离形式存在。或者，可以在孵育期间将标记并入寡核苷酸中。
尽管将标记和寡核苷酸描述为在用于检测第一至第n靶核酸的组合物中的关键要素，但是本领域技术人员应理解的是，在组合物中还可以包含各种其他组分。
在用于检测靶核酸的组合物中包含的组分的实例包括但不限于用于扩增或检测靶核酸的寡核苷酸集合、标记、核酸聚合酶、缓冲剂、聚合酶辅因子和脱氧核糖核苷酸-5-三磷酸。任选地，组合物还可以包含各种多核苷酸分子、逆转录酶、各种缓冲剂和试剂以及抑制DNA聚合酶活性的抗体。组合物还可以包含进行阳性和阴性对照反应所需的试剂。有了本公开的益处，本领域普通技术人员可以容易地确定将用于给定反应的试剂的最佳量。组合物的上述组分可以存在于单独的容器中，或者多个组分可以存在于单一容器中。
在本公开中使用的用于检测n种靶核酸的n种组合物的每一种是以下任一种：(i)Under信号变化型(UnderSC型)组合物，(ii)Inter信号变化型(InterSC型)组合物和(iii)Over信号变化型(OverSC型)组合物，条件是用于检测n种靶核酸的n种组合物的至少一个是InterSC型组合物，其根据如上文所述的L-PTOCE测定产生信号。例如，当n是2时，用于检测第一靶核酸的组合物和用于检测第二靶核酸的组合物中的至少一个是L-PTOCE组合物。特别地，当n是2时，用于检测第一靶核酸的组合物和用于检测第二靶核酸的组合物的示例性组合如下表1所示。当n是3时，用于检测第一至第三靶核酸的组合物的示例性组合如下表2所示。
在表1和表2中，“UnderSC”、“InterSC”和“OverSC”分别指UnderSC型、InterSC型和OverSC型组合物。
【表1】
n＝2 用于检测第一靶核酸的组合物 用于检测第二靶核酸的组合物
1 UnderSC L-PTOCE
2 L-PTOCE L-PTOCE
3 L-PTOCE InterSC
4 InterSC L-PTOCE
5 L-PTOCE OverSC
【表2】
UnderSC型、InterSC型和OverSC型组合物的细节参见WO2022-265463，其全部内容通过引用并入本文。
在一个实施方案中，用于检测靶核酸的n种组合物中的每一种在n种检测温度中的相应检测温度下提供信号变化，所述信号变化表明存在相应靶核酸。
例如，在存在第i靶核酸时，用于检测n种靶核酸中的第i靶核酸的组合物在n种检测温度中的第i检测温度下提供信号变化，并且在其他检测温度下提供恒定信号。
在一个实施方案中，i表示1至n的整数，并且第i检测温度低于第(i+1)检测温度。在一个实施方案中，当i是n时，不存在i+1检测温度(即，n+1种检测温度)。例如，当n是3时，i表示1至3的整数，并且有第一检测温度、第二检测温度和第三检测温度，其中第一检测温度低于第二检测温度，第二检测温度低于第三检测温度。
根据本公开，在覆盖全部n种检测温度的温度范围内，用于检测第i靶核酸的组合物具有信号变化温度范围(SChTR)，其中信号变化依赖于第i靶核酸的存在，以及一个或两个信号恒定温度范围(SCoTR)，其中即使在第i靶核酸存在时，信号也是恒定的。
在一个实施方案中，用于检测第i靶核酸的组合物是以下任一种：(i)Under信号变化型(UnderSC型)组合物，其具有信号变化温度范围低于信号恒定温度范围的熔融特征，(ii)Inter信号变化型(InterSC型)组合物，其具有信号变化温度范围高于两个信号恒定温度范围中的一个并且低于两个信号恒定温度范围中的另一个的熔融特征，以及(iii)Over信号变化型(OverSC型)组合物，其具有信号变化温度范围高于信号恒定温度范围的熔融特征。
在一个实施方案中，在存在第i靶核酸时，用于检测第i靶核酸的组合物在第i检测温度下在靶核酸扩增时提供信号变化(即，第i信号的变化)，而在其他检测温度下即使靶核酸被扩增也不提供信号变化(即，信号是恒定的)。也就是说，用于检测第i靶核酸的组合物具有信号变化温度范围，其中随着第i靶核酸被扩增信号发生变化，以及信号恒定温度范围，其中即使第i靶核酸被扩增信号也是恒定的。
如本文所用，术语“第i信号”是指用于检测第i靶核酸的组合物在第i检测温度下提供的信号，其与“在第i检测温度下的信号”可互换使用。
在一个实施方案中，当检测n种靶核酸时，第i信号可以指在第i检测温度下由用于检测靶核酸的n种组合物(包括用于检测第i靶核酸的组合物)提供的信号。
在一个实施方案中，在不存在第i靶核酸的情况下，用于检测第i靶核酸的组合物不提供信号变化，即，在孵育反应(例如，靶核酸扩增反应)期间在第i检测温度下提供恒定信号。
在一个实施方案中，信号变化温度范围是某一温度范围，在该温度范围内在靶核酸存在时和在靶核酸不存在时的信号值(例如，信号强度)产生差异。
在一个实施方案中，信号变化温度范围是某一温度范围，在该温度范围内依赖于靶核酸扩增水平(例如，扩增的靶核酸的量)信号值发生变化。
在一个实施方案中，信号恒定温度范围是某一温度范围，在该温度范围内无论是否存在靶核酸，信号值都不会变化。换言之，信号恒定温度范围是某一温度范围，在该温度范围内在存在靶核酸的情况下的信号值和在不存在靶核酸的情况下的信号值之间不存在差异。
在一个实施方案中，第i检测温度可以选自用于检测第i靶核酸的组合物的信号变化温度范围内。在本公开中，将用于检测第i靶核酸的组合物称为具有第i检测温度。此外，可以将对应于用于检测第i靶核酸的组合物的第i靶核酸称为具有第i检测温度的靶核酸。
在一个实施方案中，将由用于检测相应靶核酸的组合物确定的一种检测温度分配给一种靶核酸。
在某些实施方案中，当n是2时，用于检测第一靶核酸的组合物在第一靶核酸存在时在第一检测温度下提供信号变化并且在第二检测温度下提供恒定信号；以及用于检测第二靶核酸的组合物在第二靶核酸存在时在第二检测温度下提供信号变化并且在第一检测温度下提供恒定信号。
在某些实施方案中，当n是3时，用于检测第一靶核酸的组合物在第一靶核酸存在时在第一检测温度下提供信号变化并且在第二检测温度和第三检测温度下提供恒定信号；用于检测第二靶核酸的组合物在第二靶核酸存在时在第二检测温度下提供信号变化并且在第一检测温度和第三检测温度下提供恒定信号；以及用于检测第三靶核酸的组合物在第三靶核酸存在时在第三检测温度下提供信号变化并且在第一检测温度和第二检测温度下提供恒定信号。
在一个实施方案中，第i检测温度选自用于检测第i靶核酸的组合物的信号变化温度范围内，并且第i检测温度不包括在用于检测其他靶核酸的组合物的信号变化温度范围内。
在一个实施方案中，用于检测靶核酸的任一组合物的信号变化温度范围可以与用于检测具有相邻检测温度的靶核酸的组合物的信号变化温度范围重叠，而不与用于检测其检测温度不相邻的靶核酸的组合物的信号变化温度范围重叠。在这种情况下，在不与用于检测另一靶核酸的组合物的信号变化温度范围重叠的信号变化温度范围内，选择用于检测靶核酸的组合物的检测温度，所述靶核酸具有与用于检测其他靶核酸的组合物的信号变化温度范围重叠的信号变化温度范围。通过这样选择检测温度，在单个检测温度下只能提供指示单一特定靶核酸存在的信号。
在一个实施方案中，用于检测靶核酸的任一组合物的信号变化温度范围可以与用于检测具有相邻检测温度的靶核酸的组合物的信号变化温度范围重叠，但是这两个信号变化温度范围中的任一个都不完全包括在另一个信号变化温度范围中。
本文使用术语“相邻检测温度”指n种检测温度中的连续检测温度，并且例如，第i检测温度的相邻检测温度为第(i-1)检测温度或第(i+1)检测温度。
在一个实施方案中，用于检测第i靶核酸的组合物的信号变化温度范围可以部分地与用于检测具有相邻检测温度的靶核酸的组合物的信号变化温度范围重叠，而不与用于检测具有与其不相邻的检测温度的靶核酸的组合物的信号变化温度范围重叠。
在一个实施方案中，用于检测第i靶核酸的组合物可以具有一个信号变化温度范围和一个信号恒定温度范围。
在一个实施方案中，用于检测第i靶核酸的组合物可以具有一个信号变化温度范围和两个信号恒定温度范围。
在一个实施方案中，用于检测第i靶核酸的组合物包含标记，所述标记提供依赖于第i靶核酸存在的信号。
在一个实施方案中，本文中的标记可以连接至寡核苷酸或者可以以游离形式存在。或者，在孵育(例如，核酸扩增)期间可以将标记引入寡核苷酸中。换言之，用于检测靶核酸的组合物最初可以包含标记的寡核苷酸，或者可以在孵育反应期间将标记引入新产生的寡核苷酸(例如，延伸链)来提供标记的寡核苷酸。
在一个实施方案中，用于检测第i靶核酸的组合物包含引入的标记，其在孵育期间引入寡核苷酸中，并且依赖于第i靶核酸的存在提供信号。
在一个实施方案中，用于检测第i靶核酸的组合物提供标记的寡核苷酸，其用于依赖于第i靶核酸的存在提供信号。
在一个实施方案中，用于检测第i靶核酸的组合物最初包含标记的寡核苷酸，其用于依赖于第i靶核酸的存在提供信号。如在本文中所述的，CTO对应于标记的寡核苷酸的实例。
或者，用于检测第i靶核酸的组合物可以包含寡核苷酸和依赖于第i靶核酸存在提供信号的标记，以及所述标记在孵育反应(例如，核酸扩增反应)期间引入寡核苷酸，从而提供标记的寡核苷酸，其用于依赖于第i靶核酸的存在提供信号。
如本文所用，术语“标记的寡核苷酸”是指参与被检测信号的产生的寡核苷酸。
在一个实施方案中，标记的寡核苷酸可以包括与靶核酸(例如探针或引物)特异性杂交的寡核苷酸；当与靶核酸杂交的探针或引物被切割以释放片段时，标记的寡核苷酸可以包含与所述片段特异性杂交的捕获寡核苷酸；当与捕获寡核苷酸杂交的片段延伸以形成延伸链时，标记的寡核苷酸可以包括与所述延伸链特异性杂交的寡核苷酸、在片段延伸过程中通过并入标记而产生的寡核苷酸、与捕获寡核苷酸特异性杂交的寡核苷酸及其组合。
在一个实施方案中，标记的寡核苷酸包括参与实际信号产生的寡核苷酸。例如，标记的寡核苷酸和另一种寡核苷酸(例如，包含与标记的寡核苷酸或靶核酸互补的核苷酸序列的寡核苷酸)之间的杂交或非杂交确定了信号的产生。
在一个实施方案中，标记的寡核苷酸可以是本领域已知的“探针”。如本文所用，术语“探针”是指包含与靶核酸序列基本上互补的一个或多个部分的单链核酸分子。根据本公开的一个实施方案，探针的3'-末端被“封闭”以阻止其延伸。可以根据常规方法实现封闭。例如，可以通过向最后一个核苷酸的3′-羟基添加化学部分(如生物素、标记、磷酸基、烷基、非核苷酸接头、硫代磷酸酯或烷-二醇残基)来进行封闭。或者，封闭可以通过去除最后一个核苷酸的3’羟基或使用没有3’羟基的核苷酸如双脱氧核苷酸来进行。
在一个实施方案中，标记的寡核苷酸可以由至少一种寡核苷酸组成。根据本发明的实施方案，当标记的寡核苷酸由多个寡核苷酸组成时，标记的寡核苷酸可以以各种方式标记。例如，多个寡核苷酸的全部或部分可以具有至少一个标记。
在一个实施方案中，标记可以是单个标记或相互作用的标记。
例如，单个标记包括荧光标记、发光标记、化学发光标记、电化学标记和金属标记。在一个实施方案中，单个标记依赖于其在双链或单链上的存在而提供不同的信号(例如不同的信号强度)。在一个实施方案中，单个标记是荧光标记。本公开中使用的单个荧光标记的优选类型和结合位点公开于美国专利号7,537,886和7,348,141中，其通过引用整体并入本文。例如，单个荧光标记包括，而不限于JOE、FAM、TAMRA、ROX和基于荧光素的标记。可以通过各种方法将单个标记与寡核苷酸连接。例如，标记可以经由含有碳原子的间隔子(例如3-碳间隔子、6-碳间隔子或12-碳间隔子)与探针连接。
