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CN120815063A - 一种重组腺病毒载体疫苗制剂及其制备方法 - Google Patents

一种重组腺病毒载体疫苗制剂及其制备方法

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CN120815063A
CN120815063A CN202510469343.0A CN202510469343A CN120815063A CN 120815063 A CN120815063 A CN 120815063A CN 202510469343 A CN202510469343 A CN 202510469343A CN 120815063 A CN120815063 A CN 120815063A
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CN
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virus
vaccine
concentration
vaccine formulation
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CN202510469343.0A
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赵晓龙
王月然
彭少丹
菅慧
王丽萍
蒋悦颖
司伟雪
徐方
朱涛
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CanSino Biologics Inc
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Abstract

本发明涉及一种雾化吸入疫苗制剂及其制备方法，该制剂包含有效成分和辅料；所述有效成分为低浓度的表达抗原蛋白的重组人复制缺陷型腺病毒，所述辅料包括缓冲剂、保护剂、稳定剂、表面活性剂、渗透压调节剂。本发明雾化吸入疫苗制剂能够保持人复制缺陷型腺病毒载体疫苗制剂良好的稳定性。

Description

一种重组腺病毒载体疫苗制剂及其制备方法
技术领域
本发明属于病毒生物学领域，具体涉及一种重组腺病毒载体雾化吸入疫苗制剂及其制备方法。
背景技术
基因治疗和疫苗研究领域的一个持续挑战是产生在特定温度范围内更长时间稳定的液体病毒制剂。腺病毒载体目前是被认为是基因传递/治疗的主要方法之一。腺病毒在基因治疗领域具有巨大潜力,因此需要开发适合人类肠胃外使用的制剂。虽然已经开发出供人使用的活腺病毒疫苗,但是以冻干制剂形式给药，这些冻干制剂中使用的赋形剂(明胶、脱脂奶、人血清白蛋白等)不适用于肠胃外给药途径。因此尽管有关于腺病毒的结构和表征的报道,但很少有关于用于人类肠胃外给药的腺病毒的稳定化制剂的开发的相关研究报告。此外,大多数腺病毒制剂为冻干制剂而不是液体制剂,其原因大概是液体制剂的稳定性难以保证。随着腺病毒制剂的不断研究，现有技术已经开发出腺病毒雾化吸入制剂，在针对腺病毒吸入制剂的进一步研究中，发明人意外的发现，不同浓度的腺病毒颗粒对制剂体系要求不同，更意外的发现，目前广泛使用和公开报道的腺病毒的稳定体系，不适用于低浓度腺病毒雾化吸入制剂。为此，亟需开发一种制剂配方以提高低浓度腺病毒雾化吸入制剂的稳定性。
发明内容
本发明的目的在于提供稳定的、低病毒浓度的腺病毒液体制剂，本发明的重组腺病毒载体疫苗制剂使得疫苗制剂在低浓度病毒条件下也可以维持制剂的稳定性，并可以有效激起机体的免疫反应，且可稳定的作为雾化吸入制剂提供。
本发明提供一种雾化吸入疫苗制剂，可以有效激起机体的免疫反应。本发明在针对雾化吸入疫苗制剂的研究中意外的发现，雾化吸入疫苗制剂的有效成分为低浓度的表达抗原蛋白的重组人复制缺陷型腺病毒颗粒时，使用常规的稳定体系会出现制剂稳定性不足的问题，因此针对性开发一种低浓度腺病毒雾化吸入制剂。
