CN120700212A

CN120700212A - 一种用于检测弹状病毒的qPCR引物探针组合物、试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN120700212A
Application number: CN202511206090.4A
Authority: CN
Inventors: 刘君; 牟春花; 赵健
Original assignee: Beijing Zhaoderivative Technology Co ltd
Current assignee: Beijing Zhaoderivative Technology Co ltd
Priority date: 2025-08-27
Filing date: 2025-08-27
Publication date: 2025-09-26

Abstract

本申请公开了一种用于检测弹状病毒的qPCR引物探针组合物、试剂盒及其应用，本申请的qPCR引物探针组合物、试剂盒以及qPCR检测方法，能够特异性识别弹状病毒，qPCR检测的检测范围为1.0×10²‑1.0×10⁵copies/反应，最低加标浓度（LOQ）为1.0×10² copies/反应（即20copies/μL），同时在1.0×10²‑1.0×10⁵copies/反应的不同浓度范围内均表现出良好的重复性。

Description

一种用于检测弹状病毒的qPCR引物探针组合物、试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于分子检测技术领域，涉及一种用于检测弹状病毒的qPCR引物探针组合物、试剂盒及其应用。

背景技术

昆虫细胞是昆虫体内重要的细胞类型，广泛用于生物医学研究和病毒学研究。弹状病毒（Nim）是一类具有高致病性的病毒，主要感染昆虫细胞系，如Sf9细胞系，严重威胁昆虫细胞的正常功能和实验结果的可靠性。因此，开发一种快速、灵敏且特异性强的检测方法对于监测和控制弹状病毒感染至关重要。

实时荧光定量PCR（qPCR）技术因其高效、快速和灵敏度高的特点，已成为现代分子生物学中广泛使用的检测工具。qPCR通过特异性引物和探针结合目标DNA序列，利用荧光信号的变化实时监测扩增过程，从而实现对目标基因的定量分析。

发明内容

本申请旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，在本申请的第一方面，本申请提出的一种用于检测弹状病毒的qPCR引物探针组合物，

所述qPCR引物探针组合物包括引物对和探针；

所述引物对包括SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，所述探针包括SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。

做为一种优选方式，所述探针含有荧光基团和/或淬灭基团；

优选地，所述荧光基团选自FAM、HEX、Texas Red、CY5、TET、JOE、CY3、ROX、LCRED640、LC RED705中的任意一种；

优选地，所述淬灭基团包括TAMRA、MGB、Dabcyl、BHQ1、BHQ2中的任意一种。

在本申请的第二方面，本申请提出了一种用于检测弹状病毒的靶序列，所述靶序列包括SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列。

在本申请的第三方面，本申请提出了一种qPCR引物探针组合物或靶序列在制备弹状病毒的检测试剂盒中的应用。

在本申请的第四方面，本申请提出了一种检测弹状病毒的qPCR试剂盒，所述qPCR试剂盒包括上述的qPCR引物探针组合物。

做为一种优选方式，所述qPCR试剂盒还包括阳性标准品；

优选地，所述阳性标准品包括阳性质粒标准品，所述阳性质粒标准品包含携带SEQID NO .4或SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列的质粒；

优选地，所述阳性质粒标准品的终浓度为(3-4)×10⁸拷贝数/μL。

在本申请的第五方面，本申请提出了一种qPCR试剂盒的制备方法，所述制备方法包括：

合成qPCR引物探针组合物中的引物对和探针；

构建阳性质粒标准品，得到所述检测弹状病毒的qPCR试剂盒；

做为一种优选方式，所述阳性质粒标准品的构建方法包括：

合成靶序列，并将靶序列连接到克隆载体上，得到重组质粒；

对重组质粒进行检测，得到阳性质粒标准品；

所述靶序列包括SEQ ID No.4或SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列。

在本申请的第六方面，本申请提出了一种检测弹状病毒的方法，所述方法包括检测靶序列，所述靶序列包含SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列。

在本申请的第七方面，本申请提出了一种检测弹状病毒的方法，其包括如下步骤：

使用上述的qPCR引物探针组合物，和/或上述的qPCR试剂盒，对待测样品进行qPCR检测，根据扩增曲线和Ct值判断待测样品中是否含有弹状病毒；

做为一种优选方式，所述引物探针组合物中引物对的终浓度为8-12µmol/L，所述引物探针组合物中探针的终浓度为8-12µmol/L。

在本申请的第八方面，本申请提出了上述的检测弹状病毒的qPCR引物探针组合物、上述的检测弹状病毒的靶序列、上述的检测弹状病毒的qPCR试剂盒或上述的检测弹状病毒的方法中的任意一种或至少两种的组合在弹状病毒检测中的应用。

