[go: up one dir, main page]

CN120718826A - 多尔氏菌Dorea的增菌剂、微生物培养基及应用 - Google Patents

多尔氏菌Dorea的增菌剂、微生物培养基及应用

Info

Publication number
CN120718826A
CN120718826A CN202511222101.8A CN202511222101A CN120718826A CN 120718826 A CN120718826 A CN 120718826A CN 202511222101 A CN202511222101 A CN 202511222101A CN 120718826 A CN120718826 A CN 120718826A
Authority
CN
China
Prior art keywords
extract
dorea
microbial
culture medium
culture
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202511222101.8A
Other languages
English (en)
Inventor
沈鹤霄
李国龙
吴新宇
闫彩霞
陈莹
吕永玲
周先锋
滕兆伟
艾旭
秦秋霖
张英
蒋志伟
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Maintain Biomedical Wuhan Co ltd
Original Assignee
Maintain Biomedical Wuhan Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Maintain Biomedical Wuhan Co ltd filed Critical Maintain Biomedical Wuhan Co ltd
Priority to CN202511222101.8A priority Critical patent/CN120718826A/zh
Publication of CN120718826A publication Critical patent/CN120718826A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/38—Chemical stimulation of growth or activity by addition of chemical compounds which are not essential growth factors; Stimulation of growth by removal of a chemical compound
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/24—Methods of sampling, or inoculating or spreading a sample; Methods of physically isolating an intact microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开一种多尔氏菌Dorea的增菌剂、微生物培养基及应用，涉及微生物分离培养技术领域。增菌剂包括以下组分：齿叶乳香提取物、金银花提取物、鱼类提取物和维生素E，所述金银花提取物中绿原酸的含量≥30wt%，所述鱼类提取物中胶原蛋白肽的含量≥40wt%。本发明提供的增菌剂能显著增加人源粪便样本分离培养过程中多尔氏菌Dorea的活菌比例，相对传统方案增加了19倍的挑选概率（1个单菌落即获取目标菌株），节约大量多尔氏菌Dorea种重复鉴定工作和经费，从而有效提高其分离培养效率。

Description

多尔氏菌Dorea的增菌剂、微生物培养基及应用
技术领域
本发明涉及微生物分离培养技术领域，具体涉及一种多尔氏菌Dorea的增菌剂、微生物培养基及应用。
背景技术
多尔氏菌Dorea株属于厚壁菌门（Firmicutes）、梭菌纲（Clostridia）、毛螺菌科（Lachnospiraceae）；多尔氏菌Dorea株通常是革兰氏阳性菌，形状为杆状或短杆状。多尔氏菌Dorea属菌株作为肠道微生态中的重要成员，其属于厌氧菌，能够发酵碳水化合物并产生短链脂肪酸（SCFAs），如乙酸、丁酸等，这些代谢产物对肠道健康有重要作用，对多尔氏菌Dorea深入研究有助于开发新型益生菌制剂，可为人体肠道微生态平衡维持、免疫调节等方面提供新策略。
人源粪便样本中含有一定量的多尔氏菌Dorea，目前人们较难对人源粪便样本中的多尔氏菌Dorea 进行分离及培养，严重制约了对其功能特性及应用潜力的研究，具有以下局限性：1）多尔氏菌Dorea为严格厌氧菌，对氧气敏感，传统培养基的氧化还原电位难以满足其生长需求；2）肠道环境中菌群复杂，多尔氏菌Dorea在自然样本中的丰度较低，且与其他厌氧菌（如拟杆菌、梭菌等）存在营养竞争，常规增菌方法难以选择性富集目标菌株；3）传统培养基（如基础厌氧培养基）对于肠道中的多尔氏菌Dorea的分离培养效率不足3%，严重制约了其功能机制研究及潜在益生应用的开发。
发明内容
本发明的主要目的是提出一种多尔氏菌Dorea的增菌剂、微生物培养基及应用，以解决人源粪便样本中的多尔氏菌Dorea分离效率较低的问题。
第一方面，本发明提出一种多尔氏菌Dorea的增菌剂，所述增菌剂包括以下组分：齿叶乳香提取物、金银花提取物、鱼类提取物和维生素E，所述金银花提取物中绿原酸的含量≥30wt%，所述鱼类提取物中胶原蛋白肽的含量≥40wt%。
在上述技术方案中，按照重量份数计，所述增菌剂的组分包括1～8份齿叶乳香提取物、1～5份金银花提取物、1～8 份鱼类提取物和0.05～0.5份维生素E。
在上述技术方案中，按照重量份数计，所述增菌剂的组分包括1～3份齿叶乳香提取物、1～2份金银花提取物、5～7份鱼类提取物和0.06～0.46份维生素E。
在上述技术方案中，所述增菌剂的组分包括：2份齿叶乳香提取物、1.25份金银花提取物、7份鱼类提取物和0.06份维生素E。
第二方面，本发明还提出一种提高多尔氏菌Dorea增殖效率的微生物培养基，所述微生物培养基中包括第一方面所述的增菌剂。