进一步的，所述雾化吸入疫苗制剂包含有效成分和辅料，所述有效成分为低浓度的表达抗原蛋白的重组人复制缺陷型腺病毒，复制缺陷型腺病毒含量低于5ⅹ109VP/ml；
本发明的制剂在低病毒浓度下为腺病毒提供稳定性,并且可以施用于多种脊椎动物生物体,优选哺乳动物,尤其是人类。本发明的稳定化病毒制剂优选是基于重组腺病毒的组合物,其中例如作为疫苗施用可以为先前未感染的个体提供预防优势和/或通过降低受感染个体内的病毒载量水平提供治疗效果,从而延长特定微生物感染的无症状阶段。
进一步的，雾化吸入疫苗制剂的辅料成分中不包含乙醇；
进一步的，在不含乙醇的体系下，缓冲体系优选为组氨酸；组氨酸浓度大于2mM。
进一步的，在所述缓冲剂为组氨酸时，所述疫苗制剂的pH值优选为6.2-6.8。
进一步的，雾化吸入疫苗制剂辅料还包括保护剂；
在一些具体实施方式中，所述保护剂选自明胶、乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)、氯化镁和氯化镁水合物中的一种或多种。优选的，所述保护剂为乙二胺四乙酸二钠和氯化镁六水合物。
在一些具体实施方式中，所述保护剂为乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)和氯化镁六水合物，雾化吸入疫苗制剂疫苗制剂中EDTA-2Na的浓度为0-1mM，优选的，所述制剂中EDTA-2Na的浓度为0.1mM。
在一些具体实施方式中，疫苗制剂中氯化镁六水合物的浓度为1-10mM，优选的，所述制剂中氯化镁六水合物的浓度为1-5mM；更优选所述制剂中氯化镁六水合物的浓度为2mM。
在一些具体实施方式中，所述稳定剂选自蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、甘露醇和甘油中的一种或多种。
优选的，所述稳定剂为蔗糖、甘露醇和甘油。
在一些具体实施方式中，所述疫苗制剂中的甘油的浓度为0.5-10mg/ml，或所述疫苗制剂中的甘油的重量/体积分数(w/v)为0.05％-1％，优选的，所述制剂中甘油的浓度为1.5mg/ml。或优选的，所述疫苗制剂中的甘油的重量/体积分数(w/v)为0.15％。
在一些具体实施方式中，所述疫苗制剂中蔗糖的浓度为20-80mg/ml，优选的，所述制剂中蔗糖的浓度为25mg/ml。
在一些具体实施方式中，所述疫苗制剂中甘露醇的浓度为20-80mg/ml，或所述疫苗制剂中甘露醇的重量/体积分数(w/v)为2％-8；优选的，所述制剂中甘露醇的浓度为50mg/ml，或优选的，所述疫苗制剂中甘露醇的重量/体积分数(w/v)为5％。
在一些具体实施方式中，所述表面活性剂选自非离子型表面活性剂、阴离子型表面活性剂和两性离子型表面活性剂中的一种或多种。
优选的，所述表面活性剂选自十二烷基硫酸钠、十二烷基磺酸钠、聚乙烯醇、吐温80(聚山梨酯80)、吐温20(聚山梨酯20)、司盘80和司盘20中的一种或多种。
优选的，所述表面活性剂为吐温80(聚山梨酯80)。
在一些具体实施方式中，所述表面活性剂的浓度为0.01-1mg/ml，或，所述表面活性剂的重量/体积分数(w/v)为0.001％-0.1％；优选的，所述表面活性剂的浓度为0.1mg/ml，或优选的，所述表面活性剂的重量/体积分数(w/v)为0.01％。
在一些具体实施方式中，所述渗透压调节剂为氯化钠和/或氯化钙。
优选的，所述渗透压调节剂为氯化钠。
在一些具体实施方式中，所述渗透压调节剂的浓度为30mM-70mM，优选的，所述渗透压调节剂的浓度为50mM。
在一些具体实施方式中，本发明所述的人复制缺陷型腺病毒包含编码肺结核抗原的多核苷酸，包括编码结核分枝杆菌Mtb32A、Mtb39A抗原或Ag85A抗原的肽或结构蛋白中的一种或多种；优选地，抗原肽或结构蛋白通过linker进行连接。
