CN120813371A

CN120813371A - 用于在衣原体病的治疗中使用的组合物

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Publication number: CN120813371A
Application number: CN202480015809.3A
Authority: CN
Inventors: N·阿诺·巴尔贝; L·科尔; A·卡尔森; V·桑切斯; T·蒂比特斯
Original assignee: Sanofi Pasteur Inc
Current assignee: Sanofi Pasteur Inc
Priority date: 2023-03-02
Filing date: 2024-03-04
Publication date: 2025-10-17
Also published as: MX2025010274A; US12263213B2; US20250339506A1; WO2024180262A1; US20240299524A1; KR20250155051A; IL323069A; TW202502375A; AR132053A1; EP4673168A1; AU2024228998A1; CO2025013415A2

Abstract

本发明涉及可用于免疫抵抗衣原体感染的组合物(例如，疫苗组合物)。这些组合物包含可用于免疫抵抗衣原体属物种的衣原体属物种抗原和抗原组合，这些抗原和抗原组合以编码抗原蛋白的核酸(例如，mRNA)的形式或以重组蛋白抗原的形式使用。

Description

用于在衣原体病的治疗中使用的组合物

技术领域

本发明属于治疗和预防衣原体(Chlamydia)感染的领域。特别地，本发明涉及可用作免疫抵抗衣原体属物种(Chlamydia sp.)感染的疫苗的抗原和抗原组合。疫苗可作为编码抗原蛋白的核酸(例如，mRNA)或作为重组蛋白抗原递送。

背景技术

衣原体门(Chlamydiae)是造成多种感染的细胞内细菌性病原体，这些感染包括由沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)引起的人类性传播疾病和眼感染(沙眼)。衣原体属进一步包括流产衣原体(Chlamydia abortus)、肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)、鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci)、反刍动物衣原体(Chlamydia pecorum)、猫衣原体(Chlamydiafelis)和豚鼠衣原体(Chlamydia caviae)物种。

沙眼衣原体(C.trachomatis)包括三种生物变型，它们在人类中导致一系列病理状况，并且进一步细分为血清变型。¹沙眼生物变型的血清变型A-C(A、B、Ba和C)可引起衣原体性结膜炎或沙眼，这是一种可导致失明的疾病。²生殖道生物变型的血清变型D-K(D、E、F、G、H、I、J和K)引起生殖道疾病。³性病性淋巴肉芽肿生物变型的血清变型L1-3(L1、L2和L3)引起侵袭性泌尿生殖和肛门直肠感染，并且已经变得尤其与感染HIV的男男性行为者相关。⁴

沙眼衣原体(血清变型D-K)是性传播感染最常见的细菌性病原体。⁵在2020年，WHO估计了1.29亿新增沙眼衣原体感染。这些都是公共卫生问题，特别是因为未经治疗的感染通常没有症状或症状轻微，但它们助长病原体的传播。此外，如果不进行治疗，感染尤其可能导致输卵管炎、子宫内膜炎、盆腔炎性疾病(PID)、异位妊娠、输卵管性不孕症，并且可能增加传播或获得HIV和发展成宫颈癌的风险。⁶虽然沙眼衣原体感染可通过抗生素治疗得到有效控制，但由于沙眼衣原体感染病例的高发病率以及无症状病例经常被延迟诊断，沙眼衣原体已成为全球女性不孕症的主要病因。⁷需要开发一种有效的沙眼衣原体疫苗，作为遏制沙眼衣原体感染率的可持续战略。

发明内容

本发明人提供了可用于免疫抵抗衣原体属物种的衣原体属物种抗原和抗原组合。

特别地，本发明人发现，源自沙眼衣原体的原生主要外膜蛋白(MOMP)多肽的抗原以及除MOMP以外的沙眼衣原体抗原，当通过编码相关抗原的mRNA递送时，引发稳健的T细胞应答，特别是诱导产IFN-γ的CD4+ T细胞，和/或B细胞(即抗体)应答。特别地，T细胞应答被认为是保护性免疫的关键。

因此，本发明提供了经修饰的MOMP多肽，嵌合MOMP VD多肽以及CT443、CT584、CT600和CT812衣原体属物种多肽，以及包含编码此类多肽的核苷酸序列的核酸。

本文所述的多肽抗原可通过包含编码所述多肽的核苷酸序列的核酸(例如，mRNA)递送，即以该核酸的形式递送。

MOMP

MOMP是⁸在衣原体属物种细菌中发现的整合膜孔蛋白。它大约占沙眼衣原体膜⁹中蛋白质质量的60％，并含有多个B和T细胞表位。¹⁰在沙眼衣原体感染中，MOMP是免疫显性抗原。衣原体属物种的原生MOMP多肽包含由四个表面暴露的可变结构域(VD1、VD2、VD3和VD4)隔开的五个保守结构域。^11,12因此，在衣原体属物种的原生MOMP多肽中，VD1、VD2、VD3和VD4是表面暴露的环。在衣原体属物种(例如，沙眼衣原体)内，在不同血清变型中，原生MOMP多肽的VD序列有所相同。^13,14在沙眼衣原体的每个血清变型内，原生MOMP多肽序列高度保守，序列同一性大于98％。跨沙眼衣原体的血清变型，除表面暴露的VD外，蛋白质序列高度保守。中和抗体表位已被映射到VD。^{15,16,17,18,19}

本发明人已经认识到，产IFN-γ的CD4+ T细胞对于保护性免疫是关键的；事实上，细胞IFN-γ的产生已被证明与保护作用强烈相关²⁰，并且CD4+T细胞似乎是关键的，因为HIV+女性再次感染衣原体的风险增加²¹。还有证据表明，单独的沙眼衣原体抗体(即B细胞介导的应答)可能无法预防再感染，并且抗沙眼衣原体IgG的存在甚至可能增加意外感染的风险。²²抗沙眼衣原体抗体已被证明在小鼠体内存在CD4+ T细胞的情况下加速清除原发性沙眼衣原体攻击，然而，在不存在CD4+ T细胞的情况下，原发性攻击未被清除。²³

如本文所用，“原生衣原体属物种MOMP多肽”涵盖不含原生信号肽序列的衣原体属物种全长原生MOMP多肽的成熟形式和包含原生信号肽序列的衣原体属物种全长原生MOMP多肽。优选地，本文所指的衣原体属物种是沙眼衣原体。原生沙眼衣原体MOMP多肽可以属于血清变型A-C、D-K或L1-L3之一，例如血清变型D-K。在一些实施例中，原生沙眼衣原体MOMP多肽属于血清变型D-G之一。在一些优选的实施例中，原生沙眼衣原体MOMP多肽属于血清变型E。包括原生信号肽序列的原生衣原体属物种MOMP多肽的示例性序列由SEQ ID NO 1-4提供。

血清变型E的原生沙眼衣原体MOMP多肽的氨基酸序列提供于SEQ ID NO:2中：

原生信号肽序列对应于沙眼衣原体血清变型E的MOMP的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)中的残基1-22，并以下划线示出。SEQ ID NO:2的残基23-393对应于沙眼衣原体的血清变型E的全长原生MOMP多肽的成熟形式，其缺乏原生信号肽序列。沙眼衣原体的血清变型E的MOMP多肽的VD1-VD4序列在上文以粗体和下划线示出。

原生衣原体属物种MOMP多肽可以包括以下各项的序列：

(i)沙眼衣原体的血清变型D的原生MOMP多肽(SEQ ID NO:1)或其成熟形式(SEQID NO:1的残基23-393)；

(ii)沙眼衣原体的血清变型F的原生MOMP多肽(SEQ ID NO:3)或其成熟形式(SEQID NO:3的残基23-395)；或者

(iii)沙眼衣原体的血清变型G的原生MOMP多肽(SEQ ID NO:4)或其成熟形式(SEQID NO:4的残基23-395)。

原生衣原体属物种MOMP多肽包含由四个可变表面暴露结构域(VD1、VD2、VD3和VD4)隔开的五个保守结构域。例如，在沙眼衣原体血清变型E的原生MOMP多肽中，VD1(SEQID NO:9)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸残基86-105，VD2(SEQ ID NO:10)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸残基161-181，VD3(SEQ ID NO:11)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸残基245-260，并且VD4(SEQ ID NO:12)对应于SEQ ID NO:2的氨基酸残基309-337。保守结构域对应于氨基酸残基23-85(第一保守结构域)、106-160(第二保守结构域)、182-244(第三保守结构域)、261-308(第四保守结构域)和338-393(第五保守结构域)。对于血清变型E，VD4(SEQ ID NO:12)对应于SEQ ID NO:2中的位置309-337，并且第五保守结构域对应于SEQ ID NO:2中的位置338-393，或者VD4(SEQ ID NO:883)对应于SEQ ID NO:2中的位置309-338，并且第五保守结构域对应于SEQ ID NO:2中的位置339-393。

对于沙眼衣原体的血清变型D、F和G，对应于VD1、VD2、VD3和VD4的残基以及五个保守结构域如表1所示。对于血清变型D，VD4(SEQ ID NO:8)对应于SEQ ID NO:1中的位置309-337，并且第五保守结构域对应于SEQ ID NO:1中的位置338-393，或者VD4(SEQ ID NO:882)对应于SEQ ID NO:1中的位置309-338，并且第五保守结构域对应于SEQ ID NO:1中的位置339-393。对于血清变型F，VD4(SEQ ID NO:16)对应于SEQ ID NO:3中的位置310-339，并且第五保守结构域对应于SEQ ID NO:3中的位置340-395，或者VD4(SEQ ID NO:884)对应于SEQ ID NO:3中的位置310-340，并且第五保守结构域对应于SEQ ID NO:3中的位置341-395。对于血清变型G，VD4(SEQ ID NO:20)对应于SEQ ID NO:4中的位置310-339，并且第五保守结构域对应于SEQ ID NO:4中的位置340-395，或者VD4(SEQ ID NO:885)对应于SEQ IDNO:4中的位置310-340，并且第五保守结构域对应于SEQ ID NO:4中的位置341-395。

表1-沙眼衣原体血清变型D-G的原生MOMP多肽中的VD1-VD4以及第一、第二、第三、第四和第五保守结构域。

血清变型A-C、H-K或L1-L3的原生沙眼衣原体MOMP多肽或其他原生衣原体属物种MOMP多肽在对应于针对沙眼衣原体的血清变型D-G(例如，血清变型E)的原生MOMP多肽所述的残基编号的位置处包含VD1-VD4和保守结构域。

其他原生衣原体属物种MOMP多肽的序列，包括血清变型A-C、H-K或L1-L3的沙眼衣原体MOMP多肽的序列，是众所周知的，并且可从公共数据库获得。例如，原生衣原体属物种MOMP多肽的氨基酸序列可在Uniprot(https://www.uniprot.org/)和NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库中获得。编码原生衣原体属物种MOMP多肽的核酸序列可从NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库获得。其他原生衣原体属物种MOMP多肽内的VD和保守结构域的位置是众所周知的，并且在任何情况下可以通过以下方式来确定：将例如沙眼衣原体血清变型D、E、F和G的序列与其他原生衣原体属物种MOMP多肽的序列进行比对，并寻找高序列保守性的区域以鉴定例如保守结构域。

经修饰的MOMP多肽

本发明人已经生成了包含非原生环序列而不是原生衣原体属物种MOMP VD序列的经修饰的MOMP多肽。本发明人已经认识到，此类经修饰的MOMP多肽可用于引发针对衣原体属物种感染的保护性免疫应答。特别地，本发明人已经证明，此类经修饰的MOMP多肽诱导T细胞(包括CD4+T细胞，诸如产IFNγ的CD4+ T细胞)应答。值得注意的是，据信，产IFN-γ的CD4+ T细胞在抵抗衣原体属物种感染方面具有重要作用。因此，原生VD序列的消除可以减少B细胞介导的(例如，抗体)应答(例如，针对VD中的B细胞表位)，同时优先处理针对MOMP(例如针对血清变型之间保守的保守结构域中的序列)的T细胞应答。本发明人已经表明，经修饰的MOMP多肽可引发交叉血清变型T细胞免疫应答，即，针对衣原体属物种的两种或更多种血清变型(例如，沙眼衣原体的血清变型D-G和J)具有交叉反应性的T细胞免疫应答。

因此，本发明人已经证明，这些经修饰的MOMP多肽是合适的疫苗候选物，其作为独立抗原使用或与能够在受试者中引发B细胞介导的(例如，抗体)应答和/或T细胞介导的应答的其他衣原体属物种抗原(诸如本文提供的一种或多种嵌合MOMP VD多肽和/或本文提供的一种或多种衣原体属物种CT443、CT584、CT600或CT812多肽)组合使用，以促进长效记忆T细胞应答和针对感染的保护性免疫。本文所述的经修饰的MOMP多肽可通过包含编码经修饰的MOMP多肽的核苷酸序列的核酸递送。

因此，在一方面，本发明提供了一种核酸，该核酸包含编码经修饰的MOMP多肽的核苷酸序列，其中经修饰的MOMP多肽具有包含原生衣原体属物种MOMP多肽的两个或更多个保守结构域序列和保守结构域序列之间的非原生环序列的氨基酸序列。在另外的方面，本发明提供了一种经修饰的MOMP多肽，其具有包含原生衣原体属物种MOMP多肽的两个或更多个保守结构域序列和保守结构域序列之间的非原生环序列的氨基酸序列。

在一个优选的实施例中，经修饰的MOMP多肽不包含两个或更多个保守结构域序列之间的原生衣原体属物种MOMP可变结构域。因此，在经修饰的MOMP多肽中，非原生环序列可以替代原生衣原体属物种MOMP多肽VD序列。因此，经修饰的MOMP多肽可以省略两个或更多个保守结构域序列之间的原生衣原体属物种MOMP VD序列，并且包含两个或更多个保守结构域序列之间的非原生环序列。

用非原生环替代原生衣原体属物种MOMP VD序列可去除在原生衣原体属物种MOMPVD中发现的B细胞表位(例如，抗体表位)。这些B细胞表位的去除可减少受试者中B细胞介导的对抗原(例如，对原生MOMP VD中的B细胞表位)的应答。这可以有利地增加受试者中对MOMP的T细胞应答，例如对MOMP保守结构域中的序列的T细胞应答，这些序列在MOMP血清变型之间共享高度同一性。因此，本发明的经修饰的MOMP多肽可在受试者中引发交叉血清变型T细胞免疫应答，即，针对衣原体属物种的两种或更多种血清变型具有交叉反应性(例如，针对沙眼衣原体的两种或更多种血清变型(例如，血清变型D-G和J)具有交叉反应性)的T细胞免疫应答。因此，本发明的经修饰的MOMP多肽可能能够增强T细胞介导的应答(例如，相对于对应的原生MOMP多肽)。例如，相对于对应的原生MOMP多肽，本发明的经修饰的MOMP多肽可能能够增强CD4+ T细胞介导的应答(例如，IFNγ+CD4+ T细胞应答，诸如IFNγ+IL2+ TNFα+CD4+T细胞应答)。本发明的经修饰的MOMP多肽可能能够在受试者中诱导T细胞应答(例如，抗原特异性T细胞应答)。T细胞应答可以是免疫显性的。本发明的经修饰的MOMP多肽可能能够在受试者中引发对原生衣原体属物种MOMP多肽有反应的T细胞群。在一些实施例中，T细胞应答是CD4+ T细胞应答(例如，IFNγ+CD4+ T细胞应答)。在一些实施例中，T细胞应答是IFNγ+IL2+ TNFα+CD4+ T细胞应答。

“非原生环序列”是指对任何血清变型的任何衣原体属物种MOMP VD(VD1、VD2、VD3或VD4)并非原生的序列。在一些实施例中，非原生环序列与任何血清变型的任何原生衣原体属物种MOMP VD(VD1、VD2、VD3或VD4)序列具有不超过40％、不超过35％、不超过30％、不超过25％、不超过20％、不超过15％、不超过10％或不超过5％的同一性。在一些实施例中，非原生环序列与沙眼衣原体的血清变型E的MOMP VD序列(VD1、VD2、VD3或VD4)(SEQ ID No:9-12)具有不超过40％、不超过35％、不超过30％、不超过25％、不超过20％、不超过15％、不超过10％或不超过5％的同一性。

非原生环序列可以允许经修饰的MOMP多肽中的保守结构域序列形成β-桶结构，例如，以维持原生衣原体属物种MOMP多肽的保守结构域的β-桶结构。因此，在本发明的经修饰的MOMP多肽中，两个或更多个保守结构域序列通过非原生环序列连接，使得保守结构域序列形成β-桶结构(例如，由反平行β链组成)。β-桶结构可以通过计算机进行预测(例如，使用Alphafold2(深思考公司(Deepmind))软件)。

计算机建模可用于创建原生MOMP蛋白质的3D结构，该结构包含一个β桶，其中VD1-VD4序列作为连接各个β链的环。VD1-VD4环位于桶结构的同一侧(在原生MOMP多肽中表面暴露)。非原生环序列可在计算机模型中映射到VD环上，并且合适的非原生环序列可以由本领域技术人员确定。合适的非原生环序列包括可以覆盖原生VD侧翼保守结构域末端之间的距离的肽序列，例如，如计算机所建模的。该距离可以对应于通过计算机3D模型确定的VD序列前最后一个保守结构域残基到VD序列后第一个保守结构域残基之间的距离(例如，以埃计)。

非原生环序列可以排除在受试者(例如，人)蛋白质组中发现的序列基序，例如长度为8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、13个或更多个、14个或更多个或15个或更多个氨基酸的序列基序。被排除在外的主题蛋白质组(例如，人蛋白质组)序列基序典型地长度为8个或更多个氨基酸。这有助于最大限度地减少由于抗原与自身蛋白之间的同源性而产生的不需要的交叉反应性。

非原生环序列的长度可以介于3个与30个氨基酸之间，例如，长度介于4个与20个氨基酸之间。在一些实施例中，替代VD1的非原生环序列可具有根据SEQ ID NO:462或466(例如，SEQ ID NO:462)的序列。在一些实施例中，替代VD2的非原生环序列可具有根据SEQID NO:463或467(例如，SEQ ID NO:463)的序列。在一些实施例中，替代VD3的非原生环序列可具有根据SEQ ID NO:464或468(例如，SEQ ID NO:464)的序列。在一些实施例中，替代VD4的非原生环序列可具有根据SEQ ID NO:465或469(例如，SEQ ID NO:465)的序列。典型地，经修饰的MOMP多肽可包含分别替换VD1、VD2、VD3和VD4的根据SEQ ID NO 462-465的四个非原生环序列。经修饰的MOMP多肽可以替代性地包含分别替换VD1、VD2、VD3和VD4的根据SEQID NO 466-469的四个非原生环序列。

“原生衣原体属物种MOMP多肽的保守结构域序列”是指任何血清变型的衣原体属物种的MOMP多肽或其变体的保守结构域的序列。变体包含与任何血清变型的衣原体属物种MOMP多肽的保守结构域具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性(优选至少95％同一性)的序列。在一些实施例中，经修饰的MOMP多肽的保守结构域序列与任何血清变型的衣原体属物种的原生MOMP多肽的保守结构域(例如，表1中定义的保守结构域)具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性(至少95％同一性)。变体还包含衣原体属物种的MOMP多肽的原生保守结构域的截短形式，例如其中经修饰的MOMP多肽中的保守结构域序列缺乏原生衣原体属物种MOMP保守结构域序列的多达3个、5个、8个、10个、15个、20个、25个或30个(例如，多达3个或5个，例如，多达3个)氨基酸。在一些实施例中，经修饰的MOMP多肽的保守结构域序列缺乏原生衣原体属物种MOMP保守结构域序列的多达3个或5个氨基酸。沙眼衣原体血清变型D、E、F和G的保守结构域边界如表1所示。

在一些实施例中，经修饰的MOMP多肽包含原生衣原体属物种MOMP多肽或其变体的两个、三个、四个或五个保守结构域。在一些实施例中，经修饰的MOMP多肽包含原生衣原体属物种MOMP多肽或其变体的五个保守结构域序列。在一些实施例中，经修饰的MOMP多肽包含原生衣原体属物种MOMP多肽的所有五个全长保守结构域。经修饰的MOMP多肽的保守结构域总体上可与原生MOMP多肽(例如，血清变型E MOMP)的保守结构域具有至少95％的序列同一性。在一些实施例中，经修饰的MOMP多肽的保守结构域序列总体上与原生MOMP多肽的保守结构域(例如，表1中定义的保守结构域)具有至少90％或至少95％(例如，至少95％)序列同一性。

经修饰的MOMP多肽的保守结构域可以包含来自沙眼衣原体的血清变型(例如，血清变型D-K，诸如血清变型D-G)的MOMP的保守结构域序列。在一些实施例中，经修饰的MOMP多肽的保守结构域可以包含来自沙眼衣原体的血清变型E的MOMP的保守结构域序列。

经修饰的MOMP多肽可以包含每个保守结构域序列之间的非原生环序列。因此，经修饰的MOMP多肽可以包含一个、两个、三个或四个非原生环序列。一个或多个非原生环序列可以替代对应的原生VD环中的一个、两个、三个或四个。原生VD可以保留在任何剩余的保守结构域之间。经修饰的MOMP多肽可以具有原生衣原体属物种MOMP多肽的五个保守结构域序列。在一些实施例中，经修饰的MOMP多肽不包含任何保守结构域序列之间的任何原生衣原体属物种MOMP VD。在一些实施例中，经修饰的MOMP多肽包含四个非原生环序列，并且不包含这些保守结构域序列之间的任何原生衣原体属物种MOMP VD。在一些实施例中，经修饰的MOMP多肽不包含任何原生衣原体属物种MOMP VD(或其至少5个、6个或7个连续氨基酸的片段)。

在一些实施例中，经修饰的MOMP多肽包含(1)任何血清变型的沙眼衣原体的衣原体属物种MOMP多肽的所有五个保守结构域序列，和(2)四个非原生环序列，其中非原生环序列位于每个保守结构域序列之间，并且其中经修饰的MOMP多肽不包含任何保守结构域序列之间的任何原生衣原体属物种MOMP可变结构域，进一步地其中非原生环序列的长度介于3个与30个氨基酸之间并且与任何血清变型的任何原生衣原体属物种MOMP VD(VD1、VD2、VD3或VD4)序列具有不超过40％的同一性。

经修饰的MOMP多肽可以包含根据下式的氨基酸序列(例如，从N末端至C末端)：

C1–L1–C2(式I)，

其中C1和C2是原生衣原体属物种MOMP多肽的两个保守结构域序列，并且L1是非原生环序列。

在一些实施例中，经修饰的MOMP多肽包含根据下式的氨基酸序列(例如，从N末端至C末端)：

C1–L1–C2–L2–C3(式II)，

其中C1、C2和C3是原生衣原体属物种MOMP多肽的三个保守结构域序列，并且L1和L2是非原生环序列。

C1–L1–C2–L2–C3–L3–C4(式III)，

其中C1、C2、C3和C4是原生衣原体属物种MOMP多肽的四个保守结构域序列，并且L1、L2和L3是非原生环序列。

C1–L1–C2–L2–C3–L3–C4–L4–C5(式IV)

其中C1、C2、C3、C4和C5是原生衣原体属物种MOMP多肽的五个保守结构域序列，并且L1、L2、L3和L4是非原生环序列。

保守结构域序列和非原生环序列可以如本文所述。

在一些实施例中，C1-C5分别对应于原生沙眼衣原体MOMP多肽的第一、第二、第三、第四和第五保守结构域(例如，如表1中所定义)。

因此，在一些实施例中，本发明的核酸包含编码经修饰的MOMP多肽的核苷酸序列，其包含式I、II、III或IV，优选IV所示的序列或由其组成。

在一些实施例中，经修饰的MOMP多肽包含根据SEQ ID NO:486-489中任一者(例如，SEQ ID NO:486)的序列或与其具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的序列。在一些实施例中，经修饰的MOMP多肽包含与SEQ ID NO 486-489(例如，SEQ ID NO:486)具有至少90％同一性的序列。在一些实施例中，经修饰的MOMP多肽包含与SEQ ID NO 486-489(例如，SEQ ID NO:486)具有至少95％同一性的序列。

在一些实施例中，包含编码经修饰的MOMP多肽的核苷酸序列的核酸包含根据SEQID NO:551-566中任一者(例如，SEQ ID NO:551)的核苷酸序列或与其具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％(例如，至少75％)同一性的序列。典型地，核酸包含根据SEQ ID NO:551的核苷酸序列或与其具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％(例如，至少75％)同一性的序列。在一些实施例中，核酸包含编码本文所述的分泌信号肽序列(例如，根据SEQ ID NO:187的分泌信号肽序列)的核苷酸序列。

在一个实施例中，本发明的核酸是包含以下结构元件或由以下结构元件组成(例如，由以下结构元件组成)的mRNA：

(1)5'帽；

(2)5'非翻译区(5'UTR)，其具有根据SEQ ID NO:838的核酸序列；

(3)蛋白质编码区，其具有根据SEQ ID NO:213的核酸序列，任选地后接终止密码子(例如，TGA)；

(4)3'非翻译区(3'UTR)，其具有根据SEQ ID NO:839的核酸序列；以及

(5)polyA尾。

(1)5'帽，其具有以下结构：

(2)5'非翻译区(5'UTR)，其具有根据SEQ ID NO:838的核酸序列；

(3)蛋白质编码区，其具有根据SEQ ID NO:213的核酸序列；

(4)3'非翻译区(3'UTR)，其具有根据SEQ ID NO:839的核酸序列；以及

(5)polyA尾。

在一些实施例中，(1)的3'端经由3'至5'磷酸二酯键直接键合至(2)的5'端；(2)的3'端经由3'至5'磷酸二酯键直接键合至(3)的5'端；(3)的3'端经由3'至5'磷酸二酯键直接键合至(4)的5'端；并且(4)的3'端经由3'至5'磷酸二酯键直接键合至(5)的5'端。在一些实施例中，mRNA是经化学修饰的，并且该化学修饰包括N1-甲基假尿苷来替换每个尿苷。mRNA可以包封在LNP中。

嵌合MOMP VD多肽

本发明人已经证明，用包含不同沙眼衣原体血清变型的VD序列的嵌合衣原体属物种MOMP VD多肽进行免疫引发了有效的抗体应答。特别地，本发明人已经表明，编码嵌合MOMP VD多肽的mRNA成功地引发了有效的抗体(IgG)应答，这些多肽组合了血清变型的VD序列，这些血清变型相对于其他血清变型彼此显示出更低水平的VD序列同一性。含有VD结构域的嵌合MOMP VD多肽能够引发针对特定血清变型的稳健IgG应答，这些VD结构域中只有一个来自该血清变型。使用编码嵌合MOMP VD多肽的mRNA获得的IgG抗体应答水平高于用编码组合了血清变型D、E、F和G的四个VD4序列的多肽的mRNA进行免疫所诱导的IgG抗体应答水平(其基于以下文献中描述的多肽：Anja W.Olsen等人,Protection Against Chlamydiatrachomatis Infection and Upper Genital Tract Pathological Changes byVaccine-Promoted Neutralizing Antibodies Directed to the VD4 of the MajorOuter Membrane Protein[疫苗促进的针对主要外膜蛋白VD4的中和抗体对沙眼衣原体感染和上生殖道病理变化的保护作用],The Journal of Infectious Diseases[传染病杂志],第212卷,第6期,2015,第978–989页)。此外，使用编码嵌合MOMP VD多肽的mRNA获得的IgG抗体应答水平高于用编码原生MOMP蛋白的mRNA进行免疫所诱导的IgG抗体应答水平。本发明人还证明，用本发明的嵌合衣原体属物种MOMP VD多肽进行免疫引发了针对沙眼衣原体原生小体(EB)的有效抗体(例如，IgG)应答。所引发的抗体针对沙眼衣原体的不同血清变型的EB具有交叉反应性。本发明人还证明，本发明的衣原体属物种MOMP VD多肽引发了T细胞应答，包括CD4+和CD8+T细胞，诸如产IFNγ的CD4+和CD8+ T细胞。发明人已经证明，本发明的嵌合MOMP VD多肽是合适的疫苗候选物。

因此，在另一方面，本发明提供了一种核酸，该核酸包含编码嵌合衣原体属物种MOMP可变结构域(VD)多肽的核苷酸序列，其中嵌合MOMP VD多肽包含含有衣原体属物种的不同血清变型的两个或更多个衣原体属物种MOMP VD序列的氨基酸序列。在进一步的方面，本发明提供了嵌合衣原体属物种MOMP VD多肽，其中嵌合MOMP VD多肽包含含有衣原体属物种的不同血清变型的两个或更多个衣原体属物种MOMP VD序列的氨基酸序列。原生MOMP VD序列跨衣原体属物种血清变型是高度可变的，并且包含引发B细胞(即，抗体)免疫应答的表位。本发明的嵌合MOMP VD多肽可以在受试者中引发B细胞(即，抗体)应答，例如，抗原特异性抗体应答。抗体应答可以是IgG应答。所引发的抗体可结合沙眼衣原体原生小体。术语“嵌合MOMP VD构建体”、“嵌合衣原体属物种MOMP VD多肽”和“嵌合MOMP VD多肽”在本文中可互换使用。

因此，包含不同衣原体属物种血清变型的两个或更多个MOMP VD序列的本发明的嵌合MOMP VD多肽可引发针对沙眼衣原体的多于一种血清变型的B细胞(即抗体)应答，例如，交叉血清变型应答。因此，本发明的嵌合VD多肽可引发针对衣原体属物种的两种或更多种血清变型的B细胞(抗体)应答。应答可以是保护性抗体应答。

本发明人比较了沙眼衣原体的MOMP VD序列，并且发现了跨血清变型的不同水平的序列变异。一些血清变型的MOMP VD序列是相同的或具有高水平的序列同一性(例如，至少70％)，而其他血清变型具有更大程度的序列变异。例如，血清变型D和E的VD1序列具有高水平的序列同一性，并且血清变型F和G的VD1序列是相同的。然而，(i)血清变型D或E与(ii)血清变型F或G的VD1序列之间存在大得多的变异水平。血清变型D和E的VD2序列具有高水平的序列同一性，并且同样，血清变型F和G的VD2序列具有高水平的序列同一性。然而，(i)血清变型D或E与(ii)血清变型F或G的VD2序列之间存在大得多的变异水平。血清变型D和F的VD3序列是相同的，并且血清变型F和G的VD3序列具有高水平的序列同一性。与血清变型G相比，血清变型E的VD3序列与血清变型D/F的VD3序列相比具有较低百分比的序列同一性。然而，本发明人发现，血清变型E的VD3序列含有与人蛋白质组中发现的序列同源的氨基酸基序。对于VD4，血清变型D和E的序列具有高水平的序列同一性，并且同样，血清变型F和G的序列具有高水平的序列同一性。然而，(i)血清变型D或E与(ii)血清变型F或G的VD4序列之间存在大得多的序列变异水平。

因此，本发明的嵌合MOMP VD多肽可以包含衣原体属物种的不同血清变型的两个MOMP VD1序列，其中与衣原体属物种的其他血清变型的VD1序列相比，这两个VD1序列彼此具有更低的序列同一性。在一些实施例中，嵌合MOMP VD多肽中衣原体属物种的不同血清变型的两个MOMP VD1序列彼此具有不超过70％、69％、68％、67％、66％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％的同一性(例如，不超过50％的同一性)。血清变型可选自沙眼衣原体血清变型D-K，例如，D、E、F和G。

本发明的嵌合MOMP VD多肽可以包含衣原体属物种的不同血清变型的两个MOMPVD2序列，其中与衣原体属物种的其他血清变型的VD2序列相比，这两个VD2序列彼此具有更低的序列同一性。在一些实施例中，嵌合MOMP VD多肽中衣原体属物种的不同血清变型的两个MOMP VD2序列彼此具有不超过80％、79％、78％、77％、76％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％(例如，不超过50％)的同一性。血清变型可选自沙眼衣原体血清变型D-K，例如，D、E、F和G。

本发明的嵌合MOMP VD多肽可以包含衣原体属物种的不同血清变型的两个MOMPVD3序列，其中与衣原体属物种的其他血清变型的VD3序列相比，这两个VD3序列彼此具有更低的序列同一性。在一些实施例中，嵌合MOMP VD多肽中衣原体属物种的不同血清变型的两个MOMP VD3序列彼此具有不超过87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％(例如，不超过70％)的同一性。在其他实施例中，嵌合MOMP包含单个MOMP VD3结构域。血清变型可选自沙眼衣原体血清变型D-K，例如，D、E、F和G。

本发明的嵌合MOMP VD多肽可以包含衣原体属物种的不同血清变型的两个MOMPVD4序列，其中与衣原体属物种的其他血清变型的VD4序列相比，这两个VD4序列彼此具有更低的序列同一性。在一些实施例中，嵌合MOMP VD多肽中衣原体属物种的不同血清变型的两个MOMP VD4序列彼此可以具有不超过77％、76％、75％、74％、73％、72％、71％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％的同一性(例如，不超过60％的同一性)。血清变型可选自沙眼衣原体血清变型D-K，例如，D、E、F和G。

在优选的实施例中，嵌合MOMP VD多肽中的MOMP VD序列排除在受试者(例如，人)蛋白质组中发现的序列基序，例如长度为8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、13个或更多个、14个或更多个或15个或更多个(例如，8个或更多个)氨基酸的序列基序。被排除在外的主题蛋白质组(例如，人蛋白质组)序列基序典型地长度为8个或更多个氨基酸。如上所述，这有助于最大限度地减少不需要的交叉反应性。

在优选的实施例中，嵌合MOMP VD多肽包含位于两个或更多个MOMP VD序列中的每一个序列侧翼的原生衣原体属物种MOMP多肽的保守结构域序列部分。

嵌合MOMP VD多肽可以包含2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个或14个MOMP VD序列。在一些实施例中，嵌合MOMP VD多肽包含七个MOMP VD序列。

衣原体属物种可以是沙眼衣原体，并且血清变型可以是D-K。

嵌合MOMP VD多肽可以包含沙眼衣原体的两种、三种、四种、五种、六种、七种或八种不同血清变型(例如，血清变型D-K)的MOMP VD。在一些实施例中，嵌合MOMP VD多肽包含沙眼衣原体的四种不同血清变型(例如，血清变型变D-G)的MOMP VD。

嵌合MOMP VD多肽可以包含(i)衣原体属物种的不同血清变型的两个MOMP VD1序列；以及/或者(ii)衣原体属物种的不同血清变型的两个MOMP VD2序列；以及/或者(iii)一个MOMP VD3序列；以及/或者(iv)衣原体属物种的不同血清变型的两个MOMP VD4序列。在其他实施例中，存在衣原体属物种的不同血清变型的两个MOMP VD3序列。不同的血清变型可选自沙眼衣原体的血清变型D、E、F或G。

因此，本发明的嵌合MOMP VD多肽可以包含沙眼衣原体的血清变型D或E的一个MOMP VD序列和沙眼衣原体的血清变型F或G的一个MOMP VD序列。在一些实施例中，嵌合MOMP VD多肽包含沙眼衣原体的血清变型D或E的MOMP VD1序列和沙眼衣原体的血清变型F或G的MOMP VD1序列(例如，沙眼衣原体的血清变型E的MOMP VD1序列和沙眼衣原体的血清变型G的MOMP VD1序列)。在一些实施例中，嵌合MOMP VD多肽包含沙眼衣原体的血清变型D或E的MOMP VD2序列和沙眼衣原体的血清变型F或G的MOMP VD2序列(例如，沙眼衣原体的血清变型D的MOMP VD2序列和沙眼衣原体的血清变型G的MOMP VD2序列)。在一些实施例中，嵌合MOMP VD多肽包含沙眼衣原体的血清变型D、F或G(例如，血清变型F)的MOMP VD3序列。在一些实施例中，嵌合MOMP VD多肽包含沙眼衣原体的血清变型D或E的MOMP VD4序列和沙眼衣原体的血清变型F或G的MOMP VD4序列(例如，沙眼衣原体的血清变型D的MOMP VD4序列和沙眼衣原体的血清变型F的MOMP VD4序列)。

本发明的嵌合MOMP VD多肽可以包含沙眼衣原体的血清变型D或E的两个、三个或四个MOMP VD序列和沙眼衣原体的血清变型F或G的两个、三个或四个MOMP VD序列。在一些实施例中，对于MOMP VD1、VD2、VD3和VD4中的每一者，嵌合MOMP VD多肽包含沙眼衣原体的血清变型D或E的一个MOMP VD序列和沙眼衣原体的血清变型F或G的一个MOMP VD序列。在优选的实施例中，嵌合MOMP VD多肽包含仅一个MOMP VD3序列，其对应于沙眼衣原体的血清变型D、F或G(例如，血清变型F)的VD3。

嵌合MOMP VD多肽可以包含(i)-(iv)中的至少一者(例如，一者、两者、三者或四者)：(i)来自血清变型D的MOMP VD1序列和来自血清变型F的MOMP VD1序列，或来自血清变型E的MOMP VD1序列和来自血清变型F的MOMP VD1序列；以及/或者(ii)来自血清变型E的MOMP VD2序列和来自血清变型F的MOMP VD2序列，或来自血清变型D的MOMP VD2序列和来自血清变型G的MOMP VD2序列；以及/或者(iii)来自血清变型G的MOMP VD3序列，或来自血清变型F的MOMP VD3序列；以及/或者(iv)来自血清变型E的MOMP VD4序列和来自血清变型G的MOMP VD4序列，或来自血清变型D的MOMP VD4序列和来自血清变型F的MOMP VD4序列，其中血清变型D、E、F或G属于沙眼衣原体。在一些实施例中，嵌合MOMP VD多肽包含(i)-(iv)中的四者。在一些实施例中，嵌合MOMP VD多肽包含(i)来自血清变型E的MOMP VD1序列和来自血清变型G的MOMP VD1序列；和(ii)来自血清变型D的MOMP VD2序列和来自血清变型G的MOMPVD2序列；和(iii)来自血清变型F的MOMP VD3序列；和(iv)来自血清变型D的MOMP VD4序列和来自血清变型F的MOMP VD4序列，其中血清变型D、E、F或G属于沙眼衣原体。来自沙眼衣原体的血清变型F的MOMP VD1序列与来自沙眼衣原体的血清变型G的MOMP VD1序列相同。

在一些实施例中，嵌合MOMP VD多肽包含：(i)来自血清变型D的MOMP VD1序列和来自血清变型F的MOMP VD1序列、来自血清变型E的MOMP VD2序列和来自血清变型F的MOMPVD2序列、来自血清变型G的MOMP VD3序列、来自血清变型E的MOMP VD4序列和来自血清变型G的MOMP VD4序列；或(ii)来自血清变型E的MOMP VD1序列和来自血清变型F的MOMP VD1序列、来自血清变型D的MOMP VD2序列和来自血清变型G的MOMP VD2序列、来自血清变型F的MOMP VD3序列、来自血清变型D的MOMP VD4序列和来自血清变型F的MOMP VD4序列，其中血清变型D、E、F或G属于沙眼衣原体。在一些实施例中，嵌合MOMP VD多肽包含如(i)中的MOMPVD序列。典型地，嵌合MOMP VD多肽包含如(ii)中的MOMP VD序列。

典型地，嵌合MOMP VD多肽在对应于原生衣原体属物种MOMP多肽中的N-糖基化位点的一个或多个(例如，所有)位置处包含单个氨基酸取代，例如，在一个或多个MOMP VD结构域中。

本文所述的嵌合MOMP VD多肽可包含保守结构域序列部分，这些部分是位于其原生衣原体属物种MOMP多肽中的VD侧翼的原生衣原体属物种MOMP多肽的保守结构域序列的部分。位于其原生衣原体属物种MOMP多肽中的VD侧翼的保守结构域序列可以紧邻VD序列。

嵌合MOMP VD多肽中的每个保守结构域序列部分可以包含原生衣原体属物种MOMP多肽的保守结构域序列的3至30个氨基酸残基(例如，4至20个)，其中3至30个(例如，4至20个)氨基酸残基紧邻其原生衣原体属物种MOMP多肽中的VD序列。

本文所述的嵌合MOMP VD多肽可以包含根据下式的氨基酸序列：

(Ax–VDx–Bx)y–(Aw–VDw–Bw)z，其中

VDx包含原生沙眼衣原体血清变型y MOMP多肽的VD1、VD2、VD3或VD4的VD序列；

Ax包含在血清变型y的原生衣原体属物种MOMP多肽序列中紧接在VDx之前的3至30个(例如，4至20个)氨基酸残基；

Bx包含在血清变型y的原生衣原体属物种MOMP多肽序列中紧接在VDx之后的3至30个(例如，4至20个)氨基酸残基；

VDw包含原生沙眼衣原体血清变型z MOMP多肽的VD1、VD2、VD3或VD4的VD序列；

Aw包含在血清变型z的原生衣原体属物种MOMP多肽序列中紧接在VDw之前的3至30个(例如，4至20个)氨基酸残基；

Bw包含在血清变型z的原生衣原体属物种MOMP多肽序列中紧接在VDw之后的3至30个(例如，4至20个)氨基酸残基，

x和w独立地选自1-4并且表示选自VD1、VD2、VD3或VD4的MOMP VD；以及

y和z是沙眼衣原体的血清变型(例如，选自血清变型D、E、F或G)。

在一些实施例中，嵌合MOMP VD多肽包含根据SEQ ID NO:490-505中任一者(例如，SEQ ID NO:495或503(例如，SEQ ID NO:503))的序列或与其具有至少70％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的序列。在一些实施例中，嵌合MOMP VD多肽包含与SEQID NO 490-505(例如，SEQ ID NO:495或503(例如，SEQ ID NO:503)具有至少90％同一性的序列。在一些实施例中，嵌合MOMP VD多肽包含与SEQ ID NO 490-505中任一者(例如，SEQID NO:495或503(例如，SEQ ID NO:503)具有至少95％同一性的序列。

在一些实施例中，包含编码嵌合MOMP VD多肽的核苷酸序列的核酸包含根据SEQID NO:567-630中任一者(例如，SEQ ID NO:617)的核苷酸序列或与其具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的序列。在一些实施例中，包含编码嵌合MOMP VD多肽的核苷酸序列的核酸包含与SEQ IDNO:567-630中任一者(例如，SEQ ID NO:617)具有至少85％同一性的核苷酸序列。在一些实施例中，核酸包含编码本文所述的分泌信号肽序列(例如，根据SEQ ID NO:187的分泌信号肽序列)的核苷酸序列。例如，核酸可以包含根据SEQ ID NO:870的序列。

在一个实施例中，核酸是包含以下结构元件或由以下结构元件组成(例如，由以下结构元件组成)的mRNA：

(1)5'帽；

(2)5'非翻译区(5'UTR)，其具有根据SEQ ID NO:838的核酸序列；

(3)蛋白质编码区，其具有根据SEQ ID NO:870的核酸序列，任选地后接终止密码子(例如，TGA)；

(4)3'非翻译区(3'UTR)，其具有根据SEQ ID NO:839的核酸序列；以及

(5)polyA尾。

(1)5'帽，其具有以下结构：

(2)5'非翻译区(5'UTR)，其具有根据SEQ ID NO:838的核酸序列；

(3)蛋白质编码区，其具有根据SEQ ID NO:870的核酸序列；

(4)3'非翻译区(3'UTR)，其具有根据SEQ ID NO:839的核酸序列；以及

(5)polyA尾。

在备选的实施例中，嵌合MOMP VD多肽包含选自以下的三个MOMP VD4序列：(i)沙眼衣原体的血清变型D的MOMP VD4序列；(ii)沙眼衣原体的血清变型E的MOMP VD4序列；(iii)沙眼衣原体的血清变型F的MOMP VD4序列；或(iv)沙眼衣原体的血清变型G的MOMPVD4序列。在一些实施例中，嵌合MOMP VD多肽包含所有四个VD4结构域(i)-(iv)。在一些实施例中，嵌合MOMP VD多肽包含根据SEQ ID NO:506、841、842或843中任一者的序列或与其具有至少90％或至少95％同一性的序列。

除MOMP以外的衣原体属物种抗原

本发明人已经鉴定了可用于本发明的除MOMP以外的衣原体属物种抗原(“非MOMP抗原”)。非MOMP抗原或编码它们的核酸可以与MOMP抗原，包括本文所述的MOMP抗原(和编码它们的核酸)组合提供或使用。这些非MOMP抗原包含衣原体属物种多肽CT443、CT584、CT600和CT812。这些抗原是高度丰富的外膜蛋白，并且跨衣原体属物种(例如，跨沙眼衣原体的血清变型)是高度保守的。因此，使用这些抗原中的任何一种或多种可以提供交叉血清变型免疫应答，即，针对衣原体属物种的两种或更多种血清变型具有交叉反应性(例如，针对沙眼衣原体的两种或更多种血清变型具有交叉反应性)的免疫应答。本发明人已经证明，沙眼衣原体多肽CT443、CT584、CT600和CT812，当作为表达相关抗原的mRNA或以重组蛋白的形式递送时，引发了T细胞应答。本发明人还已表明，至少编码沙眼衣原体多肽CT443、CT584或CT600以及重组CT443、CT584或CT600蛋白的mRNA诱导了稳健的抗原特异性抗体应答。

CT443

本发明人已经证明，编码沙眼衣原体CT443多肽和重组沙眼衣原体CT443蛋白的两种mRNA都引发了产IFNγ的T细胞。此外，沙眼衣原体CT443多肽，当作为表达抗原的mRNA或以重组蛋白的形式递送时，引发了稳健的IgG应答。作为mRNA递送的沙眼衣原体CT443多肽已被证明引发针对沙眼衣原体原生小体(EB)的有效抗体(例如，IgG)应答。所引发的抗体针对沙眼衣原体的不同血清变型的EB具有交叉反应性。本发明人已经证明，本发明的沙眼衣原体CT443多肽是合适的疫苗候选物。

在一方面，本发明提供了一种核酸，该核酸包含编码衣原体属物种CT443多肽的核苷酸序列。在另一方面，本发明提供了一种多肽，该多肽包含衣原体属物种CT443多肽的氨基酸序列。用于在本发明中使用的衣原体属物种CT443多肽可在受试者中引发抗体(例如，IgG)应答(例如，抗原特异性抗体应答)。所引发的抗体可结合沙眼衣原体原生小体。本发明的衣原体属物种CT443多肽可引发针对沙眼衣原体的多于一种血清变型的抗体(IgG)应答，例如，交叉血清变型应答。因此，本发明的衣原体属物种CT443多肽可引发针对衣原体属物种的两种或更多种血清变型的B细胞(抗体)应答。应答可以是保护性抗体应答。

用于在本发明中使用的衣原体属物种CT443多肽可在受试者中引发T细胞应答(例如，抗原特异性T细胞应答)。在一些实施例中，用于在本发明中使用的衣原体属物种CT443多肽在受试者中引发产IFNγ的T细胞，诸如产IFNγ的CD4+ T细胞和/或产IFNγ的CD8+ T细胞。

CT443(也称为外膜蛋白B(omcB或OMPB))是一种丰富的外膜蛋白。已经提出，CT443是促进沙眼衣原体原生小体与宿主细胞之间的相互作用的粘附素。²⁴CT443，并且尤其是其C末端，被证明在人类感染期间具有免疫原性。²⁵,26另据报道，在小鼠模型中，CT443也是一种保护性抗原。27^,28

“衣原体属物种CT443多肽”包括不含原生信号肽序列的衣原体属物种全长原生CT443多肽的成熟形式，及其免疫原性变体。原生衣原体属物种CT443多肽的免疫原性变体能够在受试者中引发免疫应答(例如，抗原特异性免疫应答)，例如T细胞应答和/或抗体应答。原生衣原体属物种CT443多肽的免疫原性变体包括原生衣原体属物种CT443多肽的免疫原性片段。免疫原性CT443片段包括至少50个、至少75个、至少100个、至少125个、至少150个、至少175个、至少200个、至少225个、至少250个、至少275个、至少300个、至少325个、至少350个、至少375个、至少400个、至少425个、至少450个、至少475个或至少500个氨基酸长的原生衣原体属物种CT443多肽的片段。典型地，本发明的CT443多肽是全长衣原体属物种CT443多肽。在一些实施例中，免疫原性变体排除在受试者(例如，人)蛋白质组中发现的序列基序，例如长度为8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、13个或更多个、14个或更多个或15个或更多个(例如，8个或更多个)氨基酸的序列基序。被排除在外的主题蛋白质组序列基序典型地长度为8个或更多个氨基酸。如上所述，这有助于最大限度地减少不需要的交叉反应性。

示例性衣原体属物种CT443多肽序列包括沙眼衣原体CT443多肽序列(参见SEQ IDNO:507，其缺乏沙眼衣原体CT443多肽的原生信号肽序列)。

在一些实施例中，衣原体属物种CT443多肽包含SEQ ID NO:507-508中任一者(例如，SEQ ID NO:507)的序列或与其具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的序列。在一些实施例中，衣原体属物种CT443多肽包含与SEQ ID NO:507-508中任一者(例如，SEQ ID NO:507)具有至少90％同一性的序列。在一些实施例中，衣原体属物种CT443多肽包含与SEQ ID NO:507-508中任一者(例如，SEQ ID NO:507)具有至少95％同一性的序列。

在一些实施例中，包含编码衣原体属物种CT443多肽的核苷酸序列的核酸包含根据SEQ ID NO:707-710中任一者(例如，SEQ ID NO:707)的核苷酸序列或与其具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的序列。在一些实施例中，核酸包含与SEQ ID NO:707-710中任一者(例如，SEQID NO:707)具有至少85％同一性的核苷酸序列。在一些实施例中，核酸包含编码本文所述的分泌信号肽序列(例如，根据SEQ ID NO:187的分泌信号肽序列)的核苷酸序列。例如，核酸可以包含根据SEQ ID NO:369的序列。

