CN120738164A - 一种苍白杆菌核糖磷酸异构酶b突变体及其在利用木糖制备稀有糖中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种核糖‑5‑磷酸异构酶B突变体及其在制备稀有糖中的应用，属于生物工程技术领域。本发明提供了具备较高活力和稳定性的苍白杆菌核糖‑5‑磷酸异构酶B突变体，其编码基因、含有该基因序列的重组表达载体和重组表达转化体，突变体酶制剂的制备方法，以及利用该突变体转化生物质来源的D‑木糖的实际应用。本发明可通过单酶或多酶级联反应将D‑木糖等低附加值生物质单糖转化为D‑木酮糖、D‑核酮糖等高价值的稀有糖化合物，扩展了底物和产物范围，具有广泛的应用前景。

Description

一种苍白杆菌核糖磷酸异构酶B突变体及其在利用木糖制备 稀有糖中的应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，尤其是涉及利用核糖-5-磷酸异构酶B制备稀有糖化合物，其编码核酸，含有该核酸序列的重组表达载体和重组表达转化体，突变体酶制剂的制备方法，以及该突变体酶制剂在转化生物质来源的D-木糖为高附加值稀有糖中的应用。

背景技术

稀有糖是自然界中含量较低的单糖及其衍生物的总称。稀有糖可以用于制备手性化合物作为药物分子的前体，也是良好的代糖，可以作为食品添加剂应用于食品领域。本发明中的目的产物为D-木酮糖及D-核酮糖，可以用于制备寡糖、抗生素和抗肿瘤药物分子（Curr. Org. Chem., 2015, 20:1-1）。目前制备稀有糖的方法主要为发酵及酶转化法。通过氧化还原酶及异构酶等多酶偶联反应可以完成所有稀有糖的制备，被称为Izumoring方法（J. Biotechnol., 2006, 124(4):717-722）。但是，现有制备稀有糖的单步酶法起始底物通常也为稀有糖，因此反应的经济性欠佳，难以大规模应用。因此，已有较多研究通过多酶级联反应将起始底物延申至葡萄糖等非稀有糖（Appl. Microbiol. Biotechnol.,2015, 99(16):6571-84）。

众所周知，生物质是目前工业化生产中主要的糖来源之一，然而其中含量巨大的D-木糖却难以通过酶法用于制备稀有糖。原因在于常见的D-木糖异构酶（D-xyloseisomerase）底物范围广泛，对D-葡萄糖等常见的生物质来源糖类都有较高的活性。核糖-5-磷酸异构酶（Ribose-5-phosphate isomerase）是生物体内磷酸戊糖途径中的关键代谢酶，分布广泛且具有独特的底物范围（Appl. Microbiol. Biotechnol., 2021, 105(2):509-523）。发明人发现来自苍白杆菌（Ochrobactrum sp.）CSL1的核糖-5-磷酸异构酶B对生物质来源的D-木糖有微弱的活性，具有转化D-木糖制备稀有糖的潜力（J. Microbiol.Biotechnol., 2018, 28(7):1122–1132）。但是，该酶对D-木糖活性较低，温度稳定性不高，因此其在催化反应时酶用量较高，转化率较低，阻碍了其进一步产业化应用。

发明内容

鉴于现有技术存在的不足，本发明以苍白杆菌中发现的核糖-5-磷酸异构酶B的氨基酸序列为出发序列，通过定点突变、饱和突变和组合突变，获得了多个能够高效转化廉价生物质来源D-木糖的突变体。该系列突变体对D-木糖的活力由显著提升，有助于其在利用D-木糖制备稀有糖中的应用。

本发明的第一个目的是提供一种核糖-5-磷酸异构酶B突变体，是由序列表SEQ IDNo.1所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸取代后衍生的氨基酸序列。

优选地，所述核糖-5-磷酸异构酶B突变体，是序列表SEQ ID No.1所示的氨基酸序列第94位精氨酸替换为天冬酰胺，第137位天冬酰胺替换为谷氨酰胺。

上述突变体可以通过丙氨酸扫描等方法进行定点突变，通过定点饱和突变等方法随机突变，以及对有利突变进行组合地方式实现。结合高通量初筛和进一步摇瓶培养复筛，鉴别获得多个对D-木糖活性显著提升的核糖-5-磷酸异构酶B突变体。