在一些具体实施方式中，所述linker为柔性linker，其序列所述连接肽为GGGGSGGGGSGGGGS连接肽、GGGGS连接肽、GlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyGly连接肽、GlyGlyGlyGlyGlyGly连接肽、EAAAKEAAAK连接肽、EAAAK连接肽、PAPAP连接肽、APAPAPAPAPAPAPAP连接肽、KESGSVSSEQLAQFRSLD连接肽、AEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKALEAEAAAKEAAAKEAAAK连接肽、EAAAKA和/或EAAAKEAAAKEAAAK连接肽。在一些具体实施方式中，编码Ag85A抗原的氨基酸序列为SEQ ID NO:1或具有至少75％的同源性序列；优选地，至少具有80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性。
在一些具体实施方式中，所述抗原的肽或结构蛋白为Mtb32A、Mtb39A融合抗原(简称TB75K)；优选地，所述编码抗原的氨基酸序列为SEQ ID NO:2或具有至少75％的同源性序列；优选地，至少具有80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性；更优选地，其中linker序列可进行替换。
在一些具体实施方式中，所述Ag85A与TB75K通过l inker融合；优选地，为Ag85A-linker-TB75K或TB75K-l inker-Ag85A。
在一些具体实施方式中，编码Ag85A-l inker-TB75K抗原的氨基酸序列为SEQ IDNO:3或具有至少75％的同源性序列；优选地，至少具有80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性；更优选地，其中linker序列可进行替换。
在一些具体实施方式中，编码TB75K-linker-Ag85A抗原的氨基酸序列为SEQ IDNO:4或具有至少75％的同源性序列；优选地，至少具有80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性；更优选地，其中linker序列可进行替换。
在一些具体实施方式中，进一步包含编码信号肽的氨基酸序列；优选地，所述信号肽选自组织型纤溶酶原激活物(tPa)信号肽、Ag85A野生型信号肽、生长激素信号肽、重组人肿瘤抑制素M(人OSM)、水泡性口炎病毒融合性外壳G糖蛋白(VSV-G)、小鼠Ig Kappa、小鼠重链、基底膜蛋白40(BM40)、人糜蛋白酶原、人胰蛋白酶原-2、人白细胞介素-2(人IL-2)、虫荧光素酶、人血白蛋白(HSA)、流感血凝素、人胰岛素、蚕纤维蛋白LC中的一种或多种。
本发明还提供包含上述任一多核苷酸的载体和包含上述任一多核苷酸的重组人复制缺陷型腺病毒。
在一些具体实施方式中，本发明所述重组人复制缺陷型腺病毒由以下方法制备得到，所述方法包括以下步骤：
(1)构建含有所述编码抗原肽或结构蛋白的多核苷酸的穿梭质粒载体；
(2)将步骤(1)所述穿梭质粒载体与骨架质粒一起转染入宿主细胞；
(3)培养步骤(2)所述宿主细胞；
(4)收获从步骤(3)所述细胞中释放的人复制缺陷重组腺病毒；
(5)对步聚(4)中的重组腺病毒进行扩大培养；
(6)对步聚(5)中的培养产物进行纯化。
本发明的另一方面，提供一种制备上述任一种疫苗制剂的方法，所述方法包括以下步骤：1)纯化重组腺病毒抗原原液；2)按比例配置疫苗辅料；3)配制半成品；4)将半成品分装入管制瓶。
在一些具体实施方式中，所述纯化步骤包括：病毒收获液经过裂解、离心、过滤后得到澄清液，然后经过离子交换层析和复合模式层析两步层析后得到纯化病毒液，再经过超滤换液至指定配方中，最后通过无菌过滤得到疫苗原液。
本发明的另一个方面，提供一种重组腺病毒载体疫苗制剂的制备方法，包括以下步骤：制备编码目标抗原蛋白的重组腺病毒载体；加入药学上可接受的辅料。
具体的，制备编码结核分枝杆菌Ag85A抗原的重组腺病毒载体，任选的，加入药学上可接受的辅料；或，制备编码结核分枝杆菌Mtb32A和Mtb39A抗原的重组腺病毒载体，任选的，加入药学上可接受的辅料；或，制备编码结核分枝杆菌Mtb32A、Mtb39A和Ag85A抗原的重组腺病毒载体，任选的，加入药学上可接受的辅料；或，分别制备编码结核分枝杆菌Ag85A抗原的重组腺病毒载体及编码结核分枝杆菌Mtb32A和Mtb39A抗原(TB75K)的重组腺病毒载体，混合，任选的，加入药学上可接受的辅料。