本申请的qPCR引物探针组合物、试剂盒以及qPCR检测方法，能够特异性识别弹状病毒，qPCR检测的检测范围为1.0×10²-1.0×10⁵copies/反应，最低加标浓度（LOQ）为1.0×10² copies/反应（即20copies/μL），同时在1.0×10²-1.0×10⁵copies/反应的不同浓度范围内均表现出良好的重复性。

附图说明

图1为本申请实施例3中的阳性质粒标准品的标准曲线图；

图2为本申请实施例4中的qPCR检测方法的特异性分析中的扩增曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本申请，具体实施例仅用于解释本申请，而不能理解为对本申请的限制。本领域的普通技术人员可以理解为：在不脱离本申请的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本申请的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。

本发明人发现针对弹状病毒的检测，已有研究开发了基于qPCR的检测方法，然而，仍存在一些例如检测范围有限、操作复杂性较高以及对实验条件要求严格等问题。本发明人为了解决上述问题，发明了新的用于检测弹状病毒的qPCR引物探针组合物、试剂盒及其应用，本申请的用于检测弹状病毒的qPCR引物探针组合物、试剂盒及其应用能够显著提升检测效率和准确性。

在一些实施方式中，本申请提出的一种用于检测弹状病毒的qPCR引物探针组合物，

所述qPCR引物探针组合物包括特异性靶向弹状病毒基因组的保守区域的引物对和探针；

所述引物对包括上游引物和下游引物，其中上游引物包括如SEQ ID No.1：TCGTGACATGTGGTCTCCAA所示的核苷酸序列，下游引物包括如SEQ ID No.2：AGGTGTATGCAGGTGGTTGA所示的核苷酸序列；

所述探针包括如SEQ ID No.3：CCGCTCCTTCTCCTCCACCCA所示的核苷酸序列。

做为一种实施方式，所述探针含有荧光基团和/或淬灭基团；

所述荧光基团选自FAM、HEX、Texas Red、CY5、TET、JOE、CY3、ROX、LC RED640、LCRED705中的任意一种

所述淬灭基团包括TAMRA、MGB、Dabcyl、BHQ1、BHQ2中的任意一种。

作为一种实施方式，荧光基团标记在探针的5’末端，淬灭基团标记在探针的3’末端；

以荧光基团为FAM，淬灭基团为TAMRA为例，探针的5’末端标记FAM，3’末端标记TAMRA，包含荧光基团FAM，淬灭基团TAMRA的探针为FAM-CCGCTCCTTCTCCTCCACCCA-TAMRA。

在一些实施方式中，本申请提出的一种用于检测弹状病毒的靶序列，所述靶序列包括SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列；其中，所述靶序列包括弹状病毒保守基因序列（SEQ ID NO.4）或弹状病毒保守基因序列的反向互补序列（SEQ ID NO.5）。

SEQ ID NO.4：CGTGACCATGGATTCCACAAATTGGAGATGCTCAACGAGAAAGAGAAGAAAATGTTGAACTATATGGGGGTCAAACAATTAAAACCCCAGTATACACATGAAAAGACATTCGAGAAACTCATTCTCAAGAACAAAGGTCCAAAGGGGTCTCGTGTCAGGGCAATTCTTCACTCTCAAAGTCGTGACATGTGGTCTCCAACCGCTCCTTCTCCTCCACCCACATATGAAGATGGATCCTCAGATGAATGGGATCAGCAACAACTGCACAGCCTCAACCACCTGCATACACCTTCTGTCCCCCTGAGGGCCCCCAGGACATCCCCACCCCAACAACTCTCCCCAAAACCGACATCCACAACCCAACCCCTCCCACAACTCACACAACCAAACAAGCCCCAAGAACTCTCCAAGTAGACACTTGACAGCCCCCACCAATTACTTTTAGATCATAAAAAAC

