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CN120608008B - 一株工程改造的枯草芽孢杆菌、制备方法及其应用 - Google Patents

一株工程改造的枯草芽孢杆菌、制备方法及其应用

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CN120608008B
CN120608008B CN202511084755.9A CN202511084755A CN120608008B CN 120608008 B CN120608008 B CN 120608008B CN 202511084755 A CN202511084755 A CN 202511084755A CN 120608008 B CN120608008 B CN 120608008B
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Shandong Jincheng Bio Pharmaceutical Co ltd
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Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一株工程改造的枯草芽孢杆菌、制备方法及其应用。本发明中，为提升枯草芽孢杆菌发酵生产胞磷胆碱过程中前体胞苷三磷酸（CTP）的供应，首先过表达去反馈抑制的CTP合成酶PyrGE156K，促进尿苷三磷酸到CTP的转化；然后敲除嘧啶操纵子的阻遏蛋白基因pyrR，促进尿苷单磷酸的合成，进而促进CTP的合成；最后敲除嘧啶核苷酸降解基因pdp和cdd，分别阻断尿苷/胞苷到尿嘧啶/胞嘧啶的转化及胞苷到尿苷的转化，减少嘧啶核苷酸的消耗，进而有利于CTP的胞内积累。最终构建的工程菌胞磷胆碱产量约是原始出发菌产量的12.6倍，本发明的结果进一步证明了CTP对于胞磷胆碱合成的重要性。

Description

一株工程改造的枯草芽孢杆菌、制备方法及其应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一株工程改造的枯草芽孢杆菌、制备方法及其应用。
背景技术
胞磷胆碱，又称胞苷-5′-二磷酸胆碱，其是生物体内磷脂酰胆碱合成途径的关键中间体，对于维持神经元膜的结构完整与功能至关重要。作为合成神经递质乙酰胆碱的前体，胞磷胆碱的规模化生产至关重要。
现阶段，关于胞磷胆碱的发酵生产菌株已有诸多报道，如专利CN115896211A、专利CN116144559A等均披露了以大肠杆菌作为初始菌株进行改造的重组工程菌，另外，专利CN116790466A中公开了对枯草芽孢杆菌进行改造制备胞磷胆碱的发酵菌株。然而，上述的基因重组菌株仍然存在胞磷胆碱发酵产量低、发酵原料成本高等问题，严重的限制了胞磷胆碱的工业化生产规模。
其中，磷酸胆碱胞苷酰转移酶（CCT）催化磷酸胆碱与胞苷三磷酸（CTP）反应生成胞磷胆碱，因此，CTP是合成胞磷胆碱的重要前体之一。在微生物体内，尿苷三磷酸（UTP）氨化生成CTP，而尿苷单磷酸（UMP）又是合成UTP的前体，而且CTP又会转化成胞苷单磷酸（CMP），UMP、CMP等又会转化成尿苷、胞苷，进一步转化成尿嘧啶、胞嘧啶等成分，进而影响CTP的胞内积累。
因此，通过对枯草芽孢杆菌的CTP前体供应的相关基因进行改造，以保证发酵过程中的能量供应，避免碳源的额外损耗，对提高枯草芽孢杆菌的胞磷胆碱发酵效果意义重大。
发明内容
为了解决上述的技术问题，本发明提供了一株工程改造的枯草芽孢杆菌、制备方法及其应用。
本发明的第一个方面是，提供了一株工程改造的枯草芽孢杆菌，所述工程改造的枯草芽孢杆菌是通过对枯草芽孢杆菌BSC1-4进行（a1）-（a4）中的至少一种改造实现的：
（a1）引入或过表达编码去反馈抑制的胞苷三磷酸合成酶的基因，所述的基因为pyrG基因突变体，其编码的PyrG蛋白在第156位的谷氨酸被赖氨酸取代；
