CN120818506A - Baf170突变体及其制药用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及BAF170突变体及其制药用途。本发明的BAF170突变体，与野生型BAF170相比，所述BAF170突变体为K874位点突变，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明通过促进WWP2在K874位点泛素化BAF170，促进其降解，从而保护心肌细胞免受氧化应激损伤。

Description

BAF170突变体及其制药用途

技术领域

本发明涉及BAF170突变体及其制药用途。

背景技术

根据2019年全球疾病负担研究，心血管疾病尤其是冠状动脉疾病(CAD)依然是全球面临的首要健康挑战。冠心病(CHD)是一种与动脉内膜斑块形成相关的临床综合征，这种斑块逐渐导致血管狭窄，最终可能导致血管闭塞。2019年的死亡统计数据显示每年约有910万人因冠心病去世。临床上，冠心病主要表现为两种形式：心肌梗死(MI)和缺血性心肌病。长期的冠状动脉阻塞会导致心脏不可逆的缺血损伤，进而引发心肌梗死。2021年，心肌梗死导致了300万人死亡。在心肌梗死区域的边缘地带，细胞凋亡显著增多，这已成为慢性缺血性心脏病发展为心力衰竭的关键因素。

根据中国2021年版《胸痛中心指南》，门到导丝(D-to-W)时间的参考标准为90分钟。如果在此期间未能及时进行有效的药物干预，会导致心肌细胞持续死亡。更复杂的是，许多患者在治疗窗口期(即黄金12小时)之后才到达医院，需要在一周后进行支架植入。在这段时间里，心肌细胞继续死亡。尽管对心肌细胞凋亡的发病机制有了深入理解，但在慢性缺血性心脏病中，心肌细胞凋亡的具体机制仍不明确。因此，深入研究心肌细胞凋亡的机制以延缓其进展并开发有效的靶向治疗药物显得尤为重要。

心肌梗死(MI)初期会导致氧化应激(ROS)的积累，并进一步引发心肌细胞死亡。凋亡和坏死都会导致冠状动脉阻塞引起的心肌损伤，但凋亡是主要机制。在心肌细胞凋亡过程中，线粒体凋亡途径起着关键作用。线粒体占据了心肌细胞体积的近三分之一，通过氧化磷酸化提供了心脏活动所需能量的95％。然而，过量的ROS爆发会损害线粒体，影响呼吸功能，破坏氧化磷酸化过程，加剧线粒体损伤。随着线粒体外膜变得通透，促凋亡蛋白被释放，直接损害心脏组织，诱导心肌细胞凋亡。这最终导致心脏纤维化、功能障碍，并最终导致心力衰竭。尽管对心肌细胞凋亡的发病机制已有一定了解，但进一步研究如何减少心肌细胞凋亡对于开发靶向治疗干预措施，预防心肌梗死后的心脏重塑，最终改善患者预后和生存率至关重要。

在分子层面上，BAF170是心脏发育的关键因素。它主要在心肌细胞中表达，对于心脏的分化和特定阶段的基因表达至关重要。BAF170缺乏会阻碍心肌细胞的分化，并延迟首次心跳。尽管BAF170在心肌细胞分化和心脏发育中起着重要作用，但缺血性心脏病的病理生理意义仍不清楚。

发明内容

本申请的发明人通过深入研究，发现BAF170与心肌细胞死亡密切相关，可能在心血管疾病，例如心肌梗死中起重要作用。WWP2是BAF170的泛素化E3连接酶，通过在K874位点泛素化BAF170，促进其降解，从而保护心肌细胞免受氧化应激损伤。心肌梗死时，BAF170表达增加，但WWP2与其结合减少。WWP2的缺失会加重心肌细胞损伤，而过表达则减轻损伤。

本发明是通过如下技术方案来实现的。

一方面，本发明提供了一种BAF170突变体，与野生型BAF170相比，所述BAF170突变体为K874位点突变，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

SEQ ID NO:1

MAVRKKDGGPNVKYYEAADTVTQFDNVRLWLGKNYKKYIQAEPPTNKSLSSLVVQLLQFQEEVFGKHVSNAPLTKLPIKCFLDFKAGGSLCHILAAAYKFKSDQGWRRYDFQNPSRMDRNVEMFMTIEKSLVQNNCLSRPNIFLCPEIEPKLLGKLKDIIKRHQGTVTEDKNNASHVVYPVPGNLEEEEWVRPVMKRDKQVLLHWGYYPDSYDTWIPASEIEASVEDAPTPEKPRKVHAKWILDTDTFNEWMNEEDYEVNDDKNPVSRRKKISAKTLTDEVNSPDSDRRDKKGGNYKKRKRSPSPSPTPEAKKKNAKKGPSTPYTKSKRGHREEEQEDLTKDMDEPSPVPNVEEVTLPKTVNTKKDSESAPVKGGTMTDLDEQEDESMETTGKDEDENSTGNKGEQTKNPDLHEDNVTEQTHHIIIPSYAAWFDYNSVHAIERRALPEFFNGKNKSKTPEIYLAYRNFMIDTYRLNPQEYLTSTACRRNLAGDVCAIMRVHAFLEQWGLINYQVDAESRPTPMGPPPTSHFHVLADTPSGLVPLQPKTPQQTSASQQMLNFPDKGKEKPTDMQNFGLRTDMYTKKNVPSKSKAAASATREWTEQETLLLLEALEMYKDDWNKVSEHVGSRTQDECILHFLRLPIEDPYLEDSEASLGPLAYQPIPFSQSGNPVMSTVAFLASVVDPRVASAAAKSALEEFSKMKEEVPTALVEAHVRKVEEAAKVTGKADPAFGLESSGIAGTTSDEPERIEESGNDEARVEGQATDEKKEPKEPREGGGAIEEEAKEKTSEAPKKDEEKGKEGDSEKESEKSDGDPIVDPEKEKEPKEGQEEVLKEVVESEGERKTKVERDIGEGNLSTAAAAALAAAAVKARHLAAVEERKIKSLVALLVETQMKKLEIKLRHFEELETIMDREREALEYQRQQLLADRQAFHMEQLKYAEMRARQQHFQQMHQQQQQPPPALPPGSQPIPPTGAAGPPAVHGLAVAPASVVPAPAGSGAPPGSLGPSEQIGQAGSTAGPQQQQPAGAPQPGAVPPGVPPPGPHGPSPFPNQQTPPSMMPGAVPGSGHPGVAGNAPLGLPFGMPPPPPPPAPSIIPFGSLADSISINLPAPPNLHGHHHHLPFAPGTLPPPNLPVSMANPLHPNLPATTTMPSSLPLGPGLGSAAAQSPAIVAAVQGNLLPSASPLPDPGTPLPPDPTAPSPGTVTPVPPPQ

另一方面，本发明提供了一种分离的核酸分子，所述核酸分子编码所述BAF170突变体。

再一方面，本发明提供了一种载体，所述载体包含所述的分离的核酸分子。

又一方面，本发明提供了一种宿主细胞，其中所述宿主细胞包含所述的载体。

再又一方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含所述的BAF170突变体。

优选地，所述药物组合物还包含药学上可接受的稀释剂、赋形剂和/或载体。

还又一方面，本发明提供了BAF170突变体或所述药物组合物在制备用于预防、缓解和/或治疗心血管疾病的药物中的用途。

优选地，所述心血管疾病选自冠状动脉疾病、冠心病、心机梗死。

与现有技术相比，本申请至少具有如下有益的技术效果：

本申请首次证实BAF170突变体可以预防、缓解和/或治疗心肌梗死。

本申请首次利用蛋白组学、泛素化修饰组学结合WWP2心肌特异性敲除、WWP2心肌特异性过表达小鼠以及BAF170-K874位点突变小鼠联合BAF170-K874位点突变细胞系，在细胞、分子、动物水平上证实WWP2能够促进BAF170-K874位点泛素化，并降解BAF170，从而缓解心肌梗死。

附图说明

图1显示，MI期间BAF170的表达显著增加。

A，火山图比较对照组和MI条件下小鼠心脏中蛋白质表达的变化，突出显著的倍数变化和P值。

B，通过基因本体富集分析比较对照组与MI组之间的差异表达蛋白质。统计显著性通过Fisher精确检验(-log10 P值)确定。

C，热图可视化比较了对照组和MI组小鼠心脏组织中SWI/SNF染色质重塑复合物的表达。

D，Westernblot分析评价缺氧/血清剥夺(H/SD)处理不同时间点(0-24h)后H9C2细胞中BAF170、Cleaved-PARP1和Cleaved-Caspase3蛋白的表达。(n＝3次独立实验)。

E，通过Hoechst 33342染色(蓝色)检测H/SD处理后0、2、4和6小时的凋亡细胞数量(n＝3次独立实验)。

F，Westernblotting分析评估H9C2细胞系中WWP2在不同时间点(0-24h)与H/SD的表达水平。(n＝3次独立实验)。

G，用抗BAF170抗体对细胞裂解液进行免疫沉淀，随后使用抗WWP2抗体进行Westernblot分析。

H，用抗WWP2抗体对细胞裂解液进行免疫沉淀，随后使用抗BAF170抗体进行Westernblot分析。

I，通过HA标记的WWP2过表达和免疫沉淀实验，检测外源性WWP2与细胞裂解液中内源性BAF170之间的直接相互作用。

J，BAF170包含四个功能结构域，包括N端、C端、SWIRM和SANT结构域。

K，将带有Flag标签的全长或截短型BAF170质粒转染至HEK293T细胞中。随后，使用抗Flag抗体对细胞裂解液进行免疫沉淀，并通过抗WWP2抗体进行Western印迹分析。

D、E、F，进行了三个独立的实验。根据中心极限定理，数据被认为是正态分布的。相对蛋白质水平计算为与第一组相比的倍数变化。量化数据为平均值±标准差。采用Tukey多重比较检验的单因素方差分析评估统计显著性(D、F、P值经15次比较调整；E，P值经6次比较调整)。H/SD表示缺氧和血清剥夺；IB，免疫印迹。

图2WWP2调节K874位点的BAF170多泛素化并促进其降解。

A、在四种条件下分析H9C2细胞中BAF170和WWP2的表达水平：正常对照和用WWP2短发夹RNA变体(shWWP274451、74452和74453)处理。(n＝3的独立实验)。

B、Westernblot分析以评估HA标记的WWP2剂量依赖性过表达后HEK293T和H9C2细胞中BAF170的表达。(n＝3的独立实验)。

C和G、Western印迹分析以评估环己酰亚胺处理后在不同时间点对照细胞和shWWP2细胞中BAF170蛋白水平。(n＝3的独立实验)。

D和H、Western印迹分析以评估环己酰亚胺处理后在不同时间点对照细胞和过表达HA标记的WWP2的细胞中BAF170蛋白的表达水平。(n＝3的独立实验)。

E和I、Western印迹分析以评估不同时间点用MG132处理的正常对照细胞和shWWP2细胞中BAF170的表达水平。(n＝3的独立实验)。

F和J、Western印迹分析以评估正常对照细胞和在不同时间点用MG132处理的表达HA标记WWP2的细胞中BAF170的表达水平。(n＝3的独立实验)。

K、在存在或不存在蛋白酶体抑制剂MG132的情况下，将HA标记的WWP2或HA标记的载体对照与HA泛素(HA-Ub)共转染后，使用抗HA抗体通过免疫共沉淀分析BAF170泛素化水平。