SEQ ID NO.5：GTTTTTTATGATCTAAAAGTAATTGGTGGGGGCTGTCAAGTGTCTACTTGGAGAGTTCTTGGGGCTTGTTTGGTTGTGTGAGTTGTGGGAGGGGTTGGGTTGTGGATGTCGGTTTTGGGGAGAGTTGTTGGGGTGGGGATGTCCTGGGGGCCCTCAGGGGGACAGAAGGTGTATGCAGGTGGTTGAGGCTGTGCAGTTGTTGCTGATCCCATTCATCTGAGGATCCATCTTCATATGTGGGTGGAGGAGAAGGAGCGGTTGGAGACCACATGTCACGACTTTGAGAGTGAAGAATTGCCCTGACACGAGACCCCTTTGGACCTTTGTTCTTGAGAATGAGTTTCTCGAATGTCTTTTCATGTGTATACTGGGGTTTTAATTGTTTGACCCCCATATAGTTCAACATTTTCTTCTCTTTCTCGTTGAGCATCTCCAATTTGTGGAATCCATGGTCACG

在一些实施方式中，本申请提出了一种qPCR引物探针组合物或靶序列在制备弹状病毒的检测试剂盒中的应用。

在一些实施方式中，本申请提出了一种检测弹状病毒的qPCR试剂盒，所述qPCR试剂盒包括上述的qPCR引物探针组合物。

做为一种实施方式，所述qPCR试剂盒还包括阳性标准品；

做为一种实施方式，所述阳性标准品包括阳性质粒标准品，所述阳性质粒标准品包含携带SEQ ID NO .4或SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列的质粒；

做为一种实施方式，所述阳性质粒标准品的终浓度为(3-4)×10⁸拷贝数（copies）/μL。

在一些实施方式中，本申请提出了一种qPCR试剂盒的制备方法，所述制备方法包括：

合成qPCR引物探针组合物中的引物对和探针；

构建阳性质粒标准品，得到所述检测弹状病毒的qPCR试剂盒；

做为一种实施方式，所述阳性质粒标准品的构建方法包括：

对重组质粒进行检测，得到阳性质粒标准品；

所述靶序列包括SEQ ID No.4或SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列。

在一些实施方式中，本申请提出了一种检测弹状病毒的方法，所述方法包括检测靶序列，所述靶序列包含SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列。

在一些实施方式中，本申请提出了一种检测弹状病毒的方法，其包括如下步骤：

做为一种实施方式，所述引物探针组合物中引物对的终浓度为8-12µmol/L，包括但不限于8µmol/L、9µmol/L、10µmol/L、11µmol/L、12µmol/L，所述引物探针组合物中探针的终浓度为8-12µmol/L，包括但不限于8µmol/L、9µmol/L、10µmol/L、11µmol/L、12µmol/L。

做为一种实施方式，所述qPCR检测的扩增程序包括：

预变性：(93-98)℃，(4-6)min；

退火延伸：(93-98)℃，(5-20)s；(55-65)℃，(20-40)s；循环(35-50)次。

做为一种实施方式，所述qPCR检测的扩增程序包括：

预孵育：(35-40)℃，(1-4)min；

预变性：(93-98)℃，(4-6)min；

做为一种实施方式，所述qPCR检测的扩增程序包括：

预孵育：37℃，2min；

预变性：95℃，2min；

退火延伸：95℃，10s；60℃，31s；循环45次；

反应体积：20μL。

在一些实施方式中，本申请提出了上述的检测弹状病毒的qPCR引物探针组合物、上述的检测弹状病毒的靶序列、上述的检测弹状病毒的qPCR试剂盒或上述的检测弹状病毒的方法中的任意一种或至少两种的组合在弹状病毒检测中的应用。

以下通过具体实施方式，对本申请的技术方案进行进一步的说明。

实施例1 检测弹状病毒的qPCR引物探针组中引物和探针的设计和合成

根据分离自昆虫细胞Sf9中弹状病毒基因组的保守区域设计引物和探针，引物探针组中引物的序列分别如SEQ ID NO.1-2所示（上游引物SEQ ID No.1：TCGTGACATGTGGTCTCCAA，下游引物SEQ ID No.2：AGGTGTATGCAGGTGGTTGA），探针的序列如SEQ ID NO.3所示（连接有荧光基团和淬灭基团的探针：FAM-CCGCTCCTTCTCCTCCACCCA-TAMRA）。引物和探针由北京擎科生物科技股份有限公司合成。