本发明的第二个目的是提供一种分离的核酸，所述的核酸编码所述苍白杆菌核糖-5-磷酸异构酶B或任意一个核糖-5-磷酸异构酶B突变体。

进一步地，编码所述核糖-5-磷酸异构酶B突变体的核酸的核苷酸序列如SEQ IDNo.3所示。

本发明的第三个目的是提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包含本发明第二个目的所述的核酸。

在本发明的一个实施方式中，所述的重组表达载体为含有核糖-5-磷酸异构酶B基因的pET-28a。

本发明的第四个目的是提供一种重组表达转化体，所述的重组表达转化体包含所述重组表达载体。

在本发明的一个实施方式中，所述重组表达转化体，是含有所述重组表达载体，且表达核糖-5-磷酸异构酶B的大肠杆菌。

在本发明的一个实施方式中，所述的大肠杆菌为E.coli BL21(DE3)。

本发明的第五个目的是提供一种重组核糖-5-磷酸异构酶B催化剂，所述重组核糖-5-磷酸异构酶B催化剂是以下形式中的任意一种：

培养本发明所述重组表达转化体，分离含有所述核糖-5-磷酸异构酶B突变体的转化体细胞；

培养本发明所述重组表达转化体，分离含有所述核糖-5-磷酸异构酶B突变体的粗酶液，以及干燥得到的粗酶粉；

培养本发明所述重组表达转化体，分离含有所述核糖-5-磷酸异构酶B突变体的纯酶液，以及干燥得到的纯酶粉；

培养本发明所述重组表达转化体，分离含有所述核糖-5-磷酸异构酶B突变体并进行固定化所获得的固定化酶；

本发明的第六个目的是提供所述重组核糖-5-磷酸异构酶B催化剂的应用。具体而言，所述重组核糖-5-磷酸异构酶B催化剂在催化D-木糖制备D-木酮糖及D-核酮糖中的应用。

在本发明的一个实施方式中，所述核糖-5-磷酸异构酶B催化剂催化D-木糖底物异构化为D-木酮糖。

在本发明的一个实施方式中，所述核糖-5-磷酸异构酶B催化剂催化D-木糖底物异构化为D-木酮糖，并在塔格糖-3-差向异构酶的催化下进一步转化为D-核酮糖。

与现有技术相比，本发明的有益技术效果主要体现在以下方面：本发明提供了一种核糖-5-磷酸异构酶B，编码所述核糖-5-磷酸异构酶B突变体的核酸，含有该核酸的重组表达载体，含有该重组表达载体的重组表达转化体，重组核糖-5-磷酸异构酶B突变体催化剂，以及重组核糖-5-磷酸异构酶B突变体催化剂在由D-木糖制备稀有糖化合物中的应用。通过对野生型核糖-5-磷酸异构酶的定向改造，获得了对D-木糖具有较高活性，并且温度稳定性具有显著提高的突变体，该突变体及其与塔格糖-3-差向异构酶等联用可以将生物质来源的D-木糖转化为D-木酮糖和D-核酮糖等高附加值稀有糖分子。

附图说明

图1为本发明中核糖-5-磷酸异构酶B突变体通过单酶反应及级联反应催化D-木糖制备D-木酮糖和D-核酮糖等稀有糖化合物的反应过程示意图。

图2为本发明中野生型的核糖-5-磷酸异构酶B、突变体Y42W、R94N、N137Q、R94N/N137Q催化D-木糖的HPLC分析结果。

图3为本发明中R94N/N137Q核糖-5-磷酸异构酶B突变体和塔格糖-3-差向异构酶一锅法制备D-木酮糖和D-核酮糖的HPLC分析结果。

具体实施方式

为使本发明的上诉目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明

此处所称的“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方案中的特定特征、结构或特性。

为了描述本发明的方便，使用各种氨基酸残基的常规和非常规缩写。这些缩写是本领域技术人员熟悉的，但是为了清楚在下面列出：

Arg=R=精氨酸；Asn=N=天冬氨酸；Gln=Q=谷氨酰胺；

Glu=E=谷氨酸；Gly=G=甘氨酸；His=H=组氨酸；

Ile=I=异亮氨酸；Lys=K=赖氨酸；Leu=L=亮氨酸；

Phe=F=苯丙氨酸；Pro=P=脯氨酸；Ser=S=丝氨酸；

Trp=W=色氨酸；Tyr=Y=酪氨酸；Val=V=缬氨酸。

本发明所述的突变体命名，按照本领域技术人员常规命名方式，；例如：突变体Y42W表示核糖-5-磷酸异构酶B其氨基酸第42位的酪氨酸（Y）经过定点突变为色氨酸（W）。

