CN120775750A - 一种卷曲乳杆菌及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种卷曲乳杆菌及应用，属于微生物技术领域。本发明的卷曲乳杆菌Lcris‑CD6保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2025370。本发明的卷曲乳杆菌Lcris‑CD6无毒力因子和耐药基因、不溶血，具有良好的安全性，其有益效果是：能产多种有机酸并对酸性环境具有耐受性，可适应并维持女性生殖道的酸性环境；抑制致病菌的繁殖；对白色念珠菌性阴道炎小鼠的局部组织起修复作用；调节小鼠白色念珠菌阴道炎感染后阴道微生物菌群相对丰度，恢复阴道微生物菌群环境；提高阴道微生物群的多样性和丰富性。

Description

一种卷曲乳杆菌及应用

技术领域

本发明涉及一种卷曲乳杆菌及应用，属于微生物技术领域。

背景技术

健康女性的阴道是一个非常复杂的微生态系统，寄居着大量不同种类的微生物，包含细菌、真菌等，它们主要定殖于阴道四周的侧壁黏膜中。这些微生物彼此制约、相互制衡，形成动态平衡，多种阴道炎的发生与阴道微生态环境失衡有关。

阴道微生物群通常由各种厌氧和需氧微生物组成。其中，乳杆菌是最常见且通常是主要的微生物，作为抵御感染的保护屏障发挥着至关重要的作用。乳杆菌可通过粘附竞争、产生细菌素、激活免疫系统等途径来维持阴道微生态环境，改善阴道炎症。总体上可将阴道菌群分为5种菌群类型(community-state types，CST)，其中4种以乳杆菌为主。卷曲乳杆菌、格氏乳杆菌、惰性乳杆菌、詹氏乳杆菌分别在CST I、CST II、CST III和CST V中占主导地位；CST IV厌氧菌比例更高（普雷沃菌属、小杆菌属、奇异菌属、加德纳菌属和斯尼思菌属），并影响乳杆菌的生长。当阴道微生态环境遭到破坏时，阴道菌群的种类和数量会发生较大变化，即有益菌种类和数量减少、有害菌占据优势菌群，进而引发阴道炎，使人体出现阴道疼痛、瘙痒、白带增多、异味等不适症状，给人们的生活造成严重影响。念珠菌性阴道炎(vulvovaginal candidiasis, VVC)是一种具有高发病率、高复发性以及非致命性等特点的妇科疾病，是困扰全球女性身体健康的一大难题。念珠菌性阴道炎的主要致病菌为白假丝酵母，这是一种存在于健康女性阴道内的机会致病菌，其菌丝态可以通过分泌黏附素定殖在阴道上皮细胞，进而形成生物膜，来抵抗抗真菌药物和宿主防御。

针对VVC，当前的治疗方法主要是使用抗生素治疗，虽然抗生素对疾病的控制具有积极的作用，但是研究表明，在使用抗生素治疗阴道细菌感染患者12个月后有50%的复发率。标准的抗生素疗法忽视了已经失调的阴道环境，无法重建阴道酸性环境，同时，抗生素也不适用于孕妇和哺乳期妇女。这些副作用给抗生素治疗带来了新的挑战。

阴道微生态失衡的治疗包括抗菌、修复受损的阴道黏膜、恢复阴道微生态平衡三步。抗菌是使用敏感的抗菌药物来抑制或灭杀病原微生物，包括过度增殖的需氧菌、厌氧菌、芽生孢子、真菌或滴虫等。在病原微生物被抑制或灭杀后，重点转移到修复阴道黏膜和恢复优势乳杆菌的功能，这是治疗阴道炎症的最终目标。在这期间，如果阴道黏膜的修复、乳杆菌的恢复过程被影响、阴道内理化环境未恢复至正常，被抑制的病原微生物或者外来的病原微生物还会再度繁殖甚至致病而出现复发或新的阴道炎症。而益生菌在阴道内可以通过竞争黏附机制阻止致病微生物黏附于阴道上皮细胞，从而促使阴道恢复至正常微环境，减少阴道炎症的复发。因此，采用益生菌微生态制剂治疗VVC是以现在的技术手段看来，最为优选的一种方式。

卷曲乳酸杆菌可减轻白色念珠菌的毒力，调节细胞因子和趋化因子的分泌，并增强 VK2/E6E7 细胞在体外的免疫反应。然而，目前中国市场上还没有含有卷曲乳酸杆菌的市售阴道制剂。一种以德氏乳杆菌（Lactobacillus delbrueckii）为活性成分的阴道微生态药物是目前唯一的乳杆菌商业制剂。此外，还有一些口服益生菌，如科汉森开发的UREX®和ASTARTE®，已经被广泛应用在各种针对女性生殖道健康问题的口服产品中。由于肛门与阴道的解剖关系密切，因此便于肠道微生物（包括口服益生菌乳酸杆菌菌株（如酸奶饮料））迁移到阴道。乳酸菌从直肠被动转移到阴道可能是食品和膳食补充剂中输送益生菌的一个重要考虑因素。口服含有乳酸杆菌菌株的益生菌可提高阴道感染患者的康复率，改善其症状，并有改善阴道微生物模式的趋势。