(1)5'帽：

(2)5'非翻译区(5'UTR)，其具有根据SEQ ID NO:838的核酸序列；

(3)蛋白质编码区，其具有根据SEQ ID NO:369的核酸序列，任选地后接终止密码子(例如，TGA)；

(4)3'非翻译区(3'UTR)，其具有根据SEQ ID NO:839的核酸序列；以及

(5)polyA尾。

(1)5'帽，其具有以下结构：

(2)5'非翻译区(5'UTR)，其具有根据SEQ ID NO:838的核酸序列；

(3)蛋白质编码区，其具有根据SEQ ID NO:369的核酸序列；

(4)3'非翻译区(3'UTR)，其具有根据SEQ ID NO:839的核酸序列；以及

(5)polyA尾。

CT584

本发明人已经证明，编码沙眼衣原体CT584多肽和重组沙眼衣原体CT584蛋白的mRNA引发了产IFNγ的T细胞。此外，沙眼衣原体CT584多肽，当作为表达抗原的mRNA或以重组蛋白的形式递送时，被证明引发稳健的IgG应答。作为mRNA递送的沙眼衣原体CT584多肽已被证明引发针对沙眼衣原体原生小体(EB)的有效抗体(例如，IgG)应答。所引发的抗体针对沙眼衣原体的不同血清变型的EB具有交叉反应性。本发明人已经证明，本发明的沙眼衣原体CT584多肽是合适的疫苗候选物。

在一方面，本发明提供了一种核酸，该核酸包含编码衣原体属物种CT584多肽的核苷酸序列。在另一方面，本发明提供了一种多肽，该多肽包含衣原体属物种CT584多肽的氨基酸序列。用于在本发明中使用的衣原体属物种CT584多肽可在受试者中引发抗体(例如，IgG)应答(例如，抗原特异性抗体应答)。所引发的抗体可结合沙眼衣原体原生小体。本发明的衣原体属物种CT584多肽可引发针对沙眼衣原体的多于一种血清变型的抗体(IgG)应答，例如，交叉血清变型应答。因此，本发明的衣原体属物种CT584多肽可引发针对衣原体属物种的两种或更多种血清变型的B细胞(抗体)应答。应答可以是保护性抗体应答。

用于在本发明中使用的衣原体属物种CT584多肽可在受试者中引发T细胞应答(例如，抗原特异性T细胞应答)。在一些实施例中，用于在本发明中使用的衣原体属物种CT584多肽在受试者中引发产IFNγ的T细胞，诸如产IFNγ的CD4+ T细胞和/或产IFNγ的CD8+ T细胞。

CT584是III型分泌系统中一种推定的顶端蛋白(基于对沙眼衣原体的计算结构预测和同源性搜索研究)。²⁹它与来自其他衣原体门的蛋白质具有高序列同源性，但它与来自其他细菌属的蛋白质不具有同源性。³⁰在所有沙眼衣原体血清变型中，它也是普遍保守的。因此，CT584是一种用于生成跨血清变型的免疫应答的有前景的靶抗原。

“衣原体属物种CT584多肽”包括衣原体属物种的全长原生CT584多肽，及其免疫原性变体。衣原体属物种CT584多肽的免疫原性变体能够在受试者中引发免疫应答，例如T细胞应答和/或抗体应答(例如，抗原特异性T细胞和/或抗体应答)。CT584的免疫原性变体包括原生衣原体属物种CT584多肽的免疫原性片段。免疫原性CT584片段包括至少50个、至少75个、至少100个、至少125个、至少150个、至少175个氨基酸长的原生衣原体属物种CT584多肽的片段。典型地，本发明的CT584多肽是全长衣原体属物种CT584多肽。在实施例中，免疫原性变体排除在受试者(例如，人)蛋白质组中发现的序列基序，例如长度为8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、13个或更多个、14个或更多个或15个或更多个氨基酸的序列基序。被排除在外的主题蛋白质组(例如，人蛋白质组)序列基序典型地长度为8个或更多个氨基酸。如上所述，这有助于最大限度地减少不需要的交叉反应性。

示例性衣原体属物种CT584多肽序列包括沙眼衣原体CT584多肽序列(参见SEQ IDNO:509)。典型地，本发明的衣原体属物种CT584多肽在对应于SEQ ID NO:509的残基11的位置处包含单个氨基酸取代(例如，N到Q的取代)。

在一些实施例中，衣原体属物种CT584多肽包含SEQ ID NO:509-512中任一者(SEQID NO:510)的序列或与其具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的序列。在一些实施例中，衣原体属物种CT584多肽包含与SEQ ID NO:509-512中任一者(例如，SEQ ID NO:510)具有至少90％同一性的序列。在一些实施例中，衣原体属物种CT584多肽包含与SEQ ID NO:509-512中任一者(例如，SEQ ID NO:510)具有至少95％同一性的序列。

在一些实施例中，包含编码衣原体属物种CT584多肽的核苷酸序列的核酸包含根据SEQ ID NO:711-718中任一者(例如，SEQ ID NO:715)的核苷酸序列或与其具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的序列。在一些实施例中，核酸包含与SEQ ID NO:711-718中任一者(例如，SEQID NO:715)具有至少85％同一性的核苷酸序列。在一些实施例中，核酸包含编码本文所述的分泌信号肽序列(例如，根据SEQ ID NO:187的分泌信号肽序列)的核苷酸序列。例如，核酸可以包含根据SEQ ID NO:377的序列。

(1)5'帽：

(2)5'非翻译区(5'UTR)，其具有根据SEQ ID NO:838的核酸序列；

(3)蛋白质编码区，其具有根据SEQ ID NO:377的核酸序列，任选地后接终止密码子(例如，TGA)；

(4)3'非翻译区(3'UTR)，其具有根据SEQ ID NO:839的核酸序列；以及

(5)polyA尾。

(1)5'帽，其具有以下结构：

(2)5'非翻译区(5'UTR)，其具有根据SEQ ID NO:838的核酸序列；

(3)蛋白质编码区，其具有根据SEQ ID NO:377的核酸序列；

(4)3'非翻译区(3'UTR)，其具有根据SEQ ID NO:839的核酸序列；以及

(5)polyA尾。

CT600

本发明人已经证明，沙眼衣原体CT600多肽，当作为表达抗原的mRNA或以重组蛋白的形式递送时，引发了稳健的IgG应答。本发明人还已经表明，编码沙眼衣原体CT600多肽和重组沙眼衣原体CT600蛋白的mRNA能够引发产IFNγ的T细胞。

在一方面，本发明提供了一种核酸，该核酸包含编码衣原体属物种CT600多肽的核苷酸序列。在另一方面，本发明提供了一种多肽，该多肽包含衣原体属物种CT600多肽的氨基酸序列。用于在本发明中使用的衣原体属物种CT600多肽可在受试者中引发抗体(例如，IgG)应答(例如，抗原特异性抗体应答)。作为mRNA递送的沙眼衣原体CT600多肽已被证明引发针对沙眼衣原体原生小体(EB)的有效抗体(例如，IgG)应答。所引发的抗体针对沙眼衣原体的不同血清变型的EB具有交叉反应性。本发明人已经证明，本发明的沙眼衣原体C600多肽是合适的疫苗候选物。

用于在本发明中使用的衣原体属物种CT600多肽可在受试者中引发T细胞应答(例如，抗原特异性T细胞应答)。在一些实施例中，用于在本发明中使用的衣原体属物种CT600多肽在受试者中引发产IFNγ的T细胞，诸如产IFNγ的CD4+ T细胞和/或产IFNγ的CD8+ T细胞。

CT600是衣原体属物种肽聚糖相关脂蛋白(Pal)，其被认为在肽聚糖与外膜之间形成交联桥。

“衣原体属物种CT600多肽”包括不含原生信号肽序列的衣原体属物种全长原生CT600多肽的成熟形式。原生衣原体属物种CT600多肽的免疫原性变体能够在受试者中引发免疫应答(例如，抗原特异性免疫应答)，例如T细胞应答和/或抗体应答。原生衣原体属物种CT600多肽的免疫原性变体包括原生衣原体属物种CT600多肽的免疫原性片段。免疫原性CT600片段包括至少50个、至少75个、至少100个、至少125个或至少150个氨基酸长的原生衣原体属物种CT600多肽的片段。衣原体属物种CT600多肽的优选免疫原性片段包括缺乏衣原体属物种CT600多肽的N末端半胱氨酸富集区的片段(例如，缺乏紧接在衣原体属物种CT600多肽的原生信号肽之后的13个氨基酸的片段)。在实施例中，免疫原性片段排除在受试者(例如，人)蛋白质组中发现的序列基序，例如长度为8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、13个或更多个、14个或更多个或15个或更多个氨基酸的序列基序。被排除在外的主题蛋白质组(例如，人蛋白质组)序列基序典型地长度为8个或更多个氨基酸。如上所述，这有助于最大限度地减少不需要的交叉反应性。

示例性衣原体属物种CT600多肽序列包括SEQ ID NO:513中的沙眼衣原体CT600多肽序列，其缺乏沙眼衣原体CT600多肽的原生信号肽序列和紧接在该信号肽之后的13个氨基酸长的区域。

在一些实施例中，衣原体属物种CT600多肽包含SEQ ID NO:513或514的序列或与其具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的序列。在一些实施例中，衣原体属物种CT600多肽包含与SEQ ID NO:513-514中任一者具有至少90％同一性的序列。在一些实施例中，衣原体属物种CT600多肽包含与SEQ ID NO:513-514中任一者具有至少95％同一性的序列。

在一些实施例中，包含编码衣原体属物种CT600多肽的核苷酸序列的核酸包含根据SEQ ID NO:719-722中任一者的核苷酸序列或与其具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的序列。在一些实施例中，核酸包含与SEQ ID NO:719-722中任一者具有至少85％同一性的核苷酸序列。

CT812

本发明人已经证明，编码沙眼衣原体CT812多肽和重组沙眼衣原体CT812蛋白的mRNA诱导了产IFNγ的T细胞。

在一方面，本发明提供了一种核酸，该核酸包含编码衣原体属物种CT812多肽的核苷酸序列。在另一方面，本发明提供了一种多肽，该多肽包含衣原体属物种CT812多肽的氨基酸序列。用于在本发明中使用的衣原体属物种CT812多肽可在受试者中引发抗体(例如，IgG)应答(例如，抗原特异性抗体应答)。用于在本发明中使用的衣原体属物种CT812多肽可在受试者中引发T细胞应答(例如，抗原特异性T细胞应答)。在一些实施例中，用于在本发明中使用的衣原体属物种CT812多肽在受试者中引发产IFNγ的T细胞，诸如产IFNγ的CD4+ T细胞和/或产IFNγ的CD8+ T细胞。

CT812(也称为多态膜蛋白D(或PmpD))是一种锚定在衣原体属物种细菌的外膜中的自体转运蛋白。CT812是一种推荐的粘附素蛋白。成熟的CT812包含乘客结构域(passenger domain)和β桶结构域。³²用重组CT812蛋白进行免疫已被证明对小鼠中的沙眼衣原体血清变型D具有保护作用。³¹

如本文所用，“衣原体属物种CT812多肽”包括不含原生信号肽序列的衣原体属物种全长原生CT812多肽的成熟形式，及其免疫原性变体。衣原体属物种CT812多肽的免疫原性变体能够在受试者中引发免疫应答(例如，抗原特异性免疫应答)，例如T细胞应答和/或抗体应答。原生衣原体属物种CT812多肽的免疫原性变体包括原生衣原体属物种CT812多肽的免疫原性片段。免疫原性CT812片段包括至少50个、至少75个、至少100个、至少150个、至少200个、至少250个、至少300个、至少350个、至少400个、至少450个、至少500个、至少550个、至少600个、至少650个、至少700个、至少750个、至少800个、至少850个、至少900个、至少950个、至少1000个、至少1050个、至少1100个或至少1150个氨基酸长的原生衣原体属物种CT812多肽的片段。在一些实施例中，衣原体属物种CT812多肽的免疫原性片段包括SEQ IDNO:515中的氨基酸序列的片段。在一些实施例中，免疫原性片段可以是乘客结构域的片段，例如，包含SEQ ID NO:515的残基52-1003或SEQ ID NO:515的残基52-1179的片段。在一些实施例中，免疫原性片段包含根据SEQ ID NO:516或518的氨基酸序列。在一些实施例中，乘客结构域的片段可以是至少600个、至少650个、至少700个、至少750个、至少800个、至少850个、至少900个、至少950个、至少1000个、至少1050个、至少1100个或至少1150个氨基酸长。在实施例中，免疫原性片段排除在受试者(例如，人)蛋白质组中发现的序列基序，例如长度为8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、13个或更多个、14个或更多个或15个或更多个氨基酸的序列基序。被排除在外的主题蛋白质组(例如，人蛋白质组)序列基序典型地长度为8个或更多个氨基酸。如上所述，这有助于最大限度地减少不需要的交叉反应性。

示例性衣原体属物种CT812多肽序列包括SEQ ID NO:515中的沙眼衣原体CT812多肽序列，其缺乏沙眼衣原体CT812多肽的原生信号肽序列。衣原体属物种CT812多肽序列还包含SEQ ID NO 516和518。

在一些实施例中，衣原体属物种CT812多肽包含SEQ ID NO:515-535中任一者的序列或与其具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的序列。在一些实施例中，衣原体属物种CT812多肽包含与SEQ ID NO:515-535中任一者具有至少90％同一性的序列。在一些实施例中，衣原体属物种CT812多肽包含与SEQ ID NO:515-535中任一者具有至少95％同一性的序列。

在一些实施例中，包含编码衣原体属物种CT812多肽的核苷酸序列的核酸包含根据SEQ ID NO:723-762中任一者的核苷酸序列或与其具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的序列。在一些实施例中，核酸包含与SEQ ID NO:723-762中任一者具有至少85％同一性的核苷酸序列。

经修饰的MOMP多肽、嵌合MOMPVD多肽和非MOMP抗原多肽的变体

本文所述的经修饰的MOMP多肽、嵌合衣原体属物种MOMP VD多肽、衣原体属物种CT443多肽、衣原体属物种CT584多肽、衣原体属物种CT600多肽和/或衣原体属物种CT812多肽的序列可以包含一个或多个突变或修饰。

在一些实施例中，本文所述的经修饰的MOMP多肽、嵌合衣原体属物种MOMP VD多肽、衣原体属物种CT443多肽、衣原体属物种CT584多肽、衣原体属物种CT600多肽和/或衣原体属物种CT812多肽的序列可以包含一个或多个保守氨基酸取代。

“保守氨基酸取代”是氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基替代的取代。具有类似侧链的氨基酸残基家族已在本领域中定义，这些侧链包括基本侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β支化侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，如果多肽中的一个氨基酸被来自同一侧链家族的另一个氨基酸取代，则该取代被认为是保守的。在一些实施例中，氨基酸串可以用在侧链家族成员的顺序和/或组成上不同的结构上类似的串保守地替代。

半胱氨酸残基的突变

本文所述的多肽中的一个或多个半胱氨酸残基可通过单个氨基酸取代而发生突变，例如突变为丝氨酸残基。半胱氨酸残基参与二硫键形成，并且因此，半胱氨酸突变可限制多肽多聚化。

在一些实施例中，本文所述的经修饰的MOMP多肽在对应于原生衣原体属物种MOMP多肽的保守结构域序列中的半胱氨酸残基的一个或多个(例如，所有)位置处包含单个氨基酸取代。在一些实施例中，本文所述的嵌合MOMP VD多肽可以在对应于原生衣原体属物种MOMP多肽的保守结构域序列中的半胱氨酸残基的一个或多个(例如，所有)位置处包含单个氨基酸取代。原生沙眼衣原体血清变型E MOMP多肽的保守结构域在SEQ ID NO:2的位置C48、C51、C55、C124、C137、C204、C206、C229和/或C357处包含Cys残基。衣原体属物种的原生MOMP多肽的保守结构域可以在对应于针对沙眼衣原体的血清变型E的原生MOMP多肽所述的残基的位置处包含半胱氨酸残基。

在一些实施例中，本文所述的衣原体属物种CT443多肽在对应于原生衣原体属物种CT443多肽中的半胱氨酸残基的一个或多个(例如，所有)位置处包含单个氨基酸取代。在一些实施例中，衣原体属物种CT443多肽在对应于SEQ ID NO:507的C57、C100、C111、C156、C157、C164、C166、C175、C181、C191、C194、C252、C268、C285、C299、C341、C380、C383、C386、C389、C405、C410、C414和/或C424的位置处包含一个或多个单个氨基酸取代。在一些实施例中，衣原体属物种CT443多肽在对应于SEQ ID NO:507的C57、C100、C111、C156、C157、C164、C166、C175、C181、C191、C194、C252、C268、C285、C299、C341、C380、C386、C405、C410、C414和/或C424的位置处包含一个或多个单个氨基酸取代。然而，典型地，本文所述的衣原体属物种CT443多肽在对应于原生衣原体属物种CT443多肽中的半胱氨酸残基的任何位置处不包含单个氨基酸取代。

在一些实施例中，本文所述的衣原体属物种CT584多肽在对应于原生衣原体属物种CT584多肽中的半胱氨酸残基的一个或多个(例如，所有)位置处包含单个氨基酸取代。在一些实施例中，衣原体属物种CT584多肽在对应于SEQ ID NO:509的C44、C114和/或C138的位置处包含一个或多个单个氨基酸取代。

在一些实施例中，本文所述的衣原体属物种CT600多肽在对应于原生衣原体属物种CT600多肽中的半胱氨酸残基的一个或多个(例如，所有)位置处包含单个氨基酸取代。在一些实施例中，衣原体属物种CT600多肽在对应于SEQ ID NO:844的C1、C5、C10和/或C13的位置处包含一个或多个(例如，所有)单个氨基酸取代。

在一些实施例中，本文所述的衣原体属物种CT812多肽在对应于原生衣原体属物种CT812多肽中的半胱氨酸残基的一个或多个(例如，所有)位置处包含单个氨基酸取代。在一些实施例中，衣原体属物种CT812多肽在对应于SEQ ID NO:515的C1、C96、C160、C169、C179、C187、C233、C291、C300、C331、C348、C365、C401、C432、C560、C570、C571、C641、C665、C756、C838、C859、C963、C980和/或C1477的位置处包含一个或多个(例如，所有)单个氨基酸取代。在一些实施例中，衣原体属物种CT812多肽在对应于SEQ ID NO:515的C96、C169、C291、C300、C331、C348、C365、C401、C432、C560、C570、C571、C756、C838、C859、C963和/或C980的位置处包含一个或多个(例如，所有)单个氨基酸取代。

糖基化位点的突变

糖基化可发生在真核细胞中，但不发生在原核细胞中。如本文所用，“糖基化”是指向蛋白质添加糖单元。特别地，N-连接的糖基化是指将聚糖连接到蛋白质的天冬酰胺(Asn；N)残基的酰胺氮上。糖基化可发生在蛋白质中的任何天冬酰胺残基处，该天冬酰胺残基在蛋白质翻译后可被糖基化酶接近并识别，并且最常见在可接近的天冬酰胺处，这些天冬酰胺是NXS/T基序的一部分，其中天冬酰胺后的第二个氨基酸残基是丝氨酸(Ser；S)或苏氨酸(Thr；T)。O-连接的糖基化是指将聚糖连接到蛋白质中的丝氨酸(Ser)或苏氨酸(Thr)残基的氧原子上。连接过程产生糖基化蛋白。此聚糖可以是多糖。非人糖基化模式可使多肽在用于引发抗体时产生不期望的反应原性。另外，通常未糖基化的多肽(诸如本文所述的多肽)的糖基化可改变其免疫原性。例如，糖基化可掩盖蛋白质内的重要免疫原性表位。因此，为了减少或消除糖基化，可以对天冬酰胺残基或丝氨酸/苏氨酸残基进行修饰，例如，通过取代为另一个氨基酸。

在某些实施例中，本文所述的经修饰的MOMP多肽、嵌合衣原体属物种MOMP VD多肽、衣原体属物种CT443多肽、衣原体属物种CT584多肽、衣原体属物种CT600多肽和/或衣原体属物种CT812多肽中的一者或多者包含至少一个突变的糖基化位点，优选至少一个突变的N-连接的糖基化位点和/或至少一个O-连接的糖基化位点。在一些实施例中，本文所述的经修饰的MOMP多肽、嵌合衣原体属物种MOMP VD多肽、衣原体属物种CT443多肽、衣原体属物种CT584多肽、衣原体属物种CT600多肽和/或衣原体属物种CT812多肽中的一者或多者中的一个或多个N-糖基化位点被去除。去除N-糖基化位点可降低多肽的糖基化。去除糖基化位点可降低多肽的糖基化。在一些实施例中，本文所述的经修饰的MOMP多肽、嵌合衣原体属物种MOMP VD多肽、衣原体属物种CT443多肽、衣原体属物种CT584多肽、衣原体属物种CT600多肽和/或衣原体属物种CT812多肽中的一者或多者相对于相应的原生多肽具有降低的糖基化。去除N-糖基化位点可消除多肽的N-糖基化。去除O-糖基化位点可消除多肽的O-糖基化。

在某些实施例中，修饰包括取代NXS/T序列基序中的N、S和T氨基酸中的一者或多者，其中X对应于任何氨基酸。在一些实施例中，修饰包括取代蛋白质中的一个或多个丝氨酸(Ser)或苏氨酸(Thr)残基。在一些实施例中，N、S或T氨基酸被保守氨基酸取代所取代。典型地，N氨基酸可以被Q、S、K或A氨基酸取代。

在一些实施例中，本文所述的嵌合MOMP VD多肽在对应于原生衣原体属物种MOMP多肽中的N-糖基化位点的一个或多个(例如，所有)位置处包含单个氨基酸取代。原生衣原体属物种MOMP多肽中的N-糖基化位点可以在一个或多个MOMP VD结构域中。N-糖基化位点可存在于以下各项中：血清变型E的MOMP VD1(SEQ ID NO:9的位置9)、血清变型F的MOMPVD1(SEQ ID NO:13的位置11)、血清变型G的MOMP VD1(SEQ ID NO:17的位置11)、血清变型E的MOMP VD2(SEQ ID NO:10的位置6和/或17)、血清变型F的MOMP VD2(SEQ ID NO:14的位置4和/或21)、血清变型D的MOMP VD2(SEQ ID NO:6的位置17)；血清变型G的MOMP VD2(SEQ IDNO:18的位置4和/或21)、血清变型E的MOMP VD4(SEQ ID NO:12中的位置14)；血清变型G的MOMP VD4(SEQ ID NO:20中的位置14)；血清变型D的MOMP VD4(SEQ ID NO:8中的位置14)和/或血清变型F的MOMP VD4(SEQ ID NO:16中的位置14)，其中血清变型D-G属于沙眼衣原体。在一些实施例中，嵌合MOMP VD多肽包含(i)来自血清变型E的MOMP VD1序列和来自血清变型G的MOMP VD1序列；和(ii)来自血清变型D的MOMP VD2序列和来自血清变型G的MOMPVD2序列；和(iii)来自血清变型F的MOMP VD3序列；和(iv)来自血清变型D的MOMP VD4序列和来自血清变型F的MOMP VD4序列，其中血清变型D、E、F或G属于沙眼衣原体。典型地，嵌合MOMP VD多肽在对应于以下位置的每个氨基酸残基处包含单个氨基酸取代：SEQ ID NO:9的位置9(例如，N到A的取代)、SEQ ID NO:17的位置11(例如，T到A的取代)、SEQ ID NO:6的位置17(例如，S到A的取代)、SEQ ID NO:18的位置4和21(例如，分别为N到A和S到A的取代)、SEQ ID NO:8的位置14(例如，T到A的取代)和SEQ ID NO:16中的位置14(例如，T到A的取代)。

在一些实施例中，本文所述的衣原体属物种CT443多肽在对应于原生衣原体属物种CT443多肽中的N-糖基化位点的一个或多个(例如，所有)位置处包含单个氨基酸取代。在一些实施例中，衣原体属物种CT443多肽在对应于SEQ ID NO:507的残基18、29和435的位置处包含一个或多个(例如，所有)单个氨基酸取代。

在一些实施例中，本文所述的衣原体属物种CT584多肽在对应于原生衣原体属物种CT584多肽中的N-糖基化位点的一个或多个(例如，所有)位置处包含单个氨基酸取代。典型地，衣原体属物种CT584多肽在对应于SEQ ID NO:509的残基11的位置处包含单个氨基酸取代(例如，N到Q的取代)。

在一些实施例中，本文所述的衣原体属物种CT600多肽在对应于原生衣原体属物种CT600多肽中的N-糖基化位点的一个或多个(例如，所有)位置处包含单个氨基酸取代。在一些实施例中，衣原体属物种CT600多肽在对应于SEQ ID NO:513的残基48和65的位置处包含一个或两个单个氨基酸取代。

在一些实施例中，本文所述的衣原体属物种CT812多肽在对应于原生衣原体属物种CT812多肽中的N-糖基化位点的一个或多个(例如，所有)位置处包含单个氨基酸取代。

分泌信号肽序列

本文所述的经修饰的MOMP多肽、嵌合衣原体属物种MOMP VD多肽、衣原体属物种CT443多肽、衣原体属物种CT584多肽、衣原体属物种CT600多肽和/或衣原体属物种CT812多肽可以包含分泌信号肽序列。分泌信号肽可以在本文所述的衣原体属物种多肽的翻译后加工中被切割。因此，衣原体属物种多肽的成熟形式可能不包含分泌信号肽序列。然而，编码分泌信号肽序列的核苷酸序列可存在于编码本文所述的衣原体属物种多肽的本文所述的核酸中。

本文所述的经修饰的MOMP多肽、嵌合衣原体属物种MOMP VD多肽、衣原体属物种CT443多肽、衣原体属物种CT584多肽、衣原体属物种CT600多肽和/或衣原体属物种CT812多肽可以包含相应的原生衣原体属物种多肽的分泌信号肽序列。如果衣原体属物种多肽作为重组蛋白在原核细胞中表达，则这可能是有利的。

在一些实施例中，本文所述的经修饰的MOMP多肽、嵌合衣原体属物种MOMP VD多肽、衣原体属物种CT443多肽、衣原体属物种CT584多肽、衣原体属物种CT600多肽和/或衣原体属物种CT812多肽可以包含病毒或真核生物(例如，人)分泌信号肽(SS)序列。使用与本文所述的多肽连接的病毒或真核分泌信号肽序列可为免疫原性组合物提供许多优点。当从mRNA表达时，尤其是在真核细胞中，包含SS序列的本发明多肽相对于不含SS序列的多肽可具有增加的细胞外表达。增加的细胞外表达可以促进更高的免疫原性，进而提高疫苗功效。

病毒SS序列可以在公众可访问的数据库(例如，NCBI或UniProt数据库)中找到，这些数据库包括经注释的病毒多肽序列，并鉴定经实验验证的SS的起始和结束位置。

在某些实施例中，可通过使用SignalP算法来预测给定已知输入多肽序列的SS序列以及SS序列切割位点的位置。SignalP算法(并且更具体地，SignalP v6.0)在以下文献中更详细地描述：Armenteros等人(Nature Biotechnology.[自然生物技术]37:420-423.2019)、Teufel等人(Nature Biotechnology.[自然生物技术]40:1023-1025.2022)和https://services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-6.0/，它们中的每一者通过援引以其全文并入本文。基于累积排名得分来评估预测的强度，该累积排名得分考虑检出信号序列的规范特征的可能性(SS可能性得分)和在切割位点处切割的概率(切割概率得分)。在某些实施例中，病毒分泌信号肽具有使用SignalP 6.0确定的至少0.8、至少0.85、至少0.90或至少0.95的SignalP切割概率得分。在一些实施例中，病毒分泌信号肽具有使用SignalP6.0确定的至少0.8、至少0.85、至少0.90或至少0.95的SignalP信号肽可能性得分。

在某些实施例中，SS序列是病毒SS序列。在某些实施例中，病毒分泌信号肽序列源自能够感染人的病毒中的病毒序列。短语“分泌信号肽序列”之前的短语“流感”、“SARSCoV-2”、“水痘-带状疱疹病毒(VZV)”、“麻疹”、“风疹”、“狂犬病”、“埃博拉”和“天花”表示分泌信号肽源自对应于该名称的病毒。

在某些实施例中，病毒分泌信号肽源自选自下组的病毒序列，该组由以下各项组成：流感分泌信号肽序列、SARS CoV-2分泌信号肽序列、水痘-带状疱疹病毒(VZV)分泌信号肽序列、麻疹分泌信号肽序列、风疹分泌信号肽序列、腮腺炎分泌信号肽序列、埃博拉分泌信号肽序列、狂犬病分泌信号肽序列和天花分泌信号肽序列。这些特定的信号肽源自作为疫苗(减毒活疫苗、灭活疫苗或mRNA疫苗)施用于人的病毒中的病毒序列，这些疫苗显示出强大的安全性。

在某些实施例中，病毒分泌信号肽选自由以下组成的组：流感血凝素(HA)分泌信号肽序列、SARS CoV-2刺突分泌信号肽序列、VZV gB分泌信号肽序列、VZV gE分泌信号肽序列、VZV gI分泌信号肽序列、VZV gK分泌信号肽序列、麻疹F蛋白分泌信号肽序列、风疹E1蛋白分泌信号肽序列、风疹E2蛋白分泌信号肽序列、腮腺炎F蛋白分泌信号肽序列、埃博拉GP蛋白分泌信号肽序列、狂犬病病毒糖蛋白(狂犬病G)分泌信号肽序列和天花6kDa IC蛋白分泌信号肽序列。

在某些实施例中，病毒分泌信号肽包含来自甲型流感或乙型流感，优选来自甲型流感的HA分泌信号肽序列。

本披露的示例性病毒分泌信号肽氨基酸序列示于下表2中。本披露的源自甲型或乙型流感的示例性病毒分泌信号肽氨基酸序列示于下表2.1中。

表2-病毒分泌信号肽(SS)氨基酸序列

表2.1-甲型和乙型流感病毒特异性病毒分泌信号肽(SS)氨基酸序列

分泌信号肽序列可定位在本文所述的多肽的N末端或C末端(例如，在N末端)。

在某些实施例中，SS氨基酸序列由密码子优化的多核苷酸序列编码。

在某些实施例中，病毒分泌信号肽源自能够感染人的病毒中的病毒序列。

在某些实施例中，病毒分泌信号肽源自选自下组的病毒序列，该组由以下各项组成：流感分泌信号肽序列；和非流感分泌信号肽序列，其选自由以下组成的组：SARS CoV-2分泌信号肽序列、水痘-带状疱疹病毒(VZV)分泌信号肽序列、麻疹分泌信号肽序列、风疹分泌信号肽序列、腮腺炎分泌信号肽序列、埃博拉分泌信号肽序列、天花分泌信号肽序列和狂犬病分泌信号肽序列。

在某些实施例中，病毒分泌信号肽选自由以下组成的组：流感血凝素(HA)分泌信号肽序列、SARS CoV-2刺突分泌信号肽序列、VZV gB分泌信号肽序列、VZV gE分泌信号肽序列、VZV gI分泌信号肽序列、VZV gK分泌信号肽序列、麻疹F蛋白分泌信号肽序列、风疹E1蛋白分泌信号肽序列、风疹E2蛋白分泌信号肽序列、腮腺炎F蛋白分泌信号肽序列、埃博拉GP蛋白分泌信号肽序列、天花6kDaIC蛋白分泌信号肽序列和狂犬病G蛋白分泌信号肽序列，优选地其中病毒分泌信号肽包含来自甲型流感或乙型流感，更优选来自甲型流感的HA分泌信号肽序列。

在某些实施例中，HA分泌信号肽序列包含氨基酸序列MKX1X2LX3VX4LX5TFX6X7X8X9A(SEQ ID NO:856)，其中X1选自A和V；X2选自I和K；X3选自V和L；X4选自L和M；X5选自Y和C；X6选自T和A X7选自T和A；X8选自A和T；并且X9选自N和Y。

在某些实施例中，HA分泌信号肽序列包含选自MKAKLLVLLCTFTATYA(SEQ ID NO:187)、MKAILVVLLYTFTTANA(SEQ ID NO:846)、MKVKLLVLLCTFTATYA(SEQ ID NO:847)、MKAILVVLLYTFATANA(SEQ ID NO:188)和MKAILVVMLYTFTTANA(SEQ ID NO:848)的氨基酸序列。

在某些实施例中，HA分泌信号肽序列包含氨基酸序列MKX1IIALSX2ILCLVFX3(SEQID NO:857)，其中X1选自T和A；X2选自Y、N、C和H；并且X3选自T和A。

在某些实施例中，HA分泌信号肽序列包含选自MKTIIALSYILCLVFT(SEQ ID NO:849)、MKTIIALSYILCLVFA(SEQ ID NO:193)、MKTIIALSNILCLVFA(SEQ ID NO:850)、MKAIIALSNILCLVFA(SEQ ID NO:851)、MKTIIALSCILCLVFA(SEQ ID NO:852)和MKTIIALSHILCLVFA(SEQ ID NO:853)的氨基酸序列。

在某些实施例中，HA分泌信号肽序列包含氨基酸序列MKAIIVLLMVVTSX1A(SEQ IDNO:858)，其中X1选自S和N。

在某些实施例中，HA分泌信号肽序列包含氨基酸序列MX1AIIVLLMVVTSNA(SEQ IDNO:859)，其中X1选自K和E。

在某些实施例中，HA分泌信号肽序列包含选自MKAIIVLLMVVTSNA(SEQ ID NO:194)、MKAIIVLLMVVTSSA(SEQ ID NO:854)和MEAIIVLLMVVTSNA(SEQ ID NO:855)的氨基酸序列。

在某些实施例中，病毒分泌信号肽包含选自下组的氨基酸序列，该组由以下各项组成：MKAKLLVLLCTFTATYA(SEQ ID NO:187)；MKAILVVLLYTFATANA(SEQ ID NO:188)；MKTIIALSYILCLVFA(SEQ ID NO:193)；MKAIIVLLMVVTSNA(SEQ ID NO:194)；MFVFLVLLPLVS(SEQ ID NO:195)；MFLLTTKRTMFVFLVLLPLVS(SEQ ID NO:196)MSPCGYYSKWRNRDRPEYRRNLRFRRFFSSIHPNAAAGSGFNGPGVFITS VTGVWLCFLCIFSMFVTAVVS(SEQ ID NO:803)；MGTVNKPVVGVLMGFGIITGTLRITNPVRA(SEQ ID NO:804)；MFLIQCLISAVIFYIQVTNA(SEQ ID NO:805)；MQALGIKTEHFIIMCLLSGHA(SEQ ID NO:806)；MGLKVNVSAIFMAVLLTLQTPTG(SEQ ID NO:807)；MGAAAALTAVVLQGYNPPAYG(SEQ ID NO:808)；MGAPQAFLAGLLLAAVAVGTARA(SEQ ID NO:809)；MKVFLVTCLGFAVFSSSVC(SEQ ID NO:810)；MGVTGILQLPRDRFKRTSFFLWVIILFQRTFS(SEQID NO:811)；MRSLIIFLLFPSIIYS(SEQ ID NO:812)；和MVPQALLFVPLLVFPLCFG(SEQ ID NO:845)。

在某些实施例中，病毒分泌信号肽包含MKAKLLVLLCTFTATYA的氨基酸序列(SEQ IDNO:187)。

在某些实施例中，病毒分泌信号肽定位在原核抗原多肽的N末端。在某些实施例中，病毒分泌信号肽定位在本文披露的多肽的N末端。

在某些实施例中，病毒分泌信号肽定位在原核抗原多肽的C末端。在某些实施例中，病毒分泌信号肽定位在本文披露的多肽的C末端。

在某些实施例中，病毒分泌信号肽通过接头与原核抗原多肽连接。在某些实施例中，病毒分泌信号肽通过接头与本文披露的多肽连接。

异源跨膜结构域(TMB)

本文所述的嵌合衣原体属物种MOMP VD多肽、衣原体属物种CT443多肽、衣原体属物种CT584多肽、衣原体属物种CT600多肽和/或衣原体属物种CT812多肽可以包含异源跨膜结构域。包含TMB可能是有利的，因为这将使抗原定位于细胞膜。相对于没有TMB序列的抗原，这可以减少抗原在细胞内的定位并进一步促进更高的免疫原性。包含异源跨膜结构域的嵌合衣原体属物种MOMP VD多肽、衣原体属物种CT443多肽、衣原体属物种CT584多肽、衣原体属物种CT600多肽和/或衣原体属物种CT812多肽还可以包含分泌信号肽序列。典型地，本文所述的编码包含异源跨膜结构域的嵌合衣原体属物种MOMP VD多肽的核酸还包括编码分泌信号肽序列的核苷酸序列。典型地，本文所述的编码包含异源跨膜结构域的衣原体属物种CT443多肽的核酸还包括编码分泌信号肽序列的核苷酸序列。典型地，本文所述的编码包含异源跨膜结构域的衣原体属物种CT584多肽的核酸还包括编码分泌信号肽序列的核苷酸序列。典型地，本文所述的编码包含异源跨膜结构域的衣原体属物种CT600多肽的核酸还包括编码分泌信号肽序列的核苷酸序列。典型地，本文所述的编码包含异源跨膜结构域的衣原体属物种CT812多肽的核酸还包括编码分泌信号肽序列的核苷酸序列。

TMB可以来自本领域任何已知的TMB，包括但不限于来自真核跨膜蛋白(例如，哺乳动物跨膜蛋白，诸如人跨膜蛋白)的TMB、来自原核跨膜蛋白的TMB和来自病毒跨膜蛋白的TMB。TMB可以通过计算机预测算法进一步鉴定，例如，在Krogh等人(J Mol Biol.[分子生物学杂志]305(3):567-580.2001)和https://services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/中所述的TMHMM预测方法，它们中的每一者通过援引以其全文并入本文。在Albers等人中更详细地描述了TMB的一些特征(Chapter 2–cell membrane structuresand functions.[第2章–细胞膜结构和功能]Basic Neurochemistry eighth edition.[基础神经化学第八版]第26-39页.2012)，其通过援引并入本文。TMB典型地(但不排他地)主要包含非极性(疏水性)氨基酸残基，并且可以穿过脂质双层一次或几次。技术人员熟知确定氨基酸疏水性的方法。参见Simm等人(2016),Biol Res.[生物学研究],49(1):31；Wimlet和White(1996),Nat Struct Biol.[自然结构生物学],3(10):842-848；https://blanco.biomol.uci.edu/hydrophobicity_scales.html；和https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/docs/UsersGuide/midas/hydrophob.html。

TMB通常包含α螺旋，每个螺旋含有18-21个氨基酸，其足以跨越脂质双层。因此，在某些实施例中，跨膜结构域包含一个或多个α螺旋。在一些实施例中，TMB：(a)包含15至50个氨基酸残基、优选15至30个氨基酸残基、更优选18至25个氨基酸残基，或由这些氨基酸残基组成；以及/或者(b)包含至少50％、至少55％或至少60％的疏水性氨基酸残基，这些疏水性氨基酸残基优选地选自由以下组成的组：丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸；以及/或者(c)包含至少一个α螺旋。

在某些实施例中，跨膜结构域源自整合膜蛋白，如下文和Albers等进一步定义，“整合膜蛋白”(也称为内在膜蛋白)是永久附着于脂质膜的膜蛋白。在某些实施例中，跨膜结构域源自整合多表位蛋白。整合多表位蛋白是跨越整个膜的蛋白质。在某些实施例中，跨膜结构域源自单程(反式)膜蛋白，更特别地，例如I型或II型的双表位膜蛋白。单程膜蛋白仅穿过膜一次(即，双表位膜蛋白)，而多程膜蛋白几次穿进穿出。单程跨膜蛋白可分类为I型，其被定位成使得其羧基末端朝向胞质溶胶，或II型，其氨基末端朝向胞质溶胶。在某些实施例中，跨膜结构域源自整合单表位蛋白。整合单表位蛋白是仅从一侧与膜缔合并且不完全跨越脂质双层的蛋白质。

在某些实施例中，异源跨膜结构域源自非人序列。

在某些实施例中，异源跨膜结构域源自病毒序列。短语“跨膜结构域序列”之前的短语“流感”、“SARS CoV-2”、“水痘-带状疱疹病毒(VZV)”、“麻疹”、“风疹”、“狂犬病”、“埃博拉”和“天花”表示跨膜结构域序列源自对应于该名称的病毒。

在某些实施例中，异源跨膜结构域源自选自下组的病毒跨膜结构域序列，该组由以下各项组成：流感跨膜结构域序列、SARS CoV-2跨膜结构域序列、水痘-带状疱疹病毒(VZV)跨膜结构域序列、麻疹跨膜结构域序列、风疹跨膜结构域序列、腮腺炎跨膜结构域序列、狂犬病跨膜结构域序列和埃博拉跨膜结构域序列。这些特定的跨膜结构域源自作为疫苗(减毒活疫苗、灭活疫苗或mRNA疫苗)施用于人的病毒中的病毒序列，这些疫苗显示出强大的安全性。

在某些实施例中，异源跨膜结构域选自由以下组成的组：流感血凝素(HA)跨膜结构域序列、SARS CoV-2刺突跨膜结构域序列、VZV gB跨膜结构域序列、VZV gE跨膜结构域序列、VZV gI跨膜结构域序列、VZV gK跨膜结构域序列、麻疹F蛋白跨膜结构域序列、风疹E1蛋白跨膜结构域序列、风疹E2蛋白跨膜结构域序列、腮腺炎F蛋白跨膜结构域序列、狂犬病病毒糖蛋白(狂犬病G)跨膜结构域序列和埃博拉GP蛋白跨膜结构域序列。

在某些实施例中，异源跨膜结构域包含来自甲型流感或乙型流感、优选来自甲型流感的HA跨膜结构域序列。

本披露的示例性病毒跨膜结构域氨基酸序列示于下表3中。

表3-病毒跨膜结构域(TMB)信号氨基酸序列

在某些实施例中，异源TMB序列定位在本文所述的多肽的N末端或C末端(例如，C末端)。

在某些实施例中，TMB氨基酸序列由密码子优化的多核苷酸序列编码。

在一些实施例中，嵌合MOMP VD多肽包含如本文所述的异源跨膜结构域。在一些实施例中，异源跨膜结构域不包含SEQ ID NO:189的序列。在一些实施例中，异源跨膜结构域包含SEQ ID NO:190的序列。典型地，嵌合MOMP VD多肽不包含异源跨膜结构域。

在备选的实施例中，本文所述的嵌合MOMP VD多肽、衣原体属物种CT443多肽、衣原体属物种CT584多肽、衣原体属物种CT600多肽和/或衣原体属物种CT812多肽中的一者或多者不包含异源跨膜结构域。此类多肽可以包含分泌信号肽序列。在进一步的实施例中，本发明的多肽是分泌型的。在一些实施例中，本文所述的嵌合MOMP VD多肽是分泌型多肽。在一些实施例中，本文所述的衣原体属物种CT443多肽是分泌型多肽。在一些实施例中，本文所述的衣原体属物种CT584多肽是分泌型多肽。在一些实施例中，本文所述的衣原体属物种CT600多肽是分泌型多肽。在一些实施例中，本文所述的衣原体属物种CT812多肽是分泌型多肽。在优选的实施例中，本文所述的经修饰的MOMP多肽是分泌型多肽。本文所述的分泌型多肽包含分泌信号肽序列。

在某些实施例中，TMB：(a)包含15至50个氨基酸残基、优选15至30个氨基酸残基、更优选18至25个氨基酸残基，或由这些氨基酸残基组成；以及/或者(b)包含至少50％的疏水性氨基酸残基，这些疏水性氨基酸残基优选地选自由以下组成的组：丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸；以及/或者(c)包含至少一个α螺旋。

在某些实施例中，TMB源自整合膜蛋白，优选来自单程膜蛋白，更优选来自双表位膜蛋白，甚至更优选来自I型双表位膜蛋白。

在某些实施例中，TMB源自非人序列。

在某些实施例中，TMB源自病毒序列。

在某些实施例中，TMB源自选自下组的病毒跨膜结构域序列，该组由以下各项组成：流感跨膜结构域序列；和非流感跨膜结构域序列，其选自由以下组成的组：SARS CoV-2跨膜结构域序列、水痘-带状疱疹病毒(VZV)跨膜结构域序列、麻疹跨膜结构域序列、风疹跨膜结构域序列、腮腺炎跨膜结构域序列、埃博拉跨膜结构域序列和狂犬病跨膜结构域序列。

在某些实施例中，TMB选自由以下组成的组：流感血凝素(HA)跨膜结构域序列、SARS CoV-2刺突跨膜结构域序列、VZV gB跨膜结构域序列、VZV gE跨膜结构域序列、VZV gI跨膜结构域序列、VZV gK跨膜结构域序列、麻疹F蛋白跨膜结构域序列、风疹E1蛋白跨膜结构域序列、风疹E2蛋白跨膜结构域序列、腮腺炎F蛋白跨膜结构域序列、埃博拉GP蛋白跨膜结构域序列和狂犬病G蛋白跨膜结构域序列，优选地其中TMB包含来自甲型流感或乙型流感，更优选来自甲型流感的HA跨膜结构域序列。

在某些实施例中，TMB包含选自下组的氨基酸序列，该组由以下各项组成：ILAIYSTVASSLVLLVSLGAISF(SEQ ID NO:813)；ILAIYSTVASSLVLVVSLGAISF(SEQ ID NO:814)；ILWISFAISCFLLCVVLLGFI(SEQ ID NO:815)；STAASSLAVTLMLAIFIVYMV(SEQ ID NO:816)；WYIWLGFIAGLIAIVMVTIML(SEQ ID NO:817)；FGALAVGLLVLAGLVAAFFAY(SEQ ID NO:818)；AAWTGGLAAVVLLCLVIFLIC(SEQ ID NO:819)；IIIPIVASVMILTAMVIVIVI(SEQ ID NO:820)；YFWCVQLKMIFFAWFVYGMYL(SEQ ID NO:821)；IVYILIAVCLGGLIGIPALIC(SEQ ID NO:822)；LDHAFAAFVLLVPWVLIFMVC(SEQ ID NO:823)；WWQLTLGAICALLLAGLLACC(SEQ ID NO:824)；IVAALVLSILSIIISLLFCCW(SEQ ID NO:825)；WIPAGIGVTGVIIAVIALFCI(SEQ ID NO:826)；和VLLSAGALTALMLIIFLMTCW(SEQ ID NO:860)。

在某些实施例中，TMB包含ILAIYSTVASSLVLLVSLGAISF的氨基酸序列(SEQ ID NO:813)。

在某些实施例中，TMB通过接头与本文所述的多肽连接。

在某些实施例中，TMB定位在本文所述的多肽的N末端。

在某些实施例中，TMB定位在本文所述的多肽的C末端。

接头

在本披露的某些实施例中，分泌信号肽(SS)序列或跨膜结构域(TMB)直接融合至本文所述的多肽(即，不存在将SS序列或TMB连接至本文所述的多肽的接头，诸如氨基酸接头)。

在其他实施例中，本披露的SS序列和TMB任选地通过接头与本文所述的多肽连接。在某些实施例中，接头是氨基酸接头。在某些实施例中，氨基酸接头的长度为1-10个氨基酸(例如，氨基酸接头的长度为1个氨基酸、2个氨基酸、3个氨基酸、4个氨基酸、5个氨基酸、6个氨基酸、7个氨基酸、8个氨基酸、9个氨基酸或10个氨基酸)。

接头的说明性实例包括甘氨酸聚合物(Gly)n，其中n为至少一、二、三、四、五、六、七或八的整数；甘氨酸-丝氨酸聚合物(GlySer)n，其中n为至少一、二、三、四、五、六、七或八的整数；甘氨酸-丙氨酸聚合物；丙氨酸-丝氨酸聚合物；以及本领域已知的其他柔性接头。

甘氨酸和甘氨酸-丝氨酸聚合物相对来说是非结构化和柔性的，并且因此可能能够充当SS序列和/或TMB与本文所述的多肽之间的中性系链。在某些实施例中，接头是SGS或GSG。

其他示例性接头包括但不限于以下氨基酸序列：GGG；DGGGS(SEQ ID NO:827)；TGEKP(SEQ ID NO:828)(Liu等人Proc.Natl.Acad.Sci.[美国国家科学院院刊]94:5525-5530.1997)；GGRR(SEQ ID NO:829)；(GGGGS)n(SEQ ID NO:830)，其中n＝1、2、3、4或5(Kim等人Proc.Natl.Acad.Sci.[美国国家科学院院刊]93:1156-1160.1996)；EGKSSGSGSESKVD(SEQ ID NO:831)(Chaudhary等人Proc.Natl.Acad.Sci.[美国国家科学院院刊]87:1066-1070.1990)；KESGSVSSEQLAQFRSLD(SEQ ID NO:832)(Bird等人Science.[科学]242:423-426.1988)、GGRRGGGS(SEQ ID NO:833)；LRQRDGERP(SEQ ID NO:834)；LRQKDGGGSERP(SEQID NO:835)；和GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:836)(Cooper等人Blood.[血液]101(4):1637-1644.2003)。优选的接头较短，例如，由3个、4个或5个氨基酸组成。