在一个实施方案中，相互作用的标记可以包括至少一个报告分子和至少一个淬灭分子。特别是，相互作用的标记可以包括一个报告分子和一个淬灭分子。或者，相互作用的标记可以包括一个报告分子和两个淬灭分子。
本公开使用的报告分子和淬灭分子可包括本领域已知的任何分子，其具体细节见说明书第一方面中关于报告分子和淬灭分子的描述章节。
在一个实施方案中，当标记是相互作用的标记时，所述相互作用的标记可以包括至少一个报告分子和至少一个淬灭分子，其中所述相互作用的标记可以全部与一种寡核苷酸连接或者可以连接到多个寡核苷酸中的每一种。
在一个实施方案中，并入标记可以用于在引物延伸期间并入标记的过程中，以产生信号(例如Plexor技术，Sherrill CB等人,Journal of the American ChemicalSociety,126:4550-45569(2004))。此外，在通过双链体产生信号中可以使用并入标记，所述双链体以依赖于与靶核酸杂交的介导寡核苷酸切割的方式形成。
在一个实施方案中，并入标记一般可以与核苷酸连接。此外，可以使用具有非天然碱基的核苷酸。
如本文所用，术语“非天然碱基”是指天然碱基的衍生物，如腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)，其能够形成氢键碱基对。如本文所用，术语“非天然碱基”包括具有与作为母体化合物的天然碱基不同的碱基配对模式的碱基，例如描述于美国专利5,432,272、5,965,364、6,001,983和6,037,120中。与天然碱基一样，非天然碱基之间的碱基配对包括两个或三个氢键。非天然碱基之间的碱基配对也以特定的方式形成。非天然碱基的具体实例包括以下碱基对组合中的碱基：iso-C/iso-G、iso-dC/iso-dG、Z/P、V/J、K/X、H/J、Pa/Ds、Pa/Q、Pn/Ds、Pn/Dss、Px/Ds、NaM/5SICS、5FM/5SICS和M/N(参见美国专利号5,432,272；5,965,364；6,001,983；6,037,120；6,140,496；6,627,456；6,617,106；和7,422,850；和Filip Wojciechowski等人,Chem.Soc.Rev.,2011,40，5669-5679)。
用于检测多种靶核酸的常规方法的缺点是对多种靶核酸进行实时检测时需要使用不同类型的荧光标记，或者甚至当使用单一类型的荧光标记时需要额外的分析，如熔融曲线分析。与之相反，根据本公开的方法可以使用单一类型的标记(例如单个荧光标记)以实时方式检测多种靶核酸，而不需要额外的分析，如熔融分析。
在一个实施方案中，用于检测靶核酸的n种组合物中的每一种提供一种或多种双链体。
如本文所用，术语"双链体"是指在杂交条件下，由两条序列彼此部分或完全互补的单链核酸分子通过杂交形成的双链核酸分子。形成双链体的两个单链核酸分子可以以结合形式(即双链分子)或解离形式(即两条单链分子)存在，依赖于温度(特别是检测温度)。在这方面，术语“双链体”当指代表述“用于检测靶核酸的组合物提供双链体”时，用于涵盖结合形式的双链体和解离形式的双链体。
在一个实施方案中，双链体还可以称为“杂交体”。
如本文所用，表述“用于检测靶核酸的组合物提供双链体”可以指提供结合形式的双链体和/或解离形式的双链体的组合物。同样，如本文所用，表述“用于检测靶核酸的组合物在孵育期间产生双链体”可以指在孵育反应期间产生结合形式的双链体和/或解离形式的双链体的组合物。
在一个实施方案中，由用于检测靶核酸的组合物提供的双链体中的至少一种是提供信号的双链体。特别是，双链体是提供信号变化的双链体。换言之，用于检测第i靶核酸的组合物提供了提供信号的双链体，并且特别是，用于检测第i靶核酸的组合物提供了提供信号变化的双链体，所述信号变化依赖于第i靶核酸的存在。
如本文所用，术语“提供信号的双链体”是指能够提供信号的双链体，所述信号可以根据双链体是结合形式还是解离形式来区分。例如，这意味着结合形式的双链体产生信号(或使其消失)，而解离形式的双链体使信号消失(或产生信号)。
在一个实施方案中，提供信号的双链体可以包括至少一个标记。
如本文所用，术语“提供信号变化的双链体”是指提供表明存在靶核酸的信号变化的双链体，该提供信号变化的双链体的量根据靶核酸的存在而变化。具体来说，根据本公开的延伸双链体对应于提供本文所述信号变化的双链体的实例。
在一个实施方案中，提供信号变化的双链体包含标记。特别是，至少一个标记与构成双链体的两个单链核酸分子中的至少一个连接。例如，提供信号变化的双链体包含单个标记，并且在这种情况下，所述单个标记与构成双链体的两个单链核酸分子中的任何一个连接。作为另一个实例，提供信号变化的双链体包括相互作用的标记，在这种情况下，相互作用的标记全部与构成提供信号变化的双链体的两个单链核酸分子中的一个连接，或者相互作用的标记中的一个与两个单链核酸分子中的一个连接，而相互作用的标记中的另一个与两个单链核酸分子中的另一个连接。
在一个实施方案中，用于检测第i靶核酸的组合物提供了提供信号变化的双链体。
在一个实施方案中，当提供信号变化的双链体是结合形式时，用于检测第i靶核酸的组合物由标记提供信号。换言之，用于检测第i靶核酸的组合物提供依赖于构成双链体的两个单链核酸分子的结合的信号。
在可替选的实施方案中，当提供信号变化的双链体是解离形式时，用于检测第i靶核酸的组合物由标记提供信号。换言之，用于检测第i靶核酸的组合物提供依赖于构成双链体的两个单链核酸分子的解离的信号。
在一个实施方案中，双链体的结合或解离可以依赖于温度。
在一个实施方案中，提供信号变化的双链体可以是最初(原先)已经包含于用于检测靶核酸的组合物中的双链体。
在一个实施方案中，当提供信号变化的双链体已经包含于用于检测靶核酸的组合物中时，可以通过标记的寡核苷酸和与标记的寡核苷酸可杂交的寡核苷酸之间的杂交而产生双链体。本公开的CTO/LPHO杂交体或双链核酸杂交探针(美国专利第7,799,522号，亦称阴阳(Yin-Yang)探针)是依赖于靶核酸的存在提供信号变化的示例性双链体，其最初被包含在用于检测靶核酸的组合物中。
在一个实施方案中，当提供信号变化的双链体最初已经包含于用于检测靶核酸的组合物中时，提供信号变化的双链体的量以依赖于靶核酸的存在的方式变化，特别是减少，从而提供信号变化。例如，CTO/LPHO杂交体的量随着延伸双链体的产生而减少，所述延伸双链体的产生依赖于靶核酸的存在，从而提供了依赖于靶核酸存在的信号变化。
在一个实施方案中，提供信号变化的双链体可以是在孵育反应期间由用于检测靶核酸的组合物新提供的双链体。
在一个实施方案中，可以通过标记的寡核苷酸和靶核酸之间的杂交来提供在孵育反应期间产生的提供信号变化的双链体。
通过标记寡核苷酸与靶核酸之间形成双链体而产生的信号可以通过各种方法生成，包括Scorpion方法(Whitcombe等人，Nature Biotechnology 17:804-807(1999))，Sunrise(或Amplifluor)方法(Nazarenko等人，Nucleic Acids Research,25(12):2516-2521(1997)，以及美国专利号6,117,635)，LUX方法(美国专利号7,537,886)，Plexor方法(Sherrill CB等人，Journal of the American Chemical Society,126:4550-4556(2004))，分子信标方法(Tyagi等人，Nature Biotechnology v.14MARCH 1996)，Hybeacon方法(French DJ等人，Mol.Cell Probes,15(6):363-374(2001))，相邻杂交探针方法(Bernard P.S.等人，Anal.Biochem.,273:221(1999))，和LNA方法(美国专利号6,977,295)。
在一个实施方案中，在孵育反应期间产生的提供信号变化的双链体可以是通过依赖于靶核酸的存在的切割反应而产生的双链体。根据本公开的延伸的双链体是依赖于靶核酸的存在的切割反应而产生的双链体的实例。
在一个实施方案中，通过依赖于与靶核酸特异性杂交的介导寡核苷酸的切割而产生的双链体来产生信号变化。
如本文所用，术语“介导寡核苷酸(mediation oligonucleotide)”是指介导双链体产生的寡核苷酸，不包括靶核酸。
在一个实施方案中，单独的介导寡核苷酸的切割不产生信号，但是在介导寡核苷酸的杂交和切割之后，通过切割产生的片段(切割产物)参与信号产生的系列反应。
在一个实施方案中，单独的介导寡核苷酸的杂交或切割不产生信号。
在一个实施方案中，介导寡核苷酸包括与靶核酸杂交并被切割以释放片段的寡核苷酸，从而介导双链体的产生。
在一个实施方案中，所述片段通过在捕获寡核苷酸上的片段延伸来介导双链体的产生。
根据一个实施方案，介导寡核苷酸包含(i)靶向部分，其包含与靶核酸杂交的核苷酸序列，和(ii)标记部分，其包含与靶核酸不杂交的核苷酸序列。
在一个实施方案中，用于检测靶核酸的组合物可以包含与靶核酸杂交的标记寡核苷酸，以及依赖于靶核酸的存在的切割反应可以涉及切割标记寡核苷酸。标记寡核苷酸对应于上述介导寡核苷酸的实例，本公开的PTO对应于标记寡核苷酸的实例。
根据一个实施方案，介导寡核苷酸的切割释放了片段，并且所述片段与捕获寡核苷酸特异性杂交并在捕获寡核苷酸上延伸。当捕获寡核苷酸包含标记时，所述捕获寡核苷酸对应于本文所述的标记的寡核苷酸的实例。
根据一个实施方案，与靶核酸杂交的介导寡核苷酸被切割并释放片段，所述片段与捕获寡核苷酸特异性杂交，并且所述片段延伸以产生延伸链，这诱导在延伸链和捕获寡核苷酸之间形成延伸双链体，从而提供表明存在靶核酸的信号。
根据一个实施方案，可以使用包含与延伸链杂交的核苷酸序列的第三寡核苷酸。当使用第三寡核苷酸时，延伸链和第三寡核苷酸的杂交形成另一种类型的双链体，从而提供指示靶核酸存在的信号(例如PCE-SH)。在这种情况下，另一种类型的双链体是提供信号变化的双链体。
可以通过各种方法产生依赖于介导寡核苷酸的切割的方式产生的双链体的信号，所述方法包括PTOCE(PTO切割及延伸)方法(WO 2012/096523)、PCE-SH(PTO切割及延伸依赖性信号传导寡核苷酸杂交)方法(WO 2013/115442)和PCE-NH(PTO切割及延伸依赖性非杂交)方法(WO 2014/104818)。
关于以上参考文献中公开的术语，寡核苷酸的相应实例如下：介导寡核苷酸对应于PTO(探测和标记寡核苷酸)，捕获寡核苷酸对应于CTO(捕获和模板寡核苷酸)，而第三寡核苷酸对应于SO(信号传导寡核苷酸)或第三寡核苷酸对应于HO(杂交寡核苷酸)。SO、HO、CTO、延伸链或其组合可以起到标记的寡核苷酸的作用。
在一个实施方案中，提供信号变化的双链体可以是单一类型双链体或多种类型双链体。具体地，当提供信号变化的双链体是单一类型双链体时，双链体的数量可以为1，而当提供信号变化的双链体是多种类型双链体时，双链体的数量可以为2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20，具体地，可以为2、3或4，并且更具体地，可以为2或3。