在上述技术方案中，所述微生物培养基中增菌剂和培养基的质量体积比为0.7～1.2g/L，所述增菌剂的各组分在培养基的中浓度包括：齿叶乳香提取物0.2～0.6g/L、金银花提取物0.1～0.3 g/L、鱼类提取物0.1～0.4 g/L、0.006～0.046 g/L维生素E。
第三方面， 本发明还提出一种提高多尔氏菌Dorea的分离培养效率的方法，包括如下步骤：
按照第一方面所述增菌剂所处的组分准备原材料，所述原材料包括经过灭菌处理后的齿叶乳香提取物、经过灭菌处理后的金银花提取物、经过灭菌处理后的鱼类提取物和经过灭菌处理后的维生素E；
将所述齿叶乳香提取物、金银花提取物、鱼类提取物和维生素E加入至基础液体培养基中，得到微生物培养基；
配置碳酸盐-磷酸盐缓冲液，将人源粪便样本用所述碳酸盐-磷酸盐缓冲液匀浆，然后过滤，得到接种物；
在恒温、低氧条件下将所述接种物加入到所述的微生物培养基中进行发酵培养，得到增菌培养物；
提取所述增菌培养物的基因组DNA，经PCR扩增、测序后，筛选得到含有多尔氏菌Dorea的增菌培养物；
对所述增菌培养物进行稀释，然后涂布于固体培养基上，经发酵培养后，得到单菌落，对所述单菌落进行鉴定，得到多尔氏菌Dorea。
在上述技术方案中，接种物中人源粪便样本含量为0.3～0.4g/mL；接种物与所述微生物培养基的体积比为（0.5～1.5）∶（8.5～9.5）；所述恒温、低氧条件为：温度为37°C、氧气浓度＜0.1%；增菌培养物的稀释的倍数为1×105倍～1×107倍。
第四方面， 本发明还提供一种第一方面所述的增菌剂在接种或分离或鉴定多尔氏菌Dorea中的应用。
第五方面， 本发明还提供一种第二方面所述的微生物培养基在接种或分离或鉴定多尔氏菌Dorea中的应用。
需要说明的是，多尔氏菌Dorea的菌种在人类肠道微生态中相对丰度是通常在1%～2%，肥胖人群3～5%，过敏患者可能<1%，人类肠道菌群的种类大致范围是1000多种，实际的种类数量因个体差异而变化。具体到健康个体的肠道细菌大约只有300～400种。
相对于现有技术，本发明的有益效果在于：
（1）本发明提供的增菌剂能显著增加人源粪便样本（肠道微生物群落）分离培养过程中多尔氏菌Dorea的活菌比例，相对传统方案增加了19倍的挑选概率（1个单菌落即获取目标菌株），有效提高其分离培养效率，从而节约了大量多尔氏菌Dorea的菌种重复鉴定工作和经费。
（2）本发明的微生物培养基可为多尔氏菌Dorea的生长提供适宜的环境，可以降低培养环境中的氧化还原电位，为多尔氏菌Dorea营造一个更接近其天然生存环境的厌氧条件，有助于多尔氏菌Dorea的存活和生长；
传统方法主要依靠选择性培养基来富集目标菌，本发明先对培养物进行Illumina测序，根据测序结果筛选出多尔氏菌Dorea占比高的培养物，然后重复传代培养，以此来进一步提高多尔氏菌Dorea在培养物中的比例，该方法则是基于分子层面的监测，能够实时了解培养物中微生物群落的组成变化，更加科学、高效；
常规的微生物鉴定方法通常只使用一种测序技术，本发明先利用Illumina测序对V3～V4区进行分析，初步了解微生物群落的组成情况，然后再通过Sanger测序对全长16SrDNA进行鉴定，该方法结合了两种不同的测序技术，相互补充，确保鉴定结果的准确性。
（3）本发明先从众多已知物质中确定了四种对多尔氏菌Dorea具有增殖促进作用的物质分组，包括：齿叶乳香提取物、金银花提取物、鱼类提取物和维生素E。在此技术上，本发明再通过改良复合营养基质成分、优化生长参数组合和培养条件，显著提升菌株分离效率，为后续系统解析其代谢机制与产业化开发奠定了方法学基础。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为Genus物种分布堆叠图；
图2为对照组稀释、涂布图，其有限稀释为1×105倍。
图3为图2的平板涂布图。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。此外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
目前，人们对肠道微生物的作用机制、作用原理、功能属性和应用价值等的相关研究较少且进展较缓慢，由于常用目标菌（如长链多尔氏菌Dorea longicatena）一般可以在市面上直接购买得到，故当需要对某个特定目标菌进行增殖培养，以便于后续系统解析该目标菌的代谢机制与产业化开发时，现有技术一般是直接对市面上的该目标菌进行培养，以减少研发成本。
然而，市面上可购买得到的目标菌一般仅为某个特定菌属（如多尔氏菌Dorea）中的某个或某几个特定菌种（如长链多尔氏菌Dorea longicatena），该特定菌属（如多尔氏菌Dorea）中的其它已知菌种则难以购买得到，如Dorea acetigenes（产醋多尔氏菌）、Doreaammoniilytica（解氨多尔氏菌）、Dorea amylophila（嗜淀粉多尔氏菌）、Dorea hominis（人源多尔氏菌）、Dorea longicatena（长链多尔氏菌）和Dorea phocaeensis（海豹多尔氏菌）等等。
目前，基于市面上已有部分以菌种为单位的常用益生菌（目标菌），而以菌属为单位的肠道微生物中的益生菌（如多尔氏菌Dorea）所进行的相关研究较少，当需要对以菌属为单位的肠道微生物中的益生菌（如多尔氏菌Dorea）进行培养、分离和鉴定时，其实验步骤如下：
1）配置固体培养基（如：LB琼脂培养基、GAM琼脂培养基、MRS琼脂培养基等）；2）配置缓冲液（如：生理盐水、碳酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液等）；3）采集样本并匀浆、经缓冲液洗涤过滤，得到滤液；4）将步骤3）中得到的滤液有限稀释（如：10倍、100倍、1×1010倍等）至不同浓度，然后分别涂布至固体培养基；5）经恒温条件在体外发酵48-72h获得培养物；6）收集单菌落，储存备用；7）将储存的样品分别提取基因组DNA；8）应用商业化试剂盒和PCR技术扩增获得样品的全长16S基因序列；9）将获得的基因序列进行Sanger测序分析；10）利用公开的BLAST数据库对比基因信息，鉴定是否是目标菌属（相似度＞98.7%）；11）鉴定结果如果是阴性，则需不断重复步骤7）-10），直到获得目标菌株。
通常地，上述步骤4）中，有限稀释要达到1×107倍至1×1010倍获得才能获得单菌落，故上述多尔氏菌Dorea的传统培养方法效率较低，有必要对此进行改进。