具体的，所述方法包括以下步骤：构建融合抗原序列；构建质粒；将所得重组腺病毒穿梭质粒与携带腺病毒大部分基因组的骨架质粒共转染包装。
优选地，利用基因工程的方法,构建Ag85A抗原序列(SEQ ID NO.1)；或，构建Mtb32A和Mtb39A(TB75K)融合抗原序列(SEQ ID NO.2)；或，将含Mtb32A和Mtb39A(TB75K)融合抗原序列(SEQ ID NO.2)和Ag85A抗原序列(SEQ ID NO.1)使用连接肽(即linker)连接。
更优选地，构建成TB75K-linker-Ag85A(SEQ ID NO.4)或Ag85A-linker-TB75K(SEQ ID NO.3)融合抗原。
具体的，还包括以下步骤：将所述共转染包装后的原始毒株种子加入相应辅料，即得到该疫苗。
具体地，编码结核分枝杆菌TB75K、Ag85A融合抗原蛋白的重组腺病毒载体的构建步骤包括：
(1)构建pDC316-TB75K-Ag85A质粒
将合成完毕的TB75K、Ag85A融合蛋白基因片段，酶切，回收酶切片段。同时，将AdMax腺病毒系统的穿梭质粒载体进行酶切，回收载体。使用同源重组的方法将TB75K-Ag85A片段连接于载体上，化转感受态，涂布平板。挑取单克隆进行划线接种同时进行菌落PCR鉴定。随后取划线平板中的阳性克隆单克隆进行培养，提取质粒进行酶切鉴定。取10个酶切鉴定阳性克隆进行序列测定，将测序鉴定正确的载体记为pDC316-TB75K-Ag85A。
(2)重组腺病毒Ad5，TB75K、Ag85A毒种包装
将穿梭质粒pDC316-TB75K-Ag85A和AdMax腺病毒系统的骨架质粒，通过共转染的方法进行Ad5-TB75K-Ag85A的包装，包装得到的病毒命名为Ad5-105K。
本发明吸入疫苗吸入制剂所用辅料不会对疫苗原液产生免疫抑制，相容性良好。
本发明的疫苗制剂在对机体进行免疫后，诱导产生高水平的抗原特异性IgG、IgA、sIgA抗体，且在肺部和系统都能产生良好的细胞免疫应答。本发明提供的重组腺病毒载体疫苗具有良好的稳定性、安全高效。
本发明疫苗制剂利用呼吸道黏膜递送的方式给药，较注射不仅具有顺应性，而且给药剂量更低，还可产生体液免疫、细胞免疫和黏膜免疫的三重免疫效果。本发明提供的疫苗组合物可以用于基础免疫或加强免疫。
本发明疫苗经适宜的设备雾化后，可产生粒径为3～10μm的颗粒，具体的，可产生粒径包括但不限于为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5或10μm的颗粒；优选的，为5～10μm粒径均一度较佳的气溶胶颗粒，具体的，包括但不限于为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5或10.0粒径均一度较佳的气溶胶颗粒。其经鼻腔或口腔吸入可到达肺部，从而产生对整个呼吸道，以及肺部的保护性免疫反应，增强疫苗的有效利用率，提高疫苗的效果。
具体的，本发明还提供一种多组分重组腺病毒载体疫苗制剂组合物的制备以及其在预防和/或治疗疾病中的应用。
具体的，所述疾病为由SARS-CoV、SARS-CoV-2、埃博拉病毒、乙肝病毒、丙肝病毒、登革热病毒、带状疱疹病毒、狂犬病毒、人类免疫缺陷病毒、水痘-带状疱疹病毒和/或结核分枝杆菌感染引起的疾病。
本发明另一方面，提供上述任一种重组人复制缺陷型腺病毒载体疫苗制剂在制备预防和/或治疗疾病的药物中的应用。
具体的，所述疾病为由SARS-CoV、SARS-CoV-2、埃博拉病毒、乙肝病毒、丙肝病毒、登革热病毒、带状疱疹病毒、狂犬病毒、人类免疫缺陷病毒、水痘-带状疱疹病毒和/或结核分枝杆菌感染引起的疾病。
本发明的有益效果是：
一、本发明疫苗制剂能够保持人复制缺陷型腺病毒载体疫苗制剂良好的稳定性，特别是在低病毒浓度的条件下仍能维持制剂的良好稳定性。该疫苗制剂可有效避免抗原的聚集，可以长期稳定保存，且其异常毒性试验合格，使用安全。