本发明中，苍白杆菌（Ochrobactrum sp CSL1）来源的核糖-5-磷酸异构酶B（D-ribose-5-phosphate isomerase B，OsRpiB）由459个基因编码，将基因序列优化，将其编码基因插入到表达载体pET-28a得到重组表达载体pET-28a-OsRpiB。以质粒pET-28a-OsRpiB为模板，分别对核糖-5-磷酸异构酶B的活性区域位点进行饱和定点突变，以及进行两个以上的OsRpiB活性区域的组合位点突变，本研究将野生型OsRpiB重组表达载体pET-28a-OsRpiB作为空白对照。

上述重组表达转化体的培养方法包括如下步骤：培养本发明的重组表达转化体，获得重组核糖-5-磷酸异构酶B突变体。对于重组大肠杆菌，优选培养基为LB培养基。优选的培养方法为：将如上所述构建的重组大肠杆菌，接种至含有卡那霉素（50 µg/mlKanamycin）的LB培养基中，37℃、200 rpm振荡培养过夜。按1-2%(v/v)的接种量接入装有100 mL LB培养基(含卡那霉素)的500 mL三角烧瓶中，置于37℃、200 rpm摇床振荡培养，当培养液的OD600达到0.6-0.8时，加入终浓度为0.1-0.5 mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)作为诱导剂，16-30℃诱导16~24 h后，将培养液离心，收集沉淀，弃上清，然后用50mM磷酸缓冲液（pH 8.0）洗涤两次，获得重组表达转化体细胞。将收获的重组细胞进行冷冻干燥，即可获得含有所述核糖-5-磷酸异构酶B或其突变体的冻干细胞。将收获的重组细胞悬浮于5~10倍体积(v/w)的缓冲液中，超声破碎，离心收集上清液，即可获得所述重组核糖-5-磷酸异构酶B或其突变体的粗酶液；然后将粗酶液经50%碧云天His-tag PurificationResin纯化，超滤管超滤浓缩脱盐获得纯酶液，收集的纯酶液置于-80℃下冷冻，然后使用真空冷冻干燥机低温干燥，即可得到纯酶粉。将所获得的纯酶粉保存在4℃冰箱内，可以方便地使用。

本发明中野生型核糖-5-磷酸异构酶B的重组质粒和重组大肠杆菌为本课题组先前的工作，并且以EcoRI，HindIII为双酶切位点。

实施例1：

本发明将野生型OsRpiB重组表达质粒Pet-28a-OsRpiB作为空白对照。所述饱和突变的位点分别选取：第8、9、42、94、99或137位氨基酸位点，初步活性筛选后，选择催化活性最优的94&137氨基酸组合位点突变。

分别挑取含有重组质粒D8A、D8E、S9A、Y42A、Y42W、R94A、R94E、R94I、R94S、R94F、R94K、R94L、R94P、R94V、R94Y、R94H、R94N、R94G、N137A、N137K、N137E、N137Y、N137L、N137Q、R94N/N137K、R94N/N137L、R94N/N137Q的单克隆接种到5 ml LB液体培养基（50 µg/mlKanamycin），37℃、200 rpm，过夜活化。吸取1m培养基到100 ml LB液体培养基（50 µg/mlKanamycin），置于37℃、200 rpm摇床振荡培养，当培养液的OD600达到0.6-0.8时，加入终浓度为0.1 mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）作为诱导剂，18℃诱导24 h后，离心（8000g，10 min，4℃），收集沉淀，弃上清，然后用50 mM磷酸缓冲液,（pH 8.0）洗涤两次，获得重组表达转化体细胞。将收获的重组细胞进行冷冻干燥，即可获得含有所述核糖-5-磷酸异构酶B或其突变体的冻干细胞。将收获的重组细胞悬浮于5~10倍体积(v/w)的缓冲液中，超声破碎，离心（10000 g, 25 min，4℃）收集上清液，即可获得所述重组核糖-5-磷酸异构酶B或其突变体的粗酶液；然后将粗酶液经50%碧云天His-tag Purification Resin纯化，超滤管超滤浓缩脱盐获得纯酶液，收集的纯酶液置于-80℃下冷冻，然后使用真空冷冻干燥机低温干燥，即可得到纯酶粉。将所获得的纯酶粉保存在4℃冰箱内，可以方便地使用。

进行定点突变OsRpiB重组表达质粒所涉及的引物如下：

突变体D8A上游引物：5'-agcagtagcaggcgctagcgccggcgaaggtctg-3'

突变体D8A下游引物：5'-tagcgcctgctactgctactttcatcatgaat-3'

突变体D8E上游引物：5'-agcagtagcaggcgaaagcgccggcgaaggtctg-3'

突变体D8E下游引物：5'-tttcgcctgctactgctactttcatcatgaat-3'

突变体S9A上游引物：5'-agtagcaggcgacgctgccggcgaaggtctggcc-3'

突变体S9A下游引物：5'-cagcgtcgcctgctactgctactttcatcatg-3'

突变体Y42A上游引物：5'-tgcattcgctgccaatctttccgaccgcgtgg-3'

突变体Y42A下游引物：5'-gattggcagcgaatgcatccgcgccagcgtcc-3'

突变体Y42W上游引物：5'-tgcattctgggccaatctttccgaccgcgtgg-3'

突变体Y42W下游引物：5'-gattggcccagaatgcatccgcgccagcgtcc-3'

突变体R94A上游引物：5'-tattcggcagaggctcagcgctttccaacaatgc-3'

突变体R94A下游引物：5'-tgagcctctgccgaataggtgtcgtgcgtgag-3'

突变体R94N上游引物：5'-gcagagaatcagcgctttccaacaatgcccag-3'

突变体R94N下游引物：5'-aagcgctgattctctgccgaataggtgtcgtg-3'

突变体N137Q上游引物：5'-ccaagtcaacgcgatcaacgaagttgacgcga-3'

突变体N137Q下游引物：5'-tgatcgcgttgacttggccagccgaacggccgtt-3'

实施例2：

将含有苍白杆菌核糖-5-磷酸异构酶B（表达自序列SEQ ID No.1，目的蛋白浓度为1 mg/mL）的酶液与50 mM的磷酸缓冲液（pH 7.5）混合后加入生物质来源的D-木糖（纯度为40%，终浓度为20 mM），于50℃下分别反应1小时和4小时后，加热煮沸样品5 min终止反应，利用HPLC检测D-木糖和D-木酮糖的含量，计算D-木糖的转化率分别为8%和17%。

实施例3：

将含有R94N/N137Q OsRpiB突变体（表达自序列SEQ ID No.3，目的蛋白浓度为1mg/mL）的酶液与50 mM的磷酸缓冲液（pH 7.5）混合后加入生物质来源的D-木糖（纯度为40%，终浓度为20 mM），于55℃下分别反应1小时和4小时后，加热煮沸样品5 min终止反应，利用HPLC检测D-木糖和D-木酮糖的含量，计算D-木糖的转化率分别为13%和22%。

实施例4：

将含有R94N/N137Q OsRpiB突变体（表达自序列SEQ ID No.3，蛋白终浓度为1 mg/mL）的酶液及含有来自菊苣假单胞菌的塔格糖-3-差向异构酶（表达自序列GenBank:BAA24429.1，蛋白终浓度为1 mg/mL）的酶液与50 mM的磷酸缓冲液（pH 8.0）混合后加入生物质来源的D-木糖（纯度为40%，终浓度为20 mM）和氯化锰（1 mM），于55℃下反应4小时后，加热煮沸样品5 min终止反应，利用HPLC检测D-木糖、D-木酮糖和D-核酮糖的含量，计算D-木糖和D-核酮糖的转化率分别为44%和27%。

实施例5：

高效液相色谱法：将反应样品在100℃下水浴灭活5 min，离心（15000 r/min，10min），然后通过0.22 μm膜过滤。上清液上样至配备Sugar-PakTM色谱柱（6.5×300 mm，Waters）和示差折光检测器的Agilent 1120 HPLC，洗脱条件为：柱温85℃，流速0.3 mL/min，超纯水洗脱。

