CN120648809A

CN120648809A - 一种与鸭乌骨性状相关的kit基因错义突变及其应用

Info

Publication number: CN120648809A
Application number: CN202510808292.XA
Authority: CN
Inventors: 侯卓成; 赵强森; 尹忠涛
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2025-06-17
Filing date: 2025-06-17
Publication date: 2025-09-16

Abstract

本申请提供了一种与鸭乌骨性状相关的KIT基因错义突变及其在鸭乌骨形状鉴定和育种中的应用，以CAU_Wild_1.0，Ensembl ID:ASM874695v1的参考基因组计算，该突变位于4号染色体48,845,947处，为T>C突变。本发明首次揭示了乌骨表型的关键遗传因素，为理解鸭黑色素沉积的分子机制提供了新的见解；基于本申请的突变，可以在鸭的任何生长阶段进行乌骨性状的基因型鉴定，大大缩短了育种周期；本申请的突变作为鸭乌骨性状分子标记辅助选择的有效工具，提高选育的准确性和效率，有助于乌骨鸭种质资源的保护、改良和利用。

Description

一种与鸭乌骨性状相关的KIT基因错义突变及其应用

技术领域

本申请属于分子标记育种领域和家禽养殖领域，具体地，本申请提供了一种与鸭乌骨性状相关的KIT基因错义突变及其应用。

背景技术

乌骨性状(黑色素沉积，如乌皮、乌肉、乌骨等)在部分家禽品种中是一种重要的经济性状和品质特征，深受特定消费群体的喜爱。玉林乌鸭作为一种具有代表性的乌骨型鸭种，其全身乌黑的表型特征稳定遗传。目前，地方育种工作者主要通过表型观察进行乌骨性状的选育，这种传统选育方法周期长、效率相对较低，且难以从分子层面精确控制和改良该性状。

黑色素的合成和沉积是一个复杂的生物学过程，受多基因调控。KIT基因(酪氨酸激酶受体基因)是已知的参与黑色素细胞发育、迁移和功能维持的关键基因之一，其变异在多种动物的毛色、肤色和羽色变异中发挥重要作用。然而，在鸭中，特别是针对玉林乌鸭这一特定品种，其乌骨表型的精确分子遗传机制尚未完全阐明，缺乏直接有效的分子标记用于早期鉴定和辅助育种。

因此，开发一种能够准确、快速鉴定与玉林乌鸭乌骨性状相关的分子标记，对于提高选育效率、保护和利用地方特色鸭种资源具有重要意义。

发明内容

本发明旨在解决现有技术中对玉林乌鸭乌骨性状遗传基础认识不清，缺乏精确分子标记用于早期鉴定和辅助选育的问题。具体而言，本发明致力于鉴定导致玉林乌鸭乌骨表型的关键基因突变，并提供基于该突变的分子检测方法和应用。

为解决上述技术问题，本发明通过对玉林乌鸭及其他参考鸭种(23个品种，466只鸭)进行大规模多品种的群体GWAS和选择信号分析，确定了一个与玉林乌鸭全身乌黑表型显著关联的错义SNP突变：

物种：鸭(Anas platyrhynchos)，位于4号染色体约48.5±1Mb处，具体位点Chr4:48,845,947(参考基因组版本：CAU_Wild_1.0，Ensembl ID:ASM874695v1；基因：KIT(KITproto-oncogene,receptor tyrosine kinase，ENSAPLG00020011541，4:48,832,997-48,885,352reverse strand.)；突变类型：错义突变；核苷酸变异：T->C(野生型为T，突变型为C)；关联表型：乌骨性状(黑色素沉积，全身乌黑，如乌皮、乌肉、乌骨等)。

通过VEP对显著SNP 4:48,845,947的突变效应进行预测，结果显示该SNP(T->C)为KIT基因第十二号外显子(转录本ENSAPLT00020017224.1)或第十一号外显子(转录本ENSAPLT00020017227.1)上的错义突变。该T->C突变导致KIT蛋白相应位置的氨基酸由酪氨酸(Tyrosine,Y)变为半胱氨酸(Cysteine,C)(分别为第462位或第542位氨基酸，取决于转录本)。群体基因型分析显示，玉林乌鸭中该突变等位基因(C等位基因)频率高达80.65％，显著高于其他鸭种(0.90％)(χ²＝661.04,P<0.001)。在玉林乌鸭群体中，87％的个体携带该变异位点(基因型为TC或CC)，且这些个体均表现出典型的乌骨表型。