实施例2 阳性质粒标准品的制备

构建阳性质粒标准品，所述阳性质粒标准品含有实施例1中的引物探针组合物所针对的靶序列的质粒，其中靶序列包括SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列；其中，所述靶序列包括弹状病毒保守基因序列（SEQ ID NO.4）或弹状病毒保守基因序列的反向互补序列（SEQ ID NO.5）。本实施例中靶序列采用弹状病毒基因组的保守区域，也就是包括SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。

构建阳性质粒标准品的具体方法如下：

将目标序列(靶序列SEQ ID NO.4)发至北京擎科生物科技股份有限公司合成，并将目标序列连接至pUC57载体，构建重组质粒。

其中，目标序列(SEQ ID NO :4)：CGTGACCATGGATTCCACAAATTGGAGATGCTCAACGAGAAAGAGAAGAAAATGTTGAACTATATGGGGGTCAAACAATTAAAACCCCAGTATACACATGAAAAGACATTCGAGAAACTCATTCTCAAGAACAAAGGTCCAAAGGGGTCTCGTGTCAGGGCAATTCTTCACTCTCAAAGTCGTGACATGTGGTCTCCAACCGCTCCTTCTCCTCCACCCACATATGAAGATGGATCCTCAGATGAATGGGATCAGCAACAACTGCACAGCCTCAACCACCTGCATACACCTTCTGTCCCCCTGAGGGCCCCCAGGACATCCCCACCCCAACAACTCTCCCCAAAACCGACATCCACAACCCAACCCCTCCCACAACTCACACAACCAAACAAGCCCCAAGAACTCTCCAAGTAGACACTTGACAGCCCCCACCAATTACTTTTAGATCATAAAAAAC

将重组质粒转化至大肠杆菌感受态细胞中，筛选阳性克隆并进行质粒提取。

采用EcoRI限制性内切酶对提取的质粒进行酶切线性化处理，随后进行柱回收线性化质粒，并测定线性化质粒的浓度，即得阳性质粒标准品。

实施例3 qPCR检测方法

1.待测样品准备

待测样品为qPCR反应的检测样品，根据待测样品的不同，对待测样品进行处理以满足qPCR反应的需求。

当待测样品为昆虫细胞中弹状病毒等RNA病毒时，通过RNA提取、反转录反应等步骤，获得的产物（cDNA）用于后续qPCR反应，待测样品具体的处理步骤如下所示：

1.1.RNA提取

采用核酸提取试剂盒（宿主细胞残留DNA样本前处理试剂盒，湖州申科生物技术股份有限公司，货号为SK030203D100），从待测样品中提取弹状病毒的RNA。

1.2.反转录反应

采用反转录试剂盒（HiScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit (+gDNAwiper)，南京诺唯赞生物科技股份有限公司，货号为R212-02），将提取的RNA反转录为互补DNA（cDNA），所得cDNA作为后续qPCR反应的模板。

1.2.1基因组DNA去除

按照表1配制混合液，混合液用移液器轻轻吹打混匀，并在42℃条件反应下2 min。

表1 反转录反应液

1.2.2 第一链cDNA合成

按照表2配制第一链cDNA合成反应液，混合液用移液器轻轻吹打混匀，并依次在50℃条件反应下15min，在85℃条件反应下2min，获得cDNA。

获得的产物（cDNA）可立即用于qPCR反应，或在-20℃保存，并在半年内使用；如长期存放需要分装后在-70℃保存。cDNA应避免反复冻融。

表2 第一链cDNA合成反应液

2.标准曲线制备

将实施例2中制备的阳性质粒标准品（线性化质粒），浓度稀释至1ng/μL，然后按照10倍系列稀释法进行稀释构建标准曲线，具体稀释浓度如表3所示。

表3 标准曲线稀释浓度表

3. qPCR反应体系

将步骤1.2.2获得的产物cDNA和实施例2获得的阳性质粒标准品分别作为模板进行qPCR反应：

qPCR反应液配制：按照表4，将实施例1中制备的上游引物（Primer-F）、下游引物（Primer-R）、探针（Probe），qPCR反应预混液（Probe Master Mix）以及水混合，配置15µL的qPCR反应液；