二、本发明疫苗制剂适于利用雾化吸入方式给药，该疫苗制剂同时可以保证在雾化后的活性收率，同时可产生体液免疫、细胞免疫和黏膜免疫的三重免疫效果，可以用于基础免疫或加强免疫。
三、本发明疫苗制剂可靶向免疫肺部巨噬细胞，可利用人5型腺病毒载体作为安全的天然I型佐剂在肺部增强疫苗的免疫应答。
四、使用本发明疫苗制剂不会影响到各抗原成分的免疫原性，抗原之间不会产生免疫反应的相互干扰，辅料成分、含量及制剂pH值合适，可以有效保护机体免受致病细菌或病毒的感染和预防潜伏感染的复发。
附图说明
图1抗原表达验证的Western Blot结果(1：TB75K；2：Ag85A；3：Ag85A:TB75K＝1:1；4：Ag85A-linker-TB75K；5：TB75K-l inker-Ag85A；6：阴性对照)；
图2不同浓度制剂在37℃条件下4周LossLgIFU变化趋势
图3腺病毒浓度为5×109VP/ml的不同缓冲体系制剂37℃加速稳定性变化趋势
图4腺病毒浓度为5×109VP/ml的不同缓冲体系制剂的雾化稳定性
图5.不同浓度组氨酸缓冲体系制剂37℃加速稳定性变化趋势
图6.乙醇-组氨酸缓冲体系和组氨酸体系下(5×109vp/ml)制剂37℃加速稳定性变化趋势
图7.乙醇-组氨酸缓冲体系和组氨酸体系下(1×109vp/ml)制剂37℃加速稳定性变化趋势
图8.乙醇-组氨酸缓冲体系和组氨酸体系下(1×108vp/ml)制剂37℃加速稳定性变化趋势
图9.不同pH的重组腺病毒载体制剂37℃-4周LossLgIFU加速稳定性变化趋势
图10.不同pH的重组腺病毒载体制剂的雾化稳定性活性收率具体实施方式
除非另有定义，本发明中所使用的所有科学和技术术语具有与本发明涉及技术领域的技术人员通常理解的相同的含义。下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：重组腺病毒载体疫苗制剂的构建包装
1、融合抗原毒株的构建制备
(1)构建pDC316-TB75K-Ag85A质粒
优化后的结核分枝杆菌融合抗原序列见SEQ ID NO:4。
将合成完毕的TB75K、Ag85A融合基因片段，酶切，回收酶切片段。同时，将AdMax腺病毒系统的穿梭质粒载体使进行酶切，回收载体。使用同源重组的方法将TB75K-Ag85A片段连接于载体上，化转感受态，涂布于Amp抗性LB平板。第二天挑单克隆进行划线接种同时进行菌落PCR鉴定。随后取划线平板中的阳性克隆单克隆进行培养，提取质粒进行酶切鉴定。取10个酶切鉴定阳性克隆进行序列测定，将测序鉴定正确的载体记为pDC316-TB75K-Ag85A
(2)重组腺病毒Ad5-TB75K-Ag85A毒种包装
将穿梭质粒pDC316-TB75K-Ag85A和AdMax腺病毒系统的骨架质粒，通过共转染的方法进行Ad5-TB75K-Ag85A的包装，包装得到的病毒命名为Ad5-105K。
疫苗吸入制剂的制备：
1)重组肺结核疫苗(5型腺病毒载体)的制备：取上述新型重组肺结核疫苗TB75K-Ag85A原液(含病毒颗粒数5×1010VP)，加入辅料甘露醇50mg、氯化钠5mg、HEPES1mg、聚山梨酯80 0.2mg、甘油4mg、氯化镁0.2mg、蔗糖30mg，混合得1ml重组多组分肺结核疫苗(5型腺病毒载体)制剂。标记为ADTB202302001。
实施例2：重组腺病毒载体疫苗制剂体外表达鉴定
采用细胞试验结合Western Blot法检测实施例1制备的重组腺病毒载体肺结核疫苗目的抗原表达。
(1)细胞试验
经过细胞铺板，接毒，病毒感染细胞，裂解细胞，将细胞裂解上清转移至新的EP管中，获得供试品裂解上清液和阴性对照裂解上清液。-80℃冰箱保存，备用。
(1)Western Blot实验检测目的基因表达
电泳，转膜，封闭，一抗孵育，二抗孵育。
结果分析
1)试验成立条件
a.阴性对照样品不应有目的抗原条带；
b.阳性样品目的抗原条带清晰可辩且分子量大小准确。
2)判定标准
TB75K抗原蛋白在75kDa附近有目的条带，多组分结合抗原在105～110KDa附近有目的条带，且阴性对照不应出现目标蛋白条带，判定为目标蛋白表达阳性。
(2)重组腺病毒肺结核疫苗目的抗原表达结果分析
重组新型肺结核疫苗(5型腺病毒载体)目的抗原表达，应满足上述两种同时为阳性(+)时，判定其结果为阳性。检测结果如图1所示。
实施例3：HEPES缓冲体系下不同病毒浓度制剂的稳定性
缓冲剂为HEPES，在此体系下，设置重组腺病毒浓度梯度，验证不同重组腺病毒浓度下，重组腺病毒载体制剂的稳定性，制剂中含包括甘露醇、蔗糖、氯化钠、氯化镁、甘油、PS-80、乙醇等。检测不同浓度的重组腺病毒制剂样品在37℃、HEPES缓冲体系条件下的IFU,考查LossLgIFU变化趋势
组别 病毒颗粒数VP/ml pH值
1 1.00E+08 7.5
2 1.00E+09 7.5
3 5.00E+09 7.5
4 1.00E+10 7.5
5 1.00E+11 7.5
结果如图2所示，当腺病毒含量低于5×109时，以HEPES缓冲液为体系，制剂37℃加速实验稳定性明显变差。
实施例4：不同缓冲剂对低剂量腺病毒浓度制剂稳定性的影响和制剂雾化活性收率
设置不同缓冲体系，考察在不同缓冲体系下，重组腺病毒载体制剂放置1周、2周、3周、4周的IFU变化情况。选择组氨酸、PB、Tris-HCl、HEPES、组氨酸+Tris-HCl、组氨酸+HEPES；制剂中含包括甘露醇、蔗糖、氯化钠、氯化镁、甘油、PS-80、乙醇等。检测不同缓冲体系下的重组腺病毒制剂样品在37℃条件下的IFU,考查LossLgIFU变化趋势。检测不同缓冲体系的重组腺病毒制剂未经雾化样品和雾化回收样品的活性，计算雾化活性收率。
组别 病毒颗粒数VP/ml pH值 缓冲液
1 5.00E+09 7.5 HEPES
2 5.00E+09 7.5 HIS
3 5.00E+09 7.5 Tris-HCl
4 5.00E+09 7.5 PB
5 5.00E+09 7.5 HIS-Tris-HCl
6 5.00E+09 7.5 HIS-HEPES
结果如图3和图4所示，当腺病毒含量为5×109时，以HIS缓冲液为体系，制剂稳定性最佳。
实施例5.不同浓度组氨酸缓冲体系对低剂量腺病毒浓度制剂稳定性的影响
设置HIS缓冲体系，考察在不同浓度组氨酸含量，低剂量病毒含量下，重组腺病毒载体制剂在37℃放置1周、2周、3周、4周的IFU变化情况。制剂中含包括甘露醇、蔗糖、氯化钠、氯化镁、甘油、PS-80、乙醇等。
组别 组氨酸浓度 pH值
1 2mM 7.5
2 5mM 7.5
3 10mM 7.5
4 15mM 7.5
5 20mM 7.5
6 30mM 7.5
结果如图5所示，当腺病毒含量为5×109vp/ml时，以HIS缓冲液为体系，浓度为2mM时，制剂稳定性较差；浓度为5-30nM时，制剂稳定性更优。
实施例6：EtOH对重组腺病毒载体制剂稳定性的影响率
设置HIS缓冲体系，考察在有无乙醇及不同低剂量病毒含量下，重组腺病毒载体制剂在37℃放置1周、2周、3周、4周的IFU变化情况。
组别 病毒颗粒数VP/ml 缓冲液 乙醇
1 5.00E+09 HIS 0
2 1.00E+09 HIS 0
3 1.00E+08 HIS 0
4 5.00E+09 HIS 0.5％
5 1.00E+09 HIS 0.5％
6 1.00E+08 HIS 0.5％
结果如图5-7所示，当腺病毒含量低于5×109，缓冲液为HIS体系时，不含乙醇制剂稳定性更佳。
实施例6：pH对重组腺病毒载体制剂稳定性的影响率和制剂雾化活性收率
设置HIS缓冲体系，在无乙醇体系下，低剂量病毒含量研究pH变化对重组腺病毒载体制剂稳定性的影响，重组腺病毒载体制剂在37℃放置1周、2周、3周、4周的IFU变化情况。
组别 病毒颗粒数VP/ml 缓冲液 pH
1 5.00E+09 HIS 7
2 1.00E+09 HIS 7
3 1.00E+08 HIS 7
4 5.00E+09 HIS 6.8
5 1.00E+09 HIS 6.8
6 1.00E+08 HIS 6.8
7 5.00E+09 HIS 6.6
8 1.00E+09 HIS 6.6
9 1.00E+08 HIS 6.6