该发生突变的氨基酸位点在23种脊椎动物中高度保守，均为酪氨酸，暗示其重要的功能意义。KIT基因跨膜结构域预测分析显示，该氨基酸突变位点位于跨膜结构域的关键功能区域，可能影响KIT蛋白的跨膜信号传导，进而导致色素异常。

一方面，本申请提供了一种与鸭乌骨性状相关的KIT基因错义突变，以CAU_Wild_1.0，Ensembl ID:ASM874695v1的参考基因组计算，该突变位于4号染色体48,845,947处，为T>C突变。

另一方面，本申请提供了检测上述突变的试剂在制备鉴定鸭乌骨性状的试剂盒中的应用。

另一方面，本申请提供了检测上述突变的试剂在制备选育乌骨性状鸭的试剂盒中的应用。进一步地，所述检测上述突变的试剂包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示的引物组。

进一步地，所述检测上述突变的试剂还包括探针。

检测突变位点的方法本领域技术人员公知，包括但不限于扩增含突变位点的片段后进行sangger测序的方法、Taqman探针法、ARMS-PCR法、HRM法、CAPS法、SnaPshot法、KASP法、芯片法、质谱法等，在已知突变位点位置、周边序列信息、突变方式的情况下，本领域技术人员可以常规设计出这些方法对应的检测试剂和步骤、参数。

另一方面，本申请提供了鉴定鸭乌骨性状的的方法，所述方法包括检测待测样本鸭在上述突变位置的基因型，如果待测样本鸭携带C等位基因，则将待测样本鸭鉴定为倾向于表现乌骨性状。

另一方面，本申请提供了乌骨性状鸭分子标记辅助育种的方法，所述方法包括检测育种候选鸭在上述突变位置的基因型，并选择携带C等位基因的育种候选鸭作为亲本进行繁育。

进一步地，上述方法中包括提取待测样本或者育种候选鸭基因组DNA的步骤。

进一步地，所述方法包括使用核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物组扩增基因组DNA的步骤以及sanger测序步骤。

进一步地，使用核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物组扩增基因组DNA的步骤中PCR反应体系为：模板DNA 50-100ng，10μM的正向引物0.5μL，10μM的反向引物0.5μL，2x Taq PCR MasterMix 12.5μL，ddH₂O补足至25μL；PCR程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55-60℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃终延伸5min。

具体PCR体系和条件，本领域技术人员可以根据实际试剂、设备、检测要求等因素调整，并不局限于上述体系和参数。

有益效果：

科学性与精确性：本发明首次揭示了玉林乌鸭KIT基因中的一个特定错义突变(Chr4:48,845,947,T->C)是导致其乌骨表型的关键遗传因素，为理解鸭黑色素沉积的分子机制提供了新的见解。

