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CN120732814A - 一种脂质纳米颗粒及其应用 - Google Patents

一种脂质纳米颗粒及其应用

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CN120732814A
CN120732814A CN202510659726.4A CN202510659726A CN120732814A CN 120732814 A CN120732814 A CN 120732814A CN 202510659726 A CN202510659726 A CN 202510659726A CN 120732814 A CN120732814 A CN 120732814A
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CN
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lipid
targeting
car
tumor
drug
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CN202510659726.4A
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李素萍
聂广军
李梦尧
陆泽方
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Original Assignee
National Center for Nanosccience and Technology China
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Abstract

本发明涉及一种脂质纳米颗粒及其应用。所述脂质纳米颗粒包括：阳离子脂质、阴离子脂质DOPS（1,2‑二油酰基‑sn‑甘油‑3‑磷脂酰‑L‑丝氨酸）、其他脂质和靶向抗体。本发明经过研究发现，掺杂阴离子脂质DOPS并间接偶联靶向抗体可以显著提高纳米颗粒对脾脏T细胞的转染效率。本发明进一步将编码靶向肿瘤血管内皮细胞和肿瘤细胞的CAR蛋白的核酸装载在上述脂质纳米颗粒中并用于肿瘤治疗，结果上述治疗显著促进了免疫细胞的瘤内浸润，显著抑制多种实体瘤进展，为CAR‑T疗法在实体瘤中的有效应用提供了新思路、新手段。

Description

一种脂质纳米颗粒及其应用
技术领域
本发明属于CAR-T细胞疗法，本发明涉及利用脂质纳米颗粒在体高效编辑脾脏CAR-T细胞，靶向实体瘤血管和肿瘤细胞的联合治疗新技术。
背景技术
CAR-T 细胞疗法已成为抗肿瘤免疫治疗的重要领域。目前，CAR-T疗法已经在血液癌症治疗和自身免疫性疾病治疗中取得乐观结果，包括白血病、淋巴瘤，多发性骨髓瘤和红斑狼疮等，且已有六种CAR-T疗法获得FDA准许用于B细胞来源的血液系统肿瘤。然而，CAR-T细胞疗法在实体瘤中始终未能取得良好进展，肿瘤异质性和T细胞难以浸润至实体瘤间质是其疗效不佳的主要原因，因此，市场上尚无对实体瘤有效的CAR-T疗法。肿瘤血管对于维持肿瘤生长和转移至关重要，靶向杀伤肿瘤血管能够阻断肿瘤获取营养物质及代谢物的排出，抑制肿瘤进展，同时促进免疫细胞浸润。此外，相较于肿瘤细胞，肿瘤血管内皮细胞的抗原表达更加稳定，不易产生免疫突变。因此，联合靶向肿瘤血管和肿瘤细胞的CAR-T疗法，可以通过打破血管结构/屏障，增加靶向肿瘤细胞的CAR-T瘤内浸润，从而为改善CAR-T 疗法在实体瘤中的有效应用提供新思路、新手段。