L、在对照细胞和shWWP2细胞中过表达HA-Ub后，无论是否经过MG132处理，通过与抗HA抗体免疫共沉淀分析BAF170泛素化。

M、说明WWP2 cKO、WWP2-TG和WT小鼠MI(每组7只)心脏组织中蛋白质组学和泛素化分析的工作流程图。

N、WWP2敲除(WWP2 cKO)和转基因(WWP2-TG)小鼠与野生型(WWP2-WT)对照小鼠心脏组织中蛋白质组学和泛素化修饰组织学的九象限图。

O、WWP2 cKO、WWP2-WT、WWP2-TG的蛋白质组学Muffz分析。

P、WWP2 cKO、WWP2-WT和WWP2-TG的泛素组学Muffz分析。

Q、WWP2转基因与野生型组织样本中上调的泛素化位点和蛋白质的生物功能富集分析。

R、WWP2基因敲除与野生型组织样本中下调的泛素化位点和蛋白质的生物功能富集分析。

U-W、用Flag-BAF170变体(WT、K874R、K694R或K704R)和HA-Ub或HA-WWP2转染H9C2细胞。用抗Flag抗体进行免疫沉淀，然后用抗HA抗体进行蛋白质印迹。

A、B，G-J，进行了三个独立的实验。根据中心极限定理，数据被认为是正态分布的。相对蛋白质水平计算为与第一组相比的倍数变化。量化数据为平均值±标准差。采用Tukey多重比较检验的单因素方差分析评估统计显著性(A和B，P值经6次比较调整)；未配对t检验(2-tailed Student t检验；G-J)。Ub表示泛素抗体；CHX表示环己酰亚胺；IB，免疫印迹。WWP2 cKO:Myh6 Cre+；Wwp2f/f；WWP2-WT:Wwp2f/f；WWP2-TG:R26-LSL-WWP2+/+；Myh6CreER。

图3心肌特异性WWP2敲除小鼠显示BAF170表达增加，MI诱导的心肌细胞损伤明显加重。

A、显示心肌特异性WWP2敲除(Myh6-Cre+；Wwp2f/f)小鼠的构建方法。

B、MI小鼠模型构建示意图。从对照(Wwp2f/f)和心脏特异性敲除(Myh6-Cre+；Wwp2f/f)28天MI心脏中提取的蛋白质。

C、用抗BAF170抗体对心脏组织的总裂解物进行免疫沉淀(IP)，用抗WWP2抗体进行蛋白质印迹。

D、在Myh6-Cre+；Wwp2f/f小鼠中用抗BAF170抗体对心脏组织的总裂解物进行IP和用抗泛素化(Ub)抗体进行Western印迹。

E-G,Wwp2f/fand Myh6-Cre+；Wwp2f/f小鼠的EF％和FS％。

H-I,Wwp2f/fandMyh6-Cre+；Wwp2f/f小鼠的HW/BW和HW/TL。

J-K，WWP2表达水平的蛋白质印迹分析。

L、使用DHE(二氢乙锭)检测试剂盒(红色)对心脏组织进行染色。比例尺＝20μm。

M-N，蛋白质印迹分析，以评估3-Nitrotyrosine、8-oxo-dG、SOD1(超氧化物歧化酶1)和SOD2(超氧化物岐化酶2)的表达水平。

O-P，BCL2表达水平的蛋白质印迹分析。

Q、Oroboros O2K系统用于评估线粒体氧化磷酸化组分活性。

R、透射电子显微镜捕获的心肌细胞线粒体的代表性图像。红色箭头表示线粒体。比例尺＝1μm。

S-T、Westernblot分析以评估凋亡标志物Cleaved-PARP1和Cleaved-Aspase3的表达水平。

U-W、苏木精、伊红(H&E)、麦胚凝集素(WGA)和Masson染色测定，以评估心肌肥大和纤维化的程度。以上，比例尺＝800μm；下面，比例尺＝20μm。

F-N，P-W，对于具有正态性和等方差的数据，使用Bonferroni检验的双向方差分析对各组进行比较。如果不符合方差的正态性或同质性，则通过Kruskal-Wallis检验和Dunn多重比较检验评估治疗差异(每组n＝7只小鼠)。相对蛋白质水平计算为与第一组相比的倍数变化。量化数据为平均值±标准差。采用Bonferroni多重比较检验的双向方差分析评估统计显著性(H-I、K、L、N、P、Q、T、V、W值经6次比较调整)；Kruskal-Wallis与Dunn多重比较检验。

图4WWP2过表达导致BAF170表达降低，心肌梗死诱导的心肌细胞损伤减少。

A、显示Rosa26-WwP2-Flag(WWP2-TG,R26-LSL-Wwp2+/+；Myh6-CreER)小鼠的构建方法。

B、MI小鼠模型构建示意图。从梗死后28天的野生型(WWP2-WT、R26-LSL-WWP2+/+；Myh6-CreER-)和WWP2-TG小鼠心脏中提取蛋白质样本。

C、将WWP2-TG小鼠和WWP2-WT小鼠的心脏组织的总裂解物用抗BAF170抗体进行免疫沉淀(IP)，用抗WWP2抗体进行蛋白质印迹。

D、用抗BAF170抗体对WWP2-TG小鼠和WWP2-WT小鼠的心脏组织总裂解物进行IP处理，用抗泛素化(Ub)抗体进行Western印迹。

E-G、WWP2-TG小鼠和WWP2-WT小鼠的EF％和FS％。

H-I、WWP2-TG小鼠和WWP2-WT小鼠的HW/BW和HW/TL。

J-K，WWP2表达水平的蛋白质印迹分析。

L、使用DHE(二氢乙锭)检测试剂盒(红色)对心脏组织进行染色。比例尺＝20μm。

M-N，蛋白质印迹分析，以评估3-Nitrotyrosine、8-oxo-dG、SOD1(超氧化物歧化酶1)和SOD2(超氧化物岐化酶2)的表达水平。

O-P，BCL2表达水平的蛋白质印迹分析。

Q、Oroboros O2K系统用于评估线粒体氧化磷酸化组分活性。

R、透射电子显微镜捕获的心肌细胞线粒体的代表性图像。红色箭头表示线粒体。比例尺＝1μm。

S-T、Westernblot分析以评估Cleaved-PARP1和Cleaved-Aspase3的表达水平。

U-W、苏木精、伊红(H&E)、麦胚凝集素(WGA)和Masson染色测定，以评估心肌肥大和纤维化的程度。以上，比例尺＝800μm；下面，比例尺＝20μm。

F-N，P-W，对于具有正态性和等方差的数据，使用Bonferroni检验的双向方差分析对各组进行比较。如果不符合方差的正态性或同质性，则通过Kruskal-Wallis检验和Dunn多重比较检验评估治疗差异(每组n＝7只小鼠)。相对蛋白质水平计算为与第一组相比的倍数变化。量化数据为平均值±标准差。采用Bonferroni多重比较检验的双向方差分析评估统计显著性(H-I、K、L、N、P、Q、T、V、W，经6次比较调整后的值)；Kruskal-Wallis与Dunn多重比较检验。

图5BAF170-K874R破坏BAF170的泛素化，显著加重MI诱导的心肌细胞损伤。

A、K874R杂合突变小鼠的构建方法示意图。从梗死后28天的野生型(WT)和K874R杂合突变小鼠心脏中提取蛋白质样本。

B、显示K874R突变位点和N端、SWIRM、SANT和C端功能结构域的图。

C、在BAF170-K874R小鼠中，使用抗BAF170抗体对心脏组织裂解物进行免疫沉淀，并通过抗泛素(Ub)抗体进行蛋白质免疫印迹分析。

D-F、WT和BAF170-K874R小鼠的EF％和FS％。

G-H、WT和BAF170-K874R小鼠的HW/BW和HW/TL。

I-J、BAF170表达水平的蛋白质印迹分析

K、使用DHE(二氢乙锭)检测试剂盒(红色)对心脏组织进行染色。比例尺＝20μm。

L-M，蛋白质印迹分析，以评估33-Nitrotyrosine、8-oxo-dG、SOD1(超氧化物歧化酶1)和SOD2(超氧化物岐化酶2)的表达水平。

N-O，BCL2表达水平的蛋白质印迹分析。

P、使用Oroboros O2K系统评估线粒体氧化磷酸化组分的活性。

Q、透射电子显微镜捕获的心肌细胞线粒体的代表性图像。红色箭头表示线粒体。比例尺＝1μm。

R-S、Western blot分析以评估Cleaved-PARP1和Cleaved-Aspase3的表达水平。

T-V、苏木精、伊红(H&E)、麦胚凝集素(WGA)和Masson染色测定，以评估心肌肥大和纤维化的程度。以上，比例尺＝800μm；下面，比例尺＝20μm。

E-F，O-V，对于正态分布和等方差数据，使用Bonferroni检验的双向方差分析对各组进行比较。如果不符合方差的正态性或同质性，则通过Kruskal-Wallis检验和Dunn多重比较检验评估治疗差异(每组n＝7只小鼠)。相对蛋白质水平计算为与第一组相比的倍数变化。量化数据为平均值±标准差。采用Bonferroni多重比较检验的双向方差分析评估统计显著性(G-H、J、K、M、O、P、S、U、V，经6次比较调整后的值)；Kruskal-Wallis与Dunn多重比较检验。

图6.BFH772显著减轻了心肌梗死诱导的心肌细胞损伤。

A、图表显示用浓度为0、20、30和40mg/kg的BFH772治疗的野生型小鼠。分析梗死后28天从心脏组织中提取的总蛋白。

B-D、用不同浓度的BFH772(包括0mg/kg、20mg/kg、30mg/kg、40mg/kg)治疗的小鼠的EF％和FS％。

E、用不同浓度的BFH772(包括0mg/kg、20mg/kg、30mg/kg、40mg/kg)治疗的小鼠的HW/BW和HW/TL。

F-G，蛋白质印迹分析，以评估3-Nitrotyrosine、8-oxo-dG、SOD1(超氧化物歧化酶1)和SOD2(超氧化物岐化酶2)的表达水平。

H-I，BCL2表达水平的蛋白质印迹分析。

J-K，Oroboros O2K系统用于评估线粒体氧化磷酸化组分活性。

L、透射电子显微镜捕获的心肌细胞线粒体的代表性图像。红色箭头表示线粒体。比例尺＝1μm。

M-N、Western blot分析以评估Cleaved-PARP1和Cleaved-Aspase3的表达水平。

O-Q、苏木精、伊红(H&E)、麦胚凝集素(WGA)和Masson染色用于检测心肌肥大和纤维化。以上，比例尺＝800μm；下面，比例尺＝20μm。

C-E、G、I-K、N、P-Q。对于具有正态性和等方差的数据，使用Tukey多重比较检验的单因素方差分析对各组进行比较(每组N＝7只小鼠)。量化数据为平均值±标准差。通过Tukey多重比较检验的单因素方差分析评估统计显著性(C-E、J-K、P-Q，6次比较调整后的值；G、I、N，15次比较调整值)。

图7.WWP2泛素蛋白质组学分析的质量控制结果。

A、主成分分析(PCA)显示了蛋白质强度的前两个主成分，根据样本类型，样本由质心连接。

B、Pearson的相关分析；每个值表示两个样本之间的相关系数。

C、肽质量的耐受性分布

D、基于相对标准偏差(RSD)的箱线图，每个点代表一个RSD值。

E、质谱结果直方图。

F、蛋白质分子量统计；每个条形高度代表蛋白质数量。

G、密度分布图。

H、强度值分布条形图。

I、基于强度值的箱线图(WWP2-cKO:Myh6-Cre+；Wwp2f/f；WWP2-WT:Wwp2f/f；WWP2-TG:R26-LSL-Wwp2+/+；Myh6-CreER)。