针对上述问题，本发明先针对市面上可购买得到的长链多尔氏菌Dorealongicatena进行研究（单因素变量实验），以初步确定对长链多尔氏菌Dorea longicatena具有增殖促进作用的物质组分。
在此基础上，本发明进一步研究上述已确定物质组分联合在一起使用时，以确定上述物质组分的合适用量配比和最佳配比（多因素正交实验）；接着，本申请基于由人源粪便样本所得到的接种物和物质组分最佳配比对多尔氏菌Dorea（以菌属为研究单位）进行分离培养和鉴定，验证了本发明所述的增菌剂及其相应的微生物培养基对多尔氏菌Dorea（以菌属为研究单位）具有良好的增殖促进作用。
本申请通过改良复合营养基质成分、优化增菌剂的生长参数组合，从而得到内部含有合适增菌剂组分的微生物培养基，进而显著提升多尔氏菌Dorea 的野生菌株的分离效率，为后续多尔氏菌Dorea地系统解析、其代谢机制及产业化开发奠定了坚实基础。
在第一方面，本发明提供了一种多尔氏菌Dorea的增菌剂，增菌剂的组分包括：齿叶乳香提取物、金银花提取物、鱼类提取物和维生素E。
在本发明实施例的技术方案中，通过将齿叶乳香提取物、金银花提取物、鱼类提取物和维生素E进行组合后，得到的增菌剂能促进多尔氏菌Dorea的增殖，并且有利于高效分离多尔氏菌Dorea。
其中，所述齿叶乳香提取物的规格为10：1，辐照灭菌；所述金银花提取物中绿原酸的含量≥30wt%，辐照灭菌；所述鱼类提取物中胶原蛋白肽的含量≥40wt%，规格为10:1，辐照灭菌；所述维生素E的规格为30万IU/G，辐照灭菌；上述齿叶乳香提取物、金银花提取物、鱼类提取物和维生素E均购自陕西瑞林生物科技有限公司。
进一步地，在一些实施例中，按照重量份数计，增菌剂的组分包括1～8份齿叶乳香提取物、1～5份金银花提取物、1～8 份鱼类提取物和0.05～0.5份维生素E中的一种或多种。
在本发明实施例提供的技术方案中，通过将特定质量份数的齿叶乳香提取物、金银花提取物、鱼类提取物和维生素E进行组合后得到的增菌剂能进一步促进多尔氏菌Dorea的增殖，并且更有利于高效分离多尔氏菌Dorea。
在本发明实施例提供的增菌剂中，齿叶乳香提取物的质量份数例如可以为1份、2份、3份、4份、5份、6份、7份、8份或该范围内的其他数值，金银花提取物的质量份数例如可以为1份、2份、3份、4份、5份或该范围内的其他数值，鱼类提取物的质量份数例如可以为1份、2份、3份、4份、5份、6份、7份、8份或该范围内的其他数值，维生素E例如可以为0.05份、0.10份、0.15份、0.20份、0.25份、0.30份、0.35份、0.40份、0.45份、0.50份或该范围内的其他数值。
进一步地，在一些实施例中，按照重量份数计，增菌剂的组分包括：1～3份齿叶乳香提取物、1～2份金银花提取物、5～7份鱼类提取物和0.06～0.46份维生素E。
在本发明实施例提供的技术方案中，上述齿叶乳香提取物、金银花提取物、鱼类提取物和维生素E的用量配比在经过优化后，本申请能在保证多尔氏菌Dorea的增殖效率较高的情况下尽量减少用料成本，能同时满足高效分离多尔氏菌Dorea并节约拉菌Dorea的鉴定工作和经费的需求。
进一步地，在一些实施例中，按照重量份数计，增菌剂的组分包括：2份齿叶乳香提取物、1.25份金银花提取物、7份鱼类提取物和0.06份维生素E。
在本发明实施例提供的技术方案中，通过采用正交实验对齿叶乳香提取物、金银花提取物、鱼类提取物和维生素E的质量份数进行优化，将最优质量份数的齿叶乳香提取物、金银花提取物、鱼类提取物和维生素E进行组合后得到的增菌剂对多尔氏菌Dorea的增殖具有最优的促进效果，并且能在最好的高效分离多尔氏菌Dorea的情况下，尽可能节约拉菌Dorea的鉴定工作和经费。
在第二方面，本发明实施例提供了一种提高多尔氏菌Dorea增殖效率的微生物培养基，其包括上述任一项增菌剂。
在本发明实施例提供的微生物培养基中，将增菌剂中的组分加入至基础培养基中即可得到微生物培养基，齿叶乳香提取物的质量份数例如可以为0.1g/L、0.2g/L、0.3g/L、0.4g/L、0.5g/L、0.6g/L、0.7g/L、0.8g/L或该范围内的其他数值，金银花提取物的质量份数例如可以为0.1g/L、0.2g/L、0.3g/L、0.4g/L、0.5g/L或该范围内的其他数值，鱼类提取物的质量份数例如可以为0.1g/L、0.2g/L、0.3g/L、0.4g/L、0.5g/L、0.6g/L、0.7g/L、0.8g/L或该范围内的其他数值，维生素E例如可以为0.005g/L、0.01g/L、0.015g/L、0.02g/L、0.025g/L、0.03g/L、0.035g/L、0.04g/L、0.045g/L、0.5g/L或该范围内的其他数值。
在本发明实施例提供的微生物培养基中，通过向基础培养基中加入上述增菌剂后，得到的微生物培养基能促进多尔氏菌Dorea的增殖，并且能高效分离多尔氏菌Dorea。
进一步地，在一些实施例中，所述微生物培养基中增菌剂和培养基的质量体积比为0.7～1.2g/L，所述增菌剂的各组分在培养基的中浓度包括：齿叶乳香提取物0.2～0.6g/L、金银花提取物0.1～0.3 g/L、鱼类提取物0.1～0.4 g/L、0.006～0.046 g/L维生素E。
在本发明实施例提供的技术方案中，上述齿叶乳香提取物、金银花提取物、鱼类提取物和维生素E的在微生物培养基中的浓度配比在经过优化后，本申请能在保证多尔氏菌Dorea的增殖效率较高的情况下尽量减少用料成本，能同时满足高效分离多尔氏菌Dorea并节约拉菌Dorea的鉴定工作和经费的需求。
在本发明实施例提供的技术方案中，培养基用于满足多尔氏菌Dorea增殖的营养需求。
可以理解地是，培养基可以根据实际使用需要选择现有技术中常规的培养基，只要能满足多尔氏菌Dorea增殖的营养需求即可。本发明中培养基优选包括LB培养基、GAM培养基、MRS培养基中的至少一种。
在第三方面，本发明实施例提供了一种提高多尔氏菌Dorea分离培养效率的方法，其包括如下步骤：
S1、按照第一方面所述增菌剂所处的组分准备原材料，所述原材料包括经过灭菌处理后的齿叶乳香提取物、经过灭菌处理后的金银花提取物、经过灭菌处理后的鱼类提取物和经过灭菌处理后的维生素E；
S2、将所述齿叶乳香提取物、金银花提取物、鱼类提取物和维生素E加入至基础液体培养基中，得到微生物培养基；
S3、配置碳酸盐-磷酸盐缓冲液，将人源粪便样本用所述碳酸盐-磷酸盐缓冲液匀浆，然后过滤，得到接种物；