目前CAR-T细胞疗法是一种个性化疗法，包括患者T细胞的收集、基因修饰和扩增，清除患者体内淋巴细胞以及输注CAR-T细胞回患者体内，这种个性化及多步骤的特点致使其价格昂贵、制备时间长、工艺复杂，副作用大，难以大规模推广。因此，发展体内原位编辑CAR-T技术有望弥补传统CAR-T疗法的不足，在发挥高效抗肿瘤作用的同时，降低生产成本，缩短制备时间，免除传统CAR-T治疗所需的清淋等步骤进而提高CAR-T治疗的安全性。目前，已有多个不同递送系统被用于体内递送CAR基因，相较载药率有限、免疫原性和细胞毒性高的病毒载体而言，脂质纳米颗粒(lipid nanoparticle, 脂质纳米颗粒)具有易于配制、稳定性高、细胞摄取高效、内体逃逸等优点, 是最具临床应用价值的非病毒基因递送载体之一，特别是其被成功应用于递送mRNA新冠疫苗和CRISPR-Cas9系统，在临床试验中实现了有效的基因编辑、理想的治疗效果和安全性。
然而, 脂质纳米颗粒在肝脏中的积累严重限制了mRNA-脂质纳米颗粒技术在肝脏以外的靶向与治疗；仅通过在临床批准的四组分脂质纳米颗粒表面修饰靶向抗体用于体内编辑产生CAR-T细胞，其转染效率普遍不高，进而导致其疗效有限。因此，发展脾脏特异性靶向脂质纳米颗粒，改进抗体偶联方式进而提高体内T细胞的编辑效率十分必要。
发明内容
本发明提供一种脂质纳米颗粒及其应用，用以解决现有技术中体内编辑CAR-T靶向性不足，转染效率低的缺陷，实现mRNA的脾脏靶向递送和高效转染，并进一步提供了一种靶向治疗药物用于治疗实体瘤。
第一方面，本发明提供一种脂质纳米颗粒，包括：阳离子脂质、阴离子脂质，其他脂质，Linker和靶向T细胞的抗体；
所述阴离子脂质为DOPS；所述阳离子脂质为MC3。
本发明通过研究和实验对比发现，在MC3-LNP中掺杂DOPS（1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰-L-丝氨酸）能够提高体内外T细胞转染效率。在脂质纳米颗粒中掺杂DOPS能够实现脂质纳米颗粒脾脏靶向特性，使mRNA在脾脏特异性表达。通过在脂质纳米颗粒表面采用间接偶联靶向T细胞表面抗原的抗体的方法，可以进一步提高其在脾脏T细胞中的转染效率。
优选地，上述脂质纳米颗粒中所述其他脂质包括：胆固醇、磷脂、PEG脂质和反应性PEG脂质中的一种或多种；
所述阴离子脂质占总脂质浓度的10%~20%，优选为10%。
优选地，上述脂质纳米颗粒中所述阳离子脂质MC3和所述其他脂质的摩尔比为1~2:1~2，优选为1:1；
所述脂质纳米颗粒中的阳离子脂质、胆固醇、磷脂、PEG脂质和反应性PEG脂质比例为45~55:36~40:9~12:1.3~1.7:0.4~0.6，优选为50:38:10:1.5:0.5。
优选地，上述脂质纳米颗粒中所述Linker为anti-rat IgG2α antibody，所述Linker与反应性PEG脂质的摩尔比为1:4~6.5；
所述靶向抗体为CD3或CD5抗体，如anti-mouse CD5 antibody，所述靶向抗体与Linker的质量比为1:1。
本发明中的反应性PEG脂质的末端可以和linker发生偶联反应，并进一步连接靶向抗体，这种连接方式可以避免靶向抗体上的结合位点被占用，导致靶向效果降低。
上述Linker、反应性PEG脂质、靶向抗体的比例可以达到最优的抗体连接效果，保证靶向抗体连接量的前提下保留其抗体结合位点。
在四元组分MC3-LNP中掺杂DOPS能够实现脂质纳米颗粒脾脏靶向特性，使mRNA在脾脏特异性表达。此外，通过在脂质纳米颗粒表面采用间接偶联抗体的方法，可以显著提高其在体内T细胞中的转染效率。通过静脉注射包载靶向肿瘤血管内皮细胞（VEGFR2）和肿瘤细胞的CAR基因的脂质纳米颗粒，在体内能够生成能够特异性杀伤肿瘤血管内皮细胞或肿瘤细胞的CAR-T细胞，从而显著抑制肿瘤的进展。
第二方面，本发明提供上述的脂质纳米颗粒在制备药物递送载体或在制备药物中的应用，所述药物为基因治疗药物。
第三方面，本发明提供药物递送载体，所述药物递送载体含有上述的脂质纳米颗粒。
第四方面，本发明提供一种体内编辑CAR-T的靶向药物，所述靶向药物包含：