接头的额外实例提供于Chen等人中(Adv Drug Deliv Rev.[先进药物递送综述]65(10):1357–1369.2013)，其通过援引并入本文。

组合物

本发明提供了一种包含一种或多种本披露的核酸的组合物。本发明还提供了一种包含一种或多种本披露的多肽的组合物。本发明的组合物可以是药物组合物，例如包含药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂。在某些实施例中，本发明的组合物是免疫原性组合物。“免疫原性组合物”意指包含核酸或蛋白质的组合物，当施用于受试者时，其引发免疫应答，例如抗原特异性免疫应答。应答可以是T细胞免疫应答或抗体应答。本发明的组合物可以是疫苗组合物。免疫原性组合物(例如，疫苗组合物)可引发针对衣原体属物种感染的保护性免疫(例如，T细胞和/或B细胞(即抗体)应答)。T细胞应答可包括CD4+ T cell细胞应答和/或CD8+ T细胞应答，诸如产IFNγ的CD4+ T细胞和/或产IFNγ的CD8+ T细胞。在一些实施例中，T细胞应答包括CD4+ T细胞，诸如产IFNγ的CD4+ T细胞。

如本文所用，“保护性免疫”或“保护性免疫应答”是指受试者表现出的针对感染性病原体(例如，衣原体性病原体)的免疫或引发针对该感染性病原体的免疫应答，其预防或改善感染或减少感染的至少一种症状。具体地，通过消除或减少衣原体感染的一种或多种症状的存在和/或扩增衣原体应答性记忆T细胞群，可以明显看出，施用本发明的组合物诱导保护性免疫或保护性免疫应答。如本文所用，“免疫应答”是指体液免疫应答和细胞介导的免疫应答。优选地，本发明提供的保护性免疫的特征在于针对病原体的保护性免疫记忆(例如，保护性记忆T细胞应答)。保护性免疫的特征可在于有效的病原体应答性(例如，衣原体应答性)记忆T细胞群。在优选的实施例中，用本文所述的本发明的组合物进行治疗提供了针对衣原体性病原体再感染的保护性免疫。保护性免疫可以是灭菌免疫(即完全保护性免疫)，由此受保护的受试者可以引发完全消除感染的免疫应答。本文所述的衣原体性抗原(例如，本发明的嵌合MOMP VD多肽和本发明的衣原体属物种CT443和CT584多肽)可结合衣原体属物种(例如，沙眼衣原体)原生小体，例如，两种或更多种血清变型的原生小体。

核酸组合物

在一方面，本发明提供了一种包含如本文所述的核酸的组合物，该核酸包含编码如本文所述的经修饰的MOMP多肽的核苷酸序列。

在另一方面，本发明提供了一种包含如本文所述的核酸的组合物，该核酸包含编码如本文所述的嵌合MOMP VD多肽的核苷酸序列。

在另一方面，本发明提供了一种包含如本文所述的核酸的组合物，该核酸包含编码如本文所述的衣原体属物种CT443多肽的核苷酸序列。

在另一方面，本发明提供了一种包含如本文所述的核酸的组合物，该核酸包含编码如本文所述的衣原体属物种CT584多肽的核苷酸序列。

在另一方面，本发明提供了一种包含如本文所述的核酸的组合物，该核酸包含编码如本文所述的衣原体属物种CT600多肽的核苷酸序列。

在另一方面，本发明提供了一种包含如本文所述的核酸的组合物，该核酸包含编码如本文所述的衣原体属物种CT812多肽的核苷酸序列。

在进一步的方面，本发明提供一种组合物，该组合物包含以下中的一者、两者、三者或四者：(a)包含编码如本文所述的衣原体属物种CT443多肽的核苷酸序列的如本文所述的核酸；(b)包含编码如本文所述的衣原体属物种CT584多肽的核苷酸序列的如本文所述的核酸；(c)包含编码如本文所述的衣原体属物种CT600多肽的核苷酸序列的如本文所述的核酸；以及/或者(d)包含编码如本文所述的衣原体属物种CT812多肽的核苷酸序列的如本文所述的核酸。

本发明的组合物可包括如本文所述的核酸的如本文所述的组合(例如，它们可配制在同一组合物中)。如本文所述的核酸的如本文所述的组合可以替代性地在两种或更多种单独的组合物中(例如，作为用于同时、单独或依次施用的组合物的组合(例如，在如本文所述的治疗用途中))。

在一些实施例中，组合物可以包含(a)包含编码如本文所述的经修饰的MOMP多肽的核苷酸序列的如本文所述的核酸；(b)包含编码如本文所述的嵌合MOMP VD多肽的核苷酸序列的如本文所述的核酸；和(c)包含编码如本文所述的衣原体属物种CT443多肽的核苷酸序列的如本文所述的核酸。

在一些实施例中，组合物可以包含(a)包含编码如本文所述的经修饰的MOMP多肽的核苷酸序列的如本文所述的核酸；(b)包含编码如本文所述的嵌合MOMP VD多肽的核苷酸序列的如本文所述的核酸；和(c)包含编码如本文所述的衣原体属物种CT584多肽的核苷酸序列的如本文所述的核酸。

典型地，组合物可以包含(a)包含编码如本文所述的经修饰的MOMP多肽的核苷酸序列的如本文所述的核酸；(b)包含编码如本文所述的嵌合MOMP VD多肽的核苷酸序列的如本文所述的核酸；(c)包含编码如本文所述的衣原体属物种CT443多肽的核苷酸序列的如本文所述的核酸；和(d)包含编码如本文所述的衣原体属物种CT584多肽的核苷酸序列的如本文所述的核酸。

包含本披露的一种或多种核酸的本披露的组合物还可包含一种或多种额外的组分，诸如小分子免疫增强剂(例如，TLR激动剂)。本披露的组合物还可包含用于本文所述的核酸(例如，RNA)的递送系统，诸如脂质体、水包油乳液或微粒。在一些实施例中，该组合物包含脂质纳米颗粒(LNP)。在某些实施例中，该组合物包含包封在LNP内的本发明的核酸分子。

多肽组合物

在一方面，本发明提供了一种包含如本文所述的经修饰的MOMP多肽的组合物。

在另一方面，本发明提供了一种包含如本文所述的嵌合MOMP VD多肽的组合物。

在另一方面，本发明提供了一种包含如本文所述的衣原体属物种CT443多肽的组合物。

在另一方面，本发明提供了一种包含如本文所述的衣原体属物种CT584多肽的组合物。

在另一方面，本发明提供了一种包含如本文所述的衣原体属物种CT600多肽的组合物。

在另一方面，本发明提供了一种包含如本文所述的衣原体属物种CT812多肽的组合物。

在进一步的方面，本发明提供一种组合物，该组合物包含以下中的一者、两者、三者或四者：(a)包含如本文所述的衣原体属物种CT443多肽的氨基酸序列的多肽；(b)包含如本文所述的衣原体属物种CT584多肽的氨基酸序列的多肽；(c)包含如本文所述的衣原体属物种CT600多肽的氨基酸序列的多肽；以及/或者(d)包含如本文所述的衣原体属物种CT812多肽的氨基酸序列的多肽。

本发明的组合物可包括如本文所述的多肽的如本文所述的组合(例如，它们可配制在同一组合物中)。如本文所述的多肽的如本文所述的组合可以替代性地在两种或更多种单独的组合物中(例如，作为用于同时、单独或依次施用的组合物的组合(例如，在如本文所述的治疗用途中))。

在一些实施例中，该组合物可包含(i)如本文所述的经修饰的MOMP多肽；(ii)如本文所述的嵌合MOMP VD多肽；和(iii)如本文所述的衣原体属物种CT443多肽。

在一些实施例中，该组合物可包含(i)如本文所述的经修饰的MOMP多肽；(ii)如本文所述的嵌合MOMP VD多肽；和(iii)如本文所述的衣原体属物种CT584多肽。

典型地，该组合物可包含(i)如本文所述的经修饰的MOMP多肽；(ii)如本文所述的嵌合MOMP VD多肽；(iii)如本文所述的衣原体属物种CT443多肽；和(iv)如本文所述的衣原体属物种CT584多肽。

包含一种或多种本披露的多肽的本披露的组合物可包含佐剂。如本文所用，“佐剂”是指增强对抗原的免疫应答的物质或媒剂。佐剂可以包括但不限于其上吸附有抗原的矿物质(例如，明矾、氢氧化铝或磷酸盐)的悬浮液；抗原溶液乳化在矿物油中或水中的油包水或水包油乳剂(例如，弗氏不完全佐剂)。有时包括杀死的分枝杆菌(例如，弗氏完全佐剂)以进一步增强抗原性。佐剂可包括基于角鲨烯的水包油乳液佐剂(例如AF03，例如，如WO2007006939和美国专利号8,703,095中所述；AS03，例如，如WO 1995017209、WO1995017210和美国专利号6,623,739、7,029,678和7,510,698中所述；和MF59，例如，如WO1990014837和美国专利号6,299,884和6,451,325中所述)。免疫刺激寡核苷酸(例如，CpG基序)也可以用作佐剂(例如，参见美国专利号6,194,388、6,207,646、6,214,806、6,218,371、6,239,116、6,339,068、6,406,705和6,429,199)。佐剂还可以包括生物分子，诸如Toll样受体(TLR)激动剂(例如，AS01，例如，如WO 2007068907和美国专利号10,039,823和10,143,745中所述；SPA14，例如，如WO 2022090359中所述；和LEQ，例如，WO 2023056089中所述)和共刺激分子。在一些实施例中，佐剂是AF03(水包油角鲨烯基乳液佐剂)。在一些实施例中，佐剂是可以引发Th1应答的佐剂。

核酸组合

本发明提供了包含两种或更多种本发明的核酸的组合。

因此，在一方面，本发明提供了一种组合，该组合包含：包含编码如本文所述的经修饰的MOMP多肽的核苷酸序列的如本文所述的核酸，以及：

(i)包含编码如本文所述的嵌合MOMP VD多肽的核苷酸序列的如本文所述的核酸；以及/或者

(ii)以下中的一者或多者：

(a)包含编码如本文所述的衣原体属物种CT443多肽的核苷酸序列的如本文所述的核酸；

(b)包含编码如本文所述的衣原体属物种CT584多肽的核苷酸序列的如本文所述的核酸；

(c)包含编码如本文所述的衣原体属物种CT600多肽的核苷酸序列的如本文所述的核酸；以及/或者

(d)包含编码如本文所述的衣原体属物种CT812多肽的核苷酸序列的如本文所述的核酸。

在一些实施例中，该组合包含(a)的核酸、(b)的核酸、(c)的核酸、(d)的核酸、(a)和(b)的核酸、(a)和(c)的核酸、(a)和(d)的核酸、(b)和(c)的核酸、(b)和(d)的核酸、(c)和(d)的核酸、(a)、(b)和(c)的核酸、(a)、(c)和(d)的核酸、(a)、(b)和(d)的核酸、(b)、(c)和(d)的核酸或(a)、(b)、(c)和(d)的核酸。在一些实施例中，该组合包含(a)的核酸。在一些实施例中，该组合包含(b)的核酸。典型地，该组合包含(a)的核酸和(b)的核酸。

(a)-(d)中任一者的核酸可位于同一核酸分子上。替代性地，(a)-(d)的核酸可以是分离的核酸分子。

因此，在一些实施例中，本发明的组合包含：包含编码如本文所述的经修饰的MOMP多肽的核苷酸序列的如本文所述的核酸；和包含编码如本文所述的嵌合MOMP VD多肽的核苷酸序列的如本文所述的核酸。

在一些实施例中，本发明的组合包含：包含编码如本文所述的经修饰的MOMP多肽的核苷酸序列的如本文所述的核酸，以及以下中的一者、两者、三者或四者：(a)包含编码如本文所述的衣原体属物种CT443多肽的核苷酸序列的如本文所述的核酸；(b)包含编码如本文所述的衣原体属物种CT584多肽的核苷酸序列的如本文所述的核酸；(c)包含编码如本文所述的衣原体属物种CT600多肽的核苷酸序列的如本文所述的核酸；以及/或者(d)包含编码如本文所述的衣原体属物种CT812多肽的核苷酸序列的如本文所述的核酸。该组合可包含上述(a)-(d)非MOMP抗原组合中的任一者。在一些实施例中，该组合包含(a)的核酸。在一些实施例中，该组合包含(b)的核酸。典型地，该组合包含(a)的核酸和(b)的核酸。

在一些实施例中，本发明的组合包含(i)包含编码如本文所述的经修饰的MOMP多肽的核苷酸序列的如本文所述的核酸；(ii)包含编码如本文所述的嵌合MOMP VD多肽的核苷酸序列的如本文所述的核酸；以及(iii)(a)-(d)中的核酸中的一者、两者、三者或四者。该组合可包含上述(a)-(d)非MOMP抗原组合中的任一者。在一些实施例中，该组合包含(a)的核酸。在一些实施例中，该组合包含(b)的核酸。典型地，该组合包含(a)的核酸和(b)的核酸。

在进一步的方面，本发明提供了一种组合，该组合包含：包含编码如本文所述的嵌合MOMP VD多肽的核苷酸序列的如本文所述的核酸，以及(a)-(d)中的核酸中的一者、两者、三者或四者。该组合可包含上述(a)-(d)非MOMP抗原组合中的任一者。在一些实施例中，该组合包含(a)的核酸。在一些实施例中，该组合包含(b)的核酸。典型地，该组合包含(a)的核酸和(b)的核酸。在一些实施例中，该组合进一步包含：包含编码如本文所述的经修饰的MOMP多肽的核苷酸序列的如本文所述的核酸。

在另一方面，本发明提供了一种组合，该组合包含：包含编码如本文所述的衣原体属物种CT443多肽的核苷酸序列的如本文所述的核酸，以及如(b)-(d)中定义的核酸中的一者、两者或三者。该组合可包含上述(b)、(c)和/或(d)的非MOMP抗原组合中的任一者。典型地，该组合包含(b)的核酸。在一些实施例中，该组合进一步包含含有编码原生衣原体属物种MOMP多肽或其变体的核苷酸序列的核酸。

在另一方面，本发明提供了一种组合，该组合包含：包含编码如本文所述的衣原体属物种CT584多肽的核苷酸序列的如本文所述的核酸，以及如(a)、(c)或(d)中定义的核酸中的一者、两者或三者。该组合可包含上述(a)、(c)和/或(d)的非MOMP抗原组合中的任一者。典型地，该组合包含(a)的核酸。在一些实施例中，该组合进一步包含含有编码原生衣原体属物种MOMP多肽或其变体的核苷酸序列的核酸。

在另一方面，本发明提供了一种组合，该组合包含：包含编码如本文所述的衣原体属物种CT600多肽的核苷酸序列的如本文所述的核酸，以及如(a)、(b)或(d)中定义的核酸中的一者、两者或三者。该组合可包含上述(a)、(b)和/或(d)的非MOMP抗原组合中的任一者。在一些实施例中，该组合进一步包含含有编码原生衣原体属物种MOMP多肽或其变体的核苷酸序列的核酸。

在另一方面，本发明提供了一种组合，该组合包含：包含编码如本文所述的衣原体属物种CT812多肽的核苷酸序列的如本文所述的核酸，以及如(a)-(c)中定义的核酸中的一者、两者或三者。该组合可包含上述(a)、(b)和/或(c)的非MOMP抗原组合中的任一者。在一些实施例中，该组合进一步包含含有编码原生衣原体属物种MOMP多肽或其变体的核苷酸序列的核酸。

因此，本发明的组合可以包含含有编码原生衣原体属物种MOMP多肽或其变体的核苷酸序列的核酸，以及(a)-(d)中的核酸中的一者、两者、三者或四者。原生衣原体属物种MOMP多肽的变体包括包含一个或多个保守氨基酸取代的MOMP多肽、在对应于原生衣原体属物种MOMP多肽中的半胱氨酸残基的一个或多个(例如，所有)位置处包含单个氨基酸取代的MOMP多肽和在对应于原生衣原体属物种MOMP中的糖基化位点，优选N-糖基化位点的一个或多个(例如，所有)位置处包含单个氨基酸取代的MOMP多肽。原生衣原体属物种MOMP多肽的变体包括包含分泌信号肽序列的MOMP多肽和包含异源跨膜结构域的MOMP多肽。在一些实施例中，原生衣原体属物种MOMP多肽包含分泌信号肽序列。在一些实施例中，原生衣原体属物种MOMP多肽包含分泌信号肽序列和异源跨膜结构域。

如本文所披露的核酸的组合涵盖处于同一组合物中的所有个别核酸和处于一种或多种单独组合物中的所有个别核酸。在一些实施例中，本文所述组合中的所有个别核酸均在同一组合物中。在一些实施例中，本文所述组合中的每种核酸是单独的组合物。在一些实施例中，本文所述组合中的两种或更多种核酸在两种或更多种组合物中。在本发明的组合的一些实施例中，上述(a)-(d)的核酸中的一者、两者、三者或四者在一种或多种组合物中。在本发明的组合的一些实施例中，上述(a)-(d)的核酸中的两者、三者或四者在两种或更多种单独的组合物中。典型地，所有个别核酸均在同一组合物中。

多肽组合

本发明提供了包含两种或更多种本发明的多肽的组合。

因此，在一方面，本发明提供一种组合，该组合包含如本文所述的经修饰的MOMP多肽，以及：

(i)如本文所述的嵌合MOMP VD多肽；以及/或者

(ii)以下中的一者或多者：

(a)包含如本文所述的衣原体属物种CT443多肽的氨基酸序列的多肽；

(b)包含如本文所述的衣原体属物种CT584多肽的氨基酸序列的多肽：

(c)包含如本文所述的衣原体属物种CT600多肽的氨基酸序列的多肽；以及/或者

(d)包含如本文所述的衣原体属物种CT812多肽的氨基酸序列的多肽。

在一些实施例中，该组合包含(a)的多肽，(b)的多肽，(c)的多肽，(d)的多肽，(a)和(b)的多肽，(a)和(c)的多肽，(a)和(d)的多肽，(b)和(c)的多肽，(b)和(d)的多肽，(c)和(d)的多肽，(a)、(b)和(c)的多肽，(a)、(c)和(d)的多肽，(a)、(b)和(d)的多肽，(b)、(c)和(d)的多肽，(a)、(b)、(c)和(d)的多肽。在一些实施例中，该组合包含(a)的多肽。在一些实施例中，该组合包含(b)的多肽。典型地，该组合包含(a)的多肽和(b)的多肽。

因此，在一些实施例中，本发明的组合包含如本文所述的经修饰的MOMP多肽和如本文所述的嵌合MOMP VD多肽。

在一些实施例中，本发明的组合包含如本文所述的经修饰的MOMP多肽，以及以下中的一者、两者、三者或四者：(a)包含如本文所述的衣原体属物种CT443多肽的氨基酸序列的多肽；(b)包含如本文所述的衣原体属物种CT584多肽的氨基酸序列的多肽；(c)包含如本文所述的衣原体属物种CT600多肽的氨基酸序列的多肽；以及/或者(d)包含如本文所述的衣原体属物种CT812多肽的氨基酸序列的多肽。该组合可包含上述(a)-(d)非MOMP抗原组合中的任一者。在一些实施例中，该组合包含(a)的多肽。在一些实施例中，该组合包含(b)的多肽。典型地，该组合包含(a)的多肽和(b)的多肽。

在一些实施例中，本发明的组合包含(i)如本文所述的经修饰的MOMP多肽；(ii)如本文所述的嵌合MOMP VD多肽；和(iii)(a)-(d)中的多肽中的一者、两者、三者或四者。该组合可包含上述(a)-(d)非MOMP抗原组合中的任一者。在一些实施例中，该组合包含(a)的多肽。在一些实施例中，该组合包含(b)的多肽。典型地，该组合包含(a)的多肽和(b)的多肽。

在进一步的方面，本发明提供了一种组合，该组合包含如本文所述的嵌合MOMP VD多肽，以及(a)-(d)中的多肽中的一者、两者、三者或四者。该组合可包含上述(a)-(d)非MOMP抗原组合中的任一者。在一些实施例中，该组合包含(a)的多肽。在一些实施例中，该组合包含(b)的多肽。典型地，该组合包含(a)的多肽和(b)的多肽。在一些实施例中，该组合物进一步包含如本文所述的经修饰的MOMP多肽。

在另一方面，本发明提供了一种组合，该组合包含含有如本文所述的衣原体属物种CT443多肽的氨基酸序列的多肽，以及如(b)-(d)中定义的多肽中的一者、两者或三者。该组合可包含上述(b)、(c)和/或(d)的非MOMP抗原组合中的任一者。典型地，该组合包含(b)的多肽。在一些实施例中，该组合进一步包含原生衣原体属物种MOMP多肽或其变体。

在另一方面，本发明提供了一种组合，该组合包含含有如本文所述的衣原体属物种CT584多肽的氨基酸序列的多肽，以及如(a)、(c)或(d)中定义的多肽中的一者、两者或三者。该组合可包含上述(a)、(c)和/或(d)的非MOMP抗原组合中的任一者。典型地，该组合包含(a)的多肽。在一些实施例中，该组合进一步包含原生衣原体属物种MOMP多肽或其变体。

在另一方面，本发明提供了一种组合，该组合包含含有如本文所述的衣原体属物种CT600多肽的氨基酸序列的多肽，以及如(a)、(b)或(d)中定义的多肽中的一者、两者或三者。该组合可包含上述(a)、(b)和/或(d)的非MOMP抗原组合中的任一者。在一些实施例中，该组合进一步包含原生衣原体属物种MOMP多肽或其变体。

在另一方面，本发明提供了一种组合，该组合包含含有如本文所述的衣原体属物种CT812多肽的氨基酸序列的多肽，以及如(a)-(c)中定义的多肽中的一者、两者或三者。该组合可包含上述(a)、(b)和/或(c)的非MOMP抗原组合中的任一者。在一些实施例中，该组合进一步包含原生衣原体属物种MOMP多肽或其变体。

因此，本发明的组合可以包含原生衣原体属物种MOMP多肽或其变体，以及(a)-(d)中的多肽中的一者、两者、三者或四者。原生衣原体属物种MOMP多肽的变体包括包含一个或多个保守氨基酸取代的MOMP多肽、在对应于原生衣原体属物种MOMP多肽中的半胱氨酸残基的一个或多个(例如，所有)位置处包含单个氨基酸取代的MOMP多肽和在对应于原生衣原体属物种MOMP中的糖基化位点，优选N-糖基化位点的一个或多个(例如，所有)位置处包含单个氨基酸取代的MOMP多肽。原生衣原体属物种MOMP多肽的变体包括包含分泌信号肽序列的MOMP多肽和包含异源跨膜结构域的MOMP多肽。在一些实施例中，原生衣原体属物种MOMP多肽包含分泌信号肽序列。在一些实施例中，原生衣原体属物种MOMP多肽包含分泌信号肽序列和异源跨膜结构域。

如本文所披露的多肽的组合涵盖处于同一组合物中的所有个别多肽和处于一种或多种单独组合物中的所有个别多肽。在一些实施例中，本文所述组合中的所有个别多肽均在同一组合物中。在一些实施例中，本文所述组合中的每种多肽是单独的组合物。在一些实施例中，本文所述组合中的两种或更多种多肽是两种或更多种组合物。在本发明的组合的一些实施例中，上述(a)-(d)的多肽中的一者、两者、三者或四者在一种或多种组合物中。在本发明的组合的一些实施例中，上述(a)-(d)的多肽中的两者、三者或四者在两种或更多种单独的组合物中。典型地，所有个别多肽均在同一组合物中。

LNP

在某些实施例中，本发明的组合物(例如，包含本发明的核酸的组合物)进一步包含脂质纳米颗粒(LNP)。在某些实施例中，本发明的核酸被包封在LNP中。

本披露的LNP可以包括四类脂质：(i)可电离脂质(例如，阳离子脂质)；(ii)PEG化脂质；(iii)基于胆固醇的脂质；和(iv)辅助脂质。

A.可电离脂质

可电离脂质促进mRNA包封，并且可以是阳离子脂质。阳离子脂质在低pH下提供带正电荷的环境，以促进带负电荷的mRNA药物物质的有效包封。

在一些实施例中，阳离子脂质是OF-02：

OF-02是OF-Deg-Lin的不可降解的结构类似物。OF-Deg-Lin含有可降解的酯键以连接二酮哌嗪核心和双不饱和尾，而OF-02含有不可降解的1,2-氨基-醇键以连接相同的二酮哌嗪核心和双不饱和尾(Fenton等人,Adv Mater.[先进材料](2016)28:2939；美国专利10,201,618)。本文的示例性LNP配制品(脂质A)含有OF-02。

在一些实施例中，阳离子脂质是cKK-E10(Dong等人,PNAS[美国国家科学院院刊](2014)111(11):3955-60；美国专利9,512,073)：

本文的示例性LNP配制品(脂质B)含有cKK-E10。

在一些实施例中，阳离子脂质是GL-HEPES-E3-E10-DS-3-E18-1(2-(4-(2-((3-(双((Z)-2-羟基十八碳-9-烯-1-基)氨基)丙基)二硫烷基)乙基)哌嗪-1-基)乙基4-(双(2-羟基癸基)氨基)丁酸酯)，其是具有哌嗪核心的基于HEPES的二硫化物阳离子脂质，具有式III：

本文的示例性LNP配制品(脂质C)含有GL-HEPES-E3-E10-DS-3-E18-1。脂质C具有与脂质A或脂质B相同的组成，只是阳离子脂质不同。

在一些实施例中，阳离子脂质是GL-HEPES-E3-E12-DS-4-E10(2-(4-(2-((3-(双(2-羟基癸基)氨基)丁基)二硫烷基)乙基)哌嗪-1-基)乙基4-(双(2-羟基十二烷基)氨基)丁酸酯)，其是具有哌嗪核心的基于HEPES的二硫化物阳离子脂质，具有式IV：

本文的示例性LNP配制品(脂质D)含有GL-HEPES-E3-E12-DS-4-E10。脂质D具有与脂质A或脂质B相同的组成，只是阳离子脂质不同。

在一些实施例中，阳离子脂质是GL-HEPES-E3-E12-DS-3-E14(2-(4-(2-((3-(双(2-羟基十四烷基)氨基)丙基)二硫烷基)乙基)哌嗪-1-基)乙基4-(双(2-羟基十二烷基)氨基)丁酸酯)，其是具有哌嗪核心的基于HEPES的二硫化物阳离子脂质，具有式V：

本文的示例性LNP配制品(脂质E)含有GL-HEPES-E3-E12-DS-3-E14。脂质E具有与脂质A或脂质B相同的组成，只是阳离子脂质不同。

阳离子脂质GL-HEPES-E3-E10-DS-3-E18-1(III)、GL-HEPES-E3-E12-DS-4-E10(IV)和GL-HEPES-E3-E12-DS-3-E14(V)可根据方案1中所述的一般程序合成：

方案1：式(III)、(IV)和(V)的脂质的一般合成方案

在一些实施例中，阳离子脂质是MC3，其具有式VI：

在一些实施例中，阳离子脂质是SM-102(9-十七烷基8-{(2-羟乙基)[6-氧代-6-(十一烷氧基)己基]氨基}辛酸酯)，其具有式VII：

在一些实施例中，阳离子脂质是ALC-0315[(4-羟基丁基)氮杂二基]二(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯)，其具有式VIII：

在一些实施例中，阳离子脂质是cOrn-EE1，其具有式IX：

在一些实施例中，阳离子脂质是ATX-126(4,4'-[[[[3-(二甲基氨基)丙基]硫代]羰基]亚氨基]双-丁酸、1,1'-双(1-庚辛基)酯)，其具有式X：

在一些实施例中，阳离子脂质可以选自包含以下各项的组：cKK-E10；OF-02；[(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七-6,9,28,31-四烯-19-基]4-(二甲基氨基)丁酸酯(D-Lin-MC3-DMA)；2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)；1,2-二亚油基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(Dlin-DMA)；二((Z)-壬-2-烯-1-基)9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸酯(L319)；8-{(2-羟乙基)[6-氧代-6-(十一烷氧基)己基]氨基}辛酸9-十七烷基酯(SM-102)；[(4-羟丁基)氮烷二基]二(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯)(ALC-0315)；[3-(二甲基氨基)-2-[(Z)-十八碳-9-烯酰基]氧基丙基](Z)-十八碳-9-烯酸酯(DODAP)；2,5-双(3-氨基丙基氨基)-N-[2-[二(十七烷基)氨基]-2-氧代乙基]戊酰胺(DOGS)；[(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-二甲基-17-[(2R)-6-甲基庚烷-2-基]-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-十二氢-1H-环戊二烯并[a]菲-3-基]N-[2-(二甲基氨基)乙基]氨基甲酸酯(DC-Chol)；四(8-甲基壬基)3,3',3”,3″′-(((甲基氮烷二基)双(丙烷-3,1二基))双(氮烷三基))四丙酸酯(306Oi10)；(2-(二辛基铵基)乙基)磷酸癸酯(9A1P9)；5,5-二((Z)-十七碳-8-烯-1-基)-1-(3-(吡咯烷-1-基)丙基)-2,5-二氢-1H-咪唑-2-甲酸乙酯(A2-Iso5-2DC18)；双(2-(十二烷基二硫烷基)乙基)3,3'-((3-甲基-9-氧代-10-氧杂-13,14-二噻-3,6-二氮杂二十六基)氮烷二基)二丙酸酯(BAME-O16B)；1,1'-((2-(4-(2-((2-(双(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)哌嗪-1-基)乙基)氮烷二基)双(十二烷-2-醇)(C12-200)；3,6-双(4-(双(2-羟基十二烷基)氨基)丁基)哌嗪-2,5-二酮(cKK-E12)；六(辛烷-3-基)9,9',9”,9″′,9””,9″′″-((((苯-1,3,5-三羰基)三(氮烷二基))三(丙烷-3,1-二基))三(氮烷三基))六壬酸酯(FTT5)；(((3,6-二氧代哌嗪-2,5-二基)双(丁烷-4,1-二基))双(氮烷三基))四(乙烷-2,1-二基)(9Z,9′Z,9″Z,9″′Z,12Z,12′Z,12″Z,12″′Z)-四(十八碳-9,12-二烯酸酯)(OF-Deg-Lin)；TT3；N¹,N³,N⁵-三(3-(双十二烷基氨基)丙基)苯-1,3,5-三甲酰胺；N1-[2-((1S)-1-[(3-氨基丙基)氨基]-4-[二(3-氨基丙基)氨基]丁基甲酰氨基)乙基]-3,4-二[油烯基氧基]-苯甲酰胺(MVL5)；8-((2-羟乙基)(8-(壬氧基)-8-氧代辛基)氨基)辛酸十七烷-9-基酯(脂质5)；4,4'-[[[[3-(二甲基氨基)丙基]硫代]羰基]亚氨基]双-丁酸、1,1'-双(1-庚基辛基)酯(ATX-126)GL-HEPES-E3-E10-DS-3-E18-1；GL-HEPES-E3-E12-DS-4-E10；GL-HEPES-E3-E12-DS-3-E14、IM-001；以及其组合。

在一些实施例中，阳离子脂质是IM-001，其具有式XI(EP 23306049.0)：

本文的示例性LNP配制品(脂质G)含有IM-001。脂质G具有与脂质A或脂质B相同的组成，只是阳离子脂质不同。

阳离子脂质IM-001(XI)可根据方案2中所述的一般程序合成：

方案2：式(XI)的脂质的一般合成方案

方案2可如实例14中所述进行。

在一些实施例中，阳离子脂质是可生物降解的。

在一些实施例中，阳离子脂质不是可生物降解的。

在一些实施例中，阳离子脂质是可裂解的。

在一些实施例中，阳离子脂质不是可裂解的。

阳离子脂质进一步详细描述在Dong等人(PNAS.[美国国家科学院院刊]111(11):3955-60.2014)；Fenton等人(Adv Mater.[先进材料]28:2939.2016)；美国专利号9,512,073；和美国专利号10,201,618中，这些文献中的每一篇通过援引并入本文。

B.PEG化脂质

PEG化的脂质组分提供了对纳米颗粒的粒度和稳定性的控制。此类组分的添加可以防止复合物聚集，并且提供了用于增加脂质-核酸药物组合物的循环寿命并增加其至靶组织的递送的手段(Klibanov等人FEBS Letters[欧洲生化学会联合会快报]268(1):235-7.1990)。可以选择这些组分以在体内快速交换出药物组合物(参见例如，美国专利号5,885,613)。

所考虑的PEG化脂质包括但不限于长度长达5kDa的聚乙二醇(PEG)链，其共价连接至具有C₆-C₂₀(例如，C₈、C₁₀、C₁₂、C₁₄、C₁₆或C₁₈)长度的一条或多条烷基链的脂质，诸如衍生化神经酰胺(例如，N-辛酰基-鞘氨醇-1-[琥珀酰基(甲氧基聚乙二醇)](C8 PEG神经酰胺))。在一些实施例中，PEG化脂质是1,2-二肉豆蔻酰-外消旋-甘油-3-甲氧基聚乙二醇(DMG-PEG)；1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)；1,2-二月桂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-聚乙二醇(DLPE-PEG)；或1,2-二硬脂酰基-外消旋-甘油-聚乙二醇(DSG-PEG)；PEG-DAG；PEG-PE；PEG-S-DAG；PEG-S-DMG；PEG-cer；PEG-二烷氧基丙基氨基甲酸酯；2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-双十四烷基乙酰胺(ALC-0159)；以及其组合。

在某些实施例中，PEG具有高分子量，例如2000-2400g/mol。在某些实施例中，PEG是PEG2000(或PEG-2K)。在某些实施例中，本文的PEG化脂质是DMG-PEG2000、DSPE-PEG2000、DLPE-PEG2000、DSG-PEG2000、C8 PEG2000、或ALC-0159(2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-双十四烷基乙酰胺)。在某些实施例中，本文的PEG化脂质是DMG-PEG2000。

C.基于胆固醇的脂质

胆固醇组分为纳米颗粒内的脂质双层结构提供了稳定性。在一些实施例中，LNP包括一种或多种基于胆固醇的脂质。合适的基于胆固醇的脂质包括例如：DC-Choi(N,N-二甲基-N-乙基甲酰氨基胆固醇)、l,4-双(3-N-油烯基氨基-丙基)哌嗪(Gao等人,BiochemBiophys Res Comm.[生物化学与生物物理学研究通讯](1991)179:280；Wolf等人,BioTechniques[生物技术](1997)23:139；美国专利5,744,335)、咪唑胆固醇酯(“ICE”；WO2011/068810)、谷甾醇(22,23-二氢豆甾醇)、β-谷甾醇、谷甾烷醇、岩藻甾醇、豆甾醇(豆甾烷-5,22-二烯-3-醇)、麦角甾醇；链甾醇(3β-羟基-5,24-胆甾二烯)；羊毛甾醇(8,24-羊毛甾二烯-3b-醇)；7-脱氢胆固醇(Δ5,7-胆固醇)；二氢羊毛甾醇(24,25-二氢羊毛甾醇)；酵母甾醇(5α-胆甾-8,24-二烯-3β-醇)；胆甾烯醇(lathosterol)(5α-胆甾-7-烯-3β-醇)；薯蓣皂苷元((3β,25R)-螺甾-5-烯-3-醇)；菜油甾醇(campesterol)(菜油甾-5-烯-3β-醇)；菜油甾烷醇(campestanol)(5a-菜油甾烷-3b-醇)；24-亚甲基胆固醇(5,24(28)-胆甾二烯-24-甲基烯-3β-醇)；十七烷酸胆甾醇酯(cholesterylmargarate)(十七烷酸胆甾-5-烯-3β-基酯)；油酸胆甾醇酯；硬脂酸胆甾醇酯和胆固醇的其他经修饰形式。在一些实施例中，在LNP中使用的基于胆固醇的脂质是胆固醇。

D.辅助脂质

辅助脂质可增强LNP的结构稳定性，并帮助LNP在内体中逃逸。它改善了mRNA药物有效载荷的摄取和释放。在一些实施例中，辅助脂质是两性离子脂质，其具有用于增强药物有效载荷的摄取和释放的促融合特性。辅助脂质的实例为1,2-二油酰基-SN-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)；1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)；1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸(DOPS)；1,2-二反油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DEPE)；以及1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPOC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、DMPC、1,2-二月桂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DLPC)、1,2-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)和1,2-二月桂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DLPE)。

其他示例性辅助脂质是二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰油酰基-磷脂酰乙醇胺(POPE)、二油酰基-磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚氨基甲基)-环己烷-l-甲酸酯(DOPE-mal)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰磷酸乙醇胺(DMPE)、磷脂酰丝氨酸、鞘脂、鞘磷脂、神经酰胺、脑苷脂、神经节苷脂、16-O-单甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反式PE、l-硬脂酰基-2-油酰基-磷脂酰乙醇胺(SOPE)或其组合。在某些实施例中，辅助脂质是DOPE。在某些实施例中，辅助脂质是DSPC。

在各种实施例中，本发明的LNP包括(i)选自OF-02、cKK-E10、GL-HEPES-E3-E10-DS-3-E18-1、GL-HEPES-E3-E12-DS-4-E10、GL-HEPES-E3-E12-DS-3-E14或IM-001的阳离子脂质；(ii)DMG-PEG2000；(iii)胆固醇；和(iv)DOPE。

在其他实施例中，本发明的LNP包括(i)SM-102、(ii)DMG-PEG2000、(iii)胆固醇和(iv)DSPC。

在又其他实施例中，本发明的LNP包括(i)ALC-0315、(ii)ALC-0159、(iii)胆固醇和(iv)DSPC。

在又其他实施例中，本发明的LNP包括(i)ATX-126、(ii)DMG-PEG2000、(iii)胆固醇和(iv)DSPC。

E.脂质组分的摩尔比

上述组分的摩尔比对于LNP在递送mRNA中的有效性是重要的。阳离子脂质、PEG化脂质、基于胆固醇的脂质和辅助脂质的摩尔比是A:B:C:D，其中A+B+C+D＝100％。在一些实施例中，在LNP中阳离子脂质相对于总脂质的摩尔比(即，A)是35％-55％，诸如35％-50％(例如，38％-42％，诸如40％或45％-50％)。在一些实施例中，PEG化的脂质组分相对于总脂质的摩尔比(即，B)是0.25％-2.75％(例如，1％-2％，诸如1.5％)。在一些实施例中，基于胆固醇的脂质相对于总脂质的摩尔比(即，C)是20％-50％(例如，27％-30％，诸如28.5％或38％-43％)。在一些实施例中，辅助脂质相对于总脂质的摩尔比(即，D)是5％-35％(例如，28％-32％，诸如30％或8％-12％，诸如10％)。在一些实施例中，(PEG化脂质+胆固醇)组分具有与辅助脂质相同的摩尔量。在一些实施例中，LNP所含有的阳离子脂质与辅助脂质的摩尔比大于1。

在某些实施例中，本披露的LNP包括：

摩尔比为35％至55％或40％至50％的阳离子脂质(例如，摩尔比为35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％或55％的阳离子脂质)；

摩尔比为0.25％至2.75％或1.00％至2.00％的聚乙二醇(PEG)缀合的(PEG化的)脂质(例如，摩尔比为0.25％、0.50％、0.75％、1.00％、1.25％、1.50％、1.75％、2.00％、2.25％、2.50％或2.75％的PEG化脂质)；

摩尔比为20％至50％、25％至45％或28.5％至43％的基于胆固醇的脂质(例如，摩尔比为20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％或50％的基于胆固醇的脂质)；以及

摩尔比为5％至35％、8％至30％或10％至30％的辅助脂质(例如，摩尔比为5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％或35％的辅助脂质)，

其中所有摩尔比均相对于该LNP的总脂质含量。

在某些实施例中，该LNP包括：摩尔比为40％的阳离子脂质；摩尔比为1.5％的PEG化脂质；摩尔比为28.5％的基于胆固醇的脂质；和摩尔比为30％的辅助脂质。

在某些实施例中，本披露的LNP包括：摩尔比为45％至50％的阳离子脂质；摩尔比为1.5％至1.7％的PEG化脂质；摩尔比为38％至43％的基于胆固醇的脂质；和摩尔比为9％至10％的辅助脂质。

在某些实施例中，该PEG化脂质是二肉豆蔻酰-PEG2000(DMG-PEG2000)。

在各种实施例中，该基于胆固醇的脂质是胆固醇。

在一些实施例中，该辅助脂质是1,2-二油酰基-SN-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)。

在某些实施例中，该LNP包括：摩尔比为35％至55％的OF-02；摩尔比为0.25％至2.75％的DMG-PEG2000；摩尔比为20％至50％的胆固醇；和摩尔比为5％至35％的DOPE。

在某些实施例中，该LNP包括：摩尔比为35％至55％的cKK-E10；摩尔比为0.25％至2.75％的DMG-PEG2000；摩尔比为20％至50％的胆固醇；和摩尔比为5％至35％的DOPE。

在某些实施例中，该LNP包括：摩尔比为35％至55％的GL-HEPES-E3-E10-DS-3-E18-1；摩尔比为0.25％至2.75％的DMG-PEG2000；摩尔比为20％至50％的胆固醇；和摩尔比为5％至35％的DOPE。

在某些实施例中，该LNP包括：摩尔比为35％至55％的GL-HEPES-E3-E12-DS-4-E10；摩尔比为0.25％至2.75％的DMG-PEG2000；摩尔比为20％至50％的胆固醇；和摩尔比为5％至35％的DOPE。

在某些实施例中，该LNP包括：摩尔比为35％至55％的GL-HEPES-E3-E12-DS-3-E14；摩尔比为0.25％至2.75％的DMG-PEG2000；摩尔比为20％至50％的胆固醇；和摩尔比为5％至35％的DOPE。

在某些实施例中，该LNP包括：摩尔比为35％至55％的SM-102；摩尔比为0.25％至2.75％的DMG-PEG2000；摩尔比为20％至50％的胆固醇；和摩尔比为5％至35％的DSPC。

在某些实施例中，该LNP包括：摩尔比为35％至55％的ALC-0315；摩尔比为0.25％至2.75％的ALC-0159；摩尔比为20％至50％的胆固醇；和摩尔比为5％至35％的DSPC。

在某些实施例中，该LNP包括：摩尔比为40％的OF-02；摩尔比为1.5％的DMG-PEG2000；摩尔比为28.5％的胆固醇；和摩尔比为30％的DOPE。这种LNP配制品在本文中被指定为“脂质A”。

在某些实施例中，该LNP包括：摩尔比为40％的cKK-E10；摩尔比为1.5％的DMG-PEG2000；摩尔比为28.5％的胆固醇；和摩尔比为30％的DOPE。这种LNP配制品在本文中被指定为“脂质B”。

在某些实施例中，该LNP包括：摩尔比为40％的GL-HEPES-E3-E10-DS-3-E18-1；摩尔比为1.5％的DMG-PEG2000；摩尔比为28.5％的胆固醇；和摩尔比为30％的DOPE。这种LNP配制品在本文中被指定为“脂质C”。

在某些实施例中，该LNP包括：摩尔比为40％的GL-HEPES-E3-E12-DS-4-E10；摩尔比为1.5％的DMG-PEG2000；摩尔比为28.5％的胆固醇；和摩尔比为30％的DOPE。这种LNP配制品在本文中被指定为“脂质D”。

在某些实施例中，该LNP包括：摩尔比为40％的GL-HEPES-E3-E12-DS-3-E14；摩尔比为1.5％的DMG-PEG2000；摩尔比为28.5％的胆固醇；和摩尔比为30％的DOPE。这种LNP配制品在本文中被指定为“脂质E”。

在某些实施例中，该LNP包括摩尔比为50％的DLin-MC3-DMA(MC3)；摩尔比为1.5％的DMG-PEG2000；摩尔比为38.5％的胆固醇；和摩尔比为10％的DSPC。这种LNP配制品在本文中被指定为“脂质F”。

在某些实施例中，该LNP包括：摩尔比为40％的IM-001；摩尔比为1.5％的DMG-PEG2000；摩尔比为28.5％的胆固醇；和摩尔比为30％的DOPE。这种LNP配制品在本文中被指定为“脂质G”。

在某些实施例中，该LNP包括：摩尔比为50％的8-{(2-羟乙基)[6-氧代-6-(十一烷氧基)己基]氨基}辛酸9-十七烷基酯(SM-102)；摩尔比为10％的1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)；摩尔比为38.5％的胆固醇；和摩尔比为1.5％的1,2-二肉豆蔻酰-外消旋-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000(DMG-PEG2000)。

在某些实施例中，该LNP包括：摩尔比为46.3％的(4-羟丁基)氮烷二基]二(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯)(ALC-0315)；摩尔比为9.4％的1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)；摩尔比为42.7％的胆固醇；和摩尔比为1.6％的2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-双十四烷基乙酰胺(ALC-0159)。

在某些实施例中，该LNP包括：摩尔比为47.4％的(4-羟丁基)氮烷二基]二(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯)(ALC-0315)；摩尔比为10％的1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)；摩尔比为40.9％的胆固醇；和摩尔比为1.7％的2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-双十四烷基乙酰胺(ALC-0159)。

在某些实施例中，该LNP包括摩尔比为50％的4,4'-[[[[3-(二甲基氨基)丙基]硫代]羰基]亚氨基]双-丁酸、1,1'-双(1-庚辛基)酯(ATX-126)；摩尔比为1.5％的DMG-PEG2000；摩尔比为38.5％的胆固醇；和摩尔比为10％的DSPC。

在一些实施例中，LNP配制品如针对“脂质A”、“脂质B”、“脂质D”或脂质G(例如，脂质D或脂质G)所定义。

为了计算待放入LNP配制品中的每种脂质的实际量，首先基于所需的N/P比确定阳离子脂质的摩尔量，其中N是阳离子脂质中氮原子的数量，并且P是待由LNP转运的mRNA中的磷酸基团的数量。接下来，基于阳离子脂质的摩尔量和所选择的摩尔比计算每种其他脂质的摩尔量。然后使用每种脂质的分子量将这些摩尔量转化为重量。

F.LNP内的核酸

本文所述的LNP组合物可以包含本发明的核酸(例如，mRNA)。

如果需要，LNP可以是多价的。在一些实施例中，LNP可以携带核酸，诸如mRNA，其编码多于一种本发明的多肽，诸如两种、三种、四种、五种、六种、七种或八种多肽。例如，LNP可以携带多种本发明的核酸(例如，mRNA)，其各自编码本发明的不同多肽；或者携带可以翻译成多于一种本发明的多肽的多顺反子mRNA(例如，每个抗原编码序列由编码自切割肽诸如2A肽的核苷酸接头隔开)。携带不同核酸(例如，mRNA)的LNP典型地包含(包封)每种核酸的多个拷贝。例如，携带或包封两种不同核酸的LNP典型地携带这两种不同核酸中的每种核酸的多个拷贝。

在一些实施例中，编码如本文所述的不同多肽的如本文所述的两种或更多种(例如，两种、三种或四种)核酸(例如，mRNA)共包封在同一LNP中。例如，本文所述的LNP可以共包封(a)包含编码如本文所述的经修饰的MOMP多肽的核苷酸序列的如本文所述的核酸；(b)包含编码如本文所述的嵌合MOMP VD多肽的核苷酸序列的如本文所述的核酸；和(c)包含编码如本文所述的衣原体属物种CT443多肽的核苷酸序列的如本文所述的核酸。在一些实施例中，本文所述的LNP共包封(a)包含编码如本文所述的经修饰的MOMP多肽的核苷酸序列的如本文所述的核酸；(b)包含编码如本文所述的嵌合MOMP VD多肽的核苷酸序列的如本文所述的核酸；和(d)包含编码如本文所述的衣原体属物种CT584多肽的核苷酸序列的如本文所述的核酸。在一些实施例中，本文所述的LNP共包封(a)包含编码如本文所述的经修饰的MOMP多肽的核苷酸序列的如本文所述的核酸；(b)包含编码如本文所述的嵌合MOMP VD多肽的核苷酸序列的如本文所述的核酸；(c)包含编码如本文所述的衣原体属物种CT443多肽的核苷酸序列的如本文所述的核酸；和(d)包含编码如本文所述的衣原体属物种CT584多肽的核苷酸序列的如本文所述的核酸。

本文所述的任何两种核酸(例如，两种mRNA)可以按1:1的重量比存在。本文所述的任何三种核酸(例如，三种mRNA)可以按1:1:1的重量比存在。本文所述的任何四种核酸(例如，四种mRNA)可以按1:1:1:1的重量比存在。

在一些实施例中，LNP如本文所述(例如，脂质D或脂质G)。

替代性地，编码如本文所述的不同多肽的任何两种或更多种(例如，四种)核酸(例如，mRNA)包封在单独的LNP中。

在一些实施例中，单一LNP配制品可以包含多种(例如，两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或更多种)LNP，每种携带不同的核酸(例如，mRNA)。

当核酸是mRNA时，该mRNA可以是未经修饰的(即，仅含有由磷酸二酯键连接的天然核糖核苷酸A、U、C和/或G)，或者可以是经化学修饰的(例如，包括核苷酸类似物，诸如假尿苷(例如，N-1-甲基假尿苷)、2'-氟核糖核苷酸和2'-甲氧基核糖核苷酸；和/或硫代磷酸酯键)。mRNA分子可以包含5'帽和polyA尾。

G.缓冲液和其他组分

为了稳定核酸和/或LNP(例如，为了延长疫苗产品的保质期)，为了促进LNP药物组合物的施用，和/或为了增强核酸的体内表达，核酸和/或LNP可以与一种或多种载剂、靶向配体、稳定试剂(例如，防腐剂和抗氧化剂)和/或其他药学上可接受的赋形剂组合配制。此类赋形剂的实例为对羟基苯甲酸酯、硫柳汞(thimerosal)、硫柳汞钠(thiomersal)、氯丁醇、苯扎氯铵、螯合剂(例如，EDTA)。