5.00E+09 HIS 6.2
1.00E+09 HIS 6.2
1.00E+08 HIS 6.2
10 5.00E+09 HIS 6.0
11 1.00E+09 HIS 6.0
12 1.00E+08 HIS 6.0
结果如图9和图10所示，当腺病毒含量低于5×109，缓冲液为HIS体系、不含乙醇时，pH在6.2-6.8之间制剂37℃加速实验稳定性和制剂雾化活性收率最佳。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

Claims (12)

1.一种雾化吸入疫苗制剂，其特征在于，所述疫苗制剂有效成分为表达抗原蛋白的重组5型人复制缺陷型腺病毒，所述制剂不包含乙醇，所述制剂中重组5型人复制缺陷型腺病毒含量低于5ⅹ109VP/ml。
2.根据权利要求1所述的疫苗制剂，其特征在于，疫苗制剂的缓冲体系为组氨酸。
3.根据权利要求4所述的疫苗制剂，其特征在于，所述疫苗制剂中的组氨酸浓度大于2mM。
4.根据权利要求1-3任一项所述的疫苗制剂，其特征在于，所述保护剂选自明胶、乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)、氯化镁和氯化镁水合物中的一种或多种；优选的，所述保护剂为乙二胺四乙酸二钠和氯化镁六水合物,疫苗制剂中EDTA-2Na的浓度为0-1mM，优选为0.1mM，疫苗制剂中氯化镁六水合物的浓度为1-10mM，优选为1-5mM，更优选为2mM。
5.根据权利要求1-4任一项所述的疫苗制剂，其特征在于，所述稳定剂选自蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、甘露醇和甘油中的一种或多种；优选的，所述稳定剂为蔗糖、甘露醇和甘油。
所述制剂中的甘油的浓度为0.5-10mg/ml；优选的，所述制剂中甘油的浓度为1.5mg/ml,所述制剂中蔗糖的浓度为20-80mg/ml；优选的，所述制剂中蔗糖的浓度为25mg/ml,所述制剂中甘露醇的浓度为20-80mg/ml；优选的，所述制剂中甘露醇的浓度为50mg/ml。
6.根据权利要求1-6任一项所述的疫苗制剂，其特征在于，所述表面活性剂选自非离子型表面活性剂、阴离子型表面活性剂和两性离子型表面活性剂中的一种或多种；优选的，所述表面活性剂选自十二烷基硫酸钠、十二烷基磺酸钠、聚乙烯醇、吐温80、吐温20、司盘80和司盘20中的一种或多种；优选的，所述表面活性剂为吐温80,所述表面活性剂的浓度为0.01-1mg/ml；优选的，所述表面活性剂的浓度为0.1mg/ml。
7.根据权利要求1-6任一项所述的疫苗制剂，其特征在于，所述制剂的pH值为6.2-6.8。
8.根据权利要求1-7任一项所述的疫苗制剂，其特征在于，所述制剂为雾化吸入制剂，所述制剂经雾化给药装置雾化后形成粒径10μm以下的颗粒；优选地，0.5～10μm,更优选地，5～10μm。
9.根据权利要求1-8任一项所述的疫苗制剂，其特征在于，所述抗原蛋白来源于SARS-CoV、SARS-CoV-2、埃博拉病毒、乙肝病毒、丙肝病毒、登革热病毒、带状疱疹病毒、狂犬病毒、人类免疫缺陷病毒、水痘-带状疱疹病毒和/或结核分枝杆菌。
10.一种制备如权利要求1-9任一项所述疫苗制剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)纯化重组腺病毒抗原原液；2)按比例配置疫苗辅料；3)配制半成品；4)将半成品分装入管制瓶。
11.一种重组人复制缺陷型腺病毒载体疫苗制剂在制备预防和/或治疗疾病的药物中的应用，其特征在于，所述疫苗制剂如权利要求1-11所述。
12.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述疾病由SARS-CoV、SARS-CoV-2、埃博拉病毒、乙肝病毒、丙肝病毒、登革热病毒、带状疱疹病毒、狂犬病毒、人类免疫缺陷病毒、水痘-带状疱疹病毒和/或结核分枝杆菌感染导致。
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