CN120603956A - 用于酶试剂的喷墨递送的可变粘度油墨 - Google Patents

Abstract

本发明涉及使用可变粘度改性剂的末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)油墨的制剂，以及它们在基底上的反应位点喷墨辅助合成多个多核苷酸的用途。

Description

用于酶试剂的喷墨递送的可变粘度油墨

喷墨打印是一种用于以最少的浪费将限定量的液体非接触地递送至精确位置的低成本的多用途技术。该技术已被应用于使用亚磷酰胺化学的寡核苷酸微阵列合成，并且已被用于在基于酶的生物传感器的生产中将酶直接打印到基底上。对于喷墨打印的后一种应用，已经观察到酶活性不仅受到剪切力和液滴形成的流变要求的影响，而且还受到当例如含酶流体被打印到微阵列时，蒸发损失导致的酶浓度和缓冲条件变化的影响。

近来，人们对将基于酶的多核苷酸合成应用于不适于常规基于化学的DNA合成的问题感兴趣，尤其是因为酶促过程的温和水性反应条件。已经观察到，目前在打印液滴形成的所需油墨粘度值与喷墨递送后有效实施酶促过程的所需粘度值之间存在折衷。也就是说，针对液滴形成而优化的油墨粘度目前对于酶活性是次优的，并且反之亦然。

发明内容

本发明涉及包含可变粘度改性剂的油墨，用于将酶喷墨递送至反应位点。

在一方面，本发明涉及使用这种油墨酶促合成多个多核苷酸的基于喷墨的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供在多个反应位点具有引发剂(initiator)的基底，其中每个引发剂具有游离3’-羟基，并且其中所述多个多核苷酸中的每个多核苷酸被指派到(assigned to)反应位点用于合成；(b)通过一个或多个喷墨泵将至少一种合成试剂的至少一个液滴分配到所述多个反应位点中的每个反应位点以进行反应循环，所述反应循环包括以下步骤：(i)在延伸条件下，使具有游离3’-O-羟基的引发剂或延伸片段与3’-O保护的核苷三磷酸和无模板聚合酶反应，使得所述引发剂或延伸片段通过掺入3’-O保护的核苷三磷酸而延伸，以形成3’-O保护的延伸片段，以及(ii)使所述延伸片段脱保护以形成具有游离3’-羟基的延伸片段，其中所述合成试剂包含无模板聚合酶、3’-O保护的核苷三磷酸、无模板聚合酶和3’-O保护的核苷三磷酸的混合物或脱保护溶液；其中所述至少一种合成试剂包含可变粘度改性剂，所述可变粘度改性剂在所述一个或多个喷墨泵处形成所述至少一个液滴期间具有大于2 mPa.s的第一粘度，并且在所述反应循环的反应步骤期间在所述多个反应位点中的每个反应位点处具有小于或等于2 mPa.s的第二粘度；以及(c)重复步骤(b)，直到合成所述多个多核苷酸；其中所述第一粘度和第二粘度不同。在一些实施方案中，所述基底是平面基底。

在另一方面，本发明涉及用于喷墨打印的无模板聚合酶油墨，其包含：水溶液，所述水溶液包含浓度为1.0 μM至30 μM的无模板聚合酶；其中每当所述油墨被打印到基底上时，所打印的液滴各自具有所述水溶液的0.1pL至5nL的体积，并且其中所述油墨包含可变粘度改性剂，所述可变粘度改性剂在每当温度为5-30℃时具有2-20 mPa.s的第一粘度，以及在每当温度为35-60℃时具有1-2 mPa.s的第二粘度；其中所述第一粘度和所述第二粘度不同。

附图简要说明

图1A包含酶促合成循环的示意图，其中3’-O保护的dNTP被添加到核酸链中，然后脱保护。

图1B示出了可以用作合成支持物的具有疏水-亲水图案化表面的液滴微阵列。

图2A至图2C示出了本发明的四个不同实施方案的合成循环。

图3示出了本发明的一个实施方案，其中使用喷墨仪器限定阵列上的反应位点，以消除将喷墨递送与预形成的反应位点对准的问题。

图4A示出了用于本发明的示例性喷墨系统的组件，图4B示出了用于实施本发明的几个实施方案的喷墨仪器。

图5示出了用于评估基于喷墨的酶促合成效率的技术，其可以用于选择可变粘度改性剂。

图6示出了该示例在不同温度下粘度的变化。

图7示出了在不同温度下储存的延伸油墨的稳定性。

图8示出了用手动EDS进行的10个循环poly(T)的结果。

具体实施方式

虽然本发明可以进行各种修改和替代形式，但是其细节已经通过附图中的示例示出并将被详细描述。然而，应当理解，目的并非是将本发明限制到所描述的特定实施方案。目的是覆盖落入本发明的精神和范围的所有修改、等同物和替代物。针对选择材料和组件以执行特定功能的指导可以在关于科学仪器的可用论文和参考文献中找到，包括但不限于Moore et al, Building Scientific Apparatus, Third Edition (Perseus Books,Cambridge, MA); Hermanson, Bioconjugate Techniques, 3rd Edition (AcademicPress, 2013)以及类似的参考文献。

在一方面，本发明涉及用于在通过喷墨形成的液滴中递送含酶试剂的油墨，以及使用这种油墨来酶促合成多核苷酸的方法。这种油墨包含至少一种可变粘度改性剂，所述改性剂能够在液滴形成过程中在打印头的喷嘴处表现出第一粘度，并且在递送后在反应位点处表现出用于进行酶促过程的第二粘度。通常，可变粘度改性剂在液滴形成过程中在喷嘴处以及在液滴递送后实施酶促过程时在反应位点处响应于不同的物理条件，例如温度，表现出不同的粘度值。在一些实施方案中，打印头的喷嘴保持在比反应位点的温度更低的温度，并且使用具有随着温度升高而单调降低的粘度的可变粘度改性剂。在其它实施方案中，打印头的喷嘴保持在比反应位点的温度更高的温度，并且使用具有随着温度的升高而单调增加的粘度的可变粘度改性剂。在其它实施方案中，使用具有剪切增稠(或膨胀(dilatant))性质的可变粘度改性剂，使得液滴形成条件诱导2-20 mPa.s的粘度，并且反应位点处的条件诱导1-2 mPa.s的粘度。

粘度随温度升高而降低的可变改性剂可以包括在选定浓度和选定温度范围的常规粘度改性剂。这样的常规粘度改性剂包括但不限于乙二醇、聚乙烯醇、二甲基亚砜(DMSO)、聚乙二醇(PEG)、聚乙二醇甲基醚(OMe)PEG、聚乙二醇二甲醚(OMe)₂PEG、羧甲基纤维素、羟乙基纤维素等。本发明的油墨中的可变粘度改性剂的选定浓度包括但不限于溶液体积的5-50%，优选溶液体积的20-40%。选定的温度范围包括但不限于至少一个喷墨泵的15℃或更低、或12℃或更低、或10℃或更低的温度。

粘度随着温度的升高而降低的可变粘度改性剂还可以包括热可逆聚合物，优先未交联的，掺入聚(N-烷基取代的丙烯酰胺)的组合物，优先未交联的，例如Sassi et al,Electrophoresis, 17: 1460-1469 (1996); Schild, Prog. Polymer Sci., 17: 163-249 (1992)等。例如，聚(N-异丙基丙烯酰胺)聚合物的可变粘度性质可以通过选择分子量、浓度和合适的共聚单体来容易地改性(例如SigmaAldrich, Technical Bulletin,“Designing temperature and pH sensitive NIPAM based polymers;” Plate et al,Polymer Journal, 31(1): 21-27 (1999))。

在一些实施方案中，可以配制包含未交联的聚(N-烷基取代的丙烯酰胺)的无模板聚合酶油墨，所述未交联的聚(N-烷基取代的丙烯酰胺)每当温度在5-30℃时具有2-20mPa.s的第一粘度，并且每当温度在35-60℃时具有1-2 mPa.s的第二粘度。

粘度随着温度的升高而增加的可变粘度改性剂可以包括聚(环氧乙烷)-聚(环氧丙烷)-聚(环氧乙烷)三嵌段聚合物，例如F127，例如Wu et al, Electrophoresis, 19:231-241 (1998); Rill et al, Proc. Natl. Acad. Sci., 95: 1534-1539 (1998)等。聚(环氧乙烷)-聚(环氧丙烷)-聚(环氧乙烷)三嵌段聚合物的可变粘度性质可以通过选择分子量、浓度和合适的共聚单体容易地改性。在一些实施方案中，可以配制包含未交联的聚(环氧乙烷)-聚(环氧丙烷)-聚(环氧乙烷)三嵌段聚合物的无模板聚合酶油墨，所述未交联的聚(环氧乙烷)-聚(环氧丙烷)-聚(环氧乙烷)三嵌段聚合物每当温度在35-60℃时具有2-20 mPa.s的第一粘度，并且每当温度在5-30℃时具有1-2 mPa.s的第二粘度。

在进一步的实施方案中，可变粘度改性剂可以包含剪切增稠剂或膨胀剂(dilatant)，包括但不限于Rheovis PU 1331、Rheovis PE 1330 (BASF)等。其它这样的可变粘度改性剂可以包括聚(N-异丙基丙烯酰胺)。选择浓度和温度，使得每当喷墨泵的喷嘴处的剪切力为105(s-1)或更大时，油墨粘度为3 mPa.s或更大。

在一些实施方案中，可以配制包含冷却时胶凝的聚合物溶液的无模板聚合酶油墨，所述聚合物溶液每当温度在5-30℃时具有2-20 mPa.s的第一粘度，并且每当温度在35-60℃时具有1-2 mPa.s的第二粘度。

在一些实施方案中，可变粘度改性剂可以包含冷却时胶凝的聚合物溶液。这种聚合物选自：具有UCST型相行为的疏水改性聚合物、天然聚合物、去嵌段共聚物刷接枝的二氧化硅纳米颗粒、聚(PEO-共-苯乙烯)，以及它们的组合中的至少一种。所述聚合物可以溶解在离子液体中或PNIPAM微凝胶和主-客体相互作用的溶液中。

在一些实施方案中，至少一种合成试剂溶液不含甘油。

在一些实施方案中，存在多于一种合成试剂溶液，每种溶液具有不同的可变粘度改性剂。

在一些实施方案中，具有可变粘度改性剂的油墨还可以包含如下所述的另外的组分，包括但不限于常规粘度改性剂、表面活性剂、湿润剂、醛清除剂等，如下所述。

在一些实施方案中，本发明涉及使用无模板聚合酶，例如末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)，进行多个多核苷酸各自在基底上的不同位点处的喷墨辅助合成的方法和组合物。通常，这种合成发生在包含平坦表面(例如，玻璃、二氧化硅、氧化硅、塑料等表面)的基底上，但也可以发生在其它表面上，例如，诸如生物组织或从组织中提取的表面固定的cDNA。如本文所用，“喷墨辅助合成”意指在由一个或多个喷墨泵产生的液滴中将一种或多种合成试剂递送至反应位点。

“合成试剂”包括在合成循环中用于将单体，特别是3’-O保护的核苷三磷酸偶联至引发剂或延伸片段的任何试剂，例如包含无模板聚合酶的缓冲液、包含3’-O保护的核苷酸单体的缓冲液、包含无模板聚合酶和一种或多种3’-O保护的核苷三磷酸的混合物的缓冲液、脱保护(或去封闭)缓冲液等。术语“脱保护”剂、缓冲液、溶液等在本文中分别与术语“去封闭”剂、缓冲液、溶液等同义使用。同样，有关化合物(例如dNTP)的术语“保护的”与有关化合物的术语“封闭的”同义使用。如本文所用，术语“脱保护溶液”(或其等效术语)意指引起或促进保护基团(例如核苷酸的3’-O保护基团)的去除的试剂。如以下更充分描述的，脱保护溶液(和脱保护反应条件)的组成取决于要除去的保护基团(或封闭基团)的性质。在各种实施方案中，脱保护溶液可以含有与保护基团和/或保护部分化学反应的特定试剂(例如还原剂，如TCEP(三(2-羧乙基)膦))、用于酶促切割的酶、清除剂、辅因子等。在一些实施方案中，脱保护溶液可以不包含与保护基团反应的特定试剂，但是，例如在光可切割的保护基团的情况下，可以包含与保护基团相容或促进保护基团的物理切割的组分，例如pH缓冲液。通常，在延伸多核苷酸片段的反应循环中，在脱保护步骤中，脱保护溶液与3’-O保护的延伸片段孵育预先确定的孵育时间。典型的孵育时间(即孵育步骤的持续时间)为1分钟至30分钟；或3分钟至30分钟；或3分钟至15分钟。典型的延伸反应温度为室温(RT)至80℃；或20℃至80℃；或20℃至60℃。

“合成试剂”还包括用于制备用于多核苷酸合成的基底的试剂，例如用于限定反应位点的试剂、引发剂、封端(capping)试剂等。通常，基底上的“不同反应位点”是离散的位点，因为它与其它反应位点分离；也就是说，例如图1B所例示的，离散的位点不具有与另一反应位点的边界，或不与另一反应位点重叠。换句话说，离散的或不同的反应位点不与其它反应位点邻接或重叠。这种通常布置的例外包括下面描述的用于在表面上产生高密度条形码的“重写(overwriting)”实施方案。

在一些实施方案中，多个多核苷酸可以为2至500000个；或100至400000个；或100至200000个；或100至100000个。多个多核苷酸的数量可以与多个反应位点的数量相同或不同。在一些实施方案中，多个反应位点的数量可以多于多个多核苷酸的数量。在一些实施方案中，上述多个反应位点各自具有与均匀沉积在与标准25mm×75mm显微镜载玻片的面积相当的面积上的密度相当的密度。在一些实施方案中，通过均匀沉积形成的反应位点的阵列可以是直线阵列；并且在其它实施方案中，通过均匀沉积形成的反应位点阵列可以是六边形阵列。

多核苷酸的无模板酶促合成的基本步骤如图1A所示，并在下文更全面地描述。简言之，合成方法包括通常涉及向反应位点递送至少一种以下试剂的步骤循环：包含无模板聚合酶的缓冲液，一种或多种各自包含一种或多种3’-O保护的dNTP (即单体)的缓冲液，脱保护缓冲液和洗涤溶液。在本发明的各种实施方案中，无模板聚合酶缓冲液，包含3’-O保护的dNTP单体的缓冲液，或脱保护缓冲液可以通过由喷墨泵产生和递送的液滴传送到反应位点。为了通过喷墨产生的液滴递送，这些试剂必须被配制为满足液滴形成的流变要求。这些制剂被称为“油墨”。影响液滴形成的关键流变参数是粘度、密度和表面张力，例如Derby,Annu. Rev. Mater. Sci., 40: 395-414 (2010); Derby, J. Mater. Chem., 18: 5717-57-21 (2008); Calvert, Chem. Mater., 13: 3299-3305 (2001); Tekin et al, SoftMatter, 4: 703-713 (2008)以及类似的参考文献。与液滴体积相关的另一个关键参数是喷墨泵的喷嘴直径。在一些实施方案中，用于本发明的喷嘴直径可以为10 μm至100 μm。因此，如下文更全面描述的，本发明的一个方面包括用于多核苷酸的无模板酶促合成的试剂油墨，并且特别是包含无模板聚合酶的油墨，特别是包含末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)的油墨或包含TdT和一种或多种3’-O保护的dNTP单体的油墨。在一些实施方案中，本发明的油墨可以包含多于一种3’-O保护的核苷三磷酸，在一些情况下，出于合成多核苷酸的随机序列片段的目的，例如出于创建多核苷酸标签或条形码的目的，可以包含所有四种单体类型。

根据本发明，多核苷酸的喷墨辅助酶促合成可以在各种实施方案(其中通过喷墨泵递送不同的试剂)中实施。在图2A至图2C中描述了这些实施方案中的一些。图2A示出了两个循环，其中包含无模板聚合酶和单一种类单体的液滴(或微滴)被递送至由基底上的缓冲液液滴包围的反应位点。反应位点(204)的表面包含引发剂寡核苷酸层(未示出)并且被基底(203)的疏水表面包围，这允许反应位点(204)被表面(203)上的一定体积(202)的水性液体包围，而不会扩散或与来自另一反应位点的液体聚结。图2A将引发剂描绘为具有带有游离3’-羟基(未显示)的3’-末端单体“A”。在图2A至图2C中，单体A、B和C各自意在表示任何3’-O保护的dNTP单体。油墨液滴(201)通过喷墨泵(未示出)分配到在反应位点(204)的体积(202)(或者，如果实施了干燥步骤则直接分配到反应位点(204))。油墨液滴(201)包含预先确定浓度的无模板聚合酶和预先确定浓度的单体B，还有针对聚合酶活性的盐和缓冲液组分，以及满足液滴形成流变要求所需的粘度改性剂和表面张力改性剂。液滴(201)还可以包含湿润剂以最小化蒸发损失。在一些实施方案中，每当使用3’-O-氨基-NTP时，液滴(201)可以还包含醛清除剂。液滴(201)在干燥的反应位点(207)上沉积或在未干燥的反应位点(221)上与体积(202)聚结，以在液滴(205)中形成反应混合物(206)，允许其孵育(208)预先确定时间以允许B单体偶联到引发剂的3’端(或在初始循环后先前延长或延伸的链)。在一些实施方案中，这种孵育在高于环境湿度下发生以防止在孵育步骤期间干燥。

在一些实施方案中，可以实施干燥反应位点的单独步骤以防止流体累积和/或与相邻反应位点处的反应混合物聚结。

在经过偶联反应的孵育时间后，将整个基底表面在脱保护缓冲液(210)中浸没或喷洒(209)预先确定的时间以允许去除保护基团，这在延伸的链的末端再生了游离3’-羟基。在经过预先确定的脱保护时间后，将整个基底表面在一种或多种洗涤缓冲液中浸没预先确定的时间一次或多次，以得到具有延长的或延伸的链或片段(显示为“-AB”)的反应位点(211)，其已准备好进行下一个偶联循环。

在一些实施方案中，如上所述，可以在脱保护和洗涤(213)之后实施干燥步骤，以便使液滴(211)扩散或与相邻液滴聚结的可能性最小化。可以使用喷墨打印中的常规干燥技术，热空气或气体、辐射干燥等，例如Hoynant et al, 美国专利8485096。

下一个循环的步骤与附接B单体的步骤相同，除了在下一个循环中偶联C单体。因此，可能除C单体的身份之外具有与液滴(201)相同组成的液滴(212)被分配到体积(211)中。如上所述，将液滴(215)中的反应混合物(214)孵育预先确定量的时间，在此之后用脱保护缓冲液和洗涤溶液(210)处理(218)整个基底，以得到具有延长链的反应位点(220)，显示为“-ABC”。

根据本实施方案和其它实施方案中基底(203)的性质，偶联循环还可以包括干燥步骤，以防止液滴扩散和在相邻反应位点之间聚结。如果反应位点(204)之间的基底(203)的表面足够疏水，则这种聚结的可能性是最小化的。

图2A的实施方案可以通过以下步骤进行：(a)提供在多个不同反应位点具有引发剂的基底，其中每个引发剂具有游离3’-羟基，并且其中多个核苷酸中的每个多核苷酸被指派到不同的反应位点用于合成；(b)通过一个或多个喷墨泵将包含含有无模板聚合酶和3’-O封闭的dATP、3’-O封闭的dCTP、3’-O封闭的dGTP或3’-O封闭的dTTP的混合物的缓冲溶液的至少一个液滴分配到每个反应位点，其中分配到反应位点的3’-O封闭的dNTP的种类取决于指派到反应位点的多核苷酸的预先确定序列；(c)在每个反应位点孵育无模板聚合酶和3’-O封闭的dNTP，使得通过掺入3’-O封闭的dNTP来延伸反应位点处的引发剂或延伸片段，以形成3’-O封闭的延伸片段；(d)通过用去封闭剂处理平面支持物，在每个反应位点将延伸片段去封闭以形成具有游离3’-羟基的延伸片段；(e)重复步骤(b)、(c)和(d)，直到合成多个多核苷酸。在一些实施方案中，在步骤(b)、(c)和(d)的每个循环期间将多个液滴递送至每个反应位点。在一些实施方案中，多个液滴为2至10个，或2至5个，或2至3个。在其它实施方案中，多个液滴可以为2至150个，或者10至120个。在一些实施方案中，实施从基底切割多个多核苷酸的进一步的步骤。

在一些实施方案中，基底是平面基底。

在一些实施方案中，可以在步骤(d)之后或在步骤(d)和洗涤步骤之后包括干燥步骤，以在分配下一个液滴时最小化液滴的扩散或聚结。

图2B说明了一个实施方案，其中单体和无模板聚合酶在不同的喷墨递送的液滴中被递送至反应位点。如上所述，反应位点(204)的表面包含用显示为“-A”的A单体终止的引发剂层。向体积(202)分配(250)包含无模板聚合酶的液滴(252)，在此之后分配(256)包含B单体的液滴(254)。在一些实施方案中，分配无模板聚合酶和单体的顺序可以颠倒，使得在循环内在分配无模板聚合酶之前分配单体。在将反应体积(265)孵育预先确定时间以允许B单体在反应位点(204)处与引发剂或延长链偶联之后，将基底的整个表面暴露(268)于脱保护缓冲液(267)并随后暴露于一种或多种洗涤缓冲液以得到具有延伸链“-AB”的反应位点(268)。下一个循环以相同的方式进行，除了添加C单体，即：分配包含无模板聚合酶的液滴(270)，分配包含C单体的液滴(272)以形成反应混合物(273)，孵育反应混合物(273)，脱保护和洗涤(276)以得到具有延长链“-ABC”的反应位点(278)。

图2B的实施方案可以通过以下步骤进行：(a)提供在多个不同的反应位点处具有引发剂的基底，其中每个引发剂具有游离3’-羟基，并且其中多个多核苷酸中的每个多核苷酸被指派到不同的反应位点用于合成；(b)通过一个或多个喷墨泵将包含含有无模板聚合酶的缓冲溶液的至少一个液滴分配到每个反应位点；(c)通过一个或多个喷墨泵将包含含有3’-O封闭的dATP、3’-O封闭的dCTP、3’-O封闭的dGTP或3’-O封闭的dTTP的缓冲溶液的至少一个液滴分配到每个反应位点，其中分配到反应位点的3’-O封闭的dNTP的种类取决于指派到反应位点的多核苷酸的预先确定序列；(d)孵育每个反应位点处的无模板聚合酶和3’-O封闭的dNTP，使得通过掺入3’-O封闭的dNTP来延伸反应位点处的引发剂或延伸片段，以形成3’-O封闭的延伸片段；(e)通过用去封闭剂处理平面支持物，在每个反应位点将延伸片段去封闭，以形成具有游离3’-羟基的延伸片段；(f)重复步骤(b)、(c)、(d)和(e)，直到合成多个多核苷酸。在一些实施方案中，在步骤(b)和(c)的每个循环期间将多个液滴递送至每个反应位点。在一些实施方案中，这样的多个液滴可以仅包含含有无模板聚合酶的缓冲液，或仅包含含有3’-O封闭的核苷三磷酸的缓冲液，或两者的组合。在一些实施方案中，所述多个液滴为2至10个，或2至5个，或2至3个。在其它实施方案中，所述多个液滴可以为2至150个，或10至120个。在一些实施方案中，实施从基底切割多个多核苷酸的进一步的步骤。

在一些实施方案中，基底是平面基底。

在一些实施方案中，在步骤(b)之前，可以实施干燥每个反应位点的步骤，并且在步骤(c)之前，可以实施干燥每个反应位点的步骤。

图2C说明了一种实施方案，其中在反应位点的液滴中发生偶联反应的同时，将含有无模板聚合酶和单体的缓冲液的多个液滴递送至反应位点。与在反应位点的液滴中进行反应相关的重要问题是蒸发导致的流体损失。这种损失改变了酶、盐以及诸如粘度改性剂、表面活性剂等的组分的浓度，所有这些都可能影响酶活性。此外，在一些实施方案中，通过喷墨递送的液滴中的无模板聚合酶的浓度可能必须低于偶联反应的最佳浓度，因为在较高的浓度下聚合酶增加油墨的粘度，使得其不利地影响液滴形成；因此，为了能够通过喷墨递送足够浓度的聚合酶，将低浓度聚合酶的两个或更多个液滴递送至反应位点，使得在偶联反应过程中，通过这种重复添加，反应位点处的浓度增加，同时反应位点处的缓冲液持续蒸发。图2C示出了单一反应循环的步骤，其中将包含无模板聚合酶和单体的缓冲液的两个液滴递送至反应位点。在一些实施方案中，可以在合成期间将含有这样的试剂的多个液滴递送至每个反应位点。这种液滴递送的数量是取决于诸如反应位点液滴尺寸、递送液滴尺寸、相对湿度、湿润剂是否是油墨的组分、偶联反应的持续时间、对于不同的试剂是否使用不同的打印头等的因素的设计选择。在一些实施方案中，改变基底上的液滴的试剂，例如表面活性剂、粘度改性剂、去垢剂、湿润剂等，可以在由喷墨打印头中的不同喷墨泵产生的不同液滴中递送。除了将两个或更多个液滴递送至反应混合物之外，该实施方案的操作类似于图2A的操作。如上所述，反应位点(204a，包含液滴(202)，或204b，不包含液滴)的表面包含用显示为“-A”的A单体终止的引发剂层。向液滴(202)递送包含无模板聚合酶和B单体的缓冲液的第一液滴以在反应位点(204)处形成反应混合物的液滴(282)。

同样，在采用干燥步骤的一些实施方案中，液滴(283)将被直接递送至反应位点(204b)，而非反应位点(204)处的液滴(202)，来形成反应液滴(282)。

反应液滴(282)在孵育(286)期间通过蒸发(285)持续失去水，这减少了其体积并增加了液滴的所有非挥发性组分的浓度，特别是无模板聚合酶的浓度，从而改善了反应液滴(282)中的偶联活性。通过分别地或作为混合物递送包含无模板聚合酶和B单体的缓冲液的第二液滴进一步改善了偶联活性。尽管在递送液滴(287)和反应液滴(282)的初始聚结时聚合酶的浓度降低，但是持续的蒸发迅速增加了反应液滴(282)中聚合酶的浓度，使得其接近所需值。在递送包含具有聚合酶和单体的缓冲液的多个液滴之后，用脱保护缓冲液(288)和一种或多种洗涤溶液浸没基底的整个表面，以得到具有延长链“-AB”的反应位点(294)。递送试剂溶液的多个液滴来解决蒸发引起的问题和液滴形成的流变约束的相同程序也可以应用于图2B和图2C的实施方案。

在图2A至图2C的一些实施方案中，偶联循环还可以包括在脱保护步骤之后的洗涤步骤。在一些这样的实施方案中，偶联循环可以还包括在洗涤步骤之后的干燥步骤。如上所述，在连续的偶联循环之前的干燥步骤将防止反应液滴在相邻反应位点的扩散和可能的聚结。在一些实施方案中，可以通过使用在偶联循环之间容易蒸发的挥发性洗涤溶液(例如乙腈、甲醇等)来合并洗涤和干燥。

如上所述，本发明的方法的实施方案可以包括一个或多个洗涤步骤，其中洗涤溶液流动或喷洒到包含反应位点阵列的基底上。洗涤溶液可以包含多种溶剂，包括但不限于水、乙腈、甲醇、PBS或其它缓冲盐溶液等。在一些实施方案中，出于除去可能粘附于反应位点的任何聚合酶的目的，洗涤溶液可以包含一种或多种蛋白酶，例如蛋白酶K。也就是说，图2A至图2C的实施方案可以还包括用一种或多种蛋白酶处理反应位点以除去或灭活可能在反应位点积聚的聚合酶的步骤。

尽管图2A至图2C示出了具有被液滴连续包围或占据的反应位点的基底，但这并不是本发明的所有实施方案的要求。在一些实施方案中，可以在步骤的循环之间干燥具有反应位点的基底，使得严格来说基底在整个合成过程中不总是或不连续地是液滴微阵列。

在一些实施方案中，包括上述的那些实施方案，在具有喷墨递送试剂的基底上酶促合成的多个多核苷酸(即反应位点的数目)为100个至2百万个，或100个至1百万个，或100个至10万个，或100个至50万个，或1000个至1百万个。在一些实施方案中，这样的多个多核苷酸在具有1 cm²至500 cm²、或1 cm²至256 cm²、1 cm²至30 cm²的表面积的基底上合成，或在具有1 cm²至15 cm²的表面积的基底上合成，或在具有1 cm²至7 cm²的表面积的基底上合成，或在具有7 cm²至20 cm²的表面积的基底上合成。在一些实施方案中，可以制备基底并进行表面处理，之后将其切割或分割(dice)成较小的片以供使用。在一些实施方案中，根据本发明合成的多核苷酸的长度为10至500个核苷酸、或50至500个核苷酸、或100至400个核苷酸、或100至500个核苷酸。在一些实施方案中，在这些长度范围中的多核苷酸的合成中的每循环偶联效率为至少98%、或为至少99%、或为至少99.5%、或为至少99.8%或为至少99.9%。在一些实施方案中，在这些长度范围中的多核苷酸的合成中的偶联循环时间为每循环小于15分钟、或每循环小于10分钟、或每循环小于7分钟或每循环小于5分钟。

在一些实施方案中，液滴的喷墨递送可能涉及基底上的特征，所述基底具有与其大小或面积直接相关的尺寸，例如正方形反应位点的宽度或圆形反应位点的直径。因此，在一些实施方案中，反应位点具有约10 μm至约1.0cm的宽度或直径。在一些实施方案中，可以将液滴沉积到宽度或直径约1.0μm至约1.0mm，通常约5.0 μm至500 μm，更通常约10 μm至200 μm，以及更通常约20 μm至约100 μm的反应位点。

在一些实施方案中，递送至反应位点的试剂油墨的体积为0.1至1000 pL，或0.5至500 pL，或1.0至250 pL，或1.0至100 pL，或2至50 pL。在一些实施方案中，试剂油墨在由打印头产生的预先确定数量的液滴或“脉冲”中被递送至每个反应位点，其中，例如，每个脉冲具有约2.4皮升的体积。

用于喷墨合成的设备

通过喷墨打印机递送流体是一种成熟的技术，其已可用几十年，从而可找到大量描述它和提供将它适用于如本发明中的新应用的指导。提供对构建喷墨递送系统的指导的示例性参考文献：Lausted et al, Genome Biology, 5: R58 (2004); Le, RecentProgress in Ink Jet Technologies II, chapter 1, pgs. 1-14 (1999); Derby(2010, cited above); Zapka, editor, “Handbook of Industrial Inkjet Printing,”(Wiley-VCH, Weinheim, Germany); 美国专利5474796; 10384189; 10669304; 6306;6323043; 5847105等。如Le (1999)所述，喷墨泵可以被分类为“连续的”和“按需滴落的”(DOD)。在一些实施方案中，DOD喷墨泵用于本发明的设备，并且特别地，在各种DOD喷墨打印机中，压电喷墨泵是令人感兴趣的。例如，在Dong et al, Physics of Fluids, 18:072102 (2006)中描述了DOD喷墨打印机中的液滴形成。这样的各种喷墨泵是大量喷墨打印机(例如，数十至数百(10’s to 100’s))的可获得的组(bank)或组成件(assemblies)，其可以被单独编程以致动和递送液滴。这样的喷墨打印机和喷墨组成件(在本文中称为“喷墨头”)可从许多制造商商购获得，包括Epson、Xaar、Fujifilm等。如本文所用，“喷墨泵”意指能够产生和喷射流体液滴的装置。在一些实施方案中，喷墨泵是能够以预先确定速率和预先确定均匀大小产生和喷射流体液滴的装置。在一些实施方案中，喷墨泵能够喷射各自大约具有0.1pL至5.0nL的相同大小、或0.5pL至1.0nL的相同大小的液滴。在一些实施方案中，喷墨泵能够以1至100千赫兹的速率喷射液滴。

在一些实施方案中，本发明的喷墨设备的组件可以根据它们是否可以相对于彼此移动或者它们是否固定来布置，如图4A中分别通过组件(602)和组件(600)所示。计算机和软件(604)通过控制器直接或间接地提供对系统组件的总体控制。例如，软件可以提供单程试剂沉积，其中打印头(618)是固定的，并且合成支持物保持器(620)移动以将试剂递送至反应位点。可选地，不同的软件可以通过各种组件，例如打印控制器(606)、打印头驱动器(612)和运动控制器(610)，提供一个或多个移动打印头(618)和/或移动合成支持物保持器(620)。通常，计算机和软件(604)控制封端站(622)、冲洗站(624)、擦拭器(626)、检查系统(628)以及洗涤和可能的干燥功能(630)，如果有的话。

封端站(622)保持打印头湿润并防止油墨的干燥。冲洗站(624)灌注(prime)并冲洗打印头，这有助于去除截留的空气和碎屑以及干燥的油墨。擦拭器(626)用于去除过量的油墨并防止交叉污染。它可以是冲洗站的一部分。检查系统(628)记录沉积的试剂斑点(spot)或不正确放置的试剂斑点的存在、不存在或大小。检查系统(628)可以包含拍摄合成支持物的图像的照相机和从所述图像中提取处理信息的图像分析软件。这种信息可以实时地用于优化合成或实施校正措施。洗涤和干燥功能(630)由与用于液滴递送的流体递送系统分开的流体递送系统执行。洗涤可以包括脱保护步骤，其中脱保护试剂流过合成基底，任选地随后进行干燥步骤。干燥可以通过将空气或惰性气体(例如氩气)吹到合成支持物上来实现，或者可以通过在洗涤步骤中使用挥发性溶剂(例如甲醇)来实现。

在一些实施方案中，照相机或显微镜可以用于捕捉斑点(即反应位点)的图像并鉴定丢失的斑点，确定斑点大小和斑点位置。用于图像捕捉的照明可以来自上方、来自侧面、来自下方或集成到基板保持器中，无论哪一种都在油墨中不存在或存在染料的情况下给出最好的对比度。在使用染料的情况下(如下所述)，选择染料以使其不会干扰酶促反应、不会与核苷酸的保护基团反应，并将与酶和脱保护缓冲液相容。在一些实施方案中，每种单体将具有不同的可辨别的染料，覆盖可见光谱的不同部分。在一些实施方案中，反应位点阵列的成像在延伸反应的孵育期间(30秒-10分钟)进行，并且使用足够高的放大率来观察单个斑点，但又不太高以致扫描阵列将需要过度的时长。对于标准显微镜载玻片，在成像步骤中拍摄的图像数量可以是20张到100张。图像可以通过扫描基底而在视频流中无缝捕捉，或者在移动-停止过程中捕捉。所捕捉的图像可以使用算法并在载玻片上存在的基准标记的帮助下进行缝合。基准标记还有助于确定载玻片是否已在载玻片保持器中移动，并有助于确定斑点位置。在一些实施方案中，允许鉴定缺失斑点或不良斑点位置的实时图像分析可以伴随有自动生成新图像和另外的一个或多个打印。

用于实施本发明的各种实施方案(例如，图2A至图2C的那些)的示例性喷墨设备在图4B中图解示出。多个DOD喷墨打印机容纳在打印头(680)中，打印头(680)能够相对于液滴微阵列(657)进行x-y和z移动。在一些实施方案中，打印头(680)和液滴微阵列(657)都能够进行x-y移动。在一些实施方案中，打印头(680)保持在固定位置，并且液滴阵列(657)进行x-y移动。在该示例中，“dATP试剂”、“dCTP试剂”、“dGTP试剂”和“dTTP试剂”(696)各自是包含无模板聚合酶、相应的3’-O保护的dNTP、聚合酶活性所必需或有用的盐和辅因子以及满足所需的液滴形成和/或降低蒸发损失的要求所需的粘度和表面张力改性剂、湿润剂等的缓冲制剂或油墨。打印头(680)包括温度调节件，以将油墨保持在递送和活性最佳的温度下。在该实施方案中，大批流动至或递送至液滴微阵列的试剂是脱保护溶液(或缓冲液)(695)和洗涤溶液(661)。形成在基底(655)上的液滴微阵列(657)位于或安装在流动室(677)中，流动室(677)包括入口(652)和出口(653)。流动室(677)限定了试剂(未由打印头(680)递送)在液滴微阵列(657)上的流动路径。这样的试剂可以连续地流过液滴微阵列(657)，或者可以将试剂递送至流动室(677)，在那，它们保持预先确定的孵育时间，然后被去除或再循环。这样的试剂可以通过常规泵或压力头在试剂储器上移动。流动室(677)包括温度控制元件(未示出)和湿度控制元件(未示出)以维持或优化偶联反应活性。在离开后，试剂被丢弃到废物容器(656)中或再循环。喷墨排出的时机、打印头(680)的定位、阀(675)和阀(674)的致动由流体学/喷墨控制器(665)控制，流体学/喷墨控制器(665)可以包括成像软件，所述成像软件执行对从照相机(697)获得的阵列图像的分析，并且例如当检测到聚结反应位点时，引起试剂沉积的改变。在一些实施方案中，打印头(680)可以由从Meteor(Meteor Inkjet Ltd, (Cambridge, UK))可获得的电子器件驱动。例如，打印控制器卡(Print Controller Card，PCC)与来自Thorlabs运动控制器的编码器信号同步。头驱动器卡(Head Driver Card，HDC)向打印头提供电力和波形。驱动电子器件由Meteor的数字打印前端控制，Meteor的数字打印前端包括MetDrop和MetWave软件，用于优化斑点参数，打印由Thorlabs Kinesis软件启动。整个仪器控制可以由仪器软件(例如LabView)执行。

通常，喷墨喷嘴和基底表面之间的距离可以为约10 μm至10mm，或为约100 μm至2mm，或为约200 μm至1mm，或为500 μm至3mm。液滴速度可以为1-10米/秒。打印头移动可以为1-30 cm/秒，或5-30 cm/秒，或20-30 cm/秒。如下面更全面地描述的，打印头可以具有不同的液滴递送模式，例如单程模式、多程模式和移动-停止模式。

如上所述，在一些实施方案中，用于本发明的喷嘴直径可以为10 μm至100 μm。在其它实施方案中，喷墨喷嘴大小可以为20-30 μm，用于产生10-20 pL大小的液滴。在一些实施方案中，选择喷嘴直径、合成试剂密度、表面张力和粘度以将液滴分配到具有2 pL至5nL、或2 pL至1nL、或2 pL至500 pL或在2 pL至100 pL体积的反应位点。在一些实施方案中，喷墨泵是DOD喷墨泵并且具有1至100kHz的液滴产生率。

在一些实施方案中，基于喷墨的合成器包括液滴检测组件，以监测和记录喷墨喷嘴在液滴形成和递送中的任何异常。在一些实施方案中，这种液滴监测可以包括垂直于打印头运动方向安装的激光二极管，使得每组喷嘴的液滴流与光束相交，使得如果存在液滴则引起光散射。在每轮打印之前，喷嘴可以通过光束依次启动(fired)，并且每个液滴的前向散射由光电二极管检测。未能启动的喷嘴可以在合成期间离线。本发明的设备还可以配备有市售的液滴监测器，例如从Meteor Inkjet Ltd (Cambridge, UK)可得的Meteor液滴监测器以及对固体支持物和反应位点阵列进行成像的照相机。后者允许监测反应位点阵列以检测液滴沉积的准确性、反应位点的大小和几何构造、反应位点的聚结等。在一些实施方案中，可以提供软件以通过将包括较小图像的图块(tile)拼接在一起来提供载玻片或固体支持物上的阵列的完整图像，例如S. Preibisch, S. Saalfeld, P. Tomancak,Bioinformatics, 2009, 25(11), 1463-1465。

在某些实施方案中，防止合成试剂和反应混合物在沉积后蒸发可能是期望的。可以以多种不同的方式防止蒸发。在一些实施方案中，合成循环可以在高湿度环境中进行，例如相对湿度为75-85%。可选地或另外地，可以使用具有蒸发延迟剂或湿润剂的试剂，例如甘油、聚乙二醇、羧甲基纤维素、羟乙基纤维素等。

在一些实施方案中，采用了再循环油墨打印头，因为这样减少了喷嘴因酶而干燥和/或堵塞的问题。再循环油墨打印头可商购自例如Fujifilm，并且描述于美国专利8820899、8534807、8752946、9144993、9511598、9457579，将所述美国专利通过引用并入本文。

合成基底

在一些实施方案中，用于合成的基底包含已经用疏水和亲水区图案化的表面，其中形成离散的亲水反应位点。这些允许亲水反应位点上的液滴形成，例如，在整个表面的水性试剂或反应物流动之后。也就是说，在一些实施方案中，用于合成的基底包括所谓的“液滴微阵列”，例如，如以下示例性参考文献中所公开的，将它们通过引用并入：Brennan, 美国专利5474796; Chrisey et al, Nucleic Acids Research, 24(15): 3040-3047(1996); Fixe et al, Materials Research Society Symposium Proceedings. Volume723, Molecularly Imprinted Materials - Sensors and Other Devices. Symposia(San Francisco, California on April 2-5, 2002); Goldfarb, 美国专利公开2008/0166667; Gopinath et al, ACS Nano, 8(12): 12030-12040 (2014); Hong et al,Microfluid. Nanofluid., 10: 991-997 (2011); Kumar et al, Nucleic AcidsResearch, 28(14): e71 (2000); Peck et al, 美国专利10384189; Indermuhle et al,美国专利10669304; Wu et al, Thin Solid Films, 515: 4203-4208 (2007); Zhang etal, J. Phys. Chem., 111: 14521-14529 (2007)以及类似的参考文献。如本文所用，术语“液滴微阵列”是指基底，优选平面基底，其表面已被处理以产生多个离散的亲水区，其可以直接或经进一步处理用作反应位点，例如附接引发剂。在一些实施方案中，多个离散的亲水区中的每一个都被疏水区包围。离散的亲水区可以具有各种形状，但是为了制造方便，通常是圆形或矩形或正方形。在一些实施方案中，反应位点具有容纳如上所述的水性反应混合物的面积和容量。尽管一些实施方案的合成基底可以包括液滴微阵列，但是在合成过程中，这样的阵列可以经历从反应位点去除液体的干燥步骤。也就是说，在一些实施方案中，包括液滴微阵列的合成基底可以不时地没有微滴，例如，在结束于干燥步骤的延伸循环之后。亲水-疏水配置允许在合成试剂喷墨递送至亲水区之后或通过使“大批(bulk)”水溶液(例如合成试剂或洗涤溶液)在基底上流动，在液滴微阵列的表面上形成液滴。如以上参考文献中所公开的，由亲水区保留的液滴可以用作反应室或容器。这样的过程在图1B中示出。基底(150)(其为平面基底)具有带有疏水区(152)和可以用作反应位点的离散亲水区(154)的表面。当基底(150)被水溶液(158)淹没(156)时，疏水区(152)和亲水区(154)都被浸没。当水溶液(158)排出(160)时，一些水溶液被亲水区(154)保留以形成液滴微阵列(164)的液滴(162)。单独的液滴，例如(162)，可以被称为“微阵列液滴”，以将它们与在递送至反应位点之前通过喷墨泵形成的液滴(例如(162))区分开。

可以通过已知的方法完成具有离散反应位点的基底的制备。例如，这样的方法可以涉及通过首先在基底表面的选定区域上应用保护剂或抗蚀剂(resist)(例如，氧化硅或类似的材料)来创建亲水反应位点。然后，用疏水剂涂覆未保护的区域以产生非反应性表面。例如，疏水涂层可以通过将(十三氟四氢辛基)-三乙氧基硅烷化学气相沉积到围绕被保护的圆形物的暴露的氧化物上来而产生。最后，使用本文所述的高表面张力溶剂和本领域已知的工序(例如Maskos & Southern, Nucl. Acids Res. 20:1679-1684 (1992)所描述的那些)去除保护剂或抗蚀剂，暴露阵列的孔区域，用于进行进一步的修饰和核苷合成。可选地，玻璃板基底的整个表面可以用疏水性材料，例如3-(1,1-二氢全氟辛氧基)丙基三乙氧基硅烷涂覆，在所需位点将其烧蚀以暴露下面的二氧化硅玻璃。然后用缩水甘油氧基丙基三甲氧基硅烷(glycidyloxypropyl trimethoxysilane)涂覆基底，缩水甘油氧基丙基三甲氧基硅烷仅与玻璃反应，并且随后将其用六乙二醇和硫酸“处理”以形成带羟基基团的连接子，在该连接子上可以合成化学物质(Brennan, 美国专利号5,474,796)。以这种方式生产的阵列可以凭借表面张力效应将小体积的溶剂定位在反应位点内(Lopez et al.,Science 260:647-649 (1993))。

在一些实施方案中，可以遵循Brennan, 美国专利5474796；Peck et al, 美国专利10384189；Indermuhle et al, 美国专利10669304；Fixe et al (上文引用)；或者上文引用的类似参考文献的光刻方法在基底上形成反应位点。根据这些方法，将包含氨基硅烷的一组亲水分子附接到基底的表面以形成反应位点。这样的亲水分子可以包括N-(3-三乙氧基甲硅烷基丙基)-4-羟基丁酰胺(HAPS)、11-乙酰氧基十一烷基三乙氧基硅烷、正癸基三乙氧基硅烷、(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷、(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷、3-缩水甘油氧基丙基三甲氧基硅烷(GOPS)或3-碘-丙基三甲氧基硅烷。包含氟硅烷的一组疏水分子附接到反应位点之外的区域中的基底表面。这样的疏水分子可以包括全氟辛基三氯硅烷、辛基氯硅烷、十八烷基三氯硅烷、(十三氟-1,1,2,2-四氢辛基)三氯硅烷或(十三氟-1,1,2,2-四氢辛基)三甲氧基硅烷。在这种附接之后，通过将引发剂偶联到反应位点处的氨基硅烷来制备用于多核苷酸合成的基底。这种偶联可以使用任何数量的可用的同双官能连接子或异双官能连接子来完成，以在基底上的氨基基团和引发剂上的5’-巯基基团或5’-氨基基团之间形成共价键。这样的连接子例如可从Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)获得，并且描述在例如Hermanson, Bioconjugate Techniques, 3^rd Edition (Academic Press, 2013)的论文中，。具有5’-巯基基团或5’-氨基基团的多核苷酸的合成是众所周知的，并且描述在Kupihar et al, Nucleosides Nucleotides & Nucleic Acids, 22(5-8): 1297-1299(2003); Fung et al, 美国专利4757141和类似的参考文献中。

在一些实施方案中，反应位点的阵列可以使用点击化学通过在偶联条件下将5’-DBCO (二苯并环辛基)标记的引发剂(例如Glen Reseach)的液滴沉积在包含叠氮化物层(例如PolyAn 2D叠氮化物载玻片)的基底(优选平面基底)上来形成。在一些实施方案中，这样的反应可以以对DNA损伤较小的无铜点击反应进行，例如Dommerholt et al, Top.Curr. Chem. (Z) 374: 16 (2016)。

可以使用各种基底来创建用于多核苷酸酶促合成的反应位点阵列。基底可以是刚性材料，包括但不限于玻璃；熔融石英；硅，例如二氧化硅或氮化硅；金属，例如金或铂；塑料，例如聚四氟乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯，及其任意组合。刚性表面可以由选自硅、聚苯乙烯、琼脂糖、葡聚糖、纤维素聚合物、聚丙烯酰胺、聚二甲基硅氧烷(PDMS)和玻璃的材料制成。基底还可以包含柔性材料，其能够被弯曲、折叠或类似地操作而不破裂。示例性柔性材料包括但不限于尼龙(未改性尼龙、改性尼龙、透明尼龙)，硝化纤维素，聚丙烯，聚碳酸酯，聚乙烯，聚氨酯，聚苯乙烯，缩醛，丙烯酸材料，丙烯腈，丁二烯苯乙烯(ABS)，聚酯膜如聚对苯二甲酸乙二醇酯，聚甲基丙烯酸甲酯或其它丙烯酸树脂，聚氯乙烯或其它乙烯基树脂，透明PVC箔，用于打印机的透明箔，聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)，甲基丙烯酸酯共聚物，苯乙烯聚合物，高折射率聚合物，含氟聚合物，聚醚砜，含有脂环族结构的聚酰亚胺，橡胶，织物，金属箔，及其任意组合。

在一些实施方案中，超疏水区和超亲水区的图案化表面可以形成在基底上。在以下参考文献中描述了形成具有这样的图案化表面的液滴微阵列的指导，将所述参考文献通过引用并入：Feng et al, Adv. Mater. Interfaces, 1400269 (2014); Zhan et al,Trends Anal. Chem., 108: 183-194 (2018); Neto et al, Adv. Functional Mater.,201400503 (2014)。

实现液滴递送与预制液滴微阵列的反应位点的精确对准是多核苷酸的喷墨辅助合成的一个重要方面。在一些实施方案中，通过在合成前立即通过将合成试剂的液滴沉积到基底上的引发剂寡核苷酸层上以限定反应位点的位置来创建反应位点阵列，可以最小化或避免这样的对准任务。在液滴的这种初始沉积之后，处理液滴限定位点之外的引发剂层，以使它们对随后的延长是惰性的，或使它们对延长惰性以及使它们是疏水的。在这样的初始表面处理以创建反应位点之后，进一步或随后的液滴向相同反应位点的喷墨递送将是精确的，因为用于限定反应位点位置的相同的喷墨头和泵将被用于在多核苷酸的合成期间递送随后的液滴。在一些实施方案中，递送至引发剂层的合成试剂包含无模板聚合酶和3’-O保护的dNTP的混合物。这些试剂延长引发剂以限定被具有3’-O保护端的延长片段占据的寡核苷酸层上的反应位点或区域。然后，对这些区域之外的区域进行处理，以使它们对延长是惰性的。在一些实施方案中，在限定反应位点的初始偶联步骤之后，将整个基底暴露于无模板聚合酶和终止剂，例如双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)或类似的试剂。在一些实施方案中，这种ddNTP可以是，例如，与疏水部分缀合的ddNTP，从而使反应位点之外的涂层疏水。这样的疏水部分可以是例如染料或淬灭剂分子，例如Black Hole Quencher®分子。为此目的可以采用各种终止剂。特别地，终止剂包括没有3’-羟基取代基的核苷三磷酸，并包括2’,3’-二脱氧核糖核苷、2’,3’-二脱氢核糖核苷以及2’,3’-二脱氧-3’-卤代核糖核苷，例如3’-脱氧-3’-氟代核糖核苷或2’,3’-二脱氧-3’-氟代核糖核苷。可选地，呋喃核糖类似物可以用于终止剂，例如2’,3’-双脱氧-β-D-呋喃核糖基、β-D-阿拉伯呋喃核糖基、3’-脱氧-β-D-阿拉伯呋喃核糖基等。在以下参考文献中公开了其它终止剂：Chidgeavadze et al.,Nucleic Acids Res., 12: 1671-1686 (1984); Chidgeavadze et al., FEBS Lett.,183: 275-278 (1985); Izuta et al, Nucleosides & Nucleotides, 15: 683-692(1996); 以及Krayevsky et al, Nucleosides & Nucleotides, 7: 613-617 (1988)。核苷酸终止剂还包括可逆的核苷酸终止剂，例如Metzker et al. Nucleic Acids Res., 22(20):4259 (1994)。

因此，在这样的实施方案中，用于合成操作的起始材料是涂覆有引发剂寡核苷酸层的表面。在这样的起始材料上的反应位点的示例性制造在图3中示出。基底(400)(例如载玻片)具有引发剂寡核苷酸层(402)，所述寡核苷酸具有游离3’-羟基基团并且通过它们的5’-端附接到基底。在一些实施方案中，引发剂密度可以例如为10¹¹至10¹³条链/cm²。喷墨头(404)中的喷墨泵用于在限定反应位点(例如406)的层(402)上以规则且可重复的图案沉积液滴(407)。例如，这样的引发剂的3’-羟基可以是未保护的，并且液滴可以含有无模板聚合酶和初始的3’-O保护的核苷三磷酸，从而在每个反应位点产生3’-O保护的延伸片段。在这种沉积之后，引发剂层(402)在包含无模板聚合酶和终止剂(例如如上所述)的缓冲液(408)中浸没并孵育(409)，以产生液滴微阵列(414)，所述液滴微阵列(414)具有在反应位点(例如412)之外的表面(410)，取决于所选的终止剂，所述表面(410)对延长是惰性的或对延长是惰性的且是疏水的。

采用如图3中所述的反应位点形成的用于合成多个多核苷酸的本发明的实施方案可以通过以下步骤进行：(a)提供已附接引发剂层的基底，优选平面基底，其中每个引发剂具有游离3’-羟基；(b)通过一个或多个喷墨泵将一个或多个液滴分配到引发剂层上的多个位点中的每一个，以限定反应位点的阵列，其中每个液滴包含含有无模板聚合酶和3’-O封闭的dATP、3’-O封闭的dCTP、3’-O封闭的dGTP或3’-O封闭的dTTP的混合物的缓冲溶液，并且其中多个多核苷酸中的每个多核苷酸被指派到不同的反应位点用于合成；(c)将反应位点之外的引发剂的游离3’-羟基封端；(d)通过一个或多个喷墨泵将包含含有无模板聚合酶和3’-O封闭的dATP、3’-O封闭的dCTP、3’-O封闭的dGTP或3’-O封闭的dTTP的混合物的缓冲溶液的至少一个液滴分配到每个反应位点，其中分配到反应位点的3’-O封闭的dNTP的种类取决于指派到反应位点的多核苷酸的预先确定序列；(e)在每个反应位点孵育无模板聚合酶和3’-O封闭的dNTP，使得通过掺入3’-O封闭的dNTP来延伸反应位点处的引发剂或延伸片段，以形成3’-O封闭的延伸片段；(f)通过用去封闭剂处理平面支持物，在每个反应位点将延伸片段去封闭以形成具有游离3’-羟基的延伸片段；(g)重复步骤(d)、(e)和(f)，直到合成多个多核苷酸。

本发明的一方面是制备用于多个多核苷酸的无模板酶促合成的反应位点阵列的方法。在一些实施方案中，这种阵列制备方法可以通过以下步骤进行：(a)提供附接有引发剂的表面，(b)用一个或多个喷墨泵将液滴递送至表面上的多个不同位置以形成多个反应位点，所述液滴包含反应位点中与引发剂反应的合成试剂，以去除3’-O保护基团或通过添加3’-O保护的核苷三磷酸来延伸这样的引发剂，以及(c)将反应位点之外的表面上的引发剂封端。在一些实施方案中，步骤(a)的表面上的引发剂具有游离3’-羟基，并且在步骤(b)中递送的合成试剂包含无模板聚合酶和3’-O保护的核苷三磷酸，使得无模板聚合酶催化3’-O保护的核苷三磷酸的添加，以在反应位点内产生3’-O保护的延伸片段。因此，反应位点之外的引发剂可以通过将表面浸没在封端试剂(例如含有双脱氧核苷三磷酸和无模板聚合酶的混合物)中而封端。在一些实施方案中，表面上的引发剂可以具有3’-O保护基团，并且通过液滴递送的合成试剂可以包含脱保护剂，该脱保护剂从引发剂中去除3’-O保护基团以形成反应位点。在新形成的反应位点中，递送含有3’-O保护的核苷三磷酸和无模板聚合酶的试剂，其中所递送的核苷三磷酸的保护基团与表面的引发剂的保护基团正交。示例性的正交3’-O保护基团如下所述。例如，这样的正交保护基团可以是叠氮基甲基和氨基。

普通技术人员将理解，对于其它实施方案，例如图2B和图2C中描述的那些，可以实施类似的反应位点形成。普通技术人员还将理解，对于图2A至图2C的实施方案描述的任选步骤(例如洗涤、干燥、用蛋白酶处理等)也可以在上述实施方案(包括图3的那些)中实施。

在另一实施方案中，引发剂寡核苷酸的起始层全部具有3’-O-氨基保护的或3’-O-叠氮基甲基保护的末端。该实施方案中的方法步骤类似于图3的那些，不同之处在于脱保护缓冲液被喷墨打印在基底上以将反应位点限定为具有游离3’-羟基的引发剂的离散区域。在这种选择性脱保护之后，用醛或酮的水溶液处理表面以形成稳定的不可延长的亲水性或疏水性3’-肟。醛或酮可以是水溶性的，例如丙酮，或微水溶性的且疏水的(例如戊醛、醛-PEG-DBCO等)或非常疏水且不溶于水的(例如庚醛)。

在另一实施方案中，将包含无模板聚合酶/3’-O保护的dNTP混合物的缓冲液打印在如上所述的具有游离3’-羟基的引发剂寡核苷酸层上，以限定具有带有3’-O保护的末端的延长的引发剂的反应位点。然后用无模板聚合酶和叠氮化物或炔烃衍生的ddNTP处理这些限定位点之外的表面以阻断进一步的3’延长。然后，具有互补点击化学基团(例如DBCO、苄基叠氮化物)的疏水分子可以与ddNTP终止剂反应，以使反应位点之外的表面疏水。示例性点击化学对描述于Feng et al, Adv. Mater. Interfaces, 1400269 (2014)。

在另一实施方案中，对于不具有引发剂寡核苷酸层的基底表面，将包含具有5’连接子基团的引发剂寡核苷酸的缓冲液喷墨打印在用互补反应基团(例如环氧树脂、叠氮化物/炔烃)衍生的表面上，使得引发剂通过它们的5’末端附接到表面上。对于这些附接的引发剂，可以根据本发明进行偶联反应循环。此外，未反应的互补反应基团可以通过使它们与惰性基团(例如，乙醇胺用于环氧树脂)反应来淬灭，并且可以选择具有疏水特征的惰性基团。

无模板酶促合成的方法

通常，无模板(或等效地，“非模板依赖的”)酶促多核苷酸合成方法包括重复的步骤循环，例如如图1A所示，其中在每个循环中将预先确定的核苷酸偶联到引发剂或生长链上。以下参考文献中描述了无模板酶促合成的一般要素：Champion et al, 美国专利10752887; Ybert et al, 国际专利公开WO/2015/159023; Ybert et al, 国际专利公开WO/2017/216472; Godron et al, 国际专利公开WO/2020/120442; Hyman, 美国专利5436143; Hiatt et al, 美国专利5763594; Jensen et al, Biochemistry, 57: 1821-1832 (2018); Mathews et al, Organic & Biomolecular Chemistry, DOI: 0.1039/c6ob01371f (2016); Schmitz et al, Organic Lett., 1(11): 1729-1731 (1999)。

在本发明中，通过喷墨泵递送的合成试剂必须被配制为满足至少两个约束条件：(i)保持无模板聚合酶的延伸活性(在无模板聚合酶油墨的情况下)的需要，和(ii)满足液滴形成的流变要求的需要。影响通过喷墨打印机的液滴形成的关键溶液参数是粘度、表面张力、液体密度和喷墨喷嘴的直径。对于本发明的特定实施方案，针对非液滴递送至反应混合物而制备的合成试剂可以通过添加粘度改性剂、表面张力改性剂和密度改性剂等来重新配制，以便形成可以在由喷墨泵产生的液滴中递送的“可打印油墨”。有关试剂油墨的“可打印的”意指可重复的液滴能够以均匀的速度和体积从喷嘴喷出，并且没有卫星液滴。

如图1A所示，提供了例如附接到合成支持物(120)上的具有游离3’-羟基(130)的引发剂多核苷酸(100)。在对于将3’-O保护的dNTP酶促掺入到引发剂多核苷酸(100)(或延伸的引发剂多核苷酸)的3’端的有效条件(140)下，向引发剂多核苷酸(100)(或后续循环中的延伸的引发剂多核苷酸)中加入3’-O保护的dNTP和无模板聚合酶，例如末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)或其变体(例如Ybert et al, WO/2017/216472; Champion et al, WO2019/135007)。该反应产生3’-羟基被保护的延伸的引发剂多核苷酸(160)。如果延伸序列不完整，则实施另一添加循环(180)。如果延伸的引发剂多核苷酸含有竞争序列，则3’-O保护基团可以被去除或脱保护，并且所需的序列可以从原始引发剂多核苷酸上切割下来(182)。这种切割可以使用各种单链切割技术中的任一种进行，例如，通过在原始引发剂多核苷酸内的预先确定位置插入可切割的核苷酸。示例性的可切割核苷酸可以是被尿嘧啶DNA糖基化酶切割的尿嘧啶核苷酸。根据本发明的一些实施方案，可以将切割试剂通过喷墨泵产生的液滴递送至反应位点。在这样的实施方案中，反应位点处的已知不完整或有缺陷的多核苷酸可以与完全竞争的多核苷酸分离，或者可以通过切割并重新合成整个多核苷酸，或通过切割或以其它方式去除不正确的序列并仅重新合成多核苷酸的有缺陷部分，来选择性地重新合成。

如果延伸的引发剂多核苷酸不是完整的序列(即终产物)，则去除3’-O保护基团以暴露游离3’-羟基(130)，并且使延伸的引发剂多核苷酸经历核苷酸添加和脱保护的另一循环。

如本文所用，“引发剂”(或等效术语，例如“起始片段”、“引发剂核酸”、“引发剂寡核苷酸”等)通常是指在其末端具有游离3’-羟基的短寡核苷酸序列，其可以通过无模板聚合酶(例如TdT)进一步延伸。在一个实施方案中，起始片段是DNA起始片段。在替代实施方案中，起始片段是RNA起始片段。在一些实施方案中，起始片段具有3-100个核苷酸，特别是3-20个核苷酸。在一些实施方案中，起始片段是单链的。在替代实施方案中，起始片段可以是双链的。在一些实施方案中，引发剂寡核苷酸可以通过其5’端附接到合成支持物；在其它实施方案中，引发剂寡核苷酸可以通过与直接附接到合成支持物上的互补寡核苷酸形成双链体(例如通过共价键)，来间接地附接到合成支持物上。在一些实施方案中，合成支持物是固体支持物，其可以是固体平面固体的离散区域，或可以是珠粒。

在一些实施方案中，引发剂可以包含具有游离羟基的非核酸化合物，TdT可以将3’-O保护的dNTP偶联到该游离羟基，例如Baiga, 美国专利公开US2019/0078065和US2019/0078126。

在合成完成后，具有所需核苷酸序列的多核苷酸可以通过切割而从引发剂和合成支持物中释放出来。

各种可切割的连接键或可切割的核苷酸可以用于此目的。在一些实施方案中，切割所需的多核苷酸在所切割的链上留下天然的游离5’-羟基；然而，在替代实施方案中，切割步骤可以留下可以在随后步骤中例如通过磷酸酶处理而被去除的部分，例如5’-磷酸。切割步骤可以以化学方法、用热的方法、酶促地或通过光化学方法进行。在一些实施方案中，可切割的核苷酸可以是核苷酸类似物，例如脱氧尿苷或8-氧代-脱氧鸟苷，它们被特异性糖基化酶(例如，分别是，尿嘧啶脱氧糖基化酶随后是核酸内切酶VIII，以及8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶)识别。在一些实施方案中，切割可以通过提供具有脱氧肌苷(其可以在引发剂的3’端被核酸内切酶V切割，在所释放的多核苷酸上留下5’-磷酸)作为倒数第二个3’核苷酸的引发剂来实现。在一些实施方案中，引发剂可以含有末端尿苷，使得在合成之后，所需的多核苷酸可以通过用KOH或类似的碱处理而从引发剂上切割下来。用于切割单链多核苷酸的进一步的方法公开于以下参考文献中，将它们通过引用并入：第5739386、5700642和5830655号美国专利以及第2003/0186226和2004/0106728号美国专利公开；以及Urdea和Horn, 美国专利5367066。

回到图1A，在一些实施方案中，在每个合成步骤中，在3’-O保护的dNTP的存在下，使用无模板聚合酶，例如TdT，将有序序列的核苷酸与引发剂核酸偶联。在一些实施方案中，合成寡核苷酸的方法包括以下步骤：(a)提供具有游离3’-羟基的引发剂；(b)在延长(或延伸)条件下，使具有游离3’-羟基的引发剂或延长中间体与无模板聚合酶在3’-O保护的核苷三磷酸的存在下反应，以产生3’-O保护的延长中间体；(c)使延长中间体脱保护以产生具有游离3’-羟基的延长中间体；以及(d)重复步骤(b)和(c)，直到合成多核苷酸。(有时术语“延长中间体”或“延伸片段”或“生长链”可互换使用)。如本文所用，术语“延伸条件”意指无模板聚合酶催化延伸反应所需的反应混合物的物理和化学条件，其中3’-O保护的核苷三磷酸单体与核酸片段的游离3’-羟基偶联(通过形成磷酸二酯键)，所述核酸片段例如可以是引发剂或延伸片段。示例性的延伸条件包括反应温度、反应持续时间、pH、各种盐的浓度、不需要的反应组分的清除剂、减少核酸二级结构的试剂等的选择。在一些实施方案中，引发剂作为附接到固体支持物上(例如通过其5’端)的寡核苷酸提供。上述方法还可以包括在反应或延长步骤之后以及在脱保护步骤之后的洗涤步骤。例如，反应步骤可以包括在预先确定的孵育期或反应时间之后例如通过洗涤去除未掺入的核苷三磷酸的子步骤。在一些实施方案中，这种预先确定的孵育期或反应时间可以为30秒至30分钟、或1分钟至30分钟、或1分钟至15分钟、或1分钟至10分钟或30秒至5分钟。

在一些实施方案中，在图1A的合成循环完成之后，可以进行进一步的步骤以从固体支持物切割完成的多核苷酸。这种进一步的步骤可以在阵列的反应位点进行。另外地，一些切割方法可能导致释放的产物仍需要修饰以将其转化成可用产物。例如，在“核酸内切酶V-肌苷”切割(如下所述)中，留下对于一些应用必须被去除的5’-磷酸。因此，可能需要磷酸酶处理的进一步步骤。

当合成支持物上的多核苷酸的预先确定序列包含反向互补子序列时，可能通过反向互补区之间氢键的形成而产生二级分子内或分子间结构。在一些实施方案中，选择用于环外胺的碱基保护部分，使得所保护的氮的氢不能参与氢键合，从而防止这种二级结构的形成。也就是说，可以使用碱基保护部分来防止氢键的形成，例如在正常碱基配对中形成，例如在核苷A和T之间以及在核苷G和C之间。在合成结束时，可以去除碱基保护部分，并且可以从固体支持物上将多核苷酸产物切割下来，例如通过将其从其引发剂上切割下来。

除提供具有碱基保护基团的3’-O封闭的dNTP单体之外，还可以使用热稳定无模板聚合酶在较高温度下进行延伸反应。例如，可以使用在40℃以上具有活性的热稳定无模板聚合酶；或者，在一些实施方案中，可以使用在40-85℃具有活性的热稳定无模板聚合酶；或者，在一些实施方案中，可以使用在40-65℃具有活性的热稳定无模板聚合酶。

在一些实施方案中，延伸条件可以包括向延伸反应混合物中添加抑制氢键合或碱基堆积的溶剂。这样的溶剂包括具有低介电常数的水混溶性溶剂，例如二甲基亚砜(DMSO)、甲醇等。同样，在一些实施方案中，延伸条件可以包括提供离液剂(chaotropic agent)，其包括但不限于正丁醇、乙醇、氯化胍、高氯酸锂、乙酸锂、氯化镁、苯酚、2-丙醇、十二烷基硫酸钠、硫脲、脲等。在一些实施方案中，延伸条件包括二级结构抑制量的DMSO的存在。在一些实施方案中，延伸条件可以包括提供抑制二级结构形成的DNA结合蛋白，其中这样的蛋白包括但不限于单链结合蛋白、解旋酶、DNA乙二醇酶(DNA glycolase)等。

当使用碱基保护的dNTP时，图1A的上述方法可以还包括去除碱保护部分的步骤(e)，其在酰基或脒保护基团的情况下可以(例如)包括用浓氨水处理。

上述方法还可以包括封端步骤以及在反应或延长步骤之后以及在脱保护步骤之后的洗涤步骤。如上所述，在一些实施方案中，可以包括封端步骤，其中未延长的游离3’-羟基与防止封端链的任何进一步延长的化合物反应。在一些实施方案中，这样的化合物可以是双脱氧核苷三磷酸。在其它实施方案中，具有游离3’-羟基的未延长链可以通过用3’-核酸外切酶活性(例如Exo I)处理而降解。例如，参见Hyman，美国专利5436143。同样，在一些实施方案中，可以处理未能去封闭的链以去除所述链或使其对进一步的延长是惰性的。当使用封端剂(例如ddNTP)时，含有这样的试剂的缓冲液或合成试剂可以通过在含有反应位点的基底上流动或喷洒这样的试剂来递送。

在一些实施方案中，用于延伸步骤(有时也称为延长步骤或偶联步骤)的反应条件可以包括以下：2.0 μM纯化的TdT；125-600 μM 3’-O封闭的dNTP (例如3’-O-NH₂封闭的dNTP)；约10至约500mM的二甲胂酸钾缓冲液(pH为6.5-7.5)和约0.01至约10mM的二价阳离子(例如COCl₂或MnCl₂)，其中延伸反应可以在RT至45℃的温度下进行3分钟。应理解，无论何时通过喷墨产生的液滴递送前述偶联试剂，必须调节其粘度、密度和表面张力以使其变成可打印的油墨。就此而言，本发明部分地包括这样的认识和理解，即用于将TdT递送至反应位点的油墨可以具有针对液滴形成而改性的粘度和通过选择粘度改性剂而保存的活性，例如，当选择羧甲基纤维素作为粘度改性剂时。

在3’-O封闭的dNTP是3’-O-NH₂封闭的dNTP的实施方案中，用于去封闭步骤的反应条件可以包括以下：700mM NaNO₂；1M乙酸钠(用乙酸调节至pH为4.8-6.5)，其中去封闭反应可以在RT至45℃的温度下进行30秒至几分钟。可以用不具有偶联反应的组分(例如酶、单体、二价阳离子)的二甲胂酸盐缓冲液进行洗涤。如果通过喷墨递送将上述试剂组合物递送至反应位点，则应理解，将改变所述组合物以满足通过所使用的喷墨打印头的喷嘴形成液滴的流变要求。

在一些实施方案中，RNA合成可以通过与上述类似的步骤完成，但是使用专门选择用于RNA合成的无模板聚合酶和单体，例如polyA聚合酶(PAP)、polyU聚合酶(PUP)等，例如国际专利公开WO2020/077227。例如，本发明的系统、设备和套装产品可以实施合成具有预先确定序列的多核糖核苷酸的方法，所述方法包括以下步骤：a)提供具有带有游离3’-羟基的3’-末端核苷酸的引发剂；以及b)重复以下循环，直到形成所述多核糖核苷酸：(i)在延伸条件下，使具有游离3’-羟基的引发剂或延伸片段与3’-O封闭的核苷三磷酸和无模板聚合酶接触，使得引发剂或延伸片段通过掺入3’-O封闭的核苷三磷酸而延伸以形成3’-O封闭的延伸片段，以及(ii)使延伸片段去封闭，以形成具有游离3’-羟基的延伸片段；其中所述无模板聚合酶是poly(A)聚合酶(PAP)或poly(U)聚合酶。在进一步的实施方案中，引发剂可以通过5’端附接到支持物上，所述支持物可以是固体支持物，并且上述方法可以包括将多核苷酸从引发剂上切割下来的步骤。在一些实施方案中，使用PAP或PUP进行延长或延伸步骤的反应条件可以包括以下：反应条件1 (对于引物+AM-rATP)：250 μM AM-rATP、0.1 μMATTO488-(rA)5、1 μM PAP、1×ATP缓冲液(20mM Tris-HCl、0.6mM MnCl₂、0.02mM EDTA、0.1%BSA、10%甘油、100mM咪唑，pH7-8)，37℃，30分钟。反应条件2 (对于引物+AM-rGTP)：250μMrGTP、0.1 μM ATTO488-(rA)5、1 μM PAP、1×GTP缓冲液(0.6mM MnCl₂、0.1% BSA、10mM咪唑，pH6)，37℃，30分钟。在上文中，“AM-rNTP”是指3’-叠氮基甲基-O-核糖核苷三磷酸。用于本发明的许多3’-O封闭的rNTP可以从商业供应商(例如Jena Bioscience、MyChemLabs等)购买或使用公开的技术合成，例如美国专利7057026；国际专利公开WO2004/005667、WO91/06678；Canard et al, Gene (上文引用的); Metzker et al, Nucleic Acids Research,22: 4259-4267 (1994)；Meng et al, J. Org. Chem., 14: 3248-3252 (3006)；美国专利公开2005/037991; Zavgorodny et al, Tetrahedron Letters, 32(51): 7593-7596(1991)。在进一步的特定实施方案中，3’-封闭的核苷酸三磷酸被3’-O-炔丙基、3’-O-叠氮基甲基、3’-O-NH₂或3’-O-烯丙基基团封闭。在其它实施方案中，本发明的3’-O封闭基团包括3’-O-甲基、3’-O-(2-硝基苄基)、3’-O-烯丙基、3’-O-胺、3’-O-叠氮基甲基、3’-O-叔丁氧基乙氧基、3’-O-(2-氰基乙基)和3’-O-炔丙基。如上所述，如果通过喷墨递送将上述试剂组合物递送至反应位点，则应理解，将改变组合物以满足通过所使用的喷墨打印头的喷嘴形成液滴的流变要求。

3’-O保护的核苷三磷酸

根据特定应用，去封闭和/或切割的步骤可以包括各种化学或物理条件，例如光、热、pH、能够切割指定化学键的诸如酶的特定试剂的存在。在选择3’-O封闭基团和相应的去封闭条件方面的指导可以在以下参考文献中找到，将它们通过引用并入：Benner, 美国专利7544794和8212020；美国专利5808045；美国专利8808988；国际专利公开WO91/06678；以及以下引用的参考文献。在一些实施方案中，切割剂(有时也称为去封闭试剂或去封闭剂)是化学切割剂，例如，诸如二硫苏糖醇(DTT)。在替代实施方案中，切割剂可以是酶促切割剂，例如，诸如磷酸酶，其可以切割3’-磷酸封闭基团。本领域技术人员将理解，去封闭剂的选择取决于所用3’-核苷酸封闭基团的类型、是否使用一种或多种封闭基团、引发剂是否附接到活细胞或生物体或固体支持物等(这使温和处理成为必要)。例如，膦，例如三(2-羧乙基)膦(TCEP)可以用于切割3’O-叠氮基甲基基团，钯络合物可以用于切割3’O-烯丙基基团，或亚硝酸钠可以用于切割3’O-氨基基团。在特定的实施方案中，切割反应涉及TCEP、钯络合物或亚硝酸钠。

如上所述，在一些实施方案中，期望采用可以使用正交去封闭条件去除的两种或更多种封闭基团。在平行合成实施方案中可以使用以下示例性的封闭基团对。应理解，含有多于两种的其它封闭基团对或组可用于本发明的这些实施方案中。

在一些实施方案中，特定的酶促可去除的封闭基团的去除需要特定的酶。例如，可以用酯酶(例如乙酰酯酶)或类似的酶去除基于酯或酰基的封闭基团，并且可以用3’磷酸酶(例如T4多核苷酸激酶)去除磷酸封闭基团。例如，3’-O-磷酸可以通过用100mM Tris-HCl(pH6.5)、10mM MgCl₂、5mM 2-巯基乙醇和一个单位的T4多核苷酸激酶的溶液处理来去除。反应在37℃的温度下进行1分钟。如上所述，如果通过喷墨递送将前述组合物递送至反应位点，则应理解，将改变组合物以满足通过所使用的喷墨打印头的喷嘴形成液滴的流变要求。

3’-O-酯保护的dNTP或3’-O-磷酸保护的dNTP的合成和酶促脱保护的其它实例描述于以下参考文献中：Canard et al, Proc. Natl. Acad. Sci., 92:10859-10863(1995); Canard et al, Gene, 148: 1-6 (1994); Cameron et al, Biochemistry, 16(23): 5120-5126 (1977); Rasolonjatovo et al, Nucleosides & Nucleotides, 18(4&5): 1021-1022 (1999); Ferrero et al, Monatshefte fur Chemie, 131: 585-616(2000); Taunton-Rigby et al, J. Org. Chem., 38(5): 977-985 (1973); Uemura etal, Tetrahedron Lett., 30(29): 3819-3820 (1989); Becker et al, J. Biol.Chem., 242(5): 936-950 (1967); Tsien, 国际专利公开WO1991/006678。

在一些实施方案中，经修饰的核苷酸包括经修饰的核苷酸或核苷分子，所述经修饰的核苷酸或核苷分子包含嘌呤或嘧啶碱基和核糖或脱氧核糖糖部分，所述核糖或脱氧核糖糖部分具有共价附接其上的可移除的3’-OH封闭基团，使得3’碳原子附接有以下结构的基团：

-O-Z

其中-Z是-C(R’)₂-O-R”、-C(R’)₂-N(R”)₂、-C(R’)₂-N(H)R”、-C(R’)₂-S-R”和-C(R’)₂-F中的任一个，其中每个R”是可移除的保护基团或是可移除的保护基团的一部分；每个R’独立地是氢原子、烷基、取代的烷基、芳基烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂环基、酰基、氰基、烷氧基、芳氧基、杂芳氧基或酰胺基基团，或通过连接基团附接的可检测标记物；条件是，在一些实施方案中，这样的取代基具有至多10个碳原子和/或至多5个氧或氮杂原子；或(R’)₂表示式=C(R”’)₂的基团，其中每个R”’可以相同或不同并且选自氢原子和卤素原子以及烷基基团，条件是在一些实施方案中，每个R”’的烷基具有1至3个碳原子；并且其中分子可以反应以产生中间体，其中每个R’’被交换为H，或在Z是-(R’)₂-F的情况下，F被交换为OH、SH或NH2，优选OH，所述中间体在水性条件下离解以提供具有游离3’-OH的分子；条件是在Z是-C(R’)₂-S-R”的情况下，两个R’基团不是H。在某些实施方案中，经修饰的核苷酸或核苷的R’是烷基或取代的烷基，条件是这样的烷基或取代的烷基具有1至10个碳原子和0至4个氧或氮杂原子。在某些实施方案中，经修饰的核苷酸或核苷的-Z的式为-C(R’)₂-N3。在某些实施方案中，Z是叠氮基甲基基团。

在一些实施方案中，Z是分子量为200或更小的具有或不具有杂原子的可切割的有机部分。在其它实施方案中，Z是分子量为100或更小的具有或不具有杂原子的可切割的有机部分。在其它实施方案中，Z是分子量为50或更小的具有或不具有杂原子的可切割的有机部分。在一些实施方案中，Z是分子量为200或更小的具有或不具有杂原子的酶促可切割的有机部分。在其它实施方案中，Z是分子量为100或更小的具有或不具有杂原子的酶促可切割的有机部分。在其它实施方案中，Z是分子量为50或更小的具有或不具有杂原子的酶促可切割的有机部分。在其它实施方案中，Z是分子量为200或更小的酶促可切割的酯基团。在其它实施方案中，Z是可被3’-磷酸酶去除的磷酸基团。在一些实施方案中，以下3’-磷酸酶中的一种或多种可以根据制造商推荐的方案使用：T4多核苷酸激酶、小牛肠碱性磷酸酶、重组虾碱性磷酸酶(例如可得自New England Biolabs, Beverly, MA)。

在一些实施方案中，3’-封闭的核苷酸三磷酸被3’-O-叠氮基甲基、3’-O-NH₂或3’-O-烯丙基基团封闭。

在一些实施方案中，本发明的3’-O封闭基团包括3’-O-甲基、3’-O-(2-硝基苄基)、3’-O-烯丙基、3’-O-胺、3’-O-叠氮基甲基、3’-O-叔丁氧基乙氧基、3’-O-(2-氰基乙基)和3’-O-炔丙基。

无碱基保护的3’-O封闭的dNTP可以从商业供应商购买或使用公开的技术合成，例如美国专利7057026；Guo et al, Proc. Natl. Acad. Sci., 105(27): 9145-9150(2008)；Benner, 美国专利7544794和8212020；国际专利公开WO2004/005667、WO91/06678；Canard et al, Gene (本文引用)；Metzker et al, Nucleic Acids Research, 22:4259-4267 (1994)；Meng et al, J. Org. Chem., 14: 3248-3252 (2006)；美国专利公开2005/037991。具有碱基保护的3’-O封闭的dNTP可以如下所述合成。

用于多核苷酸合成的无模板聚合酶

各种不同的无模板聚合酶可用于本发明的方法。无模板聚合酶包括但不限于polX家族聚合酶(包括DNA聚合酶β、λ和μ)、poly(A)聚合酶(PAP)、poly(U)聚合酶(PUP)、DNA聚合酶θ等，例如描述于以下参考文献中：Ybert et al, 国际专利公开WO2017/216472;Champion et al, 美国专利10435676; Champion et al, 国际专利公开WO2020/099451;Champion et al, 国际专利公开WO/2021/116270; Heinisch et al, 国际专利公开WO2021/018919。特别地，末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)及其变体在无模板DNA合成中是有用的。

在一些实施方案中，TdT变体用于本发明，其相对于3’-O-氨基核苷三磷酸显示出增加的掺入活性。例如，这种TdT变体可以使用Champion et al, 美国专利10435676(将其通过引用并入)中描述的技术制备。

无模板聚合酶油墨

如上所述，必须配制由喷墨泵递送的合成试剂以保持合成试剂的活性并满足液滴形成的流变要求，这可以通过使用可变粘度改性剂来进行。这样的制剂在本文中被称为“油墨”。例如，满足第一个约束条件(活性)可能需要无模板聚合酶在反应混合物中以某一最小浓度存在。然而，由于高蛋白粘度，所需活性的浓度可能妨碍满足第二个约束条件，即液滴形成能力。在这种情况下，本发明的实施方案可能需要递送各自具有较低浓度聚合酶的多个液滴，其与蒸发相结合，允许产生活性所需水平的聚合酶浓度。这种实施方案在图2C中示出。

同样如上所述，影响通过喷墨打印机的液滴形成的关键溶液参数是粘度、表面张力、喷墨喷嘴的密度和直径，它们通过以下公式相关联：Z=[(a)^(0.5)]/，其中是流体的密度，是表面张力，是粘度，a是喷墨泵喷嘴的半径，并且Z为1至10以可靠形成液滴，例如Derby, J. Mater. Chem., 18: 5717-5721 (2008)。这种关系应用于通过喷墨产生的液滴递送的任何合成试剂，所述液滴包括(i)其偶联缓冲液中的无模板聚合酶，(ii)其偶联缓冲液中的无模板聚合酶和3’-O保护的dNTP的混合物，(iii)缓冲液中的3’-O保护的dNTP，(iv)脱保护缓冲液，和(v)含有5’-连接子衍生的引发剂的缓冲液。本领域普通技术人员可以通过调节反应物密度、粘度改性剂、表面张力改性剂等，来实施对该关系的应用，以确定能够形成用于特定实施方案的所需液滴的油墨组合物。

因此，对于本发明的特定实施方案，针对非液滴递送至反应混合物而制备的合成试剂可以通过添加粘度改性剂、表面张力改性剂和密度改性剂等来重新配制，以便形成可以在由喷墨泵产生的液滴中递送的“可打印油墨”。有关试剂油墨的“可打印的”意指可重复的液滴能够以均匀的速度和体积从喷嘴喷出，并且没有卫星液滴。

在一些实施方案中，如果无模板聚合酶的比活性相对较低使得必须将相对大量的蛋白质递送至反应位点以完成偶联步骤，则可以通过在每个偶联循环中分配多个液滴，同时允许受控量的蒸发以将反应体积维持在规定范围内，例如10-100 pL，来进行聚合酶递送。在一些实施方案中，所递送的多个液滴为2个至10个，或2个至5个，或2个至3个。在其它实施方案中，所述多个液滴可以为2个至150个，或10个至120个。在一些实施方案中，每当无模板聚合酶是TdT时，所述多个液滴是使反应位点处的反应混合物中TdT的浓度达到1 μM至30 μM的值或2 μM至20 μM的值所需的数目。在一些实施方案中，油墨中TdT的浓度是在反应位点处在TdT分子和多核苷酸之间产生约1: 1化学计量的浓度。在其它实施方案中，油墨中TdT的浓度是在反应位点处在TdT分子和多核苷酸之间产生1: 1或更大的化学计量的浓度。

在一些实施方案中，本发明包括可打印油墨，其包含TdT变体和粘度改性剂，例如可变粘度改性剂。在一些实施方案中，这种TdT在适于偶联活性的缓冲液中的浓度为1 μM至20 μM/mg。在一些实施方案中，这种缓冲液包含约10至约500mM的二甲胂酸钾缓冲液(pH为6.5至7.5)和约0.01至约10mM的二价阳离子(例如COCl₂或MnCl₂)。在一些实施方案中，延伸反应缓冲液是醋酸盐缓冲液，例如0.1M醋酸盐，0.5M NaCl，pH4.5。

在一些实施方案中，不可变粘度改性剂可以与可变粘度改性剂一起使用。这种不可变粘度改性剂可以选自乙二醇、不同分子量的聚乙二醇、聚乙二醇甲基醚、聚乙二醇二甲醚、聚(乙烯醇)、羧甲基纤维素和羟乙基纤维素。

在一些实施方案中，除了粘度改性剂之外，可打印的无模板聚合酶油墨，例如TdT油墨，还包含表面张力改性剂。这种表面张力改性剂可以是去垢剂。这种去垢剂可以选自吐温20、Triton X-100、CHAPS、NP-40、辛基硫葡糖苷、辛基葡糖苷或十二烷基麦芽糖苷。特别感兴趣的是Triton X-100。同样特别感兴趣的是吐温20。另外的表面张力改性剂(即表面活性剂)公开在Buret, LabChip, 12: 422-433 (2012)中。

在一些实施方案中，本发明包括包含TdT变体、3’-O保护的dNTP和可变粘度改性剂的可打印油墨。在一些实施方案中，这种TdT在适于偶联活性的缓冲液中的浓度为1 μM-50μM/mg，或1 μM-20 μM/mg。在一些实施方案中，这种缓冲液包含约10至约500mM的二甲胂酸钾缓冲液(pH为6.5至7.5)和约0.01至约10mM的二价阳离子(例如COCl₂或MnCl₂)；这种3’-O保护的dNTP的浓度为125-600 μM。在一些实施方案中，可变粘度改性剂选自未交联的聚(N-烷基取代的-丙烯酰胺)和聚(环氧乙烷)-聚(环氧丙烷)-聚(环氧乙烷)三嵌段聚合物。在一些实施方案中，除了可变粘度改性剂之外，可打印的TdT油墨还包含表面张力改性剂。这种表面张力改性剂可以是去垢剂。这种去垢剂可以选自Triton X-100、CHAPS、NP-40、辛基硫葡糖苷、辛基葡糖苷或十二烷基麦芽糖苷。特别感兴趣的是吐温20和Triton X-100。

在一些实施方案中，包含无模板聚合酶(例如TdT变体)的可打印油墨包含用于减少液滴蒸发的湿润剂。合适的湿润剂包括但不限于甘油、醇糖、乙基己基甘油、泛醇、山梨糖醇、木糖醇、麦芽糖醇、丙二醇、己二醇、丁二醇、乳酸钠、透明质酸和聚右旋糖。

在一些实施方案中，本发明的TdT油墨以1 pL-200 pL，或1 pL-100 pL，或1 pL-50pL的液滴递送。

在一些实施方案中，本发明涉及末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)组合物，其包含体积为2 pL-5nL水溶液的液滴，并包含(i)浓度为1.0 μM至30 μM或2.0 μM至20 μM的TdT或其变体、浓度为0.01 mM至10mM的二价阳离子和可变粘度改性剂。在一些实施方案中，二价阳离子是钴或锰，并且这种组合物还包含表面张力改性剂。

在一些实施方案中，这种可变粘度改性剂选自未交联的聚(N-烷基取代的-丙烯酰胺)和聚(环氧乙烷)-聚(环氧丙烷)-聚(环氧乙烷)三嵌段聚合物。在一些实施方案中，每当可打印的无模板聚合酶油墨(例如可打印的TdT油墨)包含3’O-氨基核苷酸，上述组合物中的任一种都可以还包含醛清除剂(下面更全面地描述)。在一些实施方案中，上述组合物中的任一种可以还包含浓度为100-1000 μM或125-600 μM的3’-O保护的2’-脱氧核苷三磷酸单体。

在一些实施方案中，可变粘度改性剂可以包含冷却时胶凝的聚合物溶液。这种聚合物选自具有UCST型相行为的疏水改性的聚合物、天然聚合物、去嵌段共聚物刷接枝的二氧化硅纳米颗粒、聚(PEO-共-苯乙烯)和它们的组合中的至少一种。所述聚合物可以溶解在离子液体中或PNIPAM微凝胶和主-客体相互作用的溶液中。

在一些实施方案中，本发明涉及3’-O保护的2’-脱氧核苷三磷酸组合物，其包含体积为2 pL-5nL的水溶液的液滴，并包含(i)浓度为125-600 μM的3’-O保护的2’-脱氧核苷三磷酸和可变粘度改性剂。在一些实施方案中，前述3’-O保护的2’-脱氧核苷三磷酸组合物还包含表面张力改性剂。

在前述组合物的一些实施方案中，可变粘度改性剂选自未交联的聚(N-烷基取代的-丙烯酰胺)和聚(环氧乙烷)-聚(环氧丙烷)-聚(环氧乙烷)三嵌段聚合物。在一些实施方案中，前述组合物的3’-O保护的2’-脱氧核苷三磷酸是3’-O保护的2’-脱氧腺苷三磷酸、3’-O保护的2’-脱氧鸟苷三磷酸、3’-O保护的2’-脱氧胞苷三磷酸或3’-O保护的2’-脱氧胸苷三磷酸。在前述组合物的一些实施方案中，3’-O保护基团选自3’-O-甲基、3’-O-(2-硝基苄基)、3’-O-烯丙基、3’-O-胺、3’-O-叠氮基甲基、3’-O-叔丁氧基乙氧基、3’-O-(2-氰基乙基)和3’-O-炔丙基。

如上所述，在使用3’-O-氨基-dNTP单体的本发明的一些实施方案中，在无模板聚合酶油墨中醛清除剂的存在通过与在环境中普遍存在的外来(adventitious)醛或酮(例如甲醛)反应来减少3’-胺的伪封端(spurious capping)。这是喷墨合成的一个特殊问题，因为油墨的液滴具有非常高的表面积-体积比，其增强了环境醛的吸收。因此，在使用3’-O-氨基-dNTP单体的本发明的实施方案中，如上所述的无模板聚合酶油墨还包含有效量的至少一种醛清除剂。如本文所用，有关醛清除剂的“有效量”意指足以使产物中的伪封端多核苷酸产生可测量的减少的量(或浓度)。这种测量可以使用常规技术容易地完成，例如产物样本的DNA序列分析、凝胶电泳等。如本文所用，术语“醛清除剂”包括酮清除剂。在一些实施方案中，醛清除剂是与具有式R-C(=O)H或R¹-C(=O)-R²的化学基团的化合物反应的试剂，其中R、R¹和R²通常是烷基或芳基。更具体地，在一些实施方案中，醛清除剂是这样的试剂，其以足够高的速率与化合物上的R-C(=O)H或R¹-C(=O)-R²基团反应，使得这样的化合物不与3’-O-氨基-核苷酸的3’-胺基团反应(或仅可忽略不计地反应)。如本文所用，术语“清除剂”意指添加到混合物中以去除或失活导致不希望的反应产物的杂质或化合物的化学物质。在各种实施方案中，醛清除剂可以在溶液中、固定在用于储存或合成的材料上或与本发明方法中所用的试剂偶联，例如，无模板聚合酶，如TdT。

如上所述，可以使用各种试剂(本文中称为“合成试剂”)进行酶促合成，所述试剂可以含有反应物、洗涤溶液、脱保护缓冲液、酶等或由反应物、洗涤溶液、脱保护缓冲液、酶等组成。(术语“合成试剂”意指在合成循环中用于将单体，特别是3’-O-氨基-核苷三磷酸偶联至引发剂或延伸片段的任何试剂，例如包含无模板聚合酶的缓冲液、包含3’-O保护的核苷酸单体的缓冲液、脱保护(或去封闭)缓冲液等。)在各种实施方案中，醛清除剂可以是合成试剂中的一种或多种的组分。在一些实施方案中，醛清除剂可以作为单独的合成试剂(没有其它反应物、洗涤缓冲液或酶)添加到反应混合物中。在一些实施方案中，将醛清除剂作为包含无模板聚合酶的合成试剂的组分添加到反应混合物中。

在例如使用Sudo et al, 美国专利公开US2020/0061225中公开的或在图8A至图8B中列出的醛清除剂的一些实施方案中，通过1至500mM的浓度提供有效量，或在其它实施方案中，通过1至200mM的浓度提供有效量，或在其它实施方案中，通过1至100mM的浓度提供有效量。

在一些实施方案中，本发明中使用的醛清除剂包括O-取代的羟胺或多羟胺。在一些实施方案中，本发明中使用的O-取代的羟胺由下式定义：

R¹-ONH₂，

例如Sudo et al, 美国专利公开US2020/0061225或Kitasaka et al, 美国专利7241625所公开的，将上述美国专利公开和美国专利通过引用并入本文。在一些实施方案中，R¹为C_1-18直链、支链或环状烷基基团，其可以被选自以下的至少一种取代基取代：卤素原子；C_1-6烷氧基基团；C_1-6卤代烷基基团；C_1-6卤代烷氧基基团；羧基基团；羟基基团；巯基基团；氰基基团；硝基基团；C_6-14芳基基团，其可以被卤素原子、C_1-6烷基基团、C_1-6烷氧基基团、C_1-6卤代烷基基团、C_1-6卤代烷氧基基团、羧基基团、羟基基团、巯基基团、氰基基团或硝基基团取代；C_4-14杂芳基，其可以被卤素原子、C_1-6烷基基团、C_1-6烷氧基基团、C_1-6卤代烷基基团、C_1-6卤代烷氧基基团、羧基基团、羟基基团、巯基基团、氰基基团或硝基基团取代；由下式表示的烷氧基羰基基团：

-(C=O)-O-R²

和由下式表示的氨基甲酰基：

-(C=O)-NR³(R³)

其中R²是C_1-18直链、支链或环状烷基基团，其可以在化学上可接受的任选位置被选自以下的至少一种取代基取代：羧基基团；羟基基团；巯基基团；卤素原子；C_1-6烷氧基基团；C_1-6卤代烷氧基基团；C_6-14芳基基团；和C_4-14杂芳基基团；并且其中每个R³可以相同或不同并且各自独立地是C_1-18直链、支链或环状烷基基团，其可以被选自以下的至少一种取代基取代：羧基基团；羟基基团；巯基基团；卤素原子；C_1-6烷氧基基团；C_1-6卤代烷氧基基团；C_6-14芳基基团；和C_4-14杂芳基基团；C_6-14芳基基团、C_4-14杂芳基基团或氢原子。

特别地，可以用于本发明的示例性O-取代的羟胺或多羟胺在图3A和图3B中显示为化合物(1)至化合物(14)，其中化合物(1)在本文中也称为“BOX”试剂。

在一些实施方案中，醛清除剂包括由Pacifici, 美国专利5446195或Burdeniucet al, 美国专利公开US20160369035公开的羰基化合物，将上述美国专利和美国专利公开通过引用并入本文，并且由下式定义：

其中R和R’是CH₃或H[O(CH₂)_m]_nO-，并且其中m和n选自由以下组成的m和n的组合：m=1且n=1、3-19；m=2且n=2-19；或m=3且n=1-19；Y是--CH₂-或--CH₂-CO-CH₂--。