本披露的LNP组合物可以作为冷冻液体形式或冻干形式提供。可以使用各种冷冻保护剂，包括而不限于蔗糖、海藻糖、葡萄糖、甘露糖醇、甘露糖、右旋糖等。冷冻保护剂可以构成LNP组合物的5％-30％(w/v)。在一些实施例中，LNP组合物包括海藻糖，例如为5％-30％(例如，10％)(w/v)。一旦用冷冻保护剂配制，LNP组合物便可以在-20℃至-80℃下冷冻(或冻干和冷冻保存)。

可以将LNP组合物在水性缓冲溶液中提供给患者：如果先前冷冻，则解冻，或者如果先前冻干，则在床边在水性缓冲溶液中重构。缓冲溶液优选是等渗的，并且适用于例如肌内或皮内注射。在一些实施例中，缓冲溶液是磷酸盐缓冲盐水(PBS)。

核酸

本发明的核酸可以是RNA或DNA。本发明的核酸可以是单链或双链的。在某些实施例中，核酸是RNA，例如，mRNA。

mRNA

在一些实施例中，本发明的核酸是信使RNA(mRNA)。mRNA可以是经修饰的或未经修饰的。mRNA可以含有一个或多个编码区和非编码区。编码区可替代性地称为开放阅读框(ORF)。mRNA中的非编码区包含5'帽、5'非翻译区(UTR)、3'UTR和polyA尾。mRNA可以从天然来源中纯化，使用重组表达系统(例如，体外转录)产生并任选地纯化，或化学合成。

在某些实施例中，mRNA包含编码目标抗原的ORF。在某些实施例中，RNA(例如，mRNA)进一步包含至少一个5'UTR、3'UTR、poly(A)尾和/或5'帽。在一些实施例中，mRNA包含(i)如本文所定义的5'帽；(ii)如本文所定义的5'非翻译区(UTR)；(iii)蛋白质编码区；(iv)如本文所定义的3'UTR；和(v)polyA尾。典型地，(i)的3'端经由3'至5'磷酸二酯键直接键合至(ii)的5'端；(ii)的3'端经由3'至5'磷酸二酯键直接键合至(iii)的5'端；(iii)的3'端经由3'至5'磷酸二酯键直接键合至(iv)的5'端；并且(iv)的3'端经由3'至5'磷酸二酯键直接键合至(v)的5'端。

在某些实施例中，mRNA包含至少一个、至少两个、至少三个或更多个终止密码子，其中终止密码子可以选自UAA、UGA和UAG，并且其中该至少两个、至少三个或更多个终止密码子可以相同或不同。典型地，该至少一个终止密码子包括UAA或UGA(例如，UAA)。典型地，该至少两个终止密码子包括至少两个相同的终止密码子，诸如UAA或UGA(例如，UAAUAA或UGAUGA)或至少两个不同的终止密码子，其可特别地选自UAA和UGA(例如，UGAUAA)。典型地，该至少三个终止密码子包括UAA、UGA和UAG(例如，UGAUAAUAG)。

除非另有说明，否则mRNA序列的显示方向为5'至3'。

5'帽

mRNA 5'帽可以提供对大多数真核细胞中发现的核酸酶的抗性，并且促进翻译效率。已知几种类型的5'帽。7-甲基鸟苷帽(也称为“m⁷G”或“帽-0”)包括鸟苷，该鸟苷通过5'–5'-三磷酸键与第一转录核苷酸连接。

典型地如下添加5'帽：首先，RNA末端磷酸酶从5'核苷酸中去除一个末端磷酸基团，留下两个末端磷酸；然后，经由鸟苷酰基转移酶向末端磷酸中添加鸟苷三磷酸(GTP)，产生5‘5‘5三磷酸键联；然后，通过甲基转移酶甲基化鸟嘌呤的7-氮。帽结构的实例包括但不限于m7G(5')ppp、(5'(A,G(5')ppp(5')A和G(5')ppp(5')G。美国公开号US2016/0032356和美国公开号US2018/0125989中描述了额外的帽结构，这些文献通过援引并入本文。

多核苷酸的5'加帽可以根据制造商的方案使用以下化学RNA帽类似物在体外转录反应期间伴随完成，以生成5'-鸟苷帽结构：3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G(ARCA帽)；G(5')ppp(5')A；G(5')ppp(5')G；m7G(5')ppp(5')A；m7G(5')ppp(5')G；m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG；m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pU；m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)pG(马萨诸塞州伊普斯维奇市新英格兰生物实验室；三联生物技术公司(New England BioLabs,Ipswich,MA；TriLinkBiotechnologies))。经修饰的RNA的5'-加帽可以使用痘苗病毒加帽酶在转录后完成，以生成帽0结构：m7G(5')ppp(5')G。帽1结构可以使用痘苗病毒加帽酶和2'-O甲基转移酶两者来生成以生成：m7G(5')ppp(5')G-2'-O-甲基。可以从帽1结构生成帽2结构，然后使用2'-O甲基-转移酶对5'倒数第三个核苷酸进行2'-O-甲基化。可以从帽2结构生成帽3结构，然后使用2'-O甲基-转移酶对5'倒数第四个核苷酸进行2'-O-甲基化。

在某些实施例中，本发明的mRNA包含选自由以下组成的组的5'帽：3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G(ARCA帽)、G(5')ppp(5')A、G(5')ppp(5')G、m7G(5')ppp(5')A、m7G(5')ppp(5')G、m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG、m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pU和m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)pG。

在某些实施例中，本发明的mRNA包含以下5'帽：

非翻译区(UTR)

在一些实施例中，本发明的mRNA包含5'和/或3'非翻译区(UTR)。在mRNA中，5'UTR在转录起始位点处开始并且继续到起始密码子，但是不包括起始密码子。3'UTR紧接终止密码子之后开始并且继续直到转录终止信号。

在一些实施例中，本文披露的mRNA可以包含5'UTR，其包括影响mRNA的稳定性或翻译的一种或多种元件。在一些实施例中，5'UTR可以具有约10至5,000个核苷酸的长度。在一些实施例中，5'UTR可以具有约50至500个核苷酸的长度。在一些实施例中，5'UTR具有至少约10个核苷酸的长度、约20个核苷酸的长度、约30个核苷酸的长度、约40个核苷酸的长度、约50个核苷酸的长度、约100个核苷酸的长度、约150个核苷酸的长度、约200个核苷酸的长度、约250个核苷酸的长度、约300个核苷酸的长度、约350个核苷酸的长度、约400个核苷酸的长度、约450个核苷酸的长度、约500个核苷酸的长度、约550个核苷酸的长度、约600个核苷酸的长度、约650个核苷酸的长度、约700个核苷酸的长度、约750个核苷酸的长度、约800个核苷酸的长度、约850个核苷酸的长度、约900个核苷酸的长度、约950个核苷酸的长度、约1,000个核苷酸的长度、约1,500个核苷酸的长度、约2,000个核苷酸的长度、约2,500个核苷酸的长度、约3,000个核苷酸的长度、约3,500个核苷酸的长度、约4,000个核苷酸的长度、约4,500个核苷酸的长度或约5,000个核苷酸的长度。

在一些实施例中，本文披露的mRNA可以包含3'UTR，其包含以下中的一者或多者：多腺苷酸化信号、影响mRNA在细胞中的位置的稳定性的蛋白质的结合位点或miRNA的一个或多个结合位点。在一些实施例中，3'UTR可以具有50至5,000个核苷酸或更长的长度。在一些实施例中，3'UTR可以具有50至1,000个核苷酸或更长的长度。在一些实施例中，3'UTR具有至少约50个核苷酸的长度、约100个核苷酸的长度、约150个核苷酸的长度、约200个核苷酸的长度、约250个核苷酸的长度、约300个核苷酸的长度、约350个核苷酸的长度、约400个核苷酸的长度、约450个核苷酸的长度、约500个核苷酸的长度、约550个核苷酸的长度、约600个核苷酸的长度、约650个核苷酸的长度、约700个核苷酸的长度、约750个核苷酸的长度、约800个核苷酸的长度、约850个核苷酸的长度、约900个核苷酸的长度、约950个核苷酸的长度、约1,000个核苷酸的长度、约1,500个核苷酸的长度、约2,000个核苷酸的长度、约2,500个核苷酸的长度、约3,000个核苷酸的长度、约3,500个核苷酸的长度、约4,000个核苷酸的长度、约4,500个核苷酸的长度或约5,000个核苷酸的长度。

在一些实施例中，本文披露的mRNA可以包含5'或3'UTR，其源自与由mRNA转录物编码的基因不同的基因(即，UTR是异源UTR)。

在某些实施例中，5'和/或3'UTR序列可以源自稳定的mRNA(例如，珠蛋白、肌动蛋白、GAPDH、微管蛋白、组蛋白或柠檬酸循环酶)，以增加mRNA的稳定性。例如，5'UTR序列可以包括部分序列的CMV即早期1(IE1)基因或其片段，以改善mRNA的核酸酶抗性和/或改善mRNA的半衰期。还考虑了将编码人生长激素(hGH)的序列或其片段包括到mRNA的3'端或非翻译区。典型地，相对于其未经修饰的对应物，这些修饰可以改善mRNA的稳定性和/或药代动力学特性(例如，半衰期)，并且包括例如为改善mRNA对体内核酸酶消化的这种抗性而进行的修饰。

示例性5'UTR包括源自CMV即早期1(IE1)基因的序列(美国公开号2014/0206753和2015/0157565，其中的每一个通过援引并入本文)或序列GGGAUCCUACC(SEQ ID NO:837)(美国公开号2016/0151409，其通过援引并入本文)。

在各种实施例中，5'UTR可以源自TOP基因的5'UTR。TOP基因的特征典型地在于5'-末端寡嘧啶(TOP)束的存在。此外，大多数TOP基因的特征在于生长相关的翻译调节。然而，具有组织特异性翻译调节的TOP基因也是已知的。在某些实施例中，源自TOP基因的5'UTR的5'UTR缺乏5'TOP基序(寡嘧啶束)(例如，美国公开号2017/0029847、2016/0304883、2016/0235864和2016/0166710，其中的每一个通过援引并入本文)。

在某些实施例中，5'UTR源自核糖体蛋白大32(L32)基因(美国公开号2017/0029847，同上)。

在某些实施例中，5'UTR源自羟基类固醇(17-b)脱氢酶4基因(HSD17B4)的5'UTR(美国公开号2016/0166710，同上)。

在某些实施例中，5'UTR源自ATP5A1基因的5'UTR(美国公开号2016/0166710，同上)。

在一些实施例中，使用内部核糖体进入位点(IRES)代替5'UTR。

在一些实施例中，5'UTR包含SEQ ID NO:838所示的核酸序列，并再现如下：

GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACCGGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCGUGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUUGACACG(SEQID NO:838)。

在一些实施例中，3'UTR包含SEQ ID NO:839所示的核酸序列，并再现如下：

CGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCC UGGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUU AAGUUGCAUC(SEQ ID NO:839)。

5'UTR和3'UTR进一步详细描述于WO2012/075040(通过援引并入本文)中。

多腺苷酸化尾

如本文所用，术语“poly(A)序列”、“poly(A)尾”和“poly(A)区”是指mRNA分子的3'端处的腺苷核苷酸序列。poly(A)尾可以为mRNA赋予稳定性，并且保护其免于外切核酸酶降解。poly(A)尾可以增强翻译。在一些实施例中，poly(A)尾实质上是同聚物的。例如，100个腺苷核苷酸的poly(A)尾实质上可以具有100个核苷酸的长度。在某些实施例中，poly(A)尾可以被与腺苷核苷酸不同的至少一个核苷酸(例如，不是腺苷核苷酸的核苷酸)中断。例如，100个腺苷核苷酸的poly(A)尾可以具有超过100个核苷酸的长度(包括100个腺苷核苷酸和与腺苷核苷酸不同的至少一个核苷酸或一段核苷酸)。在某些实施例中，poly(A)尾包含序列AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCAUAUGACUAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(SEQ ID NO:840)。

如本文所用，“poly(A)尾”典型地涉及RNA。然而，在本披露的上下文中，该术语同样涉及DNA分子中的对应序列(例如，“poly(T)序列”)。

poly(A)尾可以包括约10至约500个腺苷核苷酸、约10至约200个腺苷核苷酸、约40至约200个腺苷核苷酸或约40至约150个腺苷核苷酸。poly(A)尾的长度可以为至少约10、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450或500个腺苷核苷酸。在一些实施例中，polyA尾包含至少50、至少75或至少100个腺苷核苷酸。

在核酸是RNA的一些实施例中，在RNA体外转录期间从DNA模板获得核酸的poly(A)尾。在某些实施例中，通过常用的化学合成方法在体外获得poly(A)尾，而无需从DNA模板转录。在各种实施例中，使用可商购获得的多腺苷酸化试剂盒和对应的方案通过对RNA进行酶促多腺苷酸化(在RNA体外转录后)，或者替代性地，通过使用固定化的poly(A)聚合酶，例如使用如WO 2016/174271中所述的方法和手段，生成poly(A)尾。

核酸可以包含通过酶促多腺苷酸化获得的poly(A)尾，其中大部分核酸分子包括约100(+/-20)至约500(+/-50)或约250(+/-20)个腺苷核苷酸。

在一些实施例中，核酸可以包含源自模板DNA的poly(A)尾，并且可以额外包含通过酶促多腺苷酸化生成的至少一个额外的poly(A)尾，例如，如WO 2016/091391中所述。

在某些实施例中，核酸包含至少一个多腺苷酸化信号。

在各种实施例中，核酸可以包含至少一个poly(C)序列。

如本文所用，术语“poly(C)序列”旨在是多达约200个胞嘧啶核苷酸的胞嘧啶核苷酸序列。在一些实施例中，poly(C)序列包含约10至约200个胞嘧啶核苷酸、约10至约100个胞嘧啶核苷酸、约20至约70个胞嘧啶核苷酸、约20至约60个胞嘧啶核苷酸或约10至约40个胞嘧啶核苷酸。在一些实施例中，poly(C)序列包含约30个胞嘧啶核苷酸。

化学修饰

本文披露的mRNA可以是经修饰的或未经修饰的。典型地，该mRNA包含至少一个化学修饰。在一些实施例中，本文披露的mRNA可以含有一个或多个典型地增强RNA稳定性的修饰。示例性修饰可以包括骨架修饰、糖修饰或碱基修饰。在一些实施例中，所披露的mRNA可以由天然存在的核苷酸和/或核苷酸类似物(经修饰的核苷酸)(包括但不限于嘌呤(腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G))或嘧啶(胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)))合成。在某些实施例中，所披露的mRNA可以由嘌呤和嘧啶的经修饰的核苷酸类似物或衍生物合成，该类似物或衍生物诸如例如为1-甲基-腺嘌呤、2-甲基-腺嘌呤、2-甲硫基-N-6-异戊烯基-腺嘌呤、N6-甲基-腺嘌呤、N6-异戊烯基-腺嘌呤、2-硫代-胞嘧啶、3-甲基-胞嘧啶、4-乙酰基-胞嘧啶、5-甲基-胞嘧啶、2,6-二氨基嘌呤、1-甲基-鸟嘌呤、2-甲基-鸟嘌呤、2,2-二甲基-鸟嘌呤、7-甲基-鸟嘌呤、肌苷、1-甲基-肌苷、假尿嘧啶(5-尿嘧啶)、二氢-尿嘧啶、2-硫代-尿嘧啶、4-硫代-尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫代-尿嘧啶、5-(羧基羟基甲基)-尿嘧啶、5-氟-尿嘧啶、5-溴-尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-尿嘧啶、5-甲基-2-硫代-尿嘧啶、5-甲基-尿嘧啶、N-尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、5-甲基氨基甲基-尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫代-尿嘧啶、5'-甲氧基羰基甲基-尿嘧啶、5-甲氧基-尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧基乙酸(v)、1-甲基-假尿嘧啶、辫苷、β-D-甘露糖基-辫苷、氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、肽核苷酸、甲基膦酸酯、7-脱氮鸟苷、5-甲基胞嘧啶和肌苷。

在一些实施例中，所披露的mRNA可以包含至少一个化学修饰，包括但不限于假尿苷、N1-甲基假尿苷、2-硫代尿苷、4'-硫代尿苷、5-甲基胞嘧啶、2-硫代-l-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-l-甲基-假尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫代-l-甲基-假尿苷、4-硫代-假尿苷、5-氮杂-尿苷、二氢假尿苷、5-甲基尿苷、5-甲基尿苷、5-甲氧基尿苷和2'-O-甲基尿苷。

在一些实施例中，该化学修饰选自由以下组成的组：假尿苷、N1-甲基假尿苷、5-甲基胞嘧啶、5-甲氧基尿苷及其组合。

在一些实施例中，化学修饰包括N1-甲基假尿苷。典型地，化学修饰包括N1-甲基假尿苷。典型地，化学修饰包括N1-甲基假尿苷来替换每个尿苷，即，100％的U残基是N1-甲基假尿苷。

在一些实施例中，该mRNA中至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％的尿嘧啶核苷酸是经化学修饰的。

在一些实施例中，该ORF中至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％的尿嘧啶核苷酸是经化学修饰的。

此类类似物的制备描述在例如美国专利号4,373,071、美国专利号4,401,796、美国专利号4,415,732、美国专利号4,458,066、美国专利号4,500,707、美国专利号4,668,777、美国专利号4,973,679、美国专利号5,047,524、美国专利号5,132,418、美国专利号5,153,319、美国专利号5,262,530和美国专利号5,700,642。

mRNA合成

本文披露的mRNA可以根据多种方法中的任一种合成。例如，根据本披露的mRNA可以经由体外转录(IVT)而合成。一些用于体外转录的方法描述在例如Geall等人(2013)Semin.Immunol.[免疫学研讨会杂志]25(2):152-159；Brunelle等人(2013)MethodsEnzymol.[酶学方法]530:101-14中。简而言之，典型地用以下进行IVT：含有启动子的线性或环状DNA模板、核糖核苷三磷酸库、可以包括DTT和镁离子的缓冲系统、适当的RNA聚合酶(例如，T3、T7或SP6 RNA聚合酶)、DNA酶I、焦磷酸酶和/或RNA酶抑制剂。确切的条件可以根据特别应用而变化。这些试剂的存在通常在最终mRNA产物中是不希望的，并且这些试剂可以被认为是可以纯化或去除的杂质或污染物，以提供适用于治疗用途的无污染的和/或同质的mRNA。虽然在一些实施例中可能需要从体外转录反应提供的mRNA，但根据本披露可以使用其他来源的mRNA，包括由细菌、真菌、植物和/或动物产生的野生型mRNA。

用于制备本发明LNP组合物的方法

可以通过本领域目前已知的各种技术来制备本发明的LNP。例如，可以根据常规技术制备多层囊泡(MLV)，诸如通过使所选择的脂质沉积在合适的容器或器皿的内壁上(通过将脂质溶解在适当的溶剂中，然后蒸发溶剂以在器皿内部留下薄膜)或通过喷雾干燥来制备。然后可以伴随涡旋运动向器皿中添加水相，这使得MLV形成。然后可以通过将多层囊泡匀浆、超声或挤出来形成单层囊泡(ULV)。另外，可以通过洗涤剂去除技术形成单层囊泡。

各种方法在US2011/0244026、US2016/0038432、US2018/0153822、US 2018/0125989和PCT/US2020/043223(2020年7月23日提交)中有所描述，并可用于实践本披露。一种示例性方法需要通过将其与脂质的混合物混合来包封mRNA，而无需首先将脂质预形成脂质纳米颗粒，如US2016/0038432中所述。另一种示例性方法需要通过将预形成的LNP与mRNA混合来包封mRNA，如US2018/0153822中所述。

在一些实施例中，制备负载mRNA的LNP的方法包括将一种或多种溶液加热到大于环境温度的温度的步骤，该一种或多种溶液是包含预形成的脂质纳米颗粒的溶液、包含mRNA的溶液和包含LNP包封的mRNA的混合溶液。在一些实施例中，该方法包括在混合步骤之前加热mRNA溶液和预形成的LNP溶液中的一者或两者的步骤。在一些实施例中，该方法包括在混合步骤期间加热包含预形成的LNP的溶液、包含mRNA的溶液和包含LNP包封的mRNA的溶液中的一者或多者。在一些实施例中，该方法包括在混合步骤之后加热LNP包封的mRNA的步骤。在一些实施例中，一种或多种溶液被加热到的温度为或高于约30℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃或70℃。在一些实施例中，一种或多种溶液被加热到的温度的范围为约25℃-70℃、约30℃-70℃、约35℃-70℃、约40℃-70℃、约45℃-70℃、约50℃-70℃或约60℃-70℃。在一些实施例中，温度为约65℃。

可以使用各种方法来制备适用于本披露的mRNA溶液。在一些实施例中，可以将mRNA直接溶解在本文所述的缓冲溶液中。在一些实施例中，可以通过在与用于包封的脂质溶液混合之前将mRNA储备溶液与缓冲溶液混合来生成mRNA溶液。在一些实施例中，可以通过紧接在与用于包封的脂质溶液混合之前将mRNA储备溶液与缓冲溶液混合来生成mRNA溶液。在一些实施例中，合适的mRNA储备溶液可以含有在水或缓冲液中的浓度为或大于约0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml、1.0mg/ml、1.2mg/ml、1.4mg/ml、1.5mg/ml、或1.6mg/ml、2.0mg/ml、2.5mg/ml、3.0mg/ml、3.5mg/ml、4.0mg/ml、4.5mg/ml或5.0mg/ml的mRNA。

在一些实施例中，使用泵将mRNA储备溶液与缓冲溶液混合。示例性泵包括但不限于齿轮泵、蠕动泵和离心泵。典型地，将缓冲溶液以大于mRNA储备溶液的速率的速率混合。例如，缓冲溶液可以按mRNA储备溶液的速率的至少1x、2x、3x、4x、5x、6x、7x、8x、9x、10x、15x或20x的速率混合。在一些实施例中，将缓冲溶液在范围为约100-6000ml/分钟(例如，约100-300ml/分钟、300-600ml/分钟、600-1200ml/分钟、1200-2400ml/分钟、2400-3600ml/分钟、3600-4800ml/分钟、4800-6000ml/分钟、或60-420ml/分钟)的流速下混合。在一些实施例中，将缓冲溶液以为或大于约60ml/分钟、100ml/分钟、140ml/分钟、180ml/分钟、220ml/分钟、260ml/分钟、300ml/分钟、340ml/分钟、380ml/分钟、420ml/分钟、480ml/分钟、540ml/分钟、600ml/分钟、1200ml/分钟、2400ml/分钟、3600ml/分钟、4800ml/分钟或6000ml/分钟的流速混合。

在一些实施例中，将mRNA储备溶液在范围为约10-600ml/分钟(例如，约5-50ml/分钟、约10-30ml/分钟、约30-60ml/分钟、约60-120ml/分钟、约120-240ml/分钟、约240-360ml/分钟、约360-480ml/分钟、或约480-600ml/分钟)的流速下混合。在一些实施例中，将mRNA储备溶液以为或大于约5ml/分钟、10ml/分钟、15ml/分钟、20ml/分钟、25ml/分钟、30ml/分钟、35ml/分钟、40ml/分钟、45ml/分钟、50ml/分钟、60ml/分钟、80ml/分钟、100ml/分钟、200ml/分钟、300ml/分钟、400ml/分钟、500ml/分钟或600ml/分钟的流速混合。

将所需mRNA掺入脂质纳米颗粒中的过程称为“加样”。示例性方法描述于Lasic等人,FEBS Lett.[FEBS通讯](1992)312:255-8中。LNP掺入的核酸可以完全或部分位于脂质纳米颗粒的内部空间中，脂质纳米颗粒膜的双层膜内，或与脂质纳米颗粒膜的外表面相关。将mRNA掺入脂质纳米颗粒中在本文中也称为“包封”，其中核酸完全或基本上包括在脂质纳米颗粒的内部空间内。

合适的LNP可以按各种尺寸制备。在一些实施例中，减小的脂质纳米颗粒尺寸与mRNA的更有效递送相关。选择适当的LNP尺寸可以考虑靶细胞或组织的位点以及在某种程度上脂质纳米颗粒将用于的应用。

本领域已知的多种方法可用于调节脂质纳米颗粒群的大小。本文中的优选方法利用Zetasizer Nano ZS(马尔文帕纳科公司(Malvern Panalytical))来测量LNP粒度。在一种方案中，将10μl的LNP样品与990μl的10％海藻糖混合。将此溶液装入比色皿中，并且然后放入Zetasizer机器中。z-平均直径(nm)或累积量平均值被认为是样品中LNP的平均尺寸。Zetasizer机器还可以用于通过使用动态光散射(DLS)和自相关函数的累积量分析来测量多分散性指数(PDI)。可以通过对所形成的LNP进行超声处理来减小平均LNP直径。间歇超声处理循环可以与准弹性光散射(QELS)评估交替，以指导有效的脂质纳米颗粒合成。

在一些实施例中，大部分纯化LNP(即，大于约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的LNP)的尺寸为约70-150nm(例如，约145nm、约140nm、约135nm、约130nm、约125nm、约120nm、约115nm、约110nm、约105nm、约100nm、约95nm、约90nm、约85nm或约80nm)。在一些实施例中，基本上所有(例如，大于80％或90％)的经纯化的脂质纳米颗粒的尺寸为约70-150nm(例如，约145nm、约140nm、约135nm、约130nm、约125nm、约120nm、约115nm、约110nm、约105nm、约100nm、约95nm、约90nm、约85nm或约80nm)。

在一些实施例中，本发明的组合物中的LNP的平均尺寸小于150nm、小于120nm、小于100nm、小于90nm、小于80nm、小于70nm、小于60nm、小于50nm、小于30nm或小于20nm。

在一些实施例中，本发明的组合物中的大于约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的LNP的尺寸的范围为从约40-90nm(例如，约45-85nm、约50-80nm、约55-75nm、约60-70nm)或约50-70nm(例如，55-65nm)，这特别适合于经由雾化进行肺部递送。

在一些实施例中，通过本披露提供的药物组合物中的LNP的分散性或分子尺寸异质性量度(PDI)小于约0.5。在一些实施例中，LNP的PDI小于约0.5、小于约0.4、小于约0.3、小于约0.28、小于约0.25、小于约0.23、小于约0.20、小于约0.18、小于约0.16、小于约0.14、小于约0.12、小于约0.10或小于约0.08。PDI可以通过如上所述的Zetasizer机器测量。

在一些实施例中，本文提供的药物组合物中大于约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的经纯化的LNP将mRNA包封在每个单独的颗粒内。在一些实施例中，药物组合物中基本上所有(例如，大于80％或90％)的经纯化的脂质纳米颗粒将mRNA包封在每个单独的颗粒内。在一些实施例中，脂质纳米颗粒的封装效率为50％至99％；或大于约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、98％或99％。典型地，用于在本文中使用的脂质纳米颗粒的包封效率为至少90％(例如，至少91％、92％、93％、94％或95％)。

在一些实施例中，LNP的N/P比介于1与10之间。在一些实施例中，脂质纳米颗粒的N/P比高于1、约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7或约8。在进一步的实施例中，本文的典型LNP的N/P比为4。

在一些实施例中，根据本披露的药物组合物含有至少约0.5μg、1μg、5μg、10μg、100μg、500μg或1000μg包封mRNA。在一些实施例中，药物组合物含有约0.1μg至1000μg、至少约0.5μg、至少约0.8μg、至少约1μg、至少约5μg、至少约8μg、至少约10μg、至少约50μg、至少约100μg、至少约500μg或至少约1000μg包封mRNA。

在一些实施例中，mRNA可以通过化学合成或通过DNA模板的体外转录(IVT)来制备。在此方法中，在IVT过程中，使用DNA模板(诸如cDNA或pDNA模板)来产生mRNA转录物，并且将DNA模板通过DNA酶降解。通过深度过滤和切向流过滤(TFF)纯化转录物。通过添加帽和尾进一步修饰经纯化的转录物，并且通过深度过滤和TFF再次纯化经修饰的RNA。

然后在水性缓冲液中制备mRNA，并且将其与含有LNP的脂质组分的两亲溶液混合。用于溶解LNP的四种脂质组分的两亲溶液可以是醇溶液。在一些实施例中，醇是乙醇。水性缓冲液可以是例如柠檬酸盐、磷酸盐、乙酸盐或琥珀酸盐缓冲液，并且可以具有约3.0-7.0(例如，约3.5、约4.0、约4.5、约5.0、约5.5、约6.0或约6.5)的pH。缓冲液可以含有其他组分，诸如盐(例如，钠，钾和/或钙盐)。在特定实施例中，水性缓冲液具有1mM柠檬酸盐、150mMNaCl，pH为3.5或4.5。

用于制备mRNA-LNP组合物的示例性方法涉及将经缓冲的mRNA溶液与脂质的乙醇溶液以受控的均匀方式混合，其中在整个混合过程中维持脂质:mRNA的比率。在此说明性实例中，mRNA在含有柠檬酸一水合物、柠檬酸三钠二水合物和氯化钠的水性缓冲液中呈现。将mRNA溶液添加到溶液(1mM柠檬酸盐缓冲液、150mM NaCl，pH 4.5)中。将四种脂质(例如，阳离子脂质、PEG化脂质、基于胆固醇的脂质和辅助脂质)的脂质混合物溶解在乙醇中。将水性mRNA溶液和乙醇脂质溶液在具有近“无脉动”泵系统的“T”形混合器中以4:1的体积比混合。然后对所得混合物进行下游纯化和缓冲液交换。可以使用透析盒或TFF系统实现缓冲液交换。可以使用TFF来紧接在经由T混合过程形成之后对所得的新生LNP进行浓缩和缓冲液交换。渗滤过程是连续操作，通过以与渗透物流相同的速率添加适当的缓冲液使体积保持不变。

载体

在一方面，本文披露了包含本文披露的核酸的载体。在一些实施例中，可以将本文所述的mRNA克隆到载体中。载体包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。载体还包括表达载体、复制载体、探针生成载体、测序载体和为体外转录(IVT)而优化的载体。

在某些实施例中，载体可用于在宿主细胞中表达mRNA。在各种实施例中，载体可用作IVT的模板。适用于治疗用途的最优选地翻译的IVT mRNA的构建详细披露在Sahin等人(2014).Nat.Rev.Drug Discov.[自然评论药物发现]13,759–780；Weissman(2015).ExpertRev.Vaccines[疫苗专家评审]14,265-281中。

在一些实施例中，本文披露的载体可以从5'至3'包含至少以下元件：RNA聚合酶启动子；编码5'UTR的多核苷酸序列；编码ORF的多核苷酸序列；编码3'UTR的多核苷酸序列；和编码至少一种RNA适体的多核苷酸序列。在一些实施例中，本文披露的载体可以包含编码poly(A)序列和/或多腺苷酸化信号的多核苷酸序列。

已知多种RNA聚合酶启动子。在一些实施例中，启动子可以是T7 RNA聚合酶启动子。其他有用的启动子可以包括但不限于T3和SP6 RNA聚合酶启动子。用于T7、T3和SP6启动子的共有核苷酸序列是已知的。

本文还披露了包含本文披露的载体或核酸的宿主细胞(例如，哺乳动物细胞，例如，人细胞)。“宿主细胞”包括可以是或已经是外源核酸的接受者的个别细胞或细胞培养物。宿主细胞包括单个宿主细胞的后代，并且由于天然的、偶然的或故意的突变和/或变化，后代(在形态学上或总DNA互补物上)可能不一定与原始亲本细胞完全相同。宿主细胞包括用本文披露的核酸或载体体内或体外转染或感染的细胞。

可以使用多种不同方法中的任一种将载体引入靶细胞，例如，商业上可获得的方法，包括但不限于电穿孔(Amaxa Nucleofector-II(德国科隆市阿玛西亚生物系统公司(Amaxa Biosystems,Cologne,Germany)))、(ECM 830(BTX)(马萨诸塞州波士顿市哈佛仪器公司(Harvard Instruments,Boston,Mass.))或Gene Pulser II(科罗拉多州丹佛市伯乐公司(BioRad,Denver,Colo.))、Multiporator(德国汉堡市艾本德公司(Eppendorf,Hamburg,Germany))、使用脂质转染的阳离子脂质体介导的转染、聚合物包封、肽介导的转染、生物射弹颗粒递送系统(诸如“基因枪”)(参见例如，Nishikawa等人(2001).Hum GeneTher.[人类基因疗法]12(8):861-70或TransIT-RNA转染试剂盒(威斯康星州麦迪逊市米卢斯公司(Mirus,Madison,WI))。

用于将载体引入宿主细胞中的化学手段包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠和基于脂质的系统(包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体)。用作体外和体内递送媒剂的示范性胶体系统是脂质体(例如，人工膜囊)。

不管使用何种方法将外源核酸引入宿主细胞中或以其他方式将细胞暴露于本披露的抑制剂，为了证实宿主细胞中mRNA序列的存在，可以进行多种测量。

自我复制RNA、反式复制RNA和非复制RNA

典型地，本文所述的核酸分子是非复制RNA。然而，本文所述的核酸分子可以替代性地是自我复制RNA或反式复制RNA。

自我复制RNA

可以通过使用源自例如甲病毒的复制元件并且用编码目标蛋白(例如，衣原体属物种抗原)的核苷酸序列取代结构病毒蛋白来产生自我复制(或自我扩增)RNA。自我复制RNA典型地是正链分子，该正链分子在递送到细胞后可以直接翻译，并且这种翻译提供RNA依赖性RNA聚合酶，该聚合酶然后从递送的RNA产生反义和有义转录物两者。因此，递送的RNA使得多个子RNA的产生。这些子RNA以及共线性亚基因组转录物可以翻译其自身以提供经编码抗原的原位表达，或可以被转录以提供与递送的RNA具有相同意义的进一步转录物，这些转录物被翻译以提供抗原的原位表达。这一转录序列的总体结果是引入的复制子RNA的数量大量扩增，并且因此编码的抗原成为细胞的主要多肽产物。

一种合适的以这种方式实现自我复制的系统是使用基于甲病毒的复制子。这些复制子是正链(正义链)RNA，其在递送至细胞后导致复制酶(或复制酶-转录酶)的翻译。复制酶被翻译为多蛋白，其自动切割以提供复制复合物，该复制复合物产生正链递送的RNA的基因组链拷贝。这些负(-)链转录物本身可以被转录以产生正(-)链亲本RNA的进一步拷贝，并且也产生编码抗原的亚基因组转录物。因此，亚基因组转录物的翻译导致被感染的细胞在原位表达抗原。合适的甲病毒复制子可以使用来自辛德比斯病毒(Sindbis virus)、塞姆利基森林病毒(Semliki forest virus)、东部马脑炎病毒(eastern equine encephalitisvirus)、委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus)等的复制酶。可以使用突变体或野生型病毒序列，例如，VEEV的减毒TC83突变体已经用于复制子中，参见以下参考文献：WO 2005/113782，其通过援引并入本文。

在一个实施例中，本文所述的每种自我复制RNA编码(i)RNA依赖性RNA聚合酶，其可以从自我复制RNA分子转录RNA，和(ii)衣原体属物种抗原。聚合酶可以是甲病毒复制酶，例如，包含甲病毒蛋白nsP1、nsP2、nsP3和nsP4中的一者或多者。尽管天然甲病毒基因组除了编码非结构复制酶多蛋白之外还编码结构病毒体蛋白，但在某些实施例中，自我复制RNA分子不编码甲病毒结构蛋白。因此，自我复制RNA可能导致细胞中自身基因组RNA拷贝的产生，但不导致含RNA病毒体的产生。无法产生这些病毒体意味着，与野生型甲病毒不同，自我复制RNA分子无法以感染形式使自身永久存在。在野生型病毒中永久存在所必需的甲病毒结构蛋白不存在本披露的自我复制RNA，并且它们的位置被一个或多个编码目标免疫原的基因所取代，使得亚基因组转录物编码免疫原，而不是甲病毒结构病毒体蛋白。自我复制RNA进一步详细描述在WO 2011005799中，将其通过援引并入本文。

反式复制RNA

反式复制(或反式扩增)RNA具有与上述自我复制RNA类似的元件。然而，对于反式复制RNA，使用两种单独的RNA分子。第一RNA分子编码上述RNA复制酶(例如，甲病毒复制酶)，并且第二RNA分子编码目标蛋白(例如，本文所述的衣原体属物种抗原)。RNA复制酶可以复制第一RNA分子和第二RNA分子中的一个或两个，从而大大增加编码目标蛋白的RNA分子的拷贝数。反式复制RNA进一步详细描述在WO 2017162265中，将其通过援引并入本文。

非复制RNA

非复制(或非扩增)RNA是不具有自身复制能力的RNA。

治疗用途

在另一方面，本发明提供了用作药物的本发明的多肽、核酸、组合或组合物。本发明还提供了本发明的多肽、核酸、组合或组合物用于制造药物的用途。该药物可用于治疗或预防本文所述的疾病。本发明进一步提供了一种治疗或预防疾病的方法，该方法包括向有需要的受试者施用本发明的多肽、核酸、组合或组合物。可以例如以有效治疗或预防受试者疾病的量施用本发明的多肽、核酸、组合或组合物。因此可以以有效量施用多肽、核酸、组合或组合物。典型地，治疗是预防性的。

在另一方面，本发明提供了用于在治疗或预防受试者(例如，人)的衣原体属物种感染中使用的本发明的多肽、核酸、组合或组合物。本发明还提供了本发明的多肽、核酸、组合或组合物用于制造药物的用途，该药物用于治疗或预防受试者(例如，人)的衣原体属物种感染。本发明进一步提供了一种治疗或预防受试者(例如，人)的衣原体属物种感染的方法，该方法包括向受试者施用本发明的多肽、核酸、组合或组合物。可以例如以有效治疗或预防受试者的衣原体属物种感染的量施用(即以有效量施用)本发明的多肽、核酸、组合或组合物。这些多肽、核酸、组合或组合物可用于生成针对受试者(例如，人)的衣原体属物种感染的免疫应答。在优选的实施例中，感染是沙眼衣原体感染。

本发明提供了本发明的多肽、核酸、组合或组合物，用于在治疗或预防受试者(例如，人)的沙眼(由沙眼衣原体感染引起的眼部疾病)、由沙眼衣原体引起的生殖道感染、性病性淋巴肉芽肿(由沙眼衣原体引起的疾病)、由沙眼衣原体引起的口咽部感染或由沙眼衣原体引起的直肠感染中使用。本发明还提供了本发明的多肽、核酸、组合或组合物用于制造药物的用途，该药物用于治疗或预防受试者(例如，人)的由沙眼衣原体感染引起的沙眼、由沙眼衣原体引起的生殖道感染、性病性淋巴肉芽肿(由沙眼衣原体引起的疾病)、由沙眼衣原体引起的口咽部感染或由沙眼衣原体引起的直肠感染。本发明进一步提供了一种治疗或预防受试者(例如，人)的由沙眼衣原体感染引起的沙眼、由沙眼衣原体引起的生殖道感染、由沙眼衣原体感染引起的性病性淋巴肉芽肿、由沙眼衣原体引起的口咽部感染或由沙眼衣原体引起的直肠感染的方法，该方法包括向受试者施用本发明的多肽、核酸、组合物或组合物。可以例如以有效治疗或预防受试者的由沙眼衣原体感染引起的沙眼、由沙眼衣原体引起的生殖道感染、由沙眼衣原体感染引起的性病性淋巴肉芽肿、由沙眼衣原体引起的口咽部感染或由沙眼衣原体引起的直肠感染的量施用(即以有效量施用)本发明的多肽、核酸、组合或组合物。在优选的实施例中，感染是沙眼衣原体感染。沙眼可由沙眼衣原体血清变型A、B、Ba或C的感染引起。性病性淋巴肉芽肿可由沙眼衣原体血清变型L1、L2和L3的感染引起。生殖道感染可由血清变型D-K引起。在优选的实施例中，衣原体属物种(例如，沙眼衣原体)感染是生殖道感染。

本发明提供了用于在提供针对受试者(例如，人)的衣原体属物种感染的保护性免疫的方法中使用的本发明的多肽、核酸、组合或组合物。本发明还提供了本发明的多肽、核酸、组合或组合物用于制造药物的用途，该药物用于在提供针对受试者(例如，人)的衣原体属物种感染的保护性免疫的方法中使用。本发明进一步提供了一种提供针对受试者(例如，人)的衣原体属物种感染的保护性免疫的方法，该方法包括向受试者施用本发明的多肽、核酸、组合或组合物。可以例如以有效提供针对受试者的衣原体属物种感染的保护性免疫的量施用(即以有效量施用)本发明的多肽、核酸、组合或组合物。在优选的实施例中，感染是沙眼衣原体感染。

本发明的多肽、核酸、组合或组合物可在受试者中引发T细胞应答(例如，抗原特异性T细胞应答)。本发明的多肽、核酸、组合或组合物可在受试者中引发CD4+ T细胞应答和/或CD8+ T细胞应答(例如，CD4+ T细胞应答)。在一些实施例中，本发明的多肽、核酸、组合或组合物可在受试者中引发产IFNγ的T细胞，诸如产IFNγ的CD4+ T细胞和/或产IFNγ的CD8+T细胞(例如，产IFNγ的CD4+ T细胞)。在一些实施例中，本发明的多肽、核酸、组合或组合物可引发CD4+IFNγ+IL2+ TNFα+ T细胞(即产生IFNγ、IL2和TNFα的CD4+ T细胞)。在一些实施例中，本发明的多肽、核酸、组合或组合物可引发CD8+IFNγ+IL2-TNFα+ T细胞或产生IFNγ和TNFα的CD8+ T细胞。在一些实施例中，本发明的多肽、核酸、组合或组合物可在受试者中引发交叉血清变型T细胞免疫应答，即，针对衣原体属物种的两种或更多种血清变型具有交叉反应性(例如，针对沙眼衣原体的两种或更多种血清变型具有交叉反应性)的T细胞免疫应答。T细胞的细胞因子产生可通过T细胞(例如。从受试者获得的T细胞)的细胞内细胞因子染色或通过检测分泌的细胞因子(例如，通过ELISA)来测量。本发明的多肽、核酸、组合或组合物可在受试者中引发Th1应答(例如，Th1 T细胞应答)。

本发明的多肽、核酸、组合或组合物可在受试者中引发抗体(例如，IgG)应答，诸如中和抗体(IgG)应答。抗体可以是任何同种型(例如，IgA、IgG、IgM，即α、γ或μ重链)，但通常是IgG。在IgG同种型内，抗体可以是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚类。抗体可具有κ或λ轻链。“中和抗体”是中和衣原体属物种抗原在受试者中的生物效应的抗体。在一些实施例中，本发明的多肽、核酸、组合或组合物可在受试者中引发交叉血清变型抗体应答，即，针对衣原体属物种的两种或更多种血清变型具有交叉反应性(例如，针对沙眼衣原体的两种或更多种血清变型具有交叉反应性)的抗体应答。

在一些实施例中，本发明的多肽、核酸、组合或组合物可引发如本文所述的T细胞应答和/或如本文所述的抗体应答。

向受试者施用本发明的多肽、核酸、组合或组合物可使受试者在暴露于衣原体属物种细菌或衣原体属物种抗原时产生衣原体属物种抗原应答性CD4记忆T细胞群或CD8记忆T细胞群(例如，CD4 T细胞记忆群)。衣原体属物种应答性CD4记忆T细胞群可赋予抗再感染的“灭菌”免疫(即完全保护性免疫)。

向受试者施用本发明的多肽、核酸、组合或组合物可使受试者在暴露于衣原体属物种细菌或衣原体属物种抗原时产生衣原体属物种抗原应答性记忆B细胞群。衣原体属物种应答性记忆B细胞群可赋予抗再感染的“灭菌”免疫(即完全保护性免疫)。

本发明的多肽、核酸、组合或组合物可用于诱导初次免疫应答和/或加强免疫应答。

本发明的多肽、核酸、组合或组合物可以施用于受试者以允许受试者产生和/或维持对衣原体属物种感染的灭菌免疫。衣原体属物种感染后，可在免疫后受试者中提供或增强保护性免疫。

本发明的多肽、核酸、组合或组合物可用于初免-加强疫苗接种方案。根据本发明，针对衣原体属物种感染的保护性免疫可通过施用包含本发明的多肽、核酸、组合或组合物的初始疫苗，然后施用加强疫苗来提供。加强疫苗可以与初始疫苗相同。

在某些实施例中，受试者是脊椎动物，例如哺乳动物，诸如人或兽医哺乳动物(例如猫、狗、马、母牛、绵羊、牛、鹿、山羊、猪、啮齿动物(例如小鼠))。在优选的实施例中，受试者是人。受试者(例如，人类受试者)可以是男性或女性。在一些实施例中，人类受试者的年龄可以是7-50(例如，9-44)岁。

施用模式

本发明的多肽、核酸、组合或组合物可以肠胃外(例如，肌内、皮内、皮下、腹膜内、静脉内或组织间隙)施用或通过直肠、口腔、阴道、局部、透皮、鼻内、舌下、眼部、耳部、肺部或其他粘膜施用。在一些实施例中，本发明的组合物肌内施用。在一些实施例中，本发明的组合物通过粘膜施用递送。

在某些实施例中，提供了用于在肌内(IM)注射中使用的本发明的多肽、核酸、组合或组合物(例如，组合物)。多肽、核酸、组合或组合物(例如，组合物)可以施用于受试者的大腿或上臂，例如，其上臂三角肌。在一些实施例中，多肽、核酸、组合或组合物(例如，组合物)在预填充的针筒或注射器(例如，单室的或多室的)中提供。注射可以通过针(例如，皮下注射针)进行，但可以替代性地使用无针注射。典型的肌内剂量为0.5ml。在一些实施例中，多肽、核酸、组合或组合物(例如，组合物)被提供以用于在吸入中使用，并且在预填充的泵、雾化器或吸入器中提供。

在某些实施例中，本发明的多肽、核酸、组合或组合物(例如，组合物)被提供以用于在皮肤注射中使用，例如，在皮肤的表皮、真皮或皮下组织中。在一些实施例中，组合物在适于皮肤注射的装置中提供，诸如针(例如，表皮、真皮或皮下组织针)、无针装置、微针装置或微突起阵列装置。适于根据本发明进行皮肤注射的微针或微突起阵列装置的实例描述于US 20230270842A1、US20220339416 A1、US20210085598 A1、US20200246450A1、US20220143376 A1、US20180264244 A1、US20180263641 A1、US 20110245776A1中。

本发明的组合物可用于引发全身和/或粘膜免疫。

剂量治疗可以是单剂量时间表或多剂量时间表。在初次免疫时间表中和/或在加强免疫时间表中可以使用多个(例如，两个或三个)剂量。初次剂量时间表之后可以是加强剂量时间表。多个剂量(例如，两个剂量或三个)典型地将间隔至少1周(例如，约2周、约3周、约4周、约6周、约8周、约10周、约12周、约16周等)施用于有需要的受试者，以实现期望的治疗或预防效果。剂量(例如，初免剂量和加强剂量)可以隔开例如1周、2周、3周、4周、一个月、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月、一年、两年、五年或十年的间隔。

本发明的组合物可以是即用配制品的形式，例如，本发明的组合物可以是冻干的。此类组合物可在临用前用生理缓冲液(例如，PBS)重构。本发明的组合物可以以水溶液或冷冻水溶液的形式提供，并且可以直接施用于受试者而无需重构(如果先前冷冻，则在解冻后)。

在包含如本文所述的mRNA的组合物的一些实施例中，单剂量的组合物含有1至400μg，诸如1-50μg如本文所述的mRNA(例如，单价或多价的)。例如，单剂量可含有约2.5μg、约5μg、约7.5μg、约10μg、约12.5μg或约15μg如本文所述的mRNA，例如用于肌内(IM)注射。

在一些实施例中，组合物包含编码如本文所述的不同多肽的如本文所述的两种核酸(例如，两种mRNA)，并且这些核酸按1:1的重量比存在。在一些实施例中，组合物包含编码如本文所述的不同多肽的如本文所述的三种核酸(例如，三种mRNA)，并且这些核酸以1:1:1的重量比存在。典型地，本文所述的LNP共包封(a)包含编码如本文所述的经修饰的MOMP多肽的核苷酸序列的如本文所述的核酸；(b)包含编码如本文所述的嵌合MOMP VD多肽的核苷酸序列的如本文所述的核酸；(c)包含编码如本文所述的衣原体属物种CT443多肽的核苷酸序列的如本文所述的核酸；和(d)包含编码如本文所述的衣原体属物种CT584多肽的核苷酸序列的如本文所述的核酸。典型地，组合物包含编码如本文所述的不同多肽的如本文所述的四种核酸(例如，四种mRNA)。典型地，这些核酸按1:1:1:1的重量比存在。

在进一步的实施例中，本发明的组合物可以作为含有多种(例如，2、3或4种)LNP(各自针对不同的抗原)的多价单剂量提供，并且每种LNP具有例如2.5μg、约5μg、约7.5μg、约10μg、约12.5μg或约15μg的mRNA量。

在一些实施例中，向受试者施用一种或多种本发明的核酸组合物。核酸组合物可包含含有编码如本文所述的多肽抗原的核苷酸序列的核酸。核酸组合物可以同时、分开或依次施用。在一些实施例中，向受试者施用本发明的核酸组合。核酸组合包括如本文所述的两种或更多种核酸的组合。组合内的核酸可以同时、分开或依次施用。

在一些实施例中，向受试者施用一种或多种本发明的多肽组合物。多肽组合物可包含如本文所述的多肽抗原。多肽组合物可以同时、分开或依次施用。在一些实施例中，向受试者施用本发明的多肽组合。多肽组合包括本文所述的两种或多种多肽的组合。组合内的核酸可以同时、分开或依次施用。