上述的脂质纳米颗粒；或上述的药物递送载体；
用于编码CAR蛋白的核酸，所述核酸装载于脂质纳米颗粒中。
优选地，上述靶向药物中所述CAR蛋白包括靶向血管内皮细胞与靶向肿瘤的蛋白；
所述靶向肿瘤血管内皮细胞的蛋白包括VEGFR2、TAM1、CLEC14A等，优选为VEGFR2；
所述靶向肿瘤的蛋白包括TRP1、CLDN18.2、HER2、GPC3、MSLN中的一种或多种；
所述VEGFR2与靶向肿瘤蛋白的比值为3~5:1，优选为4:1。
通过静脉注射包载靶向肿瘤血管内皮细胞VEGFR2和肿瘤细胞的CAR基因的脂质纳米颗粒，在体内能够生成能够特异性杀伤肿瘤血管内皮细胞或肿瘤细胞的CAR-T细胞，从而显著抑制肿瘤的进展。
优选地，上述靶向药物中编码靶向所述VEGFR2的CAR分子的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示，编码靶向所述TRP1的CAR分子的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码靶向所述CLDN18.2的CAR分子的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
优选地，上述靶向药物中所述用于编码靶向CAR蛋白的核酸为mRNA或CRISPR-Cas系统，优选为mRNA；
所述脂质纳米颗粒和所述mRNA质量比为4:1。
第五方面，本发明提供上述的脂质纳米颗粒和/或上述的药物递送载体和/或上述的靶向药物在制备治疗肿瘤药物中的应用，优选为制备实体肿瘤治疗药物中的应用。
本发明研究发现通过在MC3-脂质纳米颗粒中掺杂DOPS阴离子脂质,并在其表面通过anti-rat IgGα antibody作为linker间接偶联anti-mouse CD5 antibody靶向抗体，可以使脂质纳米颗粒富集在脾脏并在体内高效转染T细胞，产生具有特异性杀伤功能的CAR-T细胞。此外，联合靶向肿瘤血管内皮细胞和肿瘤细胞的CAR-T治疗策略能够有效抑制肿瘤血管新生，促进细胞毒性T细胞瘤内浸润进而增强抗肿瘤疗效。
本发明提供的纳米载体能够高效转染体内T细胞，产生能够特异性杀伤靶细胞的CAR-T细胞；本发明提供的治疗策略能够有效抑制肿瘤生长，提高存活率，在CAR-T细胞疗法治疗实体瘤领域具有重要价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明提供的体内编辑的CAR-T肿瘤靶向药物制备流程示意图。
图2是本发明提供的实施例1、对比例1、对比例2制备的纳米颗粒对小鼠各器官靶向性的测试结果，其中从左到右依次为心、肝、脾、肺、肾。
图3是本发明提供的实施例2制备得到的体内编辑的CAR-T肿瘤靶向药物的冷冻电镜形态图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本发明提供一种用于体内脾脏靶向递送mRNA的纳米颗粒，通过如下方法制备得到：
（1）首先制备含有脂质成分的有机相：将MC3、胆固醇、DSPC、DMG-PEG2000和DOPS按照45:34.2:9:1.8:10的摩尔比例混合到有机相中，所有成分总摩尔浓度之和为2.57mM；其中，DOPS需用四氢呋喃先溶解后再与其他脂质混合。
（2）随后将Luciferase mRNA溶解于柠檬酸钠缓冲液中（10mM,pH=4）,其浓度为0.025mg/mL，将水相和有机相按照速度比3：1通过微流控芯片，获得包载Luciferase mRNA的脂质纳米颗粒纳米颗粒。随后4000g离心40min，并用PBS洗两次，去掉多余的无水乙醇，得到包载特定mRNA的脂质纳米颗粒。
实施例2
本实施例进一步提供一种体内转染T细胞的纳米颗粒及体内编辑的CAR-T肿瘤靶向药物。