在本发明的一些实施方案中，如上所述的无模板聚合酶油墨还包含染料，以允许在初始分配试剂以限定反应位点时或在合成期间在随后的液滴分配时，监测反应位点的位置、大小、形状和可能的重叠，特别是监测在相邻位点的反应混合物的可能聚结。为此目的，有大量供选择的荧光和非荧光染料。使用的主要标准是染料(i)不会不利地影响任何反应组分的性能，(ii)足够亮或足够浓以使液滴或反应位点易于检测到，(iii)如果使用多于一种，则在光谱上不同，和(iv)不会影响油墨的流变特性。在一些实施方案中，食品染料用于本发明的油墨中。在其它实施方案中，pH指示剂染料用于本发明的油墨中。在其它实施方案中，荧光染料用于本发明的油墨中。用于无模板聚合酶油墨的示例性染料包括BrilliantBlue FCF、Fast Green FCF、Ponceau 4R和Sunset Yellow FCF。在一些实施方案中，食品染料以1至20mM的浓度或1至10mM的浓度使用。

实施例

用于评价酶促喷墨合成中的反应条件的方法

在该实施例中，创建了用于评价不同喷墨反应条件的试验床。因为在各个反应位点的非常少量的材料难以分析，所以制备载玻片，其允许含有大量反应位点(例如10个或更多个)的区域一起加工并汇集用于通过凝胶电泳进行分析。通过在每个区域中沉积等体积的碱可切割或光可切割引发剂来创建所述区域。在图5中示出了示例性的载玻片(900)(其可以是PolyAn 3D-环氧树脂涂覆的玻璃载玻片)。它包含24个圆形区域(902)，其中的每一个包含大约相同数量的反应位点(未示出)。通过将20 μM 5’-氨基衍生的光可切割的引发剂手动点样至24个位置(遵循载玻片制造商推荐的方案)在载玻片(900)上创建区域(902)。简言之，在70%相对湿度下孵育过夜后，然后将载玻片加热至80℃持续5分钟，在1M乙醇胺pH8中洗涤1小时，在SSC 4X中洗涤30分钟，在SSC 2X 0.1% SDS中洗涤30分钟，在SSC 0.2X中洗涤30分钟，在MQ中洗涤30分钟。示例性的引发剂可以具有以下序列：5’-氨基-C12-10T(PC)4T(FAM-T)18T-3’，其中C12是12碳烷基连接子，T是胸苷，“PC”是光可切割连接子(例如Horgan, WO2021/048142)，“FAM-T”是荧光素标记的胸苷。在进行实验后，通过将特定区域浸没在PBS(例如40 μL/区域)中并用365nm光(例如Analytik Jena, 95-0252-02, UVLMS-38,，3”处的8 W强度对于365 nm为1500 μW/cm²)照射该区域来从该区域光切割序列，在此之后，如图5所示将汇集的序列上样至凝胶上。在图5的示例中，区域被分成8组，每组3个区域。在第1组-第4组中，进行23个延伸反应循环，在此之后，将每组3个区域中的所得产物进行光切割、汇集并上样(909)至它们各自的泳道1-4上(914)。在第5组-第8组中，没有进行合成反应。非延伸的引发剂与第1组-第4组进行完全相同的加工，但是被上样至泳道5-8中(916)。凝胶提供了对各种反应参数变化的影响的方便且灵敏的测量，包括但不限于反应物浓度，流变成分(例如表面活性剂、粘度改性剂等)的存在、不存在和浓度，不同的无模板聚合酶，二级结构改性剂等。

温度对粘度和酶促喷墨合成的影响的评价

在该实施例中，评估温度对油墨粘度的影响。如下表1中所述制备延伸油墨。

表1 油墨组合物

如图6所示，可以看出粘度随着温度的升高而显著降低，这是所预期的。

还在不同温度下评估了延伸油墨的稳定性。如图7所示，可以看出在低温下储存油墨的益处，以及不能用在37℃下储存在打印头中的油墨进行合成，因为所述油墨在24小时内沉淀。

在该实施例中，进行手动合成测试以评价在不同温度下的反应效力。

载玻片被光可切割的引发剂完全覆盖。在图5中示出了示例性的载玻片(900)(其可以是PolyAn 2D-叠氮化物涂覆的玻璃载玻片)。在70% RH下，在pH=4.5的NaOAc/NaCl缓冲液中将5 μM的5’DBCO光可切割引发剂孵育1小时来进行固定化。然后用一系列缓冲液洗涤载玻片，用MQ冲洗并干燥。

示例性的引发剂可以具有以下序列：5’-DBCO-TEG-10T(PC)4T(FAM-T)18T-3’，其中DBCO是二苯并环辛炔，TEG是三乙二醇，T是胸苷，“PC”是光可切割的连接子(例如Horgan,WO2021/048142)以及“FAM-T”是荧光素标记的胸苷。

然后在硅垫圈中在22℃、37℃或4℃ (一个载玻片)下如下进行手动合成：i)用延伸油墨孵育(70% RH，在4℃、20℃或37℃下5分钟)，ii)用脱保护缓冲液孵育(70% RH, 3分钟)，iii)用H2O milli-Q冲洗，iv)用压缩空气干燥。

在进行实验后，用PBS填充垫圈并用365nm光(例如Analytik Jena, 95-0252-02,UVLMS-38, 3”处的8 W强度对于365 nm为1500 mW/cm2)照射特定区域来从该区域光切割序列。

将在4℃、20℃和37℃的延伸寡聚物与用作参考的非延伸寡聚物一起进行凝胶电泳。

凝胶提供了对各种反应参数变化的影响的方便且灵敏的测量，包括但不限于反应物浓度，流变成分的存在、不存在和浓度，延伸温度，不同的无模板聚合酶，二级结构改性剂等。

从图8中可以看出，37℃下的合成比4℃下的合成更好，杂质的量随着更高的温度而减少。从图6和图7中可以看出，为了获得更好的结果，需要在合成之前具有高粘度，在合成期间需要具有较低的粘度。

定义

除非本文另有具体定义，否则本文所用的核酸化学、生物化学、遗传学和分子生物学的术语和符号遵循本领域的标准论文和教科书中的术语和符号，例如Kornberg andBaker, DNA Replication, Second Edition (W.H. Freeman, New York, 1992)；Lehninger, Biochemistry, Second Edition (Worth Publishers, New York, 1975)；Strachan and Read, Human Molecular Genetics, Second Edition (Wiley-Liss, NewYork, 1999)；Le, Recent Progress in Ink Jet Technologies II, chapter 1, pgs.1-14 (1999)；Zapka, editor, “Handbook of Industrial Inkjet Printing,” (Wiley-VCH, Weinheim, Germany)。

“湿润剂”是吸引和保留水分的任何吸湿物质。示例性的湿润剂包括但不限于甘油、醇糖、乙基己基甘油、泛醇、山梨糖醇、木糖醇、麦芽糖醇、丙二醇、己二醇、丁二醇、乳酸钠、透明质酸、聚右旋糖等。

“多核苷酸”意指核苷酸单体或其类似物的线性聚合物。构成多核苷酸的单体可以能够通过单体-单体相互作用的规则模式，例如Watson-Crick型碱基配对、碱基堆叠、Hoogsteen或反向Hoogsteen型碱基配对等，与天然多核苷酸特异性结合。这样的单体和它们的核苷间连接键可以是天然存在的或可以是其类似物，例如天然存在的或非天然存在的类似物。非天然存在的类似物可以包括PNA、硫代磷酸核苷间连接键、含有允许标记物(例如荧光团或半抗原)附接的连接基团的碱基等。每当多核苷酸的使用需要酶促加工，例如通过聚合酶延长、通过连接酶连接等时，本领域普通技术人员将理解，在那些情况下，多核苷酸将在任何或一些位置不含有核苷间连接键、糖部分或碱基的某些类似物。多核苷酸的大小通常为几个单体单元，例如5-40个，至几千个单体单元。每当多核苷酸由字母序列(大写或小写)表示时，例如“ATGCCTG”，将理解，核苷酸从左至右为5’→3’的顺序，并且“A”表示脱氧腺苷，“C”表示脱氧胞苷，“G”表示脱氧鸟苷，以及“T”表示胸苷，“I”表示脱氧肌苷，“U”表示尿苷，除非另有说明或从上下文显而易见。除非另有说明，否则术语和原子编号惯例将遵循Strachan and Read, Human Molecular Genetics 2 (Wiley-Liss, New York, 1999)中公开的术语和原子编号惯例。通常，多核苷酸包含通过磷酸二酯连接键连接的四种天然核苷(例如，对于DNA而言，脱氧腺苷、脱氧胞苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷，或者对于RNA而言，它们的核糖对应物)；然而，它们也可以包含非天然核苷酸类似物，例如包括修饰的碱基、糖或核苷间连接键。本领域技术人员明白，当酶具有特定的多核苷酸底物活性需求时，例如单链DNA、RNA/DNA双链体等，那么选择多核苷酸底物的合适组成完全在普通技术人员的知识范围内，特别是在论文，例如Sambrook et al, Molecular Cloning, Second Edition (ColdSpring Harbor Laboratory, New York, 1989)以及类似的参考文献的指导下。同样，多核苷酸可以指单链形式或双链形式(即多核苷酸及其相应互补物的双链体)。普通技术人员从术语使用的上下文中可以明白意在哪种形式或是否意在两种形式。

Claims (20)

1.用于喷墨打印的在基底上的反应位点酶促合成多个多核苷酸的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)提供在多个反应位点具有引发剂的基底，其中每个引发剂具有游离3’-羟基，并且其中所述多个多核苷酸中的每个多核苷酸被指派到反应位点用于合成；

(b)将至少一种合成试剂的至少一个液滴分配到多个反应位点中的每个反应位点以进行反应循环，所述反应循环包括以下步骤：(i)在延伸条件下，使具有游离3’-O-羟基的引发剂或延伸片段与3’-O保护的核苷三磷酸和无模板聚合酶反应，使得所述引发剂或延伸片段通过掺入3’-O保护的核苷三磷酸而延伸，以形成3’-O保护的延伸片段，以及(ii)使所述延伸片段脱保护以形成具有游离3’-羟基的延伸片段，其中所述合成试剂包含无模板聚合酶、3’-O保护的核苷三磷酸、无模板聚合酶和3’-O保护的核苷三磷酸的混合物或脱保护溶液；其中所述至少一种合成试剂包含可变粘度改性剂，所述可变粘度改性剂在所述至少一个液滴的形成期间具有第一粘度，并且在所述反应循环的反应步骤期间在所述多个反应位点中的每个反应位点具有第二粘度；

(c)重复步骤(b)，直到合成所述多个多核苷酸；

其中所述第一粘度和所述第二粘度不同。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一粘度大于2 mPa.s，并且所述第二粘度小于或等于2 mPa.s。

3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一粘度为2 mPa.s至20 mPa.s，不含端点；并且所述第二粘度为1 mPa.s至2 mPa.s，包含端点。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述至少一种合成试剂是无模板聚合酶油墨。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述可变粘度改性剂包含粘度随温度升高而降低的热可逆聚合物。

6.根据权利要求1至4所述的方法，其中所述可变粘度改性剂包含冷却时胶凝的聚合物溶液。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述可变粘度改性剂包括聚乙烯醇、二甲基亚砜(DMSO)、聚乙二醇(PEG)、聚乙二醇甲基醚(OMe)PEG、聚乙二醇二甲醚(OMe)₂PEG、羧甲基纤维素、羟乙基纤维素，或它们的组合中的至少一种。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述步骤(b)还包括在所述脱保护的步骤之后洗涤所述延伸片段。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述反应位点中的每一个是不同的，并且与其它所述反应位点不重叠。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述反应的步骤包括将所述反应混合物孵育预先确定的持续时间。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其包括在所述反应的步骤之后，将未能延伸的所述具有游离3’-O-羟基的引发剂或延伸片段进行封端的步骤。

12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多个多核苷酸中的每个所述多核苷酸被指派到不同的反应位点用于合成。

13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述至少一种合成试剂的溶液不含甘油。

14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述可变粘度改性剂占所述至少一种合成试剂的溶液的体积的5%至50%，优选地，占所述至少一种合成试剂的溶液的体积的20%至40%。

15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中存在多于一种的合成试剂的溶液，每种溶液具有不同的可变粘度改性剂。

16.用于喷墨打印的无模板聚合酶油墨，其包含：水溶液，所述水溶液包含浓度为1.0 μM至30 μM的无模板聚合酶；其中每当所述油墨作为液滴打印到基底时，所打印的液滴各自具有所述水溶液的0.1pL至5nL的体积，并且其中所述油墨包含可变粘度改性剂，每当温度为5℃至30℃时，所述可变粘度改性剂具有2 mPa.s至20 mPa.s的第一粘度，并且每当温度为35℃至60℃时，所述可变粘度改性剂具有2 mPa.s至3 mPa.s的第二粘度；其中所述第一粘度和所述第二粘度不同。

17.根据前述权利要求所述的无模板聚合酶油墨，其中所述可变粘度改性剂包括聚乙烯醇、羧甲基纤维素、羟乙基纤维素、二甲基亚砜、聚乙二醇(PEG)、聚乙二醇甲基醚(OMe)PEG、聚乙二醇二甲醚(OMe)₂PEG，或它们的组合中的至少一种。

18.根据权利要求16至17中任一项所述的无模板聚合酶油墨，其中所述可变粘度改性剂占所述至少一种合成试剂的溶液的体积的5%至50%，优选地，占所述至少一种合成试剂的溶液的体积的20%至40%。

19.根据权利要求16至18中任一项所述的无模板聚合酶油墨，其中所述可变粘度改性剂包含冷却时胶凝的聚合物溶液。

20.根据权利要求16至19中任一项所述的无模板聚合酶油墨，其中所述油墨不含甘油。