序列表

SEQ ID No.1

Met Lys Val Ala Val Ala Gly Asp Ser Ala Gly Glu Gly Leu Ala Lys Val

1 5 10 15

Leu Ala Asp His Leu Lys Asp Arg

20 25

Phe Glu Val Ser Glu Ile Ser Arg Thr Asp Ala Gly Ala Asp Thr Phe Tyr

30 35 40

Ala Asn Leu Ser Asp Arg Val Ala

45 50

Ser Ala Val Leu Asp Gly Thr Tyr Asp Arg Ala Ile Leu Val Cys Gly Thr

55 60 65

Gly Ile Gly Val Cys Ile Ala Ala Asn

70 75

Lys Val Pro Gly Ile Arg Ala Ala Leu Thr His Asp Thr Tyr Ser Ala Glu

80 85 90

Arg Ala Ala Leu Ser Asn Asn Ala

95 100

Gln Ile Ile Thr Met Gly Ala Arg Val Ile Gly Ser Glu Val Ala Lys Thr

105 110 115

Ile Ala Asp Ala Phe Leu Ala Glu Thr

120 125

Phe Asp Glu Asn Gly Arg Ser Ala Gly Asn Val Asn Ala Ile Asn Glu Val

130 135 140

Asp Ala Lys Tyr Asn Lys Gly

145 150

SEQ ID No.2

atgaaagtggcggtggcgggcgatagcgcgggcgaaggcctggcgaaagtgctggcggatcatctgaaagatcgctttgaagtgagcgaaattagccgcaccgatgcgggcgcggataccttttatgcgaacctgagcgatcgcgtggcgagcgcggtgctggatggcacctatgatcgcgcgattctggtgtgcggcaccggcattggcgtgtgcattgcggcgaacaaagtgccgggcattcgcgcggcgctgacccatgatacctatagcgcggaacgcgcggcgctgagcaacaacgcgcagattattaccatgggcgcgcgcgtgattggcagcgaagtggcgaaaaccattgcggatgcgtttctggcggaaacctttgatgaaaacggccgcagcgcgggcaacgtgaacgcgattaacgaagtggatgcgaaatataacaaaggc

SEQ ID No.3

Met Lys Val Ala Val Ala Gly Asp Ser Ala Gly Glu Gly Leu Ala Lys Val

1 5 10 15

Leu Ala Asp His Leu Lys Asp Arg

20 25

Phe Glu Val Ser Glu Ile Ser Arg Thr Asp Ala Gly Ala Asp Thr Phe Tyr

30 35 40

Ala Asn Leu Ser Asp Arg Val Ala

45 50

Ser Ala Val Leu Asp Gly Thr Tyr Asp Arg Ala Ile Leu Val Cys Gly Thr

55 60 65

Gly Ile Gly Val Cys Ile Ala Ala Asn

70 75

Lys Val Pro Gly Ile Arg Ala Ala Leu Thr His Asp Thr Tyr Ser Ala Glu

80 85 90

Asn Ala Ala Leu Ser Asn Asn Ala

95 100

Gln Ile Ile Thr Met Gly Ala Arg Val Ile Gly Ser Glu Val Ala Lys Thr

105 110 115

Ile Ala Asp Ala Phe Leu Ala Glu Thr

120 125

Phe Asp Glu Asn Gly Arg Ser Ala Gly Gln Val Asn Ala Ile Asn Glu Val

130 135 140

Asp Ala Lys Tyr Asn Lys Gly

145 150

SEQ ID No.4

atgaaagtggcggtggcgggcgatagcgcgggcgaaggcctggcgaaagtgctggcggatcatctgaaagatcgctttgaagtgagcgaaattagccgcaccgatgcgggcgcggataccttttatgcgaacctgagcgatcgcgtggcgagcgcggtgctggatggcacctatgatcgcgcgattctggtgtgcggcaccggcattggcgtgtgcattgcggcgaacaaagtgccgggcattcgcgcggcgctgacccatgatacctatagcgcggaaaacgcggcgctgagcaacaacgcgcagattattaccatgggcgcgcgcgtgattggcagcgaagtggcgaaaaccattgcggatgcgtttctggcggaaacctttgatgaaaacggccgcagcgcgggccaggtgaacgcgattaacgaagtggatgcgaaatataacaaaggc

Claims (10)

1.一种核糖-5-磷酸异构酶B的突变体，其特征是将如SEQ ID No.1所示氨基酸序列蛋白质的第42位酪氨酸、第94位精氨酸和第137位天冬酰胺中的一个或多个氨基酸残基替换为其他氨基酸残基所形成的新氨基酸序列的衍生蛋白质。

2.根据权利要求1所述的定点突变的核糖-5-磷酸异构酶B，其特征在于：所述核糖-5-磷酸异构酶B突变体是如下序列中的一种：

(1)将如序列表中SEQ ID No.1所示氨基酸序列的第8位天冬氨酸替换为丙氨酸；

(2)将如序列表中SEQ ID No.1所示氨基酸序列的第8位天冬氨酸替换为甲硫氨酸；

(3)将如序列表中SEQ ID No.1所示氨基酸序列的第9位丝氨酸替换为丙氨酸；

(4)将如序列表中SEQ ID No.1所示氨基酸序列的第42位酪氨酸替换为丙氨酸；

(5)将如序列表中SEQ ID No.1所示氨基酸序列的第42位酪氨酸替换为色氨酸；

(6)将如序列表中SEQ ID No.1所示氨基酸序列的第94位精氨酸替换为丙氨酸；

(7)将如序列表中SEQ ID No.1所示氨基酸序列的第94位精氨酸替换为赖氨酸；

(8)将如序列表中SEQ ID No.1所示氨基酸序列的第94位精氨酸替换为缬氨酸；

(9)将如序列表中SEQ ID No.1所示氨基酸序列的第94位精氨酸替换为组氨酸；

(10)将如序列表中SEQ ID No.1所示氨基酸序列的第94位精氨酸替换为天冬酰胺；

(11)将如序列表中SEQ ID No.1所示氨基酸序列的第94位精氨酸替换为甘氨酸；

(12)将如序列表中SEQ ID No.1所示氨基酸序列的第137位天冬酰胺替换为赖氨酸；

(13)将如序列表中SEQ ID No.1所示氨基酸序列的第94位精氨酸替换为天冬酰胺，第137位天冬酰胺替换为赖氨酸；

(14)将如序列表中SEQ ID No.1所示氨基酸序列的第94位精氨酸替换为天冬酰胺，第137位天冬酰胺替换为谷氨酰胺；

(15)将如序列表中SEQ ID No.1所示氨基酸序列的第94位精氨酸替换为天冬酰胺，第137位天冬酰胺替换为亮氨酸。

3.根据权利要求1或2所述核糖-5-磷酸异构酶突变体，其特征在于，所述核糖-5-磷酸异构酶B突变体能够以生物质来源的D-木糖为底物，并将其转化为D-木酮糖。

4.一种分离的核酸，其特征在于，所述核酸编码如权利要求1或2所述核糖-5-磷酸异构酶B突变体。

5.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含如权利要求4所述核酸。

6.一种重组表达转化体，其特征在于，所述重组表达转化体包含如权利要求5所述重组表达载体。

7.一种生物催化剂，其特征在于，所述的核糖-5-磷酸异构酶突变体催化剂是以下形式中的任意一种：

(1)培养如权利要求6所述重组表达转化体，分离含有所述核糖-5-磷酸一种生物催化剂，其特征在于，所述的核糖-5-磷酸异构酶突变体催化剂是以下形式中的任意一种：

(1)培养如权利要求6所述重组表达转化体，分离含有所述核糖-5-磷酸异构酶B突变体的转化体细胞；

(2)培养如权利要求6所述重组表达转化体，分离含有所述核糖-5-磷酸异构酶B突变体的粗酶液，以及干燥得到的粗酶粉；

(3) 培养如权利要求6所述重组表达转化体，分离含有所述核糖-5-磷酸异构酶B突变体的纯酶液，以及干燥得到的纯酶粉；

(4)培养如权利要求6所述重组表达转化体，分离含有所述核糖-5-磷酸异构酶B突变体并进行固定化所获得的固定化酶；

(5)如权利要求1或2所述核糖-5-磷酸异构酶B突变体。

8.一种双酶级联反应，其特征在于，采用如权利2所述核糖-5-磷酸异构酶B异构酶B突变体的转化体细胞；

(2)培养如权利要求6所述重组表达转化体，分离含有所述核糖-5-磷酸异构酶B突变体的粗酶液，以及干燥得到的粗酶粉；

(3) 培养如权利要求6所述重组表达转化体，分离含有所述核糖-5-磷酸异构酶B突变体的纯酶液，以及干燥得到的纯酶粉；

(4)培养如权利要求6所述重组表达转化体，分离含有所述核糖-5-磷酸异构酶B突变体并进行固定化所获得的固定化酶；

(5)如权利要求1或2所述核糖-5-磷酸异构酶B突变体。

9.一种双酶级联反应，其特征在于，采用如权利2所述核糖-5-磷酸异构酶B突变体及塔格糖-3-差向异构酶进行串联反应，由D-木糖生成D-木酮糖，最后生成D-核酮糖。

10.一种如权利要求8所述的利用核糖-5-磷酸异构酶B突变体制备D-木酮糖及D-核酮糖的方法。