靶向VEGFR2的CAR分子的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，靶向TRP1的CAR分子的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，通过体外转录方法得到mRNA，方法如下：
目的序列被克隆到pVAX1载体中；随后，使用BspQⅠ对超螺旋质粒进行线性化，以线性化质粒作为模板，使用T7高产率RNA共转录试剂盒进行体外转录反应，以合成含有约109个腺苷酸残基的poly A尾的目的mRNA序列；随后使用N1-甲基假尿嘧啶三磷酸（N1-Me-pUTP）进行核苷修饰，以及帽类似物GAG进行加帽；最后利用氯化锂沉淀法对mRNA进行纯化。
其流程示意图如图1所示，通过如下方法制备得到：
（1）首先制备含有脂质成分的有机相：将MC3、胆固醇、DSPC、DMG-PEG2000、DSPE-PEG-Mal和DOPS按照45:34.2:9:1.35:0.45:10的摩尔比例混合到有机相中，所有成分总摩尔浓度之和为10.3mM;其中，DOPS需用四氢呋喃先溶解后再与其他脂质混合。
（2）随后将编码目标序列的mRNA溶解于柠檬酸钠缓冲液中（10mM,pH=4）,其浓度为0.1mg/mL，将水相和有机相按照速度比3：1通过微流控芯片，获得包载目标序列的脂质纳米颗粒纳米颗粒，如图1所示。随后4000g离心40min，并用PBS洗两次，去掉多余的无水乙醇，得到包载特定mRNA的脂质纳米颗粒。
（3）将anti-rat IgGαantibody与Traut’s Reagent按照摩尔比1：20混合，在室温下反应1小时；通过Zeba脱盐柱去除未反应的Traut’s Reagent；随后将活化好的anti-ratIgGαantibody与脂质纳米颗粒混合，4°孵育2小时；随后加入anti-mouse CD5 antibody,4°孵育0.5小时；通过4ml 10KD的超滤管进行浓缩，获得纳米颗粒。
（4）将所得包载靶向肿瘤血管内皮细胞mRNA（VEGFR2 CAR mRNA）的脂质纳米颗粒和包载靶向肿瘤细胞mRNA（TRP1 CAR mRNA）的脂质纳米颗粒按照mRNA质量比4:1混合，获得体内编辑的CAR-T肿瘤靶向药物。
实施例3
靶向VEGFR2的CAR分子的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，靶向CLDN18.2的CAR分子的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，通过体外转录方法得到mRNA，方法如下：
目的序列被克隆到pVAX1载体中；随后，使用BspQⅠ对超螺旋质粒进行线性化，以线性化质粒作为模板，使用T7高产率RNA共转录试剂盒进行体外转录反应，以合成含有约109个腺苷酸残基的poly A尾的目的mRNA序列；随后使用N1-甲基假尿嘧啶三磷酸（N1-Me-pUTP）进行核苷修饰，以及帽类似物GAG进行加帽；最后利用氯化锂沉淀法对mRNA进行纯化。
本实施例进一步提供一种体内转染T细胞的纳米颗粒及体内编辑的CAR-T肿瘤靶向药物，其流程示意图如图1所示，通过如下方法制备得到：
（1）首先制备含有脂质成分的有机相：将MC3、胆固醇、DSPC、DMG-PEG2000、DSPE-PEG-Mal和DOPS按照45:34.2:9:1.35:0.45:10的摩尔比例混合到有机相中，所有成分总摩尔浓度之和为10.3mM;其中，DOPS需用四氢呋喃先溶解后再与其他脂质混合。
（2）随后将编码目标序列的mRNA溶解于柠檬酸钠缓冲液中（10mM,pH=4）,其浓度为0.1mg/mL，将水相和有机相按照速度比3：1通过微流控芯片，获得包载目标序列的脂质纳米颗粒纳米颗粒，如图1所示。随后4000g离心40min，并用PBS洗两次，去掉多余的无水乙醇，得到包载特定mRNA的脂质纳米颗粒。