（a2）失活或敲除编码嘧啶核苷酸操纵子阻遏蛋白的基因pyrR；
（a3）失活或敲除编码嘧啶核苷酸磷酸化酶的基因pdp；
（a4）失活或敲除编码胞苷脱氨酶的基因cdd。
作为优选的，在对枯草芽孢杆菌BSC1-4进行改造之前，还需要阻断枯草芽孢杆菌BSC1-4对氯化胆碱旁路代谢的通路，同时，过表达opuD，并敲除转录阻遏基因opcR，以强化氯化胆碱的利用与吸收。
所述的枯草芽孢杆菌BSC1-4为发明人专利CN116790466B中所公开的菌株。
作为进一步优选的，所述阻断枯草芽孢杆菌对氯化胆碱旁路代谢通路的方法为：失活或敲除编码胆碱脱氢酶的基因gbsB以及编码甘氨酸甜菜碱醛脱氢酶的基因gbsA。
本发明的第二个方面是，提供了所述工程改造的枯草芽孢杆菌在发酵生产胞磷胆碱中的应用。
进一步的，本发明还提供了所述的工程改造的枯草芽孢杆菌发酵生产胞磷胆碱的方法，包括以下的步骤：
S1菌株的活化：将保存在甘油管中的菌株在LB琼脂平板上划线活化；
S2种子液的制备：在S1的平板上挑取单菌落，接种于LB液体培养基中，于35-40℃、150-220 rpm的条件下振荡培养10-18 h，制备成种子液；
S3发酵培养：将S2中的种子液转接入发酵培养基中，进行发酵培养，在发酵3-6 h后加入终浓度为0.8-1.5 g/L的氯化胆碱，继续发酵，总发酵时长为24-30 h，获得发酵液；
S4胞磷胆碱的收集：取S3中的发酵液，加入去离子水混匀后置于冰水浴中，使用超声波细胞破碎仪进行破碎，进行第一次离心，取上清液，将上清液在80-100℃条件下热处理3-8 min，随后进行第二次离心，取上清液，获得胞磷胆碱。
上述的方法中，作为优选的，S1中所述的LB培养基的成分为：胰蛋白胨6-15 g/L、酵母提取物3-8 g/L、NaCl 5-20 g/L。
作为优选的，S2中所述的摇瓶发酵培养基的成分为：葡萄糖30-50 g/L、玉米浆干粉6-25 g/L、胰蛋白胨8-12 g/L、酵母提取物3-6 g/L、NaCl 6-12 g/L、(NH4)2SO48-15 g/L、KH2PO41-5 g/L、K2HPO45-10 g/L、MgSO4·7H2O 0.5-2 g/L，pH为7.0-7.5。
作为优选的，S3中种子液的接种量为0.5%-1.2%（v/v）。
作为优选的，S4中，所述的第一次离心条件为在6000-8000 rpm下离心8-15 min，所述的第二次离心的条件为在10000-15000 rpm下离心8-12 min。
本发明的有益效果在于：
本发明通过引入或过表达编码去反馈抑制的胞苷三磷酸合成酶的基因，并对嘧啶核苷酸合成及降解途径进行修饰，减少了嘧啶核苷酸的消耗、阻断尿苷/胞苷到尿嘧啶/胞嘧啶的转化、胞苷到尿苷的转化，促进UMP的从头连续合成，进而促进CTP的胞内积累，进一步强化了工程菌发酵生产胞磷胆碱过程中对CTP的利用。
附图说明
图1为本发明所提供用于生产胞磷胆碱工程菌的代谢途径及系统性改造策略示意图；
其中，OpuB，OpuC，OpuD：胆碱转运蛋白；OpcR：胆碱转运蛋白OpuB和OpuC的转录阻遏蛋白；CKI：编码胆碱激酶；CCT：编码磷酸胆碱胞苷酰转移酶；UMP：尿苷单磷酸；UTP：尿苷三磷酸；CTP：胞苷三磷酸；CMP：5-胞苷单磷酸；PPi：焦磷酸；PyrR：嘧啶核苷酸操纵子（pyroperon）的转录阻遏蛋白；pyrG E156K：编码去反馈抑制的CTP合成酶；pdp：编码嘧啶核苷酸磷酸化酶；cdd：编码胞苷脱氨酶。
具体实施方式
为了能使本领域技术人员更好的理解本发明，现结合具体实施方式对本发明进行更进一步的阐述。
一、本发明所涉及菌株、质粒和培养基的准备及来源。
本发明涉及的所有菌株和质粒信息详见表1，引物由擎科生物公司合成。
LB培养基：胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 10 g/L，用于枯草芽孢杆菌的一般培养，固体培养基添加15 g/L琼脂粉，需要时加入新霉素16 μg/mL，或氯霉素8 μg/mL。