在一个实施方案中，单一类型双链体或多种类型双链体中的任何双链体包括标记。
在一个实施方案中，当提供信号变化的双链体是单一类型双链体时，单一类型双链体的量根据靶核酸的存在而变化，从而使信号变化。
在一个实施方案中，当双链体是多种类型的双链体时，多种类型双链体之间的量的比例根据靶核酸的存在而变化，从而使信号变化。
在一个实施方案中，多种类型双链体的Tm值彼此不同。例如，双链体的Tm值彼此相差至少2℃、至少3℃、至少4℃、至少5℃、至少7℃、至少8℃、至少9℃、至少10℃、至少11℃、至少12℃、至少13℃、至少14℃、至少15℃或至少20℃。
在一个实施方案中，双链体的量指解离形式的双链体的量和结合形式的双链体的量之和。
在一个实施方案中，多种类型双链体中的至少两种包含相同的单链核酸分子。当多种类型双链体包含相同单链核酸分子时，相同单链核酸分子包含于第一双链体中，所述第一双链体最初包含于用于检测靶核酸的组合物中，并且在孵育反应期间，可以产生包含相同单链核酸分子的新的第二双链体。在这种情况下，包含在第一双链体中的相同单链核酸分子可被认为在孵育反应中通过参与第二双链体的生成而被消耗，从而导致第一双链体的量减少和第二双链体的量增加。
在一个实施方案中，可以根据提供信号变化的双链体的长度和/或序列来确定用于检测第i靶核酸的组合物的信号变化温度范围。
在一个实施方案中，用于检测第i靶核酸的组合物提供单一类型双链体，用于检测第i靶核酸的组合物可以具有一个信号变化温度范围和一个信号恒定温度范围。可以根据单一类型双链体的长度和/或序列来确定信号变化温度范围和信号恒定温度范围。
在一个实施方案中，当用于检测第i靶核酸的组合物提供多种类型双链体(特别是两种不同类型的双链体)时，用于检测第i靶核酸的组合物可以具有一个信号变化温度范围和两个信号恒定温度范围。可以基于两种不同类型的双链体的长度和/或序列来确定信号变化温度范围和信号恒定温度范围。
在一个实施方案中，用于检测靶核酸的n种组合物中的任何一种均可以包含用于扩增相应的靶核酸的扩增寡核苷酸。在一个实施方案中，扩增寡核苷酸可以与标记的寡核苷酸相同。
如本文所用，术语“扩增寡核苷酸”是指用于扩增靶核酸的任何寡核苷酸。
在一个实施方案中，扩增寡核苷酸可以是本领域已知的“引物”。如本文所用，术语“引物”是指一种寡核苷酸，当放置在诱导合成与靶核酸链(模板)互补的引物延伸产物的条件下时，即，在存在核苷酸和聚合剂(如DNA聚合酶)时，并在合适的温度和pH下，所述寡核苷酸能够作为合成的起始点。引物必须足够长，以便在存在聚合剂时引发(prime)合成延伸产物。引物的合适长度由多种因素确定，包括温度、应用领域和引物的来源。
引物可以包括正向引物(也称为上游引物或上游寡核苷酸)、反向引物(也称为下游引物或下游寡核苷酸)或两者。扩增寡核苷酸可以是具有本领域已知结构的寡核苷酸，或可以通过本领域已知的方法合成。
扩增寡核苷酸和标记的寡核苷酸相同，这意味着单个寡核苷酸同时作为扩增靶核酸的扩增寡核苷酸，并且作为在存在靶核酸时产生信号的标记的寡核苷酸。作为一个实例，标记的寡核苷酸可以与靶核酸杂交并延伸，从而产生信号。
需注意，本公开中使用的检测靶核酸的组合物在靶核酸存在时并不一定能在任何温度下都提供信号。
在一个实施方案中，即使当用于检测靶核酸的组合物的信号产生机制相同时，包括不同序列的寡核苷酸的用于检测靶核酸的组合物也可以被认为是彼此不同的。用于检测核酸的不同组合物具有彼此不同的检测温度。
在一个实施方案中，根据本公开的检测温度可以按照用于检测靶核酸的n种组合物中每一种组合物的信号变化温度范围来预先确定。
在一个实施方案中，用于检测靶核酸的n种组合物中的任何一种的信号变化温度范围可以基于双链体的长度和/或序列来确定。换言之，通过调整双链体的Tm值，可以预先确定信号变化温度范围。
在一个实施方案中，当信号变化由与靶核酸特异性杂交的标记的寡核苷酸(例如，分子信标(molecular beacon))产生时，可以通过调整标记的寡核苷酸的Tm值，在预定的检测温度下成功地实现信号检测。
在一个实施方案中，当由在靶核酸存在时产生的双链体提供信号时，通过调节双链体的Tm值，在预定温度下成功地实现信号检测。
如上所述，根据信号变化温度范围确定检测温度，所述信号变化温度范围根据用于检测靶核酸的组合物提供的双链体而变化。
在一个实施方案中，可以在信号变化温度范围内预先确定用于检测n种靶核酸的n种组合物中的任何一种的检测温度，所述信号变化温度范围不与其他组合物的信号变化温度范围重叠。
在一个实施方案中，分配至用于检测靶核酸的组合物的检测温度彼此相差至少2℃、至少3℃、至少4℃、至少5℃、至少7℃、至少8℃、至少9℃、至少10℃、至少11℃、至少12℃、至少15℃或至少20℃或更多。
在一个实施方案中，n种检测温度可以选自45℃至97℃、45℃至96℃、45℃至95℃、45℃至94℃、45℃至93℃、45℃至92℃、45℃至91℃、45℃至90℃、46℃至97℃、46℃至96℃、46℃至95℃、46℃至94℃、46℃至93℃、46℃至92℃、46℃至91℃、46℃至90℃、47℃至97℃、47℃至96℃、47℃至95℃、47℃至94℃、47℃至93℃、47℃至92℃、47℃至91℃、47℃至90℃、48℃至97℃、48℃至96℃、48℃至95℃、48℃至94℃、48℃至93℃、48℃至92℃、48℃至91℃、48℃至90℃、49℃至97℃、49℃至96℃、49℃至95℃、49℃至94℃、49℃至93℃、49℃至92℃、49℃至91℃、49℃至90℃、50℃至97℃、50℃至96℃、50℃至95℃、50℃至94℃、50℃至93℃、50℃至92℃、50℃至91℃或50℃至90℃的温度范围。
例如，n种检测温度中的最高检测温度(即第n检测温度)可以选自70℃至97℃、70℃至95℃、70℃至93℃、70℃至90℃、73℃至97℃、73℃至95℃、73℃至93℃、73℃至90℃、75℃至97℃、75℃至95℃、75℃至93℃、75℃至90℃、78℃至97℃、78℃至95℃、78℃至93℃、78℃至90℃、80℃至97℃、80℃至95℃、80℃至93℃、80℃至90℃、83℃至97℃、83℃至95℃、83℃至93℃、83℃至90℃、85℃至97℃、85℃至95℃、85℃至93℃或85℃至90℃的温度范围。
例如，n种检测温度中的最低检测温度(即，第一检测温度)可以选自45℃至70℃、45℃至68℃、45℃至65℃、45℃至63℃、45℃至60℃、45℃至58℃、45℃至55℃、48℃至70℃、48℃至68℃、48℃至65℃、48℃至63℃、48℃至60℃、48℃至58℃、48℃至55℃、50℃至70℃、50℃至68℃、50℃至65℃、50℃至63℃、50℃至60℃、50℃至58℃或50℃至55℃的温度范围。
例如，n种检测温度中的中间检测温度(例如，从第二检测温度至第(n-1)检测温度)可以选自55℃至85℃、55℃至83℃、55℃至80℃、55℃至78℃、55℃至75℃、55℃至73℃、55℃至70℃、55℃至68℃、55℃至65℃、55℃至63℃、55℃至60℃、58℃至85℃、58℃至83℃、58℃至80℃、58℃至78℃、58℃至75℃、58℃至73℃、58℃至70℃、58℃至68℃、58℃至65℃、58℃至63℃、58℃至60℃、60℃至85℃、60℃至83℃、60℃至80℃、60℃至78℃、60℃至75℃、60℃至73℃、60℃至70℃、60℃至68℃、60℃至65℃、60℃至63℃、63℃至85℃、63℃至83℃、63℃至80℃、63℃至78℃、63℃至75℃、63℃至73℃、63℃至70℃、63℃至68℃、63℃至65℃、65℃至85℃、65℃至83℃、65℃至80℃、65℃至78℃、65℃至75℃、65℃至73℃、65℃至70℃、65℃至68℃、68℃至85℃、68℃至83℃、68℃至80℃、68℃至78℃、68℃至75℃、68℃至73℃、68℃至70℃、70℃至85℃、70℃至83℃、70℃至80℃、70℃至78℃、70℃至75℃或70℃至73℃的温度范围。
在一个实施方案中，将n种靶核酸分别分配至n种检测温度，制备用于检测适合于所述n种检测温度的n种靶核酸的n种组合物，然后可以进行步骤(a)。
在一个实施方案中，当n是3时，第一检测温度可以选自50℃至60℃的温度范围，第二检测温度可以选自65℃至75℃的温度范围，并且第三检测温度可以选自80℃至95℃的温度范围。
在步骤(a)中，在孵育期间在n种检测温度下检测信号。
在一个实施方案中，可以在每个循环或所选择的循环中、或在反应的终点循环进行信号检测。
在一个实施方案中，信号检测可以进行至少一个循环。例如，可以在所选择的一个循环中在n种检测温度下检测信号，或者可以在所选择的两个循环中的每一个中在n种检测温度下检测信号。例如，当n是3并且在第1循环和第30循环检测信号时，在第1循环的第一检测温度、第二检测温度和第三检测温度下检测信号(即，第一信号、第二信号和第三信号)，并且在第30循环的第一检测温度、第二检测温度和第三检测温度下检测信号。
在一个实施方案中，可以在至少两个循环中进行信号检测。
在一个实施方案中，可以使用在至少两个循环检测到的信号来测量信号变化。例如，核酸扩增可以在PCR中进行30个循环、40个循环、45个循环或50个循环，并且在每个循环中，可以在n种检测温度下测量信号。然后，在多个循环中在每种检测温度下检测到的信号值可以被描绘为每种检测温度下的扩增曲线(循环的数据点和循环的RFU的集合)。作为具体实例，当n是3时，可以获得第一检测温度下的扩增曲线、第二检测温度下的扩增曲线和第三检测温度下的扩增曲线，并且可以由每个扩增曲线获得信号变化。
本文所用的术语“扩增曲线”是指由信号产生反应，特别是靶核酸的扩增反应产生的曲线。扩增曲线包括样品中存在靶核酸时反应产生的曲线，或者样品中不存在靶核酸时反应产生的曲线或线。
在一个实施方案中，可以由靶核酸扩增的指征来测量信号变化和/或恒定信号。
如本文所用，术语“扩增的指征”是指与发生靶核酸扩增密切相关的任何指征，并且可由步骤(a)中提供的信号获得。扩增的指征可以指依赖于靶核酸扩增而产生的值。扩增的指征可以是随着靶核酸扩增(即靶核酸量增加)而具有更大的值的指征，也可以是随着靶核酸扩增而具有更小的值的指征。扩增的指征可以是任何指征，只要其指示靶核酸的扩增即可。
在一个实施方案中，扩增的指征可以包括由扩增曲线或熔融曲线获得的指征。特别是，扩增的指征可以包括特定循环的信号值(例如RFU)、每个循环的信号值、特定循环之间的信号值差异、或扩增曲线中特定循环的信号值和参考信号值之间的差异、或熔融曲线中最大熔融峰的高度、宽度或面积。在一个实施方案中，扩增的指征的实例包括，但不限于Ct(循环阈值)值、ΔRFU(例如两个循环的RFU差异、参考RFU和特定循环的RFU之间的差异等)、RFU比率(例如，两个循环的RFU比率或参考RFU和特定循环的RFU之间的RFU比率等)以及熔融曲线中最大熔融峰的高度/面积/宽度。
在一个实施方案中，扩增的指征是Ct值或Cq值。Ct值和Cq值的概念在本领域是众所周知的。