S4、在恒温、低氧条件下将所述接种物加入到所述的微生物培养基中进行发酵培养，得到增菌培养物；
S5、提取所述增菌培养物的基因组DNA，经PCR扩增、测序后，筛选得到含有多尔氏菌Dorea的增菌培养物；
S6、对所述增菌培养物进行稀释，然后涂布于固体培养基上，经发酵培养后，得到单菌落，对所述单菌落进行鉴定，得到多尔氏菌Dorea。
在本发明实施例提供的方法中，通过采用本发明中的微生物培养基（也可称为增菌-液体培养基），其能促进多尔氏菌Dorea的增殖，因此，缩短了多尔氏菌Dorea分离培养的流程，并且显著提高了多尔氏菌Dorea分离培养的效率，解决了现有技术中的多尔氏菌Dorea在分离培养过程中存在菌株增殖能力低、分离效率低的问题，避免了传统方法中需要进行大量重复筛选鉴定步骤，节省分离费用；另外，该方法操作简便，原料便宜易得，因此，适合于工业大规模生产应用。
进一步地，在一些实施例中，接种物中，人源粪便样本含量为0.3～0.4g/mL；接种物与所述微生物培养基的体积比为（0.5～1.5）∶（8.5～9.5），优选为1mL接种物兑9mL微生物培养基；所述恒温、低氧条件为：温度为37°C、氧气浓度＜0.1%；增菌培养物的稀释的倍数为1×105倍～1×107倍。
在本发明实施例提供的技术方案中，将接种物与微生物培养基的体积比控制在特定的范围内，有利于接种物的快速增殖；将涂布的菌液稀释控制在较小的倍数内，能减少稀释次数，节省人力物力。
本发明中，接种物与增菌-液体培养基的体积比例如可以为0.5:8.5、0.5:9、0.5:9.5、1:8.5、1:9、1:9.5、1.5:8.5、1.5:9、1.5:9.5或该范围内的其他比值；增菌培养物的稀释的倍数例如可以为1×105倍、5×105、1×106、5×106、1×107倍或该范围内的其他倍数值。
在第四方面，本发明实施例提供了第一方面所述增菌剂在接种或分离或鉴定多尔氏菌Dorea中的应用。
在本发明实施例提供的应用中，通过使用本发明中的增菌剂，其能促进多尔氏菌Dorea的增殖，因此，在高效分离多尔氏菌Dorea中具有较好的应用前景。
在第五方面，本发明实施例提供了第二方面所述微生物培养基在接种或分离或鉴定多尔氏菌Dorea中的应用。
在本发明实施例提供的应用中，通过使用本发明中的微生物培养基，其能促进多尔氏菌Dorea的增殖，因此，在高效分离多尔氏菌Dorea中具有较好的应用前景。
以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实验材料说明
模式种【长链多尔氏菌Dorea longicatena】购自德国莱布尼茨微生物与细胞培养研究所（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ）；
齿叶乳香提取物、金银花提取物、鱼类提取物和维生素E各种食品级动、植物提取物均购自陕西瑞林生物科技有限公司；
GAM基础培养基购自北京索莱宝科技有限公司，产品编号为LA4490-250g；
DNA分子操作相关试剂盒购自北京擎科生物科技有限公司，产品编号为 TSP701-50。
实施例1、单因素变量实验
目的：确定多尔氏菌Dorea野生菌株分离培养效率的增菌剂配方，并确定各成分最佳比例，提升多尔氏菌Dorea野生菌株的分离培养效率；
菌种：长链多尔氏菌Dorea longicatena，其中，长链多尔氏菌Dorea longicatena也可被称为DSM 13814活菌；
基础培养基：标准LB（Lysogeny Broth）成分 + L-半胱氨酸 1% + 葡萄糖 5%；
培养条件：厌氧，37℃；
稀释倍数：107；
变量：1）齿叶乳香提取物，规格10：1，辐照灭菌；2）金银花提取物，且该金银花提取物中绿原酸的含量≥30wt%，辐照灭菌；3）鱼类提取物，且该鱼类提取物中胶原蛋白肽的含量≥40wt%，辐照灭菌；4）维生素E，规格30万IU/G，辐照灭菌。
具体操作步骤如下：
（1）分别称取一定量的单因素变量成分，用无菌水配制成不同浓度溶液（参考表1），各组溶液如上表1所示，备用。
具体的：参考表1，在GAM液体培养基中分别单独添加1～8份齿叶乳香提取物、1～5份金银花提取物、1～8 份鱼类提取物和0.05～0.5份维生素E，得到12组含有不同浓度组分的微生物培养基，包括：含有0.1～0.8 g/L齿叶乳香提取物的微生物培养基；含有0.1～0.5g/L金银花提取物的微生物培养基；含有0.1～0.8 g/L金银花提取物的微生物培养基；含有0.005～0.05 g/L维生素E的微生物培养基。
（2）将步骤（1）的溶液加入到已灭菌的LB液体培养基中，做好分组标记。
（3）无菌接种DSM 13814活菌到步骤（2）的不同分组的培养基中，稀释倍数为107倍，放入厌氧培养箱中37℃恒温培养24～48h。
（4）分别在24h、36h、48h时间点观察，长链多尔氏菌Dorea longicatena和空白对照组均培养至对数生长期（OD600≈1.0）时转接至GAM固体培养基，涂布平板计数。
实际工作时，本实施例还设置三组空白对照（仅采用实施例1所述基础培养基），三组空白对照培养的菌落个数结果平均值为16.33，其中，设计空白对照的实验方式为本领域的常规技术手段，在此不做赘述。
（5）实验结果如表1所示。
表1 单一组分的增菌剂对多尔氏菌Dorea增殖的影响结果
由上述表1可知，本申请的齿叶乳香提取物、金银花提取物、鱼类提取物和维生素E中的各个单一组分均可让长链多尔氏菌Dorea longicatena实现菌种增殖功能，将一定质量份数的齿叶乳香提取物、金银花提取物、和维生素E分别配置成特定浓度的微生物培养基后，四个单一增菌剂组分均对长链多尔氏菌Dorea longicatena增殖具有促进作用。
实际工作时，上述实验中，四种单一组分在低浓度中的菌落个数小于对照组，此为合理现象，因为实验组并不一定要全部大于对照组，有可能是本申请的四中单一组分在该浓度时，其对长链多尔氏菌Dorea longicatena的增殖促进效果没有GAM液体培养基好。
由上述表1可知，在长链多尔氏菌Dorea longicatena的增菌剂的四种单一组分中，齿叶乳香提取物对长链多尔氏菌Dorea longicatena的增殖促进效果最好，齿叶乳香提取物的最佳单一用量为0.4g/L，金银花提取物的最佳单一用量为0.25 g/L，鱼类提取物的最佳单一用量为0.8g/L，维生素E的最佳单一用量为0.05 g/L。