摇瓶发酵培养基：葡萄糖40 g/L、玉米浆干粉10 g/L、胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 10 g/L、(NH4)2SO410 g/L、KH2PO43 g/L、K2HPO48 g/L、MgSO4·7H2O 1 g/L，pH为7.2，发酵4 h后，加入终浓度为1 g/L的氯化胆碱。
分批补料初始培养基：同摇瓶发酵培养基，补料培养基由600 g/L的葡萄糖和20g/L的MgSO4·7H2O以及30 g/L氯化胆碱组成。
表1 实验中涉及的菌株和质粒
二、本发明中涉及的引物及序列。
二、本发明中涉及的引物及序列。
用于PCR的引物见表2。
表2 PCR引物序列
引物 序列名称 序列(5'→3')
pksL-U1 SEQ ID No.1 TGCCTCCTGTAATCTCTGA
pksL-U2 SEQ ID No.2 GCCATCTAAGTGTCCGAAA
pksL-D1q SEQ ID No.3 TTTTCGGACACTTAGATGGCGGCACACAACATTGATGAAT
pksL-D2 SEQ ID No.4 TTGATTTGGCTGACTCTATTG
pksL-CR1q SEQ ID No.5 GCAATAGAGTCAGCCAAATCAATCTTCAACTAAAGCACCCAT
CR2 SEQ ID No.6 TTATTCATTCAGTTTTCGTG
pksL-G1q SEQ ID No.7 GCACGAAAACTGAATGAATAAAGGCTGATTACGCAATGG
pksL-G2 SEQ ID No.8 CTTACCTGCTTCTGCTCTT
pksL-U2q SEQ ID No.9 TCTACTATGTTCTCTCTTCCTTTTGCCATCTAAGTGTCCGAAA
pyrG-P1 SEQ ID No.10 AAAAGGAAGAGAGAACATAGTAG
pyrG-2 SEQ ID No.11 CTTTAAGGAATGGCAGTGATT
pyrG-3 SEQ ID No.12 AATCACTGCCATTCCTTAAAG
pyrG-4 SEQ ID No.13 CACCACTGTTTGTCTATCAC
pksL-pD1q SEQ ID No.14 CGTGATAGACAAACAGTGGTGGGCATACAACATTGATGAAT
pyrR-U1 SEQ ID No.15 CCTCGGACTTATGCTTGG
pyrR-U2 SEQ ID No.16 TCCTGCCAGAGCATAGAG
pyrR-D1q SEQ ID No.17 CCTCTATGCTCTGGCAGGATCAACAATCAGGGGGAAAT
pyrR-D2 SEQ ID No.18 CGCTGAATACTCTTGTGATG
pyrR-CR1q SEQ ID No.19 CCATCACAAGAGTATTCAGCGTCATCAACTAAAGCACCCAT
pyrR-G1q SEQ ID No.20 CGCACGAAAACTGAATGAATAACTATATGAACTGTGAGGTGTC
pyrR-G2 SEQ ID No.21 TGCTGAAGGCTGAATGAA
pdp-U1 SEQ ID No.22 TGAATGTTCTCTTGCCAATC
pdp-U2 SEQ ID No.23 CACCTTAGCCATCGTCAA
pdp-D1q SEQ ID No.24 ACTTGACGATGGCTAAGGTGCGGCGAAGGTGATTCATA
pdp-D2 SEQ ID No.25 AGTGTATGGATGTGGAGTG
pdp-CR1q SEQ ID No.26 GCACTCCACATCCATACACTTCTTCAACTAAAGCACCCAT
pdp-G1q SEQ ID No.27 CGCACGAAAACTGAATGAATAACTTGTTGGGGCTCTTGAT
pdp-G2 SEQ ID No.28 CCGATGAGGATGTTGTCA
cdd-U1 SEQ ID No.29 AATCCTAACCATCCGCTATT
cdd-U2 SEQ ID No.30 GTACCGCTATCACTTTATATTTTAC
cdd-D1q SEQ ID No.31 TGTAAAATATAAAGTGATAGCGGTACGGAAGAATTATTGCCAGGC
cdd-D2 SEQ ID No.32 AACACAAGAAACCCACCTTT
cdd-CR1q SEQ ID No.33 AAAGGTGGGTTTCTTGTGTTTCTTCAACTAAAGCAGCCAT
cdd-G1q SEQ ID No.34 CGCACGAAAACTGAATGAATAAAAGTGATAGAGGAACCATTA
cdd-G2 SEQ ID No.35 TGGCAATAATTCTTCCACAG
实施例1
一株工程改造的枯草芽孢杆菌，制备方法如下：
首先，阻断枯草芽孢杆菌对氯化胆碱旁路代谢的通路，采用本领域技术人员所公知的常规技术手段敲除编码胆碱脱氢酶的基因gbsB、编码甘氨酸甜菜碱醛脱氢酶的基因gbsA、编码胆碱转运蛋白转录阻遏蛋白的基因opcR，同时，根据专利CN116790466B中的方法，过表达opuD以强化氯化胆碱的吸收，获得氯化胆碱旁路代谢且氯化胆碱吸收强化的菌株BSC5-1。
接着，构建pksL敲除菌株作为对照：以BS168N的基因组为模板，分别利用引物对pksL-U1/pksL-U2、pksL-D1q/pksL-D2和pksL-G1q/pksL-G2扩增片段U（SEQ ID No.36，1118bp）、片段D（SEQ ID No.37，1004 bp）和片段G（SEQ ID No.38，769 bp）；以BS168N/ΔyrpCm的基因组为模板，用引物对pksL-CR1q/CR2扩增片段CR（见专利CN116790466B所公开的，以下均同，不再赘述），然后将片段U、片段D、片段CR和片段G拼接成片段UDCRG（SEQ ID No.39，4960 bp），并将其转化至BSC5-1的感受态细胞，获得pksL敲除菌株BSC6。
构建pyrG E156K过表达菌株：以BSC6m的基因组为模板，分别利用引物对pksL-U1/pksL-U2q、pyrG-3/pyrG-4和pksL-pD1q/pksL-G2扩增片段U（SEQ ID No.40，1118 bp）、含有pyrG后半部分基因序列的片段G2（SEQ ID No.41，1306 bp）和片段DCRG（SEQ ID No.42，3842 bp）；以质粒pUC57-simple-PyrGE156K为模板，利用引物对pyrG-P1/pyrG-2扩增含有P SB 启动子以及pyrG前半部分基因序列（含突变E156K）的片段G1（SEQ ID No.43，576 bp），将片段U、片段PG1、片段G2和片段DCRG拼接成片段UPG1G2DCRG（SEQ ID No.44，6842 bp），并将其转化至BSC5-1的感受态细胞，获得P SB -pyrG E156K在pksL位点整合表达的pyrG E156K过表达菌株重组菌株BSC7。
pyrR、pdp、cdd等基因的敲除，具体操作如下：
以BS168N的基因组为模板，分别利用引物对pyrR-U1/pyrR-U2、pyrR-D1q/pyrR-D2和pyrR-G1q/pyrR-G2扩增片段U（SEQ ID No.45，1258 bp）、片段D（SEQ ID No.46，960 bp）和片段G（SEQ ID No.47，820 bp）；以BS168N/ΔyrpCm的基因组为模板，用引物对pyrR-CR1q/CR2扩增片段CR，将片段U、片段D、片段CR和片段G拼接成片段UDCRG（SEQ ID No.48，5107 bp），并将其转化至BSC7的感受态细胞，获得pyrR敲除菌株BSC8。
以BS168N的基因组为模板，分别利用引物对pdp-U1/pdp-U2、pdp-D1q/pdp-D2和pdp-G1q/pdp-G2扩增片段U（SEQ ID No.49，1129 bp）、片段D（SEQ ID No.50，1128 bp）和片段G（SEQ ID No.51，962 bp）；以BS168N/ΔyrpCm的基因组为模板，用引物对pdp-CR1q/CR2扩增片段CR，将片段U、片段D、片段CR和片段G拼接成片段UDCRG（SEQ ID No.52，5288 bp），并将片段UDCRG转化至BSC8的感受态细胞，获得pdp敲除菌株BSC9-6。
以BS168N的基因组为模板，分别利用引物对cdd-U1/cdd-U2、cdd-D1q/cdd-D2和cdd-G1q/cdd-G2扩增片段U（SEQ ID No.53，1601 bp）、片段D（SEQ ID No.54，1099 bp）和片段G（SEQ ID No.55，408 bp）；以BS168N/ΔyrpCm的基因组为模板，用引物对cdd-CR1q/CR2扩增片段CR，将片段U、片段D、片段CR、片段G拼接成片段UDCRG（SEQ ID No.56，5177 bp），并将片段UDCRG转化至BSC8的感受态细胞，获得cdd敲除菌株BSC9-7。
此外，同时敲除pdp和cdd的双敲除菌株，命名为BSC9-8。
实施例2
采用实施例1所制备的各种工程改造的枯草芽孢杆菌发酵生产胞磷胆碱的方法，包括以下的步骤：
S1菌株的活化：将各工程改造的枯草芽孢杆菌在LB琼脂平板上划线活化；
S2种子液的制备：在S1的平板上挑取单菌落，接种于装有5 mL LB液体培养基的试管中，于37℃、200rpm条件下振荡培养12 h，制备成种子液；
S3发酵培养：按照1%（v/v）的接种量，将S2中的种子液转接入装有30 mL发酵培养基的250 mL锥形瓶中，37℃、220 rpm的摇床中振荡培养，在发酵4 h后加入终浓度为1 g/L的氯化胆碱，继续发酵，总发酵时间为24 h，获得发酵液；
S4胞磷胆碱的收集：取S3中的发酵液，加入去离子水混匀后置于冰水浴中，使用超声波细胞破碎仪进行破碎，先于8000 rpm下离心10 min，取上清液，将上清液在100℃条件下热处理5 min，随后再于12000 rpm下离心10 min，取上清液，即得。
在发酵过程中，对菌悬液的OD600值以及发酵液中的胞磷胆碱总产量进行测定。
本发明中，胞磷胆碱的浓度通过高效液相色谱法（HPLC）进行测定。具体方法如下：
HPLC分析条件：高效液相色谱仪LC-2030（Shimadzu）；色谱柱，PC HILIC色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温，30℃；流动相A为0.5%甲酸水溶液，流动相B为乙腈/甲醇（8:2，v/v）溶液，A:B以4:6（v/v）的比例进行等度洗脱；流速，1.0 mL/min；检测器，紫外检测器；检测波长，280 nm；进样量，20 μL。
总胞磷胆碱浓度的测定：取S4中获得的上清液，用20%乙腈水（v/v）进行适当倍数稀释，过0.22 μm滤膜后即可进行HPLC分析。
采用对照菌株BSC5-1、pksL敲除菌株BSC6、pyrG E156K过表达菌株BSC7、pyrR敲除菌株BSC8、pdp敲除菌株BSC9-6、cdd敲除菌株BSC9-7以及pdp和cdd双敲除菌株9-8进行发酵，发酵过程中，各菌株的生长情况如表3所示。
表3 菌株生长情况
注：*示与对照菌相比具有显著差异（P＜0.05）；**示与对照菌相比具有极显著差异（P＜0.01）。
BSC6是BSC7的对照菌；BSC7是BSC8的对照菌；BSC8是BSC9-6、9-7和9-8的对照菌，同表4。
表3的结果显示，在BSC6的基础上过表达去反馈抑制的CTP合成酶（pyrG E156K）导致菌株BSC7的生长受到显著抑制，然而，在BSC7的基础上进一步敲除嘧啶操纵子阻遏蛋白基因pyrR后，菌株BSC8的生长水平得到了有效恢复，其他基因修饰对菌株生长无显著影响。
各菌株在发酵12 h和24 h后胞磷胆碱产量见表4所示。
表4 发酵12 h和24 h后不同菌株的胞磷胆碱产量（mg/L）
菌株 12 h 24 h
BSC5-1 757.6±9.9 1181.6±11.2
BSC6 749.3±14.2 1114.6#±15.9
BSC7 795.7##±6.1 1219.7##±14.3
BSC8 819.2##±4.3 1309.5##±3.0
BSC9-6 802.0#±6.5 1324.6##±1.4
BSC9-7 832.5#±4.3 1384.9##±5.1
BSC9-8 846.9#±17.2 1441.4##±15.7
表4的结果显示，发明中每一步基因修饰均带来了产量的稳定提升。菌株BSC7（过表达pyrG E156K）在生长受抑制的情况下，其24 h产量仍达到1219.7±14.3 mg/L，较其对照菌BSC6提升了9.4%，证明了强化CTP合成步骤的直接有效性；菌株BSC8（敲除pyrR）在恢复生长的同时，产量进一步提升至1309.5±3.0 mg/L，较BSC7提升了7.4%；在BSC8的基础上，通过敲除pdp和cdd基因阻断CTP降解途径，产量得到持续提高，其中，双敲除菌株BSC9-8表现出最佳性能，其24 h产量达到了1441.4±15.7 mg/L，较菌株BSC5-1，产量显著提升了22.0%，是原始的出发菌株BSC1-4产量（专利CN116790466B中114.3 mg/L）的12.6倍。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一株工程改造的枯草芽孢杆菌，其特征在于，通过对枯草芽孢杆菌BSC1-4进行以下的改造获得的，所述的枯草芽孢杆菌BSC1-4为专利CN116790466B中所公开的菌株：
首先，敲除枯草芽孢杆菌BSC1-4中编码胆碱脱氢酶的基因gbsB、敲除编码甘氨酸甜菜碱醛脱氢酶的基因gbsA、敲除编码胆碱转运蛋白转录阻遏蛋白的基因opcR，过表达opuD获得氯化胆碱旁路代谢且氯化胆碱吸收强化的菌株BSC5-1；
接着，在菌株BSC5-1的基础上，敲除pksL基因，引入或过表达编码去反馈抑制的胞苷三磷酸合成酶的基因，所述的基因为pyrG基因突变体，其编码的PyrG蛋白在第156位的谷氨酸被赖氨酸取代，获得在pksL位点整合表达的pyrG E156K过表达菌株，即所述工程改造的枯草芽孢杆菌，命名为BSC7。
2.如权利要求1所述的一株工程改造的枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述的改造还包括，在工程改造的枯草芽孢杆菌BSC7的基础上，进一步失活或敲除编码嘧啶核苷酸操纵子阻遏蛋白的基因pyrR，获得工程改造的枯草芽孢杆菌，命名为BSC8。
3.如权利要求2所述的一株工程改造的枯草芽孢杆菌，其特征在于，在工程改造的枯草芽孢杆菌BSC8的基础上，进一步进行以下改造中的至少一种：
失活或敲除编码嘧啶核苷酸磷酸化酶的基因pdp；
失活或敲除编码胞苷脱氨酶的基因cdd。
4.权利要求1-3中任一项所述的工程改造的枯草芽孢杆菌在发酵生产胞磷胆碱中的应用。
5.采用如权利要求1-3中任一项所述的工程改造的枯草芽孢杆菌发酵生产胞磷胆碱的方法，其特征在于，包括以下的步骤：
S1菌株的活化：将保存在甘油管中的菌株在LB琼脂平板上划线活化；
S2种子液的制备：在S1的平板上挑取单菌落，接种于LB液体培养基中，于35-40℃、150-220 rpm的条件下振荡培养10-18 h，制备成种子液；
S3发酵培养：将S2中的种子液转接入发酵培养基中，进行发酵培养，在发酵3-6 h后加入终浓度为0.8-1.5 g/L的氯化胆碱，继续发酵，总发酵时长为24-30 h，获得发酵液；
S4胞磷胆碱的收集：取S3中的发酵液，加入去离子水混匀后置于冰水浴中，使用超声波细胞破碎仪进行破碎，进行第一次离心，取上清液，将上清液在80-100℃条件下热处理3-8min，随后进行第二次离心，取上清液，获得胞磷胆碱。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，S3中种子液的接种量为0.5%-1.2%。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，S4中，所述的第一次离心条件为在6000-8000rpm下离心8-15 min，所述的第二次离心的条件为在10000-15000 rpm下离心8-12 min。
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