在一个实施方案中，扩增的指征是在扩增反应中获得的RFU值之间的ΔRFU或RFU比率。例如，扩增的指征是两个循环的RFU之间的差异(减法)或比率，或者特定循环的RFU与参考RFU之间的差异(减法)或比率。
根据本公开的方法利用了这样一个事实，即用于检测靶核酸的组合物仅在相应的检测温度下提供依赖于靶核酸的存在的信号变化。在一个实施方案中，根据本公开的方法可以使用在检测温度下在至少两个循环检测到的信号值来测量信号变化。在另一个实施方案中，根据本公开的方法可以通过使用在检测温度下在一个循环检测到的信号值(即在步骤(a)中检测到的信号值)和参考信号值来测量信号变化。
在一个实施方案中，当在步骤(a)中在多个循环检测信号时，可以选择使检测信号的第一循环和末尾循环彼此之间相隔至少1个循环至至少20个循环。特别是，可以选择使检测信号的第一循环和末尾循环彼此之间相隔1个循环、2个循环、3个循环、4个循环、5个循环、6个循环、7个循环、8个循环、9个循环、10个循环、11个循环、12个循环、13个循环、14个循环、15个循环、16个循环、17个循环、18个循环、19个循环、20个循环或更多个循环，并且更具体地为5个循环、10个循环、15个循环、20个循环、30个循环或更多个循环。
在一个实施方案中，可以在包括指数相区的任何中间循环或在包括平台区的任何晚期循环进行信号检测。例如，可以在两个循环检测信号，一个循环是包括基线区的任何初始循环，而另一个循环是任何中间循环或晚期循环，或者一个循环是任何中间循环，而另一个循环是中间循环或晚期循环的任意。
在一个实施方案中，初始循环包括从第1循环直至与将末尾循环除以3所获得的值相近的任何循环。例如，当末尾循环为45时，45除以3等于15，因此，初始循环可以确定为第1循环至第20循环、第1循环至第15循环、第1循环至第10循环或第1循环至第5循环。中间循环可以是与将末尾循环除以2所获得的值相接近的循环。例如，当末尾循环为第45循环时，45除以2等于22.5，因此，中间循环可以是第16循环至第30循环、第18循环至第30循环、第20循环至第30循环、第16循环至第27循环、第18循环至第27循环、第20循环至第27循环、第16循环至第25循环、第18循环至第25循环或第20循环至第25循环。晚期循环可以是扩增反应的末尾循环、或接近末尾循环的循环。例如，当末尾循环为第45循环时，晚期循环可以确定为第31循环至第45循环、第35循环至第45循环、第38循环至第45循环、第40循环至第45循环或第43循环至第45循环。初始循环、中间循环和晚期循环可以依据扩增反应的末尾循环而改变。
在一个实施方案中，可以使用在至少一个循环检测到的信号值和“参考信号值”来测量信号变化。参考信号值可以指通过单独的反应可以用于确认依赖于靶核酸的存在的信号变化的值。
在一个实施方案中，可以在不存在相应靶核酸时，在相应的检测温度下由反应获得参考信号值。例如，在不存在靶核酸时，参考信号值可以是“在检测温度下的信号值”。
在一个实施方案中，n种检测温度有n种参考信号值。
在一个实施方案中，可以通过单独的阴性对照反应获得在不存在靶核酸(例如，第i靶核酸)时检测到的“在检测温度(例如第i检测温度)下的信号值”。
在一个实施方案中，可以通过与根据本公开的方法同时或分开进行阴性对照反应来获得参考信号值。
在一个实施方案中，可以通过阴性对照反应获得参考信号值。根据某个实施方案，在第i检测温度下的参考信号值可以通过以下获得：将不含第i靶核酸的样品(例如蒸馏水)与用于检测n种靶核酸的n种组合物混合，并在第i检测温度下在扩增靶核酸的同时检测信号。在此，可以在任何循环进行信号检测。具体而言，可以使用阴性对照反应中初始循环或晚期循环中的任意检测到的信号值作为参考信号值。更具体地，在与步骤(a)中检测信号的循环相同的循环检测的信号值可以用作参考信号值。
在一个实施方案中，可以通过阳性对照反应获得参考信号值。根据某个实施方案，可以通过以下获得参考信号值：将含有第i靶核酸的样品与用于检测第i靶核酸的组合物(具体地，用于检测第n靶核酸的第n组合物)混合，并在第i检测温度下扩增第i靶核酸的同时检测信号。
当通过阳性对照反应获得参考信号值时，检测信号值的循环可以是在反应的基线区。基线区是指其中信号(例如荧光信号)在扩增反应(例如PCR)的初始循环期间保持基本恒定的区域。在该区域，因为扩增产物的水平不足以达到可检测，该区域中的大多数荧光信号归因于反应样品固有的荧光信号以及背景信号(包括测量系统本身的荧光信号)。换言之，在阳性对照反应的基线区中的循环检测到的信号值与在不存在靶核酸(例如阴性对照反应)时从反应中获得的参考信号值基本上相同。
在一个实施方案中，可以通过参考信号值和步骤(a)中检测到的信号值之间的差异来测量信号变化。
在一个实施方案中，参考信号值可以是通过考虑检测器的背景信号和灵敏度或所用标记的特征而由阴性对照反应预先确定的阈值。使用阈值，可以确定信号变化的显著性。阈值可以通过本领域已知的任何阈值设定方法确定。例如，可以鉴于背景信号、灵敏度、标记特征、检测器的信号变化或误差幅度等来确定阈值。
在一个实施方案中，如果在步骤(a)中检测到的信号值等于或大于作为参考信号值的阈值，则可以确定信号已经变化。
在一个实施方案中，可以使用单一类型的检测器在n种检测温度下进行信号检测。
在一个实施方案中，单一类型的检测器是一个检测器。在一个实施方案中，来自包含于用于检测靶核酸的n种组合物中的每种标记的寡核苷酸中的标记的信号不会由于每种靶核酸使用的单一类型的检测器而彼此不同。
如本文所用，单一或一种类型的荧光标记是指具有相同或基本上相同的信号特征(例如，光学特征、发射波长和电信号)的荧光标记。例如，FAM和CAL Fluor610提供不同类型的信号。
如本文所用，单一或一种类型的荧光标记意味着来自使用检测通道的荧光标记的信号不会彼此不同。这种单一或一种类型的荧光标记不是基于荧光标记的化学结构，即使当具有不同化学结构的两个荧光标记使用检测通道而没有不同时，它们也被视为一种类型。
根据本公开，使用一个检测通道，由共同包含一种类型荧光标记的用于检测靶核酸的n种组合物产生的信号没有不同。
如本文所用，术语“检测通道”是指用于检测来自单一类型的荧光标记的信号的手段。本领域中可用的热循环仪，例如ABI 7500(Applied Biosystems)、QuantStudio(Applied Biosystems)、CFX96(Bio-Rad Laboratories)、Cobas z 480(Roche)、LightCycler(Roche)等，包括用于检测来自几种不同类型荧光标记的信号的数个通道(例如光学二极管)，并且这些通道对应于本文中使用的检测通道。
本文使用的检测通道包括用于检测信号的装置。例如，检测通道可以是能够检测特定波长的荧光信号的光学二极管。
在一个实施方案中，使用单一类型的检测器在n种检测温度下检测的信号不会彼此不同。
步骤(b)：确定靶核酸的存在
检测信号后，由步骤(a)中检测到的信号确定n种靶核酸的存在。
在一个实施方案中，通过在第i检测温度下检测到的信号变化来确定第i靶核酸的存在。例如，由在第i检测温度下检测到的信号来测量信号变化以确定第i靶核酸的存在。
在一个实施方案中，当在第i检测温度下检测到信号变化时，可以确定存在第i靶核酸。
在一个实施方案中，当在第i检测温度下没有检测到信号变化时，即在第i检测温度下的信号是恒定的，可以确定不存在第i靶核酸。
在一个实施方案中，可以使用在至少两个循环检测到的信号，或者使用在至少一个循环检测到的信号值和参考信号值来测量信号变化。
由在每种检测温度下检测到的信号来确定靶核酸的存在，这可以通过步骤(a)中描述的用于测量信号变化的过程来执行，例如，使用扩增的指征的方法，或本领域已知的任何其他方法。
在某些实施方案中，当n是3且在第10循环、第20循环和第30循环进行信号检测时，可以由在第一检测温度下检测到的信号(在第10循环的第一信号、在第20循环的第一信号和在第30循环的第一信号)来确定第一靶核酸的存在，可以通过在第二检测温度下检测到的信号(在第10循环的第二信号、在第20循环的第二信号和在第30循环的第二信号)来确定第二靶核酸的存在，并且可以通过在第三检测温度下检测到的信号(在第10循环的第三信号、在第20循环的第三信号和在第30循环的第三信号)来确定第三靶核酸的存在。
在某些实施方案中，当n是4且在第30循环进行信号检测时，由在第一检测温度下检测到的信号(即在第30循环的第一信号)和参考信号值来确定第一靶核酸的存在，由在第二检测温度下检测到的信号(即在第30循环的第二信号)和参考信号值来确定第二靶核酸的存在，并且由在第三检测温度下检测到的信号(即在第30循环的第三信号)和参考信号值来确定第三靶核酸的存在。
在一个实施方案中，可以通过单独的阴性对照反应或阳性对照反应获得参考信号值。
在一个实施方案中，根据本公开的方法可以与阴性对照反应一起进行。在阴性对照反应中检测到的信号值可以用作参考信号值。例如，在包含用于检测第i靶核酸的组合物的反应的一个循环(例如，末尾循环)中在第i检测温度下检测到的信号，可以与在阴性对照反应中在相同循环(例如末尾循环)在相同检测温度(即第i检测温度)下检测到的信号进行比较，以确定信号是否已经变化。
在某些实施方案中，当n是3且在第30循环检测到信号时，可以通过在第一检测温度下检测到的信号(即在第30循环的第一信号)和第一参考信号值(例如，在阴性对照反应的第30循环在第一检测温度下检测到的信号)来确定第一靶核酸的存在，可以通过在第二检测温度下检测到的信号(即在第30循环的第二信号)和第二参考信号值(例如在阴性对照反应的第30循环在第二检测温度下检测到的信号)来确定第二靶核酸的存在，并且可以通过在第三检测温度下检测到的信号(即在第30循环的第三信号)和第三参考信号值(例如在阴性对照反应的第30循环在第三检测温度下检测到的信号)来确定第三靶核酸的存在。
在一个实施方案中，根据本公开的方法可以与阳性对照反应一起进行。可以将在阳性对照反应中检测到的信号值用作参考信号值。例如，可以将在一个循环(例如，循环30)中在第i检测温度下检测到的第一信号与在阳性对照反应的第30循环之前的例如循环1中在第i检测温度下检测的信号进行比较，以确定信号是否已经改变。
在一个实施方案中，当在步骤(a)中的一个循环中进行信号检测并且使用通过阳性对照反应获得的参考信号值来测量信号变化时，可以在步骤(a)中进行信号检测的循环之前的至少30个循环、至少20个循环、至少10个循环或至少5个循环的循环中进行在阳性对照反应中的信号检测以获得参考信号值。
在某些实施方案中，当n是3并且在循环30中进行信号检测时，可以根据在第一检测温度下检测到的信号(即，在循环30中的第一信号)和第一参考信号值(例如，在第一靶核酸的阳性对照反应的循环1中在第一检测温度下检测的信号)确定第一靶核酸的存在，可以根据在第二检测温度下检测到的信号(即，在循环30中的第二信号)和第二参考信号值(例如，在第二靶核酸的阳性对照反应的循环1中在第二检测温度下检测的信号)确定第二靶核酸的存在，以及可以根据在第三检测温度下检测到的信号(即，在循环30中的第三信号)和第三参考信号值(例如，在第三靶核酸的阳性对照反应的循环1中在第三检测温度下检测的信号)确定第三靶核酸的存在，
IV.用于使用LPHO检测靶核酸的方法