（3）将anti-rat IgGαantibody与Traut’s Reagent按照摩尔比1：20混合，在室温下反应1小时；通过Zeba脱盐柱去除未反应的Traut’s Reagent；随后将活化好的anti-ratIgGαantibody与脂质纳米颗粒混合，4°孵育2小时；随后加入anti-mouse CD5 antibody,4°孵育0.5小时；通过4ml 10KD的超滤管进行浓缩，获得纳米颗粒。
（4）将所得包载靶向肿瘤血管内皮细胞mRNA（VEGFR2 CAR mRNA）的脂质纳米颗粒和包载靶向肿瘤细胞mRNA（CLDN18.2 CAR mRNA）的脂质纳米颗粒按照mRNA质量比4:1混合，获得体内编辑的CAR-T肿瘤靶向药物。
实施例3与实施例2的区别在于，使用的CAR蛋白组合为VEGFR2 与CLDN18.2。
对比例1
本发明提供一种用于体内递送mRNA的纳米颗粒，所述纳米颗粒与实施例1相同，区别在于MC3、胆固醇、DSPC、DMG-PEG2000、DSPE-PEG-Mal和DOPS的摩尔比例为50：38：10：2：0。
对比例2
本发明提供一种用于体内脾脏靶向递送mRNA的纳米颗粒，所述纳米颗粒与实施例1相同，区别在于MC3、胆固醇、DSPC、DMG-PEG2000、DSPE-PEG-Mal和DOPS的摩尔比例为40:30.4:8:1.6:20。
对比例3
本发明提供一种用于体内脾脏靶向递送mRNA的纳米颗粒，所述纳米颗粒与实施例1相同，区别在于将DOPS更换为DOPG。
对比例4
本发明提供一种用于体内脾脏靶向递送mRNA的纳米颗粒，所述纳米颗粒与实施例1相同，区别在于将DOPS更换为DOPA。
对比例5
本发明对比例提供一种靶向递送CAR基因的纳米颗粒，所述纳米颗粒与实施例2相同，区别在于不修饰靶向抗体在纳米颗粒表面。
对比例6
本发明对比例提供一种靶向递送CAR基因的纳米颗粒，所述纳米颗粒与实施例2相同，区别在于不修饰linker，直接将靶向抗体anti-mouse CD5 antibody修饰在纳米颗粒表面。
对比例7
本发明对比例提供一种靶向递送CAR基因的纳米颗粒，所述纳米颗粒与对比例5相同，区别在于MC3、胆固醇、DSPC、DMG-PEG2000、DSPE-PEG-Mal和DOPS的摩尔比例为50：38：10：2：0
对比例8
本发明提供一种用于体内靶向递送CAR基因的纳米颗粒，所述纳米颗粒与实施例2相同，区别是仅含有包载靶向肿瘤血管内皮细胞mRNA（VEGFR2 CAR mRNA）的脂质纳米颗粒。
对比例9
本发明提供一种用于体内靶向递送CAR基因的纳米颗粒，所述纳米颗粒与实施例2相同，区别是仅含有包载靶向肿瘤细胞mRNA（TRP1 CAR mRNA或CLDN18.2 CAR mRNA）的脂质纳米颗粒。
实验例1
本实验测试了实施例1制备得到的体内靶向递送mRNA纳米颗粒的脾脏靶向性，得到的测试结果如图2所示。具体包括以下步骤：
（1）尾静脉注射实施例1 和对比例1-2所制备的纳米颗粒，每只小鼠注射含8μgmRNA的LNP。
（2）6小时后，每只小鼠腹腔注射D-luciferin (150mg/kg)，15分钟后，解剖小鼠，取主要脏器（心、肝、脾、肺、肾），通过小动物光学3D活体成像系统测定荧光素酶活性。
统计肝脏和脾脏的荧光分布，得到的结果如表1示，对脾脏进行荧光定量分析，得到的结果如表2所示。
从图2及表1可以看出，掺杂了DOPS的LNP使得mRNA的表达从肝脏转移到脾脏，实现了脾脏特异性表达。从表2可以看出，当DOPS以摩尔比10%掺杂时（实施例1），脾脏荧光强度显著提高，表明其脾脏递送效率的提高。
实验例2
本实验比较了不同阴离子脂质（DOPS、DOPG及DOPA）对T细胞的体外转染效率，得到的测试结果如表3所示。具体包括以下步骤：
（1）将Jurkat 细胞按1×105/ml的浓度铺在96孔板中，每孔100 μl，培养过夜。
（2）将实施例1，对比例3及对比例4分别加入96孔板中（每孔200 ng），与Jurkat细胞共孵育24小时。
（3）使用Bright-Glo™ 萤光素酶报告基因检测系统检测细胞中荧光素酶表达情况。