高效性与早期性：基于该SNP位点的分子检测方法，可以在鸭的任何生长阶段(如早期胚胎、雏鸭)进行乌骨性状的基因型鉴定，无需等待表型显现，大大缩短了育种周期。

育种应用价值：该SNP可作为玉林乌鸭及其他相关鸭种乌骨性状分子标记辅助选择的有效工具，提高选育的准确性和效率，有助于乌骨鸭种质资源的保护、改良和利用。

品种鉴定：该SNP位点的高频率差异性使其可用于辅助区分玉林乌鸭与其他非乌骨鸭种，或用于玉林乌鸭种质纯度的评估。

附图说明

图1为玉林乌鸭乌骨表型特征图。

图2为色素合成通路示意图。

图3A为玉林乌鸭与绿头野鸭比较的选择信号分析结果(三种扫描方法结果)。

图3B为玉林乌鸭与绿头野鸭比较的选择信号分析结果(三种扫描方法结果比较)。

图4A为玉林乌鸭与北京鸭比较的选择信号分析结果(三种扫描方法结果)。

图4B为玉林乌鸭与北京鸭比较的选择信号分析结果(三种扫描方法结果比较)。

图5为GWAS结果图。

图6为显著关联区域的单倍型分析图。

图7为连锁不平衡分析及SNP定位图。

图8为SNP 4:48,845,947在不同鸭群体中的基因型频率分布图。

图9为KIT基因突变氨基酸位点在脊椎动物中的保守性分析图。

图10为KIT蛋白跨膜结构域预测及突变位点示意图。

具体实施方式

以下实施例便于更好地理解本发明，但不限于此，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制发明的保护范围。

实施例1：玉林乌鸭乌骨性状关联SNP的筛选与鉴定

样品收集与DNA提取：

收集55只北京鸭(白色羽毛参照)、15只鲁昂鸭、31只玉林乌鸭(典型乌骨表型)、13只龙胜翠鸭、10只文桥鸭、20只绍兴鸭、13只金定鸭、15只连城白鸭、16只山麻鸭、16只印度跑鸭、10只银苹果鸭、20只威尔士小丑鸭、19只萨克森鸭、6只裸颈鸭、12只奉化水鸭、12只枞阳媒鸭、9只东兰麻鸭、10只靖西大麻鸭、10只西林麻鸭、10只融水香鸭、8只高邮鸭、10只玉林麻鸭、125只绿头野鸭(野生型参照)的血液或组织样本，共466只鸭。采用商品化DNA提取试剂盒提取基因组DNA。

全基因组重测序：

从上述群体的血液样本中提取基因组DNA。使用Illumina TruSeq DNA样品制备试剂盒至少提取5g DNA用于文库构建。DNA分离采用DNeasy血液与组织试剂盒。

纯化的基因组DNA使用Bioruptor进行片段化，并在3'端添加接头。随后，使用Thermal Cycler S1000(Bio-Rad)进行扩增。纯化的文库使用Step One Plus进行质量控制。最后，使用NovaSeq 6000平台生成成对末端测序数据。从血液中提取DNA，并对提取的DNA质量进行检测。对提取的DNA进行文库构建和高通量测序。

选择信号分析：

将群体中的31只玉林乌鸭的重测序数据分别与35只绿头野鸭和28只北京鸭的重测序数据进行比较。采用XP-CLR、π_ratio和F_ST三种方法进行选择信号扫描。

结果：

与绿头野鸭比较，NRAS、ADCY8、KIT、HRAS、MC1R基因受到强烈选择；与北京鸭比较，KIT、ADCY8、WNT3A、HRAS基因受到强烈选择。KIT基因在两组比较中均显著。

全基因组关联分析(GWAS)：

剔除不合格数据后，以玉林乌鸭的乌骨(31只)/非乌骨(423只，22个品种，包括绿头野鸭、枞阳媒鸭、奉化水鸭、山麻鸭、融水香鸭、西林麻鸭、靖西大麻鸭、东兰鸭、文桥鸭、金定鸭、玉林麻鸭、高邮鸭、绍兴鸭、龙胜翠鸭、连城白鸭、玉林乌骨鸭、印度跑鸭、银苹果鸭、裸颈鸭、萨克尼鸭、威尔士小丑鸭、鲁昂鸭、北京鸭)作为表型，进行GWAS分析。结果：在鸭4号染色体48.5±1Mb区域检测到显著关联的信号峰(如图5)。

精细定位与因果变异预测：

对GWAS显著区域内的SNP进行单倍型分析和连锁不平衡分析。结果：发现显著连锁的单倍型块，其中第一个SNP(Chr4:48,845,947)位于KIT基因第十二号外显子(或第十一号，取决于转录本)，为T->C的错义突变(如图7)。VEP分析预测该突变导致KIT蛋白Y462C或Y542C(如图8)。

实施例2：SNP 4:48,845,947在不同鸭群体中的基因型验证

群体验证：

对包含31只玉林乌鸭在内的466只鸭在该位点重测序SNP分型结果进行统计分析。

结果：

玉林乌鸭群体中，突变型C等位基因频率为80.65％，基因型主要为CC(23个个体)和TC(4个个体)，且携带C等位基因的个体均表现为乌骨表型。其他鸭种中C等位基因频率仅为0.9％(如图8)。