在本公开的第四个方面中，提供了一种使用标记的部分杂交寡核苷酸(LPHO)在样品中检测靶核酸的方法，
(a)根据在样品中靶核酸的存在，提供通过寡核苷酸的酶切割反应产生的片段；
(b)将片段与捕获和模板寡核苷酸(CTO)杂交；
其中在3’至5’方向所述CTO包含：(i)捕获部分，其包含与片段杂交的核苷酸序列，和(ii)模板部分，其包含不与片段杂交的核苷酸序列，
其中所述CTO具有限定标记部分的报告分子和淬灭分子，
其中将所述片段与CTO的捕获部分杂交；
(c)在标记部分杂交寡核苷酸(LPHO)存在时使用步骤(b)的所得物和具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶进行延伸反应；
其中所述LPHO包含与所述CTO的标记部分杂交的核苷酸序列，
其中当在所述样品中存在靶核酸时，与所述CTO的捕获部分杂交的所述片段被延伸以产生与所述CTO互补的延伸链，从而在所述延伸链和所述CTO之间产生延伸的双链体，其中所述延伸的双链体的产生阻止在所述CTO的标记部分和所述LPHO之间形成CTO/LPHO杂交体，
其中当在样品中不存在靶核酸时，不产生延伸链，而是替代地形成所述CTO/LPHO杂交体，
其中所述延伸的双链体具有与CTO/LPHO杂交体的熔融温度(Tm)不同的Tm；以及
(d)检测延伸的双链体的存在；
其中通过测量由延伸的双链体提供的信号检测所述延伸的双链体，
其中在来自延伸的双链体的信号强度不同于来自CTO/LPHO杂交体的信号强度的温度下进行测量，以及
其中存在所述延伸的双链体指示存在所述靶核酸。
由于本公开的第四个方面涉及一种使用在本公开的第一个和第二个方面中描述的LPHO用于检测延伸的双链体的方法，因而省略了其之间的共同描述，以避免过度冗余导致本说明书的复杂性。
首先，在步骤(a)中，根据样品中靶核酸的存在，提供由寡核苷酸的酶切割产生的片段。
该片段可以包括根据靶核酸的存在通过寡核苷酸的酶切割产生的任何片段，比如如上文所述的PTO片段。
提供在步骤(a)中的片段可以通过本领域公知的各种寡核苷酸切割反应中的任何一种来实现。
例如，如在美国专利号7,482,121中所公开的，两个寡核苷酸以非重叠方式与靶核酸的同一链杂交，以形成切割结构。然后，使用酶(如热稳定FEN-1核酸酶)对切割结构进行切割以提供片段。切割结构包括双链杂交体，所述双链杂交体包含假Y结构、空位或缺口。作为另一个实例，可以通过如上文所述的介导寡核苷酸的切割反应来提供片段。例如，Invader测定(美国专利号5,691,142)通过介导寡核苷酸的切割提供片段。作为另一个实例，将包含限制性酶识别序列的引物与靶核酸杂交，以产生包含限制性酶识别序列的扩增产物，然后将在扩增产物中的限制性酶识别序列切割以产生片段。
如上文所述，可以使用内切酶或外切酶以切割寡核苷酸。内切酶的实例包括限制性酶、RNA内切酶和DNA内切酶；以及外切酶的实例包括但不限于5’核酸外切酶和3’核酸外切酶。
在一个实施方案中，通过酶切割反应切割的寡核苷酸可以是靶核酸本身。
可以分别参考本公开的第一个方面的步骤(c)至(e)详细描述本公开的第四个方面的步骤(b)至(d)。
在下文中，将通过实施方案更加详细地描述本发明。提供以下实施方案以更加详细地描述本发明，并且对于本发明所属技术领域的本领域普通技术人员来说，显而易见的是，所附权利要求中建议的本发明的范围不受以下实施例的限制。
发明模式
实施例
实施例1：单一靶核酸的检测
在本实施例中，研究了是否能够将L-PTOCE测定用于实时检测靶核酸。
为此，制备了两种具有相同序列的CTO，其中报告分子和淬灭分子在不同位置标记，以及制备了用于两种CTO的四种不同长度的LPHO。随后，对两种CTO和四种LPHO的四种组合进行了检测靶核酸的测试。
1-1.制备靶核酸和寡核苷酸
使用生殖支原体(Mycoplasma genitalium)(MG)的基因组DNA(登录号：ATCC33530)作为靶核酸。为检测MG靶核酸，如表3中所示制备正向引物(即，上游引物)、反向引物(即，下游引物)和PTO。
【表3】
带有下划线的字符表示PTO的5’标记部分。
随后，如表4中所示制备两种CTO和四种LPHO。
【表4】
如表4中所示，第一CTO(下文中称为CTO-1)具有与靶向部分的5’末端连接的淬灭分子(BHQ-1)和与靶向部分的3’末端连接的报告分子(CAL荧光橙560)；第二CTO(下文中称为CTO-2)具有与捕获部分的3’末端连接的淬灭分子(BHQ-1)和在模板部分内连接的报告分子(CAL荧光橙560)。
此外，制备了不同长度的两种LPHO(下文中称为LPHO-1A和LPHO-1B)，其包含与CTO-1的标记部分杂交的核苷酸序列，和不同长度的两种LPHO(下文中称为LPHO-2A和LPHO-2B)，其包含与CTO-2的标记部分杂交的核苷酸序列。LPHO-1A和LPHO-2A的长度分别比LPHO-1B和LPHO-2B短。
PTO、CTO和LPHO的3’末端分别被间隔子C3封闭，以阻止其通过DNA聚合酶延伸。
1-2.实时PCR
针对两种CTO中的一种与四种LPHO中的一种的四种组合进行实时PCR，如下所示。
组合1：CTO-1和LPHO-1A
组合2：CTO-1和LPHO-1B
组合3：CTO-2和LPHO-2A
组合4：CTO-2和LPHO-2B
<组合1>
将靶核酸(管道1：1pg MG基因组DNA)和蒸馏水(管道2：阴性对照)分别与以下混合：5pmole MG正向引物(SEQ ID NO:1)、5pmole MG反向引物(SEQ ID NO:2)、3pmole MG-PTO(SEQ ID NO:3)、1pmole CTO-1(SEQ ID NO:4)和3pmole LPHO-1A(SEQ ID NO:5)混合，然后与5μL 4X Enzyme Mix(20U Taq DNA聚合酶)(Nanohelix,Korea)和5μL 4X缓冲剂混合物(最终，0.8mM dNTP,50mM KCl,3.5mM MgCl2)(Nanohelix,Korea)组合，以制备最终体积20μL的反应混合物。
将含有反应混合物的管道1和管道2分别放入实时热循环仪(CFX96实时热循环仪，Bio-Rad)中，进行实时PCR，包括在95℃下变性15分钟，然后在95℃下10秒、在60℃下15秒、在72℃下10秒和在75℃下5秒进行50个循环。
在每个循环中在三个温度下检测信号，如下所示：
(i)60℃，在此温度下延伸的双链体和CTO/LPHO杂交体两者仍保持其双链状态(即，在第一信号恒定温度范围内的温度)；
(ii)75℃，在此温度下延伸的双链体保持其双链状态和CTO/LPHO杂交体解离成单链状态(即，在信号变化温度范围内的温度)；以及
(iii)95℃，在此温度下延伸的双链体和CTO/LPHO杂交体两者均解离成单链状态(即，在第二信号恒定温度范围内的温度)。
实时PCR结果如图6中所示。
对于在第一信号恒定温度范围内在60℃下的扩增曲线和在第二信号恒定温度范围内在95℃下的扩增曲线，即使靶核酸扩增，信号也保持恒定，而没有任何改变。另一方面，对于在信号变化温度范围内在75℃下的扩增曲线，信号随着靶核酸的扩增而变化。
同时，阴性对照在60℃、75℃和95℃下提供恒定信号。也即，没有检测到信号变化。
如上文所述，发现根据本公开内容的L-PTOCE测定可以使用从阴性对照反应获得的参考信号值来测量指示靶核酸存在的信号(即，信号变化)。如果在60℃、75℃和95℃下的信号值高于基于阴性对照反应信号值(即，RFU:0)的阈值RFU 100，则认为信号发生了变化。因此，如表5中所示，仅在75℃时，Ct值为28.58，鉴定到信号发生了变化，而在60℃和95℃时，没有鉴定到信号变化。
【表5】
管道1：1pg MG基因组DNA；管道2：阴性对照；
N/A：不适用
<组合2>
将靶核酸(管道1：50pg MG基因组DNA)和蒸馏水(管道2：阴性对照)分别与以下混合：5pmole MG正向引物(SEQ ID NO:1)、5pmole MG反向引物(SEQ ID NO:2)、3pmole MG-PTO(SEQ ID NO:3)、1pmole CTO-1(SEQ ID NO:4)和3pmole LPHO-1B(SEQ ID NO:6)混合，然后与5μL 4X Enzyme Mix(20U Taq DNA聚合酶)(Nanohelix,Korea)和5μL 4X缓冲剂混合物(最终，0.8mM dNTP,50mM KCl,3.5mM MgCl2)(Nanohelix,Korea)组合，以制备最终体积20μL的反应混合物。
将含有反应混合物的管道1和管道2分别放入实时热循环仪(CFX96实时热循环仪，Bio-Rad)中，进行实时PCR，包括在95℃下变性15分钟，然后在95℃下10秒、在60℃下15秒、在72℃下10秒和在75℃下5秒进行50个循环。
在每个循环中在三个温度下检测信号，如下所示：
(i)60℃，在此温度下延伸的双链体和CTO/LPHO杂交体两者仍保持其双链状态(即，在第一信号恒定温度范围内的温度)；
(ii)75℃，在此温度下延伸的双链体保持其双链状态和CTO/LPHO杂交体解离成单链状态(即，在信号变化温度范围内的温度)；以及
(iii)95℃，在此温度下延伸的双链体和CTO/LPHO杂交体两者均解离成单链状态(即，在第二信号恒定温度范围内的温度)。
实时PCR结果如图7中所示。
对于在第一信号恒定温度范围内在60℃下的扩增曲线和在第二信号恒定温度范围内在95℃下的扩增曲线，即使靶核酸扩增，信号也保持恒定，而没有任何改变。另一方面，对于在信号变化温度范围内在75℃下的扩增曲线，信号随着靶核酸的扩增而变化。
同时，阴性对照在60℃、75℃和95℃下提供恒定信号。即，未检测到信号变化。
如上文所述，发现根据本公开内容的L-PTOCE测定可以使用从阴性对照反应获得的参考信号值来测量指示靶核酸存在的信号(即，信号变化)。如果在60℃、75℃和95℃下的信号值高于基于阴性对照反应信号值(即，RFU:0)的阈值RFU 100，则认为信号发生了变化。因此，如表6中所示，仅在75℃时，Ct值为28.58，鉴定到信号发生了变化，而在60℃和95℃时，没有鉴定到信号变化。
【表6】
管道1：50pg MG基因组DNA；管道2：阴性对照；
N/A：不适用
<组合3>
将靶核酸(管道1：5pg MG基因组DNA)和蒸馏水(管道2：阴性对照)分别与以下混合：5pmole MG正向引物(SEQ ID NO:1)、5pmole MG反向引物(SEQ ID NO:2)、3pmole MG-PTO(SEQ ID NO:3)、1pmole CTO-2(SEQ ID NO:7)和3pmole LPHO-2A(SEQ ID NO:8)混合，然后与5μL 4X Enzyme Mix(20U Taq DNA聚合酶)(Nanohelix,Korea)和5μL 4X缓冲剂混合物(最终，0.8mM dNTP,50mM KCl,3.5mM MgCl2)(Nanohelix,Korea)组合，以制备最终体积20μL的反应混合物。
将含有反应混合物的管道1和管道2分别放入实时热循环仪(CFX96实时热循环仪，Bio-Rad)中，进行实时PCR，包括在95℃下变性15分钟，然后在95℃下10秒、在60℃下15秒、在72℃下10秒和在75℃下5秒进行50个循环。
在每个循环中在三个温度下检测信号，如下所示：
(i)60℃，在此温度下延伸的双链体和CTO/LPHO杂交体两者仍保持其双链状态(即，在第一信号恒定温度范围内的温度)；
(ii)75℃，在此温度下延伸的双链体保持其双链状态和CTO/LPHO杂交体解离成单链状态(即，在信号变化温度范围内的温度)；以及
(iii)95℃，在此温度下延伸的双链体和CTO/LPHO杂交体两者均解离成单链状态(即，在第二信号恒定温度范围内的温度)。
实时PCR结果如图8中所示。
对于在第一信号恒定温度范围内在60℃下的扩增曲线和在第二信号恒定温度范围内在95℃下的扩增曲线，即使靶核酸扩增，信号也保持恒定，而没有任何改变。另一方面，对于在信号变化温度范围内在75℃下的扩增曲线，信号随着靶核酸的扩增而变化。
同时，阴性对照在60℃、75℃和95℃下提供恒定信号。即，未检测到信号变化。
如上文所述，发现根据本公开内容的L-PTOCE测定可以使用从阴性对照反应获得的参考信号值来测量指示靶核酸存在的信号(即，信号变化)。如果在60℃、75℃和95℃下的信号值高于基于阴性对照反应信号值(即，RFU:0)的阈值RFU 100，则认为信号发生了变化。因此，如表7中所示，仅在75℃时，Ct值为28.58，鉴定到信号发生了变化，而在60℃和95℃时，没有检测到信号变化。
【表7】
管1：5pg MG基因组DNA；管2：阴性对照；
N/A：不适用
<组合4>
将靶核酸(管道1：5pg MG基因组DNA)和蒸馏水(管道2：阴性对照)分别与以下混合：5pmole MG正向引物(SEQ ID NO:1)、5pmole MG反向引物(SEQ ID NO:2)、3pmole MG-PTO(SEQ ID NO:3)、1pmole CTO-2(SEQ ID NO:7)和3pmole LPHO-2B(SEQ ID NO:9)混合，然后与5μL 4X Enzyme Mix(20U Taq DNA聚合酶)(Nanohelix,Korea)和5μL 4X缓冲剂混合物(最终，0.8mM dNTP,50mM KCl,3.5mM MgCl2)(Nanohelix,Korea)组合，以制备最终体积20μL的反应混合物。
将含有反应混合物的管道1和管道2分别放入实时热循环仪(CFX96实时热循环仪，Bio-Rad)中，进行实时PCR，包括在95℃下变性15分钟，然后在95℃下10秒、在60℃下15秒、在72℃下10秒和在75℃下5秒进行50个循环。
在每个循环中在三个温度下检测信号，如下所示：
(i)60℃，在此温度下延伸的双链体和CTO/LPHO杂交体两者仍保持其双链状态(即，在第一信号恒定温度范围内的温度)；
(ii)75℃，在此温度下延伸的双链体保持其双链状态和CTO/LPHO杂交体解离成单链状态(即，在信号变化温度范围内的温度)；以及
(iii)95℃，在此温度下延伸的双链体和CTO/LPHO杂交体两者均解离成单链状态(即，在第二信号恒定温度范围内的温度)。
实时PCR结果如图9中所示。
对于在第一信号恒定温度范围内在60℃下的扩增曲线和在第二信号恒定温度范围内在95℃下的扩增曲线，即使靶核酸扩增，信号也保持恒定，而没有任何改变。另一方面，对于在信号变化温度范围内在75℃下的扩增曲线，信号随着靶核酸的扩增而变化。
同时，阴性对照在60℃、75℃和95℃下提供恒定信号。即，未检测到信号变化。
如上文所述，发现根据本公开内容的L-PTOCE测定可以使用从阴性对照反应获得参考信号值来测量指示靶核酸存在的信号(即，信号变化)。如果在60℃、75℃和95℃下的信号值高于基于阴性对照反应信号值(即，RFU:0)的阈值RFU 100，则认为信号发生了变化。因此，如表8中所示，仅在75℃时，Ct值为26.28，鉴定到信号发生了变化，而在60℃和95℃时，没有测量到信号变化。
【表8】
管道1：5pg MG基因组DNA；管道2：阴性对照；
N/A：不适用
通过组合1至组合4的结果，已经证实根据本公开内容的L-PTOCE测定和组合物可用于检测靶核酸。此外，根据本公开内容的L-PTOCE测定和组合物已被证实适用于InterSC型信号产生方法和组合物。
实施例2：单核苷酸多态性的检测
在本实施例中，研究了L-PTOCE测定是否能够用于检测靶核酸的单核苷酸多态性。
2-1.制备靶核酸和寡核苷酸
作为靶核酸，使用SARS-CoV-2N501Y变体的合成RNA，该RNA引入了编码N501Y氨基酸变体的核苷酸序列。编码氨基酸变体N501Y的核苷酸序列具有单核苷酸多态性，即在SARS-CoV-2的S基因参考序列(RefSeq:NC_045512.2.)的位置1,501处核苷酸T取代为A。
按照如下所示制备靶核酸：
pBluescriptⅡSK+质粒具有447bp的DNA序列(SEQ ID NO:10)，其插入的单核苷酸多态性如表9中所示，购自Bionics。随后，使用MEGAscriptTMT7转录试剂盒(Thermofisher,AM1334)，将质粒用于制备SARS-CoV-2N501Y变体合成RNA。
【表9】
粗体字符表示单核苷酸多肽性。
为检测SARS-CoV-2N501Y变体，如表10中所示制备正向引物、反向引物、PTO、CTO和LPHO。
【表10】
带下划线的字符表示PTO的5’标记部分；粗体字符表示单核苷酸多态性。
2-2.实时逆转录PCR
使用上述寡核苷酸进行实时RT-PCR。
将靶核酸(管道1：5X 103个拷贝的SARS-CoV-2N501Y变体的合成RNA)、非靶核酸(管道2：103个拷贝的SARS-CoV-2野生型基因组DNA(ATCC,VR-1991D))和蒸馏水(管道3：阴性对照)分别与以下混合：5pmole正向引物(SEQ ID NO:11)、5pmole反向引物(SEQ ID NO:12)、3pmole PTO(SEQ ID NO:13)、1pmole CTO(SEQ ID NO:14)和3pmole LPHO(SEQ ID NO:15)混合，然后与5μL 4X Enzyme Mix(20U Taq DNA聚合酶，30U M-MLV逆转录酶)(Nanohelix,Korea)和5μL 4X缓冲剂混合物(最终，0.8mM dNTP,200mM KCl,14mM MgCl2)(Nanohelix,Korea)组合，以制备最终体积20μL的反应混合物。
将含有反应混合物的管道1至管道3分别放入实时热循环仪(CFX96实时热循环仪，Bio-Rad)中，进行实时RT-PCR，包括在50℃下逆转录20分钟，在95℃下变性15分钟，然后在95℃下10秒、在60℃下15秒、在70℃下5秒和在72℃下10秒进行50个循环。
在每个循环中在三个温度下检测信号，如下所示：
(i)60℃，在此温度下延伸的双链体和CTO/LPHO杂交体两者仍保持其双链状态(即，在第一信号恒定温度范围内的温度)；
(ii)70℃，在此温度下延伸的双链体保持其双链状态和CTO/LPHO杂交体解离成单链状态(即，在信号变化温度范围内的温度)；以及
(iii)95℃，在此温度下延伸的双链体和CTO/LPHO杂交体两者均解离成单链状态(即，在第二信号恒定温度范围内的温度)。
实时RT-PCR结果如图10中所示。
如果在60℃、75℃和95℃下的信号值高于基于阴性对照反应的信号值(即，RFU:0)的阈值RFU 100，则认为信号发生了变化。因此，如在图10和表8中所示，仅在75℃下，从Ct值25.97中鉴定出包含SARS-CoV-2N501Y变体的合成RNA的管道1中的信号变化，而在60℃和95℃下未鉴定出信号变化。
同时，对于含有SARS-CoV-2野生型基因组RNA的管道2和作为阴性对照的管道3，在60℃和75℃下的扩增曲线提供了恒定信号。即，未检测到信号变化。
【表11】
管道1：5X 103个拷贝的SARS-CoV-2N501Y变体的合成RNA；管道2：103个拷贝的SARS-CoV-2野生型基因组RNA；
管道3：阴性对照；
N/A：不适用
这些结果表明根据本公开内容的L-PTOCE测定和组合物能够用于区分和检测单核苷酸多态性。
实施例3：多种靶核酸的检测
在本实施例中，研究了L-PTOCE组合物和采用不同信号产生机制的另一种组合物(即，UnderSC型、InterSC型和/或OverSC型组合物)的组合是否能够在单一反应容器中使用单一类型的标记实时检测多种靶核酸。
首先，制备两种靶核酸：人支原体(Mycoplasma Hominis)(MH)的基因组DNA和生殖支原体(Mycoplasma genitalium)(MG)的基因组DNA。PTOCE测定(WO 2012/096523)使用具有相互作用的双标记的CTO，采用UnderSC型信号产生机制，用于检测第一靶核酸。根据本公开内容，采用InterSC型信号产生机制的L-PTOCE测定用于检测第二靶核酸。
图11示意性地显示了用于检测第一靶核酸(MH)的组合物和用于检测第二靶核酸(MG)的组合物的信号产生原理，其依赖于靶核酸的存在与否。根据本公开内容，通过调节PTOCE测定和L-PTOCE测定的相应信号变化温度范围，能够在一个反应容器中使用单一类型标记实时检测多种靶核酸。
具体而言，如图11中所示，用于检测第一靶核酸MH的第一组合物和用于检测第二靶核酸MG的第二组合物在分别存在相应靶核酸的情况下产生延伸的双链体。调节用于检测第一靶核酸的组合物中寡核苷酸的序列和长度，以使得依赖于第一靶核酸产生的延伸的双链体在第一检测温度下保持其双链形式，并且在第二检测温度下解离成单链状态。调节用于检测第二靶核酸的组合物中寡核苷酸的序列和长度，以使得依赖于第二靶核酸产生的延伸的双链体在第一和第二检测温度下保持其双链形式，而CTO/LPHO杂交体在第一检测温度下保持其双链形式，在第二检测温度下解离成单链状态。
结果，用于检测第一靶核酸的组合物在第一靶核酸存在时在第一检测温度下提供信号变化，并且在第二检测温度下信号是恒定的。用于检测第二靶核酸的组合物在第二靶核酸存在时在第一检测温度下提供恒定信号，并且在第二检测温度下产生信号变化。
用于检测第一靶核酸的PTOCE测定和用于检测第二靶核酸的L-PTOCE测定两者是相似的，因为其都依赖于相应靶核酸的存在产生延伸的双链体。然而，用于检测第一靶核酸的组合物在第一检测温度下提供信号变化，这是由于在第一检测温度下当第一靶核酸不存在时的淬灭信号和当第一靶核酸存在时的未淬灭信号之间的差异造成的，而用于检测第二靶核酸的组合物在第二检测温度下提供信号变化，这是由于在第二检测温度下当第二靶核酸不存在时的淬灭信号和当第二靶核酸存在时的未淬灭信号之间的差异造成的。此外，用于检测第一靶核酸的组合物在第二温度下提供恒定信号，因为在第二温度下当第一靶核酸不存在时的淬灭信号和当第一靶核酸存在时的淬灭信号之间没有差异，并且用于检测第二靶核酸的组合物在第一温度下提供恒定信号，因为在第一检测温度下当第二靶核酸不存在时的未淬灭信号和当第二靶核酸存在时的未淬灭信号之间没有差异。
3-1.制备靶核酸和寡核苷酸
将人支原体(Mycoplasma Hominis)(MH)的基因组DNA(登录号：ATCC 15488)作为第一靶核酸使用，将生殖支原体(Mycoplasma genitalium)(MG)的基因组DNA(登录号：ATCC33530)作为第二靶核酸使用。
将用于检测指示第一靶核酸MH存在的信号变化的第一检测温度设置为60℃，以及将用于检测指示第二靶核酸MG存在的信号变化的第二检测温度设置为75℃。然后，如下所示制备用于检测MH靶核酸的组合物和用于检测MG靶核酸的组合物的寡核苷酸。
为检测MH靶核酸，如表12中所示制备正向引物、反向引物、MH-PTO和MH-CTO。在5’至3’方向MH-PTO包含：(i)5’标记部分，其包含不与MH靶核酸杂交的核苷酸序列，以及(ii)3’靶向部分，其包含与MH靶核酸杂交的核苷酸序列。在3’至5’方向MH-CTO包含：(i)捕获部分，其包含与MH-PTO的5’标记部分杂交的核苷酸序列，以及(ii)模板部分，其包含不与MH-PTO的5’标记部分和3’靶向部分杂交的核苷酸序列。MH-CTO具有与5’末端连接的淬灭分子(BHQ-1)和与3’靶向部分连接的报告分子(CAL荧光橙560)。PTO和CTO的3’末端分别被间隔子C3封闭，以阻止其通过DNA聚合酶延伸。
用于检测第二靶核酸MG的寡核苷酸与在实施例1中使用的用于MG靶核酸检测的那些相同，包括正向引物(SEQ ID NO:1)、反向引物(SEQ ID NO:2)、PTO(SEQ ID NO:3)、CTO-1(SEQ ID NO:4)和LPHO-1A(SEQ ID NO:5)。
【表12】
带下划线的字符表示PTO的5’标记部分。
3-2.多路复用实时PCR
在一个反应容器中使用上述寡核苷酸进行多路复用实时PCR。
将靶核酸(管道1：500fg MH基因组DNA；管道2：1pg MG基因组DNA；管道3：500fg MH基因组DNA和1pg MG基因组DNA)和蒸馏水(管道4：阴性对照)分别与以下混合：5pmole MH正向引物(SEQ ID NO:16)、5pmole MH反向引物(SEQ ID NO:17)、3pmole MH-PTO(SEQ ID NO:18)、1pmole MH-CTO(SEQ ID NO:19)、5pmole MG正向引物(SEQ ID NO:1)、5pmole MG反向引物(SEQ ID NO:2)、3pmole MG-PTO(SEQ ID NO:3)、1pmole CTO-1(SEQ ID NO:4)和3pmole LPHO-1A(SEQ ID NO:5)混合，然后与5μL 4X Enzyme Mix(20U Taq DNA聚合酶)(Nanohelix,Korea)和5μL 4X缓冲剂混合物(最终，0.8mM dNTP,50mM KCl,3.5mM MgCl2)(Nanohelix,Korea)组合，以制备最终体积20μL的反应混合物。
将含有反应混合物的管道1至管道4分别放入实时热循环仪(CFX96实时热循环仪，Bio-Rad)中，进行实时PCR，包括在95℃下变性15分钟，然后在95℃下10秒、在60℃下15秒、在72℃下10秒和在75℃下5秒进行50个循环。在每个循环中，在60℃下进行信号检测用于检测MH靶核酸，以及在75℃下进行信号检测用于检测MG靶核酸。
实时PCR结果如在图12中所示。
对于仅含有MH靶核酸的管道1，即使MH靶核酸被扩增，在75℃下的扩增曲线也显示出恒定信号。而相反的是，随着MH靶核酸被扩增，在60℃下的扩增曲线显示出信号变化。对于仅含有MG靶核酸的管道2，即使MG靶核酸被扩增，在60℃下的扩增曲线也显示出恒定信号。而相反的是，随着MG靶核酸被扩增，在75℃下的扩增曲线显示出信号变化。对于含有MH和MG靶核酸的管道3，在60℃和75℃下的扩增曲线分别显示出信号变化。
同时，对于作为阴性对照的管道4，在60℃和75℃下的扩增曲线提供了恒定信号。即，未检测到信号变化。
这些结果表明L-PTOCE组合物和采用不同信号产生机制的用于靶核酸检测的另一种组合物(即，UnderSC型、InterSC型和/或OverSC型组合物)的组合能够用于在单一反应容器中使用单一类型的标记实时检测多种靶核酸。此外，应意识到的是，可以将多种L-PTOCE组合物(其每一个均是InterSC型组合物)的组合用于实时检测多种靶核酸。
在一种替代方法中，使用从阴性对照反应获得的参考信号值来测量信号变化。如果在60℃和75℃下的信号值高于基于阴性对照反应的信号值(即，RFU:0)的阈值RFU 100，则认为信号发生了变化。作为结果，如在表13中所示，仅在60℃下从Ct值29.37鉴定了在管道1中的信号变化，仅在75℃下从Ct值28.49鉴定了在管道2中的信号变化以及分别在60℃和75℃下从Ct值29.61和Ct值28.39鉴定了在管道3中的信号变化。另一方面，对于作为阴性对照的管道4，在这两检测温度下均未鉴定出信号变化。
【表13】
管道1：500fg MH基因组DNA；管道2：1pg MG基因组DNA；
管道3：500fg MH基因组DNA和1pg MG基因组DNA；
管道4：阴性对照；
N/A：不适用
总而言之，根据本公开内容的L-PTOCE测定能够在一个反应容器中使用相同类型标记检测一种或多种靶核酸。
在描述了本发明的优选实施方案之后，应当理解的是，落入本发明精神范围内的变体和修改对本领域技术人员而言可能变得显而易见。因此，本发明的范围应由所附权利要求及其等效物来确定。

Claims (52)

1.一种用于在样品中检测靶核酸的方法，其通过LPHO辅助PTO切割和延伸(L-PTOCE)测定进行，所述方法包括：
(a)将引物以及探测和标记寡核苷酸(PTO)与所述靶核酸杂交；
其中所述引物包含与所述靶核酸的第一区域杂交的核苷酸序列，
其中在5’至3’方向所述PTO包含：(i)5’标记部分，和(ii)3’靶向部分，
其中所述3’靶向部分包含与所述靶核酸的第二区域杂交的核苷酸序列，以及当所述3’靶向部分与所述靶核酸的第二区域杂交时，所述5’标记部分包含不与所述靶核酸杂交的核苷酸序列，
其中所述引物位于所述PTO上游；
(b)在切割所述PTO的条件下，将步骤(a)的所得物与具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶接触；
其中将所述引物延伸以诱导通过所述具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶切割所述PTO，以使得切割释放包含所述PTO的5’标记部分的片段；
(c)将从所述PTO释放的片段与捕获和模板寡核苷酸(CTO)杂交；
其中在3’至5’方向所述CTO包含：(i)捕获部分，其包含与所述PTO的5’标记部分杂交的核苷酸序列，和(ii)模板部分，其包含不与所述PTO的5’标记部分和3’靶向部分杂交的核苷酸序列，
其中所述CTO具有限定标记部分的报告分子和淬灭分子，
其中所述片段与所述CTO的捕获部分杂交；
(d)在存在标记部分杂交寡核苷酸(LPHO)的情况下，使用步骤(c)的所得物和所述具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶进行延伸反应；
其中所述LPHO包含与所述CTO的标记部分杂交的核苷酸序列，
其中当在所述样品中存在靶核酸时，与所述CTO的捕获部分杂交的所述片段被延伸以产生与所述CTO互补的延伸链，从而在所述延伸链和所述CTO之间产生延伸的双链体，其中所述延伸的双链体的产生阻止在所述CTO的标记部分和所述LPHO之间形成CTO/LPHO杂交体，
其中当在所述样品中不存在所述靶核酸时，不产生延伸链，而是替代地形成CTO/LPHO杂交体，
其中所述延伸的双链体的熔融温度(Tm)与CTO/LPHO杂交体的Tm不同；以及
(e)检测延伸的双链体的存在；
其中通过测量由所述延伸的双链体提供的信号检测所述延伸的双链体，
其中在由延伸的双链体提供的信号强度不同于由CTO/LPHO杂交体提供的信号强度时的温度下进行所述测量，以及
其中存在所述延伸的双链体指示存在所述靶核酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其中通过以下方式产生所述延伸的双链体：(i)在所述CTO的标记部分与LPHO杂交之前延伸与所述CTO的捕获部分杂交的片段，(ii)在所述CTO的标记部分和LPHO之间杂交时延伸与所述CTO的捕获部分杂交的片段从而切割LPHO，或者(iii)(i)和(ii)两者。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述延伸的双链体的产生通过优先在所述延伸链和CTO之间的杂交而不是CTO的标记部分和LPHO之间的杂交，阻止所述CTO/LPHO杂交体的形成。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述延伸的双链体的产生通过在步骤(d)的延伸期间切割LPHO从而阻止形成CTO/LPHO杂交体。
5.根据权利要求1所述的方法，其中当所述CTO未与所述延伸链或LPHO杂交时在所述CTO上的报告分子和所述淬灭分子彼此之间非常接近，从而使所述淬灭分子淬灭来自所述报告分子的信号。
6.根据权利要求5所述的组合物，其中当CTO与所述延伸链或LPHO杂交时，在所述CTO上的报告分子和所述淬灭分子是分离的，从而使所述淬灭分子不淬灭来自所述报告分子的信号。
7.根据权利要求1所述的方法，其中(i)所述报告分子和所述淬灭分子两者连接至所述CTO的捕获部分，(ii)所述报告分子和所述淬灭分子两者连接至所述CTO的模板部分，或者(iii)所述报告分子和所述淬灭分子的一个连接至所述CTO的捕获部分，另一个连接至所述CTO的模板部分。
8.根据权利要求1所述方法，其中所述LPHO与所述CTO的标记部分的完整或部分序列杂交，以及在所述CTO上的报告分子和淬灭分子被分离，从而引起所述淬灭分子不淬灭来自所述报告分子的信号。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述延伸的双链体的Tm比所述CTO/LPHO杂交体的Tm高至少3℃。
10.根据权利要求1所述的方法，其中可通过以下调节所述延伸的双链体的Tm：(i)所述片段的序列和/或长度，(ii)所述CTO的序列和/或长度，或(iii)所述片段的序列和/或长度和所述CTO的序列和/或长度，以及可通过所述LPHO的序列和/或长度调节所述CTO/LPHO杂交体的Tm。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述LPHO包含与所述CTO杂交的片段竞争的核苷酸序列。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述LPHO不被所述片段或其延伸产物切割。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述LPHO包含不与所述CTO杂交的片段竞争的核苷酸序列。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述LPHO被所述片段或其延伸产物切割。
15.根据权利要求1所述的方法，其中用于测量的温度依赖于所述延伸的双链体的Tm和所述CTO/LPHO杂交体的Tm。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法在存在多个PTO、多个CTO和多个LPHO的情况下进行，以及重复所述步骤(a)-(e)，在重复循环之间变性。
17.根据权利要求16所述的方法，其中用于测量的温度允许(i)至少一个所述延伸的双链体保持其双链状态和(ii)至少一个所述CTO/LPHO杂交体解离成单链状态。
18.一种用于检测样品中靶核酸的组合物，其包括：
(a)引物；
其中所述引物包含与所述靶核酸的第一区域杂交的核苷酸序列，
(b)探测和标记寡核苷酸(PTO)；
其中所述PTO在5’至3’方向包含：(i)5’标记部分，和(ii)3’靶向部分，
其中所述3’靶向部分包含与所述靶核酸的第二区域杂交的核苷酸序列，以及当所述3’靶向部分与所述靶核酸的第二区域杂交时，所述5’标记部分包含不与所述靶核酸杂交的核苷酸序列，
其中所述引物位于所述PTO上游，
其中将所述引物延伸以诱导通过具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶切割所述PTO，以使得所述切割释放包含所述PTO的5’标记部分的片段；
(c)捕获和模板寡核苷酸(CTO)；
其中在3’至5’方向所述CTO包含：(i)捕获部分，其包含与所述PTO的5’标记部分杂交的核苷酸序列，和(ii)模板部分，其包含不与所述PTO的5’标记部分和3’靶向部分杂交的核苷酸序列，
其中所述CTO具有限定标记部分的报告分子和淬灭分子，
其中将所述片段与所述CTO的捕获部分杂交；以及
(d)标记部分杂交寡核苷酸(LPHO)；
其中所述LPHO包含与所述CTO的标记部分杂交的核苷酸序列，
其中当在所述样品中存在所述靶核酸时，与所述CTO的捕获部分杂交的片段延伸以产生与所述CTO互补的延伸链，从而在所述延伸链和所述CTO之间产生延伸的双链体，其中所述延伸的双链体的产生阻止在所述CTO的标记部分和所述LPHO之间形成CTO/LPHO杂交体，
其中当在所述样品中不存在所述靶核酸时，不产生延伸链，而是替代地形成所述CTO/LPHO杂交体，
其中所述延伸的双链体的熔融温度(Tm)不同于所述CTO/LPHO杂交体的Tm。
19.根据权利要求18所述的组合物，其中当所述CTO未与所述延伸链或所述LPHO杂交时，在所述CTO上的报告分子和淬灭分子彼此之间非常接近，从而使所述淬灭分子淬灭来自所述报告分子的信号。
20.根据权利要求19所述的组合物，其中当所述CTO与所述延伸链或LPHO杂交时，在所述CTO上的报告分子和淬灭分子分离，从而使所述淬灭分子不淬灭来自所述报告分子的信号。
21.根据权利要求18所述的组合物，其中(i)所述报告分子和所述淬灭分子都连接至所述CTO的捕获部分，(ii)所述报告分子和所述淬灭分子都连接至所述CTO的模板部分，或者(iii)所述报告分子和所述淬灭分子的一个连接至所述CTO的捕获部分，并且另一个连接至所述CTO的模板部分。
22.根据权利要求18所述的组合物，其中所述LPHO与所述CTO的标记部分的完整或部分序列杂交，以及在所述CTO上的报告分子和淬灭分子分离，从而使得所述淬灭分子不淬灭来自所述报告分子的信号。
23.根据权利要求18所述的组合物，其中所述LPHO包含与所述CTO杂交的片段竞争的核苷酸序列。
24.根据权利要求18所述的组合物，其中所述LPHO包含不与所述CTO杂交的片段竞争的核苷酸序列。
25.根据权利要求18所述的组合物，其提供依赖于所述靶核酸存在的信号。
26.根据权利要求25所述的组合物，其中所述依赖于所述靶核酸存在的信号是由所述延伸的双链体提供的信号。
27.根据权利要求18所述的组合物，其具有信号变化温度范围(SChTR)，其中信号变化依赖于所述靶核酸的存在，以及两个信号恒定温度范围(SCoTR)，其中即使所述靶核酸存在，信号也是恒定的。
28.根据权利要求27所述的组合物，其中所述信号变化温度范围高于所述两个信号恒定温度范围的第一信号恒定温度范围并且低于所述两个信号恒定温度范围的第二信号恒定温度范围。
29.根据权利要求27所述的组合物，其中在所述靶核酸存在时在所述信号变化温度范围内的温度下，所述延伸的双链体保持其双链状态，所述CTO/LPHO杂交体解离成单链状态。
30.一种用于检测样品中n种靶核酸的方法，其包括：
(a)在n种检测温度下检测信号，同时在反应容器将用于检测n种靶核酸的n种组合物与疑似含有所述n种靶核酸中的至少一种的样品一起孵育；
其中n是2或更大的整数，
其中所述孵育包括多个反应循环，并且在所述多个反应循环的至少一个中进行信号检测，
其中在存在相应靶核酸时，用于检测所述n种靶核酸的n种组合物中的每一种在所述n种检测温度中的相应检测温度下提供信号变化，所述信号变化指示存在相应靶核酸，
其中在用于检测所述n种靶核酸的n种组合物中，在存在第i靶核酸时，用于检测第i靶核酸的组合物在n种检测温度中的第i检测温度下提供信号变化，并在其他检测温度下提供恒定信号，所述信号变化指示存在第i靶核酸，
其中i表示从1至n的整数，以及所述第i检测温度低于第(i+1)检测温度，
其中在覆盖全部n种检测温度的温度范围内，用于检测所述第i靶核酸的组合物具有信号变化温度范围(SChTR)以及一个或两个信号恒定温度范围(SCoTR)，在所述SChTR中信号变化依赖于第i靶核酸存在，在所述SCoTR中即使第i靶核酸存在时所述信号也是恒定的，
其中用于检测所述第i靶核酸的组合物是以下任一种：
(i)Under信号变化型(UnderSC型)组合物，其具有的熔融特征是信号变化温度范围低于信号恒定温度范围，
(ii)Inter信号变化型(InterSC型)组合物，其具有的熔融特征是信号变化温度范围高于两个信号恒定温度范围中的一个并且低于两个信号恒定温度范围中的另一个，以及
(iii)Over信号变化型(OverSC型)组合物，其具有的熔融特征是信号变化温度范围高于信号恒定温度范围，以及
其中用于检测所述n种靶核酸的n种组合物的至少一种是(ii)根据权利要求1至17中任一项所述的方法产生信号的InterSC型组合物，以及
(b)由步骤(a)中检测到的信号确定n种靶核酸的存在，其中根据在所述第i检测温度下检测到的信号变化来确定所述第i靶核酸的存在。
31.根据权利要求30所述的方法，其中在用于检测第i靶核酸的组合物的信号变化温度范围内选择第i检测温度，其中所述第i检测温度不包括在用于检测其他靶核酸的组合物的信号变化温度范围内。
32.根据权利要求30所述的方法，其中用于检测所述第i靶核酸的组合物的信号变化温度范围与用于检测具有相邻检测温度的靶核酸的组合物的信号变化温度范围部分重叠，并且与用于检测具有不与其相邻的检测温度的靶核酸的组合物的信号变化温度范围不重叠。
33.根据权利要求30所述的方法，其中当n是2时，用于检测第一靶核酸的组合物是UnderSC型组合物或InterSC型组合物，并且用于检测第二靶核酸的组合物是InterSC型组合物或OverSC型组合物。
34.根据权利要求30所述的方法，其中当n是3或更大时，用于检测第一靶核酸的组合物是UnderSC型组合物或InterSC型组合物，用于检测第n靶核酸的组合物是InterSC型组合物或OverSC型组合物，并且用于检测所述第一靶核酸和所述第n靶核酸以外的靶核酸的各组合物是InterSC型组合物。
35.根据权利要求30所述的方法，其中用于检测第i靶核酸的组合物包含标记，其提供依赖于所述第i靶核酸存在的信号。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述标记在孵育过程中与寡核苷酸连接或并入寡核苷酸中。
37.根据权利要求30所述的方法，其中用于检测所述第i靶核酸的组合物提供双链体，所述双链体提供信号变化。
38.根据权利要求37所述的方法，其中提供信号变化的双链体最初已经包含于用于检测第i靶核酸的组合物中。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述提供信号变化的双链体通过标记的寡核苷酸和可与所述标记的寡核苷酸杂交的寡核苷酸之间的杂交而产生。
40.根据权利要求37所述的方法，其中所述提供信号变化的双链体在孵育中产生。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述提供信号变化的双链体通过标记的寡核苷酸和相应靶核酸之间的杂交而产生。
42.根据权利要求40所述的方法，其中所述提供信号变化的双链体通过依赖于相应靶核酸的存在的切割反应而产生。
43.根据权利要求37所述的方法，其中所述提供信号变化的双链体包含标记。
44.根据权利要求30所述的方法，其中所述用于检测第i靶核酸的组合物提供双链体，所述双链体提供信号变化，并且所述用于检测第i靶核酸的组合物的信号变化温度范围依赖于所述双链体的长度和/或序列而变化。
45.根据权利要求30所述的方法，其中在多个反应循环中的至少两个循环进行信号检测。
46.根据权利要求45所述的方法，其中使用在多个反应循环中的至少两个循环检测到的信号来测量所述信号变化。
47.根据权利要求30所述的方法，其中使用在多个反应循环中的至少一个循环检测到的信号和参考信号值来测量在所述第i检测温度下的信号变化。
48.根据权利要求47所述的方法，其中在不存在所述第i靶核酸时从反应中获得参考信号值。
49.根据权利要求30所述的方法，其中使用单一类型的检测器在n种检测温度的每一种下进行信号检测。
50.根据权利要求49所述的方法，其中在n种检测温度下通过单一类型的检测器检测到的信号不会彼此不同。
51.根据权利要求30所述的方法，其中所述孵育包含核酸扩增反应。
52.一种用于检测样品中的靶核酸的方法，其使用标记部分杂交寡核苷酸(LPHO)，所述方法包括：
(a)依赖于在样品中靶核酸的存在，提供通过寡核苷酸的酶切割反应产生的片段；
(b)将所述片段与捕获和模板寡核苷酸(CTO)杂交；
其中在3’至5’方向CTO包含：(i)捕获部分，其包含与所述片段杂交的核苷酸序列，和(ii)模板部分，其包含不与所述片段杂交的核苷酸序列，
其中所述CTO具有限定标记部分的报告分子和淬灭分子，
其中所述片段与所述CTO的捕获部分杂交；
(c)在LPHO存在时使用步骤(b)的所得物和具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶进行延伸反应；
其中所述LPHO包含与所述CTO的标记部分杂交的核苷酸序列，
其中当在所述样品中存在所述靶核酸时，与所述CTO的捕获部分杂交的所述片段延伸以产生与所述CTO互补的延伸链，从而在所述延伸链和所述CTO之间产生延伸的双链体，其中所述延伸的双链体的产生阻止在所述CTO的标记部分和所述LPHO之间形成CTO/LPHO杂交体，
其中当在所述样品中不存在所述靶核酸时，不产生延伸链，而是替代地形成所述CTO/LPHO杂交体，
其中所述延伸的双链体的熔融温度(Tm)与CTO/LPHO杂交体的Tm不同；以及
(d)检测延伸的双链体的存在；
其中通过测量由所述延伸的双链体提供的信号检测所述延伸的双链体，
其中在来自延伸的双链体的信号强度不同于来自CTO/LPHO杂交体的信号强度的温度下进行测量，以及
其中存在所述延伸的双链体指示存在所述靶核酸。
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