实施例2、多因素正交实验
目的：进一步研究多变量组合对的生长影响；
菌种：长链多尔氏菌Dorea longicatena，其中，长链多尔氏菌Dorea longicatena也可被成为DSM 13814活菌；
培养基：GAM固体培养基；
培养条件：稀释倍数107倍，厌氧，37℃；
变量：1）齿叶乳香提取物，规格10：1，辐照灭菌；2）金银花提取物，且该金银花提取物中绿原酸的含量≥30wt%，辐照灭菌；3）鱼类提取物，且该鱼类提取物中胶原蛋白肽的含量≥40wt%，辐照灭菌；4）维生素E，规格30万IU/G，辐照灭菌。
本实施例中，以长链多尔氏菌Dorea longicatena作为研究对象，采用四因素三水平L9(34)的正交实验探究不同浓度的齿叶乳香提取、金银花提取物、松树皮提取物、抗性淀粉的组合对长链多尔氏菌Dorea longicatena增殖的影响，具体操作步骤如下：
（1）称取一定量的多因素变量成分（参考表2），用无菌水配制成不同浓度溶液，各组溶液如表2所示，备用；
（2）将步骤（1）的溶液加入到已灭菌的LB液体培养基中，做好分组标记。
本步骤中是将上述步骤（1）所述的增菌剂组分加入至GAM固体培养基中，以配制成一定浓度的溶液备用，例如，参照表2中的实验3所示，用0.1g齿叶乳香提取物、0.2g金银花提取物、0.7g鱼类提取物和0.046 g维生素E加入1L无菌水中，形成表2中实验3所述组分：0.1g/L齿叶乳香提取物、0.2g/L金银花提取物、0.7g/L鱼类提取物和0.046 g/L维生素E。
（3）按照步骤（2）的不同分组，无菌接种长链多尔氏菌Dorea longicatena的活菌至培养基中，接着稀释倍数为107倍后，放入厌氧培养箱中37℃恒温培养24～48h。
（4）分别在24h、36h、48h时间点观察，长链多尔氏菌Dorea longicatena培养至对数生长期（OD600≈1.0）时转接至GAM固体培养基，涂布平板计数。
（5）实验结果如表2所示，对标2中的实验结果进行统计，得到表3。
表2 正交实验的因素与水平表
表3 正交实验结果
上述表格中k1、k2、k2和R依次为水平1的平均菌落数、水平2的平均菌落数、水平3的平均菌落数和极差，根据四因素三水平L9(34)正交实验和表2所记载内容得到上述表3中所记载的实验结果的方式及方法，为本领域的常规手段，在此不做赘述。
为了让本发明的实验数据更加清楚和容易理解，本申请对上述表3 的正交实验中的数据进行说明：
例如,在本发明所述的四因素三水平L9(34)的正交实验中，数字184的含义为：在第5组实验中，齿叶乳香提取物提取物采用水平2所对应的浓度（也即齿叶乳香提取物提取物为0.2g/L），金银花提取物采用水平2所对应的浓度（也即金银花提取物为0.125g/L），鱼类提取物采用水平3所对应的浓度（也即鱼类提取物为0.7g/L），维生素E采用水平1所对应的浓度（也即维生素E为0.006 g/L），此时，模式菌株长链多尔氏菌Dorea longicatena（DSM13814）的菌落数量为184个。
例如，在本发明所述的四因素三水平L9(34)的正交实验中，数字128.33的含义为：金银花提取物采用水平2所对应的浓度数值时（也即金银花提取物为0.125g/L），模式菌株长链多尔氏菌Dorea longicatena（DSM 13814）的平均菌落数为128.33。
例如，在本发明所述的四因素三水平L9(34)的正交实验中，数字41.67的含义为：鱼类提取物的菌落数最高值和菌落数最低值之间的差值，也即采用水平3所对应的浓度数值时（鱼类提取物为0.7g/L）的平均菌落数和采用水平2所对应的浓度数值时（鱼类提取物为0.6g/L）的平均菌落数的差值。
结合本发明所述的四因素三水平L9(34)的正交实验的实验方式及实验结果，由上述表2和表3可知：
（1）本申请的增菌剂中所记载的四个组分在一起使用时，金银花提取物对模式菌株长链多尔氏菌Dorea longicatena（DSM 13814）的增殖促进作用效果最好，齿叶乳香提取物、鱼类提取物和维生素E对目标菌株（长链多尔氏菌Dorea longicatena）的增殖促进作用效果次之。
（2）由表2和表3可知，当本申请的增菌剂中所记载的四个组分在一起使用时，齿叶乳香提取物为0.2g/L时目标菌株（长链多尔氏菌Dorea longicatena）的增殖促进作用效果最好，金银花提取物为0.125g/L时目标菌株（长链多尔氏菌Dorea longicatena）的增殖促进作用效果最好，鱼类提取物为0.7g/L时目标菌株（长链多尔氏菌Dorea longicatena）的增殖促进作用效果最好，维生素E为0.006 g/L时目标菌株（长链多尔氏菌Dorealongicatena）的增殖促进作用效果最好。
因此，基于表2中的实施例5的数据和表3中平均菌落数数据可知，本申请所述的增菌剂的各组分在培养基的最佳浓度为：齿叶乳香提取物为0.2g/L、金银花提取物为0.125g/L、鱼类提取物为0.7g/L、维生素E为0.006 g/L。
（3）结合表4中的极差数据和平均落菌数据可知，金银花提取物的极差最大，在本申请的增菌剂中所记载的四个组分中，金银花提取物的的极差最大，其用量变化对目标菌株（长链多尔氏菌Dorea longicatena）的增殖促进的影响也最大；齿叶乳香提取物的极差最小，虽然齿叶乳香提取物没有金银花提取物对目标菌株（长链多尔氏菌Dorealongicatena）的增殖促进作用效果好，但是齿叶乳香提取物的用量变化对目标菌株（长链多尔氏菌Dorea longicatena）的增殖促进的影响也最小，明显低于金银花提取物。
虽然本申请的增菌剂中所记载的四个组分在一起使用时的最佳用量和实验组5中记录的数据保持一致，但是仍然要需要说明的是：在本发明的所述的四因素三水平L9(34)的正交实验中，其最优组合方案并不是以表3中实验组1至实验组9中的最佳数据为参考，而是来以表3中每个组分在k1、k2和k3中所记录的最佳数据为参考，例如，齿叶乳香提取物的最佳用量是采用k1、k2和k3三个数据中最优的数据（也即k2所代表的平均菌落数为117个），也即齿叶乳香提取物的最佳用量为其在水平2时所对应的浓度（也即0.2g/L），上述齿叶乳香提取物的最佳用量并不是以实验组5所对应的数据为参考；同理，金银花提取物最佳用量为其在水平2时所对应的浓度（0.125g/L）、苹果提取物最佳用量为其在水平3时所对应的浓度（0.7g/L）、维生素E最佳用量为其在水平1时所对应的浓度（0.006 g/L）。