实施例3：利用SNP Chr4:48,845,947进行乌骨鸭辅助育种

候选群体基因型鉴定：

在一个待选育的鸭群体中(可以是玉林乌鸭保种群或含有乌骨基因的其他杂交群体)，采集雏鸭血液样本，提取DNA。

SNP检测：

引物设计与PCR扩增：根据鸭KIT基因在SNP Chr4:48,845,947位点周围的序列，设计PCR引物，扩增包含该SNP位点的DNA片段。

上游引物(仅作示例，不限于此)：5'-[CCCCAGGTAAGCATGAGCAAT]-3'(SEQ IDNO.1)；

下游引物(仅作示例，不限于此)：5'-[ATTTGGAGTTGCTGCTGGACT]-3'(SEQ IDNO.2)；基因分型：

对PCR产物进行Sanger测序，直接读取SNP Chr4:48,845,947位点的核苷酸序列(也可以设计KASP探针、TaqMan探针等进行高通量基因分型)。

选择与配种：

优先选择基因型为CC的个体作为核心育种群；其次选择基因型为TC的个体，并尽量使其与CC个体配种，以提高后代中CC基因型频率；避免或淘汰基因型为TT的个体用于乌骨性状的选育。

后效评估：

跟踪后代表现，评估分子标记辅助选择的效果，持续优化育种方案。

实施例4：SNP Chr4:48,845,947检测方法的建立(以Sanger测序为例)

样本准备：

取鸭个体血液0.5-1ml，或肌肉/皮肤组织约25mg，或羽毛根部(带毛囊)3-5根。

DNA提取：

使用血液/组织/毛囊基因组DNA提取试剂盒(如QIAGEN DNeasy Blood&TissueKit)提取基因组DNA。OD260/280值测定DNA浓度和纯度。

PCR扩增：

设计针对KIT基因SNP 4:48,845,947所在区域的PCR引物。例如，根据已发表的鸭基因组序列(如ENSAPLG00020011541基因对应区域)，设计扩增片段长度约300-500bp的引物(例如实施例3中所示引物)。

PCR反应体系(25μL)：模板DNA(50-100ng)，正向引物(10μM)0.5μL，反向引物(10μM)0.5μL，2x Taq PCR MasterMix 12.5μL，ddH₂O补足至25μL。

PCR程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，55-60℃(根据引物Tm值优化)退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃终延伸5min。

PCR产物纯化与测序：PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，送商业测序公司进行双向Sanger测序。

结果果分析：将测序结果与参考序列比对，确定SNP Chr4:48,845,947位点的基因型(T/T,T/C,或C/C)。

验证：在包含31只玉林乌鸭的共94只鸭群体中进行验证与分析，基因型为T/C和C/C的鸭都为乌骨性状，T/T型都为正常表型(非乌骨性状)。

Claims

1.一种与鸭乌骨性状相关的KIT基因错义突变，其特征在于，以CAU_Wild_1.0，EnsemblID:ASM874695v1的参考基因组计算，所述突变位于4号染色体48,845,947处，为T>C突变。

2.检测根据权利要求1所述突变的试剂在制备鉴定鸭乌骨性状的试剂盒中的应用。

3.检测根据权利要求1所述突变的试剂在制备选育乌骨性状鸭的试剂盒中的应用。

4.鉴定鸭乌骨性状的的方法，其特征在于，所述方法包括检测待测样本鸭在根据权利要求1所述突变位置的基因型，如果待测样本鸭携带C等位基因，则将待测样本鸭鉴定为倾向于表现乌骨性状。

5.乌骨性状鸭分子标记辅助育种的方法，所述方法包括检测育种候选鸭在根据权利要求1所述突变位置的基因型，并选择携带C等位基因的育种候选鸭作为亲本进行繁育。

6.根据权利要求7所述的方法，所述方法中包括提取待测样本或者育种候选鸭基因组DNA的步骤。