由表3可知，相比于其他阴离子脂质DOPG和DOPA，添加了DOPS的脂质体对T细胞具有更强的转染能力。
实验例3
本实验例测试了实施例2制备得到的体内编辑的CAR-T肿瘤靶向药物的形态、粒径、分散系数（PDI）和mRNA包封率，其中形态通过冷冻电镜拍摄，粒径和粒径分散系数通过动态光散射测定，mRNA包封率通过RiboGreen试剂盒测定，得到的测试结果如表4所示，冷冻电镜形态如图3所示。
从表4及图3中可以看出，采用本发明制备方法得到的体内编辑的CAR-T肿瘤靶向药物粒径均一，呈完整球形结构，分散性优越，mRNA包载效率较高。
实验例4
本发明测定实施例1在体内对脾脏CD3+、CD4+、CD8+T细胞的转染效率，其中转染效率通过流式细胞仪测定，得到的测试结果如表5所示。具体包括以下步骤：
（1）取15只小鼠，分为5组，每组3只；
（2）分别尾静脉注射PBS、实施例2和对比例5-7所制备的纳米颗粒（20μg mRNA/只）；
（3）24小时后，处死小鼠，取小鼠脾脏经研磨、裂红后制成细胞悬液。取一定量细胞悬液，离心后用流式抗体重悬（1：100稀释），避光孵育20分钟。
（4）用PBS洗两次之后，用500μl PBS重悬，上机检测。
从表5可知，DOPS-LNP（对比例6）对脾脏T细胞的转染效率高于MC3-LNP（对比例7），说明DOPS的掺杂能够提高T细胞转染效率；同时，实施例2相较于对比例5-6的转染效率进一步提高，可见采用本发明制备方法得到的体内编辑的CAR-T肿瘤靶向药物对于T细胞具有最高的转染效率。
实验例5
本发明使用载荷B16F10黑色素瘤小鼠对实施例1中得到的体内编辑的CAR-T肿瘤靶向药物的疗效进行评价，具体包括以下步骤：
（1）取24只荷B16F10黑色素瘤小鼠，分为4组，每组6只；
（2）尾静脉注射实施例2和对比例8-9制备得到的纳米颗粒，注射方式如下：
空白组注射150微升生理盐水，其余三组注射150微升上述实施例1、对比例1-2中的体内编辑的CAR-T肿瘤靶向药物，其中实施例2的mRNA含量是25μg（VEGFR2 CAR mRNA 20μg；TRP1 CAR mRNA 5μg）, 对比例8的mRNA含量是20μg（VEGFR2 CAR mRNA）, 对比例9的mRNA含量是5μg（TRP1 CAR mRNA）。在肿瘤接种后的第5、7、9、11、13、15、17分别测定小鼠的肿瘤体积，记录平均体积，肿瘤体积的测定方法为长乘以宽的平方除以2，小鼠肿瘤体积大于2000mm3后判定死亡；同时观察小鼠的体重和生存期的变化，存活率为记录小鼠存活率50%以及0%的天数；其中肿瘤体积（mm3）测试结果如表6所示，存活率（d）测试结果如表6所示。
由表6可知，与空白组和单靶向肿瘤血管或肿瘤细胞组（对比例8-9）相比，采用本发明实施例2提供的体内编辑的CAR-T肿瘤靶向药物能够显著提高疗效，有效抑制小鼠肿瘤生长。
由表7可知，与空白组和对比例8-9相比，采用本发明实施例2提供的体内编辑的CAR-T肿瘤靶向药物能够显著增加小鼠的存活时间。
实验例6
本发明使用载荷CT26-mCLDN18.2结肠癌小鼠对实施例3中得到的体内编辑的CAR-T肿瘤靶向药物的疗效进行评价，步骤同实验例5，在肿瘤接种后的第9-25天，每两天测定小鼠的肿瘤体积，记录平均体积，其中肿瘤体积（mm3）测试结果如表8所示，存活率（d）测试结果如表8所示。
从表8和表9可知，采用本发明提供的体内编辑的CAR-T肿瘤靶向药物和治疗方案在两种肿瘤模型中都能够显著抑制肿瘤生长并提高小鼠生存期，证明了本发明的有效性和普适性。
实验例7
本发明使用载荷CT26-mCLDN18.2结肠癌小鼠评价实施例3中制备得到的体内编辑的CAR-T肿瘤靶向药物促进免疫细胞浸润肿瘤的能力，具体包括以下步骤：
（1）取24只荷CT26-mCLDN18.2结肠癌小鼠，分为4组，每组6只；
（2）尾静脉注射实施例3和对比例8-9制备得到的纳米颗粒，注射方式如下：