对比例1、传统培养基对多尔氏菌Dorea进行接种、培养、分离和鉴定：
目的：在传统的菌种培养方式的基础上，结合Illumina测序、重复传代培养和Sanger测序等技术，探究传统培养基对多尔氏菌Dorea增殖的影响；
菌种：DSM 13814；
基础培养基：GAM固体培养基；
培养条件：稀释倍数107倍，厌氧，37℃；
变量：仅用基础培养基对多尔氏菌Dorea进行培养，基础培养基中不含齿叶乳香提取物、金银花提取物、鱼类提取物和维生素E。
实验步骤：
（1）依次称取10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10g氯化钠溶解，加入800mL去离子水，搅拌至完全溶解，调节溶液pH至7.0，然后定容、分装后，灭菌、冷却至室温，得到基础培养基；
（2）配置碳酸盐-磷酸盐缓冲液(1:3[wt/vol])；其中，如何碳酸盐-磷酸盐缓冲液(1:3[wt/vol])为本领域的常规手段，在此不做赘述；
（3）采集粪便样本并匀浆，粪便样本经缓冲液洗涤过滤后，接种至5mL新鲜培养基中，37℃厌氧培养12～16小时至对数生长期（OD600≈1.0），得到接种物；其中，本步骤中的粪便样本为人源粪便样本，接种物中人源粪便样本的浓度为0.3～0.4g/mL（优先为0.35g/mL），上述得到待分离样品的方案为本领域的常规技术方案，在此不做赘述；
（4）按10%接种量转接至50mL新鲜培养基，厌氧环境37℃静置培养20小时；
（5）离心收集菌体（4000×g, 10min），用无菌PBS（含5%甘油）重悬，得到含有多尔氏菌Dorea的溶液，以用于后续应用或保存；
（6）提取所述保存的菌体样品的基因组DNA；
（7）应用商业化16SrDNA试剂盒和PCR技术扩增获得样品的V3～V4区扩增片段；
（8）将获得的扩增片段进行Illumina测序分析；
（9）筛选多尔氏菌Dorea占比高的增菌培养物，重复步骤4～5进一步提高多尔氏菌Dorea在增菌培养物中的比例，得到最终培养物；
（10）将获得的最终培养物经倍比稀释，然后涂布固体培养基；
（11）经恒温条件在体外发酵48h获得培养物，收集单菌落，储存备用；
（12）采用商业试剂盒及PCR扩增16S rRNA全长基因；
（13）进行Sanger测序所得基因；
（14）通过BLAST比对公共数据库，确认为目标菌属（相似度≥98.7%）；
（15）鉴定结果如果是阴性，则需重复所有步骤，直至获得目标菌株。
在上述步骤中，16S扩增子测序的实验变量、试剂、试剂盒、引物，以及实验步骤分别为：
1）变量：仅用步骤（2）所得到的新鲜培养基对多尔氏菌Dorea进行培养，基础培养基中不含齿叶乳香提取物、金银花提取物、鱼类提取物和维生素E。
2）试剂、试剂盒及引物：相关DNA 提取试剂盒、PCR 扩增试剂盒、通用引物（如806R）、文库构建试剂盒等。
3）实验步骤包括：
S1、用DNA提取试剂盒按照说明提取样本中的总DNA。以提取的DNA为模板，进行PCR扩增，如表4所示；
PCR反应条件：预变性：95℃ 10分钟。扩增25个循环：变性：94℃ 30秒，退火：60℃90秒，延伸：72℃ 30秒。终延伸：72℃ 10分钟，4℃保存。
S2、扩增后的PCR产物回收、末端修复、加A尾、连接测序接头等操作，如表5所示；
反应条件：98℃预变性45 s；98℃ 15s，60℃ 30s，72℃ 30s，8个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
S3、将构建完成的扩增子文库上机测序，测序平台为Illumina Miseq，测序策略为PE250。
S4、下机数据处理，去除低质量序列、接头序列等。
按此方案执行，如图1所示，对比例1中多尔氏菌Dorea种相对丰度是1.090403%。参考图2为对照组有限稀释1×105倍图，图（A）、（B）中从左至右稀释倍数依次为1×10、1×102、1×103、1×104、1×105），稀释涂平板法的整个平板单菌落数在30～300个之间为理想结果。
由图1及图2可知，对比例1有限稀释要达到1×107倍获得才能获得单菌落。对比例1估算挑选单个菌落即获得目标菌株的概率约1%～3%。获得目标菌株需要重复鉴定约30～100次，故对照方案缺点是单次实验即获得目标菌株的概率低，重复工作量大和花费高昂。
实施例3、采用新增菌剂组方对多尔氏菌Dorea进行接种、培养、分离和鉴定
目的：探究新增菌剂组方对多尔氏菌Dorea增殖的影响；
菌种：DSM 13814；
基础培养基：GAM固体培养基；
培养条件：稀释倍数107倍，厌氧，37℃
变量：1）齿叶乳香提取物，规格10：1，辐照灭菌；2）金银花提取物，且该金银花提取物中绿原酸的含量≥30wt%，辐照灭菌；3）鱼类提取物，且该鱼类提取物中胶原蛋白肽的含量≥40wt%，辐照灭菌；4）维生素E，规格30万IU/G，辐照灭菌。
实验步骤：
（1）先将鱼类提取物0.7g溶于40℃温水（容量为1L），搅拌至完全溶解，得到鱼类提取物溶液0.7g/L；
（2）向鱼类提取物溶液中依次加入金银花提取物0.2g、维生素E0.006g（预溶于少量乙醇），最后加入齿叶乳香提取物0.2g分散，超声均质（20kHz, 5min）确保成分均匀，避免分层，得到含有增菌剂的微生物培养基；
（3）依次称取10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10g氯化钠溶解，加入800mL去离子水，搅拌至完全溶解，调节溶液pH至7.0，然后定容、分装后，灭菌、冷却至室温，得到基础培养基；将上述步骤（2）中制备的增菌剂与基础培养基按体积比加入，即得新鲜培养基，该新鲜培养基可以被称为微生物培养基，也可以称为含增菌剂的培养基或增菌培养基；
（4）配置碳酸盐-磷酸盐缓冲液(1:3[wt/vol])；其中，如何碳酸盐-磷酸盐缓冲液(1:3[wt/vol])为本领域的常规手段，在此不做赘述；
（5）采集粪便样本并匀浆，粪便样本经缓冲液洗涤过滤后，接种至5mL新鲜培养基中，37℃厌氧培养12～16小时至对数生长期（OD600≈1.0），得到接种物；其中，本步骤中的粪便样本为人源粪便样本，接种物中人源粪便样本的浓度为0.3～0.4g/mL（优先为0.35g/mL），上述得到待分离样品的方案为本领域的常规技术方案，在此不做赘述；