卷曲乳杆菌是中国健康女性生殖道的优势菌种之一，已有一些公开的专利和文献报道其对女性生殖道健康的作用，例如中国专利CN117535208A公开了一种卷曲乳杆菌及其在女性生殖道健康中的应用，中国专利CN118853452A公开了一种改善女性阴道炎的卷曲乳杆菌BN13及其发酵制品和应用。不过，考虑到迄今为止，很少有研究评估VVC中乳酸菌菌株的抗念珠菌活性和益生菌特性以及同种属不同菌株的性能存在差异，因此，筛选益生能力更优的阴道乳杆菌是未被完全解决的需求。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术存在的缺陷，提出一种卷曲乳杆菌及应用，具有良好的安全性和益生特性，能够产生多种有机酸和过氧化氢，有效抑制致病菌的生长。

本发明通过以下技术方案解决技术问题：首先提供一种卷曲乳杆菌（Lactobacillus crispatus）Lcris-CD6，为自主分离获得，从健康育龄女性阴道分泌物中分离，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2025370的卷曲乳杆菌Lcris-CD6。

本发明进一步提供所述卷曲乳杆菌菌株的鉴定选取方法，包括通过外观特征鉴定、革兰氏染色、基因组鉴定以及代谢组对有机酸定量测定，得到产酸能力最高的卷曲乳杆菌菌株。

本发明的卷曲乳杆菌Lcris-CD6具有如下形态特征：

在MRS固体培养基中菌落边缘不规则，呈白色不透明，中央突起，表面相对光滑；

（2）呈现革兰氏阳性，杆状，无芽孢，常以单个，成对或短链状存在。

本发明的卷曲乳杆菌Lcris-CD6无毒力因子和耐药基因、不溶血，具有良好的安全性，产乳酸能力较强，能够降低女性阴道pH，并且可产抑菌物质过氧化氢，可有效抑制致病菌繁殖。

本发明进一步提供卷曲乳酸杆菌的基因组解析。

本发明再进一步提供卷曲乳杆菌菌株的培养方法，所述方法包括把卷曲乳杆菌接种到特定的培养基内增殖培养，最终获取到经过增殖的卷曲乳杆菌菌株。所述培养基为MRS培养基。

本发明的第六目的在于提供前述卷曲乳杆菌Lcris-CD6菌株在外阴阴道假丝酵母菌病（VVC）中的应用，特别是用于改善阴道微生态环境。所述产品作为抑菌剂或杀菌剂，用于抑制或杀灭致病菌。

本发明再进一步提供卷曲乳杆菌菌株在外阴阴道菌株病（VVC）中的应用，特别是用于改善阴道生态环境，包括降低阴道分泌物中致病菌的载量；降低促炎因子（如TNF-α、IL-1β）的表达水平；提高抑炎因子（IL-10）的表达水平；减少炎性细胞浸润；修复阴道粘膜完整性。

用于改善阴道微生态环境时，所述产品作为抑菌剂或杀菌剂，用于抑制或杀灭致病菌。

上述应用中所述抑制病原菌包括抑制大肠杆菌、阴道加德纳氏菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌中的一种或两种以上的生长。

通过借助对小鼠心、肝、脾、肺、肾、阴道及卵巢等完整组织的HE染色切片观察，证实前述卷曲乳杆菌Lcris-CD6具有良好的安全性和益生特性。卷曲乳杆菌改善小鼠阴道炎模型阴道微生物菌群相对丰度的作用。其安全性包括：对小鼠心、肝、脾、肺、肾、阴道及卵巢等组织无明显毒性作用；不溶血，无毒力因子，无耐药基因。本发明的卷曲乳杆菌Lcris-CD6具有良好的安全性和显著的益生特性，其核心功能物质包括其代谢产生的多种有机酸（如乳酸、琥珀酸、丙二酸等）以及过氧化氢（H₂O₂）。这些物质共同发挥以下关键作用：

1. 有机酸类物质：

Lcris-CD6能高效代谢产生乳酸、琥珀酸和丙二酸等有机酸，显著降低环境pH值，创造并维持女性生殖道的酸性环境，有效抑制多种致病菌（如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌等）的生长。

其中，乳酸含量高达189.79 μg/mL，琥珀酸为16.08 μg/mL，丙二酸为3.16 μg/mL（见表2），显示出极强的产酸能力和环境适应能力。

2. 过氧化氢（H₂O₂）：

该菌株能产生1.2 μmol/mL的过氧化氢，具有较强的氧化杀菌能力，可进一步抑制病原微生物的繁殖，增强其对阴道微生态的调节作用。

3. 协同作用：

有机酸与过氧化氢协同作用，不仅直接抑制病原菌，还能调节局部免疫反应，降低促炎因子（TNF-α、IL-1β）表达，提升抑炎因子（IL-10）水平，修复阴道黏膜结构，恢复微生物群落多样性。

综上所述，卷曲乳杆菌Lcris-CD6通过其核心功能物质——有机酸和过氧化氢，在维持阴道酸性环境、抑制病原菌、调节免疫和修复组织等方面表现出综合性的益生效果，为其在预防和治疗外阴阴道假丝酵母菌病（VVC）中的应用提供了坚实的物质基础。

本发明的卷曲乳杆菌Lcris-CD6无毒力因子和耐药基因、不溶血，具有良好的安全性，其有益效果是：能产多种有机酸并对酸性环境具有耐受性，可适应并维持女性生殖道的酸性环境；该菌可产一定量的过氧化氢，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌等具有有效的抑菌能力，能抑制致病菌的繁殖；可抑制白色念珠菌菌丝的形成，表明其很大程度上可改善阴道炎症；有免疫调节功能，能降低促炎因子TNF-α、IL-1β的表达水平，且对促炎因子TNF-α和IL-1β的降低效果优于克霉唑组；提高抑炎因子IL-10的表达水平，能较好的改善小鼠阴道炎；且治疗过程中对小鼠心、肝、脾、肺、肾以及卵巢等主要脏器不产生影响，具有良好的安全性，治疗发生部位在阴道感染处，可对白色念珠菌性阴道炎小鼠的局部组织起修复作用；调节小鼠白色念珠菌阴道炎感染后阴道微生物菌群相对丰度，恢复阴道微生物菌群环境。通过16S rRNA测序检测造模前、治疗前、治疗后的阴道微生物菌群相对丰度，所述卷曲乳杆菌Lcris-CD6能够增加乳酸杆菌属的相对丰度；降低变形菌门的相对丰度；增加厚壁菌门的相对丰度；提高阴道微生物群的多样性和丰富性。

附图说明

图1为卷曲乳杆菌Lcris-CD6菌株正面照片。

图2为卷曲乳杆菌Lcris-CD6菌株革兰氏染色照片。

图3为卷曲乳杆菌Lcris-CD6菌株的KEGG基因功能分析。

图4为卷曲乳杆菌Lcris-CD6菌株的基因组圈图分析。

图5为卷曲乳杆菌Lcris-CD6生长曲线和产酸能力图片。

图6为卷曲乳杆菌Lcris-CD6菌株的低pH生长耐受图片。

图7为卷曲乳杆菌Lcris-CD6溶血实验图片。

图8为小鼠阴道灌洗液中白色念珠菌及其菌丝的形成与变化图。

图9为小鼠心、肝、肺、肾卵巢组织HE染色（20X），以及脾脏组织HE染色（40X）。

图10为小鼠阴道组织HE染色（20X、40X）。

图11为治疗后炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-10的表达水平分析。

图12为门水平物种丰度图。

图13为卷曲乳杆菌Lcris-CD6和克霉唑治疗后Shannon指数和Chao1图。

图14 为卷曲乳杆菌Lcris-CD6和克霉唑治疗后门水平物种聚类热图。

图15为卷曲乳杆菌Lcris-CD6和克霉唑治疗后变形菌门和厚壁菌门丰度图。

图16 为卷曲乳杆菌Lcris-CD6和克霉唑治疗后乳酸杆菌属丰度图。

菌株保藏信息如下：菌株名称：Lcris-CD6；保藏号：CCTCC M 2025370；

分类命名：Lactobacillus crispatus；保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏单位地址：湖北省武汉市武汉大学；保藏日期：2025年03月04日。

具体实施方式

以下实施例中所用方法均为常规方法，所采用的原材料、试剂和设备等除特殊说明外均可以通过商业渠道购买获得，不再赘述。

卷曲乳杆菌Lcris-CD6，来源于健康育龄女性阴道分泌物，经外观特征、革兰氏染色和16Sr RNA鉴定为卷曲乳杆菌（Lactobacillus crispatus），再结合代谢组和基因组分析结果确定最终菌株的亚型。

实施例1

菌株的分离

用阴道拭子于健康育龄女性的阴道后1/3处一次性顺时针刮抹采集阴道分泌物样品；取出后立即放至10mL离心管中，并记录编号。向采样的离心管中分别加入5 mL MRS液体培养基及2mL液体石蜡，并将其斜插置于摇床48h，充分振荡混匀。用10μL接种环伸入液体石蜡液面下取少量液体涂布于添加碳酸钙的MRS固体培养基上，记录编号，置于厌氧培养箱中37℃培养，培养48h后，挑取含钙培养基上具有明显钙溶圈的菌落进行革兰氏染色、镜检。仔细观察并记录菌落形态及菌体形态，将符合条件的疑似菌初步确定为乳杆菌。然后将镜检后疑似乳杆菌剩下的菌落接种于液体培养基，继续划线于固体平板上直至确定为纯菌（划线培养至少3次）。根据MRS固体培养基上菌落形态，使用1μL接种环分别选取不同单个菌落重新划线接种至新的固体培养基并记录编号，继续在厌氧条件下37℃孵育48h。传代培养至菌株完全纯化。选取单个菌落接种于大的固体培养基，厌氧条件下，37℃孵育48h，以扩大培养细菌。准备一定数目的冻存管和2mL EP管，在冻存管中加入灭好菌的200μL甘油和800μL肉汤，在EP管中加入1mL灭好菌的PBS，并记录编号。将扩增的菌株用接种环少量刮取放入2mL EP管中，并搅散，置于-20℃保存；用同一根接种环刮取剩余的菌落放入冻存管中，并搅散，置于-80℃保存。

实施例2

菌株的鉴定

挑取纯化的单菌落放入液体培养基中培养24h制成菌悬液，一部分继续培养，一部分进行DNA提取、PCR扩增16S rRNA 基因，并送至上海生工生物工程有限公司对纯化的PCR产物进行测序，PCR结果经BLAST比对，最终确定为卷曲乳杆菌。

取卷曲乳杆菌Lcris-CD6菌株PCR验证后菌液划线至MRS固体培养基，37℃厌氧培养24- 48h，其菌落边缘规则，不透明，正面白色，中间凸起，表面光滑湿润，正面照片见图1。

采用涂片法，取少量菌落，用200μL无菌ddH₂O进行稀释，均匀涂于载玻片上，酒精灯微热固定，用革兰氏染色法进行染色，显微镜观察其形态，大小，排列方式及是否有芽孢等。卷曲乳杆菌为革兰氏阳性，杆状，无芽孢，常以单个，成对或短链状存在，见图2。

实施例3

菌株基因组测序

将卷曲乳杆菌Lcris-CD6菌株接种至5mL的厌氧配置（液体石蜡封存）的MRS肉汤中，培养至对数生长后期，提取菌株全基因组DNA，进行三代全基因组测序。组装及注释后，将蛋白序列输入KEGG数据库中进行基因功能分析、基因组圈图分析以及毒力基因库Virulence Factor Databases（VFDB）及The Comprehensive Antibiotic ResistanceDatabase（CARD）分别进行毒力因子和耐药基因分析进行毒力因子和耐药基因分析。结果如下，该菌不具有毒力因子和耐药基因，表1显示，该菌整个基因组长为2,331,794 bp，基因组中有2个contigs，GC含量占37.23%，N50值为2,323,339 bp。此外，KEGG数据库整合了基因组、化学分子和生化系统等方面的数据，其中核心的代谢通路数据库将生物代谢通路分为7个大类：细胞过程（cellular processes）、药物开发（drug development）、环境信息处理（environmental information processing）、遗传信息处理（genetic informationprocessing）、人类疾病（human diseases）、新陈代谢（metabolism）和有机体系统（organismal systems），见图3卷曲乳杆菌Lcris-CD6菌株的KEGG基因功能分析，图4为卷曲乳杆菌Lcris-CD6菌株的基因组圈图分析。分析表明卷曲乳杆菌Lcris-CD6基因功能注释主要集中在新陈代谢、环境信息处理以及遗传信息处理3个方面。新陈代谢通路共有679个得到注释的基因，其中与碳水化合物代谢相关的基因数量最多，有196个说明卷曲乳杆菌Lcris-CD6可能具有较强的糖类代谢能力。环境信息处理中共有188个得到注释的基因，与膜传输相关的基因最多，为113个，主要包括与各类跨膜运输蛋白如ABC转运蛋白、PTS转运蛋白相关的基因，推测卷曲乳杆菌Lcris-CD6可能对外界环境的适应能力较强，能够一定程度上抵抗环境变化的压力。遗传信息处理中共有223个得到注释的基因，与复制与修复相关的基因最多，为84个。

遗传信息处理中共有223个得到注释的基因，与复制与修复相关的基因最多，为84个。环境信息处理中共有188个得到注释的基因，与膜传输相关的基因最多，有113个，主要包括与各类跨膜运输蛋白如ABC转运蛋白、PTS转运蛋白相关的基因，推测该菌可能对外界环境的适应能力较强，能够一定程度上抵抗环境变化的压力。

表1卷曲乳杆菌Lcris-CD6 QUAST分析结果

实施例4

生长曲线及产酸能力测定

从上述已纯化菌株中选取已通过基因组测序确定为卷曲乳杆菌的菌种，接种于MRS培养基中，37℃厌氧培养48 h，从中挑取单菌落至MRS液体培养基中，并用液体石蜡封层，斜插放置于37℃摇床内过夜培养后，取适量菌悬液10000 r/min，离心10 min，弃上清。用灭过菌的PBS缓冲液对菌泥进行重悬，在酶标仪600 nm波长下标定至OD₆₀₀为1。按1% 的接种量接种至提前制备好并灭菌分装至10 mL离心管MRS肉汤培养基中，用灭完菌的液体石蜡隔绝氧气，37℃静置厌氧培养，此后每间隔2h测量一次菌液OD₆₀₀浓度，每次吸取菌液前都需要用涡轮仪混匀并等待静置分层，以防发酵液沉底，同时以未接菌的MRS肉汤培养基作为空白对照，连续测定24 h，记录数据，绘制生长曲线。与此同时，每隔2 h用手持PH计测量其pH变化，每次样本和空白对照都测量三次计算其平均值，用于构建产酸曲线。

结果显示，卷曲乳杆菌Lcris-CD6在0-10 h 时为迟缓期，10-22 h 时对数生长期，22 h时为达到稳定期；刚接种卷曲乳杆菌Lcris-CD6时，MRS培养液的pH是5.7，2h时培养液的pH明显下降，在4-16 h期间pH迅速下降，在16-22 h趋于平稳，至24 h时，pH为4.08，这说明卷曲乳杆菌Lcris-CD6产酸性能良好，见图5。

实施例5

低pH生长耐受实验

将卷曲乳杆菌在pH值5.7的MRS肉汤活化，37℃过夜培养；取适量菌悬液10000 r/min，离心10 min，弃上清。用灭过菌的PBS缓冲液对菌泥进行重悬，在酶标仪600 nm波长下标定至OD₆₀₀为1。按1% 的接种量接种至提前制备好并灭菌分装至10 mL离心管pH值4.5的MRS肉汤培养基中，用灭完菌的液体石蜡隔绝氧气，37℃静置厌氧培养，此后每间隔2h测量一次菌液OD₆₀₀浓度，每次吸取菌液前都需要用涡轮仪混匀并等待静置分层，以防发酵液沉底，同时以未接菌的pH值4.5的MRS肉汤培养基作为空白对照，连续测定24 h，记录数据，绘制第pH生长耐受曲线。

结果显示，卷曲乳杆菌Lcris-CD6能在低pH环境（pH值4.5）下生长，至24 h时，培养液的pH值为4.08。因此，该菌种具有耐酸产酸的特性，见图6。

实施例6

产有机酸能力测定

将卷曲乳杆菌Lcris-CD6的甘油菌液复苏，接种于MRS固体培养基上，置厌氧箱中，37℃孵育48 h。用接种环挑取单个菌落至装有40 mL灭菌完成的MRS肉汤培养基中，并用液体石蜡封层，置于37℃摇床8 h。收集培养上清于离心管中，400-1000g离心10 min去除细胞，取上清2000g高速离心去除细胞碎片和沉淀，再取其上清液送至苏州帕米诺生物医药有限公司进行有机酸靶向检测分析。

结果显示，卷曲乳杆菌Lcris-CD6具有产乳酸、琥珀酸和丙二酸等多种有机酸的特性，见表2。

表2 卷曲乳杆菌Lcris-CD6产有机酸能力

实施例7

药敏实验

采用纸片琼脂扩散法对卷曲乳杆菌Lcris-CD6进行药物敏感性测定，以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌作为对照质控菌株。将3株菌株活化培养后，用移液枪吸取少量菌液放入装有适量PBS缓冲液的比浊管中混匀，使用麦氏比浊仪将菌液调至0.5。用无菌棉签沾取适量卷曲乳杆菌Lcris-CD6菌液均匀涂布至MRS固体培养基上，用无菌棉签沾取适量大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌液均匀涂布至MH培养基上。待平板上的水分被琼脂完全吸收后，使用无菌镊子夹取药敏片（氨苄西林、青霉素G、链霉素、庆大霉素、红霉素、四环素、氯霉素、环丙沙星）均匀分散地贴在培养基表面。每个平板贴3个，注意预留出抑菌圈位置。随后将卷曲乳杆菌Lcris-CD6进行37℃厌氧培养24 h，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌置于37℃培养24 h，用直尺测量抑菌圈直径。

结果如表3显示，卷曲乳杆菌Lcris-CD6对四环素、氯霉素、红霉素、青霉素和氨苄西林5种抗生素敏感；对环丙沙星、链霉素和庆大霉素3种抗生素耐药。

表3抗生素对卷曲乳杆菌Lcris-CD6的抑制能力

实施例8

抑菌实验

采用打孔法测定分离益生菌对病原菌的抑菌能力。复苏卷曲乳杆菌Lcris-CD6、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌，将其接种于液体培养基中，置于摇床，37℃过夜培养。吸取适量卷曲乳杆菌菌液将其放入离心机中，使其在6000 rpm条件下离心5 min，留取菌液上清液；在LB平板上分别涂布10μL金黄色葡萄球菌、大肠杆菌。

吸取卷曲乳杆菌培养上清液200μL加入打好的孔中（每组做三个重复，MRS培养基为空白对照）。37℃恒温过夜培养，观察各平板上抑菌圈大小，并测量记录抑菌圈直径。结果显示，卷曲乳杆菌Lcris-CD6对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌具有抑菌作用，表4 卷曲乳杆菌Lcris-CD6抑菌圈直径大小平均值。

表4卷曲乳杆菌Lcris-CD6抑菌试验抑菌圈直径大小平均值

微量孔板测定分离益生菌对病原菌的抑菌率。96孔板每孔加入190μL卷曲乳杆菌Lcris-CD6培养上清液以及10μL指示菌悬液（10⁶ CFU/mL金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌的菌悬液），用MRS液体培养基代替卷曲乳杆菌Lcris-CD6培养上清液作为对照（每组做3个重复）。在37℃（大肠杆菌、金黄色葡萄球菌）和28°C（白色念珠菌）培养48 h后于酶标仪580nm处测定其吸光度。乳杆菌的抑菌活性以其对指示细菌和真菌的抑菌率，按照公式（1）计算。

抑菌率(%)=(1-OD_A)/ODcontrol×100 (1)

式中: OD_A为样品组的吸光度，ODcontrol为对照组的吸光度。结果显示，卷曲乳杆菌Lcris-CD6对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌均具有一定的抑菌能力，见表5 卷曲乳杆菌Lcris-CD6抑菌率。

表5卷曲乳杆菌Lcris-CD6抑菌率

实施例9

产过氧化氢能力测定

采用过氧化氢（H₂O₂）含量检测试剂盒进行测定，具体步骤如下：将卷曲乳杆菌Lcris-CD6接种于MRS液体培养基中，斜插放置于37℃摇床内培养48h后，10000 r/min，离心10 min，弃上清；按照每500万细菌加入1mL丙酮，超声破碎后，8000g 4℃离心10min，取上清，置于冰上待测；将试剂盒准备的试剂二（临用前加入3mL浓盐酸充分溶解备用）、三和四25℃水浴10min以上；标准品浓度为2μmol/mL；按试剂盒在不同EP管中分别加入样本（250μL）、标准品（250μL）、丙酮（250μL）以及试剂二（25μL）、三（50μL），4000g，常温离心10min，弃上清，流沉淀；再加入试剂四（250μL），充分震荡溶解沉淀后，室温静置5min，取200μL加入96孔板中测定415nm处吸光度，计算H₂O₂含量，该试剂盒最低检出限：0.0027μmol/mL，线性范围：0.0195-3μmol/mL。结果显示，卷曲乳杆菌Lcris-CD6在该试剂盒下产生1.2μmol/mL的H₂O₂，有较强的产H₂O₂能力。

实施例10

溶血实验

细菌的溶血试验，能够用来判断细菌是否具备致病性。为了评估卷曲乳杆菌Lcris-CD6的溶血活性，挑取其单菌落划线到哥伦比亚血平板（青岛海博生物技术有限公司）上，并设置三个平行组，于37℃下厌氧培养48 h后对细菌形态进行观察。同时，以空白培养基作为阴性对照，以粪肠球菌（β溶血，ATCC29212，购自宁波明舟生物科技有限公司）作为阳性对照。根据以下规则判断细菌溶血性：如果在菌落周围可观察到1-2 mm的草绿色半透明溶血环，则该菌株被鉴定为α溶血，有致病性；如果在菌落周围观察到2-4mm透明的溶血环，则该菌株被鉴定为β溶血，有极强致病性；如果未观察到变化，则该菌株被鉴定为γ溶血，即不溶血，无致病性。结果显示，卷曲乳杆菌Lcris-CD6菌落周围未观察到变化，为γ溶血，即不溶血，无致病性，见图7。

实施例11

卷曲乳杆菌Lcris-CD6对小鼠外阴阴道菌株病（VVC）的缓解作用

该实施例采用白色念珠菌感染的小鼠阴道炎模型。

1．实验动物：32只雌性ICR小鼠（SPF级，鼠龄6～8周，饲养在温度25℃，湿度60%，光照/黑暗12h周期交替的环境中，可以自由饮水和获取食物），体重为20-22g。

2. 实验方法：

（1）分组：将32只小鼠随机分成4组，每组8只，A健康空白组，B未治疗组为模型组，C卷曲乳杆菌治疗组、D药物治疗组（克霉唑）为对照组。实验开始前，小鼠放置于饲养环境适应一周。

（2）造模：将适应一周的小鼠，除健康空白组外，其他组别的小鼠用苯甲酸雌二醇(2 mg/mL)，进行皮下注射（2天/次，6天），每次注射0.05 mL。在苯甲酸雌二醇注射3次后，取阴道拭子，第7天给予B组、C组、D组20μL（10⁶ CFU/mL）白色念珠菌悬液接种于小鼠阴道内，连续接种4天，并将接种后的小鼠头部朝下倒挂3-5 min，接种后，每天观察小鼠外阴及分泌物情况（接种后每天肉眼观察阴道黏膜有无发生充血、水肿、出血、糜烂、分泌物增多等炎症变化）。接种后第5天，吸取无菌生理盐水100μL冲洗两到三次获得阴道灌洗液，并对其进行革兰氏染色法、平板涂布（接种在沙氏葡萄糖琼脂培养基上，28℃培养72h后，进行菌落观察，计数等）及取阴道拭子进行16S rRNA测序来检测造模是否成功。结果显示革兰氏染色检测出大量的白色念珠菌菌丝体，平板涂布也能观察到大量的白色念珠菌，即造模成功，见图8。

（3）造模成功后，A健康空白组不予处理，B模型组给予等量生理盐水，治疗组C组给予20 μL（10⁸ CFU/mL）的卷曲乳杆菌Lcris-CD6菌悬液治疗，药物对照组D组给予药物克霉唑（100 mg/mL）治疗，治疗途径为阴道灌注，持续治疗6天，接种后每天肉眼观察阴道黏膜有无发生充血、水肿、出血、糜烂、分泌物增多等炎症变化。治疗最后一天用100μL生理盐水灌洗小鼠阴道，灌洗液置于洁净无菌管中，取其进行镜检和涂布，观察是否有白色念珠菌存在，将剩余阴道灌洗液放置4℃保存备用，并取阴道拭子，然后颈椎脱臼处死小鼠，将小鼠阴道、心、肝、脾、肺、肾和卵巢等组织完整取下，置于多聚甲醛中保存。

3. 治疗前后阴道炎相关指标检测：

（1）阴道灌洗液白色念珠菌菌丝体形成及白色念珠菌涂布：在造模成功后和治疗6天后用移液枪取100μL生理盐水反复冲洗小鼠阴道，取灌洗液进行革兰氏染色以及涂布于沙氏固体培养基，在28℃培养72 h，观察治疗前后白色念珠菌菌丝形成情况以及在平板上的计数情况。结果显示，治疗前，除健康空白组外，其余接受白色念珠菌定殖感染后的组阴道灌洗液革兰氏染色以及平板涂布结果显示检测均有大量的菌丝以及白色念珠菌定殖，表明白色念珠菌感染的小鼠外阴阴道假丝酵母菌病（VVC）模型造模成功。在治疗6天后，模型组阴道灌洗液镜检和涂布结果仍持续有大量菌丝和白色念珠菌，表明其感染程度并未有明显变化，而在卷曲乳杆菌Lcris-CD6和克霉唑治疗组其菌丝量和白色念珠菌均呈现明显降低，见图8。

（2）小鼠外阴及分泌物情况评估和小鼠组织炎症情况评估：在治疗过程中，每天肉眼观察小鼠阴道黏膜有无发生充血、水肿、糜烂、分泌物增多等，并进行对比分析，阴道症状评分标准如下：正常、外阴部无异常，无分泌物或仅有少量透明分泌物（０分），红而不肿或肿而不红或分泌物增多（１分），红伴肿大、红伴分泌物增多或肿分泌物增多（２分），红肿伴分泌物增多、红肿伴糜烂、红肿分泌物增多伴糜烂（３分）。结果显示，卷曲乳杆菌Lcris-CD6治疗6天后，模型组小鼠阴道口充血、水肿，分泌物增多；卷曲乳杆菌Lcris-CD6治疗组、克霉唑组显著降低阴道口充血、水肿症状，且减少其阴道内分泌物分泌量，见表6。

表6卷曲乳杆菌Lcris-CD6治疗阴道症状评分表

（3）小鼠局部组织病理学检查：在治疗6天后，通过颈椎脱臼法对小鼠进行安乐死，随后取其阴道、心、肝、脾、肺、肾和卵巢等完整组织置于多聚甲醛中保存。待组织固定完成后，依次进行脱水、包埋、切片等步骤制备病理切片，再进行HE染色处理，最后在显微镜下观察各组织的病理变化情况。

HE染色：①包埋：4%多聚甲醛固定的组织样本，经流水冲洗后，进行组织修块，放入病理包埋塑料筐中进行梯度酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡和包埋。②切片：采用LeicaRM2235切片机将组织切成5 µm厚的薄片，在温水中展片，并固定于载玻片上。③染色：切片脱蜡至水，苏木精-伊红染色，梯度酒精脱水后经二甲苯透明，中性树脂胶封片。④核对样品编号后，用肉眼观察切片外观，盖玻片是否位置适宜，后在显微镜下进行质检，观察组织切片的完整性及着色性。

结果显示，所有治疗组连续阴道治疗6天后，包括心、肝、脾、肺、肾和卵巢等主要器官均未受到影响，见图9。具体表现为：

心：心肌纤维呈短圆柱状排列整齐，结构完整，纵切部分的心肌纤维有明显的横纹。各组心肌组织均未见明显的病理变化，呈现正常的组织学特征。

肝：以中央静脉为中心，肝细胞呈放射状排列，细胞核大而圆，细胞质丰富呈嗜酸性染色。门管区的小叶间动脉、小叶间静脉和小叶间胆管结构清晰。肝细胞呈“羽状”外观与糖原含量有关，导致每个组的肝组织切片空腔大小存在差异，是正常现象。各组肝脏均未见明显的病理变化，呈现正常组织学特征。

脾：白髓和红髓的分界明显。白髓中的淋巴小结和动脉周围淋巴鞘结构完整，细胞密集。红髓中的脾索和脾血窦结构清晰，脾索内含有丰富的巨噬细胞和淋巴细胞，脾血窦内红细胞丰富。各组脾脏均呈现正常的组织学形态。

肺：肺泡结构完整，各级支气管、肺房和肺泡壁的形态结构清晰，气道内含气量适中，各组肺脏均未见明显的病理变化。

肾：小鼠肾组织结构完整，肾小球呈圆形或椭圆形结构，位于肾皮质内，大小均匀，毛细血管袢分布清晰，系膜区无明显增宽。肾小管上皮细胞排列整齐，刷状缘清晰可见，管腔通畅，间质结构正常。各级肾脏均呈现正常的组织学形态。

卵巢：卵巢组织形态结构正常，初级卵泡、次级卵泡等各级卵泡及黄体可被清楚识别，卵泡颗粒细胞分层清晰，卵泡生长活跃、发育良好。各组卵巢均未见明显的病理变化。

同时，通过观察阴道组织病理切片发现，健康空白组阴道黏膜上皮光滑，未见充血水肿，无炎性细胞浸润，无坏死组织脱落。与空白组小鼠相比，对照组小鼠黏膜层鳞状上皮细胞增生，小区域见少量上皮细胞变性、坏死并脱落，散在有小脓肿形成，黏膜下层有较多以中性粒细胞为主的炎症细胞浸润。卷曲治疗组阴道黏膜上皮层厚度接近健康组，上皮细胞排列整齐，表层小脓肿数量减少、范围缩小，黏膜下层炎症细胞浸润显著减轻或消失，达到与克霉唑组相似的治疗效果，见图10。

（4）炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-10测定：在小鼠治疗6天后，取小鼠阴道灌洗液，严格按照ELISA试剂盒的操作说明书进行操作，检测各组小鼠阴道灌洗液中细胞炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-10的差异。结果显示，在治疗6天后，模型组与健康空白组相比促炎因子TNF-α的水平上升，IL-1β的水平显著上升（P<0.05），在卷曲乳杆菌Lcris-CD6和克霉唑治疗后与模型组相比TNF-α和IL-1β的表达均有不同程度的降低，甚至卷曲乳杆菌Lcris-CD6组对促炎因子TNF-α和IL-1β的降低效果优于克霉唑组。卷曲乳杆菌Lcris-CD6组和克霉唑组的抑炎因子IL-10的表达与模型组相比均有不同程度的升高。综上所述，卷曲乳杆菌Lcris-CD具有较好的改善患有VVC的小鼠阴道炎症的作用，见图11。

（5）通过16S rRNA测序来检测用该卷曲乳杆菌Lcris-CD6治疗小鼠阴道炎模型后阴道微生物菌群相对丰度的影响。阴道拭子样本分析显示，白色念珠菌感染后的小鼠菌群失调，见图12。治疗后，与健康空白组相比，模型组小鼠阴道菌群chao指数(P<0.001)、Shannon指数（P<0.01）减少，同时厚壁菌门（Firmicutes）减少，变形菌门（Protebacteria）增加，乳杆菌属（Lactobacillus）减少；与模型组相比，卷曲乳杆菌Lcris-CD6组小鼠阴道菌群chao指数（P<0.01）、Shannon指数（P<0.01）升高，克霉唑组小鼠阴道菌群chao指数、Shannon指数升高，同时，卷曲乳杆菌Lcris-CD6组和克霉唑组小鼠厚壁菌门（Firmicutes）增加，变形菌门（Protebacteria）减少，乳杆菌属（Lactobacillus）增加，显著改善了念珠菌阴道炎小鼠的微生物多样性。此外，卷曲乳杆菌Lcris-CD6组和克霉唑组的阴道菌群相对丰度和多样性与健康空白组结果相似，见图12-16。综上，卷曲乳杆菌Lcris-CD6组可以增加阴道微生物组的丰富性和多样性，尤其是乳杆菌属，从而有效治疗念珠菌性阴道炎。

除上述实施外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。

Claims (5)

1.一种卷曲乳杆菌，其特征在于：所述卷曲乳杆菌Lcris-CD6保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2025370。

2.根据权利要求1所述卷曲乳杆菌在制备用于外阴阴道假丝酵母菌病VVC的药物中的应用，其特征在于：所述应用包括制备用于改善阴道微生态环境的药物。

3.根据权利要求2所述卷曲乳杆菌在制备用于外阴阴道假丝酵母菌病VVC的药物中的应用，其特征在于：所述改善阴道微生态环境包括降低阴道分泌物中致病菌的载量；降低促炎因子的表达水平；提高抑炎因子IL-10的表达水平；减少炎性细胞浸润；修复阴道粘膜完整性。

4.根据权利要求2所述卷曲乳杆菌在制备用于外阴阴道假丝酵母菌病VVC的药物中的应用，其特征在于：所述改善阴道微生态环境还包括抑制病原菌的生长与繁殖，所述病原菌包括大肠杆菌、阴道加德纳菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌中的至少一种。

5.根据权利要求2所述卷曲乳杆菌在制备用于外阴阴道假丝酵母菌病VVC的药物中的应用，其特征在于：所述卷曲乳杆菌（Lactobacillus crispatus）Lcris-CD6产生多种有机酸，所述有机酸包括乳酸、琥珀酸和丙二酸，以及抑菌物质过氧化氢。