分别在接种肿瘤后第9、13、17天通过尾静脉注射150微升实施例3、对比例8和对比例9所得的体内编辑的CAR-T肿瘤靶向药物，空白组注射等量的生理盐水。在第18天时，牺牲小鼠取小鼠肿瘤进行后续分析，分别标记CD45，CD3，CD8等对肿瘤浸润T细胞进行统计分析。
具体取等质量的肿瘤组织后进行研磨提取肿瘤细胞，对抗体染色后进行流式细胞仪的测定，得到的结果如表10所示。
由表10可知，与空白组和只注射包载编码靶向肿瘤细胞mRNA的脂质纳米颗粒组（对比例9）相比，加入包载编码靶向肿瘤血管内皮细胞mRNA的脂质纳米颗粒（实施例3和对比例88）可以显著提高瘤内浸润细胞毒性T细胞的数量，说明靶向肿瘤血管能够有效促进免疫细胞浸润，联合靶向肿瘤血管和肿瘤细胞能够协同杀伤肿瘤细胞，增强抗肿瘤疗效。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种脂质纳米颗粒，其特征在于，包括：阳离子脂质、阴离子脂质，其他脂质，Linker和靶向T细胞的抗体；
所述阴离子脂质为DOPS；所述阳离子脂质为MC3。
2.根据权利要求1所述的脂质纳米颗粒，其特征在于，所述其他脂质包括：胆固醇、磷脂、PEG脂质和反应性PEG脂质中的一种或多种；
所述阴离子脂质占总脂质浓度的10%~20%，优选为10%。
3.根据权利要求1或2所述的脂质纳米颗粒，其特征在于， 所述阳离子脂质MC3和所述其他脂质的摩尔比为1~2:1~2，优选为1:1；
所述脂质纳 米颗粒中的阳离子脂质、胆固醇、磷脂、PEG脂质和反应性PEG脂质比例为45~55:36~40:9~12:1.3~1.7:0.4~0.6，优选为50:38:10:1.5:0.5。
4.根据权利要求1-3任一项所述的脂质纳米颗粒，其特征在于，所述Linker为anti-ratIgG2α antibody，所述Linker与反应性PEG脂质的摩尔比为1:4~6.5；
所述靶向抗体为CD3或CD5抗体，所述靶向抗体与Linker的质量比为1:1。
5.权利要求1-4任一项所述的脂质纳米颗粒在制备药物递送载体或在制备药物中的应用，所述药物为基因治疗药物。
6.药物递送载体，其特征在于，所述药物递送载体含有权利要求1-4任一项所述的脂质纳米颗粒。
7.一种体内编辑CAR-T的靶向药物，其特征在于，所述靶向药物包含：
权利要求1-4任一项所述的脂质纳米颗粒；或权利要求5所述的药物递送载体；
用于编码CAR蛋白的核酸，所述核酸装载于脂质纳米颗粒中。
8.根据权利要求7所述的靶向药物，其特征在于，所述CAR蛋白包括靶向肿瘤血管内皮细胞的蛋白与靶向的肿瘤蛋白；
所述靶向肿瘤血管内皮细胞的蛋白包括VEGFR2、TAM1、CLEC14A，优选为VEGFR2；
所述靶向肿瘤的蛋白包括TRP1、CLDN18.2、HER2、GPC3、MSLN中的一种或多种；
所述VEGFR2与靶向肿瘤蛋白的比值为3~5:1，优选为4:1；
编码靶向所述VEGFR2的CAR分子的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码靶向所述TRP1的CAR分子的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码靶向所述CLDN18.2的CAR分子的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
9.根据权利要求6-8任一项所述的靶向药物，其特征在于，所述用于编码靶向CAR蛋白的核酸为mRNA或CRISPR-Cas系统，优选为mRNA；
所述脂质纳米颗粒和所述mRNA质量比为4:1。
10.权利要求1-4所述的脂质纳米颗粒和/或权利要求5所述的药物递送载体和/或权利要求6-9所述的靶向药物在制备治疗肿瘤药物中的应用，优选为制备实体肿瘤治疗药物中的应用。
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