（6）将步骤（5）中的接种物按1%接种量接种量转接至50mL新鲜培养基（含增菌剂），厌氧环境37℃静置培养20小时；
（7）离心收集菌体（4000×g, 10min），用无菌PBS（含5%甘油）重悬，得到含有多尔氏菌Dorea的菌体样品（简称菌体样品），以用于后续应用或保存；
（8）提取所述保存的菌体样品的基因组DNA；
（9）应用商业化16SrDNA试剂盒和PCR技术扩增获得样品的V3～V4区扩增片段；
（10）将获得的扩增片段进行Illumina测序分析；
（11）筛选多尔氏菌Dorea占比高的增菌培养物，重复步骤4～5进一步提高多尔氏菌Dorea在增菌培养物中的比例，得到最终培养物；
（12）将获得的最终培养物经倍比稀释，然后涂布固体培养基；
（13）经恒温条件在体外发酵48h获得培养物，收集单菌落，储存备用；
（14）采用商业试剂盒及PCR扩增16S rRNA全长基因；
（15）进行Sanger测序所得基因；
（16）通过BLAST比对公共数据库，确认为目标菌属（相似度≥98.7%）；
（17）鉴定结果如果是阴性，则需重复所有步骤，直至获得目标菌株。
在上述步骤中，16S扩增子测序的实验变量、试剂、试剂盒、引物和步骤分别为：
1）变量：采用实施例2实验5所确定的增菌培养物组分，其中，叶乳香提取物0.2g/L、金银花提取物0.125g/L、鱼类提取物0.6g/L、维生素E0.006 g/L；
2）试剂、试剂盒及引物：相关DNA 提取试剂盒、PCR 扩增试剂盒、通用引物（如341F 和 806R）、文库构建试剂盒等。
3）实验步骤包括：
S1、用DNA提取试剂盒按照说明提取样本中的总DNA，以提取的DNA为模板，进行PCR扩增，如表6所示：
PCR反应条件：预变性：95℃ 10分钟。扩增25个循环：变性：94℃ 30秒，退火：60℃90秒，延伸：72℃ 30秒。终延伸：72℃ 10分钟，4℃保存。
S2、扩增后的PCR产物回收、末端修复、加A尾、连接测序接头等操作，如表7所示。
反应条件：98℃预变性45 s；98℃ 15s，60℃ 30s，72℃ 30s，8个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
S3、将构建完成的扩增子文库上机测序，测序平台为Illumina Miseq，测序策略为PE250。
S4、下机数据处理，去除低质量序列、接头序列等。
按上述步骤执行，本实施例3中多尔氏菌Dorea的相对丰度是21.2237972%。估算挑选单个菌落即获得目标菌株的概率约10～20%。获得目标菌株预计需要重复鉴定约5～10次，故本发明提供的增菌剂能显著增加人源粪便样本（肠道微生物群落）分离培养过程中多尔氏菌Dorea的活菌比例，能有效提高其分离培养效率，从而节约了大量多尔氏菌Dorea的菌种重复鉴定工作和经费。
实际工作时，为了能更进一步说明本申请的技术方案，本申请的工作人员用生物信息学软件对由对比例1和实施例3处理后的数据进行分析，得到种属物种相对丰度表8。
表8 物种相对丰度表
注：1、E用于表示10的幂次方，例如，6.89E-02表示6.89×10-2；2、实验对照组指的是不添加增菌剂，仅使用基础培养基的分离方案。
由上表8的统计结果可知，本发明提供的培养方法相对传统方案（对照组）增加了19倍的挑选概率(1个单菌落即获取目标菌株)，节约大量多尔氏菌Dorea种重复鉴定工作和经费，从而有效提高其分离培养效率。
本发明提供的增菌剂能显著增加人源粪便样本（肠道微生物群落）分离培养过程中多尔氏菌Dorea的活菌比例,相对传统方案增加了19倍的挑选概率(1个单菌落即获取目标菌株)，有效提高其分离培养效率，从而节约大量多尔氏菌Dorea种重复鉴定工作量和经费。
综上所述，本发明通过将特定浓度的齿叶乳香提取物、金银花提取物、鱼类提取物和维生素E单独作为增菌剂使用时，能促进布多尔氏菌Dorea的增殖；进一步的，将特定浓度的知母提取物、海藻提取物、松树皮提取物和抗性淀粉进行组合后，得到的增菌剂能进一步促进布多尔氏菌Dorea的增殖。
以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种多尔氏菌Dorea的增菌剂，其特征在于，所述增菌剂包括以下组分：齿叶乳香提取物、金银花提取物、鱼类提取物和维生素E，所述齿叶乳香提取物的规格为10：1，所述金银花提取物中绿原酸的含量≥30wt%，所述鱼类提取物中胶原蛋白肽的含量≥40wt%，所述维生素E的规格为30万IU/G。
2.根据权利要求1所述的增菌剂，其特征在于，按照重量份数计，所述增菌剂的组分包括1～8份齿叶乳香提取物、1～5份金银花提取物、1～8 份鱼类提取物和0.05～0.5份维生素E。
3.根据权利要求2所述的增菌剂，其特征在于，按照重量份数计，所述增菌剂的组分包括1～3份齿叶乳香提取物、1～2份金银花提取物、5～7份鱼类提取物和0.06～0.46份维生素E。
4.根据权利要求3所述的增菌剂，其特征在于，所述增菌剂的组分包括：2份齿叶乳香提取物、1.25份金银花提取物、7份鱼类提取物和0.06份维生素E。
5.一种提高多尔氏菌Dorea增殖效率的微生物培养基，其特征在于，所述微生物培养基中包括权利要求1～4中任一项所述的增菌剂。
6.根据权利要求5所述的微生物培养基，其特征在于，所述微生物培养基中增菌剂和培养基的质量体积比为0.7～1.2g/L，所述增菌剂的各组分在培养基的中浓度包括：齿叶乳香提取物0.2～0.6g/L、金银花提取物0.1～0.3 g/L、鱼类提取物0.1～0.4 g/L、0.006～0.046 g/L维生素E。
7.一种提高多尔氏菌Dorea的分离培养效率的方法，其特征在于，包括如下步骤：
按照权利要求1～4中任一项所述增菌剂所处的组分准备原材料，所述原材料包括经过灭菌处理后的齿叶乳香提取物、经过灭菌处理后的金银花提取物、经过灭菌处理后的鱼类提取物和经过灭菌处理后的维生素E；
将所述齿叶乳香提取物、金银花提取物、鱼类提取物和维生素E加入至基础液体培养基中，得到微生物培养基；
配置碳酸盐-磷酸盐缓冲液，将人源粪便样本用所述碳酸盐-磷酸盐缓冲液匀浆，然后过滤，得到接种物；
在恒温、低氧条件下将所述接种物加入到所述的微生物培养基中进行发酵培养，得到增菌培养物；
提取所述增菌培养物的基因组DNA，经PCR扩增、测序后，筛选得到含有多尔氏菌Dorea的增菌培养物；