将步骤1.2.2获得的cDNA和实施例2获得的阳性质粒标准品分别作为模板，在qPCR仪中进行扩增与检测。

具体为：在八联排中分别加入15µL的qPCR反应液以及5µL的阳性质粒标准品（实施例2中制备）或5µL的待测样品（步骤1.2.2获得的cDNA）（也就是同一个待测孔内为包括15µL的qPCR反应液和5µL的阳性质粒标准品，或者为15µL的qPCR反应液和5µL的待测样品），将八联排瞬时离心后放入定量PCR仪中运行。上机前开机预热，打开ABI7500 SDS v1.5.1软件，创建空白新程序，选择绝对定量检测，分别设置detector Rhab-M，报告荧光为FAM，猝灭荧光基团为none；分别设置样品名称及样品分组、标准品(质粒)及标准品含量。标准品设置为Standard；NTC：No template control=NTC；样品孔设置为Unknown。设置qPCR反应程序。

其中，qPCR反应液如表4中所示：

表4 qPCR反应液

备注：2×Probe Master Mix来源于南京诺唯赞生物科技股份有限公司的Taq ProHS Universal U+ Probe Master Mix，货号为QN114-01。

qPCR反应程序设置如下：

37℃，2min（37℃预孵育2min）；95℃预变性2min；95℃/10s（95℃变性10s），60℃/31s(60℃退火延伸31s)，45个循环；反应体积20μL。

4. 数据分析与结果判定

qPCR反应结束后，仪器自动记录各反应孔的循环阈值（Ct值）或循环次数（Cq值）。

根据阳性质粒标准品的检测结果绘制标准曲线，标准曲线如图1所示。

根据待测样品的检测结果，通过标准曲线计算待测样品中的病毒拷贝数（copies）。

若待测样品出现明显的扩增曲线，且Ct值不高于38，并能报告明确的拷贝数（copies），则判定该样品为弹状病毒阳性。

若待测样品未出现明显扩增曲线，或Ct值高于38，或无Ct值或拷贝数（copies）报告，则判定该样品为弹状病毒阴性。

对于Ct值接近临界值（如38左右）的待测样品，进行复测以确认结果。

实施例4 qPCR检测方法的特异性分析

分别以商业化的CHO DNA样品（CHO DNA样品来源于湖州申科生物技术股份有限公司的CHO残留DNA检测试剂盒（PCR-荧光探针法）中的CHO DNA定量参考品，货号为SK030201C100）、阳性质粒标准品加标样品(10000copies/反应，制备参见实施例2)作为待测样品，采用实施例3中qPCR检测方法获得检测结果后进行特异性分析，检测结果如图2和表5所示。

表5 qPCR检测方法的特异性分析结果

从图2和表5中可知，待测样品阳性质粒标准品加标样品(10000 copies/反应)出现明显的扩增曲线，待测样品阳性质粒标准品加标样品的Ct值为29.77，根据标准曲线计算拷贝数（copies）为9.99×10³ copies/反应，该结果满足“待测样品出现明显的扩增曲线，且Ct值不高于38，并能报告明确的拷贝数（copies）”，判定该待测样品为弹状病毒阳性。

待测样品CHO DNA样品未出现特异性扩增曲线，该结果满足“待测样品未出现明显扩增曲线，或Ct值高于38，或无Ct值或拷贝数（copies）报告”，判定该样品为弹状病毒阴性。

综上，表明该方法具有良好的特异性。

实施例5 qPCR检测方法的准确性分析

采用加标回收实验评价本检测方法的准确性。具体操作如下：

取待测样品，按照实施例3中qPCR检测方法中提取基因组RNA，并通过反转录试剂盒将提取的RNA反转录为互补DNA（cDNA），获得待测样品cDNA。

1.待测样品准备

取待测样品，按照实施例3中描述的qPCR检测方法提取基因组RNA，并反转录获得待测样品的cDNA。

2.加标

在上述cDNA样品中分别加入不同浓度的阳性质粒标准品（具体制备过程参照实施例2），加标浓度（加入DNA标准品（阳性质粒标准品）的浓度，简称加标浓度）设置为：1.0×10⁵ copies/反应、1.0×10⁴ copies/反应、1.0×10³ copies/反应、5×10² copies/反应、2.5×10² copies/反应、1.0×10² copies/反应。每个加标浓度水平设置3个平行反应管，以确保数据的重复性和可靠性。