图8.WWP2减轻了缺血和缺氧诱导的心肌细胞损伤。

A、对用H/SD或不用H/SD处理12小时的H9C2-shWWP2细胞系的裂解物用抗BAF170抗体进行IP处理，用抗WWP2抗体进行Western印迹。

B、对用H/SD或不用H/SD处理12小时的H9C2-shWWP2细胞系的裂解物用抗BAF170抗体进行IP处理，用抗泛素化(Ub)抗体进行Western印迹。

C、对用H/SD或不用H/SD处理12小时的过表达HA标记的WWP2的细胞裂解物用抗BAF170抗体进行IP处理，用抗WWP2抗体进行Western印迹。

D、对用H/SD或不用H/SD处理12小时的过表达HA标记的WWP2的细胞裂解物用抗BAF170抗体进行IP处理，用抗Ub抗体进行Western印迹。

E和F，在用或不用H/SD处理12小时后的H9C2-shWWP2细胞系中HA-WWP2 NTm重新表达，3-Nitrotyrosine、8-oxo-dG、SOD1(超氧化物歧化酶1)和SOD2(超氧化物岐化酶2)表达水平的蛋白质印迹分析(n＝3的独立实验)。

G-K,在用或不用H/SD处理12小时后的表达HA-WWP2-NTm的H9C2-shWWP2细胞中，使用MitoSOX Red和CellROX Green染色评估线粒体ROS水平，同时使用Hoechst33342(蓝色)定量凋亡细胞。(n＝3的独立实验)。

L和M，在转染了HA-WWP2 NTm的H9C2-shWWP2细胞中，进行BCL2蛋白表达的免疫印迹分析，这些细胞经过或未经过12小时的缺氧缺血清(H/SD)处理。(n＝3的独立实验)。

N和O，JC-1染色，以评估表达HA-WWP2-NTm的H9C2-shWWP2细胞在经过和不经过H/SD处理12小时后线粒体膜电位的变化。(n＝3的独立实验)。

P和Q，HA-WWP2 NTm再表达后，在有和没有H/SD处理12小时后，H9C2-shWWP2细胞中Cleaved-PARP1和Cleaved-Aspase3表达的蛋白质印迹分析。(n＝3的独立实验)。

F、I-K、M、O、Q，进行了三个独立的实验。根据中心极限定理，数据被认为是正态分布的。相对蛋白质水平计算为与第一组相比的倍数变化。量化数据为平均值±标准差。采用Tukey多重比较检验的单因素方差分析评估统计显著性(F、O、Q，P值经3次比较调整)；Bonferroni多重比较检验的双向方差分析(M、I-K，P值经过15次比较调整)。NC，正常对照组，不治疗；H/SD，氧糖剥夺；IB，免疫印迹。

图9.BAF170-K874R通过与增强子结合抑制BCL2转录并促进Casp3转录。

A、使用深度工具分析BAF170结合密度，以生成热图，显示CUT和Tag标签在结合峰上的分布。对WT和K874R杂合突变小鼠的样本在小胶质细胞和总心脏组织中进行了比较，峰值按信号强度排列。

B、差异表达基因的统计分析。

C、KEGG通路中差异基因分布的统计分析

D和E，BCL2和Casp3基因组位点CUT和Tag信号轨迹的可视化，显示富集模式。

图10.BAF170-K905R加重缺血缺氧诱导的心肌细胞损伤

A、来自不同物种的BAF170同源物中K874周围序列的比对。BAF170-K874处的泛素赖氨酸残基突出显示(粗体和红色)。

B和C，与正常对照组相比，在用三种不同的短发夹RNA构建体(shBAF170121254、121255和121256)处理后，使用蛋白质印迹分析在HEK293T细胞中评估BAF170表达水平。(n＝3的独立实验)。

D和E，蛋白质印迹分析，以评估有或没有12小时的H/SD处理的表达WT-BAF170 NTm或K905R-BAF170 NTm的H9C2-shBAF170细胞中的氧化应激标志物(3-Nitrotyrosine，8-oxo-dG)和抗氧化酶(SOD1，SOD2)的表达。(n＝3的独立实验)。

F-J，使用MitoSOX Red和CellROX Green染色评估线粒体ROS水平，而在H9C2-shBAF170细胞中WT-BAF170 NTm或K905R-BAF170 NT重新表达后，使用Hoechst33342(蓝色)定量凋亡细胞，无论是否经过H/SD处理12小时。(n＝3的独立实验)。

K和L，Western blot分析，以评估在重新引入WT-BAF170 NTm或K905R-BAF170 NTm后，在有和没有12小时H/SD处理的情况下，H9C2-shBAF170细胞中BCL2的表达。(n＝3的独立实验)。

M和N，JC-1染色，以评估表达WT-BAF170 NTm或K905R-BAF170 NTm的H9C2-shBAF170细胞在缺氧/血清剥夺(H/SD)治疗和不缺氧/血清阻断(H/SD，12小时)情况下线粒体膜电位的变化。(n＝3的独立实验)。

O和P，在有和没有12小时H/SD处理的情况下，WT-BAF170 NTm或K905R-BAF170 NTm恢复后，H9C2-shBAF170细胞中Cleaved-PARP1和Cleaved-Aspase3表达的蛋白质印迹分析。(n＝3的独立实验)。

C、E、H-J、L、N、P，进行了三个独立的实验。根据中心极限定理，数据被认为是正态分布的。相对蛋白质水平计算为与第一组相比的倍数变化。量化数据为平均值±标准差。采用Tukey多重比较检验的单因素方差分析评估统计显著性(C、P值经6次比较调整；E、N、P值经过3次比较调整)；Bonferroni多重比较检验的双向方差分析(H-J、L，P值经过15次比较调整)。H/SD表示缺氧缺血；IB，免疫印迹；NS无统计学意义。

图11.WWP2蛋白和截短BAF170肽片段的纯化

A、传感器图显示BAF170截短突变体(1-647)在7.8-125nM范围内与固定WWP2蛋白的浓度依赖性结合动力学。

B、传感器图显示BAF170截短(1-595)和固定WWP2之间的结合动力学，在15.63-250nM范围内测量。

C-F，BAF170肽片段(1-423、424-1214、569-1214和648-1214)与WWP2蛋白结合的传感器图。肽浓度范围为0.06-1μM，用于通过微阵列评估结合相互作用。

图12.涉及小分子化合物BFH772的虚拟筛选。

A、表面等离子体共振分析(SPR)，以确定十个候选小分子与固定在芯片表面上的BAF170-WWP2之间的结合亲和力。

B、WWP2被固定在芯片表面。SPR用于评估BAF170和WWP2在10种候选小分子化合物或对照存在下的结合相互作用。

C、SPR分析，以评估在小分子抑制剂BFH772存在或不存在的情况下固定化WWP2和BAF170之间的相互作用。BFH772的分子结构如图所示。

D、小分子BFH772的三维结构。

E、BFH772小分子与BAF170蛋白的结合以表面表示形式可视化。关键相互作用以红色突出显示，显示残基K874(黄色)与BFH772(青色)相互作用。

F、BFH772与BAF170的结合状态，如图所示。

G、BFH772与BAF170的三维交互图。

H、BFH772与BAF170的二维交互图。

图13.小分子化合物BFH772减轻缺血和缺氧诱导的心肌细胞损伤。

A-B，蛋白质印迹分析，以评估暴露于BFH772(0-100μM)48小时后BAF170、WWP2和凋亡标志物(Cleaved-PARP1和Cleaved-Aspase3)的蛋白质表达水平。(n＝3的独立实验)。

C、HA标记的WWP2过表达在有无1μM BFH772诱导48h后。用抗HA抗体免疫沉淀裂解物，并使用抗BAF170通过蛋白质印迹进行分析。

D、用HA标记的WWP2或载体对照和HA-Ub共转染细胞，然后用或不用1μM BFH772诱导48h。通过抗HA免疫沉淀评估BAF170泛素化。

E-F、H9C2细胞用BFH772预处理(36小时)，然后进行H/SD共处理(12小时)。进行蛋白质印迹分析以评估3-Nitrotyrosine、8-oxo-dG和SOD1的表达。(n＝3的独立实验)。

G-H、H9C2心肌细胞用BFH772处理36小时，然后用H/SD处理12小时。进行蛋白质印迹分析以评估BAF170、WWP2、BCL2和凋亡标志物(Cleaved-PARP1、Cleaved-Aspase3)的蛋白质水平(n＝3的独立实验)。

B、F、H,进行了三个独立的实验。根据中心极限定理，数据被认为是正态分布的。相对蛋白质水平计算为与第一组相比的倍数变化。量化数据为平均值±标准差。采用Tukey多重比较检验的单因素方差分析评估统计显著性(B，P值经15次比较调整)；Bonferroni检验的双向方差分析(F、H，P值经过6次比较调整)。Ub表示泛素抗体；IB，免疫印迹。

具体实施方式

以下结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步的说明。

本发明中使用的非标准缩略语和首字母缩略词如下：

8-oxo-dG 8-氧代-dG

SOD1超氧化物歧化酶1

SOD2超氧化物歧化酶2

H&E苏木精、伊红

WGA小麦胚芽凝集素

CM心肌细胞

CHD先天性心脏病

CHX环己酰亚胺

H/SD缺氧和血清剥夺

ROS活性氧

EF％射血分数

FS％缩短分数

HW/BW心脏重量/体重

HW/TL心脏重量/胫骨长度

TEM透射电子显微镜

PARP1聚ADP核糖聚合酶家族成员1

实施例

1、原料

以下方法中使用的抗体和试剂如下表1所示：

表1抗体和试剂

2、实验方法

蛋白质组学和泛素化蛋白质组学

蛋白质提取

用液氮将样本研磨成细胞粉末，然后转移到5mL离心管中。接着，向细胞粉末中加入四体积的裂解缓冲液(8M尿素、1％蛋白酶抑制剂混合物)，然后使用高强度超声波处理器(Scientz)在冰上超声三次。剩余碎片在12,000g、4℃条件下离心10分钟。最后收集上清液，使用BCA试剂盒按照说明书测定蛋白质浓度。

胰蛋白酶消化

消化时，蛋白质溶液在56℃下用5mM二硫苏糖醇还原30分钟，然后在室温黑暗环境下用11mM碘乙酰胺烷基化15分钟。然后加入100mM TEAB稀释蛋白质样品，将尿素浓度降至2M以下。最后，以1:50的胰蛋白酶与蛋白质质量比加入胰蛋白酶进行第一次过夜消化，以1:100的胰蛋白酶与蛋白质质量比进行第二次4小时消化。

翻译后修饰肽段的富集

肽段溶解于免疫沉淀(IP)缓冲液(100mMNaCl,1mM EDTA,50mM Tris-HCl,0.5％NP-40,pH 8.0)中，与预先洗净的抗赖氨酸泛素化(PTM-1104，景杰生物实验室(杭州)有限公司)残留抗体树脂混合，在4℃下轻轻振荡孵育过夜。用IP缓冲液和去离子水清洗抗体树脂。最后用0.1％三氟乙酸洗脱富集肽三次，并用C18 ZipTips纯化。

LC-MS/MS(液相色谱-串联质谱法)分析

胰蛋白酶消化的肽段溶解于液相色谱流动相A中，在NanoElute超高效液相系统中进行分离。流动相A和B分别为含0.1％甲酸和2％乙腈的水溶液，以及含0.1％甲酸的乙腈溶液。肽段洗脱梯度设定为0-72分钟，7％-24％B；72-84分钟，24％-32％B；84-87分钟，32％-80％B；87-90分钟，80％B，流速恒定为450nL/分钟。肽段在毛细管柱(内径，粒度)上分离后，注入毛细管离子源进行电离，并通过TIMS-TOF Pro质谱仪(离子源电压，1.6kV；扫描范围，100-1700Da)分析。数据采集时启用了平行累积串行碎裂(PASEF)模式。选择电荷状态0至5的前体离子进行碎裂，每个周期采集10次PASEF MS/MS扫描。MS/MS扫描的动态排除时间为30秒，以避免同一母离子多次扫描。

数据库检索

质谱原始数据通过MaxQuant(v1.6.15.0)在SwissProt蛋白序列数据库(Mus_musculus_10090_SP_20210721.fasta)中检索，包含反向诱饵条目和常见污染蛋白。胰蛋白酶/P消化最多允许2个缺失切割位点，每个肽段至少需要7个氨基酸。前体离子质量误差容限为10ppm，产物离子的质量误差容限为20ppm。半胱氨酸烷基化(氨基甲酰甲基[C])设为固定修饰。可变修饰包括甲硫氨酸氧化和N端泛素化。赖氨酸泛素化和赖氨酸上的二甘氨酸也设为可变修饰，用于相应的修饰富集分析。蛋白质和PSM鉴定的FDR均为1％。

CUT&Tag实验方法

使用Hyperactive Universal CUT&Tag Assay Kit for Illumina(Vazyme，TD903-01)按照说明书进行CUT&Tag实验。简要步骤如下：收集细胞并与伴刀豆球蛋白A包被的磁珠结合，用洋地黄皂苷透化后，与BAF170抗体(ab243634，Abcam，美国)孵育。随后加入pA-Tn5转座酶与样品孵育。DNA提取、扩增和纯化后，通过转座子激活和标签化创建文库，并在IlluminaNovaSeq 150PE平台上分析。

细胞培养与缺氧和血清剥夺(H/SD)处理

H9C2细胞购自美国菌种保藏中心(ATCC，美国)，培养于Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM，HyClone，Logan，UT，美国)。HEK293T细胞购自中国科学院上海细胞库，培养于高糖Dulbecco改良Eagle培养基。细胞在37℃、5％CO2的湿润环境中培养，培养基含10％胎牛血清(FBS，HyClone，Logan，UT，美国)、青霉素(100U)和链霉素(100μg/ml)。缺氧和血清剥夺条件下，细胞在1％O2、5％CO2和94％N2的环境中培养。

质粒构建与转染

下表2列出了各种质粒和小发夹RNA(shRNA)。将携带K874R/K704R/K694R突变的全长人BAF170克隆到3XFlag GV712载体中，并构建了六个包含不同结构域的截短BAF170质粒：带Flag标签的BAF170N端及SWIRM和SANT结构域；带Flag标签的BAF170 N端及SWIRM结构域；带Flag标签的BAF170N端结构域；带Flag标签的BAF170 C端结构域；带Flag标签的BAF170 C端及SANT结构域；带Flag标签的BAF170 C端及SANT和SWIRM结构域。HA-WWP2和HA-Ub购自生工生物工程(上海)股份有限公司。质粒转染使用Lipofectamine 3000按照说明书进行，转染48小时后收集细胞。

表2本发明使用的质粒和小发夹RNA(shRNA)

慢病毒的生产

BAF170和WWP2 shRNA慢病毒购自吉凯基因。慢病毒按照说明从HEK293T细胞中收集。慢病毒颗粒与5×PEG-itTM溶液混合。用慢病毒感染6孔培养板中的细胞。用嘌呤霉素(10μg/ml)筛选稳定的细胞系，为期7天。最后，用蛋白质印迹法确定目标细胞的感染效率。

蛋白质印迹和免疫沉淀

将细胞裂解液与抗-Flag磁珠在4℃孵育过夜，或与适当的抗体在4℃孵育3小时，然后与蛋白A/G免疫沉淀磁珠在4℃孵育12小时。在4℃下用预冷的裂解缓冲液洗涤蛋白-抗体复合物三次，并用SDS上样缓冲液煮沸10分钟洗脱。

BAF170泛素化分析

用200μL 1％SDS缓冲液(Tris pH 7.5，含0.5mM EDTA和1mM DTT)裂解小鼠心肌组织样本和转染48小时的细胞，煮沸10分钟，然后用800μLTris-HCL(pH 8.0)稀释。使用anti-BAF170抗体(1μg/mg细胞裂解物)在4℃下孵育2-3小时对内源性蛋白质进行免疫沉淀，然后用蛋白A/G免疫沉淀磁珠在4℃下孵育12小时，或者将裂解物与抗Flag(B26302；Biotool)免疫沉淀磁珠在4℃下孵育12小时。用抗-HA抗体检测泛素化的BAF170。

JC-1

用5,5′,6,6′-四氯-1,1′,3,3′-四乙基-碘化亚脒羰花青(JC-1荧光探针检测H9C2细胞的线粒体膜电位(ΔΨm)。按照说明书，每孔培养1×105个H9C2细胞，置于24孔微孔板中过夜。处理约6小时后，每孔用PBS洗涤两次。在每个孔中加入2μL的JC-1荧光探针，37℃避光孵育20分钟。用PBS冲洗3次后，加入DMEM，用荧光显微镜观察荧光。当ΔΨm发生变化时，JC-1聚合体(红色)将转变为单体(绿色)，表明H9C2细胞的线粒体膜受损。

Hoechst 33342

H9C2细胞在载玻片上处理后，用Hoechst 33342染料溶液在37℃孵育15分钟。PBS洗涤三次后，细胞在冰上用PI染料溶液避光孵育15分钟。再次用PBS洗涤三次后封片。

细胞氧化应激染色

为检测细胞内ROS水平，细胞用PBS洗涤三次后，与5μM CellROX Green或5μMMitoSOX Red在37℃避光孵育30分钟。充分洗涤后，通过荧光显微镜观察细胞内的荧光强度。

Wwp2敲除、转基因和BAF170-K874R突变小鼠造模

Myh6 Cre+Wwp2f/f小鼠、WWP2-TG小鼠、BAF170-K874R突变小鼠及相应的对照小鼠均由上海南方模式生物科技股份有限公司建立。BAF170-K874R突变小鼠来源于第四代小鼠，其中赖氨酸874位(AAG)突变为精氨酸(CGC)。所有动物均在无病原体条件下饲养。所有实验均使用8-10周大的小鼠进行。在适当的年龄段，通过结扎上述小鼠的左前降支冠状动脉建立永久性心肌梗死模型，造模效果稳定。建模过程中，在0、7、14和28天对每组小鼠进行心脏超声检查以验证建模成功。所有动物操作均符合中国医科大学动物福利条例，动物研究方案经中国医科大学动物实验伦理委员会批准(CMU20241520、CMU20241518、CMU20241909、CMU20251150)。

BFH772预处理

BFH772(6-((6-(羟甲基)嘧啶-4-基)氧基)-N-(3-(三氟甲基)苯基)-1-萘甲酰胺，APE，中国)是一种强效口服VEGFR2抑制剂，靶向VEGFR2激酶的IC50值为3nM(PMID:26629594)。体内实验中，BFH772粉末用二甲基亚砜和玉米油稀释，按二甲基亚砜:玉米油＝1:9的比例每只小鼠给药80μL。小鼠给药浓度分别为0、20、30和40mg/kg。心肌梗死后48小时开始给药，每日一次，持续28天。体外实验中，BFH772粉末用DMSO稀释至终浓度0.01、0.1、1、10和100μM，药物作用时间为48小时。

心肌梗死造模

通过腹腔注射他莫昔芬(75mg/kg体重，隔日一次，共5次)诱导靶基因表达。注射30天后进行心肌梗死造模。通过结扎C57BL/6J小鼠的左前降支冠状动脉(LAD)建立永久性心肌梗死模型。小鼠使用异氟烷给药系统吸入1.5-2％的异氟烷进行麻醉。在第三和第四肋间隙之间切开左胸腔后暴露左心室。在距其起源约3mm处找到、缝合并结扎左心室主动脉。当左心室前壁颜色变浅时，即可确认成功诱导了心肌缺血。结扎后，立即将心脏放回胸腔。

超声心动图和左心室功能评估

分别在基线(0天)、7天、14天和28天对小鼠进行超声心动图检查。使用VisualSonics Vevo 2100实时高分辨率活体显微成像系统(Visualsonic，加拿大；VINNO6 Lab，中国)评估每组小鼠的心脏功能。小鼠使用1.5％异氟烷麻醉，在持续供氧的情况下使用40MHz传感器进行心功能分析。通过二维M型记录检测左心室功能。心功能测量基于室间隔厚度(IVSd)、左心室后壁厚度(PWTd)、收缩期左心室内径(LVDs)、舒张期左心室内径(LVDd)和左心室质量测量。此外，还测定了左心室射血分数(EF％)和短轴缩短率(FS％)。28天后，对小鼠实施安乐死，并测量其体重(BW)和胫骨长度(TL)。胫骨长度是从近端关节面中部到内踝最远端投影处的测量距离[29915560]。取出心脏，用PBS洗涤并测量心脏重量(HW)。

组织病理学评估

心肌组织样本经4％固定液固定48小时后，包埋在石蜡中，切成4μm大小的切片。经二甲苯脱蜡、梯度乙醇复水后，用苏木精-伊红(H&E)以及Masson三色染色法(G1340；Solarbio，中国)染色。心肌细胞横截面积通过5μM小麦胚芽凝集素(WGA)(Genetex，美国)染色图像评估。

电子显微镜

用透射电子显微镜(TEM)观察心脏线粒体的形态。使用EM级2.5％戊二醛在0.1mol/l二甲基砷酸钠缓冲液预固定心脏组织。固定后的组织使用1％四氧化锇在0.1mol/l二甲基砷酸钠缓冲液中孵育2小时。然后将固定的组织逐级脱水进行包埋。心脏组织切片用醋酸铀染色。使用日立H-7650透射电子显微镜观察和拍摄心肌组织中线粒体的变化，每组小鼠随机拍摄15至24幅图像。

动物心肌组织氧化应激染色

体外实验中，用DHE染色检测ROS的产生。石蜡包埋的心脏切片与DHE(二氢乙啶，5μmol/L)混合，37℃避光孵育1小时。通过荧光显微镜盲法拍摄图像，使用ImageJ软件计算荧光强度，并将结果表示为相对于相应对照组的变化倍数。

线粒体提取用于高分辨率呼吸测定系统O2k

提取小鼠心脏并在4分钟内快速切成小块。用含有0.1mg/ml蛋白酶的线粒体分离缓冲液(Sigma Aldrich，P8038)在4℃下孵育2分钟。线粒体分离缓冲液成分为50mM Tris×HCl(pH 7.4)、100mM KCl、100mM蔗糖、1mM KH2PO4、0.1mM EGTA和0.2％牛血清白蛋白。组织用玻璃匀浆器轻轻匀浆6次。以不同速度多次离心后，将得到的沉淀重悬于10mM缓冲液中，该缓冲液成分为10mM Tris×HCl(pH7.4)、225mM甘露醇、75mM蔗糖和0.1mM EDTA。所有实验步骤均在4℃下进行。

线粒体呼吸活性测量

线粒体呼吸评估在37℃下使用高分辨率呼吸测定系统O2k(OroborosInstruments，Innsbruck，奥地利)进行，反应室体积为2mL。实验前用呼吸介质MIR05(110mM蔗糖、60mM乳糖酸钾、0.5mM EGTA、1g/L无脂肪酸BSA、3mM MgCl2、20mM牛磺酸、10mM KH2PO4和20mM HEPES；pH 7.1，37℃)校准氧气。介质在氧气计室中与空气平衡，750rpm搅拌20分钟至信号稳定。每室加入70μg线粒体提取物，按以下顺序进行底物-解偶联剂-抑制剂滴定(SUIT)：丙酮酸/苹果酸/谷氨酸(PMG)→MgCl2/ADP(D)→琥珀酸(S)→寡霉素(O)→羰基氰化物间氯苯腙(CCCP)→鱼藤酮(R)→抗霉素A(AmA)→N,N,N',N'-四甲基对苯二胺/抗坏血酸(TMPD/Asc)。耗氧率(OCR)通过氧浓度的负时间导数计算。数据采集和分析使用软件版本7.4.0.4(Oroboros Instruments)完成。

试剂

蛋白酶体抑制剂MG132(A2585)(50μmol/L)和放线菌酮(CHX，A8244)(50μmol/L)购自Apexbio(美国)，溶于二甲基亚砜。

蛋白质纯化-WWP2

将含有WWP2基因的重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，培养并诱导大量表达蛋白。细胞通过离心收集。亲和纯化时，细胞用缓冲液(50mM Tris、300mM NaCl、0.1％TritonX-100、0.2mM PMSF，pH 8.0)裂解，超声破碎后离心收集上清液，得到粗蛋白。然后，用五倍体积的结合缓冲液(PBS-NaCl，pH 7.4)平衡5毫升Ni-NTA柱。将粗蛋白与平衡柱填料温育1小时，收集流出液。然后用结合缓冲液清洗色谱柱，再用洗涤缓冲液(PBS-NaCl，20mM咪唑，pH 7.4)清洗，收集流出液。蛋白用洗脱缓冲液(PBS-NaCl，500mM咪唑，pH7.4)洗脱，收集洗脱液。洗脱样品通过离子交换层析(Q柱)进一步纯化，进行SDS-PAGE分析。纯化后的洗脱样品使用缓冲液(PBS，0.12％SKL，pH 7.4)进行凝胶过滤层析(Superdex200)。将纯化组分透析到蛋白质储存缓冲液(PBS，0.12％SKL，pH 7.4)中，浓缩、过滤并灭菌。纯化的蛋白质等分并保存在-80℃的温度下。

蛋白质纯化-BAF170

通过分子克隆构建了一系列编码SMARCC2不同结构域的重组表达载体：SMARCC2(1-647、1-423、1-595、648-1214、424-1214和596-1214)。重组质粒经限制性酶切分析验证正确构建后，进行重组和扩增制备。将质粒转染到293细胞中，并纯化蛋白质。首先，细胞用缓冲液C裂解，超声破碎后离心收集上清粗蛋白。5ml Ni-NTA柱用5倍于柱床体积的结合缓冲液平衡后，将粗蛋白与平衡柱填料温育1小时，收集流出液。用结合缓冲液清洗平衡柱，然后用洗涤缓冲液(PBS-NaCl，20mM咪唑，pH 7.4)清洗柱子。蛋白用洗脱缓冲液(PBS-NaCl，500mM咪唑，pH 7.4)洗脱。洗脱液样品通过离子交换层析(Q柱)纯化，进行SDS-PAGE分析。高纯度洗脱样品经凝胶过滤层析(Superdex200)纯化(PBS，0.12％SKL，pH7.4)，纯化组分透析至蛋白储存缓冲液(PBS，0.12％SKL，pH 7.4)中，浓缩、过滤除菌后分装保存于-80℃。在进行SDS-PAGE分析时，使用12％分离凝胶和5％浓缩凝胶对蛋白质样品进行处理和制备，并测定分子量。

化合物库准备

从PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)获取选定化合物(15000个分子)的SMILES形式，通过RDKit(2023.09.1)对这些化合物进行归一化和转换，生成化合物库。所有选定化合物转换为所需结构(SDF格式)。

虚拟筛选

通过AlphaFold预测SMARCC2蛋白结构模型，确认k874的结合位点。中心坐标固定为 网格框大小固定为通过AutoDockTools 1.5.6和Vina1.1.2进行柔性配体和刚性受体对接，能量范围设为4kcal/mol，穷竭度设为12。利用遗传算法(GA)和粒子群优化(PSO)找到最佳结合模式，并根据经验公式通过评分函数计算了每种结合模式的亲和力。根据亲和力对每种化合物与靶蛋白的结合模式进行排序，结果通过PyMOL2.2.0可视化。

表面等离子体共振(SPR)

不同结构域截短BAF170与WWP2结合分析

在Biacore T200系统(Cytiva)上对BAF170(1-426)、BAF170(1-595)、BAF170(1-647)、BAF170(424-1214)、BAF170(569-1214)和BAF170(648-1214)进行SPR实验，温度25℃，流速30μl/min。纯化的野生型WWP2蛋白通过胺偶联化学固定在S CM5系列传感器芯片(Cytiva)上。不同结构域截短的BAF170蛋白用运行缓冲液连续稀释为多个浓度，以恒定流速从低到高浓度流过芯片4-6分钟。数据通过Biacore T200评估软件3.0分析并计算亲和常数。

BFH772对BAF170与WWP2结合影响的SPR分析

在Biacore T200系统(Cytiva)上对盐酸考尼伐坦、NVP-BHG712、U-74389G、1-{[4-({4-[(2,3-二氧代-2,3-二氢-1H-吲哚-1-基)甲基]苯基}甲基)苯基]甲基}-2,3-二氢-1H-吲哚-2,3-二酮、瓜氨酸特异性探针、BFH772、BMS195614、LIMKi 3、N-甲基原卟啉IX、L-689,560等小分子化合物进行SPR实验，这些化合物的信息如表3所示，温度25℃，流速30μl/min。纯化的野生型WWP2蛋白通过胺偶联化学固定在S CM5系列传感器芯片(Cytiva)上。以恒定的流速分别将50μM的不同小分子化合物复合物作为结合底物流经芯片，以其平衡状态作为信号基线，再注入BAF170。通过三元相互作用系统，直观比较小分子化合物加入前后WWP2与BAF170结合曲线和信号变化，确定其特异性影响。

表3小分子化合物的信息

相对值

免疫印记图像通过ImageJ软件分析。内参条带强度作为上样蛋白的参考。首先在独立实验中，将每条带的灰度值除以内参灰度值计算目标蛋白的相对表达量。然后将每条带的相对表达量除以其平均值得到比值。在其他独立实验中重复此计算过程。接下来，将第一组(对照组)的比值取平均值，再将第一组中每个比值除以该平均值得到相对值。最后，将其他各组的比值除以此平均值，得到用于统计分析的最终值。DHE(氧化应激标志物)、CellROX-Green和MitoSOX-Red的荧光强度代表氧化应激水平，通过ImageJ软件计算相对荧光单位。首先计算第一组(对照组)荧光单位值的平均值，再将第一组中每个值除以此平均值得到相对荧光强度。最后将其他各组的值除以此平均值，得到用于统计分析的荧光强度值。

统计分析

数据以均值±标准差(SD)表示。体外实验中，若细胞数量足够大(数十万细胞)，计算比率(检测平均指数)为蛋白表达水平除以内参。根据中心极限定理，检测平均指数近似服从正态分布，三次独立重复实验的平均指数服从正态分布。体内实验(样本量≥7)通过Shapiro-Wilk检验正态性，F检验(两组比较)或Bartlett检验(两组以上比较)检验方差齐性，阈值P值为0.05。对于正态分布且方差齐的数据，两组研究使用非配对t检验(双尾Student-t检验)，多组比较使用单因素方差分析和Tukey多重比较检验。当两组间考虑两种条件时，使用双因素方差分析和Bonferroni多重比较检验。未通过正态性或方差齐性检验的数据，使用Mann-Whitney检验比较两组数据，多组比较使用Kruskal-Wallis检验和Dunn多重比较检验。多重比较采用Bonferroni校正调整I类错误膨胀，并在适用时调整P值。每个图例包含详细的显著性评估方法及每组实验的生物重复次数。显著变化的精确P值在图例中标明。统计分析使用SPSS22.0软件(SPSS，美国)和GraphPadPrism 10.0软件(GraphPad，Bethesda，MD，美国)完成，P<0.05表示统计学显著性。图中选取反映每次实验平均结果的代表性图像。图例中的“N”或“n”表示生物重复。

3、结果

实验结果如图1-13以及表4所示。

在MI期间，BAF170蛋白表达增加

为了探究心肌梗死(MI)期间心脏中哪些蛋白质和功能发生了变化，我们通过结扎左前降冠状动脉创建了一个MI小鼠模型。随后，我们对心脏组织进行了高深度蛋白质组学分析，并与对照组小鼠心脏组织进行了对比。结果显示，在差异表达的蛋白质中，1079种蛋白质上调(FC>1.5，P值<0.05)，225种蛋白质下调(FC<0.667，P值<0.05)(图1A)。GO功能富集分析显示，在细胞成分中，SWI/SNF超家族复合体得分最高，但细胞结构蛋白除外(图1B)。在差异表达的蛋白质中鉴定出的SWI/SNF染色质重塑复合体家族成员中，SMARCC2(也称为BAF170)的p值最低(图1C)。这表明BAF170可能在心肌梗死期间的心脏中发挥重要作用。

缺氧和血清剥夺(H/SD)是一种广泛认可的体外模型，用于模拟缺血性低氧条件。H/SD模型已被广泛应用于研究心肌细胞对缺血性低氧的反应。我们通过建立H9C2细胞的H/SD模型，探讨了BAF170在这些条件下的作用，发现H/SD暴露时间与细胞凋亡率和BAF170表达水平之间存在直接相关性(图1D和1E)。使用Hoechst33342，一种常用的核染色剂，我们观察到随着H/SD治疗时间的延长，凋亡细胞的数量逐渐增加，表现为蓝色荧光增强(图1E)。

为了探究BAF170表达升高的机制，我们使用BAF170抗体进行了免疫沉淀(IP)，以从对照组和心肌梗死(MI)小鼠的心脏组织中富集相互作用的蛋白质。通过质谱分析，我们检测了下游蛋白质相互作用的变化。结果显示，在心肌梗死模型中，BAF170与WWP2的结合显著减少(表4)。此外，在H/SD模型中，随着诱导时间的延长，WWP2的表达逐渐下降(图1F)。

心肌梗死后，BAF170与WWP2的相互作用减弱，这表明两者之间存在调控关系。内源性免疫沉淀实验显示，WWP2与BAF170之间存在明显的相互作用(图1G，1H)，这一发现通过外源性免疫沉淀研究得到了进一步验证(图1I)。为了确定相互作用的具体区域，研究者使用了内源性WWP2和多种带有Flag标签的BAF170构建体，包括全长和截短版本，进行了结合实验。结果显示，WWP2特异性地与BAF170的三个区域相互作用：SANT域、SWIRM域和N端区域(图1J，1K)。

WWP2通过K874泛素化调节BAF170降解

为了探讨WWP2在调节BAF170水平中的潜在作用，我们研究了减少WWP2是否会影响BAF170的表达水平。为此，我们使用三种不同的shRNA片段生成了稳定的WWP2敲低(shWWP2)H9C2细胞系(图2A)。在这三种片段中，74453片段表现出最高的敲低效率，因此被选用于后续实验。与WWP2在调节BAF170水平中发挥作用相一致，WWP2的沉默导致BAF170水平的增加。

为了进一步验证这一关系，我们在HEK293T和H9C2细胞中进行了WWP2的梯度过表达实验。结果表明，随着WWP2表达量的增加，BAF170蛋白水平呈剂量依赖性下降(图2B)。这些发现强烈表明，WWP2作为BAF170蛋白水平的负调控因子。

WWP2可能通过促进BAF170蛋白的降解来降低其水平(图2C-2H)。为了验证这一假设，我们使用了环己酰亚胺(CHX)作为翻译抑制剂进行时间梯度处理，这种抑制剂可以阻止新蛋白质的合成，从而能够监测蛋白质在不同时间点的稳定水平。实验在正常对照组和shWWP2细胞中进行。加入环己酰亚胺后，对照组的BAF170水平下降速度更快，而shWWP2组则保持较高水平(图2C，2G)。这表明WWP2水平的降低与BAF170稳定性的增加有关。同样地，当比较表达HA-Vector或HA-WWP2的细胞时，我们发现HA-WWP2的梯度过表达导致在环己酰亚胺处理下BAF170水平的加速下降(图2D，2H)。

接下来，我们测试了BAF170是否被纳入泛素蛋白酶体介导的降解途径。为了验证这一点，我们使用蛋白酶体抑制剂MG132进行了时间进程实验(图2E-2J)。与对照组相比，shWWP2转染的细胞中BAF170蛋白水平显著升高(图2E，2I)。此外，MG132处理后，表达HA-WWP2的细胞中BAF170的积累量明显增加，而表达HA-Vector的对照组则没有这种现象(图2F，2J)。这些结果支持了WWP2通过蛋白酶体途径调节BAF170蛋白水平的结论。同样地，WWP2过表达显著提高了BAF170的泛素化水平(图2K)，而WWP2敲低则显著降低了BAF170的泛素化水平(图2L)。综上所述，这些发现表明WWP2通过多泛素化后由蛋白酶体依赖性降解来促进BAF170的降解。

为了确定WWP2靶向的BAF170泛素化修饰位点，我们利用多种小鼠模型和先进的蛋白质组学技术进行了全面分析。研究中建立了两个关键实验组：条件性心肌特异性WWP2敲除小鼠(WWP2-cKO：Myh6-Cre+；Wwp2^f/f)及其相应的WWP2-WT(Wwp2^f/f)对照组，以及转基因Rosa26-WwP2-Flag小鼠(WWP2-TG)及其相应的对照组。通过复杂的定量蛋白质组学和泛素化修饰基因组学分析，探讨了WWP2在心肌梗死反应中调控的具体信号传导途径(图2M)。通过四维无标签高深度蛋白质组学，鉴定出7020个泛素化位点和2202个泛素化蛋白，其中4091个位点和1082个蛋白显示出定量差异。

随后，我们使用九象限图整合了差异蛋白质和泛素化蛋白质，特别关注两个关键群体：在WWP2敲除与野生型对照比较中，泛素化下调且高表达的蛋白质；以及在WWP2转基因与野生型对照比较中，泛素化上调且低表达的蛋白质(图2N)。通过表达模式聚类分析，我们发现不同实验组中这两种蛋白质(图2O)和泛素化位点(图2P)均显示出显著的趋势。特别值得注意的是，随着WWP2水平的增加，某些蛋白质的表达量下降(第3簇)，而某些泛素化位点的修饰程度增加(第6簇)。系统分析显示，BAF170蛋白的表达水平与WWP2的表达水平之间存在显著的负相关关系，并伴有泛素化修饰的证据。

通过生物功能富集分析，研究了WWP2在心肌梗死(MI)中的作用。在WWP2转基因/野生型模型中，对上调的泛素化蛋白进行分析，发现这些蛋白参与心脏收缩调节、肌肉丝滑动及心肌功能(图2Q)。而在WWP2条件性敲除/野生型模型中，对下调的泛素化蛋白进行分析，发现这些蛋白参与烟酰胺核苷酸代谢、NADP代谢和ADP代谢过程(图2R)。

我们特别关注了WWP2对BAF170泛素化调控的作用。通过质谱数据分析，我们发现了BAF170上的六个泛素化位点：K694、K704、K872、K874、K897和K902。在这些位点中，只有K694、K704和K874与WWP2的表达水平有直接关联，即WWP2表达量增加时，这些位点的泛素化程度也相应提高；而当WWP2表达量减少时，这些位点的泛素化程度则会降低(图2U-2W)。这些发现表明，K694、K704和K874是WWP2介导BAF170泛素化的特定位点。

为了进一步探索这些潜在的泛素化位点，我们对BAF170的K694、K704和K874位点进行了分析，通过创建赖氨酸到精氨酸(K-R)突变。我们观察了在HA标签载体或HA标签WWP2变体外源过表达后，以及在MG132存在下共转染HA-UB时，BAF170泛素化水平的变化。野生型BAF170及其突变体(K694R、K704R或BAF170-K874R)分别被过表达。共免疫沉淀实验显示，只有BAF170-K874R的过表达显著降低了BAF170的泛素化水平，与野生型相比(图2U-2W)。这些发现表明，WWP2通过K874位点特异性地介导BAF170的多泛素化，导致BAF170通过蛋白酶体途径降解。

心肌特异性WWP2缺失导致BAF170表达升高，加重心肌细胞损伤

WWP2在心肌梗死(MI)期间调节BAF170的具体作用尚不明确。为了进一步研究这一关系，我们通过使用Wwp2^f/f和Myh6-Cre+；Wwp2^f/f小鼠，对左前降冠状动脉进行了28天的结扎，构建了MI的小鼠模型。Westernblot分析证实，在Myh6-Cre+；Wwp2^f/f小鼠中，WWP2的第3外显子已被删除(图3A-B)。与Wwp2^f/f对照组相比，Myh6-Cre+；Wwp2^f/f小鼠中的WWP2表达显著减少，且在MI条件下，这种减少更加明显(图3J-3K)。

我们通过分析心肌梗死(MI)模型中心脏组织中的相互作用，确认了WWP2对BAF170的调控作用。与Wwp2^f/f对照组相比，Myh6-Cre+；Wwp2^f/f小鼠的心脏组织中，MI后BAF170与WWP2的相互作用显著减少(图3C)。此外，在MI条件下，Myh6-Cre+；Wwp2^f/f小鼠的BAF170泛素化水平显著下降(图3D)。在shWWP2细胞系中进行的IP分析显示，无论是否接受H/SD处理，WWP2与BAF170的结合情况相似。H/SD处理减弱了H9C2-shWWP2细胞中WWP2与BAF170的相互作用(图8A)，并减少了WWP2介导的BAF170泛素化(图8B)。

心肌细胞的线粒体功能障碍被认为是心肌梗死(MI)的重要致病因素。心肌梗死引发急性活性氧(ROS)爆发，导致线粒体损伤和呼吸功能障碍，进而触发心肌细胞凋亡、心脏纤维化和心脏功能障碍，最终导致心力衰竭恶化。值得注意的是，与Wwp2^f/f小鼠相比，Myh6-Cre+；Wwp2^f/f小鼠的心肌梗死后心脏功能障碍显著加重，表现为射血分数(EF％)和缩短分数(FS％)的下降(图3E-3G)。心脏肥大标志物的评估显示，Myh6-Cre+；Wwp2^f/f小鼠的心脏重量与体重比(HW/BW)和心脏重量与胫骨长度比(HW/TL)均高于对照组(图3H-3I)。同时分析心脏组织中的氧化应激标志物发现，Myh6-Cre+；Wwp2^f/f小鼠的内源性ROS水平升高(图3L)，3-Nitrotyrosine和8-oxo-dG水平增加，SOD1和SOD2表达减少，与Wwp2^f/f小鼠相比(图3M-3N)。

接下来，我们研究了在已建立的MI小鼠模型中线粒体的呼吸功能、结构异常、氧化应激损伤及纤维化。首先，我们检查了与线粒体凋亡相关的蛋白BCL2，因为其表达下调直接关联于线粒体损伤和功能障碍。通过CUT&Tag和染色质免疫沉淀-qPCR(ChIP-qPCR)分析发现，与对照组相比，MI组织中BAF170与BCL2增强子的结合减少(图9D)。值得注意的是，Myh6-Cre+；Wwp2^f/f小鼠在MI中，BCL2的表达显著低于Wwp2^f/f对照组，这表明线粒体凋亡增强(图3O-3P)。

为了评估线粒体的呼吸功能，我们分离了心脏的线粒体组织，并使用OroborosO2K系统分析了不同线粒体复合体的氧气消耗。在Wwp2^f/f和Myh6-Cre+；Wwp2f/f小鼠中，心肌梗死后，复合体I的氧化磷酸化能力、复合体I和II的氧化磷酸化能力以及ATP的产生均有所下降，而复合体II的氧化磷酸化能力则保持不变。值得注意的是，与Wwp2^f/f组相比，Myh6-Cre+；Wwp2^f/f组在这三个参数上显著降低(图3Q)。

透射电子显微镜(TEM)被广泛认为是评估线粒体含量的金标准，能够测量线粒体的体积密度。在假手术组的Wwp2^f/f小鼠中，线粒体呈现出密集、紧密排列且组织良好的嵴。然而，MI处理组的小鼠显示出线粒体损伤的迹象，表现为嵴变得松散、肿胀、破坏和空泡化。这种损伤在Myh6-Cre+；Wwp2^f/f小鼠中尤为严重(图3R)。

为了探究心肌细胞凋亡是否与凋亡相关蛋白表达的变化有关，我们对Wwp2^f/f小鼠和Myh6-Cre+；Wwp2^f/f小鼠进行了比较分析。结果显示，在Myh6-Cre+；Wwp2^f/f小鼠中，Cleaved-PARP1和Cleaved-Caspase3的水平显著升高(图3S-3T)。此外，通过苏木精和伊红(H&E)、小麦胚芽凝集素(WGA)及马松染色的组织学分析表明，Myh6-Cre+；Wwp2^f/f小鼠的心脏肥大和纤维化情况明显加重(图3U-3W)。

接下来，我们研究了H9C2-shWWP2细胞系在有无H/SD处理条件下的氧化应激标志物和内源性ROS水平。首先，我们分析了几种与氧化应激相关的蛋白质，包括3-Nitrotyrosine、8-oxo-dG、SOD1和SOD2。结果显示，无论是有无H/SD处理的H9C2-shWWP2细胞系，其氧化应激相关蛋白质的水平均高于对照组。值得注意的是，HA-WWP2 NTm的重新表达能够有效降低这些升高的水平(图8E-8F)。随后，我们通过荧光方法检测了ROS水平。CellRox-Green荧光探针通过染色细胞核来检测完整组织中的ROS生成，产生绿色荧光，而Mitosox-Red荧光探针则用于测量线粒体中的ROS，显示红色荧光。对CellRox-Green和Mitosox-Red探针染色强度的量化分析表明，无论是否经过H/SD处理，H9C2-shWWP2细胞系的ROS生成量均显著高于对照组(图8G-8J)。

为了研究WWP2对H/SD模型中线粒体功能的影响，我们将HA-WWP2 NTm转染到H9C2-shWWP2细胞系中。结果显示，在shWWP2细胞中，无论是对照组还是H/SD模型，BCL2水平显著下降，表明线粒体凋亡增加。相反，当在shWWP2细胞中重新表达HA-WWP2 NTm时，BCL2水平显著上升，表明线粒体凋亡减少(图8L-8M)。通过JC-1染色法检测线粒体膜电位的变化。无论是否接受H/SD处理，H9C2-shWWP2细胞系中绿色JC-1单体与红色JC-1聚集体的比例升高，表明线粒体膜电位下降。重要的是，HA-WWP2 NTm的重新表达缓解了这一变化(图8N-8O)。

最后，我们研究了凋亡与H9C2细胞中凋亡相关蛋白表达变化之间的关系。通过比较H/SD组和对照组，发现无论是否接受H/SD处理，H9C2-shWWP2细胞系的Cleaved-PARP1和Cleaved-Caspase3水平均显著升高。值得注意的是，HA-WWP2 NTm的重新表达能够减轻这种增加(图8P-8Q)。此外，Hoechst33342染色显示，在H/SD和对照条件下，H9C2-shWWP2细胞系中的凋亡细胞数量显著增多。这一效应也因HA-WWP2 NTm的重新表达而减弱(图8G-8H,8K)。

WWP2过表达下调BAF170，减轻心肌梗死后心肌细胞损伤

鉴于WWP2表达减少的负面影响，我们测试了过表达WWP2是否能减轻心肌细胞损伤。通过将F0代小鼠与Myh6-CreER小鼠杂交，我们生成了Rosa26-WwP2-Flag转基因小鼠(WWP2-TG，R26-LSL-Wwp2+/+；Myh6-CreER)(图4A)。随后，通过结扎左前降冠状动脉，在野生型(WWP2-WT，R26-LSL-Wwp2+/+；Myh6-CreER-)和WWP2-TG小鼠中诱导心肌梗死，并监测了28天(图4B)。分析结果证实了WWP2-TG小鼠的成功生成，这些小鼠的WWP2表达水平显著低于WWP2-WT小鼠，且在心肌梗死后有显著下降(图4J-4K)。

为了研究WWP2在该模型中对BAF170的调控作用，我们分析了心脏组织中的蛋白质相互作用。与野生型(WWP2-WT)小鼠相比，在心肌梗死(MI)条件下，观察到WWP2转基因(WWP2-TG)小鼠的心脏组织中BAF170与WWP2之间的相互作用增强(图4C)。此外，我们发现，在心肌梗死后，WWP2转基因小鼠中BAF170的泛素化水平增加(图4D)。同样地，在H/SD模型中，转染HA-WWP2后，与HA载体对照组相比，WWP2与BAF170之间的相互作用增强，并且BAF170被WWP2的泛素化水平也有所提高(图8C-8D)。

WWP2转基因小鼠的心脏功能在心肌梗死(MI)中显著改善，这通过射血分数(EF％)和缩短分数(FS％)的测量结果得到证实(图4E-4G)。此外，与WWP2野生型小鼠相比，WWP2转基因小鼠在心肌梗死中的心脏肥大标志物减少，表现为心脏重量与体重比(HW/BW)和心脏重量与胫骨长度比(HW/TL)的降低(图4H-4I)。此外，WWP2转基因小鼠的氧化应激标志物也有所下降，包括内源性活性氧水平降低(图4L)，以及3-Nitrotyrosine和8-oxo-dG水平的减少，同时抗氧化酶SOD1和SOD2的表达量保持较高(图4M-4N)，高于WWP2野生型对照组。

随后，我们研究了在已建立的MI小鼠模型中观察到的线粒体呼吸功能障碍、结构异常、氧化应激损伤和纤维化的影响。结果显示，与野生型WWP2小鼠相比，WWP2转基因小鼠在MI后BCL2的表达显著增加，这表明线粒体凋亡减少(图4O-4P)。通过Oroboros O2K系统，我们发现MI后，无论是野生型WWP2小鼠还是WWP2转基因小鼠，复合物I氧化磷酸化能力、复合物I和II氧化磷酸化能力以及ATP生成量均有所下降，与假手术组相比。值得注意的是，复合物II氧化磷酸化能力未受影响。WWP2转基因小鼠在这三个参数上的表现均优于野生型WWP2小鼠(图4Q)。

电子显微镜检查显示，WWP2-WT小鼠的假手术组中，线粒体嵴密集、紧密且组织良好。相比之下，MI处理的小鼠线粒体嵴显得松散、肿胀、紊乱并出现空泡化。然而，MI处理后，WWP2-TG小鼠的这种结构损伤明显减轻(图4R)。与WWP2-WT小鼠相比，WWP2-TG小鼠中Cleaved-PARP1和Cleaved-Caspase3的水平显著降低(图4S-4T)。此外，通过H&E染色、WGA染色和Masson染色的组织学分析表明，WWP2-TG小鼠的心脏肥大和纤维化情况有了显著改善(图4U-4W)。

为了确定WWP2在心肌梗死(MI)中对BAF170泛素化作用的具体影响，我们使用了三种不同的短发夹RNA(shRNA)片段建立了稳定的BAF170敲低细胞系。121254片段表现出最佳的敲低效率，因此被用于后续实验(图10B-10C)。随后，我们在这些敲低细胞系中表达了野生型BAF170或其突变形式。序列分析显示，K874从大鼠到哺乳动物都是进化保守的位点，可能是由WWP2调控的BAF170泛素化位点。这一位点在小鼠中对应K874，在大鼠中对应K905(图10A)。因此，我们特别关注K874/K905残基，以探讨BAF170泛素化位点在氧化应激反应中的重要性。我们分析了多种氧化应激指标，包括3-Nitrotyrosine、8-oxo-dG、SOD1和SOD2。在缺氧/血清剥夺(H/SD)条件下，表达K905R-BAF170NTm的细胞显示出比表达WT-BAF170NTm的H9C2-shBAF170细胞更高的3-Nitrotyrosine和8-oxo-dG水平。相反，表达K905R-BAF170NTm的细胞中，SOD1和SOD2的水平较低(图10D-10E)。

我们使用荧光探针MitoSOX-Red和CellRox-Green评估了线粒体活性氧(ROS)水平，实验中分别进行了H/SD处理和未处理。结果显示，表达K905R-BAF170 NTm的细胞线粒体ROS水平始终高于表达WT-BAF170 NTm的细胞，无论是否进行H/SD处理(图10F-10I)。这些结果强烈表明，K905R-BAF170能够加重氧化应激引起的细胞损伤。

接下来，我们研究了BAF170对线粒体呼吸功能的影响。通过分析H9C2-shBAF170细胞系在重新表达WT-BAF170 NTm或K905R-BAF170 NTm后，是否接受H/SD处理，我们发现，与WT-BAF170 NTm的重新表达相比，无论是否接受H/SD处理，K905R-BAF170 NTm的重新表达都显著降低了BCL2水平，这表明线粒体凋亡增强(图10K-10L)。JC-1染色结果显示，在H/SD条件下，K905R-BAF170 NTm重新表达后，绿色JC-1单体与红色JC-1聚集体的比例显著增加(图10M-10N)。这些结果表明，在缺血缺氧刺激下K905R-BAF170突变加剧了线粒体功能障碍，并损害了心肌细胞线粒体的功能。

与线粒体凋亡增加一致，与H9C2-shWWP2细胞中WT-BAF170 NTm重新表达相比，K905R-BAF170NTm重新表达后凋亡标志物Cleaved-PARP1和Cleaved-Caspase3显示出显着更高的表达(图10O-10P)。Hoechst33342测定证实，与对照组相比，在正常和H/SD条件下，H9C2-shBAF170细胞系中凋亡细胞显着增加，K905R-BAF170 NTm重新表达进一步放大了这种效应(图10F-10G,10J)。

综上所述，我们的结果表明，BAF170中874位赖氨酸(K)残基突变为精氨酸(R)可防止其WWP2介导的蛋白酶体降解，从而导致线粒体功能障碍增加，氧化应激升高和心肌细胞凋亡增强。

BAF170-K874R破坏了BAF170的泛素化，加重了心肌细胞损伤

为了直接证明BAF170-K874在心肌梗死中的作用，我们在小鼠Smarcc2基外显子28的SWIRM结构域内构建了一个杂合K874R突变体。该突变涉及从AAG(赖氨酸)到CGC(精氨酸)的密码子变化，发生在功能关键区域(图5A-5B)。与野生型BAF170对照组相比，BAF170-K874R小鼠的BAF170表达水平显著升高。此外，心肌梗死后，BAF170的表达量也显著增加(图5I-5J)。

我们利用已建立的MI点突变小鼠模型，研究WWP2在BAF170调控中的作用。分析结果显示，与野生型BAF170小鼠相比，BAF170-K874R小鼠的心脏组织在MI后BAF170泛素化水平显著降低(图5C)。重要的是，与WT-BAF170小鼠相比，BAF170-K874R小鼠表现出明显更差的MI心脏功能障碍，如射血分数(EF％)和缩短分数(FS％)测量值较低所示(图5D-5F)。对心脏肥大标志物的评估，包括心脏重量/体重(HW/BW)和心脏重量/胫骨长度(HW/TL)比值，显示与WT-BAF170对照组相比，MI的BAF170-K874R小鼠的数值升高(图5G-5H)。

对WT-BAF170和BAF170-K874R小鼠的心脏组织进行了内源性ROS水平的同步测量及氧化应激标志物的Western blot分析。检测的标志物包括3-Nitrotyrosine、8-oxo-dG、SOD1和SOD2。结果显示，BAF170-K874R小鼠的内源性ROS水平显著升高(图5K)，同时3-Nitrotyrosine和8-oxo-dG水平也有所增加。相反，这些小鼠的SOD1和SOD2水平低于WT-BAF170小鼠(图5L-5M)。通过检测BCL2蛋白的表达水平，监测线粒体凋亡。与野生型BAF170小鼠相比，BAF170-K874R小鼠在心肌梗死后BCL2水平显著下降，表明其线粒体凋亡增强(图5N-5O)。

使用Oroboros O2K系统进行的分析显示，实验组之间的线粒体功能发生了显著变化。与假手术组相比，WT-BAF170和BAF170-K874R组在心肌梗死后，复合物I氧化磷酸化能力、复合物I和II氧化磷酸化能力以及ATP产量均有所下降。值得注意的是，复合物II氧化磷酸化能力未受影响。与WT-BAF170组相比，BAF170-K874R组在这三个参数上的值显著较低(图5P)。

电子显微镜显示，各组之间存在明显的形态学差异。在WT-BAF170小鼠的假手术组中，线粒体排列整齐，嵴密集且紧凑，呈现出有序的结构。相比之下，MI组的小鼠显示出线粒体功能障碍的迹象，表现为嵴松散、肿胀、破坏，并伴有空泡化现象。这些结构异常在MI后BAF170-K874R小鼠中尤为显著(图5Q)。

为了探究心肌细胞凋亡是否与凋亡相关蛋白表达变化有关，我们对比了野生型BAF170小鼠和BAF170-K874R突变体小鼠。研究发现，BAF170-K874R突变体小鼠的Cleaved-PARP1和Cleaved-Caspase3水平显著升高(图5R-5S)。此外，这些小鼠表现出更严重的心脏肥大和纤维化，通过H&E、WGA和Masson染色试验得到了证实(图5T-5V)。这些发现表明，当BAF170蛋白第874位的赖氨酸(K)被精氨酸(R)取代时，WWP2无法再通过蛋白酶体泛素化促进BAF170的降解。这一突变导致线粒体功能障碍加剧、氧化应激增加以及心肌细胞凋亡加重。

BFH772可显著减轻心肌梗死所致心肌细胞损伤

我们的研究结果表明，BAF170-WWP2轴对于保护心脏免受心肌梗死(MI)的损害至关重要。为了寻找能够增强WWP2与BAF170结合的小分子化合物，从而有可能缓解MI的影响，我们筛选了APE公司的生物活性化合物数据库(L-CO-020)。从30,000种小分子化合物中，我们筛选出了10种具有显著结合亲和力的候选化合物，这些化合物对BAF170-K874表现出显著的结合亲和力(见表3，图12B)。

这些候选物经过了严格的体外验证，测试了它们对WWP2与SMARCC2结构域之间相互作用的影响。我们首先使用大肠杆菌BL21表达了全长WWP2蛋白并进行了纯化(图11A)。随后，我们通过在HEK293T细胞中转染的方式，生成并纯化了SMARCC2蛋白的不同结构域(包括1-647、1-423、1-595、648-1214、424-1214和596-1214)(图11B)。我们对固定在表面等离子体共振(SPR)芯片上的WWP2进行了表面等离子体共振(SPR)分析。结果显示，BAF170截短肽1-647和1-595与WWP2的结合呈浓度依赖性，其亲和力常数分别为176nM和58.7nM(图11C-11D)。值得注意的是，与1-647肽相比，BAF170截短肽1-595对WWP2的亲和力显著降低，这与我们的结合实验结果一致(图1K)。其他BAF170截短肽对WWP2没有可检测到的结合(图11E-11F)。SPR分析一致证实，WWP2与BAF170的SANT、SWIRM和N端结构域相互作用。

我们进行了表面等离子体共振(SPR)实验，评估了10种预先筛选的小分子化合物，旨在找到能够增强WWP2与BAF170截短肽(1-647)结合的化合物。通过三元相互作用系统，我们将WWP2固定在芯片上，随后将候选化合物(以及空白对照)与BAF170混合，并将混合物与芯片一起孵育(图12A)。化合物5、6和7显示出增强的信号转导，表明改善了WWP2-BAF170结合(图12B)。值得注意的是，化合物6表现出最稳健和一致的信号增强，使其成为我们进一步研究的主要候选物(图12C)。这种化合物被命名为BFH772，是一种已知的VEGF抑制剂，其在抑制黑色素瘤生长方面表现出显著效果。目前，BH772正在接受用于治疗玫瑰痤疮的临床试验，显示出良好的抗炎效果。然而，BH772在心血管疾病，尤其是心肌梗死(MI)方面的潜在治疗应用尚未得到充分探索。

小分子BFH772的三维结构(图12D)进行了虚拟筛选分析，该分析模拟了BFH772与BAF170蛋白的结合方式，以表面图(图12E)和卡通图(图12F)的形式展示。BFH772与BAF170之间的相互作用，通过3D和2D可视化(图12G-12H)揭示了多个结合点：与残基A870、V871、K874和A877的疏水相互作用；与K874的氢键；与A873酰胺基团的π-π电子相互作用；以及与残基A877和E881的卤素键。

为了进一步验证我们的发现，我们研究了BFH772在体外对H9C2细胞的影响。我们用不同浓度的BFH772(0，0.01，0.1，1，10和100μM)处理细胞48小时。结果显示，随着剂量的增加，凋亡标志物Cleaved-PARP1和Cleaved-Caspase3的表达量逐渐减少。WWP2的表达在1μm BFH772时达到峰值，而BAF170的表达在这个浓度下显著下降，并在更高浓度下保持稳定。基于这些结果，我们确定1μm为后续实验的最佳BFH772浓度(图13A-13B)。

随后，我们利用转染了HA-WWP2的H9C2细胞(有或无1μM BFH772处理)来研究WWP2与BAF170之间的相互作用。48小时后，BFH772处理显著增强了WWP2与BAF170的相互作用，并促进了BAF170的泛素化(图13C-13D)。为了研究BFH772的影响，H9C2细胞先用该化合物预处理36小时，随后与H/SD共处理12小时。结果显示，与对照组相比，BFH772处理的细胞中氧化应激标志物(3-Nitrotyrosine和8-oxo-dG)显著降低，而抗氧化酶(SOD1和SOD2)水平则显著升高(图13E-13F)。此外，BFH772治疗导致凋亡标志物(BAF170、Cleaved-PARP1和Cleaved-Caspase3)的表达降低，保护蛋白(WWP2和BCL2)的表达增加(图13G-13H)。这些发现表明，BFH772通过多种机制发挥其心脏保护作用：它增强了WWP2介导的BAF170泛素化及其随后的降解，减少了氧化应激，并抑制了线粒体凋亡。综上所述，即使在体外实验中这些作用共同导致了对心肌细胞凋亡的显著保护。

为了进一步验证BFH772在体内心肌梗死(MI)中的作用，我们通过结扎左前降冠状动脉28天建立了MI小鼠模型。手术后48小时，通过腹腔注射给予不同浓度的BFH772(20、30或40mg/kg)(图6A)。与接受DMSO处理的对照组相比，接受30和40mg/kg BFH772的小鼠MI诱导的心功能障碍得到改善。这种改善在第14天和第28天通过射血分数(EF％)和缩短分数(FS％)的增加得到证实(图6B-6D)。然而，20mg/kg剂量并未显示出显著的治疗效果。此外，仅接受30mg/kg和40mg/kg BFH772治疗的小鼠显示出HW/BW和HW/TL比率的显著降低(图6E)。

氧化应激相关蛋白分析显示，与DMSO处理的小鼠相比，接受30mg/kg和40mg/kgBFH772治疗的小鼠表现出较低水平的3-Nitrotyrosine和8-oxo-dG，而SOD1和SOD2水平较高(图6F-6G)。此外，接受30和40mg/kg BFH772的小鼠线粒体凋亡相关蛋白BCL2的表达显著增加，表明线粒体功能改善(图6H-6I)。

使用Oroboros O2K系统，我们观察到接受30mg/kg和40mg/kg BFH772治疗的小鼠，其复合体I氧化磷酸化能力、复合体I和复合体II氧化磷酸化能力以及ATP产量均显著高于DMSO处理的对照组和20mg/kg组。复合体II氧化磷酸化能力保持不变(图6J)。值得注意的是，假手术组在不同BFH772浓度下这些参数均未出现统计学显著变化(图6K)。

电子显微镜检查显示，假手术组在所有BFH772剂量下，线粒体嵴均呈现密集、紧密且有序的排列。相比之下，手术组的线粒体损伤程度不一，表现为嵴的松散、肿胀、破坏和空泡化。值得注意的是，30mg/kg和40mg/kg的治疗组相比DMSO组显示出显著改善(图6L)。

通过在30mg/kg和40mg/kg剂量下治疗的小鼠中凋亡相关蛋白(Cleaved-PARP1和Cleaved-Caspase3)水平降低，进一步证实了BFH772的治疗效果(图6M-6N)。包括H&E、WGA和Masson染色在内的组织学分析，表明与DMSO处理的对照组和20mg/kg组相比，这些高剂量组的心肌肥厚和纤维化显著改善(图6O-6Q)。

我们的研究结果表明，BFH772能够增强WWP2与BAF170的结合能力，促进BAF170的泛素化，并抑制氧化应激及线粒体凋亡。这些机制有助于减轻心肌梗死后的心肌重构，从而有效缓解心肌梗死症状。

BAF170-K874R通过与增强子结合抑制BCL 2转录并促进Caspase3转录

使用BAF170抗体进行的CUT&Tag总分析显示，来自BAF170-K874R和WT-BAF170小鼠的心脏中均存在显著的峰富集(图9A)。差异分析显示，与野生型对照组相比，K874R突变体组中有1,281个基因片段上调表达，820个基因片段下调表达(图9B)。为了阐明BAF170泛素化的作用，我们对差异表达的基因进行了KEGG通路分析。值得注意的是，几个关键的凋亡调节因子在多个信号通路中出现——Caspase3出现在MAPK信号通路和凋亡通路中，而BCL2则出现在PI3K-Akt通路中(图9C)。这些发现表明，BAF170的泛素化通过调控目标基因的转录来影响细胞凋亡程序。事实上，ChIP-seq峰分析显示，BAF170在BCL2和Caspase3的调控区域有直接结合位点。具体而言，K874R突变增强了BAF170在Caspase3增强子上的结合，同时减少了在BCL2增强子上的结合，这分别导致这些基因的转录增加和减少(图9D-9E)。

表4.心肌梗死后心力衰竭小鼠心脏组织中与BAF170结合减少的蛋白质质谱结果

4、结论

利用高深度蛋白质组学技术，我们发现SWI/SNF染色质重塑复合体家族，特别是BAF170亚基，在心肌梗死中扮演着关键角色。我们确定WWP2是负责通过在K874位点多聚泛素化来调节BAF170的生理E3泛素连接酶，这触发了BAF170的降解。值得注意的是，通过点突变(BAF170-K874R)或WWP2敲除抑制这一多聚泛素化过程，显著增加了BAF170的表达，从而加剧了心肌梗死后心肌细胞的损伤。通过CUT&Tag实验，我们确定BCL2和Cleaved-Caspase3是BAF170调控的新下游凋亡蛋白。我们的研究揭示了一种新的模式，其中SWI/SNF染色质重塑复合体的关键成分BAF170的泛素化在协调线粒体功能、氧化应激反应和凋亡信号通路中起着关键作用。此外，这些发现还揭示了染色质重塑机制如何影响心血管健康和疾病的发展。

本研究通过将SWI/SNF染色质重塑复合体的成分BAF170的调控与心肌梗死(MI)诱导的心肌细胞持续凋亡联系起来，提供了新的机制见解。通过证明WWP2介导的多泛素化在BAF170降解中的作用，我们引入了一个新的轴，即氧化应激和线粒体功能障碍如何协同作用以维持心肌细胞凋亡。我们的发现不仅揭示了涉及的分子途径，还提出了潜在的治疗靶点，以减轻心肌细胞的持续凋亡，这为对抗心力衰竭的进展提供了一种有希望的策略。

我们的研究发现，在心肌梗死后的心脏重塑过程中，BAF170的表达显著增加。这种增加与三个负面效应相关：线粒体功能障碍加剧、氧化应激水平升高以及心肌细胞凋亡加剧。这些发现标志着我们对BAF170在心血管疾病中作用的理解有了重大进展。

本研究进一步证实，WWP2作为生理性的E3泛素连接酶，负责BAF170-K874的多泛素化及其随后的降解。研究发现，在心肌梗死后的心脏重塑过程中，WWP2介导的BAF170-K874多泛素化和降解功能受损，导致BAF170积累。这种积累引发了一系列不良后果，包括线粒体功能障碍加剧、氧化应激和心肌细胞凋亡增加。这些发现揭示了泛素化在染色质重塑及心血管疾病进展中的作用机制。

通过阐明染色质动力学与细胞凋亡之间的关系，我们的发现为研究染色质重塑在其他细胞死亡途径中的潜在作用开辟了新的研究方向，特别是在终末分化细胞中。这一视角显著提升了我们对细胞死亡调控机制的理解，并为该领域的未来研究指明了方向。

令人振奋的是，通过广泛筛选小分子化合物，我们发现BFH772，一种高度选择性的VEGFR-2抑制剂，因其在癌症治疗中的显著效果而闻名，能够显著减轻心肌梗死后心力衰竭引起的心肌细胞损伤。这一发现有效改善了线粒体功能障碍，减少了氧化应激，减轻了心肌细胞凋亡，最终减少了心肌梗死和心力衰竭中的纤维化。我们的研究强调了WWP2-BAF170轴在保护心肌细胞免受心肌梗死和心力衰竭后损伤中的重要性。

总之，我们发现了一种新的泛素化依赖机制，该机制在心肌梗死后调节染色质重塑。我们的研究显示，针对BAF170-K874的泛素化可以作为治疗心肌梗死后心脏重塑的一种有前景的策略。此外，我们鉴定出一种有潜力的小分子化合物BFH772，这为开发针对心肌梗死后心脏重塑的靶向治疗奠定了坚实的基础。这一发现为治疗干预开辟了新的途径，并需要在临床前和临床环境中进一步研究。

Claims (8)

1.一种BAF170突变体，与野生型BAF170相比，所述BAF170突变体为K874位点突变，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一种分离的核酸分子，所述核酸分子编码权利要求1所述BAF170突变体。

3.一种载体，所述载体包含权利要求2所述的分离的核酸分子。

4.一种宿主细胞，其中所述宿主细胞包含权利要求3所述的载体。

5.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1所述的BAF170突变体。

6.根据权利要求5所述的药物组合物，其中，所述药物组合物还包含药学上可接受的稀释剂、赋形剂和/或载体。

7.权利要求1所述的BAF170突变体或药物组合物在制备用于预防、缓解和/或治疗心血管疾病的药物中的用途。

8.根据权利要求7所述的用途，其中，所述心血管疾病选自冠状动脉疾病、冠心病、心机梗死。