在一些实施例中，向受试者施用一种或多种本发明的核酸组合物和一种或多种本发明的多肽组合物。在一些实施例中，向受试者施用包含编码经修饰的MOMP多肽的核苷酸序列的核酸组合物(和任选地包含编码嵌合MOMP VD多肽的核苷酸序列的核酸组合物)以及包含一种或多种多肽的多肽组合物，该一种或多种多肽包含非MOMP抗原的多肽序列。在一些实施例中，向受试者施用两种或更多种多肽组合物，其各自包含含有非MOMP抗原的多肽序列的多肽。核酸组合物和一种或多种多肽组合物可以同时、分开或依次施用。

分开或依次施用的组合物可以在彼此的12个月内、在彼此的六个月内、或在彼此的一个月或更短时间内(例如，10天内)施用。组合物可以在彼此的7天内、3天内、2天内或24小时内施用。同时施用可涉及同时施用本发明的组合物。同时施用可包括在彼此的12小时内、在彼此的6小时内、在彼此的3小时内、在彼此的2小时内或在彼此的1小时内(典型地在到临床中心就诊的同一时间内)将本发明的组合物施用于患者。

本发明还提供了一种试剂盒，该试剂盒在一个或多个容器中包含一种或多种本文所述的组合物，或在一个或多个容器中提供一种或多种如本文所述的组合物并在另一个容器中提供用于重构的生理缓冲液。该一个或多个容器可以含有单次使用剂量或多次使用剂量。容器可以是预处理的玻璃小瓶或安瓿。试剂盒可包括使用说明书。

本文还提供了一种用于检测和定量血清样品中针对一种或多种如本文所述的多肽的抗体的方法。例如，可以检测和定量针对MOMP、CT443和/或CT584多肽的抗体。针对每种多肽的抗体的检测和定量可以分开进行或同时进行，例如，作为单个多孔板中的一组。因此，本文进一步提供了包含用重组多肽MOMP、CT443和CT584中的每一者包被的孔的多孔板。

定义

术语“包含”涵盖“包括”以及“由…组成”，例如，“包含”X的组合物可以仅由X组成或者可以包括额外的物质，例如，X+Y。

与数值x相关的术语“约”是任选的，并且意指例如x+/-10％。

术语“一个/种(a或an)”实体是指一个或多个该实体；例如，“核苷酸序列”应理解为表示一个或多个核苷酸序列。因此，术语“一个/种”(a/an)、“一个或多个”和“至少一个”在本文中可以互换使用。

此外，本文中使用“和/或”应当理解为在有或没有另一者的情况下明确披露了两个指定特征或组分中的每一者。因此，如在本文中在“A和/或B”等短语中使用的术语“和/或”旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独)和“B”(单独)。同样，如在“A、B和/或C”等短语中所用的术语“和/或”意图涵盖以下方面中的每一个：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；以及C(单独)。

如本文所用，术语“衣原体属物种”是指衣原体属的各物种，其包括沙眼衣原体、流产衣原体、肺炎衣原体、鼠衣原体(Chlamydia muridarum)、鹦鹉热衣原体、反刍动物衣原体、猫衣原体和豚鼠衣原体物种。在本发明的优选实施例中，衣原体属物种为沙眼衣原体。

如本文所用，术语“有效量”是指足以实现有益的或期望的结果的量(例如，如本文所述的核酸、多肽、组合或组合物的量)。有效量可以以一种或多种施用方案、应用或剂量施用，并且不限于特定的配制品或施用途径。术语“有效量”包括例如治疗有效量和/或预防有效量。如本文所用，术语“有效量”是指在以适用于任何医学治疗的合理益处/风险比治疗或预防感染、疾病、病症和/或病状中有效产生一些期望的治疗或预防作用的量(例如，如本文所述的核酸、多肽、组合或组合物的量)。

术语“原生小体”是指衣原体属物种细菌的一种形式。原生小体可以从受感染的细胞中释放出来，并且可以从一个受试者传播到另一个受试者。

当提及本披露的多肽时，术语“片段”或“变体”包括保留参考多肽的至少一些性质(例如，多肽的特异性抗原性质或多肽有助于诱导抗体结合的能力)的任何多肽。多肽的片段包括N末端和/或C末端截短的片段，例如C末端片段和N末端片段，以及缺失片段，但不包括天然存在的全长多肽(或成熟多肽)。缺失片段是指从全长多肽中缺失1个或更多个内部氨基酸的多肽。多肽的变体包括如上所述的片段，以及由于氨基酸取代、缺失或插入而具有改变的氨基酸序列的多肽。变体可以是天然存在的或非天然存在的。可以使用本领域已知的诱变技术产生非天然存在的变体。变体多肽可以包含保守或非保守氨基酸取代、缺失或添加。此类变异(即截短和/或氨基酸取代、缺失或插入)可以发生在氨基酸水平上，或相应地发生在核酸水平上。

关于序列的同一性在本文中被定义为，在比对序列并在必要时引入缺口以实现最大序列同一性百分比之后并且在不将任何保守取代视为序列同一性的一部分的情况下，候选序列中的与参考氨基酸序列相同的核酸或氨基酸残基的百分比。

序列同一性可以通过通常用于比较两个多肽的氨基酸或两个多核苷酸的核酸的位置相似性的标准方法来确定。例如，使用计算机程序诸如BLAST或FASTA，对两个多肽进行比对以使它们相应的氨基酸最佳匹配(沿一个或两个序列的全长，或沿一个或两个序列的预定部分)。程序提供默认开放罚分和默认空位罚分，并且可以结合该计算机程序使用PAM250等评分矩阵[标准评分矩阵；参见Dayhoff等人,Atlas of Protein Sequence andStructure[蛋白质序列与结构图集],第5卷,增刊3(1978)]。同一性百分比可以计算为：相同匹配的总数乘以100，然后除以匹配跨度内较长序列的长度与为使两个序列对齐而引入较短序列中的间隙数的总和。

如本文所用，术语“试剂盒”是指一组经包装的相关组分，诸如一种或多种化合物或组合物和一种或多种相关材料，诸如溶剂、溶液、缓冲液、说明书或干燥剂。

如本文所用，术语“连接”或“附着”是指第一氨基酸序列或核苷酸序列分别与第二氨基酸序列或核苷酸序列共价连接(例如，分泌信号肽氨基酸序列和/或异源跨膜结构域氨基酸序列与衣原体属物种多肽氨基酸序列连接)。第一氨基酸或核苷酸序列可以直接与第二氨基酸或核苷酸序列连接，或者替代性地，插入序列可以将第一序列与第二序列共价连接。术语“连接”不仅意指第一氨基酸序列在C末端或N末端处与第二氨基酸序列的融合，而且包括将整个第一氨基酸序列(或第二氨基酸序列)插入到第二氨基酸序列(或分别为第一氨基酸序列)中的任何两个氨基酸中。在一个实施例中，第一氨基酸序列可以通过肽键或接头与第二氨基酸序列连接。第一核苷酸序列可以通过磷酸二酯键或接头与第二核苷酸序列连接。接头可以是肽或多肽(对于多肽链)或核苷酸或核苷酸链(对于核苷酸链)或任何化学部分(对于多肽和多核苷酸链两者)。术语“连接”也由连字符(-)表示。

如本文所用，术语“原生”是指天然存在的序列。例如，原生衣原体属物种MOMP多肽是天然存在的衣原体属物种MOMP多肽。实施例

本发明至少包括下列带编号的实施例：

1.一种核酸，该核酸包含编码经修饰的主要外膜蛋白(MOMP)多肽的核苷酸序列，其中该经修饰的MOMP多肽具有包含原生衣原体属物种MOMP多肽的两个或更多个保守结构域序列和这些保守结构域序列之间的非原生环序列的氨基酸序列。

2.如实施例1所述的核酸，其中该衣原体属物种为沙眼衣原体。

3.如实施例1或2所述的核酸，其中该经修饰的MOMP多肽不包含该两个或更多个保守结构域序列之间的原生衣原体属物种MOMP可变结构域。

4.如实施例1-3中任一项所述的核酸，其中该经修饰的MOMP多肽包含原生衣原体属物种MOMP多肽的五个保守结构域序列，任选地其中

(i)该经修饰的MOMP多肽包含原生衣原体属物种MOMP多肽的所有五个全长保守结构域；

(ii)该经修饰的MOMP多肽的保守结构域序列与任何血清变型的衣原体属物种的原生MOMP多肽的保守结构域(例如，表1中定义的保守结构域)具有至少95％同一性；

(iii)该经修饰的MOMP多肽的保守结构域总体上与原生MOMP多肽(例如，血清变型E MOMP)的保守结构域具有至少95％的序列同一性；以及/或者

(iv)该经修饰的MOMP多肽的保守结构域序列缺乏原生衣原体属物种MOMP保守结构域序列的多达3个或5个氨基酸。

5.如实施例1-4中任一项所述的核酸，其中

(i)该经修饰的MOMP多肽包含每个保守结构域序列之间的非原生环序列；

(ii)该非原生环序列与任何血清变型(例如，沙眼衣原体的血清变型D、E、F或G)的任何原生衣原体属物种MOMP VD(VD1、VD2、VD3或VD4)序列具有不超过40％的同一性。

6.如实施例4所述的核酸，其中该经修饰的MOMP多肽包含四个非原生环序列，并且不包含这些保守结构域序列之间的任何原生衣原体属物种MOMP可变结构域。

7.如实施例1-6中任一项所述的核酸，其中该经修饰的MOMP多肽不包含任何这些保守结构域序列之间的任何原生衣原体属物种MOMP可变结构域。

8.如实施例1-7中任一项所述的核酸，其中

(i)该非原生环序列的长度介于3个与30个氨基酸之间，例如，长度介于4个与20个氨基酸之间；以及/或者

(ii)该两个或更多个保守结构域序列通过非原生环序列连接，使得这些保守结构域序列形成β-桶结构(例如，由反平行β链组成)，任选地其中该β-桶结构通过计算机进行预测(例如，使用Alphafold2(深思考公司)软件)。

9.如实施例1-8中任一项所述的核酸，其中

(i)替代VD1的非原生环序列包含根据SEQ ID NO:462或466(例如，SEQ ID NO:462)的序列；

(ii)替代VD2的非原生环序列包含根据SEQ ID NO:463或467(例如，SEQ ID NO:463)的序列；

(iii)替代VD3的非原生环序列包含根据SEQ ID NO 464或468(例如，SEQ ID NO:464)的序列；以及/或者

(iv)替代VD4的非原生环序列包含根据SEQ ID NO:465或469(例如，SEQ ID NO:465)的序列，

例如，其中该经修饰的MOMP多肽包含分别替换VD1、VD2、VD3和VD4的根据SEQ IDNO 462、463、464和465的四个非原生环序列。

10.如实施例1-9中任一项所述的核酸，其中该经修饰的MOMP多肽在对应于原生衣原体属物种MOMP多肽的保守结构域序列中的半胱氨酸残基的一个或多个(例如，所有)位置处包含单个氨基酸取代，任选地其中该单个氨基酸取代是用丝氨酸取代半胱氨酸。

11.如实施例1-10中任一项所述的核酸，其中该经修饰的MOMP多肽在对应于原生衣原体属物种MOMP多肽中的糖基化位点、任选地N-糖基化位点的一个或多个(例如，所有)位置处包含突变，任选地其中该突变是单个氨基酸取代。

12.如实施例1-11中任一项所述的核酸，其中该经修饰的MOMP多肽进一步包含分泌信号肽序列。

13.如实施例12所述的核酸，其中该分泌信号肽序列是病毒分泌信号肽序列，其任选地选自由以下组成的组：流感血凝素(HA)分泌信号肽序列、SARS CoV-2刺突分泌信号肽序列、VZV gB分泌信号肽序列、VZV gE分泌信号肽序列、VZV gI分泌信号肽序列、VZV gK分泌信号肽序列、麻疹F蛋白分泌信号肽序列、风疹E1蛋白分泌信号肽序列、风疹E2蛋白分泌信号肽序列、腮腺炎F蛋白分泌信号肽序列、埃博拉GP蛋白分泌信号肽序列和天花6kDaIC蛋白分泌信号肽序列，任选地其中该分泌信号肽序列包含根据表2或表2.1中的SEQ ID NO之一的氨基酸序列。

14.如实施例13所述的核酸，其中该分泌信号肽序列包含甲型流感病毒的HA蛋白的分泌信号肽序列，例如，其中该分泌信号肽序列包含根据SEQ ID NO:187或SEQ ID NO:188的序列。

15.如实施例1-14中任一项所述的核酸，其中该经修饰的MOMP多肽包含根据SEQID NO:486-489中任一者的序列或与其具有至少70％(例如，至少90％或95％)同一性的序列，例如，其中该经修饰的MOMP多肽包含根据SEQ ID NO:486的序列或与其具有至少70％(例如，至少90％或95％)同一性的序列。

16.如实施例1-15中任一项所述的核酸，其中该核酸包含根据SEQ ID NO:551-566中任一者的核苷酸序列或与其具有至少50％同一性的序列，例如，其中该核酸包含根据SEQID NO:551的核苷酸序列或与其具有至少50％(例如，至少75％)同一性的序列。

17.如实施例1-16中任一项所述的核酸，其中该核酸是信使RNA(mRNA)，任选地其中

(i)该mRNA包含至少一个5'非翻译区(5'UTR)、至少一个3'非翻译区(3'UTR)和/或至少一个多腺苷酸化(poly(A))序列；

(ii)该mRNA是未经修饰的或包含至少一个化学修饰，任选地其中该mRNA包含至少一个化学修饰，例如，其中该化学修饰包括N1-甲基假尿苷；以及/或者

(iii)该mRNA是自我复制mRNA或非复制mRNA，例如，非复制mRNA。

18.如实施例17所述的核酸，其中该mRNA包含以下结构元件或由以下结构元件组成(例如，由以下结构元件组成)：

-5'帽，例如，具有以下结构的帽：

-5'非翻译区(5'UTR)，其具有根据SEQ ID NO:838的核酸序列；

-蛋白质编码区，其具有根据SEQ ID NO:213的核酸序列；

-3'非翻译区(3'UTR)，其具有根据SEQ ID NO:839的核酸序列；以及

-polyA尾。

19.如实施例18所述的核酸，其中该mRNA是经化学修饰的，并且其中该化学修饰包括以下或由以下组成(例如，由以下组成)：N1-甲基假尿苷来替换每个尿苷。

20.一种经修饰的主要外膜蛋白(MOMP)多肽，该经修饰的MOMP多肽具有包含原生衣原体属物种MOMP多肽的两个或更多个保守结构域序列和这些保守结构域序列之间的非原生环序列的氨基酸序列。

21.如实施例20所述的经修饰的MOMP多肽，其中该经修饰的MOMP多肽不包含该两个或更多个保守结构域序列之间的原生衣原体属物种MOMP可变结构域。

22.如实施例20或21所述的经修饰的MOMP多肽，其中该经修饰的MOMP多肽包含原生衣原体属物种MOMP多肽的五个保守结构域序列，任选地其中(i)该经修饰的MOMP多肽包含原生衣原体属物种MOMP多肽的所有五个全长保守结构域；以及/或者(ii)该经修饰的MOMP多肽的保守结构域总体上与原生MOMP多肽(例如，血清变型E MOMP)的保守结构域具有至少95％的序列同一性。

23.如实施例20-22中任一项所述的经修饰的MOMP多肽，其中该经修饰的MOMP多肽包含每个保守结构域序列之间的非原生环序列。

24.如实施例22所述的经修饰的MOMP多肽，其中该经修饰的MOMP多肽包含四个非原生环序列，并且不包含这些保守结构域序列之间的原生衣原体属物种MOMP可变结构域。

25.如实施例20-24中任一项所述的经修饰的MOMP多肽，其中该经修饰的MOMP多肽不包含任何这些保守结构域序列之间的任何原生衣原体属物种MOMP可变结构域。

26.如实施例20-25中任一项所述的经修饰的MOMP多肽，其中该非原生环序列的长度介于3个与30个氨基酸之间，例如，长度介于4个与20个氨基酸之间。

27.如实施例20-26中任一项所述的经修饰的MOMP多肽，其中

例如，其中该经修饰的MOMP多肽能够包含分别替换VD1、VD2、VD3和VD4的根据SEQID NO 462-465的四个非原生环序列。

28.如实施例20-27中任一项所述的经修饰的MOMP多肽，其中该经修饰的MOMP多肽在对应于原生衣原体属物种MOMP多肽的保守结构域序列中的半胱氨酸残基的一个或多个(例如，所有)位置处包含单个氨基酸取代，任选地其中该单个氨基酸取代是用丝氨酸取代半胱氨酸。

29.如实施例20-28中任一项所述的经修饰的MOMP多肽，其中该经修饰的MOMP多肽在对应于原生衣原体属物种MOMP多肽中的N-糖基化位点的一个或多个(例如，所有)位置处包含突变，任选地其中该突变是单个氨基酸取代。

30.如实施例20-29中任一项所述的经修饰的MOMP多肽，其中该经修饰的MOMP多肽包含根据SEQ ID NO:486-489中任一者的序列或与其具有至少70％(例如，至少90％或95％)同一性的序列，例如，其中该经修饰的MOMP多肽包含根据SEQ ID NO:486的序列或与其具有至少70％(例如，至少90％或95％)同一性的序列。

31.一种组合物，该组合物包含如实施例1-19中任一项所述的核酸，优选地其中该组合物是免疫原性组合物。

32.一种组合物，该组合物包含如实施例20-30中任一项所述的多肽，优选地其中该组合物是免疫原性组合物。

33.如实施例31所述的组合物，其中该组合物进一步包含：

(i)包含编码嵌合衣原体属物种MOMP可变结构域(VD)多肽的核苷酸序列的核酸，其中该嵌合MOMP VD多肽包含含有该衣原体属物种的不同血清变型的两个或更多个衣原体属物种MOMP VD序列的氨基酸序列；以及/或者

(ii)以下中的一者或多者(例如，一者、两者、三者或四者)：

(a)包含编码衣原体属物种CT443多肽的核苷酸序列的核酸；

(b)包含编码衣原体属物种CT584多肽的核苷酸序列的核酸；

(c)包含编码衣原体属物种CT600多肽的核苷酸序列的核酸；以及

(d)包含编码衣原体属物种CT812多肽的核苷酸序列的核酸。

34.如实施例33所述的组合物，其中该组合物包含

(i)的核酸和(ii)(a)的核酸；

(i)的核酸和(ii)(b)的核酸；或者

(i)的核酸、(ii)(a)的核酸和(ii)(b)的核酸；

例如，其中该组合物包含(i)的核酸、(ii)(a)的核酸和(ii)(b)的核酸。

35.如实施例33或34所述的组合物，其中一种或多种核酸是mRNA，任选地其中

(iii)该mRNA是自我复制mRNA或非复制mRNA，例如，非复制mRNA。

36.如实施例31或33-35中任一项所述的组合物，其中该组合物进一步包含脂质纳米颗粒(LNP)，任选地其中该核酸被包封在该LNP中。

37.如实施例32所述的组合物，其中该组合物进一步包含：

(i)嵌合衣原体属物种MOMP可变结构域(VD)多肽，其中该嵌合MOMP VD多肽包含含有该衣原体属物种的不同血清变型的两个或更多个衣原体属物种MOMP VD序列的氨基酸序列；以及/或者

(ii)以下中的一者或多者(例如，一者、两者、三者或四者)：

(a)包含衣原体属物种CT443多肽的氨基酸序列的多肽；

(b)包含衣原体属物种CT584多肽的氨基酸序列的多肽；

(c)包含衣原体属物种CT600多肽的氨基酸序列的多肽；或者

(d)包含衣原体属物种CT812多肽的氨基酸序列的多肽，

例如，其中该组合物包含

(i)的多肽和(ii)(a)的多肽；或者

(i)的多肽和(ii)(b)的多肽；或者

(i)的多肽、(ii)(a)的多肽和(ii)(b)的多肽，

例如，其中该组合物包含(i)的多肽、(ii)(a)的多肽和(ii)(b)的多肽。

38.如实施例33-37中任一项所述的组合物，其中该衣原体属物种为沙眼衣原体。

39.如实施例33-38中任一项所述的组合物，其中该嵌合MOMP VD多肽包含位于该两个或更多个MOMP VD序列中的每一个序列侧翼的原生衣原体属物种MOMP多肽的保守结构域序列部分。

40.如实施例33-39中任一项所述的组合物，其中该嵌合MOMP VD多肽包含四种不同血清变型的MOMP VD序列，任选地其中这些不同血清变型选自沙眼衣原体的血清变型D、E、F或G。

41.如实施例33-40中任一项所述的组合物，其中该嵌合MOMP VD多肽包含：

(i)该衣原体属物种的不同血清变型的两个MOMP VD1序列；以及/或者

(ii)该衣原体属物种的不同血清变型的两个MOMP VD2序列；以及/或者

(iii)一个MOMP VD3序列；以及/或者

(iv)该衣原体属物种的不同血清变型的两个MOMP VD4序列，

任选地其中这些不同血清变型选自沙眼衣原体的血清变型D、E、F或G。

42.如实施例33-40中任一项所述的组合物，其中该嵌合MOMP VD多肽包含沙眼衣原体的血清变型D或E的一个MOMP VD序列和沙眼衣原体的血清变型F或G的一个MOMP VD序列。

43.如实施例41或42所述的组合物，其中该嵌合MOMP VD多肽包含(i)-(iv)中的至少一者(例如，四者)：

(i)来自血清变型D的MOMP VD1序列和来自血清变型F的MOMP VD1序列，或来自血清变型E的MOMP VD1序列和来自血清变型F或G的MOMP VD1序列(例如，血清变型E的MOMPVD1序列和血清变型G的MOMP VD1序列)；以及/或者

(ii)来自血清变型E的MOMP VD2序列和来自血清变型F的MOMP VD2序列，或来自血清变型D的MOMP VD2序列和来自血清变型G的MOMP VD2序列(例如，血清变型D的MOMP VD2序列和血清变型G的MOMP VD2序列)；以及/或者

(iii)来自血清变型G的MOMP VD3序列或来自血清变型F(例如，血清变型F)的VD3序列；以及/或者

(iv)来自血清变型E的MOMP VD4序列和来自血清变型G的MOMP VD4序列，或来自血清变型D的MOMP VD4序列和来自血清变型F的MOMP VD4序列(例如，血清变型D的MOMP VD4序列和血清变型F的MOMP VD4序列)，

其中这些血清变型D、E、F或G属于沙眼衣原体。

44.如实施例43所述的组合物，其中该嵌合MOMP VD多肽包含：

(i)来自血清变型D的MOMP VD1序列和来自血清变型F的MOMP VD1序列、来自血清变型E的MOMP VD2序列和来自血清变型F的MOMP VD2序列、来自血清变型G的MOMP VD3序列、来自血清变型E的MOMP VD4序列和来自血清变型G的MOMP VD4序列；或者

(ii)来自血清变型E的MOMP VD1序列和来自血清变型F的MOMP VD1序列、来自血清变型D的MOMP VD2序列和来自血清变型G的MOMP VD2序列、来自血清变型F的MOMP VD3序列、来自血清变型D的MOMP VD4序列和来自血清变型F的MOMP VD4序列；

其中这些血清变型D、E、F或G属于沙眼衣原体，

例如，其中该嵌合MOMP VD多肽包含根据(ii)的MOMP VD序列。

45.如实施例39-44中任一项所述的组合物，其中这些保守结构域序列部分是位于其原生衣原体属物种MOMP多肽中的VD侧翼的原生衣原体属物种MOMP多肽的保守结构域序列的部分。

46.如实施例39-45中任一项所述的组合物，其中每个保守结构域序列部分包含原生衣原体属物种MOMP多肽的保守结构域序列的3至30个氨基酸残基，其中该3至30个氨基酸残基紧邻其原生衣原体属物种MOMP多肽中的该VD序列。

47.如实施例33-36或38-46中任一项所述的组合物，其中该组合物包含含有编码嵌合衣原体属物种MOMP VD多肽的核苷酸序列的核酸，其中该嵌合MOMP VD多肽包含分泌信号肽序列。

48.如实施例47所述的组合物，其中该分泌信号肽序列是病毒分泌信号肽序列，其任选地选自由以下组成的组：流感血凝素(HA)分泌信号肽序列、SARS CoV-2刺突分泌信号肽序列、VZV gB分泌信号肽序列、VZV gE分泌信号肽序列、VZV gI分泌信号肽序列、VZV gK分泌信号肽序列、麻疹F蛋白分泌信号肽序列、风疹E1蛋白分泌信号肽序列、风疹E2蛋白分泌信号肽序列、腮腺炎F蛋白分泌信号肽序列、埃博拉GP蛋白分泌信号肽序列和天花6kDaIC蛋白分泌信号肽序列，任选地其中该分泌信号肽序列包含根据表2或表2.1中的SEQ ID NO中任一者的氨基酸序列。

49.如实施例48所述的组合物，其中该分泌信号肽序列包含甲型流感病毒的HA蛋白的分泌信号肽序列，例如，其中该分泌信号肽序列包含根据SEQ ID NO:187或SEQ ID NO:188的序列。

50.如实施例33-49中任一项所述的组合物，其中该嵌合MOMP VD多肽在对应于原生衣原体属物种MOMP多肽的保守结构域序列中的半胱氨酸残基的一个或多个(例如，所有)位置处包含单个氨基酸取代，任选地其中该单个氨基酸取代是用丝氨酸取代半胱氨酸。

51.如实施例33-50中任一项所述的组合物，其中该嵌合MOMP VD多肽在对应于原生衣原体属物种MOMP多肽中的糖基化位点、任选地N-糖基化位点的一个或多个(例如，所有)位置处包含突变，任选地其中该突变是单个氨基酸取代。

52.如实施例51所述的组合物，其中该嵌合MOMP VD多肽在对应于以下位置的每个氨基酸残基处包含单个氨基酸取代：SEQ ID NO:9的位置9(例如，N到A的取代)、SEQ ID NO:17的位置11(例如，T到A的取代)、SEQ ID NO:6的位置17(例如，S到A的取代)、SEQ ID NO:18的位置4和21(例如，分别为N到A和S到A的取代)、SEQ ID NO:8的位置14(例如，T到A的取代)和SEQ ID NO:16中的位置14(例如，T到A的取代)。

53.如实施例33-52中任一项所述的组合物，其中该嵌合MOMP VD多肽包含根据SEQID NO:490-505中任一者的序列或与其具有至少70％(例如，至少90％或95％)同一性的序列，例如，其中该嵌合MOMP VD多肽包含根据SEQ ID NO:503的序列或与其具有至少70％(例如，至少90％或95％)同一性的序列。

54.如实施例33-36或38-53中任一项所述的组合物，其中该组合物包含含有编码嵌合衣原体属物种MOMP VD多肽的核苷酸序列的核酸，并且其中该核酸包含根据SEQ IDNO:567-630的核苷酸序列或与其具有至少50％(例如，至少75％)同一性的序列，例如，其中该核酸包含根据SEQ ID NO:617的核苷酸序列或与其具有至少50％(例如，至少75％)同一性的序列。

55.如实施例33-36或38-54中任一项所述的组合物，其中该组合物包含(ii)(a)-(d)的一种或多种核酸，并且其中该衣原体属物种CT443多肽、该衣原体属物种CT584多肽、该衣原体属物种CT600多肽和该衣原体属物种CT812多肽包含分泌信号肽序列。

56.如实施例55所述的组合物，其中该分泌信号肽序列是病毒分泌信号肽序列，其任选地选自由以下组成的组：流感血凝素(HA)分泌信号肽序列、SARS CoV-2刺突分泌信号肽序列、VZV gB分泌信号肽序列、VZV gE分泌信号肽序列、VZV gI分泌信号肽序列、VZV gK分泌信号肽序列、麻疹F蛋白分泌信号肽序列、风疹E1蛋白分泌信号肽序列、风疹E2蛋白分泌信号肽序列、腮腺炎F蛋白分泌信号肽序列、埃博拉GP蛋白分泌信号肽序列和天花6kDaIC蛋白分泌信号肽序列，任选地其中该分泌信号肽序列包含根据表2或表2.1中的SEQ ID NO之一的氨基酸序列。

57.如实施例56所述的组合物，其中该分泌信号肽序列包含甲型流感病毒的HA蛋白的分泌信号肽序列，例如，其中该分泌信号肽序列包含根据SEQ ID NO:187或SEQ ID NO:188的序列。

58.如实施例55-57中任一项所述的组合物，其中该衣原体属物种CT443多肽、该衣原体属物种CT584多肽、该衣原体属物种CT600多肽或该衣原体属物种CT812多肽中的一者或多者包含异源跨膜结构域。

59.如实施例58所述的组合物，其中该跨膜结构域序列选自由以下组成的组：流感血凝素(HA)跨膜结构域序列、SARS CoV-2刺突跨膜结构域序列、VZV gB跨膜结构域序列、VZV gE跨膜结构域序列、VZV gI跨膜结构域序列、VZV gK跨膜结构域序列、麻疹F蛋白跨膜结构域序列、风疹E1蛋白跨膜结构域序列、风疹E2蛋白跨膜结构域序列、腮腺炎F蛋白跨膜结构域序列和埃博拉GP蛋白跨膜结构域序列，任选地其中该跨膜结构域包含根据表3中的SEQ ID NO之一的氨基酸序列。

60.如实施例58或59所述的组合物，其中该跨膜结构域包含甲型流感病毒的HA蛋白的跨膜结构域的序列，例如，其中该跨膜结构域包含根据SEQ ID NO:813或SEQ ID NO:814的序列。

61.如实施例33-60中任一项所述的组合物，其中该衣原体属物种CT443多肽、该衣原体属物种CT584多肽、该衣原体属物种CT600多肽或该衣原体属物种CT812多肽中的一者或多者在对应于相应原生衣原体属物种多肽中的半胱氨酸残基的一个或多个(例如，所有)位置处包含单个氨基酸取代，任选地其中该单个氨基酸取代是用丝氨酸取代半胱氨酸。

62.如实施例33-61中任一项所述的组合物，其中该衣原体属物种CT443多肽、该衣原体属物种CT584多肽、该衣原体属物种CT600多肽或该衣原体属物种CT812多肽中的一者或多者在对应于相应原生衣原体属物种多肽中的N-糖基化位点的一个或多个(例如，所有)位置处包含突变，任选地其中该突变是单个氨基酸取代。

63.如实施例62所述的组合物，其中该衣原体属物种CT584多肽在对应于SEQ IDNO:509的残基11的位置处包含单个氨基酸取代(例如，N到Q的取代)。

64.如实施例33-63中任一项所述的组合物，其中

(a)该衣原体属物种CT443多肽包含根据SEQ ID NO:507-508的序列或与其具有至少70％(例如，至少90％或95％)同一性的序列，例如，其中该衣原体属物种CT443多肽包含根据SEQ ID NO:507的序列或与其具有至少70％(例如，至少90％或95％)同一性的序列；

(b)该衣原体属物种CT584多肽包含根据SEQ ID NO:509-512中任一者的序列或与其具有至少70％(例如，至少90％或95％)同一性的序列，例如，其中该衣原体属物种CT584多肽包含根据SEQ ID NO:510中任一者的序列或与其具有至少70％(例如，至少90％或95％)同一性的序列；

(c)该衣原体属物种CT600多肽包含根据SEQ ID NO:513-514中任一者的序列或与其具有至少70％(例如，至少90％或95％)同一性的序列；以及/或者

(d)该衣原体属物种CT812多肽包含根据SEQ ID NO:515-535中任一者的序列或与其具有至少70％(例如，至少90％或95％)同一性的序列。

65.如实施例33-36或38-64中任一项所述的组合物，其中该组合物包含：

(1)该嵌合MOMP VD多肽包含根据SEQ ID NO:490-505中任一者(例如，SEQ ID NO:503)的序列或与其具有至少70％(例如，至少90％或95％)同一性的序列；

(2)该包含编码嵌合衣原体属物种MOMP VD多肽的核苷酸序列的核酸包含根据SEQID NO:567-630(例如，SEQ ID NO:617)的核苷酸序列或与其具有至少50％同一性的序列；

(3)该衣原体属物种CT443多肽包含根据SEQ ID NO:507的序列或与其具有至少70％(例如，至少90％或95％)同一性的序列；

(4)该包含编码该衣原体属物种CT443多肽的核苷酸序列的核酸包含根据SEQ IDNO:707-710中任一者(例如，SEQ ID NO:707)的核苷酸序列或与其具有至少50％(例如，至少75％)同一性的序列；

(5)该衣原体属物种CT584多肽包含根据SEQ ID NO:509-512中任一者(例如，SEQID NO:510)的序列或与其具有至少70％(例如，至少90％或95％)同一性的序列；

(6)该包含编码该衣原体属物种CT584多肽的核苷酸序列的核酸包含根据SEQ IDNO:711-718中任一者(例如，SEQ ID NO:715)的核苷酸序列或与其具有至少50％(例如，至少75％)同一性的序列；

(7)该衣原体属物种CT600多肽包含根据SEQ ID NO:513-514中任一者的序列或与其具有至少70％(例如，至少90％或95％)同一性的序列；以及/或者

(8)该包含编码该衣原体属物种CT600多肽的核苷酸序列的核酸包含根据SEQ IDNO:719-722中任一者的核苷酸序列或与其具有至少50％(例如，至少75％)同一性的序列；

(9)该衣原体属物种CT812多肽包含根据SEQ ID NO:515-535中任一者的序列或与其具有至少70％(例如，至少90％或95％)同一性的序列；以及/或者

(10)该包含编码该衣原体属物种CT812多肽的核苷酸序列的核酸包含根据SEQ IDNO:723-762中任一者的核苷酸序列或与其具有至少50％(例如，至少75％)同一性的序列；

任选地其中：

(ii)(a)的核酸，其中(ii)(a)的核酸包含根据SEQ ID NO:707的核苷酸序列或与其具有至少50％(至少75％)同一性的序列，和/或

(ii)(b)的核酸，其中(ii)(b)的核酸包含根据SEQ ID NO:715的核苷酸序列或与其具有至少50％(至少75％)同一性的序列。

66.如实施例33-36或38-65中任一项所述的组合物，其中(ii)(a)的核酸是mRNA并且该mRNA包含以下结构元件或由以下结构元件组成(例如，由以下结构元件组成)：

-5'帽，例如，具有以下结构的5'帽：

-5'非翻译区(5'UTR)，其具有根据SEQ ID NO:838的核酸序列；

-蛋白质编码区，其具有根据SEQ ID NO:369的核酸序列；

-3'非翻译区(3'UTR)，其具有根据SEQ ID NO:839的核酸序列；以及

-polyA尾。

67.如实施例33-36或38-66中任一项所述的组合物，其中(ii)(b)的核酸是mRNA并且该mRNA包含以下结构元件或由以下结构元件组成(例如，由以下结构元件组成)：

-5'帽，例如，具有以下结构的5'帽：

-5'非翻译区(5'UTR)，其具有根据SEQ ID NO:838的核酸序列；

-蛋白质编码区，其具有根据SEQ ID NO:377的核酸序列；

-3'非翻译区(3'UTR)，其具有根据SEQ ID NO:839的核酸序列；以及

-polyA尾。

68.如实施例54所述的组合物，其中包含编码该嵌合衣原体属物种MOMP VD多肽的核苷酸序列的核酸是mRNA并且该mRNA包含以下结构元件或由以下结构元件组成(例如，由以下结构元件组成)：

-5'帽，例如，具有以下结构的5'帽：

-5'非翻译区(5'UTR)，其具有根据SEQ ID NO:838的核酸序列；

-蛋白质编码区，其具有根据SEQ ID NO:870的核酸序列；

-3'非翻译区(3'UTR)，其具有根据SEQ ID NO:839的核酸序列；以及

polyA尾。

69.如实施例33-36或38-68中任一项所述的组合物，其中该组合物包含：

(1)如实施例16所述的核酸(例如，mRNA)，其中该核酸包含根据SEQ ID NO:551的核苷酸序列或与其具有至少50％(例如，至少75％)同一性的序列(例如，其中该核酸是如实施例18或19所述的mRNA)；

该包含编码该嵌合衣原体属物种MOMP VD多肽的核苷酸序列的核酸(例如，mRNA)，其中该核酸包含根据SEQ ID NO:617的核苷酸序列或与其具有至少50％(例如，至少75％)同一性的序列(例如，其中该核酸是如实施例68所述的mRNA)；以及

该包含编码该衣原体属物种CT443多肽的核苷酸序列的核酸(例如，mRNA)，其中该核酸包含根据SEQ ID NO:707的核苷酸序列或与其具有至少50％(例如，至少75％)同一性的序列(例如，其中该核酸是如实施例67所述的mRNA)；或者

(2)如实施例16所述的核酸(例如，mRNA)，其中该核酸包含根据SEQ ID NO:551的核苷酸序列或与其具有至少50％(例如，至少75％)同一性的序列(例如，其中该核酸是如实施例18或19所述的mRNA)；

该包含编码该衣原体属物种CT584多肽的核苷酸序列的核酸(例如，mRNA)，其中该核酸包含根据SEQ ID NO:715的核苷酸序列或与其具有至少50％(例如，至少75％)同一性的序列(例如，其中该核酸是如实施例67所述的mRNA)；或者

(3)如实施例16所述的核酸(例如，mRNA)，其中该核酸包含根据SEQ ID NO:551的核苷酸序列或与其具有至少50％(例如，至少75％)同一性的序列(例如，其中该核酸是如实施例18或19所述的mRNA)；

该包含编码该嵌合衣原体属物种MOMP VD多肽的核苷酸序列的核酸(例如，mRNA)，其中该核酸包含根据SEQ ID NO:617的核苷酸序列或与其具有至少50％(例如，至少75％)同一性的序列(例如，其中该核酸是如实施例68所述的mRNA)；

该包含编码该衣原体属物种CT443多肽的核苷酸序列的核酸(例如，mRNA)，其中该核酸包含根据SEQ ID NO:707的核苷酸序列或与其具有至少50％(例如，至少75％)同一性的序列(例如，其中该核酸是如实施例67所述的mRNA)；以及

(4)如实施例15所述的核酸(例如，mRNA)，其中该经修饰的MOMP多肽包含根据SEQID NO:486的序列或与其具有至少70％(例如，至少90％或95％)同一性的序列；

该包含编码该嵌合衣原体属物种MOMP VD多肽的核苷酸序列的核酸(例如，mRNA)，其中该嵌合MOMP VD多肽包含根据SEQ ID NO:503的序列或与其具有至少75％(例如，至少90％或95％)同一性的序列；以及

该包含编码该衣原体属物种CT443多肽的核苷酸序列的核酸(例如，mRNA)，其中编码该衣原体属物种CT443多肽包含根据SEQ ID NO:507的序列或与其具有至少75％(例如，至少90％或95％)同一性的序列；或者

(5)如实施例15所述的核酸(例如，mRNA)，其中该经修饰的MOMP多肽包含根据SEQID NO:486的序列或与其具有至少70％(例如，至少90％或95％)同一性的序列；

该包含编码该衣原体属物种CT584多肽的核苷酸序列的核酸，其中该衣原体属物种CT584多肽包含根据SEQ ID NO:510的序列或与其具有至少75％(例如，至少90％或95％)同一性的序列；或者

(6)如实施例15所述的核酸(例如，mRNA)，其中该经修饰的MOMP多肽包含根据SEQID NO:486的序列或与其具有至少70％(例如，至少90％或95％)同一性的序列；

该包含编码该嵌合衣原体属物种MOMP VD多肽的核苷酸序列的核酸(例如，mRNA)，其中该嵌合MOMP VD多肽包含根据SEQ ID NO:503的序列或与其具有至少75％(例如，至少90％或95％)同一性的序列；

该包含编码该衣原体属物种CT443多肽的核苷酸序列的核酸(例如，mRNA)，其中编码该衣原体属物种CT443多肽包含根据SEQ ID NO:507的序列或与其具有至少75％(例如，至少90％或95％)同一性的序列；以及

该包含编码该衣原体属物种CT584多肽的核苷酸序列的核酸，其中该衣原体属物种CT584多肽包含根据SEQ ID NO:510的序列或与其具有至少75％(例如，至少90％或95％)同一性的序列，

例如，其中该组合物包含如(3)中所定义的核酸或如(6)中所定义的核酸。

70.如实施例32或37-64中任一项所述的组合物，其中该组合物包含：

(1)该经修饰的MOMP多肽，其包含根据SEQ ID NO:486的序列或与其具有至少70％(例如，至少90％或95％)同一性的序列；

该嵌合衣原体属物种MOMP VD多肽，其包含根据SEQ ID NO:503的序列或与其具有至少75％(例如，至少90％或95％)同一性的序列；以及

该衣原体属物种CT443多肽，其包含根据SEQ ID NO:507的序列或与其具有至少75％(例如，至少90％或95％)同一性的序列；或者

(2)该经修饰的MOMP多肽，其包含根据SEQ ID NO:486的序列或与其具有至少70％(例如，至少90％或95％)同一性的序列；

该衣原体属物种CT584多肽，其包含根据SEQ ID NO:510的序列或与其具有至少75％(例如，至少90％或95％)同一性的序列；或者

(3)该经修饰的MOMP多肽，其包含根据SEQ ID NO:486的序列或与其具有至少70％(例如，至少90％或95％)同一性的序列；

该嵌合衣原体属物种MOMP VD多肽，其包含根据SEQ ID NO:503的序列或与其具有至少75％(例如，至少90％或95％)同一性的序列；

该衣原体属物种CT443多肽，其包含根据SEQ ID NO:507的序列或与其具有至少75％(例如，至少90％或95％)同一性的序列；以及

该衣原体属物种CT584多肽，其包含根据SEQ ID NO:510的序列或与其具有至少75％(例如，至少90％或95％)同一性的序列，

例如，其中该组合物包含如(3)中所定义的多肽。

71.一种组合，该组合包含如实施例1-19中任一项所述的核酸以及：

(ii)以下中的一者或多者(例如，一者、两者、三者或四者)：

(a)包含编码衣原体属物种CT443多肽的核苷酸序列的核酸；

(b)包含编码衣原体属物种CT584多肽的核苷酸序列的核酸；

(c)包含编码衣原体属物种CT600多肽的核苷酸序列的核酸；或者

(d)包含编码衣原体属物种CT812多肽的核苷酸序列的核酸。

72.如实施例71所述的组合，其中该组合物包含

(i)的核酸和(ii)(a)的核酸；

(i)的核酸和(ii)(b)的核酸；或者

(i)的核酸、(ii)(a)的核酸和(ii)(b)的核酸，

例如，其中该组合物包含(i)的核酸、(ii)(a)的核酸和(ii)(b)的核酸，任选地其中这些核酸如实施例69中所定义。

73.一种组合，该组合包含如实施例20-30中任一项所述的多肽以及：

(ii)以下中的一者或多者(例如，一者、两者、三者或四者)：

(a)包含衣原体属物种CT443多肽的氨基酸序列的多肽；

(b)包含衣原体属物种CT584多肽的氨基酸序列的多肽；

(c)包含衣原体属物种CT600多肽的氨基酸序列的多肽；或者

(d)包含衣原体属物种CT812多肽的氨基酸序列的多肽。

74.如实施例73所述的组合，其中该组合物包含

(i)的多肽和(ii)(a)的多肽；

(i)的多肽和(ii)(b)的多肽；或者

(i)的多肽、(ii)(a)的多肽和(ii)(b)的多肽，

例如，其中该组合物包含(i)的多肽、(ii)(a)的多肽和(ii)(b)的多肽，任选地其中这些多肽如实施例70中所定义。

75.如实施例71或72所述的组合，其中这些核酸存在于同一组合物中或存在于两种或更多种单独的组合物中。

76.如实施例73或74所述的组合，其中这些多肽存在于同一组合物中或存在于两种或更多种单独的组合物中。

77.如实施例37所述的组合物，其中该组合物进一步包含佐剂。

78.如实施例36所述的组合物，其中该LNP包括至少一种阳离子脂质，任选地其中：

(i)该阳离子脂质选自由以下组成的组：OF-02、cKK-E10、OF-Deg-Lin、GL-HEPES-E3-E10-DS-3-E18-1、GL-HEPES-E3-E12-DS-4-E10、GL-HEPES-E3-E12-DS-3-E14、SM-102、ALC-0315、ATX-126和IM-001(例如，GL-HEPES-E3-E12-DS-4-E10或IM-001)；以及/或者

(ii)该LNP进一步包括聚乙二醇(PEG)缀合的(PEG化的)脂质、基于胆固醇的脂质和辅助脂质，任选地其中

该(PEG化的)脂质是DMG-PEG2000或ALC-0159(例如，DMG-PEG2000)；

该基于胆固醇的脂质是胆固醇；以及/或者

该辅助脂质是DOPE或DSPC；以及/或者

(iii)该LNP包括：

(1)摩尔比为40％的OF-02、摩尔比为1.5％的DMG-PEG2000、摩尔比为28.5％的胆固醇和摩尔比为30％的DOPE；

(2)摩尔比为40％的cKK-E10、摩尔比为1.5％的DMG-PEG2000、摩尔比为28.5％的胆固醇和摩尔比为30％的DOPE；

(3)摩尔比为40％的GL-HEPES-E3-E10-DS-3-E18-1、摩尔比为1.5％的DMG-PEG2000、摩尔比为28.5％的胆固醇和摩尔比为30％的DOPE；

(4)摩尔比为40％的GL-HEPES-E3-E12-DS-4-E10、摩尔比为1.5％的DMG-PEG2000、摩尔比为28.5％的胆固醇和摩尔比为30％的DOPE；

(5)摩尔比为40％的GL-HEPES-E3-E12-DS-3-E14、摩尔比为1.5％的DMG-PEG2000、摩尔比为28.5％的胆固醇和摩尔比为30％的DOPE；

(6)摩尔比为50％的DLin-MC3-DMA(MC3)、摩尔比为1.5％的DMG-PEG2000、摩尔比为38.5％的胆固醇和摩尔比为10％的DSPC；或者

(7)摩尔比为40％的IM-001、摩尔比为1.5％的DMG-PEG2000、摩尔比为28.5％的胆固醇和摩尔比为30％的DOPE，

(8)摩尔比为50％的SM-102、摩尔比为1.5％的DMG-PEG2000、摩尔比为38.5％的胆固醇和摩尔比为10％的DSPC；

(9)摩尔比为46.3％的ALC-0315、摩尔比为1.6％的ALC-0159、摩尔比为42.7％的胆固醇和摩尔比为9.4％的DSPC；

(10)摩尔比为47.4％的ALC-0315、摩尔比为1.7％的ALC-0159、摩尔比为40.9％的胆固醇和摩尔比为10％的DSPC；或者

(11)摩尔比为50％的ATX-126、摩尔比为1.5％的DMG-PEG2000、摩尔比为38.5％的胆固醇和摩尔比为10％的DSPC。

例如，其中该LNP如(1)、(2)、(4)或(7)中所定义，例如，其中该LNP如(4)或(7)中所定义。

79.如实施例1-19中任一项所述的核酸、如实施例20-30中任一项所述的经修饰的MOMP多肽、如实施例31-70、77或78中任一项所述的组合物、或如实施例71-76中任一项所述的组合，其用作药物。

80.如实施例1-19中任一项所述的核酸、如实施例20-30中任一项所述的经修饰的MOMP多肽、如实施例31-70、77或78中任一项所述的组合物、或如实施例71-76中任一项所述的组合，用于在治疗或预防衣原体属物种感染中使用，优选地其中该感染是沙眼衣原体感染。

81.根据实施例80所述用于使用的核酸、经修饰的MOMP多肽、组合物或组合，其中该感染是生殖器感染。

82.一种疫苗，该疫苗包含如实施例1-19中任一项所述的核酸、如实施例20-30中任一项所述的经修饰的MOMP多肽、如实施例31-70、77或78中任一项所述的组合物、或如实施例71-76中任一项所述的组合。

83.一种核酸，该核酸包含编码嵌合衣原体属物种MOMP可变结构域(VD)多肽的核苷酸序列，其中该嵌合MOMP VD多肽包含含有该衣原体属物种的不同血清变型的两个或更多个衣原体属物种MOMP VD序列的氨基酸序列。

84.如实施例83所述的核酸，其中该衣原体属物种为沙眼衣原体。

85.如实施例83或84所述的核酸，其中该嵌合MOMP VD多肽包含位于该两个或更多个MOMP VD序列中的每一个序列侧翼的原生衣原体属物种MOMP多肽的保守结构域序列部分。

86.如实施例83-85中任一项所述的核酸，其中该嵌合MOMP VD多肽包含四种不同血清变型的MOMP VD序列，任选地其中这些不同血清变型选自沙眼衣原体的血清变型D、E、F或G。

87.如实施例83-86中任一项所述的核酸，其中该嵌合MOMP VD多肽包含：

(iii)一个MOMP VD3序列；以及/或者

(iv)该衣原体属物种的不同血清变型的两个MOMP VD4序列，

88.如实施例83-87中任一项所述的核酸，其中该嵌合MOMP VD多肽包含沙眼衣原体的血清变型D或E的一个MOMP VD序列和沙眼衣原体的血清变型F或G的一个MOMP VD序列。

89.如实施例87或88所述的核酸，其中该嵌合MOMP VD多肽包含(i)-(iv)中的至少一者(例如，四者)：

其中这些血清变型D、E、F或G属于沙眼衣原体。

90.如实施例89所述的核酸，其中该嵌合MOMP VD多肽包含：

其中这些血清变型D、E、F或G属于沙眼衣原体。

91.如实施例90所述的核酸，其中该嵌合MOMP VD多肽包含根据(ii)的MOMP VD序列。

92.如实施例85-91中任一项所述的核酸，其中这些保守结构域序列部分是位于其原生衣原体属物种MOMP多肽中的VD侧翼的原生衣原体属物种MOMP多肽的保守结构域序列的部分。

93.如实施例85-92中任一项所述的核酸，其中每个保守结构域序列部分包含原生衣原体属物种MOMP多肽的保守结构域序列的3至30个氨基酸残基，其中该3至30个氨基酸残基紧邻其原生衣原体属物种MOMP多肽中的该VD序列。

94.如实施例83-93中任一项所述的核酸，其中该嵌合衣原体属物种MOMP VD多肽包含分泌信号肽序列。

95.如实施例94所述的核酸，其中该分泌信号肽序列是病毒分泌信号肽序列，其任选地选自由以下组成的组：流感血凝素(HA)分泌信号肽序列、SARS CoV-2刺突分泌信号肽序列、VZV gB分泌信号肽序列、VZV gE分泌信号肽序列、VZV gI分泌信号肽序列、VZV gK分泌信号肽序列、麻疹F蛋白分泌信号肽序列、风疹E1蛋白分泌信号肽序列、风疹E2蛋白分泌信号肽序列、腮腺炎F蛋白分泌信号肽序列、埃博拉GP蛋白分泌信号肽序列和天花6kDaIC蛋白分泌信号肽序列，任选地其中该分泌信号肽序列包含根据表2或表2.1中的SEQ ID NO中任一者的氨基酸序列。

96.如实施例95所述的核酸，其中该分泌信号肽序列包含甲型流感病毒的HA蛋白的分泌信号肽序列，例如，其中该分泌信号肽序列包含根据SEQ ID NO:187或SEQ ID NO:188的序列。

97.如实施例83-96中任一项所述的核酸，其中该嵌合MOMP VD多肽在对应于原生衣原体属物种MOMP多肽的保守结构域序列中的半胱氨酸残基的一个或多个(例如，所有)位置处包含单个氨基酸取代，任选地其中该单个氨基酸取代是用丝氨酸取代半胱氨酸。

98.如实施例83-97中任一项所述的核酸，其中该嵌合MOMP VD多肽在对应于原生衣原体属物种MOMP多肽中的糖基化位点、任选地N-糖基化位点的一个或多个(例如，所有)位置处包含突变，任选地其中该突变是单个氨基酸取代。

99.如实施例98所述的核酸，其中嵌合MOMP VD多肽在对应于以下位置的每个氨基酸残基处包含单个氨基酸取代：SEQ ID NO:9的位置9(例如，N到A的取代)、SEQ ID NO:17的位置11(例如，T到A的取代)、SEQ ID NO:6的位置17(例如，S到A的取代)、SEQ ID NO:18的位置4和21(例如，分别为N到A和S到A的取代)、SEQ ID NO:8的位置14(例如，T到A的取代)和SEQ ID NO:16中的位置14(例如，T到A的取代)。

100.如实施例83-99中任一项所述的核酸，其中该嵌合MOMP VD多肽包含根据SEQID NO:490-505中任一者的序列或与其具有至少70％(例如，至少90％或95％)同一性的序列，例如，其中该嵌合MOMP VD多肽包含根据SEQ ID NO:503的序列或与其具有至少70％(例如，至少90％或95％)同一性的序列。

101.如实施例83-100中任一项所述的核酸，其中该核酸包含根据SEQ ID NO:567-630的核苷酸序列或与其具有至少50％(例如，至少75％)同一性的序列，例如，其中该核酸包含根据SEQ ID NO:617的核苷酸序列或与其具有至少50％(例如，至少75％)同一性的序列。

102.如实施例83-101中任一项所述的核酸，其中该核酸是信使RNA(mRNA)，任选地其中

(iii)该mRNA是自我复制mRNA或非复制mRNA，例如，非复制mRNA。

103.如实施例102所述的核酸，其中该mRNA包含以下结构元件或由以下结构元件组成(例如，由以下结构元件组成)：

-5'帽，例如，具有以下结构的5'帽：

-5'非翻译区(5'UTR)，其具有根据SEQ ID NO:838的核酸序列；

-蛋白质编码区，其具有根据SEQ ID NO:870的核酸序列；

-3'非翻译区(3'UTR)，其具有根据SEQ ID NO:839的核酸序列；以及

-polyA尾。

104.如实施例103所述的核酸，其中该mRNA是经化学修饰的，并且其中该化学修饰包括以下或由以下组成(例如，由以下组成)：N1-甲基假尿苷来替换每个尿苷。

105.一种嵌合衣原体属物种MOMP可变结构域(VD)多肽，其中该嵌合MOMP VD多肽包含含有衣原体属物种的不同血清变型的两个或更多个衣原体属物种MOMP VD序列的氨基酸序列。

106.如实施例105所述的嵌合MOMP VD多肽，其中该衣原体属物种为沙眼衣原体。

107.如实施例105或106所述的嵌合MOMP VD多肽，其中该嵌合MOMP VD多肽包含位于该两个或更多个MOMP VD序列中的每一个序列侧翼的原生衣原体属物种MOMP多肽的保守结构域序列部分。

108.如实施例105-107中任一项所述的嵌合MOMP VD多肽，其中该嵌合MOMP VD多肽包含四种不同血清变型的MOMP VD序列，任选地其中这些不同血清变型选自沙眼衣原体的血清变型D、E、F或G。

109.如实施例105-108中任一项所述的嵌合MOMP VD多肽，其中该嵌合MOMP VD多肽包含：

(iii)一个MOMP VD3序列；以及/或者

(iv)该衣原体属物种的不同血清变型的两个MOMP VD4序列，

110.如实施例105-109中任一项所述的嵌合MOMP VD多肽，其中该嵌合MOMP VD多肽包含沙眼衣原体的血清变型D或E的一个MOMP VD序列和沙眼衣原体的血清变型F或G的一个MOMP VD序列。

111.如实施例109或110所述的嵌合MOMP VD多肽，其中该嵌合MOMP VD多肽包含(i)-(iv)中的至少一者(例如，四者)：

其中这些血清变型D、E、F或G属于沙眼衣原体。

112.如实施例111所述的嵌合MOMP VD多肽，其中该嵌合MOMP VD多肽包含：

其中这些血清变型D、E、F或G属于沙眼衣原体。

113.如实施例112所述的嵌合MOMP VD多肽，其中该嵌合MOMP VD多肽包含根据(ii)的MOMP VD序列。

114.如实施例107-113中任一项所述的嵌合MOMP VD多肽，其中这些保守结构域序列部分是位于其原生衣原体属物种MOMP多肽中的VD侧翼的原生衣原体属物种MOMP多肽的保守结构域序列的部分。

115.如实施例107-114中任一项所述的嵌合MOMP VD多肽，其中每个保守结构域序列部分包含原生衣原体属物种MOMP多肽的保守结构域序列的3至30个氨基酸残基，其中该3至30个氨基酸残基紧邻其原生衣原体属物种MOMP多肽中的该VD序列。

116.如实施例105-115中任一项所述的嵌合MOMP VD多肽，其中该嵌合MOMP VD多肽在对应于原生衣原体属物种MOMP多肽的保守结构域序列中的半胱氨酸残基的一个或多个(例如，所有)位置处包含单个氨基酸取代，任选地其中该单个氨基酸取代是用丝氨酸取代半胱氨酸。

117.如实施例105-116中任一项所述的嵌合MOMP VD多肽，其中该嵌合MOMP VD多肽在对应于原生衣原体属物种MOMP多肽中的糖基化位点、任选地N-糖基化位点的一个或多个(例如，所有)位置处包含突变，任选地其中该突变是单个氨基酸取代。

118.如实施例117所述的嵌合MOMP VD多肽，其中嵌合MOMP VD多肽在对应于以下位置的每个氨基酸残基处包含单个氨基酸取代：SEQ ID NO:9的位置9(例如，N到A的取代)、SEQ ID NO:17的位置11(例如，T到A的取代)、SEQ ID NO:6的位置17(例如，S到A的取代)、SEQ ID NO:18的位置4和21(例如，分别为N到A和S到A的取代)、SEQ ID NO:8的位置14(例如，T到A的取代)和SEQ ID NO:16中的位置14(例如，T到A的取代)。

119.如实施例105-118中任一项所述的嵌合MOMP VD多肽，其中该嵌合MOMP VD多肽包含根据SEQ ID NO:490-505中任一者的序列或与其具有至少70％(例如，至少90％或95％)同一性的序列，例如，其中该嵌合MOMP VD多肽包含根据SEQ ID NO:503的序列或与其具有至少70％(例如，至少90％或95％)同一性的序列。

120.一种组合物，该组合物包含如实施例83-104中任一项所述的核酸，优选地其中该组合物是免疫原性组合物。

121.一种组合物，该组合物包含如实施例105-119中任一项所述的多肽，优选地其中该组合物是免疫原性组合物。

122.如实施例120所述的组合物，其中该组合物进一步包含：

(i)包含编码经修饰的MOMP多肽的核苷酸序列的核酸，其中该经修饰的MOMP多肽具有包含原生衣原体属物种MOMP多肽的两个或更多个保守结构域序列和这些保守结构域序列之间的非原生环序列的氨基酸序列；以及/或者

(ii)以下中的一者或多者(例如，一者、两者、三者或四者)：

(a)包含编码衣原体属物种CT443多肽的核苷酸序列的核酸；

(b)包含编码衣原体属物种CT584多肽的核苷酸序列的核酸；

(d)包含编码衣原体属物种CT812多肽的核苷酸序列的核酸。

123.如实施例122所述的组合物，其中该组合物包含(i)的核酸、(ii)(a)的核酸和(ii)(b)的核酸。

124.如实施例122或123所述的组合物，其中一种或多种核酸是mRNA，任选地其中

(iii)该mRNA是自我复制mRNA或非复制mRNA，例如，非复制mRNA。

125.如实施例120或122-124中任一项所述的组合物，其中该组合物进一步包含脂质纳米颗粒(LNP)，任选地其中该核酸被包封在该LNP中。

126.如实施例122-125中任一项所述的组合物，其中编码该经修饰的MOMP多肽的核酸如实施例1-19中任一项所定义。

127.如实施例122-126中任一项所述的组合物，其中该包含编码该衣原体属物种CT443多肽的核苷酸序列的核酸、该包含编码该衣原体属物种CT584多肽的核苷酸序列的核酸、该包含编码该衣原体属物种CT600多肽的核苷酸序列的核酸或该包含编码该衣原体属物种CT812多肽的核苷酸序列的核酸中的任一者如实施例55-68中任一项所定义。

128.如实施例122-127中任一项所述的组合物，其中该组合物包含：

如实施例101所述的核酸(例如，mRNA)，其中该核酸包含根据SEQ ID NO:617的核苷酸序列或与其具有至少50％(例如，至少75％)同一性的序列(例如，其中该核酸是如实施例68所述的mRNA)；以及

如实施例101所述的核酸(例如，mRNA)，其中该核酸包含根据SEQ ID NO:617的核苷酸序列或与其具有至少50％(例如，至少75％)同一性的序列(例如，其中该核酸是如实施例68所述的mRNA)；

如实施例101所述的核酸(例如，mRNA)，其中该嵌合MOMP VD多肽包含根据SEQ IDNO:503的序列或与其具有至少75％(例如，至少90％或95％)同一性的序列；以及

如实施例101所述的核酸(例如，mRNA)，其中该嵌合MOMP VD多肽包含根据SEQ IDNO:503的序列或与其具有至少75％(例如，至少90％或95％)同一性的序列；

129.如实施例121所述的组合物，其中该组合物进一步包含：

(i)经修饰的MOMP多肽，其中该经修饰的MOMP多肽具有包含原生衣原体属物种MOMP多肽的两个或更多个保守结构域序列和这些保守结构域序列之间的非原生环序列的氨基酸序列；以及/或者

(ii)以下中的一者或多者(例如，一者、两者、三者或四者)：

(a)包含衣原体属物种CT443多肽的氨基酸序列的多肽；

(b)包含衣原体属物种CT584多肽的氨基酸序列的多肽；

(c)包含衣原体属物种CT600多肽的氨基酸序列的多肽；或者

(d)包含衣原体属物种CT812多肽的氨基酸序列的多肽。

130.如实施例129所述的组合物，其中该组合物包含

(i)的多肽和(ii)(a)的多肽；或者

(i)的多肽和(ii)(b)的多肽；或者

(i)的多肽、(ii)(a)的多肽和(ii)(b)的多肽，

131.如实施例129或130中任一项所述的组合物，其中该经修饰的MOMP多肽如实施例20-30中任一项所定义。

132.如实施例129-131中任一项所述的组合物，其中该衣原体属物种CT443多肽、该衣原体属物种CT584多肽、该衣原体属物种CT600多肽或该衣原体属物种CT812多肽中的任一者如实施例55-68中任一项所定义。

133.如实施例129-132中任一项所述的组合物，其中该组合物包含：

例如，其中该组合物包含如(3)中所定义的多肽。

134.如实施例121或129-133中任一项所述的组合物，其中该组合物进一步包含佐剂。

135.如实施例125所述的组合物，其中该LNP包括至少一种阳离子脂质，任选地其中：

该(PEG化的)脂质是DMG-PEG2000或ALC-0159(例如，DMG-PEG2000)；

该基于胆固醇的脂质是胆固醇；以及/或者

该辅助脂质是DOPE或DSPC；以及/或者

(iii)该LNP包括：

(11)摩尔比为50％的ATX-126、摩尔比为1.5％的DMG-PEG2000、摩尔比为38.5％的胆固醇和摩尔比为10％的DSPC，

136.如实施例120-135中任一项所述的组合物，其中该衣原体属物种为沙眼衣原体。

137.一种组合，该组合包含如实施例83-104中任一项所述的核酸以及：

(ii)以下中的一者或多者(例如，一者、两者、三者或四者)：

(a)包含编码衣原体属物种CT443多肽的核苷酸序列的核酸；

(b)包含编码衣原体属物种CT584多肽的核苷酸序列的核酸；

(d)包含编码衣原体属物种CT812多肽的核苷酸序列的核酸。

138.如实施例137所述的组合，其中该组合物包含

(i)的核酸和(ii)(a)的核酸；

(i)的核酸和(ii)(b)的核酸；或者

(i)的核酸、(ii)(a)的核酸和(ii)(b)的核酸，

例如，其中该组合物包含(i)的核酸、(ii)(a)的核酸和(ii)(b)的核酸，任选地其中这些核酸如实施例128中所定义。

139.一种组合，该组合包含如实施例105-119中任一项所述的多肽以及：

(ii)以下中的一者或多者(例如，一者、两者、三者或四者)：

(a)包含衣原体属物种CT443多肽的氨基酸序列的多肽；

(b)包含衣原体属物种CT584多肽的氨基酸序列的多肽；

(c)包含衣原体属物种CT600多肽的氨基酸序列的多肽；或者

(d)包含衣原体属物种CT812多肽的氨基酸序列的多肽。

140.如实施例139所述的组合，其中该组合物包含

(i)的多肽和(ii)(a)的多肽；

(i)的多肽和(ii)(b)的多肽；或者

(i)的多肽、(ii)(a)的多肽和(ii)(b)的多肽，

例如，其中该组合物包含(i)的多肽、(ii)(a)的多肽和(ii)(b)的多肽，任选地其中这些多肽如实施例133中所定义。

141.如实施例137或138所述的组合，其中这些核酸存在于同一组合物中或存在于两种或更多种单独的组合物中。

142.如实施例139或140所述的组合，其中这些多肽存在于同一组合物中或存在于两种或更多种单独的组合物中。

143.如实施例83-104中任一项所述的核酸、如实施例105-119中任一项所述的嵌合MOMP VD多肽、如实施例120-136中任一项所述的组合物、或如实施例136-142中任一项所述的组合，其用作药物。

144.如实施例83-104中任一项所述的核酸、如实施例105-119中任一项所述的嵌合MOMP VD多肽、如实施例120-136中任一项所述的组合物、或如实施例136-142中任一项所述的组合，用于在治疗或预防衣原体属物种感染中使用，优选地其中该感染是沙眼衣原体感染。

145.根据实施例144所述用于使用的核酸、嵌合MOMP VD多肽、组合物或组合，其中该感染是生殖器感染。

146.一种疫苗，该疫苗包含如实施例83-104中任一项所述的核酸、如实施例105-119中任一项所述的嵌合MOMP VD多肽、如实施例120-136中任一项所述的组合物、或如实施例136-142中任一项所述的组合。

附图说明

图1示出了在用递送野生型(WT)全长MOMP(“mRNA MNR MOMP E FL”)或不具有可变结构域VD2和VD4的MOMP(“mRNA UNR MOMP E DII:IV”)的原生SS-MOMP mRNA进行免疫的小鼠中，响应于用MOMP血清变型D、E或F的重叠肽池进行刺激，诱导交叉血清变型应答性产IFNγ的T细胞。MNR＝经修饰的mRNA(其中所有尿苷核苷均被1-甲基假尿苷替代)。UNR＝未经修饰的mRNA(含有未经修饰的尿苷核苷)。

图2示出了在用“mRNA MNR MOMP E FL”或“mRNA UNR MOMP E DII:IV”进行免疫的小鼠中，响应于用MOMP血清变型E或F的重叠肽池进行刺激，诱导交叉血清变型应答性(A)CD4+IFNγ+ T细胞和(B)CD8+IFNγ+ T细胞。

图3示出了使用平板ELISA评估的在用LNP配制的编码重组血清变型E MOMP的mRNA进行免疫的小鼠中稀释IgG滴度的倒数。

图4示出了在脾IFNγELISPOT中评估的在用LNP配制的编码重组血清变型E MOMP的mRNA进行免疫的小鼠中，响应于用(A)UV灭活的EB、(B)“rMOMP”(重组血清变型E MOMP蛋白)和(C)重叠血清变型E MOMP肽池进行刺激的T细胞应答。

图5A和5B示出了在用其中去除了一个或多个可变结构域(VD)环的MOMP mRNA构建体进行免疫后，响应于用回忆抗原(recall antigen)(血清变型E MOMP的重叠肽池)进行刺激，小鼠中T细胞的IFNγ产生水平。

图6示出了在用“mRNA UNR MOMP E DII:IV”或重组血清变型E MOMP蛋白进行免疫后，在小鼠中诱导(A)产IFNγ的T细胞(响应于MOMP血清变型E肽池)、(B)CD4+IFNγT细胞和(C)CD8+IFNγT细胞。

图7示出了在用编码其中去除了VD环的经修饰的MOMP多肽抗原的mRNA(MOMP_P3_ssHA1(“P3”)、MOMP_P5_ssHA1_C2S(“P5 C2S”))或全长MOMP构建体MOMP_serE_FL_ssHA1(“FL”)、MOMP_serE_FL_ssHA1_C2S_Glycneg(“FL C2S Glycneg”)进行免疫后，在小鼠中诱导交叉血清变型应答性产IFNγ的T细胞。回忆抗原是MOMP血清变型D、E、F、G或J的重叠肽。

图8示出了在用MOMP_P3_ssHA1(“P3”)、MOMP_P5_ssHA1_C2S(“P5 C2S”)、MOMP_serE_FL_ssHA1(“FL”)或MOMP_serE_FL_ssHA1_C2S_Glycneg(“FL C2S Glycneg”)进行免疫后，在小鼠中诱导交叉血清变型应答性产IL-5的T细胞。回忆抗原是MOMP血清变型D、E、F、G或J的重叠肽。

图9示出了根据7.2中详述的研究，在用编码其中去除了VD环的经修饰的MOMP多肽抗原的mRNA(MOMP_P3_ssHA1(“P3”)、MOMP_P3_ssHA1_C2S(“P3 C2S”)、MOMP_P5_ssHA1(“P5”)、MOMP_P5_ssHA1_C2S(“P5 C2S”))或全长MOMP构建体MOMP_serE_FL_ssHA1(“SerEFL”)、MOMP_serD_FL_ssHA1(“SerD FL”)进行免疫后，在小鼠中诱导交叉血清变型应答性产IFNγ的T细胞。回忆抗原是(A)MOMP血清变型E或(B)MOMP血清变型D、F、G或J的重叠肽。

图10示出了在用MOMP_P3_ssHA1(“P3”)、MOMP_P5_ssHA1_C2S(“P5 C2S”)、MOMP_serE_FL_ssHA1(“FL”)或MOMP_serE_FL_ssHA1_C2S_Glycneg(“FL C2S Glycneg”)进行免疫后，在小鼠中诱导(A)CD4+IFNγT细胞应答和(B)CD8+IFNγT细胞应答。

图11示出了根据7.2中详述的研究，在用MOMP_P3_ssHA1(“P3”)、MOMP_P3_ssHA1_C2S(“P3 C2S”)、MOMP_P5_ssHA1(“P5”)、MOMP_P5_ssHA1_C2S(“P5 C2S”)或全长MOMP构建体MOMP_serE_FL_ssHA1(“SerE FL”)、MOMP_serD_FL_ssHA1(“SerD FL”)进行免疫后，在小鼠中诱导(A)CD4+IFNγT细胞应答和(B)CD8+IFNγT细胞应答。

图12示出了在用MOMP_P3_ssHA1(“P3”)、MOMP_P5_ssHA1_C2S(“P5 C2S”)、MOMP_serE_FL_ssHA1(“FL”)或MOMP_serE_FL_ssHA1_C2S_Glycneg(“FL C2S Glycneg”)对小鼠进行免疫后，小鼠中产生IFNγ(“IFNg”)、IL2和/或TNFα(“TNFa”)(单独和以其各种组合形式)的CD4+ T细胞的百分比。

图13示出了根据7.2中详述的研究，在用MOMP_P3_ssHA1(“P3”)、MOMP_P3_ssHA1_C2S(“P3 C2S”)、MOMP_P5_ssHA1(“P5”)、MOMP_P5_ssHA1_C2S(“P5 C2S”)或全长MOMP构建体MOMP_serE_FL_ssHA1(“SerE FL”)、MOMP_serD_FL_ssHA1(“SerD FL”)对小鼠进行免疫后，小鼠中产生IFNγ(“IFNg”)、IL2和/或TNFα(“TNFa”)(单独和以其各种组合形式)的CD4+ T细胞的百分比。

图14示出了根据7.2中详述的研究，在用MOMP_P3_ssHA1(“P3”)、MOMP_P3_ssHA1_C2S(“P3 C2S”)、MOMP_P5_ssHA1(“P5”)、MOMP_P5_ssHA1_C2S(“P5 C2S”)或全长MOMP构建体MOMP_serE_FL_ssHA1(“FL”)、MOMP_serD_FL_ssHA1(“SerD FL”)对小鼠进行免疫后，使用ELISA测量的IgG与重组MOMP(rMOMP)蛋白的结合水平。

图15示出了在用重组(r)非MOMP多肽“rCT584”、“rCT812”、“rCT600”或“rCT443”、重组MOMP蛋白(“rMOMP”)或编码缺乏VD环1-4的MOMP血清变型E的mRNA(“mRNA MOMPΔVD1234”)进行免疫后，小鼠中的IFNγT细胞应答。使用相应的原生MOMP或非MOMP的重叠肽池作为回忆抗原。

图16示出了在用非MOMP片段mRNA构建体(CT812:1-1530、CT812:1-761、Nan96-SS:CT812:32-761、CT600:1-188、CT443:1-576、Nan96-SS:CT443:32-576)或用编码缺乏VD环1-4的MOMP血清变型E的mRNA(“MOMPΔVD1234”)进行免疫后，小鼠中的IFNγT细胞应答。使用相应的原生MOMP或非MOMP的重叠肽池作为回忆抗原。

图17示出了在用编码非MOMP Ct抗原“CT443”(Nan96-SS:CT443:32-576)、“CT584”(Nan96HA-SS:CT584:2-183)、“CT600”(Nan96HA-SS:CT600:2-188)或“CT812”(Nan96-SS:CT812:32-761)的mRNA或用重组MOMP血清变型E蛋白进行免疫后，响应于用相应的重叠肽池进行刺激，小鼠中的IFNγT细胞应答。示出了在加强后第十一天(D11)和第十四天(D14)收集的脾细胞的应答。

图18示出了在用编码非MOMP Ct抗原“CT443”(Nan96-SS:CT443:32-576)、“CT584”(Nan96HA-SS:CT584:2-183)、“CT600”(Nan96HA-SS:CT600:2-188)或“CT812”(Nan96-SS:CT812:32-761)的mRNA或用重组MOMP血清变型E蛋白进行免疫后，在小鼠中诱导(A)CD4+IFNγT细胞应答和(B)CD8+IFNγT细胞应答。

图19示出了在用编码非MOMP Ct抗原CT443_ssHA1(“CT443”)、CT443_ssHA1_GlycNeg(“CT443_GN”)、CT584_ssHA1(“CT584”)、CT584_ssHA1_Glycneg(“CT584_GN”)、CT584_ssHA1_C2S(“CT584_C2S”)、CT584_ssHA1_Glycneg_C2S(“CT584_GN_C2S”)、CT600_trunc_ssHA1(“CT600_trunc”)、CT600_trunc_ssHA1_Glycneg(“CT600_trunc_GN”)、CT812_pass-domain_ssHA1(“CT812_pass-dom”)、CT812_pass-domain_ssHA1_C2S(“CT812_pass-dom_C2S”)、CT812_ext-pass-domain_ssHA1(“CT812_ext-pass-dom”)、CT812_ext-pass-domain_ssHA1_C2S(“CT812_ext-pass-dom_C2S”)的mRNA进行免疫后，使用ELISA测量的抗原特异性IgG水平。

图20示出了在用编码非MOMP Ct抗原CT443_ssHA1(“CT443”)、CT584_ssHA1_GlycNeg(“CT584_GlycNeg”)或CT600_trunc_ssHA1_Glycneg(“CT600_GlycNeg”)的mRNA或用编码重组MOMP血清变型E蛋白的mRNA作为对照进行免疫后，在小鼠中诱导产IFNγ的T细胞。

图21示出了在用编码非MOMP Ct抗原CT443_ssHA1(“CT443”)、CT584_ssHA1_GlycNeg(“CT584_GlycNeg”)或CT600_trunc_ssHA1_Glycneg(“CT600_GlycNeg”)的mRNA或用编码重组MOMP血清变型E蛋白的mRNA作为对照进行免疫后，在小鼠中诱导(A)CD4+IFNγT细胞应答和(B)CD8+IFNγT细胞应答。

图22示出了在用编码非MOMP Ct抗原CT443_ssHA1(“CT443”)、CT584_ssHA1_GlycNeg(“CT584_GlycNeg”)或CT600_trunc_ssHA1_Glycneg(“CT600_GlycNeg”)的mRNA或用编码重组MOMP血清变型E蛋白的mRNA作为对照进行免疫后，小鼠中产生IFNγ(“IFNg”)、IL2和/或TNFα(“TNFa”)(单独和以其各种组合形式)中的每一者的(A)CD4+ T细胞和(B)CD8+ T细胞的百分比。

图23示出了在用编码非MOMP Ct抗原CT443_ssHA1(“CT443 mRNA”)、CT584_ssHA1_GlycNeg(“CT584 mRNA”)、CT600_trunc_ssHA1_Glycneg(“CT600 mRNA”)的mRNA或用重组蛋白(rProt)CT584、CT600和CT443中的一者对小鼠进行免疫后，使用ELISA测量的抗原特异性IgG水平。

图24示出了在用编码非MOMP Ct抗原CT443_ssHA1(“CT443”)、CT443_ssHA1_GlycNeg(“CT443_GN”)、CT584_ssHA1(“CT584”)、CT584_ssHA1_GlycNeg(“CT584_GN”)、CT584_ssHA1_C2S(“CT584_C2S”)、CT600_trunc_ssHA1_Glycneg(“CT600_trunc”)、CT600_trunc_ssHA1_Glycneg(“CT600_trunc_GN”)、CT812_pass-domain_ssHA1(“CT812_pass-dom”)、CT812_pass-domain_ssHA1_C2S(“CT812_pass-dom_CS2”)、CT812_ext-pass-domain_ssHA1(“CT812_ext-pass-dom”)或CT812_ext-pass-domain_ssHA1_C2S(“CT812_ext-pass-dom_C2S”)的mRNA对小鼠进行免疫后，使用ELISA测量的IgG与血清变型E的EB的结合水平。

图25示出了在用编码非MOMP Ct抗原的mRNA对小鼠进行免疫后，使用ELISA测量的IgG与血清变型D的EB的结合水平，如上文在图24的图例中所述。

图26示出了在用编码非MOMP Ct抗原的mRNA对小鼠进行免疫后，使用ELISA测量的IgG与血清变型G的EB的结合水平，如上文在图24的图例中所述。

图27示出了在用编码各种嵌合MOMP VD多肽的mRNA、用编码全长MOMP多肽的mRNA或用rMOMP蛋白对小鼠进行免疫后，使用ELISA测量的抗原特异性IgG水平。

图28示出了在用编码各种嵌合MOMP VD多肽的mRNA、用编码全长MOMP多肽的mRNA或用rMOMP蛋白对小鼠进行免疫后，使用ELISA测量的IgG与血清变型E的EB的结合水平。

图29示出了在用编码各种嵌合MOMP VD多肽的mRNA、用编码全长MOMP多肽的mRNA或用rMOMP蛋白对小鼠进行免疫后，使用ELISA测量的IgG与血清变型D的EB的结合水平。

图30示出了在用编码各种嵌合MOMP VD多肽的mRNA、用编码全长MOMP多肽的mRNA或用rMOMP蛋白对小鼠进行免疫后，使用ELISA测量的IgG与血清变型G的EB的结合水平。

图31示出了在用两种不同LNP配制品中编码MOMP_P3_ssHA1(“P3”)或MOMP_VDcomb2-extS_ssHA1_Glycneg(“C2-S-GN”)的mRNA进行免疫后，在小鼠中诱导(A)CD4+IFNγT细胞应答、(B)CD8+IFNγT细胞应答和(C)CD4+IFNγ+IL2+ TNFα+细胞群。空LNP用作对照。

图32示出了在用两种不同LNP配制品中编码MOMP_VDcomb2-extS_ssHA1_Glycneg(“C2-S-GN”)的mRNA对小鼠进行免疫后，使用ELISA测量的(A)针对血清变型E的重组MOMP(rMOMP)的抗原特异性IgG水平和(B)IgG与血清变型E的EB的结合水平。空LNP和免疫前血清(“免疫前”)用作对照。

图33示出了在用如实例12中所述的多价组合物(配制在两种不同的LNP配制品中并且以三种不同的剂量配制)进行免疫后，在小鼠中诱导产生IFNγ(“IFNy”)、IL2和/或TNFα(单独和以其各种组合形式)的(A)CD4+IFNγT细胞应答和(B)CD4+ T细胞的百分比。对应于用于14.4μg和4.8μg mRNA剂量的LNP的量(“当量LNP”)的空LNP用作对照。

图34示出了在用如实例12中所述的多价组合物(配制在两种不同的LNP配制品中并且以三种不同的剂量配制)进行免疫后，在小鼠中诱导产生IFNγ(“IFNy”)、IL2和/或TNFα(单独和以其各种组合形式)的(A)CD8+IFNγT细胞应答和(B)CD8+ T细胞的百分比。对应于用于14.4μg和4.8μg mRNA剂量的LNP的量(“当量LNP”)的空LNP用作对照。

图35示出了在用如实例12中所述的多价组合物(在两种不同的LNP配制品中并且以三种不同的剂量)对小鼠进行免疫后，使用ELISA测量的(A)针对血清变型E的重组MOMP(rMOMP)的抗原特异性IgG水平和(B)IgG与血清变型E的EB的结合水平。由对应于用于14.4μg和4.8μg mRNA剂量的LNP的量(“当量LNP”)的空LNP诱导并在免疫前血清(“免疫前”)中的IgG显示为对照。

图36示出了在用如实例12中所述的多价组合物(在两种不同的LNP配制品中并且以三种不同的剂量)对小鼠进行免疫后，使用ELISA测量的针对(A)CT443蛋白和(B)CT584蛋白的抗原特异性IgG的水平。由对应于用于14.4μg和4.8μg mRNA剂量的LNP的量(“当量LNP”)的空LNP诱导并在免疫前血清(“免疫前”)中的IgG显示为对照。

图37示出了在用编码单价多肽的mRNA或如实例13中所述的多价组合物(配制在(A)“脂质D”或(B)“脂质G”中)对小鼠进行免疫后，使用ELISA测量的IgG与血清变型E的EB的结合水平。***对应于p<0.001的p值。

图38示出了在用编码单价多肽的mRNA或如实例13中所述的多价组合物(配制在(A)“脂质D”或(B)“脂质G”中)对小鼠进行免疫后，使用ELISA测量的IgG与血清变型G的EB的结合水平。***对应于p<0.001的p值。

图39示出了在用编码单价多肽的mRNA或如实例13中所述的多价组合物(配制在(A、C、E)“脂质D”或(B、D、F)“脂质G”中)对小鼠进行免疫后，使用ELISA测量的IgG与重组蛋白(A和B：MOMP；C和D：CT443；E和F：CT584)的结合水平。

具体实施方式

实例1-沙眼衣原体(Ct)抗原构建体的设计

T细胞构建体(经修饰的MOMP多肽构建体)的设计

为了引发MOMP特异性T细胞应答，特别是MOMP特异性IFNγ+CD4+T细胞，制备了编码经修饰的MOMP多肽抗原的mRNA构建体，即MOMP T细胞构建体。

使用基于结构的策略设计MOMP T细胞构建体MOMP_P3_ssHA1(“P3”)和MOMP_P5_ssHA1(“P5”)以替代VD1-4区域(其含有B细胞表位)。

作为结构指导设计的基础，使用Alphafold2(深思考公司)创建MOMP蛋白的3D模型。所得MOMP模型结构可描述为由10条反平行β链组成的β-桶。VD1-4区域位于连接各个β链的环中，所有β链都位于桶结构的同一侧。

为了设计VD1-4环的置换序列，将每个VD序列映射到MOMP模型结构上。测量每个VD区域的起点和终点之间的距离，并估计覆盖每个VD的起点和终点之间的该距离所需的近似肽序列长度。

使用可通过Maestro(v12.8，薛定谔公司(Schrodinger))获得的“交联蛋白”(CS)方案在MOMP模型结构上构建不同长度和氨基酸组成的肽序列，以替代VD区域。在对所得MOMP结构进行能量最小化和目视检查之后，选择6个MOMP VD-替代的序列的候选列表用于进一步分析。

为了避免与新设计的VD-替代的MOMP序列的人交叉反应性相关的问题，将VD-替代的MOMP序列中的8个或更多个氨基酸的序列基序(其也存在于人蛋白质组中)从潜在的设计中排除。

最后，选择VD1-4-替代的MOMP序列，其中预计VD置换肽/环对整体MOMPβ-桶结构具有最小影响，并且其与人蛋白质组中存在的序列不具有相同的序列基序(8个或更多个氨基酸)。

所得T细胞构建体MOMP_P3_ssHA1(“P3”)和MOMP_P5_ssHA1(“P5”)分别由SEQ IDNO:53和57给出。

B细胞构建体(嵌合MOMP VD多肽构建体)的设计

为了引发MOMP特异性抗体(B细胞)应答，制备了编码嵌合MOMP VD多肽抗原的另外的mRNA构建体，即MOMP B细胞构建体。

示例性的B细胞构建体是通过组合来自沙眼衣原体的4个血清变型(SerD、SerE、SerF和SerG)的可变结构域(VD)而设计的嵌合体。获得嵌合抗原，其组合了来自不同血清变型的4个可变结构域(VD1至VD4)中的每一者的拷贝，以这种方式设计以便能够诱导交叉血清变型免疫(抗体)应答。跨血清变型的VD环的蛋白质序列比较(SEQ ID NO:5至20)表明：

●SerD和SerE的VD1环高度类似，并且SerF和SerG的VD1环相同

●SerD和SerE的VD2环高度类似，并且SerF和SerG的VD2环高度类似

●SerD和SerF的VD3环相同，并且SerF和SerG的VD3环高度类似

●SerD和SerE的VD4环高度类似，并且SerF和SerG的VD4环高度类似

假设在两个血清变型之间高度类似或相同的VD环序列可能有助于至少在这两个血清变型之间的交叉血清变型应答。因此，所设计的嵌合体包含VD1、VD2和VD4中的每一者各两个(即，对于每个VD环，来自D或E的1个VD+来自F或G的1个VD)。由于与人蛋白的推定同源性，设计中排除了来自SerE的VD3，并且仅包括一个VD3(来自SerG或SerD/F*)。

为了使VD环维持在结构上与原生MOMP内的VD环类似的构象，在所设计的构建体中包括VD环任一侧的一些侧翼残基。设计了VD环任一侧的侧翼序列长度不同的两个构建体组(extP和extS)。

还设计了具有不同VD环组合的两个构建体组(VDcomb1和VDcomb2)。

●VDcomb1含有以下VD环：

VD1(serD)–VD1(serF/G*)–VD2(serE)–VD2(serF)–VD3(serG)–VD4(serE)–VD4(serG)

●VDcomb2含有以下VD环：

VD1(serE)–VD1(serF/G*)–VD2(serD)–VD2(serG)–VD3(serD/F*)–VD4(serD)–VD4(serF)

*来自这些血清变型的该特定VD的序列是相同的所得B细胞构建体由根据SEQ IDNO:61-92的蛋白质序列给出。

实例2-mRNA构建体的表达

提供了编码挑选的沙眼衣原体(Ct)抗原的mRNA构建体，并按照“方法”部分所述在HeLa细胞中进行了表达。

结果

如下表4所示，在裂解物和/或上清液中表达和检测了以下构建体。上清液中的表达表明蛋白质被分泌。

ssHA1＝SEQ ID NO:187的信号肽序列；ssHA2＝SEQ ID NO:188的信号肽序列；TMB1＝SEQ ID NO:189的跨膜结构域序列；TMB2＝SEQ ID NO:190的跨膜结构域序列；FL＝全长蛋白；C2S＝含有半胱氨酸到丝氨酸突变的变体，这些突变被设计为去除任何二硫桥；GlycNeg＝含有被设计为防止糖基化的点突变的变体；P3和P5＝MOMP变体(T细胞构建体)，其中根据实例1中描述的设计策略使用基于结构的策略替代可变环(VD)；VDcomb＝嵌合MOMP变体(B细胞构建体)，其中根据实例1中描述的设计策略组合来自不同血清变型的可变环(VD)；extP和extS＝VDcomb构建体，其在所包括的VD的任一侧具有不同长度的侧翼序列(参见实例1的设计策略)；trunc＝相关蛋白质的截短形式；CT812_pass-domain＝对应于CT812的氨基酸残基52-1003的CT812片段(SEQ ID NO:515)；CT812_ext_pass-domain＝对应于CT812的氨基酸残基52-1179的CT812片段(SEQ ID NO:515)；HPXn-n_HPXn-n＝其中也存在于人蛋白质组中的8个或更多个氨基酸的序列基序被突变以避免人交叉反应性的构建体；N.D.＝未确定。

表4-在HeLa细胞中表达的mRNA构建体

方法

将HeLa细胞以15万个细胞/孔在1mL EMEM+10％ FBS中铺板在12孔板中。第二天用1μg/孔的衣原体mRNA构建体和lipofectamine 2000转染细胞。

裂解物的制备

22-24小时后收获细胞并在每孔250μL的CelLytic M+1x HALT中裂解。将裂解物在冰上孵育10分钟，然后在微量离心机中以最大速度在4℃下澄清10min。将15μL裂解物与5μL含有还原剂的NuPAGE LDS样品缓冲液合并。将还原后的样品在85℃下孵育5分钟。

上清液样品的制备

转染后22-24小时收获上清液。将15μL上清液与5μL含有还原剂的NuPAGE LDS样品缓冲液合并。将还原后的样品在85℃下孵育5分钟。

分析

将所得裂解物或上清液样品在185V下在8％-16％梯度SDS-PAGE上运行60分钟。将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。将印迹用Intercept封闭缓冲液在4℃下封闭过夜。将印迹用抗沙眼衣原体MOMP多克隆抗体(对于全长MOMP构建体、T细胞构建体、B细胞构建体和对照构建体)、抗CT443多克隆血清(对于CT443构建体)、抗CT584多克隆血清(对于CT584构建体)、抗CT600多克隆血清(对于CT600构建体)或抗CT812多克隆血清(对于CT812构建体)染色。在室温(RT)下，在Intercept封闭缓冲液+0.2％ Tween 20中进行抗体染色，持续2小时。将印迹用TBST洗涤3×5分钟。将印迹用抗沙眼衣原体MOMP多克隆抗体染色，然后用驴抗山羊800二抗在Intercept封闭缓冲液+0.2％ Tween 20中于RT下染色1小时。将用抗CT443、抗CT584、抗CT600或抗CT812多克隆血清染色的印迹随后用驴抗兔800二抗在Intercept封闭缓冲液+0.2％ Tween 20中于室温下染色1小时。将印迹用TBST洗涤4×5分钟。在Licorodyssey上扫描印迹。

实例3-重组蛋白在大肠杆菌中的表达

使用标准方法将编码Ct抗原的DNA构建体克隆到基于T7启动子的表达载体中，以在大肠杆菌中表达。用载体转化大肠杆菌(BL21 DE3)。用IPTG诱导蛋白质表达。使用镍螯合色谱法从包涵体中纯化构建体，然后使用表5中列出的缓冲液进行蛋白质重折叠。

表5：构建体和用于每个构建体的重折叠缓冲液的组成

使用SDS-PAGE凝胶电泳在还原条件下分析纯化后的构建体。对于除MOMP_serE_FL之外的所有构建体进行使用抗His标签抗体的蛋白质印迹，并且在每种情况下在印迹上以预期分子量检测表达产物。在非还原条件下的SDS-PAGE表明，MOMP_serE_FL采用三聚体形式。通过差示扫描量热法(DSC)评估构建体稳定性和构象，并使用圆二色性(CD)评估二级结构。

实例4-用MOMP mRNA构建体进行免疫在小鼠中引发交叉血清变型T细胞应答

检测所选择的mRNA构建体引发T细胞应答的能力，这些构建体编码递送野生型(WT)全长MOMP(“mRNA MNR MOMP E FL”；SEQ ID NO:155的编码蛋白)和不具有可变结构域VD2和VD4的MOMP(“mRNA UNR MOMP E DII:IV”；SEQ ID NO:157的编码蛋白)的原生SS-MOMP。SS-MOMP＝Ct MOMP的原生分泌信号序列(SEQ ID NO:192)。如本文所用，MNR＝经修饰的mRNA(其中所有尿苷核苷均被1-甲基假尿苷替代)。UNR＝未经修饰的mRNA(含有未经修饰的尿苷核苷)。如本文在实例中所用，经修饰的mRNA(或MNR)具有如SEQ ID NO所示的核酸序列，其中所有尿苷核苷均已被1-甲基假尿苷替代。

在“mRNA UNR MOMP E DII:IV”构建体中，编码可变环VD2和VD4的核酸序列被编码仅含有甘氨酸残基的非原生环基序的序列替代，以去除包含在环中的任何免疫原性表位。

小鼠在0周和3周(W0和W3)时接受SS-MOMP构建体(2μg剂量)的两次免疫，这些构建体用LNP OF-02配制，通过IM途径给予。根据相同的方法用“mRNA MNR MOMP E FL”构建体注射两个额外的组，但剂量分别为0.5μg和0.125μg。在每组中免疫每组10只小鼠。研究包括两个阴性对照：PBS(5只小鼠)或空LNP OF-02(10只小鼠)。加强后十四天收集脾细胞。通过ELISPOT/FluoroSpot和通过细胞内细胞染色(ICCS)评估T特异性细胞应答。

LNP OF-02(“脂质A”)＝摩尔比为40％的阳离子脂质OF-02；摩尔比为1.5％的DMG-PEG2000；摩尔比为28.5％的胆固醇；和摩尔比为30％的DOPE

引发产IFNγ的T细胞的能力(FluoroSpot)

首先，使用FluoroSpot测试引发产IFNγ的T细胞的能力。对于FluoroSpot测定，在IL2(罗氏公司(Roche))存在下，将脾细胞(0.2×10⁶/孔)连同来自血清变型D、E和F的MOMP肽池一起和在无MOMP肽池的情况下铺板在200μl RPMI完全培养基中，各自一式三份培养。此处用于再刺激的重叠肽池由15个残基的肽组成，这些肽覆盖整个目标原生蛋白序列，其中连续肽之间有11个残基的重叠。随后，将板在37℃、5％ CO₂下孵育20h。用PBS洗涤后，将板与检测Ab抗IFNγ(mAb R4-6A2-BAM)一起在RT下孵育2h。在显微视觉读数器(Microvision Reader)上进行FluoroSpot测定的图像分析。

为了在如本文所述的ELISPOT/FluoroSpot测定中评估抗原特异性应答，在与特异性抗原(肽、蛋白质、完整细菌)一起孵育或在无抗原情况下孵育后评估细胞因子产生点的数量。在无抗原情况下孵育后检测到的细胞因子形成点的平均数被认为是测定阴性对照，并且从不同抗原刺激后形成的细胞因子形成点的数量中减去这一典型地非常少的点数量。这就是ELISPOT/FluoroSpot数据的归一化方法。因此，在如本文所述的ELISPOT/FluoroSpot测定中，将细胞与肽池一起和在无肽池的情况下铺板，从而同时评价对抗原刺激(有肽池)和无抗原刺激(无肽池)的应答。“无”肽数据用于将对应图中所示的抗原特异性数据归一化。

如图1所示，“mRNA MNR MOMP E FL”和“mRNA UNR MOMP E DII:IV”(2μg)均能够诱导相当水平的交叉血清变型应答性产IFNγ的T细胞，这表明尽管去除了VD环，但T细胞应答仍得以维持。应答是剂量依赖性的，其中在2μg与0.5μg之间几乎没有可观察到的差异。因此，在比较mRNA构建体的后续研究中使用0.125μg剂量。

引发CD4+IFNγ+和CD8+IFNγ+ T细胞应答的能力(ICCS)

还测试了MOMP mRNA构建体在小鼠中引发CD4+IFNγ+ T细胞和CD8+IFNγ+ T细胞的能力，这些细胞跨各种血清变型具有反应性。

对于ICCS，将分离的淋巴细胞在96孔板中以1×10⁶个细胞/孔用特异性血清变型E和F MOMP肽池(如上所述)活化，并在5％ CO₂中在37℃下用BFA培养6h，以阻断细胞因子分泌。收获活化的细胞，用于表面和细胞内细胞因子染色。通过与对CD3、CD4和CD8具有特异性的荧光缀合的单克隆抗体一起在冰上孵育20min进行细胞的表面染色。表面染色后，将细胞洗涤两次，固定并使用BD Cytofix/Cytoperm缓冲液(BD生物科学公司(BD Biosciences))在4℃下透化20min，并用BD Perm/Wash缓冲液洗涤两次。然后通过与抗鼠IL-2、IL-5、IL-10、TNF-α和IFN-γ的荧光缀合抗体一起在冰上孵育30min进行细胞内细胞因子染色。将细胞洗涤三次并用FACS Fortessa流式细胞仪(BD生物科学公司)分析。

如图2A所示，“mRNA MNR MOMP E FL”和“mRNA UNR MOMP E DII:IV”(2μg)均能够诱导交叉血清变型应答性CD4+IFNγ+ T细胞。“mRNA MNR MOMP E FL”(在多剂量下测试)的应答是剂量依赖性的。

如图2B所示，“mRNA MNR MOMP E FL”以剂量依赖性方式诱导交叉血清变型应答性CD8+IFNγ+细胞。“mRNA UNR MOMP E DII:IV”(2μg剂量)引发最小的CD8+IFNγ+ T细胞应答。

因此，去除VD环可提高CD4+IFNγ+ T细胞应答。

实例5-用MOMP mRNA进行免疫引发免疫应答

使用LNP配制的构建体(所有未经修饰的mRNA)对小鼠进行免疫。在每个研究组中免疫8只小鼠(Balb/c)。评估以下研究组(人前导序列＝SEQ ID NO:191的信号序列)：

-第1组：原初–阴性对照(LNP(MC3)缓冲液)

-第2组：UV EB+CpG初免和活加强(第一次用Ct原生小体(EB)(10⁷个UV灭活的EB的内含物形成单位(IFU))+20μg CpG佐剂进行初次免疫，第二次用10⁷个IFU活Ct血清变型EEB+20μg CpG佐剂进行加强免疫)

-第3组：rMOMP(重组血清变型E MOMP蛋白)(SEQ ID NO:134)；50μg剂量+20μg CpG佐剂

-第4组：MC3 Ser E MOMP(SEQ ID NO:148的编码蛋白)；5μg剂量

-第5组：MC3 Ser E MOMP(SEQ ID NO:148的编码蛋白)；0.5μg剂量

-第6组：具有人前导序列的MC3 Ser E MOMP(SEQ ID NO:149的编码蛋白)；5μg剂量

-第7组：具有人前导序列的MC3 Ser E MOMP(SEQ ID NO:149的编码蛋白)；0.5μg剂量

-第8组：OF-02Ser E MOMP(SEQ ID NO:151的编码蛋白)；5μg剂量

-第9组：OF-02Ser E MOMP(SEQ ID NO:151的编码蛋白)；0.5μg剂量

-第10组：具有人前导序列的OF-02Ser E MOMP(SEQ ID NO:152的编码蛋白)；5μg剂量

-第11组：具有人前导序列的OF-02Ser E MOMP(SEQ ID NO:152的编码蛋白)；0.5μg剂量

在第0天和第28天进行免疫，并在第0天、第14天、第28天和第42天进行放血。在第42天收集脾。

引发结合重组MOMP的IgG的能力(ELISA)

使用重组血清变型E MOMP在平板ELISA中评估稀释IgG滴度的倒数。与用MC3配制相比，用OF-02LNP配制在第42天产生更高的滴度(图3)。5μg的OF-02配制的构建体的滴度处于与EB+CpG和rMOMP+CpG对照的滴度相当的水平。

引发产IFNγ的T细胞的能力(ELISPOT)

如图4A、B和C所示，在脾IFNγELISPOT中评估T细胞应答。使用了不同的回忆抗原，并在各个图上方标出：“UV EB”代表UV灭活的EB(图4A)，“rMOMP”代表重组血清变型E MOMP蛋白(图4B)，并且“总肽池”代表重叠血清变型E MOMP肽池(如上所述)(图4C)。

这些数据表明，用OF-02或MC3配制的WT血清变型E MOMP mRNA进行免疫引发MOMP特异性产IFNγ的T细胞，并且这些T细胞响应于所测试的回忆抗原中的任一种而被引发。

实例6-缺乏一个或多个VD环的MOMP构建体诱导T细胞应答

测试了递送没有可变结构域的MOMP的另外的mRNA(UNR)构建体引发T细胞应答的能力。

可变结构域的去除不损害引发IFNγMOMP T细胞应答的能力

在本实例中，用MOMP mRNA构建体(含有未经修饰的mRNA)或重组MOMP对照对小鼠(雌性C57BL/6)进行免疫，以测试单独或以组合形式从MOMP血清变型E中系统性去除可变结构域环VD1、VD2、VD3、VD4的影响。在ΔVD构建体中，对核酸序列进行了修饰，使得可变环被含有甘氨酸残基的非原生环基序替代，以去除包含在环中的任何免疫原性表位。例如，ΔVD1编码血清变型E MOMP，其中VD1环被六个Gly残基替代。除Δ-信号肽mRNA构建体之外，所有mRNA构建体还编码了(SEQ ID NO:192的)原生信号序列。

进行了如下表(表6和表7)所示的两项研究，并且图5A和B中呈现的数据分别示出了对来自这些组中的小鼠的脾细胞的分析：

表6-图5A中所示的研究组

表7-图5B中所示的研究组

通过测量从脾收集的T细胞产生IFNγ的水平，使用ELISPOT测定来评价肌内(IM)注射后小鼠的T细胞应答。在小鼠最后一次放血(34/35)的当天收集来自个体小鼠的脾，并通过ELISPOT评估脾细胞中的T细胞应答，其中使用血清变型E MOMP的重叠肽池(如上所述)作为回忆抗原以刺激T细胞应答。

图5A和B示出了用mRNA构建体免疫和用回忆抗原刺激后T细胞的IFNγ产生水平。数据表明，信号序列的去除可消除T细胞应答。

用编码MOMP血清变型E的mRNA(其中去除了一个或多个可变结构域环VD1、VD2、VD3和VD4，及其各种组合)进行免疫可产生与FL MOMP血清变型E类似(甚至更强)的T细胞应答。因此，可变结构域的去除不损害引发IFNγMOMP T细胞应答的能力。

没有可变环VD2和VD4的MOMP能够引发免疫应答

将编码没有DII(VD2)和DIV(VD4)结构域(DIIDIV)的MOMP的未经修饰的(UNR)mRNA，即“mRNA UNR MOMP E DII:IV”(SEQ ID NO:157的编码蛋白)与重组MOMP蛋白(SEQ IDNO:134)进行比较，以确定其诱导T细胞应答的能力。在“mRNA UNR MOMP E DII:IV”构建体中，可变环VD2和VD4被含有甘氨酸残基的非原生环基序取代，以去除包含在环中的任何免疫原性表位。

在0周和3周(W0和W3)时，小鼠(每组中N＝15)分别以2和5μg剂量接受缺失DII和DIV结构域(DIIDIV)的未经修饰的(UNR)MOMP mRNA原生SS-构建体(原生序列信号)(“mRNAUNR MOMP E DII:IV”)和重组MOMP蛋白(serE)的两次免疫，二者分别用LNP OF-02或含有TLR4激动剂的基于脂质体的佐剂(SPA14，如WO 2022090359中所述)配制，通过IM途径给予。向对照组(N＝15)注射PBS。研究包括阴性PBS对照。在加强后七天、十一天和十四天收集脾细胞。通过ELISPOT/FluoroSpot和通过ICCS评估T特异性细胞应答。

引发产IFNγ的T细胞的能力(FluoroSpot)

首先，使用FluoroSpot测试引发产IFNγ的T细胞的能力。对于FluoroSpot测定，在IL2(罗氏公司)存在下，将脾细胞(0.2、0.5和1×10⁶/孔)连同来自血清变型E的MOMP肽池(如上所述)一起和在无MOMP肽池的情况下铺板在200μl RPMI完全培养基中，各自一式三份培养。随后，将板在37℃、5％CO₂下孵育20h。用PBS洗涤后，将板与检测Ab抗IFNγ(mAb R4-6A2-BAM)一起在RT下孵育2h。在显微视觉读数器(Microvision Reader)上进行FluoroSpot测定的图像分析。

如图6A所示，相对于用佐剂配制的重组MOMP蛋白，MOMP DIIDIV UNR mRNA(即“mRNA UNR MOMP E DII:IV”)能够诱导相当水平的产IFNγ的T细胞。在第7天、第11天和第14天，在这些抗原之间观察到高水平的产IFNγ的T细胞。因此，相对于用SPA14佐剂配制的rMOMP，可变结构域VD2和VD4的去除不损害引发IFNγMOMP T细胞应答的能力。

引发CD4+IFNγ+和CD8+IFNγ+细胞应答的能力(ICCS)

还使用ICCS比较了“mRNA UNR MOMP E DII:IV”构建体与重组MOMP蛋白引发CD4+IFNγ+细胞和CD8+IFNγ+细胞的能力。

对于ICCS，将分离自D7、D11和D14脾细胞样品的淋巴细胞在96孔板中以1×10⁶个细胞/孔用特异性血清变型E-MOMP肽池(如上所述)活化，并在5％ CO₂中在37℃下用BFA培养6h，以阻断细胞因子分泌。收获活化的细胞，用于表面和细胞内细胞因子染色。通过与对CD3、CD4和CD8具有特异性的荧光缀合的单克隆抗体一起在冰上孵育20min进行细胞的表面染色。表面染色后，将细胞洗涤两次，固定并使用BD Cytofix/Cytoperm缓冲液(BD生物科学公司(BD Biosciences))在+4℃下透化20min，并用BD Perm/Wash缓冲液洗涤两次。然后通过与抗鼠IL-2、IL-5、IL-10、TNF-α和IFNγ的荧光缀合抗体一起在冰上孵育30min进行细胞内细胞因子染色。将细胞洗涤三次并用FACS Fortessa流式细胞仪(BD生物科学公司)分析。

如图6B所示，跨每个脾细胞样品(分别在加强后7天、11天和14天收集)，MOMPDIIDIV UNR mRNA(即“mRNA UNR MOMP E DII:IV”)和重组MOMP蛋白两者均能够引发CD4+IFNγ细胞的产生。如图6C所示，MOMP DIIDIV UNR mRNA也引发CD8+IFNγ细胞应答，而重组MOMP蛋白不引发。

总之，与rMOMP一样，MOMP DIIDIV UNR mRNA引发显著的CD4+IFNγ细胞应答。另外，其示出了对于rMOMP不存在的CD8+IFNγ细胞应答。

实例7-T细胞构建体引发强烈T细胞应答

T细胞构建体能够引发T细胞应答

7.1在LNP OF-02中配制MOMP变体的以下mRNA构建体(包括实例1中设计的那些；所有均经修饰)并测试它们产生T细胞应答的能力：

-MOMP_P3_ssHA1(“P3”)(SEQ ID NO:53的编码蛋白)

-MOMP_P5_ssHA1_C2S(“P5 C2S”)(SEQ ID NO:59的编码蛋白)

-MOMP_serE_FL_ssHA1(“FL”)(SEQ ID NO:29的编码蛋白)

-MOMP_serE_FL_ssHA1_C2S_Glycneg(“FL C2S Glycneg”)(SEQ ID NO:35的编码蛋白)

-空LNP OF-02

小鼠在0周和3周(W0和W3)时以0.125μg剂量接受mRNA ssHA1-构建体(包含来自血凝素H1N1 A/Caledonia/20/1999的序列信号；ssHA1由SEQ ID NO:187给出)的两次免疫，这些构建体用LNP OF-02配制，通过IM途径给予。研究包括阴性空-LNP对照和阳性全长-MOMP-血清变型E对照。加强后两周收集脾细胞。通过ELISPOT/FluoroSpot和通过ICCS评估T特异性细胞应答。

7.2在第二项研究中，在LNP OF-02中配制MOMP变体的以下mRNA构建体(包括实例1中设计的那些；所有均经修饰)并测试它们产生T细胞应答的能力：

-MOMP_P3_ssHA1(“P3”)(SEQ ID NO:53的编码蛋白)

-MOMP_P3_ssHA1_C2S(“P3 C2S”)(SEQ ID NO:55的编码蛋白)

-MOMP_P5_ssHA1(“P5”)(SEQ ID NO:57的编码蛋白)

-MOMP_P5_ssHA1_C2S(“P5 C2S”)(SEQ ID NO:59的编码蛋白)

-MOMP_serE_FL_ssHA1(“Ser E FL”)(SEQ ID NO:29的编码蛋白)

-MOMP_serD_FL_ssHA1(“Ser D FL”)(SEQ ID NO:21的编码蛋白)

-空LNP OF-02

小鼠在0周和3周(W0和W3)时以0.125μg或2μg剂量接受mRNA ssHA1-构建体(包含来自血凝素H1N1 A/Caledonia/20/1999的序列信号；ssHA1由SEQ ID NO:187给出)的两次免疫，这些构建体用LNP OF-02配制，通过IM途径给予。研究包括阴性空-LNP对照和阳性全长-MOMP-血清变型E和全长-MOMP-血清变型D对照。加强后一周收集脾细胞。通过ELISPOT/FluoroSpot(0.125μg剂量)和通过ICCS(2μg剂量)评估T特异性细胞应答。除非另有说明，否则本实例中提供的结果均获自第7.1点中所述的研究。

引发产IFNγ的T细胞和IL-5应答的能力(FluoroSpot)

首先，使用FluoroSpot测试引发产IFNγ和产IL-5的T细胞的能力。对于FluoroSpot测定，在IL2(罗氏公司)存在下，将脾细胞(2×10⁵/孔)连同来自血清变型D、E、F、G和J(在图7-8中分别为从左到右/从浅灰色到深灰色)的MOMP肽池(如上所述)一起和在无MOMP肽池的情况下铺板在200μl RPMI完全培养基中，并一式三份培养。随后，将板在37℃、5％CO₂下孵育20h。用PBS洗涤后，将板与检测Ab抗IFNγ(mAb R4-6A2-BAM)或检测Ab抗IL-5(mAb TRFK4，生物素)一起在RT下孵育2h。在显微视觉读数器(Microvision Reader)上进行FluoroSpot测定的图像分析。

如图7所示，与MOMP_serE_FL_ssHA1(“FL”)一样，MOMP_P3_ssHA1(“P3”)和MOMP_P5_ssHA1_C2S(“P5 C2S”)产生了大量交叉血清变型应答性产IFNγ的T细胞。相反，MOMP_serE_FL_ssHA1_C2S_Glycneg(“FL C2S Glycneg”)引发的交叉血清变型应答性产IFNγ的T细胞应答水平并未高于空LNP的水平。

如图8所示，所有免疫样品(MOMP_P3_ssHA1(“P3”)、MOMP_P5_ssHA1_C2S(“P5C2S”)、MOMP_serE_FL_ssHA1(“FL”)、MOMP_serE_FL_ssHA1_C2S_Glycneg(“FL C2SGlycneg”)和空LNP)均诱导低水平的交叉血清变型应答性产IL-5的细胞，这表明最小的Th2应答。

还使用上文所述的FluoroSpot(每孔铺板1×10⁵个脾细胞)测试了在第7.2节中详述的研究中评价的mRNA构建体引发产IFNγ的T细胞的能力。

如图9中所示，在7.2节中详述的研究中测试的所有mRNA构建体均产生大量交叉血清变型应答性产IFNγ的T细胞。

引发CD4+IFNγ+、CD8+IFNγ+和多功能细胞应答的能力(ICCS)

还测试了MOMP mRNA构建体在小鼠中引发CD4+IFNγ+细胞、CD8+IFNγ+细胞和多功能细胞的能力。

对于ICCS，将分离的淋巴细胞在96孔板中以1×10⁶个细胞/孔用特异性血清变型E-MOMP肽池(如上所述)活化，并在5％ CO₂中在37℃下用BFA培养6h，以阻断细胞因子分泌。收获活化的细胞，用于表面和细胞内细胞因子染色。通过与对CD3、CD4和CD8具有特异性的荧光缀合的单克隆抗体一起在冰上孵育20min进行细胞的表面染色。表面染色后，将细胞洗涤两次，固定并使用BD Cytofix/Cytoperm缓冲液(BD生物科学公司(BD Biosciences))在+4℃下透化20min，并用BD Perm/Wash缓冲液洗涤两次。然后通过与抗鼠IL-2、IL-5或IL-17、IL-10、TNF-α和IFNγ的荧光缀合抗体一起在冰上孵育30min进行细胞内细胞因子染色。将细胞洗涤三次并用FACS Fortessa流式细胞仪(BD生物科学公司)分析。

如图10A所示，与MOMP_serE_FL_ssHA1(“FL”)一样，MOMP_P3_ssHA1(“P3”)和MOMP_P5_ssHA1_C2S(“P5 C2S”)产生了显著的CD4+IFNγT细胞应答。相反，MOMP_serE_FL_ssHA1_C2S_Glycneg(“FL C2S Glycneg”)并未产生可与空LNP对照区分开的CD4+IFNγT细胞应答。

如图10B所示，对于所测试的构建体，CD8+IFNγT细胞应答不存在或低得多。

还评估了MOMP mRNA构建体诱导多功能细胞的能力。图12示出了，对于每种mRNA构建体，所引发的MOMP特异性CD4+ T细胞的百分比，并且指示了产生IFNγ(“IFNg”)、IL2和/或TNFα(单独和以其各种组合形式)中的每一者的CD4+ T细胞的相对百分比。对于MOMP_P3_ssHA1(“P3”)、MOMP_P5_ssHA1_C2S(“P5 C2S”)和MOMP_serE_FL_ssHA1(“FL”)中的每一者，CD4+IFNγ+IL2+ TNFα+细胞群相对于其他细胞群占多数。对于任何所测试的构建体，几乎没有观察到IL5或IL10(数据未示出)。

类似地测试了在第7.2节中描述的研究中评价的MOMP mRNA构建体在小鼠中引发MOMP特异性CD4+IFNγ+细胞、CD8+IFNγ+ T细胞和多功能细胞的能力。

如图11A所示，所有MOMP mRNA构建体均产生可与空LNP对照区分开的显著CD4+IFNγT细胞应答。与全长MOMP mRNA构建体相比，MOMP_P3_ssHA1(“P3”)、MOMP_P5_ssHA1(“P5”)、MOMP_P3_ssHA1_C2S(“P3 C2S”)和MOMP_P5_ssHA1_C2S(“P5 C2S”)的CD4+IFNγT细胞应答略高。

如图11B所示，除了MOMP_P5_ssHA1_C2S(“P5 C2S”)和MOMP_serD_FL_ssHA1(“SerDFL”)构建体之外，对于所测试的构建体，CD8+IFNγT细胞应答不存在或低得多。

还评价了在7.2节中描述的研究中评价的MOMP mRNA构建体诱导多功能细胞的能力。图13示出了，对于每种MOMP mRNA构建体，所引发的MOMP特异性CD4+ T细胞的百分比，并且指示了产生IFNγ(“IFNg”)、IL2和/或TNFα(单独和以其各种组合形式)中的每一者的CD4+ T细胞的相对百分比。对于所有测试的MOMP mRNA构建体，CD4+IFNγ+IL2FFNFα+细胞群相对于其他细胞群占多数。对于任何所测试的构建体，几乎没有观察到IL-17或IL-10(数据未示出)。

T细胞构建体引发低水平的rMOMP结合抗体

还评价了MOMP mRNA构建体以确定它们是否引发重组MOMP(rMOMP)结合抗体。在第0周(W0)和最后一次疫苗施用后一周，根据上文第7.2节中描述的方案收集血液样品，以便通过ELISA测量总IgG。使用自动384ELISA从个体血清中测量特异性IgG。

简而言之，将384孔微孔板在碳酸盐缓冲液中用20μL/孔的重组MOMP蛋白以2μg/mL包被，并在+4℃下保持过夜。去除包被溶液并用缓冲液1(PBS/Tween 0.05％)洗涤。将游离位点用75μL缓冲液2(PBS/0.05％ Tween20/牛奶1％)封闭，并在室温(RT)下孵育90min。将板清空，然后在微孔板中在20μL体积下在缓冲液2中连续稀释血清(12倍)。将板在RT下孵育90min，然后用缓冲液1洗涤。在每个孔中添加20μl稀释的抗小鼠总IgG过氧化物酶缀合物(南方生物科技公司(southernbiotech))(1/2000)。在RT下孵育90min后，将板用缓冲液1洗涤。通过在每个孔中添加20μL四甲基联苯胺底物溶液来进行反应。在RT下30min后，用HCl(1N(当量浓度))化学终止反应，并在分光光度计(Synergy HTX，伯腾仪器公司(Biotek))上测量450-650nm处的吸光度。在Softmax Pro软件中使用标准曲线分析结果，并通过OD为1时对应的倒数稀释度以任意ELISA单位表示。

如图14所示，所测试的MOMP mRNA构建体(“P3”、“P3 C2S”、“P5”和“P5 C2S”)引发低水平的重组MOMP结合抗体。正如预期的那样，水平与免疫前血清中或用空LNP观察到的水平类似，这是由于这些构建体缺乏可变结构域环。

实例8-用非MOMP抗原进行免疫诱导免疫应答

非MOMP Ct蛋白构建体诱导T细胞应答

用各种Ct非MOMP重组蛋白，连同重组MOMP蛋白或MOMPΔVD1234mRNA的对照，对小鼠(雌性C57BL/6)进行免疫。研究组如下表8所示：

表8-研究组

通过测量从脾收集的T细胞所产生的IFNγ生产水平，使用ELISPOT测定来评价免疫后小鼠的T细胞应答。从小鼠收集来自个体小鼠的脾，并通过ELISPOT评估脾细胞中的T细胞应答，其中使用和不使用上述相关的特定原生MOMP或非MOMP的重叠肽库作为回忆抗原以刺激T细胞应答。

如图15所示，重组(r)非MOMP蛋白“rCT584”、“rCT812”、“rCT600”和“rCT443”各自以比EB高得多的水平诱导产IFNγ的T细胞。由重组MOMP蛋白(“rMOMP”；SEQ ID NO:134)和编码缺乏VD环1-4的MOMP血清变型E的mRNA(“mRNA MOMPΔVD1234”)引发的应答也包括在内，用于比较。

编码非MOMP Ct抗原的mRNA构建体诱导T细胞应答

用编码各种Ct非MOMP抗原片段的未经修饰的(UNR)mRNA以及配制在基于cKK-e10的LNP中的“mRNA MOMPΔVD1234”构建体对小鼠(雌性C57BL/6)进行免疫(IM)。LNP cKK-e10(“脂质B”)＝摩尔比为40％的阳离子脂质cKK-e10；摩尔比为1.5％的DMG-PEG2000；摩尔比为28.5％的胆固醇；和摩尔比为30％的DOPE。

研究组如下表9所示：

表9-研究组

Nan96-SS是由SEQ ID NO:187给出的ssHA1分泌信号。冒号后的编号表示非MOMP蛋白CT443、CT600和CT812中的每一者的相关片段的起始和终止残基(相对于野生型进行编号)。在Nan96-SS构建体中，编码SEQ ID NO:187的ssHA1分泌信号的核酸序列和非MOMP蛋白片段通过编码氨基酸DTI的核酸序列连接。

通过测量从脾收集的T细胞所产生的IFNγ生产水平，使用ELISPOT测定来评价免疫后小鼠的T细胞应答。从小鼠收集来自个体小鼠的脾(第35天)，并通过ELISPOT评估脾细胞中的T细胞应答，其中使用针对相关的特定MOMP或非MOMP的重叠肽池(如上所述)作为回忆抗原以刺激T细胞应答。

如图16所示，除了Nan96-SS:CT600:2-188之外，所有非MOMP片段mRNA构建体(CT812:1-1530、CT812:1-761、Nan96-SS:CT812:32-761、CT600:1-188、CT443:1-576、Nan96-SS:CT443:32-576)均产生与编码缺乏VD环1-4的MOMP血清变型E的mRNA(“MOMPΔVD1234”)相当水平的产IFNγ的T细胞。

因此，编码非MOMP Ct抗原片段的各种mRNA构建体也能够引发显著的产IFNγ的T细胞应答。

编码非MOMP Ct抗原的mRNA构建体诱导T细胞应答

将编码非MOMP Ct抗原“CT443”(Nan96-SS:CT443:32-576)、“CT584”(Nan96HA-SS:CT584:2-183)、“CT600”(Nan96HA-SS:CT600:2-188)和“CT812”(Nan96-SS:CT812:32-761)的mRNA与重组MOMP蛋白进行比较，以确定它们诱导T细胞应答的能力。

小鼠在0周和3周(W0和W3)时以2μg剂量接受未经修饰的mRNA原生信号序列构建体的两次免疫，这些构建体用基于cKK-e10的LNP配制，通过IM途径给予。研究包括阳性全长MOMP-血清变型E重组蛋白对照(SEQ ID NO:134)(5μg)+SPA14。在加强后第十一天和第十四天收集脾细胞。通过ELISPOT/FluoroSpot和通过ICCS评估T特异性细胞应答。

引发产IFNγ的T细胞的能力(FluoroSpot)

首先，使用FluoroSpot测试引发产IFNγ的T细胞的能力。对于FluoroSpot测定，在IL2(罗氏公司)存在下，将脾细胞(2×10⁵/孔)连同相应肽池(如上所述)一起和在无肽池的情况下以0.5至2μg/mL铺板在200μl RPMI完全培养基中，各自一式三份培养。随后，将板在37℃、5％ CO₂下孵育20h。用PBS洗涤后，将板与检测Ab抗IFNγ(mAb R4-6A2-BAM)一起在RT下孵育2h。在显微视觉读数器(Microvision Reader)上进行FluoroSpot测定的图像分析。

如图17所示，像重组MOMP血清变型E蛋白一样，编码非MOMP Ct抗原CT443、CT584和CT812的mRNA能够引发高水平的产IFNγ的T细胞。对编码非MOMP Ct抗原CT600的mRNA的应答较低。

因此，编码原生非MOMP Ct抗原(特别是CT443、CT584和CT812)的各种mRNA构建体能够引发强烈的产IFNγ的T细胞应答。

引发CD4+IFNγ+和CD8+IFNγ+细胞应答的能力(ICCS)

还测试了相同构建体在小鼠中引发CD4+IFNγ+细胞和CD8+IFNγ+细胞的能力。

对于ICCS，将分离的淋巴细胞在96孔板中以1×10⁶个细胞/孔用特异性相应肽池(如上所述)活化，并在5％ CO₂中在37℃下用BFA培养6h，以阻断细胞因子分泌。收获活化的细胞，用于表面和细胞内细胞因子染色。通过与对CD3、CD4和CD8具有特异性的荧光缀合的单克隆抗体一起在冰上孵育20min进行细胞的表面染色。表面染色后，将细胞洗涤两次，固定并使用BD Cytofix/Cytoperm缓冲液(BD生物科学公司(BD Biosciences))在+4℃下透化20min，并用BD Perm/Wash缓冲液洗涤两次。然后通过与抗鼠IL-2、IL-5、IL-10、TNF-α和IFNγ的荧光缀合抗体一起在冰上孵育30min进行细胞内细胞因子染色。将细胞洗涤三次并用FACS Fortessa流式细胞仪(BD生物科学公司)分析。

如图18A所示，跨每个脾细胞样品(1或2ug剂量且在加强后11天或14天收集)，编码非MOMP抗原CT443、CT584、CT600和CT812的mRNA产生CD4+IFNγ细胞应答，但该应答低于由重组MOMP蛋白引发的应答。

如图18B所示，跨每个脾细胞样品(1或2ug剂量且在加强后11天或14天收集)，编码非MOMP抗原CT584和CT812的mRNA，相对于CT443、CT600和重组MOMP蛋白，引发高CD8+IFNγ细胞应答。

非MOMP Ct抗原构建体能够诱导针对其编码蛋白的特异性IgG

在本实例中，测试了编码非MOMP Ct抗原的以下mRNA构建体(所有均经修饰)诱导针对其相应蛋白质的特异性IgG的能力：CT443_ssHA1(“CT443”；SEQ ID NO:105的编码蛋白)、CT443_ssHA1_GlycNeg(“CT443_GN”，SEQ ID NO:106的编码蛋白)、CT584_ssHA1(“CT584”，SEQ ID NO:107的编码蛋白)、CT584_ssHA1_Glycneg(“CT584_GN”，SEQ ID NO:108的编码蛋白)、CT584_ssHA1_C2S(“CT584_C2S”，SEQ ID NO:109的编码蛋白)、CT584_ssHA1_Glycneg_C2S(“CT584_GN_C2S”，SEQ ID NO:110的编码蛋白)、CT600_trunc_ssHA1(“CT600_trunc”；SEQ ID NO:111的编码蛋白)、CT600_trunc_ssHA1_Glycneg(“CT600_trunc_GN”，SEQ ID NO:112的编码蛋白)、CT812_pass-domain_ssHA1(“CT812_pass-dom”，SEQ ID NO:113的编码蛋白)、CT812_pass-domain_ssHA1_C2S(“CT812_pass-dom_C2S”，SEQID NO:114的编码蛋白)、CT812_ext-pass-domain_ssHA1(“CT812_ext-pass-dom”，SEQ IDNO:115的编码蛋白)、CT812_ext-pass-domain_ssHA1_C2S(“CT812_ext-pass-dom_C2S”，SEQ ID NO:116的编码蛋白)。

在两项独立研究的至少一项中，小鼠(C57Bl/6)在0周和3周(W0和W3)时以5μg剂量接受mRNA构建体的两次免疫，这些构建体用LNP OF-02配制，通过IM途径给予。研究包括阴性空OF-02LNP对照。在第0周(W0)和最后一次疫苗施用后两周收集血液样品，以便通过ELISA测量总IgG。使用自动384ELISA从个体血清中测量特异性IgG。

简而言之，将384孔微孔板在碳酸盐缓冲液中用20μL/孔的相应蛋白质(CT443(4μg/mL)、CT584(1μg/mL)、CT600(4μg/mL))包被，并在+4℃下保持过夜。去除包被溶液并用缓冲液1(PBS/Tween 0.05％)洗涤。将游离位点用75μL缓冲液2(PBS/0.05％ Tween 20/牛奶1％)封闭，并在室温(RT)下孵育90min。将板清空，然后在微孔板中在20μL体积下在缓冲液2中连续稀释血清(12倍)。将板在RT下孵育90min，然后用缓冲液1洗涤。在每个孔中添加20μl稀释的抗小鼠总IgG过氧化物酶缀合物(南方生物科技公司(southernbiotech))(1/1000)。在RT下孵育90min后，将板用缓冲液1洗涤。通过在每个孔中添加20μL四甲基联苯胺底物溶液来进行反应。在RT下30min后，用HCl(1N(当量浓度))化学终止反应，并在分光光度计(Synergy HTX，伯腾仪器公司(Biotek))上测量450-650nm处的吸光度。在Softmax Pro软件中使用标准曲线分析结果，并通过OD为1时对应的倒数稀释度以任意ELISA单位表示。

如图19所示，除了CT812之外，所有测试的样品均产生了针对其相应蛋白质具有特异性的高滴度的IgG，而CT812对于所有构建体引发较低IgG滴度。

编码非MOMP Ct抗原的mRNA构建体诱导T细胞应答

测试了编码非MOMP Ct抗原(CT443_ssHA1(“CT443”，SEQ ID NO:105的编码蛋白)、CT584_ssHA1_GlycNeg(“CT584_GlycNeg”，SEQ ID NO:108的编码蛋白)、CT600_trunc_ssHA1_Glycneg(“CT600_GlycNeg”，SEQ ID NO:112的编码蛋白))的另外的mRNA构建体(所有均经修饰)与编码MOMP_serE_FL_ssHA1(“MOMP ser E FL”；SEQ ID NO:29的编码蛋白)的mRNA对照相比诱导T细胞应答的能力。

小鼠在0周和3周(W0和W3)时以0.125μg剂量接受mRNA ssHA1-构建体的两次免疫，这些构建体用LNP OF-02配制，通过IM途径给予。研究包括阴性空-LNP(OF-02)和阳性MOMP_serE_FL_ssHA1对照。在加强后两周收集脾细胞，并通过ELISPOT/FluoroSpot和通过ICCS评估T特异性细胞应答。

引发产IFNγ的T细胞的能力(FluoroSpot)

首先，使用FluoroSpot测试引发产IFNγ的T细胞的能力。对于FluoroSpot测定，在IL2(罗氏公司)存在下，将脾细胞(2×10⁵/孔)连同相应的原生肽池(如上所述)一起和在无肽池的情况下铺板在200μl RPMI完全培养基中，各自一式三份培养。随后，将板在37℃、5％CO₂下孵育20h。用PBS洗涤后，将板与检测Ab抗IFNγ(mAb R4-6A2-BAM)一起在RT下孵育2h。在显微视觉读数器(Microvision Reader)上进行FluoroSpot测定的图像分析。

如图20所示，相对于MOMP serE FL构建体，CT443和CT584_GlycNeg构建体能够诱导类似高(甚至更强)水平的产IFNγ的T细胞。然而，CT600_GlycNeg并未诱导类似高水平的产IFNγ的T细胞。

引发CD4+IFNγ+、CD8+IFNγ+和多功能细胞应答的能力(ICCS)

对于ICCS，将分离的淋巴细胞在96孔板中以1×10⁶个细胞/孔用特异性相应肽池(如上所述)活化，并在5％ CO₂中在37℃下用BFA培养6h，以阻断细胞因子分泌。收获活化的细胞，用于表面和细胞内细胞因子染色。通过与对CD3、CD4和CD8具有特异性的荧光缀合的单克隆抗体一起在冰上孵育20min进行细胞的表面染色。表面染色后，将细胞洗涤两次，固定并使用BD Cytofix/Cytoperm缓冲液(BD生物科学公司(BD Biosciences))在+4℃下透化20min，并用BD Perm/Wash缓冲液洗涤两次。然后通过与抗鼠IL-2、IL-5、IL-10、TNF-α和IFN-γ的荧光缀合抗体一起在冰上孵育30min进行细胞内细胞因子染色。将细胞洗涤三次并用FACS Fortessa流式细胞仪(BD生物科学公司)分析。

如图21A所示，CT443构建体产生了CD4+IFNγT细胞应答，尽管其水平相对于MOMP_serE_FL_ssHA1(“MOMP ser E FL”)较低。用CT584_GlycNeg或CT600_GlycNeg进行免疫似乎并未产生CD4+IFNγT细胞应答。

如图21B所示，CT443和CT584_GlycNeg构建体各自产生了相对强烈的CD8+IFNγT细胞应答。MOMP_serE_FL_ssHA1(“MOMP ser E FL”)和CT600_GlycNeg CD8+IFNγT细胞应答与空LNP对照无法区分。

还评估了mRNA构建体诱导多功能细胞的能力。图22示出了，对于每种mRNA构建体，所引发的CD4+(A)和CD8+(B)抗原特异性T细胞的百分比，并且指示了产生IFNγ(“IFNg”)、IL2和/或TNFα(“TNFa”)(单独和以其各种组合形式)中的每一者的CD4+和CD8+ T细胞的百分比。针对MOMP_serE_FL_ssHA1(“MOMP ser E FL”)和CT443中的每一者引发CD4+应答，并且多功能CD4+IFNγ+IL2+ TNFα+细胞群相对于其他CD4+ T细胞群占多数(图22A)。

针对CT443和CT584_GlycNeg中的每一者引发CD8+应答，并且CD8+IFNγ+IL2-TNFα+细胞群相对于其他CD8+ T细胞群占多数(图22B)。

非MOMP Ct抗原构建体能够在0.125μg的低剂量下诱导针对其编码蛋白的特异性IgG

测试了另外的非MOMP Ct抗原诱导针对其相应蛋白质的特异性IgG的能力。mRNA构建体(所有均经修饰)包括：CT443_ssHA1(“CT443”，SEQ ID NO:105的编码蛋白)、CT584_ssHA1_GlycNeg(“CT584 mRNA”，SEQ ID NO:108的编码蛋白)、CT600_trunc_ssHA1_Glycneg(“CT600 mRNA”，SEQ ID NO:112的编码蛋白)。蛋白质构建体包括：重组(rProt)CT584(SEQID NO:145)、rProt CT600(SEQ ID NO:146)和rProt CT443(SEQ ID NO:143)。

小鼠在0周和3周(W0和W3)时以0.125和5μg剂量接受mRNA构建体和重组蛋白的两次免疫，二者分别用LNP OF-02和SPA14配制，通过IM途径给予。研究包括阴性空OF-02LNP对照。在第0周(W0)和最后一次疫苗施用后两周收集血液样品，以便通过ELISA测量总IgG。使用自动384ELISA从个体血清中测量特异性IgG。

简而言之，将384孔微孔板在碳酸盐缓冲液中用20μL/孔的相应蛋白质(CT443(4μg/mL)、CT584(1μg/mL)、CT600(4μg/mL))包被，并在+4℃下保持过夜。去除包被溶液并用缓冲液1(PBS/Tween 0.05％)洗涤。将游离位点用75μL缓冲液2(PBS/Tween 20 0.05％/牛奶1％)封闭，并在室温(RT)下孵育90min。将板清空，然后在微孔板中在20μL体积下在缓冲液2中连续稀释血清(12倍)。将板在RT下孵育90min，然后用缓冲液1洗涤。在每个孔中添加20μl稀释的抗小鼠总IgG过氧化物酶缀合物(南方生物科技公司(southernbiotech))(1/1000)。在RT下孵育90min后，将板用缓冲液1洗涤。通过在每个孔中添加20μL四甲基联苯胺底物溶液来进行反应。在RT下30min后，用HCl(1N(当量浓度))化学终止反应，并在分光光度计(Synergy HTX，伯腾仪器公司(Biotek))上测量450-650nm处的吸光度。在Softmax Pro软件中使用标准曲线分析结果，并通过OD为1时对应的倒数稀释度以任意ELISA单位表示。

如图23所示，所有测试的样品均产生了针对其相应蛋白质具有特异性的高滴度的IgG，即使在0.125μg的低剂量下也是如此。

非MOMP Ct抗原构建体引发与原生小体(EB)结合的抗体

测试了以下非MOMP Ct抗原的mRNA构建体(所有经修饰的mRNA)诱导IgG结合血清变型E、D或G的EB的能力。用LNP OF-02配制构建体。每个研究组使用8或10只小鼠(C57BL/6)，并且每个阴性对照使用5只小鼠。

测试了以下构建体：

●CT443_ssHA1(“CT443”，SEQ ID NO:105的编码蛋白)、

●CT443_ssHA1_GlycNeg(“CT443_GN”，SEQ ID NO:106的编码蛋白)、

●CT584_ssHA1(“CT584”，SEQ ID NO:107的编码蛋白)、

●CT584_ssHA1_Glycneg(“CT584_GN”，SEQ ID NO:108的编码蛋白)、

●CT584_ssHA1_C2S(“CT584_C2S”，SEQ ID NO:109的编码蛋白)、

●CT600_trunc_ssHA1(“CT600_trunc”，SEQ ID NO:111的编码蛋白)、

●两项独立研究中的CT600_trunc_ssHA1_Glycneg(“CT600_trunc_GN”，SEQ IDNO:112的编码蛋白)、

●CT812_pass-domain_ssHA1(“CT812_pass-dom”，SEQ ID NO:113的编码蛋白)、

●CT812_pass-domain_ssHA1_C2S(“CT812_pass-dom_CS2”，SEQ ID NO:114的编码蛋白)、

●两项独立研究中的CT812_ext-pass-domain_ssHA1(“CT812_ext-pass-dom”，SEQ ID NO:115的编码蛋白)、

●CT812_ext-pass-domain_ssHA1_C2S(“CT812_ext-pass-dom_C2S”，SEQ ID NO:116的编码蛋白)。

在两项独立研究的至少一项中，小鼠在0周和3周(W0和W3)时以5μg剂量接受mRNA构建体的两次免疫，这些构建体用LNP OF-02配制，通过IM途径给予。在第0周(W0)和最后一次疫苗施用后两周收集血液样品，以便通过ELISA测量总IgG。使用自动384ELISA从个体血清中测量特异性IgG。

简而言之，将384孔微孔板在碳酸盐缓冲液中用20μL/孔的EB(5-15μg/mL，取决于血清变型)(对于血清变型G的EB为5μg/mL，对于血清变型D的EB为7.5μg/mL，并且对于血清变型E的EB为15μg/mL)包被，并在+4℃下保持过夜。去除包被溶液并用缓冲液1(PBS/Tween0.05％)洗涤。将游离位点用75μL缓冲液2(PBS/Tween 20 0.05％/牛奶1％)封闭，并在室温(RT)下孵育90min。将板清空，然后在微孔板中在20μL体积下在缓冲液2中连续稀释血清(12倍)。将板在RT下孵育90min，然后用缓冲液1洗涤。在每个孔中添加20μL稀释的抗小鼠总IgG过氧化物酶缀合物(杰克逊公司(Jackson Inc))(1/2500)。在RT下孵育90min后，将板用缓冲液1洗涤。通过在每个孔中添加20μL四甲基联苯胺底物溶液来进行反应。在RT下30min后，用HCl(1N(当量浓度))化学终止反应，并在分光光度计(Synergy HTX，伯腾仪器公司(Biotek))上测量450-650nm处的吸光度。在Softmax Pro软件中使用标准曲线分析结果，并通过OD为1时对应的倒数稀释度以任意ELISA单位表示。

如图24所示，各种非MOMP Ct mRNA构建体引发了与血清变型E的EB结合的IgG。特别地，CT443、CT584和CT600构建体诱导了针对血清变型E的EB的可接受水平的抗体，该水平高于背景水平。在CT812构建体中，只有CT812_pass-dom构建体诱导了针对血清变型E的EB的可接受水平的抗体；然而，该水平仍然低于针对CT443、CT584和CT600构建体所观察到的水平。

如图25和26所示，CT443和CT584构建体还诱导了与血清变型D和G的EB结合的可接受水平的抗体。

实例9-B细胞构建体能够诱导针对MOMPserE的特异性IgG

测试了B细胞构建体(所有经修饰的mRNA)诱导针对重组MOMP蛋白(SEQ ID NO:134)的特异性IgG的能力。

测试了以下构建体：

1.Hirep2_ssHA1(SEQ ID NO:93的编码蛋白)

2.MOMP_VDcomb1-extP_ssHA1(“MOMP_C1_P_SSHA1”，SEQ ID NO:61的编码蛋白)

3.MOMP_VDcomb1-extS_ssHA1(“MOMP_C1_S_SSHA1”，SEQ ID NO:69的编码蛋白)

4.MOMP_VDcomb1-extP_ssHA1_TMB1_Glycneg(“MOMP_C1_P_GN_TMB1_SSHA1”；SEQID NO:67的编码蛋白)

5.MOMP_VDcomb1-extS_ssHA1_TMB1_Glycneg(“MOMP_C1_S_GN_TMB1_SSHA1”；SEQID NO:75的编码蛋白)

6.MOMP_VDcomb2-extP_ssHA2_TMB2_Glycneg(“MOMP_C2_P_GN_TMB2_SSHA2”；SEQID NO:84)

7.MOMP_VDcomb2-extP_ssHA1_Glycneg(“MOMP_C2_P_GN_SSHA1”，SEQ ID NO:79的编码蛋白)

8.MOMP_VDcomb2-extP_ssHA2_Glycneg(“MOMP_C2_P_GN_SSHA2”，SEQ ID NO:80的编码蛋白)

9.MOMP_VDcomb2-extS_ssHA1_Glycneg(“MOMP_C2_S_GN_SSHA1”，SEQ ID NO:87的编码蛋白)

10.MOMP_VDcomb2-extP_ssHA1_TMB1_Glycneg(“MOMP_C2_P_GN_TMB1_SSHA1”，SEQID NO:83的编码蛋白)

11.MOMP_VDcomb2-extS_ssHA1_TMB1(“MOMP_C2_S_TMB1_SSHA1”，SEQ ID NO:89的编码蛋白)

12.MOMP_serD_FL_ssHA1_C2S_Glycneg(“MOMP_serD_FL_C2S_GN_SSHA1”，SEQ IDNO:27的编码蛋白)

13.MOMP_serG_FL_ssHA1_Glycneg(“MOMP_serG_FL_GN_SSHA1”，SEQ ID NO:49的编码蛋白)

14.MOMP_serE_FL_ssHA1(SEQ ID NO:29的编码蛋白)

15.MOMP_serE_FL_ssHA1_C2S_Glycneg(“MOMP_serE_FL_C2S_GN_SSHA1”，SEQ IDNO:35的编码蛋白)

16.重组MOMP蛋白(rMOMP；SEQ ID NO:134)

17.空LNP

小鼠在0周和3周(W0和W3)时以5μg剂量接受mRNA构建体的两次免疫，这些构建体用LNP OF-02配制，通过IM途径给予。研究包括阴性空-LNP对照。在第0周(W0)和最后一次疫苗施用后两周收集血液样品，以便通过ELISA测量总IgG。使用自动384ELISA从个体血清中测量特异性IgG。

简而言之，将384孔微孔板在碳酸盐缓冲液中用20μL/孔的重组MOMP蛋白(rMOMP；SEQ ID NO:134)以2μg/mL包被，并在+4℃下保持过夜。去除包被溶液并用缓冲液1(PBS/Tween 0.05％)洗涤。将游离位点用75μL缓冲液2(PBS/Tween 20 0.05％/牛奶1％)封闭，并在室温(RT)下孵育90min。将板清空，然后在微孔板中在20μL体积下在缓冲液2中连续稀释血清(12倍)。将板在RT下孵育90min，然后用缓冲液1洗涤。在每个孔中添加20μL稀释的抗小鼠总IgG过氧化物酶缀合物(南方生物科技公司(southernbiotech))(1/1000)。在RT下孵育90min后，将板用缓冲液1洗涤。通过在每个孔中添加20μL四甲基联苯胺底物溶液来进行反应。在RT下30min后，用HCl(1N(当量浓度))化学终止反应，并在分光光度计(Synergy HTX，伯腾仪器公司(Biotek))上测量450-650nm处的吸光度。在Softmax Pro软件中使用标准曲线分析结果，并通过OD为1时对应的倒数稀释度以任意ELISA单位表示。

如图27所示，除了MOMP_SerG_FL_ssHA1构建体(其并未产生抗MOMP IgG应答)之外，所有测试的样品均产生了对重组MOMP具有特异性的高滴度IgG。

实例10-B细胞构建体引发与原生小体(EB)结合的抗体

测试了B细胞构建体(所有经修饰的mRNA)诱导IgG与血清变型E、D或G的EB结合的能力。用LNP OF-02配制构建体，而用含有TLR4激动剂的基于脂质体的佐剂(SPA14，如WO2022090359中所述)配制重组MOMP蛋白(阳性对照)。

测试了以下构建体：

1.MOMP_VDcomb1-extP_ssHA1(嵌合体1的“P”，SEQ ID NO:61的编码蛋白)

2.MOMP_VDcomb1-extS_ssHA1(嵌合体1的“S”，SEQ ID NO:69的编码蛋白)

3.MOMP_VDcomb1-extP_ssHA1_Glycneg(嵌合体1的“P_GN”；SEQ ID NO:63的编码蛋白)

4.MOMP_VDcomb1-extS_ssHA1_Glycneg(嵌合体1的“S_GN”；SEQ ID NO:71的编码蛋白)

5.MOMP_VDcomb1-extP_ssHA1_TMB1_Glycneg(嵌合体1的“P_GN_TMB1”；SEQ IDNO:67的编码蛋白)

6.MOMP_VDcomb1-extS_ssHA1_TMB1_Glycneg(嵌合体1的“S_GN_TMB1”；SEQ IDNO:75的编码蛋白)

7.MOMP_VDcomb2-extP_ssHA1_Glycneg(嵌合体2的“P_GN”，SEQ ID NO:79的编码蛋白)

8.MOMP_VDcomb2-extS_ssHA1_Glycneg(嵌合体2的“S_GN”，SEQ ID NO:87的编码蛋白)

9.MOMP_VDcomb2-extP_ssHA1_TMB1_Glycneg(嵌合体2的“P_GN_TMB1”，SEQ IDNO:83的编码蛋白)

10.MOMP_VDcomb2-extS_ssHA1_TMB1(嵌合体2的“S_TMB1”，SEQ ID NO:89的编码蛋白)

11.MOMP_serD_FL_ssHA1(“Ser_D”，SEQ ID NO:21的编码蛋白)

12.MOMP_serE_FL_ssHA1(“Ser_E”，SEQ ID NO:29的编码蛋白)

13.MOMP_serF_FL_ssHA1(“Ser_F”，SEQ ID NO:37的编码蛋白)

14.MOMP_serG_FL_ssHA1(“Ser_G”，SEQ ID NO:45的编码蛋白)

在两项独立研究的至少一项中，小鼠(C57BL/6)在0周和3周(W0和W3)时以5μg剂量接受mRNA构建体的两次免疫，这些构建体用LNP OF-02配制，通过IM途径给予。研究包括阴性空-LNP对照和阳性全长重组MOMP蛋白对照(rMOMP；SEQ ID NO:134，在图28-30中表示为'rec Ser E')。在第0周(W0)和最后一次疫苗施用后两周收集血液样品，以便通过ELISA测量总IgG。使用自动384ELISA从个体血清中测量特异性IgG。

简而言之，将384孔微孔板在碳酸盐缓冲液中用20μL/孔的EB(每血清变型5-15μg/mL)(对于血清变型G的EB为5μg，对于血清变型D的EB为7.5μg，并且对于血清变型E的EB为15μg)包被，并在+4℃下保持过夜。去除包被溶液并用缓冲液1(PBS/Tween 0.05％)洗涤。将游离位点用75μL缓冲液2(PBS/Tween 20 0.05％/牛奶1％)封闭，并在室温(RT)下孵育90min。将板清空，然后在微孔板中在20μL体积下在缓冲液2中连续稀释血清(12倍)。将板在RT下孵育90min，然后用缓冲液1洗涤。在每个孔中添加20μL稀释的抗小鼠总IgG过氧化物酶缀合物(杰克逊公司(Jackson Inc))(1/2500)。在RT下孵育90min后，将板用缓冲液1洗涤。通过在每个孔中添加20μL四甲基联苯胺底物溶液来进行反应。在RT下30min后，用HCl(1N(当量浓度))化学终止反应，并在分光光度计(Synergy HTX，伯腾仪器公司(Biotek))上测量450-650nm处的吸光度。在Softmax Pro软件中使用标准曲线分析结果，并通过OD为1时对应的倒数稀释度以任意ELISA单位表示。

如图28所示，各种MOMP B细胞构建体均引发了高滴度的IgG，这些IgG以与重组MOMP类似的水平与血清变型E的EB结合。包含跨膜结构域的mRNA构建体以及编码全长MOMP的mRNA并未产生抗EB IgG应答，这是因为滴度与空LNP对照的滴度类似。

如图29和30所示，观察到与血清变型D和血清变型G的EB结合的类似结果。

实例11-对于不同的LNP配制品，用MOMPmRNA免疫引发类似的免疫应答

用在两种LNP中的任一种中配制的编码重组MOMP蛋白的mRNA(所有均经修饰)对小鼠(雌性C57BL/6)进行免疫。评价了以下各组：

-以2μg剂量配制在LNP GL-HEPES-E3-E12-DS-4-E10(“脂质D”)或LNP OF-02(“脂质A”)中的MOMP P3 ssHA1(“P3”，SEQ ID NO:53的编码蛋白)、

-以2μg或5μg剂量配制在LNP GL-HEPES-E3-E12-DS-4-E10(“脂质D”)或LNP OF-02(“脂质A”)中的MOMP_VDcomb2-extS_ssHA1_Glycneg(“C2-S-GN”，SEQ ID NO:87的编码蛋白)。

小鼠在0周和3周(W0和W3)时通过IM途径接受mRNA构建体的两次免疫。W3在本文中可以替代性地称为第21天。研究包括空LNP对照。在0周(W0)时收集血液样品，并在最后一次疫苗施用后一周或两周收集最终血液样品和脾脏。在用2μg剂量进行疫苗接种后一周收集的样品中评价细胞应答，并在用5μg剂量进行疫苗接种后两周收集的样品中评价体液应答。如实例7所述，通过细胞内细胞染色(ICCS)评估T特异性细胞应答。如实例8所述评估针对重组MOMP蛋白的特异性IgG和与血清变型E的EB结合的IgG的诱导。

当在不同LNP中配制时，MOMP T细胞构建体引发强烈的T细胞应答

用MOMP_P3_ssHA1(“P3”)进行免疫产生了显著的CD4+IFNγT细胞应答，但观察到的CD8+IFNγT细胞应答非常低甚至没有，分别如图31A和31B中所示。用P3评价的两种配制品之间的应答水平类似。相反，用B细胞构建体(“C2-S-GN”)进行免疫产生了CD4+IFNγT细胞应答和CD8+IFNγT细胞应答两者。

还评估了构建体诱导多功能细胞的能力。图31C显示，CD4+IFNγ+IL2+ TNFα+细胞群由两种配制品中的P3以类似水平以及由B细胞构建体诱导。

当在不同LNP中配制时，MOMP B细胞构建体诱导针对rMOMP和针对血清变型E的EB的特异性IgG

当在不同LNP中配制时，MOMP B细胞构建体(“C2-S-GN”)产生了针对血清变型E的重组MOMP(图32A)和血清变型E的EB(图32B)具有特异性的高滴度的IgG。在两种配制品之间观察到类似水平的IgG。

实例12-用多价mRNA组合物进行免疫引发免疫应答

用多价组合物对小鼠(雌性C57BL/6)进行免疫，该多价组合物由编码以下重组蛋白的四种mRNA(所有均经修饰)构成：

-MOMP P3 ssHA1(“P3”，SEQ ID NO:53的编码蛋白)、

-MOMP_VDcomb2-extS_ssHA1_Glycneg(“C2-S-GN”，SEQ ID NO:87的编码蛋白)、

-CT443_ssHA1(“CT443”，SEQ ID NO:105的编码蛋白)和

-CT584_ssHA1_GlycNeg(“CT584”，SEQ ID NO:108的编码蛋白)。

这些mRNA的比率为1:1:1:1。评价了三个剂量。具体地，评价了0.4μg、1.2μg和3.6μg每种mRNA的剂量，它们分别对应于每次免疫的1.6μg、4.8μg和14.4μg的总mRNA剂量。将mRNA组合物配制在LNP GL-HEPES-E3-E12-DS-4-E10(“脂质D”)或LNP IM-001(“脂质G”)中。研究包括与两个最高mRNA剂量等量的空LNP作为对照。免疫和取样方案如实例11所述。如实例7所述，通过细胞内细胞染色(ICCS)评估T特异性细胞应答。如实施8所述评价针对重组MOMP蛋白的特异性IgG和与血清变型E的EB结合的IgG的诱导。在这些剂量下几乎没有观察到反应原。

当在不同LNP中配制时，多价组合物引发CD4+IFNγ+、CD8+IFNγ+和多功能细胞应答(ICCS)

测试了多价组合物在小鼠中引发MOMP特异性CD4+IFNγ+细胞、CD8+IFNγ+ T细胞和多功能细胞的能力。如图33A所示，组合物产生了可与空LNP对照区分开的显著CD4+IFNγT细胞应答。对于多价组合物，CD4+IFNγ+IL2+TNFα+细胞群相对于其他细胞群占多数(参见图33B)。对于任何所测试的构建体，几乎没有观察到IL-17或IL-10(数据未示出)。

多价组合物引发低水平的CD8+IFNγ(参见图34A)，其中CD8+IFNγ+IL2-TNFα+细胞群相对于其他细胞群占多数(参见图34B)。在“脂质D”中配制的各种剂量的mRNA之间没有观察到应答的差异。对于在“脂质G”中配制的mRNA，观察到最高剂量与两个较低剂量之间的差异。

当在不同LNP中配制时，多价组合物诱导针对rMOMP和针对血清变型E的EB的特异性IgG

如图35A所示，在所有剂量下和两种配制品中，多价组合物均产生了针对血清变型E的重组MOMP具有特异性的高滴度的IgG。观察到剂量效应。

如图35B所示，在所有剂量下和两种配制品中，多价组合物还产生了与血清变型E的EB结合的高滴度的特异性IgG。

存在于多价组合物中的非MOMP Ct抗原构建体能够诱导针对其编码蛋白的特异性IgG

存在于多价组合物中的CT443和CT584构建体分别诱导高水平的针对重组CT443和CT584的特异性IgG，如图36的图片A(CT443)和B组(CT584)所示。所测试的两种配制品的结果类似。结果表明，抗原之间没有发生干扰，因为针对每种重组蛋白都诱导了高水平的特异性IgG。

实例13-用多价mRNA组合物进行免疫引发与血清变型E和血清变型G的原生小体 (EB)以及相应的重组蛋白结合的抗体

用编码以下重组蛋白的单价或多价mRNA(所有均经修饰)对小鼠(雌性C57BL/6)进行免疫：

-MOMP P3 ssHA1(“P3”，SEQ ID NO:53的编码蛋白)、

-CT443_ssHA1(“CT443”，SEQ ID NO:105的编码蛋白)和

-CT584_ssHA1_GlycNeg(“CT584”，SEQ ID NO:108的编码蛋白)、

-一种多价组合物，其包含编码上述MOMP P3、MOMP C2-S-GN、CT443和CT584-GN的mRNA。

小鼠在0周和3周(W0和W3)时以1.2μg剂量接受mRNA构建体的两次免疫，这些构建体在LNP GL-HEPES-E3-E12-DS-4-E10(“脂质D”)或LNP IM-001(“脂质G”)中配制，通过IM途径给予。以每种mRNA构建体1:1:1:1的比率配制多价组合物，并以1.2μg每种mRNA构建体的剂量、4.8μg总mRNA进行注射。将PBS缓冲液作为对照施用。在0周(W0)时和最后一次疫苗施用后一周收集血液样品，以确定血清转化，血清转化可在该时间点被检测到。如上文实例8(对于非MOMP抗原构建体)和实例9(对于MOMP抗原构建体)所述，通过使用自动化384ELISA测量来自个体血清的总IgG来确定血清转化。使用单向ANOVA以组作为固定因子分析IgG滴度。进行了Dunnett调整。

如图37和38所示，除单价MOMP_P3外，所有单价和多价构建体均引发了针对血清变型E和G的EB具有特异性的中等至高滴度的IgG。MOMP_P3 mRNA构建体并未产生抗EB IgG应答，这是因为滴度与缓冲液对照的滴度类似。类似地，如图39所示，除单价MOMP P3外，所有单价和多价构建体均引发了针对其相应的重组蛋白具有特异性的中等至高滴度的IgG。

实例14-根据方案2合成IM-001

方案2：式(XI)的脂质的一般合成方案

缩写：DCM：二氯甲烷，DIPEA：N,N-二异丙基乙胺，DMAP：4-二甲基氨基吡啶，EDC：1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺，EtOAc：乙酸乙酯，NaHCO₃：碳酸氢钠，Py：吡啶，Na₂SO4：硫酸钠，TEA：三乙胺，TFA：三氟乙酸，MS：质谱法，ESI-MS：电喷雾电离质谱法，TLC：薄层色谱法

步骤1：中间体(3)的合成

如方案2所描绘：向酸(2)(1.2g，1.71mmol)和异山梨醇(1)(0.100g，0.68mmol)于二氯甲烷(10mL)中的溶液中添加DIPEA(0.95mL，5.47mmol)、DMAP(0.084g，0.68mmol)和EDC(0.393g，2.05mmol)。将所得混合物在室温下搅拌过夜。16h后，MS和TLC(30％ EtOAc/己烷)分析指示反应完成。将反应混合物用二氯甲烷稀释，并且用饱和NaHCO₃溶液、水和盐水溶液洗涤。将有机层经无水Na₂SO₄干燥，并浓缩。将粗残余物纯化，并将所需产物以6％ EtOAc/己烷洗脱。浓缩含有产物的级分，得到0.72g(69％)纯产物。

结果：

ESI-MS：计算值C₈₆H₁₇₇N₂O₁₀Si₄，[M+H⁺]＝1510.25，观测值＝1510.3和755.4[M/2+H⁺]

步骤2：IM-001的合成

如方案2所描绘：在0℃下向中间体(3)(0.72g，0.476mmol)于四氢呋喃(4mL)中的溶液中添加氟化氢(70％ HF.py络合物，2mL，14.298mmol)，并在相同温度下搅拌5分钟。然后将反应混合物温热至室温并搅拌16h。MS分析指示反应完成。将反应混合物用乙酸乙酯稀释，通过在0℃下缓慢添加固体NaHCO₃，然后添加饱和NaHCO₃溶液来淬灭。将有机层用饱和NaHCO₃溶液、水和盐水洗涤。然后经无水Na₂SO₄干燥，并浓缩。将粗残余物纯化，并将所需产物以65％ EtOAc/己烷洗脱。浓缩最纯的级分，得到0.120g(24％)纯产物。

结果：

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ5.30–5.00(m,2H),4.97–4.68(m,2H),4.55–3.71(m,8H),3.57–2.92(m,8H),2.84–2.04(m,8H),1.99–1.01(m,76H),0.88(t,J＝6.8Hz,12H)。

ESI-MS：计算值C₆₂H₁₂₁N₂O₁₀，[M+H⁺]＝1053.90，观测值＝1053.2和527.3[M/2+H⁺]

应当理解，本发明仅以举例的方式进行了描述，并且在本发明的范围和精神内可以进行修改。

参考文献

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序列

表10-蛋白质序列

(*)对于提及两个对应核酸序列的蛋白质序列，在小鼠中测试了第一个序列(适用时)

表11-序列信息

表12-核酸序列

Claims

1.一种组合物，该组合物包含：

(i)包含编码经修饰的主要外膜蛋白(MOMP)多肽的核苷酸序列的核酸，其中该经修饰的MOMP多肽具有包含原生沙眼衣原体MOMP多肽的两个或更多个保守结构域序列和这些保守结构域序列之间的非原生环序列的氨基酸序列；

(ii)包含编码嵌合沙眼衣原体MOMP可变结构域(VD)多肽的核苷酸序列的核酸，其中该嵌合MOMP VD多肽包含含有沙眼衣原体的不同血清变型的两个或更多个沙眼衣原体MOMPVD序列的氨基酸序列；

(iii)包含编码沙眼衣原体CT443多肽的核苷酸序列的核酸；以及

(iv)包含编码沙眼衣原体CT584多肽的核苷酸序列的核酸。

2.一种核酸，该核酸包含编码经修饰的主要外膜蛋白(MOMP)多肽的核苷酸序列，其中该经修饰的MOMP多肽具有包含原生衣原体属物种MOMP多肽的两个或更多个保守结构域序列和这些保守结构域序列之间的非原生环序列的氨基酸序列，任选地其中该衣原体属物种为沙眼衣原体。

3.一种经修饰的主要外膜蛋白(MOMP)多肽，该经修饰的MOMP多肽具有包含原生衣原体属物种MOMP多肽的两个或更多个保守结构域序列和这些保守结构域序列之间的非原生环序列的氨基酸序列，任选地其中该衣原体属物种为沙眼衣原体。

4.如权利要求1所述的组合物、如权利要求2所述的核酸或如权利要求3所述的经修饰的MOMP多肽，其中该非原生环序列与任何血清变型(例如，沙眼衣原体的血清变型D、E、F或G)的任何原生衣原体属物种MOMP VD(VD1、VD2、VD3或VD4)序列具有不超过40％的同一性。

5.如权利要求1或4所述的组合物、如权利要求2或4所述的核酸或如权利要求3或4所述的经修饰的MOMP多肽，其中该经修饰的MOMP多肽：

(1)不包含两个或更多个保守结构域序列之间的原生衣原体属物种MOMP可变结构域；以及/或者

(2)包含原生衣原体属物种MOMP多肽的五个保守结构域序列，任选地其中(i)该经修饰的MOMP多肽包含原生衣原体属物种MOMP多肽的所有五个全长保守结构域；以及/或者(ii)该经修饰的MOMP多肽的保守结构域总体上与原生MOMP多肽(例如，血清变型E MOMP)的保守结构域具有至少95％的序列同一性。

6.如权利要求1、4或5中任一项所述的组合物、如权利要求2、4或5中任一项所述的核酸或如权利要求3-5中任一项所述的经修饰的MOMP多肽，其中

(1)该经修饰的MOMP多肽包含每个保守结构域序列之间的非原生环序列，例如，其中该经修饰的MOMP多肽包含四个非原生环序列，并且不包含这些保守结构域序列之间的任何原生衣原体属物种MOMP可变结构域；以及/或者

(2)该非原生环序列的长度介于3个与30个氨基酸之间，例如，长度介于4个与20个氨基酸之间。

7.如权利要求1或4-6中任一项所述的组合物、如权利要求2或4-6中任一项所述的核酸或如权利要求3-6中任一项所述的经修饰的MOMP多肽，其中该经修饰的MOMP多肽包含：

(1)任何血清变型的沙眼衣原体的衣原体属物种MOMP多肽的所有五个保守结构域序列，和

(2)四个非原生环序列，其中非原生环序列位于每个保守结构域序列之间，并且其中该经修饰的MOMP多肽不包含任何这些保守结构域序列之间的任何原生衣原体属物种MOMP可变结构域，

进一步地其中这些非原生环序列的长度介于3个与30个氨基酸之间并且与任何血清变型的任何原生衣原体属物种MOMP VD(VD1、VD2、VD3或VD4)序列具有不超过40％的同一性。

8.如权利要求1或4-7中任一项所述的组合物、如权利要求2或4-7中任一项所述的核酸或如权利要求3-7中任一项所述的经修饰的MOMP多肽，其中

例如，其中该经修饰的MOMP多肽包含分别替换VD1、VD2、VD3和VD4的根据SEQ ID NO462、463、464和465的四个非原生环序列。

9.如权利要求1或4-8中任一项所述的组合物、如权利要求2或4-8中任一项所述的核酸或如权利要求3-8中任一项所述的经修饰的MOMP多肽，其中该经修饰的MOMP多肽包含根据SEQ ID NO:486-489中任一者(例如，SEQ ID NO:486)的序列或与其具有至少70％(例如，至少90％或95％)同一性的序列。

10.如权利要求1或4-9中任一项所述的组合物或如权利要求2或4-9中任一项所述的核酸，其中

(1)该经修饰的MOMP多肽进一步包含分泌信号肽序列，任选地其中该分泌信号肽序列包含甲型流感病毒的HA蛋白的分泌信号肽序列，例如，其中该分泌信号肽序列包含根据SEQID NO:187或SEQ ID NO:188的序列；以及/或者

(2)该核酸包含根据SEQ ID NO:551-566中任一者(例如，SEQ ID NO:551)的核苷酸序列或与其具有至少50％同一性的序列。

11.如权利要求1或4-10中任一项所述的组合物或如权利要求2或4-10中任一项所述的核酸，其中该核酸是信使RNA(mRNA)，任选地其中

(ii)该mRNA包含至少一个化学修饰，例如，其中该化学修饰包括N1-甲基假尿苷，任选地其中该化学修饰包括N1-甲基假尿苷来替换每个尿苷；以及/或者

(iii)该mRNA是自我复制mRNA或非复制mRNA，例如，非复制mRNA。

12.如权利要求11所述的组合物或核酸，其中该mRNA包含以下结构元件或由以下结构元件组成(例如，由以下结构元件组成)：

-5'帽，例如，具有以下结构的帽：

-5'非翻译区(5'UTR)，其具有根据SEQ ID NO:838的核酸序列；

-蛋白质编码区，其具有根据SEQ ID NO:213的核酸序列；

-3'非翻译区(3'UTR)，其具有根据SEQ ID NO:839的核酸序列；以及

-polyA尾，

任选地其中该mRNA是经化学修饰的，并且其中该化学修饰包括以下或由以下组成(例如，由以下组成)：N1-甲基假尿苷来替换每个尿苷。

13.一种组合物，该组合物包含：

(1)如权利要求2或4-12中任一项所述的核酸；或者

(2)如权利要求3-9中任一项所述的多肽，

优选地其中该组合物是免疫原性组合物。

14.如权利要求13所述的组合物，其中该组合物如(1)中所定义，并且该组合物进一步包含：

(i)包含编码嵌合衣原体属物种MOMP可变结构域(VD)多肽的核苷酸序列的核酸(例如，mRNA)，其中该嵌合MOMP VD多肽包含含有衣原体属物种的不同血清变型的两个或更多个衣原体属物种MOMP VD序列的氨基酸序列；以及/或者

(ii)以下中的一者或多者(例如，一者、两者、三者或四者)：

(a)包含编码衣原体属物种CT443多肽的核苷酸序列的核酸(例如，mRNA)；

(b)包含编码衣原体属物种CT584多肽的核苷酸序列的核酸(例如，mRNA)；

(c)包含编码衣原体属物种CT600多肽的核苷酸序列的核酸(例如，mRNA)；以及

(d)包含编码衣原体属物种CT812多肽的核苷酸序列的核酸(例如，mRNA)，

任选地其中该组合物包含：

(i)的核酸和(ii)(a)的核酸；

(i)的核酸和(ii)(b)的核酸；或者

(i)的核酸、(ii)(a)的核酸和(ii)(b)的核酸；

(i)的核酸、(ii)(a)的核酸和(ii)(b)的核酸。

15.如权利要求1或14中任一项所述的组合物，其中

(A)一种或多种核酸是mRNA，任选地其中

(1)该mRNA包含至少一个5'非翻译区(5'UTR)、至少一个3'非翻译区(3'UTR)和/或至少一个多腺苷酸化(poly(A))序列；

(2)该mRNA包含至少一个化学修饰，例如，其中该化学修饰包括N1-甲基假尿苷，任选地其中该化学修饰包括N1-甲基假尿苷来替换每个尿苷；以及/或者

(3)该mRNA是自我复制mRNA或非复制mRNA，例如，非复制mRNA；以及/或者

(B)该组合物进一步包含脂质纳米颗粒(LNP)，任选地其中该核酸被包封在该LNP中。

16.如权利要求13所述的组合物，其中该组合物如(2)中所定义，并且该组合物进一步包含：

(ii)以下中的一者或多者(例如，一者、两者、三者或四者)：

(a)包含衣原体属物种CT443多肽的氨基酸序列的多肽；

(b)包含衣原体属物种CT584多肽的氨基酸序列的多肽；

(c)包含衣原体属物种CT600多肽的氨基酸序列的多肽；或者

(d)包含衣原体属物种CT812多肽的氨基酸序列的多肽，

任选地其中该组合物包含

(i)的多肽和(ii)(a)的多肽；或者

(i)的多肽和(ii)(b)的多肽；或者

(i)的多肽、(ii)(a)的多肽和(ii)(b)的多肽，

17.如权利要求1、4-12或14-16中任一项所述的组合物，其中该嵌合MOMP VD多肽包含位于该两个或更多个MOMP VD序列中的每一个序列侧翼的原生衣原体属物种MOMP多肽的保守结构域序列部分，任选地其中这些保守结构域序列部分是位于其原生衣原体属物种MOMP多肽中的VD侧翼的原生衣原体属物种MOMP多肽的保守结构域序列的部分，进一步任选地其中每个保守结构域序列部分包含原生衣原体属物种MOMP多肽的保守结构域序列的3至30个氨基酸残基，并且其中该3至30个氨基酸残基紧邻其原生衣原体属物种MOMP多肽中的该VD序列。

18.如权利要求1、4-12或14-17中任一项所述的组合物，其中该嵌合MOMP VD多肽包含

(1)四种不同血清变型的MOMP VD序列，例如，其中这些不同血清变型是沙眼衣原体的血清变型D、E、F或G；

(2)(i)该衣原体属物种的不同血清变型的两个MOMP VD1序列；以及/或者

(iii)一个MOMP VD3序列；以及/或者

(iv)该衣原体属物种的不同血清变型的两个MOMP VD4序列，

任选地其中这些不同血清变型选自沙眼衣原体的血清变型D、E、F或G；以及/或者

(3)沙眼衣原体的血清变型D或E的一个MOMP VD序列和沙眼衣原体的血清变型F或G的一个MOMP VD序列。

19.如权利要求1、4-12或14-18中任一项所述的组合物，其中该嵌合MOMP VD多肽包含(1)-(4)中的至少一者(例如，四者)：

(1)来自血清变型D的MOMP VD1序列和来自血清变型F的MOMP VD1序列，或来自血清变型E的MOMP VD1序列和来自血清变型F或G的MOMP VD1序列(例如，血清变型E的MOMP VD1序列和血清变型G的MOMP VD1序列)；以及/或者

(2)来自血清变型E的MOMP VD2序列和来自血清变型F的MOMP VD2序列，或来自血清变型D的MOMP VD2序列和来自血清变型G的MOMP VD2序列(例如，血清变型D的MOMP VD2序列和血清变型G的MOMP VD2序列)；以及/或者

(3)来自血清变型G的MOMP VD3序列或来自血清变型F(例如，血清变型F)的VD3序列；以及/或者

(4)来自血清变型E的MOMP VD4序列和来自血清变型G的MOMP VD4序列，或来自血清变型D的MOMP VD4序列和来自血清变型F的MOMP VD4序列(例如，血清变型D的MOMP VD4序列和血清变型F的MOMP VD4序列)，

其中这些血清变型D、E、F和G属于沙眼衣原体，

任选地其中该嵌合MOMP VD多肽包含：

例如，其中该嵌合MOMP VD多肽包含根据(ii)的MOMP VD序列。

20.如权利要求1、4-12或14-19中任一项所述的组合物，其中

(2)该包含编码嵌合衣原体属物种MOMP VD多肽的核苷酸序列的核酸包含根据SEQ IDNO:567-630(例如，SEQ ID NO:617)的核苷酸序列或与其具有至少50％同一性的序列；

(3)该衣原体属物种CT443多肽包含根据SEQ ID NO:507-508(例如，SEQ ID NO:507)的序列或与其具有至少70％(例如，至少90％或95％)同一性的序列；

(4)该包含编码该衣原体属物种CT443多肽的核苷酸序列的核酸包含根据SEQ ID NO:707-710中任一者(例如，SEQ ID NO:707)的核苷酸序列或与其具有至少50％(例如，至少75％)同一性的序列；

(5)该衣原体属物种CT584多肽包含根据SEQ ID NO:509-512中任一者(例如，SEQ IDNO:510)的序列或与其具有至少70％(例如，至少90％或95％)同一性的序列；

(6)该包含编码该衣原体属物种CT584多肽的核苷酸序列的核酸包含根据SEQ ID NO:711-718中任一者(例如，SEQ ID NO:715)的核苷酸序列或与其具有至少50％(例如，至少75％)同一性的序列；

(7)该衣原体属物种CT600多肽包含根据SEQ ID NO:513-514中任一者的序列或与其具有至少70％(例如，至少90％或95％)同一性的序列；

(8)该包含编码该衣原体属物种CT600多肽的核苷酸序列的核酸包含根据SEQ ID NO:719-722中任一者的核苷酸序列或与其具有至少50％(例如，至少75％)同一性的序列；

(10)该包含编码该衣原体属物种CT812多肽的核苷酸序列的核酸包含根据SEQ ID NO:723-762中任一者的核苷酸序列或与其具有至少50％(例如，至少75％)同一性的序列。

21.如权利要求1、4-12、14、15或17-20中任一项所述的组合物，其中

(1)该包含编码衣原体属物种CT443多肽的核苷酸序列的核酸是mRNA并且该mRNA包含以下结构元件或由以下结构元件组成(例如，由以下结构元件组成)：

-5'帽，例如，具有以下结构的5'帽：

-5'非翻译区(5'UTR)，其具有根据SEQ ID NO:838的核酸序列；

-蛋白质编码区，其具有根据SEQ ID NO:369的核酸序列；

-3'非翻译区(3'UTR)，其具有根据SEQ ID NO:839的核酸序列；以及

-polyA尾；

(2)该包含编码衣原体属物种CT584多肽的核苷酸序列的核酸是mRNA并且该mRNA包含以下结构元件或由以下结构元件组成(例如，由以下结构元件组成)：

-5'帽，例如，具有以下结构的5'帽：

-5'非翻译区(5'UTR)，其具有根据SEQ ID NO:838的核酸序列；

-蛋白质编码区，其具有根据SEQ ID NO:377的核酸序列；

-3'非翻译区(3'UTR)，其具有根据SEQ ID NO:839的核酸序列；以及

-polyA尾；以及/或者

(3)该包含编码该嵌合衣原体属物种MOMP VD多肽的核苷酸序列的核酸是mRNA并且该mRNA包含以下结构元件或由以下结构元件组成(例如，由以下结构元件组成)：

-5'帽，例如，具有以下结构的5'帽：

-5'非翻译区(5'UTR)，其具有根据SEQ ID NO:838的核酸序列；

-蛋白质编码区，其具有根据SEQ ID NO:870的核酸序列；

-3'非翻译区(3'UTR)，其具有根据SEQ ID NO:839的核酸序列；以及

-polyA尾。

22.如权利要求1、4-12、14、15或17-21中任一项所述的组合物，其中该组合物包含：

(1)权利要求10(2)的核酸(例如，mRNA)，其中该核酸包含根据SEQ ID NO:551的核苷酸序列或与其具有至少50％(例如，至少75％)同一性的序列(例如，其中该核酸是权利要求12的mRNA)；

该包含编码该嵌合衣原体属物种MOMP VD多肽的核苷酸序列的核酸(例如，mRNA)，其中该核酸包含根据SEQ ID NO:617的核苷酸序列或与其具有至少50％(例如，至少75％)同一性的序列(例如，其中该核酸是权利要求21(3)的mRNA)；以及

该包含编码该衣原体属物种CT443多肽的核苷酸序列的核酸(例如，mRNA)，其中该核酸包含根据SEQ ID NO:707的核苷酸序列或与其具有至少50％(例如，至少75％)同一性的序列(例如，其中该核酸是权利要求21(1)的mRNA)；或者

(2)权利要求10(2)的核酸(例如，mRNA)，其中该核酸包含根据SEQ ID NO:551的核苷酸序列或与其具有至少50％(例如，至少75％)同一性的序列(例如，其中该核酸是权利要求12的mRNA)；

该包含编码该衣原体属物种CT584多肽的核苷酸序列的核酸(例如，mRNA)，其中该核酸包含根据SEQ ID NO:715的核苷酸序列或与其具有至少50％(例如，至少75％)同一性的序列(例如，其中该核酸是权利要求21(2)的mRNA)；或者

(3)权利要求10(2)的核酸(例如，mRNA)，其中该核酸包含根据SEQ ID NO:551的核苷酸序列或与其具有至少50％(例如，至少75％)同一性的序列(例如，其中该核酸是权利要求12的mRNA)；

该包含编码该嵌合衣原体属物种MOMP VD多肽的核苷酸序列的核酸(例如，mRNA)，其中该核酸包含根据SEQ ID NO:617的核苷酸序列或与其具有至少50％(例如，至少75％)同一性的序列(例如，其中该核酸是权利要求21(3)的mRNA)；

该包含编码该衣原体属物种CT443多肽的核苷酸序列的核酸(例如，mRNA)，其中该核酸包含根据SEQ ID NO:707的核苷酸序列或与其具有至少50％(例如，至少75％)同一性的序列(例如，其中该核酸是权利要求21(1)的mRNA)；以及

(4)如权利要求9所述的核酸(例如，mRNA)，其中该经修饰的MOMP多肽包含根据SEQ IDNO:486的序列或与其具有至少70％(例如，至少90％或95％)同一性的序列；

(5)如权利要求9所述的核酸(例如，mRNA)，其中该经修饰的MOMP多肽包含根据SEQ IDNO:486的序列或与其具有至少70％(例如，至少90％或95％)同一性的序列；

(6)如权利要求9所述的核酸(例如，mRNA)，其中该经修饰的MOMP多肽包含根据SEQ IDNO:486的序列或与其具有至少70％(例如，至少90％或95％)同一性的序列；

23.如权利要求16-20中任一项所述的组合物，其中该组合物包含：

例如，其中该组合物包含如(3)中所定义的多肽。

24.一种组合，该组合包含如权利要求2或4-12中任一项所述的核酸以及：

(ii)以下中的一者或多者(例如，一者、两者、三者或四者)：

(a)包含编码衣原体属物种CT443多肽的核苷酸序列的核酸；

(b)包含编码衣原体属物种CT584多肽的核苷酸序列的核酸；

(d)包含编码衣原体属物种CT812多肽的核苷酸序列的核酸，

任选地其中该组合包含

(i)的核酸和(ii)(a)的核酸；

(i)的核酸和(ii)(b)的核酸；或者

(i)的核酸、(ii)(a)的核酸和(ii)(b)的核酸，

例如，其中该组合包含(i)的核酸、(ii)(a)的核酸和(ii)(b)的核酸，

任选地其中这些核酸如权利要求22中所定义，

进一步任选地其中这些核酸存在于同一组合物中(例如，在同一组合物中)。

25.一种组合，该组合包含如权利要求3-9中任一项所述的多肽以及：

(ii)以下中的一者或多者(例如，一者、两者、三者或四者)：

(a)包含衣原体属物种CT443多肽的氨基酸序列的多肽；

(b)包含衣原体属物种CT584多肽的氨基酸序列的多肽；

(c)包含衣原体属物种CT600多肽的氨基酸序列的多肽；或者

(d)包含衣原体属物种CT812多肽的氨基酸序列的多肽，

任选地其中该组合包含

(i)的多肽和(ii)(a)的多肽；

(i)的多肽和(ii)(b)的多肽；或者

(i)的多肽、(ii)(a)的多肽和(ii)(b)的多肽，

例如，其中该组合包含(i)的多肽、(ii)(a)的多肽和(ii)(b)的多肽，

任选地其中这些多肽如权利要求23中所定义，

进一步任选地其中多肽存在于同一组合物中或存在于两种或更多种单独的组合物中(例如，在同一组合物中)。

26.一种核酸，该核酸包含编码嵌合衣原体属物种MOMP可变结构域(VD)多肽的核苷酸序列，其中该嵌合MOMP VD多肽包含含有该衣原体属物种的不同血清变型的两个或更多个衣原体属物种MOMP VD序列的氨基酸序列，任选地其中该衣原体属物种为沙眼衣原体。

27.一种嵌合衣原体属物种MOMP可变结构域(VD)多肽，其中该嵌合MOMP VD多肽包含含有该衣原体属物种的不同血清变型的两个或更多个衣原体属物种MOMP VD序列的氨基酸序列，任选地其中该衣原体属物种为沙眼衣原体。

28.如权利要求26所述的核酸或如权利要求27所述的嵌合MOMP VD多肽，其中

(a)该嵌合MOMP VD多肽包含位于该两个或更多个MOMP VD序列中的每一个序列侧翼的原生衣原体属物种MOMP多肽的保守结构域序列部分；

(b)该嵌合MOMP VD多肽包含四种不同血清变型的MOMP VD序列，任选地其中这些不同血清变型选自沙眼衣原体的血清变型D、E、F或G。

29.如权利要求26或28所述的核酸或如权利要求27或28所述的嵌合MOMP VD多肽，其中该嵌合MOMP VD多肽包含：

(1)(i)该衣原体属物种的不同血清变型的两个MOMP VD1序列；以及/或者

(iii)一个MOMP VD3序列；以及/或者

(iv)该衣原体属物种的不同血清变型的两个MOMP VD4序列，

(2)沙眼衣原体的血清变型D或E的一个MOMP VD序列和沙眼衣原体的血清变型F或G的一个MOMP VD序列。

30.如权利要求29所述的核酸或如权利要求29所述的嵌合MOMP VD多肽，其中该嵌合MOMP VD多肽包含(i)-(iv)中的至少一者(例如，四者)：

(i)来自血清变型D的MOMP VD1序列和来自血清变型F的MOMP VD1序列，或来自血清变型E的MOMP VD1序列和来自血清变型F或G的MOMP VD1序列(例如，血清变型E的MOMP VD1序列和血清变型G的MOMP VD1序列)；以及/或者

其中这些血清变型D、E、F或G属于沙眼衣原体，

任选地其中该嵌合MOMP VD多肽包含：

(1)来自血清变型D的MOMP VD1序列和来自血清变型F的MOMP VD1序列、来自血清变型E的MOMP VD2序列和来自血清变型F的MOMP VD2序列、来自血清变型G的MOMP VD3序列、来自血清变型E的MOMP VD4序列和来自血清变型G的MOMP VD4序列；或者

(2)来自血清变型E的MOMP VD1序列和来自血清变型F的MOMP VD1序列、来自血清变型D的MOMP VD2序列和来自血清变型G的MOMP VD2序列、来自血清变型F的MOMP VD3序列、来自血清变型D的MOMP VD4序列和来自血清变型F的MOMP VD4序列；

其中这些血清变型D、E、F或G属于沙眼衣原体，

例如，其中该嵌合MOMP VD多肽包含根据(2)的MOMP VD序列。

31.如权利要求28-30中任一项所述的核酸或如权利要求28-30中任一项所述的嵌合MOMP VD多肽，其中

(a)这些保守结构域序列部分是位于其原生衣原体属物种MOMP多肽中的VD侧翼的原生衣原体属物种MOMP多肽的保守结构域序列的部分；以及/或者

(b)每个保守结构域序列部分包含原生衣原体属物种MOMP多肽的保守结构域序列的3至30个氨基酸残基，其中该3至30个氨基酸残基紧邻其原生衣原体属物种MOMP多肽中的该VD序列。

32.如权利要求26或28-31中任一项所述的核酸或如权利要求27-31中任一项所述的嵌合MOMP VD多肽，其中该嵌合MOMP VD多肽包含根据SEQ ID NO:490-505中任一者的序列或与其具有至少70％(例如，至少90％或95％)同一性的序列，例如，其中该嵌合MOMP VD多肽包含根据SEQ ID NO:503的序列或与其具有至少70％(例如，至少90％或95％)同一性的序列。

33.如权利要求26或28-32中任一项所述的核酸，其中该核酸包含根据SEQ ID NO:567-630的核苷酸序列或与其具有至少50％(例如，至少75％)同一性的序列，例如，其中该核酸包含根据SEQ ID NO:617的核苷酸序列或与其具有至少50％(例如，至少75％)同一性的序列。

34.如权利要求26或28-33中任一项所述的核酸，其中该核酸是信使RNA(mRNA)，任选地其中

(iii)该mRNA是自我复制mRNA或非复制mRNA，例如，非复制mRNA。

35.如权利要求26或28-34中任一项所述的核酸，其中该mRNA包含以下结构元件或由以下结构元件组成(例如，由以下结构元件组成)：

-5'帽，例如，具有以下结构的5'帽：

-5'非翻译区(5'UTR)，其具有根据SEQ ID NO:838的核酸序列；

-蛋白质编码区，其具有根据SEQ ID NO:870的核酸序列；

-3'非翻译区(3'UTR)，其具有根据SEQ ID NO:839的核酸序列；以及

-polyA尾，

36.一种组合物，该组合物包含如权利要求26或28-35中任一项所述的核酸，优选地其中该组合物是免疫原性组合物。

37.一种组合物，该组合物包含如权利要求27-32中任一项所述的嵌合MOMP VD多肽，优选地其中该组合物是免疫原性组合物，例如，其中该组合物包含佐剂。

38.如权利要求36所述的组合物，其中该组合物进一步包含：

(ii)以下中的一者或多者(例如，一者、两者、三者或四者)：

(a)包含编码衣原体属物种CT443多肽的核苷酸序列的核酸；

(b)包含编码衣原体属物种CT584多肽的核苷酸序列的核酸；

(d)包含编码衣原体属物种CT812多肽的核苷酸序列的核酸，

任选地其中该组合物包含

(i)的核酸和(ii)(a)的核酸；

(i)的核酸和(ii)(b)的核酸；或者

(i)的核酸、(ii)(a)的核酸和(ii)(b)的核酸，

39.如权利要求38所述的组合物，其中一种或多种核酸是mRNA，任选地其中

(iii)该mRNA是自我复制mRNA或非复制mRNA，例如，非复制mRNA。

40.如权利要求38或39所述的组合物，其中

(1)该包含编码该经修饰的MOMP多肽的核苷酸序列的核酸如权利要求2或4-12中任一项所定义；以及/或者

(2)该包含编码该衣原体属物种CT443多肽的核苷酸序列的核酸、该包含编码该衣原体属物种CT584多肽的核苷酸序列的核酸、该包含编码该衣原体属物种CT600多肽的核苷酸序列的核酸或该包含编码该衣原体属物种CT812多肽的核苷酸序列的核酸中的任一者如权利要求20-22中任一项所定义。

41.如权利要求38-40中任一项所述的组合物，其中该组合物包含：

如权利要求33所述的核酸(例如，mRNA)，其中该核酸包含根据SEQ ID NO:617的核苷酸序列或与其具有至少50％(例如，至少75％)同一性的序列(例如，其中该核酸是权利要求35的mRNA)；以及

如权利要求33所述的核酸(例如，mRNA)，其中该核酸包含根据SEQ ID NO:617的核苷酸序列或与其具有至少50％(例如，至少75％)同一性的序列(例如，其中该核酸是权利要求35的mRNA)；

如权利要求32所述的核酸(例如，mRNA)，其中该嵌合MOMP VD多肽包含根据SEQ ID NO:503的序列或与其具有至少75％(例如，至少90％或95％)同一性的序列；以及

该包含编码该衣原体属物种CT443多肽的核苷酸序列的核酸(例如，mRNA)，其中该衣原体属物种CT443多肽包含根据SEQ ID NO:507的序列或与其具有至少75％(例如，至少90％或95％)同一性的序列；或者

如权利要求32所述的核酸(例如，mRNA)，其中该嵌合MOMP VD多肽包含根据SEQ ID NO:503的序列或与其具有至少75％(例如，至少90％或95％)同一性的序列；

该包含编码该衣原体属物种CT443多肽的核苷酸序列的核酸(例如，mRNA)，其中该衣原体属物种CT443多肽包含根据SEQ ID NO:507的序列或与其具有至少75％(例如，至少90％或95％)同一性的序列；以及

42.如权利要求37所述的组合物，其中该组合物进一步包含：

(ii)以下中的一者或多者(例如，一者、两者、三者或四者)：

(a)包含衣原体属物种CT443多肽的氨基酸序列的多肽；

(b)包含衣原体属物种CT584多肽的氨基酸序列的多肽；

(c)包含衣原体属物种CT600多肽的氨基酸序列的多肽；或者

(d)包含衣原体属物种CT812多肽的氨基酸序列的多肽，

任选地其中该组合物包含：

(i)的多肽和(ii)(a)的多肽；或者

(i)的多肽和(ii)(b)的多肽；或者

(i)的多肽、(ii)(a)的多肽和(ii)(b)的多肽，

43.如权利要求42所述的组合物，其中

(1)该经修饰的MOMP多肽如权利要求3-9中任一项所定义；以及/或者

(2)该衣原体属物种CT443多肽、该衣原体属物种CT584多肽、该衣原体属物种CT600多肽或该衣原体属物种CT812多肽中的任一者如权利要求20或22所定义。

44.如权利要求42或43所述的组合物，其中该组合物包含：

例如，其中该组合物包含如(3)中所定义的多肽。

45.一种组合，该组合包含如权利要求26或28-35中任一项所述的核酸以及：

(ii)以下中的一者或多者(例如，一者、两者、三者或四者)：

(a)包含编码衣原体属物种CT443多肽的核苷酸序列的核酸；

(b)包含编码衣原体属物种CT584多肽的核苷酸序列的核酸；

(d)包含编码衣原体属物种CT812多肽的核苷酸序列的核酸，

任选地其中该组合包含

(i)的核酸和(ii)(a)的核酸；

(i)的核酸和(ii)(b)的核酸；或者

(i)的核酸、(ii)(a)的核酸和(ii)(b)的核酸，

任选地其中这些核酸如权利要求41中所定义，

46.一种组合，该组合包含如权利要求27-32中任一项所述的多肽以及：

(ii)以下中的一者或多者(例如，一者、两者、三者或四者)：

(a)包含衣原体属物种CT443多肽的氨基酸序列的多肽；

(b)包含衣原体属物种CT584多肽的氨基酸序列的多肽；

(c)包含衣原体属物种CT600多肽的氨基酸序列的多肽；或者

(d)包含衣原体属物种CT812多肽的氨基酸序列的多肽，

任选地其中该组合包含

(i)的多肽和(ii)(a)的多肽；

(i)的多肽和(ii)(b)的多肽；或者

(i)的多肽、(ii)(a)的多肽和(ii)(b)的多肽，

任选地其中这些多肽如权利要求44中所定义，

进一步任选地其中这些多肽存在于同一组合物中或存在于两种或更多种单独的组合物中。

47.如权利要求2、4-12、26或28-35中任一项所述的核酸、如权利要求1、4-12、13-15、17-23、36-41中任一项所述的组合物或如权利要求24或45中任一项所述的组合，其中：

(i)该经修饰的MOMP多肽进一步包含分泌信号肽序列；

(ii)该嵌合MOMP VD多肽包含分泌信号肽序列；以及/或者

(iii)该衣原体属物种CT443多肽、该衣原体属物种CT584多肽、该衣原体属物种CT600多肽和该衣原体属物种CT812多肽包含分泌信号肽序列，

任选地其中该分泌信号肽序列是病毒分泌信号肽序列，其任选地选自由以下组成的组：流感血凝素(HA)分泌信号肽序列、SARS CoV-2刺突分泌信号肽序列、VZV gB分泌信号肽序列、VZV gE分泌信号肽序列、VZV gI分泌信号肽序列、VZV gK分泌信号肽序列、麻疹F蛋白分泌信号肽序列、风疹E1蛋白分泌信号肽序列、风疹E2蛋白分泌信号肽序列、腮腺炎F蛋白分泌信号肽序列、埃博拉GP蛋白分泌信号肽序列和天花6kDaIC蛋白分泌信号肽序列，任选地其中该分泌信号肽序列包含根据表2或表2.1中的SEQ ID NO中的一者的氨基酸序列，

例如，其中该分泌信号肽序列包含甲型流感病毒的HA蛋白的分泌信号肽序列，例如，其中该分泌信号肽序列包含根据SEQ ID NO:187或SEQ ID NO:188的序列。

48.如权利要求2、4-12、26、28-35或47中任一项所述的核酸、如权利要求3-9中任一项所述的经修饰的MOMP多肽、如权利要求27-32中任一项所述的嵌合MOMP VD多肽、如权利要求1、4-23、36-44或47中任一项所述的组合物、或如权利要求24、25或45-47中任一项所述的组合，其中：

(i)该经修饰的MOMP多肽在对应于原生衣原体属物种MOMP多肽的保守结构域序列中的半胱氨酸残基的一个或多个(例如，所有)位置处包含单个氨基酸取代，任选地其中该单个氨基酸取代是用丝氨酸取代半胱氨酸；

(ii)该嵌合MOMP VD多肽在对应于原生衣原体属物种MOMP多肽的保守结构域序列中的半胱氨酸残基的一个或多个(例如，所有)位置处包含单个氨基酸取代，任选地其中该单个氨基酸取代是用丝氨酸取代半胱氨酸；以及/或者

(iii)该衣原体属物种CT443多肽、该衣原体属物种CT584多肽、该衣原体属物种CT600多肽或该衣原体属物种CT812多肽中的一者或多者在对应于相应原生衣原体属物种多肽中的半胱氨酸残基的一个或多个(例如，所有)位置处包含单个氨基酸取代，任选地其中该单个氨基酸取代是用丝氨酸取代半胱氨酸。

49.如权利要求2、4-12、26、28-35、47或48中任一项所述的核酸、如权利要求3-9或48中任一项所述的经修饰的MOMP多肽、如权利要求27-32或48中任一项所述的嵌合MOMP VD多肽、如权利要求1、4-23、36-44、47或48中任一项所述的组合物、或如权利要求24、25或45-48中任一项所述的组合，其中：

(i)该经修饰的MOMP多肽在对应于原生衣原体属物种MOMP多肽中的糖基化位点、任选地N-糖基化位点的一个或多个(例如，所有)位置处包含突变，任选地其中该突变是单个氨基酸取代；

(ii)该嵌合MOMP VD多肽在对应于原生衣原体属物种MOMP多肽中的糖基化位点、任选地N-糖基化位点的一个或多个(例如，所有)位置处包含突变，任选地其中该突变是单个氨基酸取代，例如其中该嵌合MOMP VD多肽在对应于以下位置的每个氨基酸残基处包含单个氨基酸取代：SEQ ID NO:9的位置9(例如，N到A的取代)、SEQ ID NO:17的位置11(例如，T到A的取代)、SEQ ID NO:6的位置17(例如，S到A的取代)、SEQ ID NO:18的位置4和21(例如，分别为N到A和S到A的取代)、SEQ ID NO:8的位置14(例如，T到A的取代)和SEQ ID NO:16中的位置14(例如，T到A的取代)；以及/或者

(iii)该衣原体属物种CT443多肽、该衣原体属物种CT584多肽、该衣原体属物种CT600多肽或该衣原体属物种CT812多肽中的一者或多者在对应于相应原生衣原体属物种多肽中的N-糖基化位点的一个或多个(例如，所有)位置处包含突变，任选地其中该突变是单个氨基酸取代，例如其中该衣原体属物种CT584多肽在对应于SEQ ID NO:509的残基11的位置处包含单个氨基酸取代(例如，N到Q的取代)。

50.如权利要求1、4-23、36-44或47-49中任一项所述的组合物或如权利要求24、25或45-49中任一项所述的组合，其中该衣原体属物种CT443多肽、该衣原体属物种CT584多肽、该衣原体属物种CT600多肽或该衣原体属物种CT812多肽中的一者或多者包含异源跨膜结构域，任选地其中跨膜结构域序列选自由以下组成的组：流感血凝素(HA)跨膜结构域序列、SARS CoV-2刺突跨膜结构域序列、VZV gB跨膜结构域序列、VZV gE跨膜结构域序列、VZV gI跨膜结构域序列、VZV gK跨膜结构域序列、麻疹F蛋白跨膜结构域序列、风疹E1蛋白跨膜结构域序列、风疹E2蛋白跨膜结构域序列、腮腺炎F蛋白跨膜结构域序列和埃博拉GP蛋白跨膜结构域序列，任选地其中该跨膜结构域包含根据表3中的SEQ ID NO之一的氨基酸序列，例如，其中该跨膜结构域包含甲型流感病毒的HA蛋白的跨膜结构域的序列，任选地其中该跨膜结构域包含根据SEQ ID NO:813或SEQ ID NO:814的序列。

51.如权利要求1、4-15、17-23、36-41中任一项所述的组合物，其中该组合物进一步包含脂质纳米颗粒(LNP)，任选地其中该核酸被包封在该LNP中。

52.如权利要求52所述的组合物，其中该LNP包含至少一种阳离子脂质，任选地其中：

该(PEG化的)脂质是DMG-PEG2000或ALC-0159(例如，DMG-PEG2000)；

该基于胆固醇的脂质是胆固醇；以及/或者

该辅助脂质是DOPE或DSPC。

53.如权利要求51或52所述的组合物，其中该LNP包括：

(i)摩尔比为40％的OF-02、摩尔比为1.5％的DMG-PEG2000、摩尔比为28.5％的胆固醇和摩尔比为30％的DOPE；

(ii)摩尔比为40％的cKK-E10、摩尔比为1.5％的DMG-PEG2000、摩尔比为28.5％的胆固醇和摩尔比为30％的DOPE；

(iii)摩尔比为40％的GL-HEPES-E3-E10-DS-3-E18-1、摩尔比为1.5％的DMG-PEG2000、摩尔比为28.5％的胆固醇和摩尔比为30％的DOPE；

(iv)摩尔比为40％的GL-HEPES-E3-E12-DS-4-E10、摩尔比为1.5％的DMG-PEG2000、摩尔比为28.5％的胆固醇和摩尔比为30％的DOPE；

(v)摩尔比为40％的GL-HEPES-E3-E12-DS-3-E14、摩尔比为1.5％的DMG-PEG2000、摩尔比为28.5％的胆固醇和摩尔比为30％的DOPE；

(vi)摩尔比为50％的DLin-MC3-DMA(MC3)、摩尔比为1.5％的DMG-PEG2000、摩尔比为38.5％的胆固醇和摩尔比为10％的DSPC；

(vii)摩尔比为40％的IM-001、摩尔比为1.5％的DMG-PEG2000、摩尔比为28.5％的胆固醇和摩尔比为30％的DOPE；

(viii)摩尔比为50％的SM-102、摩尔比为1.5％的DMG-PEG2000、摩尔比为38.5％的胆固醇和摩尔比为10％的DSPC；

(ix)摩尔比为46.3％的ALC-0315、摩尔比为1.6％的ALC-0159、摩尔比为42.7％的胆固醇和摩尔比为9.4％的DSPC；

(x)摩尔比为47.4％的ALC-0315、摩尔比为1.7％的ALC-0159、摩尔比为40.9％的胆固醇和摩尔比为10％的DSPC；或者

(xi)摩尔比为50％的ATX-126、摩尔比为1.5％的DMG-PEG2000、摩尔比为38.5％的胆固醇和摩尔比为10％的DSPC，

例如，其中该LNP如(i)、(ii)、(iv)或(vii)中所定义，例如，其中该LNP如(iv)或(vii)中所定义。

54.如权利要求2、4-12、26、28-35或47-49中任一项所述的核酸、如权利要求3-9、48或49中任一项所述的经修饰的MOMP多肽、如权利要求27-32、48或49中任一项所述的嵌合MOMPVD多肽、如权利要求1、4-23、36-44或47-53中任一项所述的组合物、或如权利要求24、25或45-50中任一项所述的组合，其用作药物。

55.如权利要求2、4-12、26、28-35或47-49中任一项所述的核酸、如权利要求3-9、48或49中任一项所述的经修饰的MOMP多肽、如权利要求27-32、48或49中任一项所述的嵌合MOMPVD多肽、如权利要求1、4-23、36-44或47-53中任一项所述的组合物、或如权利要求24、25或45-50中任一项所述的组合，用于在治疗或预防衣原体属物种感染中使用，优选地其中该感染是沙眼衣原体感染，例如，沙眼衣原体生殖器感染。

56.一种疫苗，该疫苗包含如权利要求2、4-12、26、28-35或47-49中任一项所述的核酸、如权利要求3-9、48或49中任一项所述的经修饰的MOMP多肽、如权利要求27-32、48或49中任一项所述的嵌合MOMP VD多肽、如权利要求1、4-23、36-44或47-53中任一项所述的组合物、或如权利要求24、25或45-50中任一项所述的组合。