3.qPCR检测

按照实施例3中描述的qPCR反应体系和程序进行检测。

4.结果计算

根据标准曲线计算各加标样品中的实际检测拷贝数（copies），并计算回收率，以评价该方法的准确度。

检测结果如表6所示。

表6 qPCR检测方法的准确性分析结果

从表6可知，当质粒DNA加标浓度为1.0×10²-1.0×10⁵copies/反应时，加标回收率范围为59.0%-143.3%，均在的可接受范围（50.0%-150.0%）内。结果表明，在该浓度范围内，本检测方法具有良好的准确度。

根据检测结果，本检测方法的准确度符合可接受标准的最低加标浓度（LOQ），经过验证，本检测方法的LOQ为1.0×10² copies/反应（即20copies/μL）。

实施例6 qPCR检测方法的重复性分析

采用加标回收实验评价本检测方法的重复性。具体操作如下：

1.待测样品准备：

2.加标：

在上述cDNA样品中分别加入不同浓度的阳性质粒标准品，加标浓度（加入DNA标准品的浓度，简称加标浓度）设置为：1.0×10⁵ copies/反应、1.0×10⁴ copies/反应、1.0×10³ copies/反应、5×10² copies/反应、2.5×10² copies/反应、1.0×10² copies/反应。每个加标浓度水平设置3个平行反应管，以确保数据的重复性和可靠性。

3.qPCR检测：

在不同实验时间，由不同实验人员按照实施例3中描述的qPCR反应体系和程序进行检测，考察该检测方法的重复性。

4.结果计算：

根据标准曲线计算各加标样品中的实际检测拷贝数（copies），并计算回收率，以评价该方法的重复性。

检测结果如表7所示。

表7 qPCR检测方法的重复性分析结果

从表7可知，本检测方法，在不同实验时间和操作人员条件下，各加标浓度水平的RSD%均小于30%，符合分析方法验证中关于重复性的可接受标准（通常要求RSD%≤30%）。尤其是在低浓度（如1.0×10² copies/反应）和高浓度（如1.0×10³-1.0×10⁵ copies/反应）下，RSD%分别为5.2%和1.7-8.1%，表明本qPCR检测方法在不同浓度范围内均表现出良好的重复性。

此外，从实施例1-实施例6可知，本申请的质粒标准品的标准曲线范围为20-2×10⁷ copies/μL，确保了qPCR检测的特异性、准确性和重复性。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本申请的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本申请的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本申请的限制，本领域的普通技术人员在本申请的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims

1.一种用于检测弹状病毒的qPCR引物探针组合物，其特征在于，

所述qPCR引物探针组合物包括引物对和探针；

所述引物对包括SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，所述探针包括SEQ IDNo.3所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的qPCR引物探针组合物，其特征在于，

所述探针含有荧光基团和/或淬灭基团。

3.一种用于检测弹状病毒的靶序列，其特征在于，所述靶序列包括SEQ ID NO.4或SEQID NO.5所示的核苷酸序列。

4.权利要求1-2任一项所述的qPCR引物探针组合物或权利要求3所述的靶序列在制备弹状病毒的检测试剂盒中的应用。

5.一种检测弹状病毒的qPCR试剂盒，其特征在于，所述qPCR试剂盒包括权利要求1或2所述的qPCR引物探针组合物。

6.根据权利要求5所述的qPCR试剂盒，其特征在于，所述qPCR试剂盒还包括阳性标准品。

7.一种权利要求5或6所述的qPCR试剂盒的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：

合成qPCR引物探针组合物中的引物对和探针；

构建阳性质粒标准品，得到所述检测弹状病毒的qPCR试剂盒。

8.一种检测弹状病毒的方法，其特征在于，所述方法包括检测靶序列，所述靶序列包含SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列。

9.一种检测弹状病毒的方法，其特征在于，其包括如下步骤：

使用权利要求1或2所述的qPCR引物探针组合物，和/或权利要求5或6所述的qPCR试剂盒，对待测样品进行qPCR检测，根据扩增曲线和Ct值判断待测样品中是否含有弹状病毒；

所述引物探针组合物中引物对的终浓度为8-12µmol/L，所述引物探针组合物中探针的终浓度为8-12µmol/L。

10.权利要求1或2所述的检测弹状病毒的qPCR引物探针组合物、权利要求3所述的检测弹状病毒的靶序列、权利要求5或6所述的检测弹状病毒的qPCR试剂盒或权利要求8或9所述的检测弹状病毒的方法中的任意一种或至少两种的组合在弹状病毒检测中的应用。