对所述增菌培养物进行稀释，然后涂布于固体培养基上，经发酵培养后，得到单菌落，对所述单菌落进行鉴定，得到多尔氏菌Dorea。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，接种物中人源粪便样本含量为0.3～0.4g/mL；接种物与所述微生物培养基的体积比为（0.5～1.5）∶（8.5～9.5）；所述恒温、低氧条件为：温度为37°C、氧气浓度＜0.1%；增菌培养物的稀释的倍数为1×105倍～1×107倍。
9.权利要求1～4中任一项所述的增菌剂在接种或分离或鉴定多尔氏菌Dorea中的应用。
10.权利要求8或9所述的微生物培养基在接种或分离或鉴定多尔氏菌Dorea中的应用。
CN202511222101.8A 2025-08-29 2025-08-29 多尔氏菌Dorea的增菌剂、微生物培养基及应用 Pending CN120718826A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202511222101.8A CN120718826A (zh) 2025-08-29 2025-08-29 多尔氏菌Dorea的增菌剂、微生物培养基及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202511222101.8A CN120718826A (zh) 2025-08-29 2025-08-29 多尔氏菌Dorea的增菌剂、微生物培养基及应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN120718826A true CN120718826A (zh) 2025-09-30

Family

ID=97157171

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202511222101.8A Pending CN120718826A (zh) 2025-08-29 2025-08-29 多尔氏菌Dorea的增菌剂、微生物培养基及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN120718826A (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101883573A (zh) * 2007-10-01 2010-11-10 高露洁-棕榄公司 含有植物提取物的口腔组合物
CN112041427A (zh) * 2018-04-23 2020-12-04 赢创运营有限公司 合生元组合物
CN113925854A (zh) * 2021-08-25 2022-01-14 武汉益鼎天养生物科技有限公司 绿原酸在制备Anaerostipes生长促进剂中的应用
CN113974159A (zh) * 2021-11-02 2022-01-28 美益添生物医药(武汉)有限公司 齿叶乳香树树脂在制备促进肠道有益菌增殖的产品中的应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101883573A (zh) * 2007-10-01 2010-11-10 高露洁-棕榄公司 含有植物提取物的口腔组合物
CN112041427A (zh) * 2018-04-23 2020-12-04 赢创运营有限公司 合生元组合物
CN113925854A (zh) * 2021-08-25 2022-01-14 武汉益鼎天养生物科技有限公司 绿原酸在制备Anaerostipes生长促进剂中的应用
CN113974159A (zh) * 2021-11-02 2022-01-28 美益添生物医药(武汉)有限公司 齿叶乳香树树脂在制备促进肠道有益菌增殖的产品中的应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104928208B (zh) 一种植物乳杆菌Lp90及其筛选方法和应用
CN111849836A (zh) 一种具有抗氧化、延长寿命的鼠李糖乳杆菌及其应用
CN110484477A (zh) 一株德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株及其应用
CN106434482B (zh) 一株产γ-氨基丁酸的植物乳杆菌SG5
CN107151638B (zh) 一株改善肝功能的植物乳杆菌zy001及其在发酵乳中的应用
CN106939288A (zh) 植物乳杆菌SG5在产γ‑氨基丁酸中的应用
CN109294944B (zh) 一种普雷沃肠型体外模拟模型的构建方法
CN120118808B (zh) 一种羊肚菌促生菌株芽孢杆菌msb09
JP6915932B1 (ja) 新規微生物
CN111676160B (zh) 牛大力内生菌rh5在促进牛大力生长中的应用
CN110885767A (zh) 一株具有良好抗氧化活性的乳酸乳球菌霍氏亚种及其应用
CN119776233A (zh) 一种富集和筛选Blautia属肠道菌的方法
CN120718826A (zh) 多尔氏菌Dorea的增菌剂、微生物培养基及应用
CN116287335B (zh) 评估阿拉伯木聚糖对肠道微生态调节作用的方法及其应用
CN112300962A (zh) 一种乳酸菌及其应用
CN119020209A (zh) 一株高耐酸植物乳杆菌及在提高抗氧化活性中的应用
CN106755470A (zh) 一种利用q‑pcr检测混合益生菌中益生菌种类和含量的方法
CN107012095A (zh) 猪结肠微生物组体外模拟培养的发酵参数
CN105624071A (zh) 一株唾液乳杆菌xjp2及其应用
CN114292796A (zh) 一种可降解餐厨废弃物油脂的地衣芽孢杆菌及其应用
CN120699879A (zh) 副普雷沃氏菌的增菌剂、增菌培养基及应用
CN112553118A (zh) 一种利用益生元富集有益菌的方法
CN114806916A (zh) 一种双歧杆菌的选择性分离培养基
CN118755638B (zh) 一株犬源屎肠球菌Kimate-X及其应用
CN120738072A (zh) 栖粪杆菌Faecalibacterium的增菌剂、微生物培养基及应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination