[go: up one dir, main page]

CN120569200A - 用于改进癌症治疗的组合物和方法 - Google Patents

用于改进癌症治疗的组合物和方法

Info

Publication number
CN120569200A
CN120569200A CN202380091985.0A CN202380091985A CN120569200A CN 120569200 A CN120569200 A CN 120569200A CN 202380091985 A CN202380091985 A CN 202380091985A CN 120569200 A CN120569200 A CN 120569200A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cancer
cells
cell
pi3k
treating
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202380091985.0A
Other languages
English (en)
Inventor
苏达·拉奥
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
QIMR Berghofer Medical Research Institute
Original Assignee
Queensland Institute of Medical Research QIMR
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from AU2022903523A external-priority patent/AU2022903523A0/en
Application filed by Queensland Institute of Medical Research QIMR filed Critical Queensland Institute of Medical Research QIMR
Publication of CN120569200A publication Critical patent/CN120569200A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/535—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines
    • A61K31/5365—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/4164—1,3-Diazoles
    • A61K31/4184—1,3-Diazoles condensed with carbocyclic rings, e.g. benzimidazoles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/4427—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof containing further heterocyclic ring systems
    • A61K31/4439—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof containing further heterocyclic ring systems containing a five-membered ring with nitrogen as a ring hetero atom, e.g. omeprazole
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/445—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine
    • A61K31/4523—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine containing further heterocyclic ring systems
    • A61K31/454—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine containing further heterocyclic ring systems containing a five-membered ring with nitrogen as a ring hetero atom, e.g. pimozide, domperidone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/4738—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/4745—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems condensed with ring systems having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. phenantrolines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/50—Pyridazines; Hydrogenated pyridazines
    • A61K31/501—Pyridazines; Hydrogenated pyridazines not condensed and containing further heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/50—Pyridazines; Hydrogenated pyridazines
    • A61K31/502—Pyridazines; Hydrogenated pyridazines ortho- or peri-condensed with carbocyclic ring systems, e.g. cinnoline, phthalazine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/50—Pyridazines; Hydrogenated pyridazines
    • A61K31/5025—Pyridazines; Hydrogenated pyridazines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/535—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines
    • A61K31/5375—1,4-Oxazines, e.g. morpholine
    • A61K31/5377—1,4-Oxazines, e.g. morpholine not condensed and containing further heterocyclic rings, e.g. timolol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/535—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines
    • A61K31/5375—1,4-Oxazines, e.g. morpholine
    • A61K31/5383—1,4-Oxazines, e.g. morpholine ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/55—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having seven-membered rings, e.g. azelastine, pentylenetetrazole
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/56—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids
    • A61K31/58—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids containing heterocyclic rings, e.g. danazol, stanozolol, pancuronium or digitogenin
    • A61K31/585—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids containing heterocyclic rings, e.g. danazol, stanozolol, pancuronium or digitogenin containing lactone rings, e.g. oxandrolone, bufalin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39541—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against normal tissues, cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本公开总体上涉及用于治疗癌症的组合物和方法。更具体地，本公开涉及组合物及其在改变肿瘤细胞的上皮细胞向间充质细胞转化或间充质向上皮细胞转化中的一种中的用途。所述方法包括给受试者施用包含PI3K抑制剂如paxalisib(GDC‑0084)和不靶向癌症干细胞(CSC)的免疫疗法的组合物，其中所述免疫疗法是免疫检查点拮抗剂或PARP抑制剂。

Description

用于改进癌症治疗的组合物和方法
技术领域
本发明总体上涉及组合物及其在治疗癌症中的用途。更具体地，本发明涉及组合物及其在改变肿瘤细胞的上皮细胞向间充质细胞转化或间充质向上皮细胞转化中的一种中的用途。
背景技术
本说明书中提及的任何先前出版物(或从中衍生的信息)或任何已知事项不是，也不应被视为确认、承认或以任何形式暗示该先前出版物(或者从中衍生出的信息)或者已知事项构成本说明书所涉领域的公知常识的一部分。
磷脂酰肌醇是细胞膜中发现的许多磷脂之一，在细胞内信号转导中起着重要作用。通过3'-磷酸化磷酸肌醇的细胞信号传导与多种细胞过程有关，例如恶性转化、生长因子信号传导、炎症和免疫(Rameh等人(1999)J.Biol Chem，274:8347-8350)。负责产生这些磷酸化信号产物的酶，磷脂酰肌醇3-激酶(也称为PI 3-激酶或PI3K)，最初被鉴定具有与病毒癌蛋白和生长因子受体酪氨酸激酶相关的活性，这些激酶在肌醇环的3'-羟基处将磷脂酰肌醇(PI)及其磷酸化衍生物磷酸化(Panayotou等人(1992)Trends Cell Biol 2:358-60)。
磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)是在肌醇环的3-羟基残基磷酸化脂质的脂质激酶(Whitman等人(1988)Nature，332:664)。由PI3激酶产生的3-磷酸化磷脂(PIP3)充当具有脂质结合结构域(包括plekstrin同源性(PH)区域)的第二信使招募激酶，如Akt和磷酸肌醇依赖性激酶-1(PDK1)。Akt与膜PIP3的结合导致Akt移位到质膜，使Akt与PDK1接触，PDK1负责激活Akt。肿瘤抑制性磷酸酶PTEN使PIP3去磷酸化，因此充当Akt激活的负调节因子。PI3-激酶Akt和PDK1在包括细胞周期调节、增殖、存活、凋亡和运动性在内的许多细胞过程的调节中是重要的，并且是诸如癌症、糖尿病和免疫炎症的疾病的分子机制的重要组分(Vivanco等(2002)Nature Rev.Cancer 2:489；Phillips等人(1998)Cancer 83:41)。
癌症中主要的PI3K亚型是I类PI3-激酶p110α(alpha)(如美国专利5824492；5846824；6274327所述)。其他亚型与心血管和免疫炎症性疾病有关(Workman P(2004)Biochem Soc Trans 32:393-396；Patel等人(2004)Proceedings ofthe AmericanAssociation ofCancer Research(Abstract LB-247)95thAnnual Meeting,March 27-31,Orlando,Florida,USA；Ahmadi K和Waterfield MD(2004)Encyclopedia ofBiologicalChemistry(Lennarz W J,Lane M D eds)ElsevierAcademic Press)。PI3K/Akt/PTEN途径是癌症药物开发的有吸引力的靶点，因为这种调节剂或抑制剂有望抑制癌症细胞中的增殖、逆转癌症细胞中的细胞凋亡的抑制和克服癌症细胞对细胞毒性剂的耐药性(Folkes等人(2008)J.Med.Chem.51:5522-5532；Yaguchi等人(2006)Jour，ofthe Nat.CancerInst.98(8):545-556)。
然而，尽管有许多临床研究调查了使用PI3K抑制剂治疗许多实体瘤，但还没有候选药物进入临床。因此，需要进一步的工作来成功利用这些有前景的候选药物来提高疗效并降低用于这些具有挑战性疾病的毒性。
发明内容
本发明基于PI3K抑制剂在抑制EMT、抑制癌症干细胞(CSC)的形成和维持以及诱导间充质向上皮转化(MET)方面具有显著活性的发现，这使得它们可用于治疗一系列癌症(例如实体瘤)，包括复发性癌症。
在本发明的一个方面，提供了一种改变PI3K过表达细胞的上皮向间充质细胞转化或间充质向上皮细胞转化的方法，包括使PI3K过度表达细胞与包含PI3K抑制剂和不靶向癌症干细胞(CSC)的免疫疗法的组合物接触。
在另一个方面，本发明提供了治疗或预防受试者中癌症的方法，其中所述癌症包括至少一种PI3K过表达细胞，所述方法包括向所述受试者施用包含PI3K抑制剂和不靶向癌症干细胞(CSC)的免疫疗法的组合物。在向受试者施用组合物之前，可以筛查受试者中一种或多种生物标志物CSV、EGRF、ABCB5、SoX9、SNAIL、AKT1、EpCAM、MDA5、TIM3、TIGIT、PD1、TOX1、EOMES和E-cadherin的表达。
在一些实施方案中，PI3K过表达细胞是CSC。在一些实施方案中，PI3K过表达细胞是CSC肿瘤细胞。
在一些实施方案中，PI3K过表达细胞表达一种或多种间充质/癌症干细胞标志物，选自CSV、EGRF和ABCB5、SoX9、SNAIL和AKT1。
上皮细胞的特征在于表达EpCAM和MDA5中的一种或两种。此外，在一些实施方案中，受试者包括表达TIM3、TIGIT、PD1、TOX1和EOMES中的一种或多种的CD8+T细胞群。通常，上皮细胞表达包含E-钙粘蛋白的上皮细胞标志。
在一些实施方案中，靶向CSC的免疫疗法是免疫检查点分子(ICM)拮抗剂。例如，ICM拮抗剂可选自PD1拮抗剂、PD-L1拮抗剂、CTLA4拮抗剂或PD-L2拮抗剂。在一些实施方案中，ICM拮抗剂是抗原结合分子(例如抗体)。
在一些替代实施方案中，免疫疗法是PARP抑制剂。
例如，PARP抑制剂可适当地选自奥拉帕尼(Olaparib)、他拉唑帕利(talazoparib)、维利帕尼(veliparib)、尼拉帕利(niraparib)和鲁卡帕尼(rucaparib)。
通常，PI3K抑制剂是一种催化型PI3K抑制剂。作为说明性实例，PI3K抑制剂可选自paxalisib(GDC-0084)、艾代拉里斯、LY294002、3-甲基腺嘌呤、阿培利司、槲皮素(quercetin)、渥曼青霉素、GNE-490、PI3K-IN-36、740Y-P、AZD-7648、布帕尼西、伊那利塞(inavolisib)、达克利司(dactolisib)、库潘尼西(Copanlisib)、eganelisib、匹替利司、SAR405、度维利塞、taselisib、recilisib、YM-201636、奥米帕利西布(omipalisib)、PI-103、α-亚麻酸、非美诺司他和异鼠李素。
在一些优选实施方案中，PI3K抑制剂是paxalisib(GDC-0084)。
在本发明的另一个方面，提供了PI3K抑制剂和不靶向癌症干细胞(CSC)的免疫疗法用于治疗T细胞功能失调性病症，或用于增强癌症个体的免疫功能(例如免疫效应器功能、T细胞功能等)，用于治疗或延迟癌症的进展，或用于治疗癌症的复发的用途。
在另一个方面，本发明提供了PI3K抑制剂和不靶向癌症干细胞(CSC)的免疫疗法在制备用于治疗患有癌症的个体的T细胞功能失调病症，或用于增强其免疫功能(例如，免疫效应器功能、T细胞功能等)，用于治疗或延迟癌症的进展，或用于治疗癌症的复发的药物中的用途。
在一些实施方案中，PI3K抑制剂和免疫疗法被配制为同时施用。
在另一个方面，本发明提供了PI3K抑制剂、不靶向癌症干细胞(CSC)的免疫疗法和辅助剂(例如，化学治疗剂)用于治疗或辅助治疗患有癌症的个体中T细胞功能失调病症，或用于增强免疫功能(例如，免疫效应器功能、T细胞功能等)，用于治疗或延迟癌症的进展，或用于治疗癌症的复发的用途。
在另一个方面，本发明提供了PI3K抑制剂、不靶向癌症干细胞(CSC)的免疫疗法和辅助剂(例如，化学治疗剂)在制备用于治疗或辅助治疗患有癌症的个体中T细胞功能失调病症、或用于增强免疫功能(例如，免疫效应器功能、T细胞功能等)、用于治疗或延迟癌症进展、或用于治疗癌症复发的药物中的用途。
在一些优选实施方案中，PI3K抑制剂、免疫疗法和辅助剂(例如化疗剂)被配制用于同时施用。
适当地，所述用途还可以包括在同时施用之前检测从受试者获得的样本中T细胞中TIM3、TIGIT、PD1、TOX1和EOMES中的一种或多种水平升高的步骤(例如，相对于活化T细胞中的TIM3、TIGIT、PD1、TOX2和EOMES的水平)。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种试剂盒，其包含含有PI3K抑制剂和任选的药学上可接受的载体的药物，以及包含指导材料的使用说明书，用于将所述药物与另一种药物同时施用，所述另一种药物包含不靶向癌症干细胞(CSC)的免疫疗法和任选的医学上可接受的载体，用于治疗患有癌症的个体的T细胞功能失调病症，或用于增强其免疫功能(例如，免疫效应器功能、T细胞功能等)，用于治疗或延迟癌症的进展，或用于治疗个体的癌症复发。
在又一个实施方案中，本发明提供了一种试剂盒，其包含药物、任选的药学上可接受的载体和使用说明书，所述药物包含不靶向癌症干细胞(CSC)的免疫疗法，所述使用说明书包含指导材料，用于将所述药物与另一药物同时施用，所述另一药物包含PI3K抑制剂和任选的医学上可接受载体，用于治疗患有癌症的个体的T细胞功能失调病症，或用于增强其免疫功能(例如免疫效应器功能、T细胞功能等)，用于治疗或延迟癌症的进展，或用于治疗个体的癌症复发。
在本发明的另一个方面，提供了一种试剂盒，其包含第一药物和第二药物，所述第一药物包含PI3K抑制剂和任选的药学上可接受的载体，所述第二药物包含不靶向癌症干细胞(CSC)的免疫疗法和任选的医学上可接受的载体，用于治疗患有癌症的个体的T细胞功能失调病症，或用于增强其免疫功能(例如，免疫效应器功能、T细胞功能等)，用于治疗或延迟癌症的进展，或用于治疗个体的癌症复发。适当地，所述试剂盒还包括使用说明书，所述使用说明书包括用于同时施用第一药物和第二药物的指导材料，用于治疗患有癌症的个体中的T细胞功能失调病症，或用于增强其免疫功能(例如，免疫效应器功能、T细胞功能等)，用于治疗或延迟癌症的进展，或用于治疗个体中的癌症复发。
在另一个方面，本发明提供了一种用于治疗受试者癌症的药物组合物，所述组合物包含单位剂量的PI3K抑制剂，其中当单独施用时，所述PI3K抑制剂的单位剂量小于治疗剂量的75％。
在一些实施方案中，PI3K抑制剂是GDC-0084，单位剂量相当于对受试者施用约11.25mg/kg或更低的剂量。适当地，PI3K抑制剂可以是GDC-0084，单位剂量相当于对受试者施用约7.5mg/kg或更低的剂量。还考虑的PI3K抑制剂是GDC-0084，所述单位剂量相当于对受试者施用约4mg/kg或更低的剂量。
在一些实施方案中，所述组合物进一步包含不靶向癌症干细胞(CSC)的免疫疗法。
在一些实施方案中，所述免疫疗法选自ICM拮抗剂(例如PD1拮抗剂、PDL1拮抗剂、CTLA4拮抗剂等)或PARP抑制剂。
附图说明
以下附图构成本说明书的一部分，并被包括以进一步演示本公开的某些方面。通过参考这些附图中的一个或多个并结合本文中呈现的具体实施方案的详细描述，可以更好地理解本公开。
图1：提供IV期转移性癌症生存期PI3K蛋白表达的KM生存图。
图2：使用我们优化的实验室方案，对来自免疫治疗耐受或免疫治疗应答队列的癌症患者的液体活检进行处理，以从液体活检样本中分离PBMC。然后对样本进行CSV、PI3KCA、ABCB5染色。
图3：在来自IV期转移性实体瘤患者的液体活检的CTC中使用ASI数字病理学对CSV、ABCB5、EpCAM、PI3KCA、AKT1(AKT1在促进侵袭和转移中起作用)荧光强度(FI)和群体动态(细胞群体百分比)进行测定，用GDC-0084或载体对照处理CTC。(A)示出了CSV、ABCB5两种间充质标志物和PI3KCA/AKT1(B)CSV+ABCB5+或EpCAM+细胞的百分比群体或PI3KC/AKT1的百分比群体。
图4：使用我们优化的实验室方案，对癌症IV期转移性实体瘤患者的液体活检进行处理，以从液体活检样本中分离PBMC。然后，对样本进行刺激(ST：在布雷菲尔丁A存在的情况下，用PMA/CaI刺激4小时)或不刺激(NS)和/或用GDC-0084抑制剂处理。然后对样本进行三组单独的标记染色。耗尽特征指标组：EOMES、PD1和CD8。检查点组：TIGIT、TIM3和CD8。效应特征指标组：穿孔素、GZNb和CD8。
图5：(A)MCF7(上皮性乳腺癌)、MDAMB231(间充质/CSC乳腺癌)、MDAM B231-Br(MDA-MB-231的脑癌版本)和4T1(高侵袭性、免疫治疗耐受小鼠乳腺癌)细胞系；和(B)对H1299(上皮样肺癌)、CT26(上皮样、高度免疫原性小鼠结肠肿瘤)和(LLC)高度耐治疗的Lewis肺癌细胞系进行PI3KCA标记染色。样本用Triton X-100渗透，用CSV的小鼠一级抗体、PI3KCA的兔一级抗体染色，用驴AF抗小鼠568、抗兔647检测。
图6示出了PI3K抑制剂GDC-0084对MDA-MB-231和CT26细胞迁移的影响。伤口愈合(划痕试验)分析GDC-0084对细胞迁移的影响，其中图像表示用DMSO对照、IC25浓度1.25μM的GDC-0084和IC50浓度2.5μM的GDC-0084处理的不同细胞系。(C)用PI3K抑制剂处理的MDA-MB-231的相对伤口密度的图示。黑条：DMSO对照；浅灰色条：IC25浓度1.25μM；深灰色条：IC50浓度2.5μM。误差条对应于八次重复的平均值±标准差。使用Tukey多重比较检验的双向方差分析计算P值，其中ns表示不显著，ns＝p>0.05；*表示P<0.05；**表示P<0.01；***表示P<0.001；****表示P<0.0001。
图7示出了GDC-0084对不同癌症细胞系的IC50。在剂量反应设计中，将WST-1细胞增殖试剂添加到用PI3K抑制剂预处理72小时的CT26、4T1和MCF7细胞中。通过甲臜的形成间接测量细胞增殖，并记录450nm处的吸光度。如方法所述，在使用Graphpad Prism软件计算EC50之前，确定增殖百分比(％)。
图8显示，奥拉帕尼治疗上调了一些耐药性、间充质标志物。MDA-MB-231细胞用溶剂(“CTRL”)或奥拉帕尼(“Ola.”)处理。通过免疫荧光染色定量分析癌症干细胞样耐药性标志物(ABCB5，ALDH1A)的表达。图像显示(A)ABCB5和(B)ALDH1A1的IF染色，并显示ABCB5、ALDH1A1的表达上调。***P≤0.001。该图表明PARP抑制可以上调癌症干细胞耐药性特征标志物。
图9显示，奥拉帕尼治疗未能抑制CSCs或细胞增殖：用奥拉帕尼处理MDA-MB-231细胞24小时。收集细胞，用APC/CD44和PE/CD24染色后进行流式细胞术。(A)显示了与对照组相比CSCs的抑制百分比，随后是代表性的流式细胞术图像。(B)MDA-MB-231细胞用三种不同浓度的奥拉帕尼或他拉唑帕利处理，并用WST-1测定法评估细胞增殖。
图10提供了PARP敲除的图形和照片表示。PARP1敲除是用两种不同浓度的PARP1siRNA进行的，5nM和10nM，其中5nM是我们实验室在其他细胞系中预先确定的最佳浓度。用siRNA孵育48小时后，将细胞在-80℃下快速冷冻。在RNA提取和cDNA合成后，进行TaqMan-qRT-PCR以定量mRNA表达。两种浓度均显著降低了PARP1 mRNA的表达(A)。图(B)和(C)显示了PARP的核荧光强度。该图表示三个独立实验的平均值±标准误差。*P≤0.05，**P≤0.01，***P≤0.001，****P<0.0001，双向方差分析。
图11显示PARP1敲除增加了抗性标志物的表达。MDA-MB-231细胞与5nM PARP1siRNA一起孵育48小时，然后提取RNA或合成cDNA，然后通过qPCR扩增，或固定细胞进行免疫荧光染色。(A，B)mRNA表达，(C，D)PARP1敲除后间充质标志物的免疫荧光强度，(E)PD-L1。显示了mRNA表达的相对倍数变化或总核荧光强度(TNFI)或总细胞质荧光强度(TCFI)的变化。*P≤0.05，**P≤0.01，***P≤0.001，****P<0.0001，双向方差分析。伤口愈合(划痕试验)分析GDC-0084联合奥拉帕尼对细胞迁移的影响。图像表示用(F)DMSO对照、(G)IC25浓度1.25μM的GDC-0084和5nM的奥拉帕尼(H)IC50浓度2.5μM的GDC-0084和250nM的奥拉帕尼处理的MDA-MB-231细胞系。误差条对应于八次重复的平均值±标准差(I)。使用Tukey多重比较检验的双向方差分析计算P值，其中ns表示不显著，ns＝P>0.05；*表示P<0.05；**表示P<0.01；***表示P<0.001；****表示P<0.0001。
图12显示了结肠癌CT26模型和4T1乳腺癌模型中的αPD1治疗。已经证明了使用Balb/c CT26(A)结肠癌模型和4T1(B)乳腺癌模型的治疗方案。用溶剂(IgG)或αPD1(10mg/kg)处理的小鼠的肿瘤体积(n＝5/组)。*p<0.05，**p<0.01，未配对t检验。
图13：PI3K抑制靶点和抑制间充质耐药标志物的表达。用对照或GDC-0084(在两种低浓度0.2或0.3μM下)处理4T1(A)或CT26(B)癌症细胞系。然后用Triton-X 100渗透样本，用CSV或EpCAM的小鼠一级抗体、EGFR或FOXN2的兔一级抗体或ABCB5的山羊一级抗体染色，用驴AF抗小鼠488、抗兔568或抗山羊647二级抗体检测。使用100倍物镜的ASI数字病理系统对蛋白质靶点进行成像。上面描绘了带有比例尺(橙色)的图像视野示例)。对EGFR的荧光强度、CSV的细胞质荧光强度(CFI)或ABCB5的整体荧光强度进行了比较分析。数据用PRISM绘制，用Kruskal-Wallis进行单因素方差分析。绘制了显著差异的图。
图14：PI3K抑制诱导免疫可见性标志物。用对照或GDC-0084(浓度为0.2或0.3mM)处理4T1(A)或CT26(B)癌症细胞系。然后用Triton-X 100渗透样本，用CSV或EpCAM的小鼠一级抗体、MDA5的兔一级抗体染色，用驴AF抗小鼠488、抗兔568或抗山羊647二级抗体检测。使用100倍物镜的ASI数字病理系统对蛋白质靶点进行成像。上面描绘了带有比例尺(橙色)的图像视野示例)。对荧光强度进行了比较分析。数据用PRISM绘制，用Kruskal-Wallis进行单因素方差分析。绘制了显著差异的图。
图15：PI3K抑制靶向并抑制干细胞样癌症干细胞癌症复发特征，并诱导上皮特征。MDA-MB-231TNBC癌症细胞系用对照或两种不同的PI3K抑制剂艾代拉里斯(两种低浓度12.5μM或25μM)或LY294002(两种低浓度2.5μM或5μM)处理。然后用Triton-X 100渗透样本，并用CSV或EpCAM的小鼠原代抗体、SoX9的兔原代抗体(SoX9是间充质癌症干细胞和进行性、治疗抗性癌症细胞的标志物)或ABCB5或SNAIL的PI3K或山羊原代抗体染色(11A和11B)，用驴AF抗小鼠488、抗兔568或抗山羊647二级抗体检测。使用40倍物镜的ASI数字病理系统对蛋白质靶点进行成像。上面描绘了带有比例尺(橙色)的图像视野示例。对SoX9的核荧光强度、CSV和EpCAM的细胞质荧光强度(CFI)或ABCB5或SNAIL的整体荧光强度进行了比较分析。数据用PRISM绘制，用Kruskal-Wallis进行单因素方差分析。绘制了显著差异的图。
图16：7.5mg/kg的GDC-0084施用可减少4T1同源肿瘤模型中的临床异常。4T1乳腺癌模型中的GDC-0084疗法。使用Balb/c 4T1乳腺癌模型的治疗方案。以7.5mg/kg(A)或15mg/kg每日施用GDC-0084(B)。(C)在GDC-0084单药治疗结束时，出现临床异常(活动减少、驼背姿势、竖毛、体重减轻和转移)的小鼠百分比。
图17：以7.5mg/kg的剂量施用GDC-0084可消除肿瘤负荷。在Balb/c 4T1乳腺癌模型中，从施用了(A)7.5mg/kg GDC-0084(C)15mg/kg+/-αPD1的小鼠收获的肿瘤的代表性图像。(B，D)用(B)7.5mg/kg GDC-0084(D)15mg/kg每日一次+/-αPD1(10mg/kg)处理的小鼠的原发肿瘤体积和最终肿瘤重量。数据以平均值±SEM表示。采用Tukey事后分析的单因素方差分析，***p<0.001，****p<0.0001(n＝5/组)。
图18：以7.5mg/kg的剂量施用GDC-0084可减少肿瘤炎症，包括单核细胞和中性粒细胞浸润。在Balb/c 4T1乳腺癌模型中，施用(A)7.5mg/kg GDC-0084或(B)15mg/kg每日一次+/-αPD1的小鼠的H&E染色肿瘤的代表性图像和肿瘤炎症的病理学评分。数据以平均值±SEM表示。采用Tukey事后分析的单因素方差分析，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001，ns＝不显著(n＝5/组)。
图19：在4T1同源肿瘤模型中，以7.5mg/kg的剂量施用GDC-0084可减少脾肿大。在Balb/c 4T1乳腺癌模型中，从施用(A)7.5mg/kg GDC-0084或(B)15mg/kg每日一次+/-αPD1的小鼠收获的脾的代表性图像。脾脏重量以平均值±SEM表示。Tukey事后分析的单因素方差分析，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001，ns＝不显著(n＝5/组)。
图20：以7.5mg/kg的剂量施用GDC-0084可降低SOX9和TOX1的表达。使用Qupath分析捕获的图像来描绘条形图，用于：
A)CSC特征(SOX9、PDL1、panCK)，分析了n>500000个细胞。
B)CD8功能障碍特征(CD8、TOX1、PD1)，分析了n>10000个细胞。
C)CSC特征(SOX9、PDL1、panCK)，分析了n>10000个细胞。
D)CD8功能障碍特征(CD8、TOX1、PD1)，分析了n>10000个细胞。Qupath分析用于选择DAPI阳性的细胞，然后根据SOX9荧光强度对PDL1和panCK阳性的CSC特征细胞进行评分。对于CD8功能障碍特征，选择DAPI阳性的细胞，然后选择CD8和PD1+，并根据TOX1荧光强度进行评分。图像取自Aperio FL荧光玻片扫描仪，该扫描仪拍摄了用对照、抗PD1免疫疗法、GDC-0084(高剂量C/D和低剂量A/B)或组合治疗的GDC小鼠模型的染色FFPE肿瘤切片。如前所述处理肺组织的FFPE切片，并对SOX9、PDL1、panCK或CD8、TOX1、PD1进行染色；DAPI用于细胞核染色。数据以平均值±标准差绘制，表示SOX9或TOX1的荧光强度。Tukey事后检验，ns＝无显著性，
***p<0.001，****p<0.0001。
图21：PI3K单药或组合抑制靶向间充质特征，并在免疫治疗耐受小鼠模型中诱导上皮表型。在BONDRX上用靶向PI3KCA、CSV、E-钙黏蛋白或EGFR的Opal染色试剂盒处理的FFPE原发性肿瘤样本。(A)-(D)使用ASI数字病理学确定PI3KCA、CSV、E-钙黏蛋白或EGFR荧光强度(FI)的定量。
图22：PI3K单药或组合在免疫治疗耐受小鼠模型中诱导上皮表型。在BONDRX上用靶向PI3KCA、CSV、E-钙黏蛋白或EGFR的Opal染色试剂盒处理的FFPE原发性肿瘤样本。使用ASI数字病理平台确定E钙粘蛋白表达阳性细胞的百分比。
图23：PI3K单药治疗或联合治疗诱导效应子和TRM特征。还通过用Opal染色试剂盒对FFPE肿瘤样本进行染色，并用ASI数字病理学分析图像，对CD8+IFNγ+T细胞阳性细胞(A)或组织驻留记忆细胞(CD103、CD69、CD44和CD8)的CD8+T细胞表达标志物(B)进行定量。Kruskal-Wallis非参数检验表明存在显著差异。
图24：PI3K单药或组合抑制CD8+T细胞中的检查点耗竭特征。用靶向CD8、LAG3和TIM3检查点标记的酪胺染色试剂盒处理的FFPE原发性肿瘤样本。使用ASI数字病理学平台确定每种标志物的阳性细胞百分比。计算总CD8+T细胞中TIM3和LAG3阳性CD8+T细胞的表达百分比。该图表示每组n＝3只小鼠，使用Kruskal-Wallis检验计算显著差异。ns＝无显著性，*p＝<0.02。
图25：联合PI3K抑制和免疫治疗可消除4T1免疫治疗耐受模型中的转移扩散。转移性乳腺癌4T1模型中的GDC-0084+/-αPD1治疗。(A)使用Balb/c 4T1乳腺癌模型的治疗方案。(B)接种后第20天，单个小鼠肺部存在转移性肿瘤结节，**p<0.01，Tukey事后试验。
图26：在4T1 TNBC模型中建立的GDC-0084的最佳治疗剂量。(A)使用Balb/c 4T1TNBC乳腺癌模型的治疗方案。(B)剂量递减实验的流程。在第一阶段，GDC-0084在第0天和第4天每天以15mg/kg+/-αPD1(10mg/kg)的剂量施用。在第二阶段，在第0天和第4天，将GDC-0084(高达15mg/kg)与αPD1联合施用，间隔4小时。在最后阶段，GDC-0084在第0天和第4天以单次日剂量(高达7.5mg/kg)与αPD1联合施用。(C)收获前每个实验阶段的单个小鼠的肿瘤体积(溶剂百分比)，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，ns不显著，未配对t检验或Dunnett事后检验，n＝4-5/组。
图27：降低GDC-0084的剂量可以提高小鼠的安全性。(A)在起始剂量、分次剂量递减和单次剂量递减实验期间监测小鼠体重。#表示小鼠死亡。(B)在收获时测量肝脏重量。*p<0.05，非配对t检验，n＝4-5/组。
图28：使用GDC-0084的最佳治疗剂量没有观察到肝毒性。病理专家对分次剂量递减和单次剂量递减实验中H&E染色的FFPE肝脏进行评分。(A)肝脏炎症、(B)髓外造血(EMH)和(C)肝细胞变化(代谢和/或变性)的变化对每个参数的评分为1＝轻度、2＝中度或3＝重度。与溶剂相比，*p<0.05，***p<0.001，****p<0.0001，Dunnett事后检验，n＝4-5/组。
图29：PI3K-mTOR抑制可减少脾脏的脾肿大和髓外造血。(A)在收获时，通过分次剂量递减和单次剂量递减实验测量脾脏重量。*p<0.05，**p<0.01，****p<0.0001，与溶剂相比，Dunnett事后检验，n＝4-5/组。(B)病理学家对H&E染色的FFPE脾脏进行评分。与溶剂相比，髓外造血(EMH)的变化评分为1＝轻度，2＝中度，或3＝重度。*p<0.01，***p<0.001，Dunnett事后检验，n＝4-5/组。
图30：PI3K-mTOR抑制可减少白细胞浸润肺部。专家病理学家对分次剂量递减和单次剂量递减实验中H&E染色的FFPE肺进行评分。与溶剂相比，白细胞增多症的变化评分为1＝轻度，2＝中度或3＝重度，*p<0.01，***p<0.001，Dunnett事后检验，n＝4-5/组。
图31：GDC-0084和αPD1联合治疗可预防淋巴结转移。(A)来自αPD1和GDC-0084(7.5mg/kg)以及PD1处理的4T1小鼠的H&E染色的FFPE淋巴结的图像。(B)淋巴结切片由独立专家病理学家检查，并给出1＝1-3个微小部位(宽度/长度<<0.5mm)的评分，2＝1-3，其中至少一个直径为0.5-1mm，或3＝2-3个或更多部位，所有部位都肉眼可见，有白细胞浸润和/或出血。
图32：GDC-0084与PARP抑制剂联合使用显示出疗效。(A)PARP抑制剂实验流程。在第一阶段，在奥拉帕尼(50mg/kg)之前(之前)或之后30分钟(之后)每天以7.5mg/kg的剂量施用GDC-0084。在第二阶段，在奥拉帕尼(50mg/kg)后30分钟，每天以7.5mg/kg的剂量施用GDC-0084。(B)使用Balb/c 4T1 TNBC乳腺癌模型的治疗方案。(C)收获前每个实验阶段的单个小鼠的肿瘤体积(溶剂或奥拉帕尼的百分比)。**p<0.01，ns不显著，Tukey事后检验，n＝5/组。
图33：GDC-0084和奥拉帕尼联合治疗不会引起毒性。在奥拉帕尼处理后用GDC-0084(7.5mg/kg)处理后评估小鼠体重和肝脏重量。ns，不显著，Tukey事后检验，n＝5/组。
图34：GDC-0084和奥拉帕尼联合治疗后，肝脏和肺部炎症减轻。独立专家病理学家对GDC-0084奥拉帕尼实验后的H&E染色的FFPE肝脏和肺部进行评分。(A)肝脏炎症和髓外造血(EMH)的变化，以及(B)肺白细胞增多症，每个参数的评分为1＝轻度，2＝中度，或3＝重度。与溶剂相比，*p<0.05，**p<0.001，****p<0.0001，Dunnett事后检测，n＝5/组。
图35：GDC-0084和奥拉帕尼联合使用可减少脾脏的脾肿大和髓外造血。(A)专家病理学家对来自GDC-0084奥拉帕尼实验后的H&E染色FFPE脾脏评分。髓外造血(EMH)的变化评分为1＝轻度，2＝中度或3＝重度。(B)在收获时测量脾脏重量，与溶剂相比，*p<0.05，***p<0.001，****p<0.0001，Dunnett事后检测，n＝5/组。与溶剂相比，*p<0.01，***p<0.001，Dunnett事后检测，n＝5/组。
图36：PI3K-mTOR抑制剂联合治疗癌症细胞增殖的比较。在剂量反应设计中，将WST增殖试剂加入到用PI3K抑制剂预处理72小时的MDA-MB-231细胞中。通过甲臜的形成间接测量细胞增殖(％)，并记录450nm的吸光度。
图37：GDC-0084伤口愈合剂量反应曲线(划痕试验)。在用GDC-0084(0.078-2.5μM)处理24小时之前，刮擦预刺激的(PMA/TGFβ)MCF-7细胞。在24小时内监测伤口密度的变化。(A)来自划痕试验的代表性图像，比较了溶剂和GDC-0084(1.25μM和2.5μM)处理的MCF-7细胞。(B)比较GDC-0084处理的细胞(0.078-2.5μM)在24小时治疗期内伤口密度(％)的剂量反应曲线。
图38：PI3K-mTOR抑制剂治疗癌症细胞迁移的比较。在用指定剂量的PI3K-mTOR抑制剂治疗24小时之前，刮伤预刺激(PMA/TGFβ)MCF-7细胞。(A)比较24小时治疗期内PI3K-mTOR抑制剂处理的细胞(0.078-2.5μM)的伤口密度(％)的剂量反应曲线。(B)比较每种PI3K-mTOR抑制剂在24小时时观察到的相对伤口密度。与溶剂相比，****p<0.0001，Dunnett事后检测，n＝5/组。与溶剂相比，*p<0.01，***p<0.001，Dunnett事后检测，n＝6/组。
具体实施方式
1.定义
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管在本发明的实践或测试中可以使用与本文所述类似或等效的任何方法和材料，但描述了优选的方法和材料。为了本发明的目的，下面定义以下术语。
本文中使用的冠词“a”和“an”是指冠词的一个或多个(即至少一个)语法对象。例如，“一个元素”是指一个元素或多个元素。
本文使用的术语“大约”是指本技术领域的技术人员容易知道的相应值的通常误差范围。本文中提及的“大约”值或参数包括(并描述)针对该值或参数本身的实施方案。
生物标志物的“量”或“水平”是样本中可检测的水平。这些可以通过本领域技术人员已知的方法和本文中公开的方法进行测量。评估的生物标志物的表达水平或量可用于确定对治疗的反应。
如本文所用，“和/或”是指并包括一个或多个相关列出项目的任何和所有可能的组合，以及解释为替代(或)时缺乏组合。
在本说明书中，除非上下文另有要求，否则“包括(comprise)”、“包括(comprises)”和“包括(comprising)”一词将被理解为意味着包括所述步骤或元素或一组步骤或元素，但不排除任何其他步骤或元素或其他组的步骤或元素。因此，使用术语“包括(comprising)”等表示所列元素是必需的或强制性的，但其他元素是任选的，可能存在也可能不存在。“由…组成”意味着包括并限于“由……组成(consisting of)”之后的任何内容。因此，“由…组成”一词表示所列元素是必需的或强制性的，不得存在其他元素。“主要由…组成”是指包括短语后列出的任何元素，并限于不干扰或有助于本公开中为所列元素指定的活动或行动的其他元素。因此，短语“主要由…组成”表示所列元素是必需的或强制性的，但其他元素是任选的，可能存在也可能不存在，这取决于它们是否影响所列元素的活性或作用。
“化学治疗剂”包括可用于治疗癌症的化合物。化学治疗剂的实例包括厄洛替尼(Genentech/OSIPharm.)、硼替佐米(Millennium Pharm.)、双硫仑、表没食子儿茶素没食子酸酯、salinosporamideA、卡非佐米、17-AAG(格尔德霉素)、根赤壳菌素、乳酸脱氢酶A(LDH-A)、氟维司群(AstraZeneca)、sunitib(辉瑞/Sugen)、来曲唑(Novartis)、甲磺酸伊马替尼(Novartis)、finasunate(Novartis)、奥沙利铂(赛诺菲)、5-FU(5-氟尿嘧啶)、甲酰四氢叶酸、雷帕霉素(西罗莫司、惠氏)、拉帕替尼(GSK572016、葛兰素史克)、洛那法尼(SCH66336)、索拉菲尼(拜耳实验室)、吉非替尼(阿斯利康)、AG1478；烷化剂如塞替派和环磷酰胺；磺酸烷基酯如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶(如苯佐替哌、卡波醌、美妥替哌和乌瑞替哌)；乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；番荔枝内酯类(acetogenin)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；喜树碱(camptothecin)(包括拓扑替康(topotecan))和伊立替康)；苔藓抑素(bryostatin)；卡利抑素(callystatin)；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；隐藻素类(cryptophycins)(特别是隐藻素1和隐藻素8)；肾上腺皮质激素类(包括泼尼松和醋酸泼尼松)；醋酸环丙孕酮；5α-还原酶包括非那雄胺和度他雄胺)；伏立诺他、罗米地辛、帕比司他、丙戊酸、莫塞替诺特、海兔毒素、阿地白介素、talc倍癌霉素(包括合成类似物KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；水鬼蕉碱(pancratistatin)；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海绵抑素(spongistatin)；氮芥类(nitrogen mustards)，例如氯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌氮芥(estramustine)、异磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸甲氧氮芥(mechlorethamine oxidehydrochloride)、美法仑、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；硝基脲类(nitrosureas)，例如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine)；抗生素类，例如烯二炔类(enediyne)抗生素(例如，加利车霉素(calicheamicin)，尤其是加利车霉素γ1I和加利车霉素ω1I(Angew Chem.Intl.Ed.Engl.199433:183-186)；达内霉素(dynemicin)，包括达内霉素A；二膦酸盐类(bisphosphonate)，例如氯膦酸盐(clodronate)；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新抑癌菌素(neocarzinostatin)生色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素生色团、阿克拉霉素(aclacinomysins)、放线菌素、氨茴霉素(authramycin)、氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素、放线菌素C(cactinomycin)、卡柔比星(carabicin)、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycinis)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、(多柔比星)、啉代多柔比星、氰基吗啉代-多柔比星、2-吡咯代-多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星、依索比星(esorubicin)、依达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(例如丝裂霉素C)、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培来霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链脲霉素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)或佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类，例如甲氨喋呤、5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，例如二甲叶酸(denopterin)、甲氨喋呤、蝶罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，例如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，例如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、多西氟尿啶(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素类，例如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolonepropionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类，例如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，例如亚叶酸；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基酮戊酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；氨苯吖啶(amsacrine)；阿莫斯汀(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依氟鸟氨酸(elformithine)；醋酸羟吡咔唑(elliptinium acetate)；埃博霉素类(epothilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；美登木素生物碱类(maytansinoids)，例如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin))；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；苯来美特(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；多糖复合物(JHS Natural Products、Eugene、Oreg.)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西索菲兰(sizofiran)；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2’,2”-三氯三乙胺；单端孢菌素类(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、疣孢菌素A(verracurinA)、杆孢菌素A(roridinA)和蛇形菌素(anguidine))；聚氨酯；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；加西托星(gacytosine)；阿糖胞苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；噻替哌；紫杉烷类(taxoids),例如TAXOL(紫杉醇(paclitaxel)；Bristol-Myers Squibb Oncology、Princeton、N.J.)、(Cremophor-free)、紫杉醇的白蛋白工程化纳米微粒制剂(albumin-engineered nanoparticle formulations of paclitaxel)(American PharmaceuticalPartners、Schaumberg、Ill.)和(多西他赛(docetaxel)、doxetaxel；Sanofi-Aventis)；苯丁酸氮芥；(吉西他滨)；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨喋呤；铂配位络合物，例如顺铂、奥沙利铂和卡铂；长春碱(vinblastine)；铂；依托泊苷(VP-16)；异磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；(长春瑞滨)；诺安托(novantrone)；替尼泊苷；依达曲沙；柔红霉素；氨基蝶呤；卡培他滨伊拜膦酸盐(ibandronate)；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄醇，例如视黄酸；以及上述任何一种的药学上可接受的盐、酸和衍生物。
所述化学治疗剂还包括(i)用于调节或抑制肿瘤激素作用的抗激素药物，如抗雌激素和选择性雌激素受体调节剂(SERM)，包括他莫昔芬(包括tamoxifencitrate)、雷洛昔芬、屈洛昔芬、碘氧芬、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、雷洛昔芬盐酸盐(keoxifene)、LY117018、奥那斯酮和(toremifine citrate)；(ii)抑制芳香酶的芳香酶抑制剂，芳香酶调节肾上腺中雌激素的产生，例如4(5)-咪唑、氨鲁米特、(醋酸甲地孕酮)、(依西美坦，辉瑞)、福美斯坦、法曲唑、(沃罗唑)、(来曲唑，诺华)和(阿那曲唑；阿斯利康)；(iii)抗雄性激素，如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；布舍瑞林、曲普瑞林(tripterelin)、17-羟基孕酮醋酸酯、乙雌烯醇、倍美力、氟甲睾酮、全反式维甲酸、非瑞替尼(fenretinide)以及曲沙他滨(一种1,3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；(iv)蛋白激酶抑制剂；(v)脂质激酶抑制剂；(vi)反义寡核苷酸，特别是那些抑制与异常细胞增殖有关的信号通路中基因表达的寡核苷酸，例如PKC-α、Ralf和H-Ras；(vii)核酶，如VEGF表达抑制剂(如)和HER2表达抑制剂；(viii)疫苗，如基因治疗疫苗，例如和 rIL-2；拓扑异构酶1抑制剂，如 rmRH；和(ix)上述任何一种的药学上可接受的盐、酸和衍生物。
所述化学治疗剂还包括抗体，如阿仑珠单抗(Campath)、贝伐单抗(Genentech)；西妥昔单抗(Imclone)；帕尼单抗(安进公司)、利妥昔单抗(Genentech//Biogen Idec)、帕妥珠单抗(2C4，Genentech)、曲妥珠单抗(Genentech)、托西莫单抗(Bexxar，Corixia)和抗体-药物偶联物吉妥珠单抗-奥佐米星(惠氏)。
作为与本发明化合物组合的药物具有治疗潜力的其他人源化单克隆抗体包括：apolizumab(阿泊珠单抗)、aselizumab(阿塞珠单抗)、atlizumab(阿替珠单抗)、bapineuzumab(巴匹珠单抗)、bivatuzumab mertansine(比伐珠单抗美登新)、cantuzumabmertansine(坎妥珠单抗美登新)、cedelizumab(赛利珠单抗)、certolizumab pegol(聚乙二醇赛妥珠单抗)、cidfusituzumab(西法妥珠单抗)、cidtuzumab(西妥珠单抗)、daclizumab(达利珠单抗)、eculizumab(依库珠单抗)、efalizumab(依法利珠单抗)、epratuzumab(依帕珠单抗)、erlizumab(厄利珠单抗)、felvizumab(非维珠单抗)、fontolizumab(芳妥珠单抗)、gemtuzumab ozogamicin(吉妥珠单抗奥佐米星)、inotuzumabozogamicin(奥英妥珠单抗)、ipilimumab(伊匹木单抗)、labetuzumab(拉贝妥珠单抗)、lintuzumab(林妥珠单抗)、matuzumab(马妥珠单抗)、mepolizumab(美泊利珠单抗)、motavizumab(莫替韦珠单抗)、motovizumab(莫托珠单抗)、natalizumab(那他珠单抗)、nimotuzumab(尼妥珠单抗)、nolovizumab(诺洛珠单抗)、numavizumab(奴玛维珠单抗)、ocrelizumab(奥瑞珠单抗)、omalizumab(奥马珠单抗)、palivizumab(帕利珠单抗)、pascolizumab(帕司利珠单抗)、pecfusituzumab(佩法妥珠单抗)、pectuzumab(佩妥珠单抗)、pexelizumab(培克珠单抗)、ralivizumab(拉利珠单抗)、ranibizumab(雷珠单抗)、reslivizumab(瑞利珠单抗)、reslizumab(瑞利珠单抗)、resyvizumab(瑞希珠单抗)、rovelizumab(罗韦珠单抗)、ruplizumab(鲁利珠单抗)、sibrotuzumab(西罗珠单抗)、siplizumab(西普利珠单抗)、sontuzumab(松妥珠单抗)、tacatuzumab tetraxetan(他卡妥珠单抗替曲塞)、tadocizumab(他度珠单抗)、talizumab(他利珠单抗)、tefibazumab(替非珠单抗)、tocilizumab(托珠单抗)、toralizumab(托拉珠单抗)、tucotuzumab celmoleukin(妥库珠单抗赛尔白介素)、tucusituzumab(妥西妥珠单抗)、umavizumab(乌马珠单抗)、urtoxazumab(乌托珠单抗)、ustekinumab(乌司奴单抗)、visilizumab(维西珠单抗)、以及抗白细胞介素-12抗体(ABT-874/J695，惠氏研究和雅培实验室)，它是一种重组的全人源序列的全长IgG1λ型抗体经基因修饰以识别白细胞介素-12p40蛋白。
化学治疗剂还包括“EGFR抑制剂”，指与EGFR结合或以其他方式直接相互作用并阻止或降低其信号活性的化合物，也可称为“EGFR拮抗剂”。此类药物的实例包括与EGFR结合的抗体和小分子。与EGFR结合的抗体的实例包括MAb 579(ATCC CRL HB 8506)、MAb 455(ATCC CRL HB8507)、MAb 225(ATCC CRL 8508)、MAb 528(ATCC CRL 8509)(参见美国专利4943533,Mendelsohn等人)和其变体，例如嵌合225(C225或西妥昔单抗；)和改造人225(reshaped human 225，H225)(参见WO 96/40210，Imclone Systems股份有限公司)；IMC-11F8，全人EGFR靶向抗体(Imclone)；结合II型突变EGFR的抗体(美国专利5212290)；结合EGFR的人源化和嵌合抗体，如美国专利5891996；以及结合EGFR的人抗体，如ABX-EGF或帕尼单抗(参见WO98/50433，Abgenix/Amgen)；EMD 55900(Stragliotto等人，Eur.J.Cancer 32A:636-640(1996))；EMD7200(马妥珠单抗)是一种针对EGFR的人源化EGFR抗体，与EGF和TGF-α竞争EGFR结合(EMD/Merck)；人EGFR抗体HuMax-EGFR(GenMab)；称为E1.1、E2.4、E2.5、E6.2、E6.4、E2.11、E6.3和E1.6.3的全人抗体，如美国专利623583所示；MDX-447(Medarex公司)；和mAb 806或人源化mAb 806(Johns等人，J.Biol.Chem.279(29):30375-30384(2004))。抗EGFR抗体可以与细胞毒性剂偶联，从而产生免疫偶联物(参见例如EP659439A2，Merck Patent GmbH)。EGFR拮抗剂包括小分子，如美国专利5616582、5457105、5475001、5654307、5679683、6084095、6265410、6455534、6521620、6596726、6713484、5770599、6140332、5866572、6399602、6344459、6602863、6391874、6344455、5760041、6002008和5747498中描述的化合物，以及以下PCT出版物：WO98/14451、WO98/50038、WO99/09016和WO99/24037。特定的小分子EGFR拮抗剂包括OSI-774(CP-358774、厄洛替尼、Genetech/OSI制药公司)；PD 183805(Cl 1033，2-丙烯酰胺，N-[4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-7-[3-(4-吗啉基)丙氧基]-6-喹唑啉基]-二盐酸盐，辉瑞股份有限公司)；ZD1839，吉非替尼4-(3'-氯-4'-氟苯胺基)-7-甲氧基-6-(3-吗啉代丙氧基)喹唑啉，阿斯利康)；ZM 105180((6-氨基-4-(3-甲基苯基氨基)喹唑啉，Zeneca)；BIBX-1382(N8-(3-氯-4-氟苯基)-N2-(1-甲基哌啶-4-基)-嘧啶并[5,4-d]嘧啶-2,8-二胺，勃林格殷格翰)；PKI-166((R)-4-[4-[(1-苯乙基)氨基]-1H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基]-苯酚)；(R)-6-(4-羟基苯基)-4-[(1-苯乙基)氨基]-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶)；CL-387785(N-[4-[(3-溴苯基)氨基]-6-喹唑啉基]-2-丁炔酰胺)；EKB-569(N-[4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-3-氰基-7-乙氧基-6-喹啉基]-4-(-二甲氨基)-2-丁烯酰胺)(惠氏)；AG1478(辉瑞公司)；AG1571(SU5271；辉瑞公司)；双重EGFR/HER2酪氨酸激酶抑制剂，如拉帕替尼(GSK572016或N-[3-氯-4-[(3-氟苯基)甲氧基]苯基]-6[5[[[2甲基磺酰基)乙基]氨基]甲基]-2-呋喃基]-4-喹唑啉胺)。
化学治疗剂还包括“酪氨酸激酶抑制剂”，包括前段所述的EGFR靶向药物、小分子HER2酪氨酸激酶抑制剂，如可从Takeda获得的TAK165；CP-724714(一种ErbB2受体酪氨酸激酶的口服选择性抑制剂(辉瑞和OSI))；双重HER抑制剂，如EKB-569(购自惠氏)，其优先结合EGFR，但抑制HER2和EGFR过表达细胞；拉帕替尼(GSK572016；购自葛兰素史克)，一种口服HER2和EGFR酪氨酸激酶抑制剂；PKI-166(可从诺华公司获得)；泛HER抑制剂，如卡那替尼(Cl-1033；Pharmacia)；Raf-1抑制剂，如ISIS提供的反义剂ISIS-5132。
抑制Raf-1信号传导的药物；非HER靶向TK抑制剂，如甲磺酸伊马替尼(购自葛兰素史克)；多靶向酪氨酸激酶抑制剂，如舒尼替尼(购自辉瑞)；VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂，如vatalanib(PTK787/ZK222584，购自诺华/先灵股份公司)；MAPK细胞外调节激酶I抑制剂Cl-1040(购自Pharmacia)；喹唑啉类，如PD 153035，4-(3-氯苯胺基)喹唑啉；吡啶并嘧啶类；嘧啶并嘧啶类；吡咯并嘧啶类，如CGP 59326、CGP60261和CGP 62706；吡唑并嘧啶，4-(苯胺基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶；姜黄素(diferuloylmethane，4,5-双(4-氟苯胺基)邻苯二甲酰亚胺)；含有硝基噻吩部分的酪氨酸；PD-0183805(华纳-兰伯)；反义分子(例如与编码HER的核酸结合的分子)；喹喔啉(美国专利号5804396)；tryphostins(美国专利号5804396)；ZD6474(阿斯利康)；PTK-787(诺华/先灵股份公司)；泛HER抑制剂，如Cl-1033(辉瑞)；Affinitac(ISIS 3521；ISIS/Lilly)；甲磺酸伊马替尼PKI 166(诺华)；GW2016(葛兰素史克)；Cl-1033(辉瑞公司)；EKB-569(惠氏)；Semaxinib(辉瑞)；ZD6474(阿斯利康)；PTK-787(诺华/先灵股份公司)；INC-1C11(Imclone)、雷帕霉素(西罗莫司、)；或如以下任何专利公开中所述：美国专利号5804396；WO 1999/09016(美国氰胺)；WO 1998/43960(美国氰胺)；WO 1997/38983(华纳-兰伯特)；WO 1999/06378(华纳-兰伯特)；WO 1999/06396(华纳-兰伯特)；WO1996/30347(辉瑞公司)；WO 1996/33978(Zeneca)；WO 1996/3397(Zeneca)和WO 1996/33980(Zeneca)。
化学治疗剂还包括地塞米松、干扰素、秋水仙碱、氯苯氨啶(metoprine)、环孢菌素、两性霉素、甲硝唑、阿仑珠单抗、阿利维A酸、别嘌呤醇、氨磷汀、三氧化二砷、天冬酰胺酶、BCG live、贝伐珠单抗、贝沙罗汀、克拉屈滨、氯法拉宾、达依泊汀α、地尼白介素(denileukin,)、右雷佐生、阿法依泊汀、elotinib、非格司亭、醋酸组胺瑞林、替伊莫单抗、干扰素α-2a、干扰素α-2-b、来那度胺、左旋咪唑、美司钠、甲氧沙林、诺龙、奈拉滨、nofetumomab、奥普瑞白介素、帕利夫明、帕米膦酸二钠、pegademase、培门冬酶、长效非格司亭、培美曲塞二钠、普卡霉素、卟吩姆钠、奎纳克林、拉布立酶、沙格司亭、替莫唑胺、VM-26、6-TG、托瑞米芬、维甲酸、ATRA、戊柔比星、唑来膦酸(zoledronic)和唑来膦酸(zoledronicacid)，及其药学上可接受的盐。
化学治疗剂还包括氢化可的松、醋酸氢化可的松、醋酸可的松，新戊酸替可的松、曲安奈德、曲安西龙(triamcinolone alcohol)、莫米松、安西奈德、布地奈德、地奈德、氟轻松、醋酸氟轻松、倍他米松、倍他米松磷酸钠、地塞米松、地塞米松磷酸钠、氟可龙、氢化可的松-17-丁酸酯、氢化可的松-17-戊酸酯、阿氯米松双丙酸酯、倍他米松戊酸酯，倍他米松二丙酸酯、泼尼卡酯、丁酸氯倍他松、丙酸氯倍他索、己酸氟可龙、氯酸氟可龙(fluocortolonepivalate)和醋酸氟泼尼定；免疫选择性抗炎肽(ImSAIDs)，如苯丙氨酸-谷氨酰胺-甘氨酸(FEG)及其D-异构体形式(feG)(IMULAN BioTherapeutics，LLC)；抗风湿药物，如硫唑嘌呤、环孢素(环孢素A)、D-青霉胺、金盐、羟氯喹、来氟米特环素、柳氮磺胺吡啶、肿瘤坏死因子(TNF)阻断剂，如依那西普(Enbrel)、英夫利昔单抗(Remicade)、阿达木单抗(Humira)、培塞利珠单抗(Cimzia)、戈利木单抗(Simponi)、白细胞介素1(IL-1)阻滞剂如阿那白滞素(Kineret)、T-cell共刺激阻滞剂如阿巴西普(Orencia)；白细胞介素6(IL-6)阻滞剂如托珠单抗白细胞介素13(IL-13)阻滞剂，如来瑞组单抗；干扰素-α(IFN-α)阻滞剂，如隆利组单抗；β7整合素阻滞剂，如rhuMAb Beta7；IgE通路阻断剂，如抗M1 prime；分泌同源三聚体LTa3和膜结合异三聚体LTa1/β2阻断剂，如抗淋巴细胞毒素α(LTa)；放射性同位素(例如，At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素)；其他研究性药物，如硫铂(thioplatin)、PS-341、丁酸苯酯、ET-18-OCH3或法尼基转移酶抑制剂(L-739749、L-744832)；多酚类，如槲皮素、白藜芦醇、白皮杉醇、表没食子儿茶素没食子酸酯、茶黄素、黄烷醇、原花青素、白桦脂酸及其衍生物；自噬抑制剂，如氯喹；δ-9-四氢大麻酚(屈大麻酚，)；β-拉帕醌；拉帕醇；秋水仙素；白桦脂酸；乙酰喜树碱、东莨菪碱和9-氨基喜树碱)；鬼臼毒素；替加氟贝沙罗汀双膦酸盐类，如氯膦酸盐(例如，或)、依替膦酸盐NE-58095、唑来膦酸/唑来膦酸酯阿仑膦酸钠帕米磷酸钠替鲁磷酸钠或利赛磷酸钠表皮生长因子受体(EGF-R)；疫苗，如疫苗；哌立福新、COX-2抑制剂(如塞来西布或依托考昔)、蛋白酶体抑制剂(如PS341)；CCl-779；替吡法尼(R11577)；orafenib，ABT510；Bcl-2抑制剂，如奥立美生钠马来酸匹杉琼(pixantrone)；法尼基转移酶抑制剂，如洛那法尼(SCH 6636，SARASARTM)；以及上述任何一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物；以及上述两种或多种的组合，如CHOP，是环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松龙联合治疗的缩写；以及FOLFOX，是奥沙利铂(ELOXATINTM)联合5-FU和甲酰四氢叶酸治疗方案的缩写。
化学治疗剂还包括具有镇痛、解热和抗炎作用的非甾体抗炎药(NSAID)。NSAID包括环氧化酶的非选择性抑制剂。NSAID的具体实例包括阿司匹林、丙酸衍生物如布洛芬、非诺洛芬、酮洛芬、氟比洛芬、奥沙普秦和萘普生、乙酸衍生物如吲哚美辛、舒林酸、依托度酸、双氯芬酸、烯醇酸衍生物如吡罗昔康、美洛昔康、替诺昔康、屈昔康、氯诺昔康和异昔康、芬那酸类衍生物如甲芬那酸、甲氯芬那酸、氟芬那酸、托芬那酸和COX-2抑制剂如塞来昔布、依托昔布、罗美昔布、帕瑞昔布、罗非昔布、罗非昔布以及伐地考昔。非甾体抗炎药可用于缓解类风湿性关节炎、骨关节炎、炎性关节病、强直性脊柱炎、银屑病关节炎、Reiter综合征、急性痛风、痛经、转移性骨痛、头痛和偏头痛、术后疼痛、炎症和组织损伤引起的轻度至中度疼痛、发热、肠梗阻和肾绞痛等症状。
术语“相关”和“关联”在本文中可互换使用，指的是两个测量值(或被测实体)之间的关联。本公开提供了遗传和/或表观遗传变异，其水平与疾病诊断和/或预后和/或对治疗的反应有关。
本文中使用的术语“减少”、“降低”、“减小”、“抑制”、“压制”、“衰减”等都是指统计上显著的减少量。在一些实施方案中，这些术语通常意味着与参考水平相比减少至少10％(例如，不存在给定的治疗或药物)，并且可以包括例如减少至少约10％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％，至少约99％，或更多。如本文所使用的，与参考水平相比，“减少”、“压制”和“抑制”不需要完全抑制或减少。与参考水平相比，“完全抑制”等是100％的抑制。减少可以优选地降低到正常范围内可接受的水平(例如，对于没有给定疾病的个体)。
如本文所用，术语“上皮-间充质转化”(EMT)是指从上皮细胞转化为间充质表型，这是胚胎发育的正常过程。EMT也是作为离子和流体转运蛋白的受损上皮细胞变成基质重塑间充质细胞的过程，在癌症中，这种转化通常导致细胞形态改变、间充质蛋白表达和侵袭性增加。体外定义EMT的标准包括上皮细胞极性的丧失、分离成单个细胞以及在获得细胞运动性后的随后分散(参见Vincent-Salomon和Thiery，Breast CancerRes.2003；5(2):101-6)。EMT过程中,分子类别的表达、分布和/或功能的变化，以及与之相关的原因，包括生长因子(例如转化生长因子(TGF))-P、wnts)、转录因子(例如，SNAI、SMAD、LEF和核β-连环蛋白)、细胞-细胞粘附轴的分子(钙黏蛋白、连环蛋白)、细胞骨架调节剂(Rho家族)和细胞外蛋白酶(基质金属蛋白酶、纤溶酶原激活剂)(参见Thompson和Newgreen，CancerRes.2005；65(14):5991-5)。
术语“增加(increased)”、“增加(increase)”、“增强”或“激活”在本文中都是指统计上显著的增加。在一些实施方案中，术语“增加(increased)”、“增加(increase)”、“增强”或“激活”可以意味着与参考水平(例如，不存在给定的治疗或试剂)相比增加至少10％，并且可以包括例如与参考水平相比较增加至少约10％，例如增加至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或高达100％的增加或10-100％之间的任何增加，或至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍、或至少约10倍的增加，或与参考水平相比2倍至10倍或更大的任何增加。在标志物或症状的背景下，“增加”是指在统计学上显著增加的水平。
“测量(measuring)”或“测量(measurement)”是指评估样本中给定物质的存在、不存在、数量或量(可以是有效量)，包括推导此类物质的定性或定量浓度水平，或以其他方式评估受试者临床参数的值或分类。或者，术语“测试”、“检测(detecting)”或“检测(detection)”可用于指本说明书中所述的所有测量(measuring)或测量(measurement)。
如本文所使用的，术语“间充质到上皮的转化”(MET)是一个可逆的生物过程，涉及从运动的、多极的或纺锤形的间充质细胞向称为上皮细胞的平面极化细胞阵列的转化。MET是EMT的逆过程。MET发生在正常发育、癌症转移和诱导多能干细胞重编程中。
如本文所用，术语“过表达(overexpress)”、“过表达(overexpression)”、“过表达(overexpressing)”或“过表达(overexpressed)”可互换地指的是与正常细胞相比，通常在癌症细胞中以可检测的基因(例如PI3KCA基因)转录或翻译的水平更高。因此，过表达是指蛋白质和RNA的过表达(由于转录增加、转录后处理、翻译、翻译后处理、稳定性改变和蛋白质降解改变)，以及由于蛋白质运输模式改变和功能活性增强而导致的局部过表达，例如底物酶水解增加。与正常细胞或对照细胞(例如乳腺细胞)相比，过表达也可以是10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。
本文使用术语“PI3K抑制剂”及其语法变体指的是降低或抑制PI3K的至少一种功能或生物活性的分子。例如，PI3K抑制剂可以抑制或降低PI3K的酶活性和/或可以抑制或减少PI3K的表达。
如本文所使用的，术语“PI3K过表达细胞”是指脊椎动物细胞，特别是哺乳动物细胞，其以高于正常细胞的可检测水平表达PI3K。该细胞可以是脊椎动物细胞，如灵长类细胞；鸟类细胞；家畜细胞(如绵羊细胞、奶牛细胞、马细胞、鹿细胞、驴细胞和猪细胞)；实验室测试动物细胞(如兔细胞、小鼠细胞、大鼠细胞、豚鼠细胞和仓鼠细胞)；伴侣动物细胞(如猫细胞和狗细胞)；以及圈养的野生动物细胞(如狐狸细胞、鹿细胞和野狗细胞)。在具体实施方案中，PI3K过表达细胞是人细胞。在具体实施方案中，PI3K过表达细胞是癌症干细胞或非癌症干细胞肿瘤细胞；优选癌症干细胞肿瘤细胞。与正常细胞或对照细胞(例如乳腺细胞)相比，过表达也可以是10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。
术语“选择性”及其语法变体在本文中用于指代抑制PI3K而基本上不抑制一种或多种其他PI3K酶或同源异构体。通常，对PI3K具有选择性的分子对一种或多种其他PI3K酶的抑制表现出大于约2倍、5倍、10倍、20倍、50倍或大于约100倍的PI3K选择性。在其他实施方案中，选择性分子对PI3K的抑制作用比对一种或多种其他PI3K酶的抑制作用大至少50倍。在进一步的实施方案中，选择性分子对PI3K的抑制作用比对一种或多种其他PI3K酶的抑制作用大至少100倍。在进一步的实施方案中，选择性分子对PI3K的抑制作用比对一种或多种其他PI3K酶的抑制作用大至少500倍。在进一步的实施方案中，选择性分子对PI3K的抑制作用比对一种或多种其他PI3K酶的抑制作用大至少100倍。
如本文所用，“受试者”是指人或动物。通常动物是脊椎动物，如灵长类、啮齿动物、家畜或狩猎动物。灵长类动物包括黑猩猩、食蟹猴、蜘蛛猴和猕猴(如恒河猴)。啮齿动物包括小鼠、大鼠、旱獭、雪貂、兔子和仓鼠。家畜和狩猎动物包括牛、马、猪、鹿、野牛、水牛、猫科动物(如家猫)、犬科动物(如狗、狐狸、狼)、鸟类(如鸡、鸸鹋、鸵鸟)和鱼类(如鳟鱼、鲶鱼和鲑鱼)。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物(例如，灵长类动物(例如，人类))。术语“个体”、“患者”和“受试者”在本文中可互换使用。
如本文所用，术语“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”和“治疗(treating)”等是指治疗性治疗，其中目的是逆转、减轻、改善、抑制、减缓或停止与疾病或病症(例如癌症或肿瘤)相关的病症的发展或严重性。术语“治疗”包括减少或减轻与癌症或肿瘤相关的状况、疾病或病症的至少一种不良影响或症状。如果一个或多个症状或临床标志物减少，治疗通常是“有效的”。或者，如果疾病的进展减缓或停止，治疗是“有效的”。也就是说，“治疗”不仅包括症状或标志物的改善，还包括与没有治疗的情况相比，停止或至少减缓症状的进展或恶化。有益或期望的临床结果包括但不限于缓解一种或多种症状、缩小疾病范围、稳定(即不恶化)疾病状态、延迟或减缓疾病进展、改善或缓解疾病状态、缓解(无论是部分还是全部)和/或降低死亡率，无论是可检测的还是不可检测的。术语疾病的“治疗”还包括缓解疾病的症状或副作用(包括姑息治疗)。治疗不需要治愈一种疾病(即完全逆转或没有疾病)才被认为是有效的。
如本文所使用的，术语“肿瘤”是指任何肿瘤细胞生长和增殖，无论是恶性还是良性，以及所有癌前和癌细胞和组织。术语“癌症”和“癌性”是指或描述哺乳动物的生理状况，通常部分以不受调节的细胞生长为特征。如本文所用，术语“癌症”是指非转移性和转移性癌症，包括早期和晚期癌症。术语“癌前病变”是指通常在癌症之前或发展为癌症的疾病或生长。术语“非转移性”是指良性的癌症，或保留在原发部位，未渗透到淋巴或血管系统或原发部位以外的组织。一般来说，非转移性癌症是任何0、I或II期癌症。“早期癌症”是指没有侵袭性或转移性的癌症，或被分类为0、1或II期癌症。术语“晚期癌症”通常指癌症III或IV期，但也可指癌症II期或癌症II期的亚期。本领域技术人员将理解，将II期癌症分类为早期癌症或晚期癌症取决于癌症的特定类型。癌症的说明性实例包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胰腺癌、结直肠癌、肺癌、肝细胞癌、胃癌、肝癌、膀胱癌、尿道癌、甲状腺癌、肾癌、恶性肿瘤、黑色素瘤、脑癌、非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌、子宫内膜癌、多发性骨髓瘤、间皮瘤、直肠癌和食道癌。在示例性实施方案中，癌症是乳腺癌。
除非另有特别说明，否则本文所述的每个实施方案在加以必要的修正后适用于每个实施方案。
2.组合物
本发明部分基于这样的确定，即间充质表型的功能性抑制的T细胞暴露于PI3K抑制剂导致T细胞的表观遗传重新编程，其免疫效应功能去抑制，包括T细胞激活和效应能力的生物标志物(例如，IL-2、IFN-γ和TNF)的表达升高，T细胞效应抑制和癌症进展的生物标志物(例如，ZEB1)的表达降低，以及T细胞耗竭的生物标志物(例如，PD-1和EOMES)的表达减少和转录因子TBET的表达升高(这增加了适应性和先天免疫系统细胞中IFN-γ的产生)。发明人还发现，PI3K抑制剂介导的磷酸化重编程增强了耗竭T细胞对ICM结合拮抗剂重新激活的敏感性。
因此，根据本发明，提供了利用PI3K抑制剂(例如，PI3K活性抑制剂)和ICM结合拮抗剂来增强免疫效应器功能和/或增强T细胞(例如，CD8+T细胞)功能的组合物和方法，包括增加T细胞激活和增强耗竭的T细胞对ICM结合拮抗剂重新激活的敏感性。因此，本发明的方法和组合物特别适用于治疗T细胞功能障碍性疾病，包括癌症和感染。
本发明至少部分基于对抑制CSC肿瘤细胞EMT和诱导CSC肿瘤细胞MET的组合物的鉴定。因此，发明人认为本发明的组合物可用于治疗或预防癌症，和/或改善癌症或肿瘤对不靶向CSC的免疫疗法的反应性。
因此，在本发明的一个方面，提供了一种组合物，其包含PI3K抑制剂和不靶向CSC的免疫疗法。
2.1PI3K抑制剂
本发明的组合物包含抑制剂，其包括并包含任何降低PI3K的积累、功能(例如酶活性、定位等)或稳定性的活性剂；或降低PI3KCA基因的表达，此类抑制剂包括但不限于小分子和大分子，如核酸、肽、多肽、拟肽、碳水化合物、多糖、脂多糖、脂质或其他有机(含碳)或无机分子。
在一些实施方案中，PI3K抑制剂是一种拮抗核酸分子，其功能是抑制PI3K转录物的转录或翻译。
这种类型的代表性转录物包括与以下序列中的任何一个相对应的核苷酸序列：(1)例如GenBank登录号NM_006219.3、NM_001256045、NM_005026、NM_001350234和NM_0013500235中所述的人PI3K核苷酸序列，(2)与(1)中提到的任何一个序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列一致性的核苷酸序列；(3)在至少低、中或高严格条件下与(1)中所述序列杂交的核苷酸序列；(4)编码以下氨基酸序列中任一种的核苷酸序列：例如UniProt登录号P42336、Q8NEB9、O00750、O75747、P48736和P42338中所述的人PI3K氨基酸序列；(5)编码氨基酸序列的核苷酸序列，所述氨基酸序列与(4)中提及的任何一个序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列相似性；以及编码与(4)中提及的任何一个序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列一致性的氨基酸序列的核苷酸序列。
示例性拮抗核酸分子包括反义分子、适配体、核酶和三链形成分子、RNAi和外部引导序列。核酸分子可以作为靶分子所具有的特定活性的效应器、抑制剂、调节剂和刺激剂，或者功能核酸分子可以具有独立于任何其他分子的从头活性。
拮抗核酸分子可以与任何大分子相互作用，如DNA、RNA、多肽或碳水化合物链。因此，拮抗核酸分子可以与PI3KmRNA或PIK3基因的基因组DNA(例如PIK3CA)相互作用，或者它们可以与PI3K多肽相互作用。通常，拮抗核酸分子被设计为基于靶分子和拮抗核酸分子之间的序列同源性与其他核酸相互作用。在其他情况下，拮抗核酸分子和靶分子之间的特异性识别不是基于拮抗核酸分子与靶分子之间序列的同源性，而是基于允许发生特异性识别的三级结构的形成。
在一些实施方案中，反义RNA或DNA分子用于通过与靶mRNA结合并阻止蛋白质翻译来直接阻断PI3K的翻译。反义分子被设计为通过规范或非规范碱基配对与靶核酸分子相互作用。反义分子和靶分子的相互作用可以被设计为促进靶分子的破坏，例如通过RNAseH介导的RNA-DNA杂交降解。或者，反义分子可以被设计为中断通常在靶分子上发生的加工功能，如转录或复制。反义分子可以根据靶分子的序列进行设计。存在许多通过找到靶分子最容易接近的区域来优化反义效率的方法。非限制性方法包括体外选择实验和使用DMS和DEPC的DNA修饰研究。在具体实例中，反义分子以小于或等于10-6、10-8、10-10或10-12的解离常数(Kd)结合靶分子。在特定的实施方案中，使用衍生自翻译起始位点的反义寡核苷酸，例如-10至+10区域。
适配体是以特定方式与靶分子相互作用的分子。适配体通常是长度在15-50个碱基之间的小核酸，折叠成确定的二级和三级结构，如茎环或G-四联体。适配体可以结合小分子，如ATP和茶碱，以及大分子，如逆转录酶和凝血酶。适配体可以与小于10-12M的靶分子中的Kd非常紧密地结合。适当地，适配体以小于10-6、10-8、10-10或10-12的Kd结合靶分子。适配体可以以非常高的特异性结合靶分子。例如，已经分离出的适配体在靶分子和仅在分子上单个位置不同的另一个分子之间的结合亲和力差异超过10000倍。理想的是，适配体与靶分子的Kd比与背景结合分子的Kd低至少10、100、1000、10000或100000倍。生成目标适配体(如PI3K)的合适方法是“指数富集配体的系统进化”(SELEXTM)。SELEXTM方法在美国专利第5475096号和美国专利第5270163号(另见国际公开号WO 91/19813)中记载。简而言之，核酸混合物在有利于结合的条件下与靶分子接触。未结合的核酸与结合的核酸分离，核酸靶复合物解离。然后扩增解离的核酸以产生富含配体的核酸混合物，该混合物根据需要进行重复的结合、分配、解离和扩增循环，以产生对靶分子高度特异性的高亲和力核酸配体。
在其他实施方案中，抗PI3K核酶用于催化PI3K RNA的特异性切割。核酶作用的机制涉及核酶分子与互补靶RNA的序列特异性杂交，然后进行内切切割。有几种不同类型的核酶催化核酸酶或核酸聚合酶型反应，这些反应基于自然系统中发现的核酶，如锤头核酶、发夹核酶和四膜虫核酶。还有一些核酶在自然系统中没有发现，但它们被工程化以从头催化特定的反应。代表性核酶切割RNA或DNA底物。在一些实施方案中，使用切割RNA底物的核酶。潜在RNA靶标内的特定核酶切割位点最初是通过扫描靶分子寻找核酶切割位点来确认的，其中包括以下序列，GUA、GUU和GUC。一旦确认，可以评估与含有切割位点的靶基因区域相对应的15至20个核糖核苷酸的短RNA序列以预测结构特征，如可能使寡核苷酸序列不合适的二级结构。候选靶标的适用性也可以通过使用核糖核酸酶保护试验测试其与互补寡核苷酸杂交的可及性来评估。
形成三链体的功能核酸分子是可以与双链或单链核酸相互作用的分子。当三链分子与靶区相互作用时，会形成一种称为三链体的结构，其中有三条DNA链形成一个依赖于Watson Crick和Hoogsteen碱基配对的复合物。三链分子是首选，因为它们可以以高亲和力和特异性结合靶区。通常希望形成三链体的分子以小于10-6、10-8、10-10或10-12的Kd结合靶分子。
外部引导序列(EGS)是结合靶核酸分子形成复合物的分子，该复合物被切割靶分子的RNAse P识别。EGS可以被设计为特异性靶向所选的RNA分子。RNAse P有助于加工细胞内的转运RNA(tRNA)。通过使用EGS，细菌RNAse P可以被招募来切割几乎任何RNA序列，EGS使靶RNA:EGS复合物模仿天然tRNA底物。同样地，真核EGS/RNAse P引导的RNA切割可用于切割真核细胞内所需的靶标。
在其他实施方案中，介导PI3K基因或PI3K转录物的RNA干扰(RNAi)的RNA分子可用于减少或消除基因表达。RNAi是指通过引入与靶基因转录物同源的单链或通常为双链RNA(dsRNA)来干扰或破坏靶基因的产物。RNAi方法，包括双链RNA干扰(dsRNAi)或小干扰RNA(siRNA)，在许多生物体中都有广泛的记录，包括哺乳动物细胞和线虫秀丽隐杆线虫(Fire等人，1998.Nature 391,806-811).在哺乳动物细胞中，RNAi可以由小干扰RNA(siRNA)的21-23核苷酸(nt)双链体触发(Chiu等人，2002Mol.Cell.10:549-561；Elbashir等人，2001.Nature411:494-498)，或通过微小RNA(miRNA)、功能性小发夹RNA(shRNA)或其他dsRNA，这些dsRNA使用带有RNA聚合酶III启动子的DNA模板在体内表达(Zeng等人，2002.Mol.Cell 9:1327-1333；Paddison等人,2002.Genes Dev.16:948-958；Lee等人，2002.Nature Biotechnol.20:500-505；Paul等人，2002.Nature Biotechnol.20:505-508；Tuschl,T.,2002.Nature Biotechnol.20:440-448；Yu等人，2002.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99(9):6047-6052；McManus等人，2002.RNA 8:842-850；Sui等人，2002.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99(6):5515-5520)。
在具体实施方案中，使用dsRNA本身，特别是与PIK3基因的至少一部分相对应的dsRNA生产构建体来减少或消除其表达。RNAi介导的基因表达抑制可以使用本领域报道的任何技术来实现，例如通过将编码干环或发夹RNA结构的核酸构建体转染到靶细胞的基因组中，或通过从收敛启动子之间表达与PIK3基因具有同源性的转染核酸构建体，或作为从单个启动子后面的头对头或尾对尾复制来实现。任何类似的构建体都可以使用，只要它产生一个能够自我折叠并产生dsRNA的RNA，或者只要它产生两个单独的RNA转录本，然后退火形成与靶基因具有同源性的dsRNA。
RNAi不需要绝对同源性，对于约200个碱基对的dsRNA，较低的阈值被描述为约85％的同源性(Plasterk和Ketting，2000，Current Opinion in Genetics and Dev.10:562-67)。因此，根据dsRNA的长度，编码RNAi的核酸与靶基因转录物的同源性水平可以变化，即100至200个碱基对的dsRNA与靶基因具有至少约85％的同源性，而较长的dsRNA(即300至100个碱基对)与靶基因具有至少约75％的同源性。RNA编码构建体表达单个RNA转录物，所述单个RNA转录物被设计为退火结合到单独表达的RNA上，或RNA编码构建体表达来自相向启动子(convergent promoter)的单独转录物，长度适当地为至少约100个核苷酸。表达被设计用于通过内部折叠形成dsRNA的单个RNA的RNA编码构建体的长度通常至少约为200个核苷酸。
用于表达形成dsRNA的构建体的启动子可以是任何类型的启动子，如果产生的dsRNA对靶向破坏的细胞谱系中的基因产物具有特异性。或者，启动子可能是谱系特异性的，因为它只在特定发育谱系的细胞中表达。当与非靶向细胞谱系中表达的基因在同源性上存在一些重叠时，这可能是有利的。启动子也可能被外部控制因素或细胞内环境因素诱导。
在一些实施方案中，约21至约23个核苷酸的RNA分子，其指导它们对应的特定mRNA的切割，例如美国专利公开号US2002/0086356中所述，可用于介导RNAi。这种21-23nt RNA分子可以包含3'羟基，可以是单链或双链(作为两个21-23nt的RNA)，其中dsRNA分子可以是平末端或包含悬垂末端(例如5'、3')。
在一些实施方案中，拮抗剂核酸分子是siRNA。siRNA可以通过任何合适的方法制备。例如，可以参考国际公开WO 02/44321，其公开了当碱基与3'悬垂末端配对时，能够对靶mRNA进行序列特异性降解的siRNA，该文献通过引用并入本文。使用合成的短双链RNA可以在哺乳动物细胞中实现序列特异性基因沉默，这些RNA模仿酶dicer产生的siRNA。siRNA可以通过化学或体外合成，也可以是短双链发夹状RNA(shRNA)细胞内加工成siRNA的结果。合成siRNA通常使用算法和传统的DNA/RNA合成器进行设计。供应商包括Ambion(德克萨斯州奥斯汀)、ChemGenes(马萨诸塞州阿什兰)、Dharmacon(科罗拉多州拉斐特)、Glen Research(弗吉尼亚州斯特林)、MWB Biotech(德国埃斯伯斯伯格)、Proligo(科罗拉多州博尔德)和Qiagen(荷兰文托)。siRNA也可以使用Ambion的SILENCERTMsiRNA构建试剂盒等试剂盒在体外合成。
从载体中生产siRNA通常是通过转录短发夹RNA(shRNA)来完成的。用于生产包含shRNA的载体的试剂盒是可用的，例如Imgenex的GENESUPPRESSORTM构建试剂盒和Invitrogen的BLOCK-ITTM诱导型RNAi质粒和慢病毒载体。此外，制备siRNA并将其递送至受试者的方法在本领域中也是众所周知的。参见例如美国专利2005/0282188、美国专利2005/0239731、美国专利2005/0234232、美国专利2005/0176018、美国专利2005/0059817、美国专利2005/002025、美国专利2004/0192626、美国专利2003/0073640、美国专利2002/0150936、美国专利2002/0142980和美国专利2002/0120129，其每个均通过引用并入本文。
本领域描述了示例性RNAi分子(例如PI3K siRNA和shRNA)(例如Ma等人，2013.BMCBiochem.14:20；Kim等人，2013.Immune Netw.13(2):55-62)或可商购自Santa CruzBiotechnology股份有限公司(美国加利福尼亚州圣克鲁斯)、OriGene Technologies股份有限公司(国马里兰州罗克维尔))和Sigma-Aldrich Pty Ltd(澳大利亚新南威尔士州卡斯尔希尔)。
本发明进一步考虑基于肽或多肽的抑制剂化合物。如上所述的PI3K抑制肽可以通过作为融合蛋白的一部分进行修饰。融合蛋白可以包括转运蛋白或肽，其功能是增加肽抑制剂的细胞摄取，具有另一种所需的生物作用，如治疗作用，或者可以具有这两种功能。融合蛋白可以通过本领域技术人员已知的方法制备。抑制剂肽可以以本领域已知的多种方式与另一种肽结合或以其他方式缀合。例如，抑制剂肽可以通过交联与载体肽或本文所述的其他肽结合，其中融合蛋白中的两种肽都保持其活性。作为另一个实例，肽可以通过酰胺键从一个肽的C端连接或以其他方式偶联到另一个肽的N端。抑制剂肽和融合蛋白的其他成员之间的连接可以是不可切割的，可以用肽键，也可以用例如酯或本领域已知的其他可切割键切割。
在一些实施方案中，转运蛋白或肽可以是例如果蝇触角足同源结构域衍生的序列，其包含氨基酸序列CRQIKIWFQNRRMKWKK[SEQ ID NO:1]，并且可以通过N-末端Cys-Cys键交联连接到抑制剂上(例如，如Theodore等人，1995.J.Neurosci.15:7158-7167；Johnson等人，1996.Circ.Res 79:1086所述)。或者，抑制剂可以通过来自人类免疫缺陷病毒1型的反式激活调节蛋白(Tat)衍生的转运多肽(如SEQ ID NO:2所示的Tat的氨基酸第47-57位；YGRKKRRQRRR)进行修饰，如Vives等人，1997.J.Biol.Chem,272:16010-16017,专利号为5,804,604的美国专利和GenBank登录号AAT48070；或用聚精氨酸，如Mitchell et al.,2000.J.Peptide Res.56:318-325和Rolhbard等人,2000.Nature Med.6:1253-1257所述)。抑制剂可以通过本领域技术人员已知的其他方法进行修饰，以增加抑制剂的细胞摄取。
通过将包含编码PI3K抑制肽的核苷酸序列的核酸引入细胞，也可以将PI3K抑制肽引入细胞。核酸可以是重组表达载体的形式。PI3K抑制肽编码序列可以可操作地连接到表达载体中的转录控制元件，例如启动子。合适的载体包括，例如，重组逆转录病毒、慢病毒和腺病毒；逆转录病毒表达载体、慢病毒表达载体，核酸表达载体和质粒表达载体。在某些情况下，表达载体被整合到细胞的基因组中。在其他情况下，表达载体在细胞中以游离状态存在。
合适的表达载体包括但不限于病毒载体(例如，基于痘苗病毒的病毒载体、脊髓灰质炎病毒、腺病毒(参见，例如，Li等人，Invest Opthalmol Vis Sci 35:25432549,1994；Borras等人,Gene Ther 6:515524,1999；Li和Davidson,PNAS 92:77007704,1995；Sakamoto等人，H Gene Ther 5:10881097,1999；WO 94/12649,WO 93/03769；WO 93/19191；WO 94/28938；WO 95/11984和WO 95/00655)；腺相关病毒(参见，例如，Ali等人,Hum GeneTher 9:8186,1998,Flannery等人,PNAS 94:69166921,1997；Bennett等人,InvestOpthalmol Vis Sci 38:28572863,1997；Jomary等人,Gene Ther 4:683690,1997,Rolling等人,Hum Gene Ther 10:641648,1999；Ali等人,Hum Mol Genet.5:591594,1996；Srivastava的WO 93/09239,Samulski等人,J.Vir.63:3822-3828,1989；Mendelson等人,Virol.166:154-165,1988；和Flotte等人，PNAS(1993)90:10613-10617)；SV40；单纯疱疹病毒；人类免疫缺陷病毒(参见，例如Miyoshi等人，PNAS 94:1031923,1997；Takahashi等人，JVirol73:78127816,1999)；逆转录病毒载体(例如，小鼠白血病病毒、脾坏死病毒和衍生自逆转录病毒的载体，如劳斯肉瘤病毒、哈维肉瘤病毒、禽白血病病毒、慢病毒、人类免疫缺陷病毒、骨髓增生性肉瘤病毒和乳腺肿瘤病毒)等。
本发明还考虑了降低PI3K功能活性的小分子试剂(例如，降低PI3K介导的磷酸化，抑制PI3K与CD44或uPAR启动子的结合，减少PI3K(例如，活性PI3K)与染色质的结合；减少PI3K介导的鸟嘌呤交换因子GIV/Girdin的抑制，减少PI3K介导的调节性T细胞功能的抑制，降低PI3K介导的EMT等)。
适用于本发明的降低PI3K功能活性的小分子试剂包括，例如，选自式I的化合物：
以及其立体异构体、几何异构体、互变异构体及其药学上可接受的盐，其中：
虚线表示任选地双键，并且至少一条虚线是双键；
X1是S、O、N、NRa、CR1、C(R1)2或-C(R1) 2O-；
X2是C、CR2或N；
X3是C、CR3或N；
A是与X2和X3稠合的5、6或7元碳环或杂环，任选地被一个或多个R5基团取代；
Ra是s H、C1-C12烷基、C2-C8烯基、C2-C8炔基、-(C1-C12亚烷基)-(C3-C12碳环基)、-(C1-C12亚烷基)-(具有3-20个环原子的杂环基)、-(C1-C12亚烷基)-C(＝O)-(具有3-20个环原子的杂环基)、-(C1-C12亚烷基)-(C6-C20芳基)和-(C1-C12亚烷基)-(具有5-20个环原子的杂芳基)，其中烷基、烯基、炔基、亚烷基、碳环基、杂环基、芳基和杂芳基任选被一个或多个独立选自以下的基团取代：F、Cl、Br、I、-CH3、-CH2CH3、-C(CH3)3、-CH2OH、-CH2CH2OH、-C(CH3)2OH、-CH2OCH3、-CN、-CH2F、-CHF2、-CF3、-CO2H、-COCH3、-COC(CH3)3、-CO2CH3、-CONH2、-CONHCH3、-CON(CH3)2、-C(CH3)2CONH2、-NO2、-NH2、-NHCH3、-N(CH3)2、-NHCOCH3、-NHS(O)2CH3、-N(CH3)C(CH3)2CONH2、-N(CH3)CH2CH2S(O)2CH3、＝O、-OH、-OCH3、-S(O)2N(CH3)2、-SCH3、-S(O)2CH3、环丙基、环丁基、氧杂环丁基、吗啉代和1,1-二氧代-噻喃-4-基；
R1、R2和R3独立地选自H、F、Cl、Br、I、-CH3、-CH2CH3、-C(CH3)3、-CH2OH、-CH2CH2OH、-C(CH3)2OH、-CH2OCH3、-CN、-CF3、-CO2H、-COCH3、-COC(CH3)3、-CO2CH3、-CONH2、-CONHCH3、-CON(CH3)2、-C(CH3)2CONH2、-NO2、-NH2、-NHCH3、-N(CH3)2、-NHCOCH3、-NHS(O)2CH3、-N(CH3)C(CH3)2CONH2、-N(CH3)CH2CH2S(O)2CH3、＝O、-OH、-OCH3、-S(O)2N(CH3)2、-SCH3、-S(O)2CH3、环丙基、环丁基、氧杂环丁基、吗啉代和1,1-二氧代-噻喃-4-基；
R4选自C6-C20芳基、具有3-20个环原子的杂环基和具有5-20个环原子的杂芳基，它们各自任选地被一个或多个R6基团取代，所述R6基团独立地选自F、Cl、Br、I、-CH3、-CH2CH3、-CH(CH3)2、-CH2CH(CH3)2、-CH2CH3、-CH2CN、-CN、-CF3、-CH2OH、-CO2H、-CONH2、-CONH(CH3)、-CON(CH3)2、-NO2、-NH2、-NHCH3、-NHCOCH3、-OH、-OCH3、-OCH2CH3、-OCH(CH3)2、-SH、-NHC(＝O)NHCH3、-NHC(＝O)NHCH2CH3、-NHC(＝O)NHCH(CH3)2、-NHS(O)2CH3、-N(CH3)C(＝O)OC(CH3)3、-S(O)2CH3、苄基、苄氧基、吗啉基、吗啉甲基和4-甲基哌嗪-1-基；以及
R5独立地选自C1-C12烷基、C2-C8烯基、C2-C8炔基、(C1-C12亚烷基)-(C3-C12碳环基)、-(C1-C12亚烷基)-(具有3-20个环原子的杂环基)、-(C1-C12亚烷基)-C(＝O)-(具有3-20个环原子的杂环基)、-(C1-C12亚烷基)-(C6-C20芳基)、和-(C1-C12亚烷基)-(具有5-20个环原子的杂芳基)；或两个成对的R5基团形成3、4、5或6元碳环或杂环基环，其中烷基、烯基、炔基、亚烷基、碳环基、杂环基、芳基和杂芳基任选地被一个或多个独立选自以下的基团取代：F、Cl、Br、I、-CH3、-CH2CH3、-C(CH3)3、-CH2OH、-CH2CH2OH、-C(CH3)2OH、-CH2OCH3、-CN、-CH2F、-CHF2、-CF3、-CO2H、-COCH3、-COC(CH3)3、-CO2CH3、-CONH2、-CONHCH3、-CON(CH3)2、-C(CH3)2CONH2、-NO2、-NH2、-NHCH3、-N(CH3)2、-NHCOCH3、-NHS(O)2CH3、-N(CH3)C(CH3)2CONH2、-N(CH3)CH2CH2S(O)2CH3、＝O、-OH、-OCH3、-S(O)2N(CH3)2、-SCH3、-S(O)2CH3、环丙基、环丁基、氧杂环丁基、吗啉代和1,1-二氧代-噻喃-4-基；
mor选自：
任选地被一个或多个R7基团取代，所述R7基团独立地选自F、Cl、Br、I、-CH3、-CH2CH3、-CH2CH2CH3、-CH(CH3)2、-C(CH3)3、-CH2OCH3、-CHF2、-CN、-CF3、-CH2OH、-CH2OCH3、-CH2CH2OH、-CH2C(CH3)2OH、-CH(CH3)OH、-CH(CH2CH3)OH、-CH2CH(OH)CH3、-C(CH3)2OH、-C(CH3)2OCH3、-CH(CH3)F、-C(CH3)F2、-CH(CH2CH3)F、-C(CH2CH3)2F、-CO2H、-CONH2、-CON(CH2CH3)2、
-COCH3、-CON(CH3)2、-NO2、-NH2、-NHCH3、-N(CH3)2、-NHCH2CH3、
-NHCH(CH3)2、-NHCH2CH2OH、-NHCH2CH2OCH3、-NHCOCH3、-NHCOCH2CH3、
-NHCOCH2OH、-NHS(O)2CH3、-N(CH3)S(O)2CH3、＝O、-OH、-OCH3、-OCH2CH3、
-OCH(CH3)2、-SH、-NHC(＝O)NHCH3、-NHC(＝O)NHCH2CH3、-S(O)CH3、
-S(O)CH2CH3、-S(O)2CH3、-S(O)2NH2、-S(O)2NHCH3、-S(O)2N(CH3)2和
-CH2S(O)2CH3。
在一些其他实施方案中，小分子PI3K抑制剂选自以下组：
本发明允许向受试者施用较低剂量的PI3K抑制剂疗法。利用较低剂量PI3K疗法的能力降低了与对受试者施用疗法相关的毒性，而不降低所述疗法在预防、管理、治疗或改善癌症(例如，癌症实体瘤)中的功效。
在一些实施方案中，较低量/剂量的PI3K抑制剂减少或最小化了与PI3K疗法相关的任何不希望的副作用。
2.2免疫疗法
本发明的组合物还包括抗癌疗法，其通常是免疫疗法。任何不靶向癌症干细胞(CSC)的免疫疗法通常被认为适合用于本发明的组合物和方法。检查点抑制剂分子拮抗剂和PARP抑制剂通常被认为是特别合适的。
2.2.1检测点抑制剂分子(ICM)拮抗剂
可用于治疗的任何合适的ICM拮抗剂均可用于本发明的实践。例如，合适的ICM拮抗剂包括多肽、多核苷酸、碳水化合物和小分子。在一些优选实施方案中，ICM拮抗剂是抗原结合分子。
被本发明的治疗组合物拮抗的ICM包括选自PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、A2AR、A2BR、CD276、VTCN 1、BTLA、IDO、KIR、LAG 3、TIM-3、VISTA、CD73、CD96、CD155、DNAM-1、TIGIT、CD112、CRTAM、OX40、OX40L、CD244、CD160、GITR、GITRL、ICOS、GAL-9、4-1BBL、4-1BB、CD27L、CD28、CD80、CD86、SIRP-1、CD47、CD48、CD244、CD40、CD40L、HVEM、TMIGD2、HHLA2、VEGI、TNFRS25和ICOLG的任何一种或多种抑制性ICM。
在一些优选实施方案中，治疗组合物中包含的ICM拮抗剂是PD-1拮抗剂。在这方面，“PD-1拮抗剂”包括阻断PD-L1(例如，在癌症细胞表面表达的PD-L1)与在免疫细胞(例如，T细胞、B细胞或NKT细胞)上表达的PD-1结合的任何化合物或生物分子。PD-1的替代名称或同义词包括PDCD1、PD1、CD279和SLEB2。人PD-1的代表性成熟氨基酸序列(UniProt登录号Q15116)如下：
PGWFLDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQTLVVGVVGGLLGSLVLLVWVLAVICSRAARGTIGARRTGQPLKEDPSAVPVFSVDYGELDFQWREKTPEPPVPCVPEQTEYATIVFPSGMGTSSPARRGSADGPRSAQPLRPEDGHCSWPL[SEQ ID NO:3]。
与人PD-1结合并因此用于本发明的单克隆抗体(mAb)的实例在美国专利公开号US2003/0039653、US2004/0213795、US2006/0110383、US2007/0065427、US2007/0122378、US2012/237522和国际PCT公开号WO2004/072286、WO2006/121168、WO2006/133396、WO2007/005874、WO2008/083174、WO2008/156712、WO2009/024531、WO2009/014708、WO2009/114335、WO2010/027828、WO2010/027423、WO2010/036959、WO2010/029435、WO2010/029434、WO2010/063011、WO2010/089411、WO2011/066342、WO2011/110604、WO2011/110621和WO2012/145493(其全部内容通过引用并入本文)。可用于本发明目的的特异性单克隆抗体包括抗PD-1单克隆抗体纳武单抗(nivolumab)、帕博利珠单抗(帕博利珠单抗)和匹地利珠单抗(匹地利珠单抗)，以及国际专利公开号WO2008/156712中所述的人源化抗PD-1抗体h409Al l、h409A16和h409A17。
本发明的抗PD-1抗原结合分子优选结合PD-1细胞外结构域的区域。例如，抗PD-1抗原结合分子可以特异性与人PD-1细胞外结构域的一个区域结合，所述区域包含氨基酸序列SFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDR[SEQ ID NO:4](即SEQ ID NO:3中列示的天然PD-1序列的第62至86位残基)和SGTYLCGAISLAPKAQIKE[SEQ ID NO:5](即SEQ ID NO:3中列示的天然PD-1序列的第118至136位残基)中的一个或两者。在另一个实例中，抗PD-1抗原结合分子结合人PD-1细胞外结构域的一个区域，所述区域包含氨基酸序列NWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRV[SEQ ID NO:6](即，对应于SEQ ID NO:3中列示的天然人PD-1序列的第66至97位残基)。
在某些实施方案中，抗PD-1抗原结合分子包括完全人源化的IgG4单克隆抗体纳武单抗(如美国专利号8008449(称为“5C4”)中详细描述的，其全部内容通过引用并入本文)或其抗原结合片段。在这种类型的代表性实例中，抗PD-1抗原结合分子包含表5中列示的CDR序列。
表5
在更具体的实施方案中，抗PD-1抗原结合分子包含纳武单抗的重链氨基酸序列，例如如下所示：
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEW
VAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCAT
NDDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPv
TVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKP
SNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV
VVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQD
WLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVS
LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK[SEQ ID NO:13]；
或其抗原结合片段，其包含以下氨基酸序列，由或基本由以下氨基酸序列组成：
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEW
VAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSS[SEQ ID NO:14]。
在一些相同和其他实施方案中，抗PD-1抗原结合分子可以包含纳武单抗的轻链氨基酸序列，例如如下所示：
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC[SEQ IDNO:15]；
或其抗原结合片段，其包含以下氨基酸序列，由或基本由以下氨基酸序列组成：
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIK[SEQ ID NO:16]。
在替代实施方案中，抗PD-1抗原结合分子包括人源化IgG4 mAb帕博利珠单抗或其抗原结合片段。在这种类型的非限制性实例中，抗PD-1抗原结合分子包含表6中列示的CDR序列。
表6
在一些实施方案中，抗PD-1抗原结合分子与mAb帕博利珠单抗竞争以结合PD-1。
在另外的实施方案中，抗PD-1抗原结合分子包含帕博利珠单抗的重链氨基酸序列，例如如下所示：
QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPvTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK[SEQ ID NO:23]；
或其抗原结合片段，其包含以下氨基酸序列，由或基本由以下氨基酸序列组成：
QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSS[SEQ ID NO:24]。
类似地，抗PD-1抗原结合分子可以包含帕博利珠单抗的轻链氨基酸序列，如下所述：
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC[SEQ ID NO:25]；
或其抗原结合片段，其包含以下氨基酸序列，由或基本由以下氨基酸序列组成：
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIK[SEQ ID NO:26]。
在这种类型的其他实施方案中，抗PD-1抗原结合分子包括mAb匹地利珠单抗或其抗原结合片段。在一些相关实施方案中，抗PD-1抗原结合分子包含如表7所示的CDR序列。
表7
在更具体的实施方案中，抗PD-1抗原结合分子包含匹地利珠单抗的重链氨基酸序列，如下所述：
QVQLVQSGSELKKPGASVKISCKASGYTFTNYGMNWVRQAPGQGLQWMGWINTDSGESTYAEEFKGRFVFSLDTSVNTAYLQITSLTAEDTGMYFCVRVGYDALDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK[SEQ ID NO:27]；
或其抗原结合片段，其包含以下氨基酸序列，由或基本由以下氨基酸序列组成：
QVQLVQSGSELKKPGASVKISCKASGYTFTNYGMNWVRQAPGQGLQWMGWINTDSGESTYAEEFKGRFVFSLDTSVNTAYLQITSLTAEDTGMYFCVRVGYDALDYWGQGTLVTVSS[SEQ ID NO:28]。
在一些相同和其他实施方案中，抗PD-1抗原结合分子包含匹地利珠单抗的轻链氨基酸序列，如下所示：
EIVLTQSPSSLSASVGDRVTITCSARSSVSYMHWFQQKPGKAPKLWIYRTSNLASGVPSRFSGSGSGTSYCLTINSLQPEDFATYYCQQRSSFPLTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC[SEQ IDNO:29]，
或其抗原结合片段，其包含以下氨基酸序列，由或基本由以下氨基酸序列组成：
EIVLTQSPSSLSASVGDRVTITCSARSSVSYMHWFQQKPGKAPKLWIYRTSNLASGVPSRFSGSGSGTSYCLTINSLQPEDFATYYCQQRSSFPLTFGGGTKLEIK[SEQ ID NO:30]。
国际专利公开号WO2015/026634中描述了其他合适的单克隆抗体，该专利的全部内容通过引用并入本文。这些包括mAb或其抗原结合片段，其包含：(a)具有氨基酸序列RASKSVSTSGFSYLH[SEQ ID NO:31]、LASNLES[SEQ ID NO:32]和QHSWELPLT[SEQ ID NO:33]的轻链CDR(分别为CDR1、CDR2和CDR3)和具有氨基酸序列SYYLY[SEQ ID NO:34]、GVNPSNGGTNFSEKFKS[SEQ ID NO:35]和RDSNYDGGFDY[SEQ ID NO:36]的重链CDR(分别为CDR1、CDR2和CDR3)；或(b)具有氨基酸序列RASKGVSTSGYSYLH[SEQ ID NO:37]、LASYLES[SEQID NO:38]和QHSRDLPLT[SEQ ID NO:39]的轻链CDR(分别为CDR1、CDR2和CDR3)，以及具有氨基酸序列NYYMY[SEQ ID NO:40]、GINPSNGGTNFN EKFKN[SEQ ID NO:41]和RDYRFDMGFDY[SEQID NO:42]的重链CDR(分别为CDR1，CDR2和CDR 3)。
举例来说，此类单克隆抗体可以包含(a)重链可变区，所述重链可变区包含：
QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSS[SEQ ID NO:43]，
或其变体或抗原结合片段；和
轻链可变区，其包含选自以下的氨基酸序列：
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIK[SEQ ID NO:44]，
IVLTQSPLSLPVTPGEPASISCRASKGVSTSGYSYLHWYLQKPGQSPQLLIYLASYLESGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQHSRDLPLTFGQGTKLEIK[SEQ ID NO:45]，或
DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRASKGVSTSGYSYLHWYLQKPGQSPQLLIYLASYLESGVPDRFSGSGSGTAFTLKISRVEAEDVGLYYCQHSRDLPLTFGQGTKLEIK[SEQ ID NO:46]，或其变体或抗原结合片段。
在进一步的示例性实施方案中，抗PD-1单克隆抗体可以包含IgG1重链，所述IgG1重链包括：
QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK[SEQ ID NO:47]，或其变体或抗原结合片段；以及轻链，其包括以下中的任一种：
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC[SEQ ID NO:48]，
EIVLTQSPLSLPVTPGEPASISCRASKGVSTSGYSYLHWYLQKPGQSPQLLIYLASYLESGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQHSRDLPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNR GEC[SEQ ID NO:49]
DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRASKGVSTSGYSYLHWYLQKPGQSPQLLIYLASYLESGVPDRFSGSGSGTAFTLKISRVEAEDVGLYYCQHSRDLPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFN RGEC[SEQ ID NO:50]，
或其变体或抗原结合片段。
在其他实施方案中，ICM拮抗剂是PD-L1拮抗剂。PD-L1的替代名称或同义词包括PDCD1L1、PDL1、B7H1、B7-4、CD274和B7-H。通常，PD-L1拮抗剂特异性结合人PD-L1(UniProt登录号Q9NZQ7)的天然氨基酸序列，如下所示：
MRIFAVFIFMTYWHLLNAFTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDLAALIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQHSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYNKINQRILVVDPVTSEHELTCQAEGYPKAEVIWTSSDHQVLSGKTTTTNSKREEKLFNVTSTLRINTTTNEIFYCTFRRLDPEENHTAELVIPELPLAHPPNERTHLVILGAILLCLGVALTFIFRLRKGRMMDVKKCGIQDTNSKKQSDTHLEET[SEQ IDNO:51]。
适当地，PD-L1拮抗剂是抗PD-L1抗原结合分子。例如，适用于本发明的抗PD-L1抗原结合分子包括抗PD-L1 mAbs度伐利尤单抗(MEDI4736)、阿替利珠单抗(Tecentriq)、BMS-936559/MDX-1105、MSB0010718C、LY3300054、CA-170、GNS-1480、MPDL3280A和阿维鲁单抗。这些和其他抗PD-Ll抗体在国际公开号WO2007/005874和WO2010/077634以及美国专利号8217149和8779108中有所描述，每种抗体的全部内容通过引用并入本文。国际PCT专利公开号WO2016/007235中描述了其他抗PD-L1单克隆抗体，其全部内容也通过引用并入本文。
抗PD-L1抗原结合分子适当地与PD-L1细胞外结构域的区域结合。举例来说，抗PD-L1抗原结合分子可以特异性与人PD-L1细胞外结构域的区域结合，所述区域包含氨基酸序列SKKQSDTHLEET[SEQ ID NO:13](即SEQ ID NO:14中列示的天然PD-L1序列的第279至290位残基)。在某些实施方案中，抗PD-L1抗原结合分子包含完全人源化的IgG1 mAb度伐利尤单抗(如国际PCT公开号WO2011/066389和美国专利公开号2013/034559中的“MEDI4736”所述，其全部内容通过引用并入本文)或其抗原结合片段。在这种类型的代表性实施方案中，抗PD-L1抗原结合分子包含表8中列出的CDR序列。
表8
在更具体的实施方案中，抗PD-L1抗原结合分子包含度伐利尤单抗的重链氨基酸序列，例如如下所示：
VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGGWFGELAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG[SEQ ID NO:52]，
或其抗原结合片段，其包含氨基酸序列，由或基本由以下氨基酸序列组成：
VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGGWFGELAFDYWGQGTLVTVSS[SEQ ID NO:53]。
在一些相同和其他实施方案中，抗PD-L1抗原结合分子可以包含轻链氨基酸序列：
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQRVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSLPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC[SEQID NO:54]，
或其抗原结合片段，其包含以下氨基酸序列，由或基本由以下氨基酸序列组成：
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQRVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSLPWTFGQGTKVEIK[SEQ ID NO:55]。
或者，抗PD-L1抗原结合分子与mAb度伐利尤单抗竞争以与PD-L1的结合。
在其他实施方案中，抗PD-L1抗原结合分子包括完全人源化的IgG1 mAb阿替利珠单抗(如美国专利号8217148所述，其全部内容通过引用并入本文)或其抗原结合片段。在这种类型的代表性实施方案中，抗PD-L1抗原结合分子包含表9中列出的CDR序列。
表9
在更具体的实施方案中，抗PD-L1抗原结合分子包含阿替利珠单抗的重链氨基酸序列，例如如下所示：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK[SEQ ID NO:56]，或其抗原结合片段，其包含以下氨基酸序列，由或基本由以下氨基酸序列组成：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS[SEQ ID NO:57]。
在一些相同和其他实施方案中，抗PD-L1抗原结合分子包含阿替利珠单抗的轻链氨基酸序列，例如如下所示：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC[SEQ IDNO:58]，
或其抗原结合片段，其包含以下氨基酸序列，由或基本由以下氨基酸序列组成：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIK[SEQ ID NO:59]。
或者，抗PD-L1抗原结合分子与单克隆抗体阿替利珠单抗竞争与PD-L1的结合。
在其他实施方案中，抗PD-L1抗原结合分子包括完全人源化的IgG1 mAb阿维鲁单抗(如美国专利号8217148所述，其全部内容通过引用并入本文)或其抗原结合片段。在这种类型的代表性实施方案中，抗PD-L1抗原结合分子包含表10中列出的CDR序列。
表10
在具体实施方案中，抗PD-L1抗原结合分子包含阿维鲁单抗的重链氨基酸序列，例如如下所示：
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYIMMWVRQAPGKGLEWVSSIYPSGGITFYADTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARIKLGTVTTVDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK[SEQ ID NO:60]，或其抗原结合片段，其包含以下氨基酸序列，由或基本由以下氨基酸序列组成：
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYIMMWVRQAPGKGLEWVSSIYPSGGITFYADTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARIKLGTVTTVDYWGQGTLVTVSS[SEQ ID NO:61]。
在一些相同和其他实施方案中，抗PD-Ll抗原结合分子包含阿维鲁单抗的轻链氨基酸序列，例如如下所示：
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTRVFGTGTKVTVLGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS[SEQID NO:62]，
或其抗原结合片段，其包含以下氨基酸序列，由或基本由以下氨基酸序列组成：
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTRVFGTGTKVTVL[SEQ ID NO:63]。
或者，抗PD-L1抗原结合分子与阿维鲁单抗竞争以与PD-L1的结合。
在一些实施方案中，ICM拮抗剂是CTLA4的拮抗剂。CTLA4的替代名称或同义词包括ALPS5、CD、CD152、CELIAC3、CTLA-4、GRD4、GSE、IDDM 12。通常，CTLA4拮抗剂特异性与人CTLA4的成熟氨基酸序列(UniProt登录号P16410)结合，例如如下所示：
KAMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDFLLWILAAVSSGLFFYSFLLTAVSLSKMLKKRSPLTTGVYVKMPPTEPECEKQFQPYFIPIN[SEQ ID NO:64]。
适当地，CTLA4拮抗剂是抗CTLA4抗原结合分子。例如，适用于本发明的抗CTLA4抗原结合分子包括抗CTLA4单克隆抗体伊匹木单抗(ipilimumab)(BMS-734016，MDX-010，MDX-101)和曲美木单抗(tremelimumab)(ticilimumab，CP-675206)。
抗CTLA4抗原结合分子适当地与CTLA4细胞外结构域的区域结合。举例来说，抗CTLA4抗原结合分子可以特异性地与人CTLA4细胞外结构域的区域结合，所述区域包含以下氨基酸序列中的任何一个或多个，YASPGKATEVRVTVLRQA[SEQ ID NO:65](即SEQ ID NO:64中所示的天然CTLA4序列的第26至42位残基)、DSQVTEVCAATYMMGNELTFLDD[SEQ ID NO:66](即SEQ ID NO:64中所示的天然CTLA4序列的第43至65位残基)和VELMYPPPYYLGIG[SEQ IDNO:67](即SEQ ID NO:64中所示的天然CTLA4序列的第96至109位残基)。可选地或另外地，抗CTLA4抗原结合分子可以特异性地与人CTLA4的细胞外结构域的区域结合，所述区域包含下列成熟形式的残基中的任何一个或多个，优选全部：Kl、A2、M3、E33、R35、Q41、S44、Q45、V46、E48、L91、193、K95、E97、M99、P102、P103、Y104、Y105、L106、1108、N110。
在某些实施方案中，抗CTLA4抗原结合分子包括人IgG1 mAb伊匹木单抗(例如如国际公开WO2014/209804和美国专利公开号2015/0283234中所述，其全部内容通过引用并入本文)或其抗原结合片段。在这种类型的代表性实施方案中，抗CTA4抗原结合分子包含表11中列出的CDR序列。
表11
在更具体的实施方案中，抗CTLA4抗原结合分子包含伊匹木单抗的重链氨基酸序列，例如如下所述：
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYTMHWVRQAPGKGLEWVTFISYDGNNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARTGWLGPFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSC SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK[SEQ ID NO:68]，或其抗原结合片段，其非限制性实例包括以下氨基酸序列，由或基本由以下氨基酸序列组成：
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYTMHWVRQAPGKGLEWVTFISYDGNNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARTGWLGPFDYWGQGTLVTVSS[SEQ ID NO:69]。
在一些相同和其他实施方案中，抗CTLA4抗原结合分子包含伊匹木单抗的轻链氨基酸序列，例如如下所示：
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVGSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGAFSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC[SEQID NO:70]，
或其抗原结合片段，其代表性实例包括以下氨基酸序列，由或基本由以下氨基酸序列组成：
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVGSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGAFSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIK[SEQ ID NO:71]。
在一些实施方案中，抗CTAL4抗原结合分子包括人IgG2 mAb曲美木单抗(例如如美国专利公开号2009/0074787中所述，其全部内容通过引用并入本文)或其抗原结合片段。在这种类型的代表性实施方案中，抗CTLA4抗原结合分子包含表12中列出的CDR序列。
表12
在更具体的实施方案中，抗CTLA4抗原结合分子包含曲美木单抗的重链氨基酸序列，例如如下所述：
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYIQMNSLRAEDTAVYYCARDPRGATLYYYYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK[SEQ ID NO:172]，
或其抗原结合片段，其非限制性实例包括以下氨基酸序列，由或基本由以下氨基酸序列组成：
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYTMHWVRQAPGKGLEWVTFISYDGNNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARTGWLGPFDYWGQGTLVTVSS[SEQ ID NO:73]。
在一些相同和其他实施方案中，抗CTLA4抗原结合分子包含曲美木单抗的轻链氨基酸序列，例如如下所示：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSINSYLDWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSTPFTFGPGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC[SEQ IDNO:74]，
或其抗原结合片段，其代表性实例包括以下氨基酸序列，由或基本由以下氨基酸序列组成：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSINSYLDWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSTPFTFGPGTKVEIK[SEQ ID NO:75]。
在其他实施方案中，ICM拮抗剂是B7-H3拮抗剂。通常，本发明的B7-H3拮抗剂特异性与人B7-H3的天然氨基酸序列(UniProt登录号Q5ZPR3)结合，如下所述：
MLRRRGSPGMGVHVGAALGALWFCLTGALEVQVPEDPVVALVGTDATLCCSFSPEPGFSLAQLNLIWQLTDTKQLVHSFAEGQDQGSAYANRTALFPDLLAQGNASLRLQRVRVADEGSFTCFVSIRDFGSAAVSLQVAAPYSKPSMTLEPNKDLRPGDTVTITCSSYQGYPEAEVFWQDGQGVPLTGNVTTSQMANEQGLFDVHSILRVVLGANGTYSCLVRNPVLQQDAHSSVTITPQRSPTGAVEVQVPEDPVVALVGTDATLRCSFSPEPGFSLAQLNLIWQLTDTKQLVHSFTEGRDQGSAYANRTALFPDLLAQGNASLRLQRVRVADEGSFTCFVSIRDFGSAAVSLQVAAPYSKPSMTLEPNKDLRPGDTVTITCSSYRGYPEAEVFWQDGQGVPLTGNVTTSQMANEQGLFDVHSVLRVVLGANGTYSCLVRNPVLQQDAHGSVTITGQPMTFPPEALWVTVGLSVCLIALLVALAFVCWRKIKQSCEEENAGAEDQDGEGEGSKTALQPLKHSDSKEDDGQEIA[SEQ ID NO:76]。
适当地，B7-H3拮抗剂是抗B7-H3抗原结合分子。例如，适用于本发明的抗B7-H3抗原结合分子是单克隆抗体依诺妥珠单抗(enoblituzumab)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗B7-H3抗原结合分子包含如表13所示的CDR序列。
表13
在更具体的实施方案中，抗B7-H3抗原结合分子包含依诺妥珠单抗的重链氨基酸序列，例如如下所示：
VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPGKGLEWVAYISSDSSAIYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYYCGRGRENIYYGSRLDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELVGGPSVFLLPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQYNSTLRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPLVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK[SEQ ID NO:77]，
或其抗原结合片段，其代表性实例包括以下氨基酸序列，由或基本由以下氨基酸序列组成：
VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPGKGLEWVAYISSDSSAIYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYYCGRGRENIYYGSRLDYWGQGTTVTVSS[SEQ ID NO:78]。
在一些相同和其他实施方案中，抗B7-H3抗原结合分子包含依诺妥珠单抗的轻链氨基酸序列，例如如下所示。
DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQNVDTNVAWYQQKPGKAPKALIYSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNNYPFTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC[SEQ IDNO:79]，
或其抗原结合片段，其代表性实例包括以下氨基酸序列，由或基本由以下氨基酸序列组成：
DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQNVDTNVAWYQQKPGKAPKALIYSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNNYPFTFGQGTKLEIK[SEQ ID NO:80]。
在一些替代实施方案中，抗B7-H3抗原结合分子与单克隆抗体依诺妥珠单抗竞争以与B7-H3的结合。
在其他实施方案中，ICM拮抗剂是吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)拮抗剂。人IDO的成熟氨基酸序列(UniProt登录号P14902)如下所示：
MAHAMENSWTISKEYHIDEEVGFALPNPQENLPDFYNDWMFIAKHLPDLIESGQLRERVEKLNMLSIDHLTDHKSQRLARLVLGCITMAYVWGKGHGDVRKVLPRNIAVPYCQLSKKLELPPILVYADCVLANWKKKDPNKPLTYENMDVLFSFRDGDCSKGFFLVSLLVEIAAASAIKVIPTVFKAMQMQERDTLLKALLEIASCLEKALQVFHQIHDHVNPKAFFSVLRIYLSGWKGNPQLSDGLVYEGFWEDPKEFAGGSAGQSSVFQCFDVLLGIQQTAGGGHAAQFLQDMRRYMPPAHRNFLCSLESNPSVREFVLSKGDAGLREAYDACVKALVSLRSYHLQIVTKYILIPAS QQPKENKTSEDPSKLEAKGTGGTDLMNFLKTVRSTTEKSLLKEG[SEQID NO:81]。
任何IDO拮抗剂都适用于本发明的治疗剂。目前，三种小分子IDO抑制剂正在开发用于临床用途：GDC-0919(1-环己基-2-(5H-咪唑并[5,1-a]异吲哚-5-基)乙醇)、吲哚肟(1-甲基-D-色氨酸)和埃帕卡多司他(1,2,5-恶二唑-3-甲脒，4-(2-((氨基磺酰基)氨基)乙基)氨基)-N-(3-溴-4-氟苯基)-N'-羟基-，(C(Z))-)。下面提供了这些分子中的每一个的分子结构。
(Indoximod)
在一些实施方案中，ICM拮抗剂是杀伤细胞免疫球蛋白(KIR)拮抗剂。在这种类型的优选实施方案中，KIR拮抗剂阻断KIR2-DL-1、-2和-3与其配体之间的相互作用。例如，下面提供了人KIR的成熟氨基酸序列，即KIR2-DL1(UniProt登录号P43626)：
HEGVHRKPSLLAHPGPLVKSEETVILQCWSDVMFEHFLLHREGMFNDTLRLIGEHHDGVSKANFSISRMTQDLAGTYRCYGSVTHSPYQVSAPSDPLDIVIIGLYEKPSLSAQPGPTVLAGENVTLSCSSRSSYDMYHLSREGEAHERRLPAGPKVNGTFQADFPLGPATHGGTYRCFGSFHDSPYEWSKSSDPLLVSVTGNPSNSWPSPTEPSSKTGNPRHLHILIGTSVVIILFILLFFLLHRWCSNKKNAAVMDQESAGNRTANSEDSDEQDPQEVTYTQLNHCVFTQRKITRPSQRPKTPPTDIIVYTELPNAESRSKVVSCP[SEQ ID NO:82]。
适用于本发明的抗KIR抗原结合分子可以使用本领域熟知的方法产生。或者，可以使用本行业认可的KIR抗原结合分子。例如，抗KIR抗原结合分子包括例如国际公开号WO2014/066532中所述的完全人源化mAb利瑞鲁单抗或其抗原结合片段，其全部内容在此全部并入本文。适当地，抗KIR抗原结合分子包含表14中列出的CDR区。
表14
在这种类型的代表性实施方案中，抗KIR抗原结合分子可以包含利瑞鲁单抗的重链可变结构域氨基酸序列，例如如下所示：
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSFYAISWVRQAPGQGLEWMGGFIPIFGAANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSDDTAVYYCARIPSGSYYYDYDMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPvTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK[SEQ ID NO:83]，或其抗原结合片段，其代表性实例包括以下氨基酸序列，由或基本由以下氨基酸序列组成：
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSFYAISWVRQAPGQGLEWMGGFIPIFGAANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSDDTAVYYCARIPSGSYYYDYDMDVWGQGTTVTVSS[SEQ ID NO:84]。
在一些相同和其他实施方案中，抗KIR抗原结合分子可以包含利鲁单抗的轻链可变结构域氨基酸序列，例如如下所示：
EIVLTQSPVTLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWMYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC[SEQ IDNO:85]，
或其抗原结合片段，其代表性实例包括以下氨基酸序列，由或基本由以下氨基酸序列组成：
EIVLTQSPVTLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWMYTFGQGTKLEIKRT[SEQ ID NO:86]。
在替代实施方案中，ICM拮抗剂是LAG-3拮抗剂。LAG3是一种503个氨基酸的I型跨膜蛋白，具有四个细胞外Ig样结构域。LAG-3在活化的T细胞、NK细胞、B细胞和浆细胞样树突状细胞上表达。人LAG-3的代表性成熟氨基酸序列(UniProt登录号P18627)如下：
LQPGAEVPVVWAQEGAPAQLPCSPTIPLQDLSLLRRAGVTWQHQPDSGPPAAAPGHPLAPGPHPAAPSSWGPRPRRYTVLSVGPGGLRSGRLPLQPRVQLDERGRQRGDFSLWLRPARRADAGEYRAAVHLRDRALSCRLRLRLGQASMTASPPGSLRASDWVILNCSFSRPDRPASVHWFRNRGQGRVPVRESPHHHLAESFLFLPQVSPMDSGPWGCILTYRDGFNVSIMYNLTVLGLEPPTPLTVYAGAGSRVGLPCRLPAGVGTRSFLTAKWTPPGGGPDLLVTGDNGDFTLRLEDVSQAQAGTYTCHIHLQEQQLNATVTLAIITVTPKSFGSPGSLGKLLCEVTPVSGQERFVWSSLDTPSQRSFSGPWLEAQEAQLLSQPWQCQLYQGERLLGAAVYFTELSSPGAQRSGRAPGALPAGHLLLFLILGVLSLLLLvTGAFGFHLWRRQWRPRRFSALEQGIHPPQAQSKIEELEQEPEPEPEPEPEPEPEPEPE QL[SEQ ID NO:87]。
在一些实施方案中，LAG-3拮抗剂是抗LAG-3抗原结合分子。举例来说，合适的抗LAG抗原结合分子是抗LAG3人源化mAb BMS-986016。其他抗LAG-3抗体在美国专利公开号2011/0150892和国际PCT公开号WO2010/019570和WO2014/008218中有所描述，其全部内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，抗LAG-3抗原结合分子包含表15中列出的CDR序列。
表15
抗LAG-3抗原结合分子适当地包含mAb BMS-986016或其抗原结合片段。更具体地说，在一些实施方案中，抗LAG-3抗原结合分子具有BMS-986016的重链氨基酸序列，例如如下所示：
QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSDYYWNWIRQPPGKGLEWIGEINHRGSTNSNPSLKSRVTLSLDTSKNQFSLKLRSVTAADTAVYYCAFGYSDYEYNWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK[SEQ ID NO:88]，或其抗原结合片段，其代表性实例包括以下氨基酸序列，由或基本由以下氨基酸序列组成：
QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSDYYWNWIRQPPGKGLEWIGEINHRGSTNSNPSLKSRVTLSLDTSKNQFSLKLRSVTAADTAVYYCAFGYSDYEYNWFDPWGQGTLVTVSS[SEQ ID NO:89]。
类似地，抗LAG-3抗原结合分子可以包含BMS-986016的轻链氨基酸序列，如SEQ IDNO:45所示，如下所示：
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSISSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPLTFGQGTNLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC[SEQ IDNO:90]，
或其抗原结合片段，其代表性实例包括以下氨基酸序列，由或基本由以下氨基酸序列组成：
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSISSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPLTFGQGTNLEIK[SEQ ID NO:91]。
2.2.2PARP抑制剂
聚ADP核糖聚合酶(PARP)酶是一个切割NAD+、释放烟酰胺并连续添加ADP核糖单元形成ADP核糖聚合物的酶家族。PARP酶的激活可导致细胞NAD+水平的耗尽(例如，PARP作为NAD+的消费者)，并通过下游靶标的ADP核糖基化介导细胞信号传导。PARP-1是一种锌指DNA结合酶，通过与DNA双链或单链断裂结合而激活。众所周知，抗烷化剂可以耗尽肿瘤细胞的NAD+含量，PARPs的发现解释了这一现象(PARP Inhibitors andCancerTherapy.CurtinN.in PolyADP Ribosylation.ed.Alexander Burke,LandsBioscience and Springer Bioscience,2006:218-233)。抗烷化剂诱导DNA链断裂，从而激活PARP-1，PARP-1是DNA修复途径的一部分。PARP-1对核蛋白的聚ADP核糖基化将DNA损伤转化为细胞内信号，这些信号可以激活DNA修复(例如，通过碱基切除修复(BER)途径)；或者在DNA损伤过于广泛且无法有效修复的情况下引发细胞死亡。
PARP-2含有催化结构域，能够催化聚ADP核糖基化反应。PARP-2显示与PARP-1类似的自动修改特性。该蛋白质在体内定位于细胞核中，可能解释了用烷基化剂或过氧化氢处理的PARP-1缺陷细胞中观察到的残余聚ADP核糖合成。一些抑制PARP的药物(例如，主要旨在抑制PARP-1的药物)也可能抑制PARP-2(例如，尼拉帕利)。
PARP酶在DNA损伤反应中的作用(例如，响应基因毒性应激的DNA修复)提供了令人信服的提示，即PARP抑制剂可能是有用的抗癌剂。PARP抑制剂可能特别有效地治疗由同源重组DNA修复途径中生殖系或偶发性缺陷引起的癌症，如BRCA-1和/或BRCA-2缺陷型癌症。
临床前离体和体内实验表明，PARP抑制剂对具有BRCA-1和/或BRCA-2基因纯合失活的肿瘤具有选择性细胞毒性，已知这些基因在同源重组(HR)DNA修复途径中很重要。在BRCA-1和/或BRCA-2缺陷的癌症中使用PARP抑制剂作为单一药物的生物学基础是，PARP-1和PARP-2对受损DNA的碱基切除修复(BER)是必需的。在形成单链DNA断裂后，PARP-1和PARP-2在病变部位结合，被激活，并催化ADP-核糖(PAR链)的长聚合物添加到与染色质相关的几种蛋白质上，包括组蛋白。这导致染色质松弛并快速募集DNA修复因子，这些因子可以接触并修复DNA断裂。正常细胞每天修复多达10000个DNA缺陷，单链断裂是最常见的DNA损伤形式。具有BER通路缺陷的细胞进入S期时带有未修复的单链断裂。当复制机器通过断裂点时，预先存在的单链断裂会转化为双链断裂。S期出现的双链断裂优先通过无差错的HR通路进行修复。具有HR所需基因(如BRCA-1和/或BRCA-2)失活的细胞，在S期积累停滞的复制叉，并可能使用易出错的非同源末端连接(NHEJ)来修复受损的DNA。无法完成S期(由于复制叉停滞)和通过NHEJ进行易错修复，两者都被认为是导致细胞死亡的原因。
在不希望受理论束缚的情况下，假设用PARP抑制剂治疗可以选择性地杀死DNA修复途径缺乏的癌症细胞亚群(例如BRCA-1和/或BRCA-2失活)。例如，在具有种系BRCA突变的患者中产生的肿瘤具有缺陷的同源重组DNA修复途径，并且将越来越依赖于BER(一种被PARP抑制剂阻断的途径)来维持基因组的完整性。这种通过使用PARP抑制剂阻断肿瘤中的一种DNA修复途径来诱导死亡的概念被称为合成致死性，所述肿瘤具有互补DNA修复途径中预先存在的缺陷。
PARP抑制剂的治疗潜力进一步扩大，因为观察到PARP抑制剂不仅在HR缺陷型肿瘤中具有单一治疗活性，而且在临床前模型中与顺铂、卡铂、烷基化和甲基化药物、放射治疗和拓扑异构酶I抑制剂等其他药物联合使用也有效。与PARP单独抑制足以导致HR缺乏性癌症(由于内源性DNA损伤)细胞死亡的单药疗法的基本原理相反，PARP是修复标准细胞毒性化疗诱导的DNA损伤所必需的。在某些情况下，PARP的具体作用尚不清楚，但已知PARP是从DNA中释放被捕获的拓扑异构酶I/伊立替康复合物所必需的。替莫唑胺诱导的DNA损伤通过BER途径修复，这需要PARP招募修复蛋白。在不显著增加毒性的情况下加强或协同癌症治疗的联合疗法将为癌症患者，包括卵巢癌症患者提供实质性益处。
在一些实施方案中，如本文所提供的用于本文所公开的各种方法和试剂盒的PARP抑制剂(例如PARP-1/2抑制剂)的治疗可以通过利用癌症细胞类型在DNA修复中的缺陷来选择性地杀死其亚群。由于DNA修复中的潜在缺陷，人类癌症表现出基因组不稳定和突变率增加。这些缺陷使癌症细胞更依赖于剩余的DNA修复途径，并且靶向这些途径预计会对肿瘤细胞的存活产生影响，而不是对正常细胞产生影响。
在一些实施方案中，PARP抑制剂选自ABT-767、AZD 2461、BGB-290、BGP 15、CEP8983、CEP 9722、DR 2313、E7016、E7449、氟唑帕利(SHR 3162)、IMP4297、INO1001、JPI 289、JPI 547、单克隆抗体B3-LysPE40缀合物、MP 124、尼拉帕利(ZEJULA)、NU 1025、NU 1064、NU1076、NU1085、奥拉帕尼、ONO2231、PD 128763、R 503、R554、鲁卡帕尼(RUBRACA)、SBP 101、SC 101914、希明哌瑞、他拉唑帕尼(BMN-673)、维利帕尼(ABT-888)和WW46，2-(4-(三氟甲基)苯基)-7,8-二氢-5H-吡喃并[4,3-d]嘧啶-4-醇，或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，PARP抑制剂是小分子。在一些替代实施方案中，PARP抑制剂是抗体剂。在一些实施方案中，抑制PARP的试剂是试剂的组合。
在一些实施方案中，PARP抑制剂选自奥拉帕尼、尼拉帕利、鲁卡帕尼、他拉唑帕尼、维利帕尼或其任何组合。在一些实施方案中，PARP抑制剂制备为药学上可接受的盐。在一些实施方案中，盐形式可以以溶剂化或水合多晶型存在。
因此，PARP抑制剂可选自奥拉帕尼、尼拉帕利、鲁卡帕尼和他拉唑帕尼，或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，PARP抑制剂是奥拉帕尼或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，所述PARP抑制剂是奥拉帕尼。
奥拉帕尼(AZD2281，KU-0059436)是一种强效的PARP抑制剂(PARP 1、2和3)，目前正在开发为单药疗法，也可与化疗、电离辐射和其他抗癌药物(包括新药和免疫疗法)联合使用。
PARP抑制是一种针对DNA修复机制缺陷的肿瘤的新方法。PARP酶对于修复DNA单链断裂(SSB)至关重要。
抑制PARP会导致SSB的持续存在，然后在DNA复制过程中转化为更严重的DNA双链断裂(DSB)。在细胞分裂过程中，DSB可以通过同源重组修复(HRR)在正常细胞中有效修复。具有同源重组缺乏(HRD)的肿瘤，如乳腺癌易感性基因1/2(BRCA1/2)突变患者的卵巢癌，不能准确修复DNA损伤，随着DNA异常的积累可能对细胞致命。在这类肿瘤类型中，与目前可用的化疗方案相比，奥拉帕尼可能提供一种潜在有效且毒性较小的癌症治疗。奥拉帕尼将PARP的非活性形式捕获在DNA的SSB位点上，从而阻止其修复。
2.3辅助剂
在一些实施方案中，PI3K抑制剂和ICM结合拮抗剂与辅助剂同时施用，用于治疗或辅助治疗T细胞功能障碍性疾病。辅助剂的非限制性实例包括细胞毒性剂、基因治疗剂、DNA治疗剂、病毒治疗剂、RNA治疗剂、免疫治疗剂、骨髓移植剂、纳米治疗剂或前述的组合。辅助剂可以是辅助疗法或新辅助疗法的形式。在一些实施方案中，辅助剂是小分子酶抑制剂或抗转移剂。在一些实施例中，辅助剂是副作用限制剂(例如，旨在减轻治疗副作用的发生和/或严重程度的试剂，如止吐剂等)。在一些实施方案中，辅助剂是放射治疗剂。在一些实施方案中，辅助剂是靶向PI3K/AKT/mTOR途径的试剂、HSP90抑制剂、微管蛋白抑制剂、凋亡抑制剂和/或化学预防剂。在一些实施方案中，辅助剂是免疫治疗剂，例如阻断抗体、伊匹木单抗(也称为MDX-010、MDX-101或)、曲美木单抗(也称为ticilimumab或CP-675206)、针对B7-H3(也称为CD276)的拮抗剂，例如阻断抗体、MGA271、针对TGF-β的拮抗剂(例如，美替木单抗(metelimumab，也称为CAT-192)、夫瑞奴单抗(fresolimumab，也称GC1008)或LY2157299)、表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞(例如，细胞毒性T细胞或CTL)，包含显性失活TGF-β受体(例如显性失活TGF-βII型受体)的T细胞，针对CD137的激动剂(也称为TNFRSF9、4-1BB或ILA)，例如活化抗体，乌瑞芦单抗(urelumab，也称为BMS-663513)，针对CD40的激动剂，例如活化抗体，CP-870893，针对OX40的激动剂(也称为CD134)，例如活化抗体，与抗OX40抗体(例如AgonOX)联合施用，针对CD27的激动剂，例如活化抗体、CDX-1127、吲哚胺-2,3-双加氧酶(IDO)、1-甲基-D-色氨酸(也称为1-D-MT)、抗体-药物偶联物(在一些实施方案中，包含mertansine或单甲基奥瑞他汀E(MMAE))、抗NaPi2b抗体-MMAE偶联物(也称为DNIB0600A或RG7599)、曲妥珠单抗emtansine(也称为T-DM1、ado-trastuzumab emtansines或Genentech)、DMUC5754A、靶向内皮素B受体的抗体-药物缀合物(EDNBR)，例如，与MMAE结合的抗EDNBR的抗体、血管生成抑制剂、抗VEGF的抗体，如VEGF-A、贝伐单抗(也称为Genentech)、针对促血管生成素2(也称为Ang2)的抗体、MEDI3617、抗肿瘤剂、针对CSF-IR(也称为M-CSFR或CD115)的试剂、抗CSF-lR(也称为IMC-CS4)、干扰素，如IFN-α或IFN-γ、Roferon-A，GM-CSF(也称为重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、rhu GM-CSF、沙格司亭或)、IL-2(也称为阿地白介素或)、IL-12、靶向CD20的抗体(在一些实施方案中，靶向CD2的抗体为阿托珠单抗(也称为GA101或)或利妥昔单抗)、靶向GITR的抗体(在一些实施方案中，靶向GIRT的抗体为TRX518)，结合癌症疫苗(在一些方案中，癌症疫苗为肽癌症疫苗，其在某些实施方案中为个性化肽疫苗；在一些实施方案中，肽癌症疫苗是多价长肽、多肽、肽混合物、杂交肽或肽驱动的树突细胞疫苗(peptide-pulsed dendritic cell vaccine，参见，例如Yamada等人，Cancer Sci,104:14-21,2013))，与佐剂联合、TLR激动剂，例如Poly-ICLC(也称为)、LPS、MPL或CpGODN、TNF、IL-1、HMGB1、IL-10拮抗剂、IL-4拮抗剂、IL-13拮抗剂，HVEM拮抗剂、ICOS激动剂，例如通过施用ICOS-L，或针对ICOS的激动性抗体、靶向CX3CL1的试剂、靶向CXCL10的试剂、靶向CCL5的试剂、LFA-1或ICAM1激动剂、选择素激动剂、靶向治疗剂、B-Raf抑制剂、维莫非尼(也称为达拉非尼(也称为)、厄洛替尼(也称为)、MEK抑制剂，如MEK1(也称为MAP2K1)或MEK2(也称为MAP2K2)、考比替尼(也称为GDC-0973或XL-518)、曲美替尼(也称为)、K-Ras抑制剂、c-Met抑制剂、奥纳妥组单抗(也称为MetMAb)、Alk抑制剂、AF802(也称为CH5424802或阿来替尼)、BKM120、艾代拉里斯(也称作GS-1101或CAL-101)、哌立福新(也称为KRX-0401)、Akt、MK2206、GSK690693、GDC-0941、mTOR抑制剂、西罗莫司(也称为雷帕霉素)、替西罗莫司(又称CCl-779或)、依维莫司(又称作RAD001)、地磷莫斯(也称作AP-23573、MK-8669或deforolimus)、OSI-027、AZD8055、INK128、双PI3K/mTOR抑制剂、XL765、GDC-0980、BEZ235(又称NVP-BEZ235)、BGT226、GSK2126458、PF-04691502、PF-05212384(又称PKI-587)。辅助剂可以是本文所述的细胞毒性或化学治疗剂中的一种或多种。
在一些实施方案中，辅助剂是抗感染药物。所述抗感染药物适当地选自抗菌剂，其包括但不限于杀死或抑制病毒、细菌、酵母、真菌、原生动物等微生物生长的化合物，因此包括抗生素、杀阿米巴药、抗真菌药、抗原生动物药、抗疟药、抗结核药和抗病毒药。抗感染药物还包括驱虫剂和杀线虫剂。示例性抗生素包括喹诺酮类药物(例如，阿米沙星、西诺沙星、环丙沙星、依诺沙星、氟罗沙星、氟甲喹、洛美沙星、萘啶酸、诺氟沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星、洛美沙星，恶喹酸、培氟沙星、罗沙星、替马沙星、托磺沙星、司帕沙星、克林沙星、加替沙星、莫西沙星、吉美沙星和甲磺酸加诺沙星)、四环素累、甘氨酰环素和恶唑烷酮类(例如，金霉素、去甲金霉素、多西环素、赖甲四环素、甲烯土霉素、二甲胺四环素、土霉素、四环素、替加环素、利奈唑胺、依哌唑胺)、糖肽类、氨基糖苷类(如阿米卡星、阿贝卡星、丁苷菌素、达苄霉素、福提霉素、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、奈替米星，核糖霉素、西索米星、壮观霉素、链霉素、妥布霉素)、β-内酰胺类(例如，亚胺培南、美罗培南、比阿培南、头孢克洛、头孢羟氨苄、头孢孟多、头孢硫脒、头孢西酮、头孢唑林、头孢克肟、头孢甲肟、头孢地嗪、头孢尼西、头孢哌酮、头孢雷特、头孢噻肟、头孢替安、头孢咪唑、头孢匹胺、头孢泊肟酯、头孢磺啶、头孢他啶、头孢特仑、头孢替唑、头孢布烯、头孢唑肟、头孢曲松、头孢呋辛、头孢唑南、腈甲基头孢菌素(cephaacetrile)、头孢氨苄、头孢来星(cephaloglycin)、头孢噻啶、头孢噻吩、头孢匹林、头孢拉定、头孢美唑(cefinetazole)、头孢西丁、头孢替坦、氨曲南、卡芦莫南、氟氧头孢、拉氧头孢、氨卓西林、阿莫西林、氨苄西林、阿洛西林、苯拉西林、卡非西林、氯唑西林、双氯西林、甲氧西林、美洛西林、萘夫西林、苯唑西林、青霉素G、哌拉西林、磺苄西林、替莫西林、替卡西林、头孢妥仑、SC004、KY-020、头孢地尼、头孢布烯、FK-312、S-1090、CP-0467、BK-218、FK-037、DQ-2556、FK-518、头孢唑兰、ME1228、KP-736、CP-6232、Ro 09-1227、OPC-20000、LY206763)、利福霉素、大环内酯类(如阿奇霉素、克拉霉素、红霉素、竹桃霉素、罗他霉素、玫瑰霉素、罗红霉素和醋竹桃霉素)、酮内酯类(如泰利霉素、喹红霉素)、香豆素、林可酰胺类(如克林霉素、林可霉素)和氯霉素。示例性抗病毒药物包括硫酸阿巴卡韦、阿昔洛韦钠、盐酸金刚烷胺、安普那韦、西多福韦、地拉韦啶甲磺酸盐、去羟肌苷、依法韦仑、泛昔洛韦、福米韦生钠、膦甲酸钠、更昔洛韦、硫酸茚地那韦、拉米夫定、拉米夫定/齐多夫定、甲磺酸奈非那韦、奈韦拉平、磷酸奥司他韦、利巴韦林、盐酸金刚乙胺、利托那韦、沙奎那韦、甲磺酸盐沙奎那韦、司他夫定、盐酸伐昔洛韦、扎西他滨、扎那米韦和齐多夫定。抗阿米巴药或抗抗原生动物的非限制性实例包括阿托伐醌、盐酸氯喹、磷酸氯喹、甲硝唑、盐酸甲硝唑和喷他脒羟乙磺酸盐。驱虫剂可以是选自甲苯达唑、双羟萘酸噻嘧啶、阿苯达唑、伊维菌素和噻苯达唑中的至少一种。示例性抗真菌药物可选自两性霉素B、两性霉素B-胆固醇硫酸盐复合物、两性霉素B-脂质复合物、两性霉素B脂质体、氟康唑、氟胞嘧啶、微粉化灰黄霉素、超微粉化灰黄霉素、伊曲康唑、酮康唑、制霉菌素和盐酸特比萘芬。抗疟疾药物的非限制性实例包括盐酸氯喹、磷酸氯喹、多西环素、硫酸羟氯喹、盐酸甲氟喹、磷酸伯氨喹、乙胺嘧啶和乙胺嘧啶与磺胺多辛。抗结核药物包括但不限于氯法齐明、环丝氨酸、氨苯砜、盐酸乙胺丁醇、异烟肼、吡嗪酰胺、利福布汀、利福平、利福喷汀和硫酸链霉素。
3.药物组合物和制剂
本文还提供了包含PI3K抑制剂、ICM结合拮抗剂和药学上可接受的载体的药物组合物和制剂。在一些实施方案中，药物组合物和制剂还包含例如本文所述的辅助剂。
本文所述的药物组合物和制剂可以通过将具有所需纯度的活性成分(例如小分子、核酸或多肽)与一种或多种任选的药学上可接受的载体混合来制备(Remington'sPharmaceutical Sciences16th edition,Osol,A.Ed.(1980))。药学上可接受的载体在所使用的剂量和浓度下通常对受体无毒，包括但不限于：磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸等缓冲液；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵、氯化六甲双铵、苯扎氯铵、苄索氯铵、苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酯或丙酯、邻苯二酚、间苯二酚、环己醇、3-戊醇、间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖类，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；形成盐的抗衡离子，如钠；金属络合物(例如Zn蛋白络合物)；和/或非离子表面活性剂，如聚乙二醇(PEG)。本文的示例性药学上可接受的载体还包括间质药物分散剂，例如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸蛋白酶糖蛋白，例如rHuPH20(BaxterInternational股份有限公司)。美国专利公开号2005/0260186和2006/0104968中描述了某些示例性sHASEGP和使用方法，包括rHuPH20。在一个方面，sHASEGP与一种或多种额外的糖胺聚糖酶如软骨素酶结合。
在一些实施方案中，特别是涉及肽和多肽活性剂(例如抗体、抑制性肽和免疫粘附素)时，活性剂和任选的药学上可接受的载体为冻干制剂或水溶液的形式。美国专利第6267958号中描述了示例性冻干抗体制剂。水性抗体制剂包括美国专利第6171586号和WO2006/044908中描述的那些水性抗体制剂，后者的制剂包括组氨酸醋酸盐缓冲液。
本文的组合物和制剂还可以根据所治疗的特定适应症的需要含有其他活性成分，优选那些具有互补活性且不会对彼此产生不利影响的活性成分。此类活性成分以有效达到预期目的的量的适当组合存在。
活性成分可以包埋在微胶囊中，例如通过凝聚技术或界面聚合制备，例如羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊，分别包埋在胶体药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)或大乳液中。这些技术公开于Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.(1980)。
可以制备缓释制剂。缓释制剂的合适实例包括含有抗体的固体疏水聚合物的半渗透性基质，这些基质呈成形制品的形式，例如薄膜或微胶囊。用于体内施用的制剂通常是无菌的。无菌可以很容易地实现，例如通过无菌过滤膜过滤。
根据所治疗的具体情况，制剂可以全身或局部施用。例如，合适的途径可以包括例如口服、直肠、经粘膜或肠道施用；胃肠外施用，包括肌肉内、皮下、髓内注射，以及鞘内、直接脑室内、静脉内、腹腔内、鼻内或眼内注射。配方和施用技术可见于“Remington'sPharmaceutical Sciences,”Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,latest edition。
4.治疗用途
本发明公开了PI3K抑制剂和ICM-结合拮抗剂(本文中也称为“治疗组合”或“组合治疗”)可用于治疗患有癌症的个体中的T细胞功能障碍性病症，或用于增强免疫功能(例如免疫效应器功能、T细胞功能等)，用于治疗或延迟癌症的进展，或用于治疗个体中的感染。在具体实施方案中，公开了用于治疗或延迟癌症(包括转移性癌症)的进展以及用于预防癌症复发的治疗组合。在这方面可以使用本领域已知或本文所述的任何PI3K抑制剂和ICM结合拮抗剂。
在一些实施方案中，联合治疗还包括使用或施用辅助剂(例如化疗剂)，如本文所述。
适当地，用联合疗法治疗的个体包括具有间充质表型的T细胞(例如CD8+T细胞)，例如，在同一T细胞中表达CSV、EGRF和ABCB5、SoX9、SNAIL和AKT1的T细胞，和/或其水平高于活化的T细胞。T细胞可以是肿瘤浸润淋巴细胞或循环淋巴细胞。T细胞适当地表现出T细胞耗竭或无能，在这种类型的代表性实例中，T细胞表达的EOMES水平高于TBET和/或PD-1表达升高。在一些实施方案中，T细胞的免疫功能受损或受到抑制，并适当表达T细胞活化减少的生物标志物(例如，细胞因子如IL-2、IFN-γ和TNF的产生和/或分泌减少)。因此，TBET、PD1和EOMES(本文也称为“T细胞功能生物标志物”)可用于确定患者T细胞的免疫功能，以评估患者的T细胞免疫状态，包括对ICM结合拮抗剂治疗的敏感性。
在一些实施方案中，个体是人类。
在一些实施方案中，在用ICM结合拮抗剂和PI3K抑制剂联合治疗之前，个体已经用ICM结合拮抗剂治疗。
在一些实施方案中，个体患有对一种或多种ICM-结合拮抗剂具有耐药性(已被证明具有耐药性)的癌症。在一些实施方案中，对ICM-结合拮抗剂的耐药性包括癌症或难治性癌症的复发。复发可能是指癌症在治疗后在原发部位或新发部位再次出现。在一些实施方案中，对ICM-结合拮抗剂的耐药性包括在用ICM-结合阻断剂治疗期间癌症进展。在一些实施方案中，对ICM-结合拮抗剂的耐药性包括癌症对治疗没有反应。癌症可能在治疗开始时具有耐药性，也可能在治疗过程中变得具有耐药性。在一些实施方案中，癌症处于早期或晚期。
在任何方法、测定和/或试剂盒的一些实施方案中，使用选自FACS、Western blot、ELISA、免疫沉淀、免疫组织化学、免疫荧光、放射免疫测定、斑点印迹、免疫检测方法、HPLC、表面等离子体共振、分光法、质谱、HPLC、qPCR、RT-qPCR、多重qPCR或RT-qPCR、RNA-seq、微阵列分析、SAGE、MassARRAY技术和FISH及其组合的方法在样本中检测任何一种或多种T细胞功能生物标志物。
在任何方法、测定和/或试剂盒的一些实施方案中，通过蛋白质表达在样本中检测任何一种或多种T细胞功能生物标志物。在一些实施方案中，通过免疫组织化学(IHC)确定蛋白质表达。在一些实施方案中，使用特异性结合相应生物标志物的抗体检测任何一种或多种T细胞功能生物标志物。
在一些实施方案中，本发明的联合治疗包括施用PI3K抑制剂和ICM结合拮抗剂。PI3K抑制剂和ICM结合拮抗剂可以以本领域已知的任何合适的方式施用。例如，PI3K抑制剂与ICM结合阻断剂可以顺序(在不同时间)或同时(同时)施用。在一些实施方案中，PI3K抑制剂作为ICM结合拮抗剂存在于单独的组合物中。在一些实施方案中，PI3K抑制剂与ICM结合拮抗剂在相同的组合物中。因此，联合治疗可能涉及单独、同时或顺序地与ICM结合拮抗剂一起施用PI3K抑制剂。在一些实施方案中，这可以通过施用包含两种类型试剂的单一组合物或药理学制剂来实现，或者通过同时施用两种单独的组合物或制剂来实现。其中一种组合物包含PI3K抑制剂，另一种组合物包含ICM结合拮抗剂。在其他实施方案中，用PI3K抑制剂治疗可以在用ICM结合拮抗剂治疗之前或之后，间隔从几分钟到几天不等。在PI3K抑制剂与ICM结合拮抗剂分别施用的实施方案中，通常会确保在每次递送之间的很长一段时间内没有过期，这样PI3K抑制剂仍然能够如上所述对功能受抑制的T细胞(例如间充质T细胞)产生有利影响，特别是使T细胞具有增强的免疫功能，包括T细胞对ICM结合阻断剂重新激活的敏感性。在这种情况下，可以预期的是，两种模式将在彼此相距约1-12小时内施用，更合适的是，相距约2-6小时。然而，在某些情况下，可能需要显著延长治疗时间，其中在各次施用之间相隔数小时(2、3、4、5、6或7)至数天(1、2、3，4、5，6、7或8)。
可以想象，需要多次施用PI3K抑制剂或ICM结合拮抗剂。可以采用各种组合，其中PI3K抑制剂为“A”，ICM结合拮抗剂为“B”，如下所示：
A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B B/A/A A/B/B B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/BA/B/B/A B/B/A/A B/A/B/A B/A/A/B B/B/B/A A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/AA/B/B/BB/A/B/B B/B/A/B。
PI3K抑制剂和ICM结合拮抗剂可以通过相同的施用途径或不同的施用途径施用。在一些实施方案中，ICM结合拮抗剂通过静脉内、肌肉内、皮下、局部、口服、经皮、腹膜内、眶内、植入、吸入、鞘内、心室内或鼻内施用。在一些实施方案中，PI3K抑制剂通过静脉内、肌肉内、皮下、局部、口服、经皮、腹膜内、眶内、植入、吸入、鞘内、心室内或鼻内施用。可以施用有效量的PI3K抑制剂和ICM结合拮抗剂来预防或治疗疾病。PI3K抑制剂和ICM结合拮抗剂的适当剂量可根据待治疗的疾病类型、PI3K抑制剂及ICM结合阻断剂的类型、疾病的严重程度和病程、个体的临床状况、个体的病史和对治疗的反应以及主治医生的判断来确定。在一些实施方案中，用PI3K抑制剂(例如GDC-0084)和ICM结合拮抗剂(例如抗PD-1抗体)的联合治疗是协同的，由此相对于作为单一药物的ICM结合阻断剂(例如，抗PD-1抗体)的有效剂量，联合治疗中ICM结合拮抗剂(例如，抗PD-1抗体)的有效剂量减少。
作为一般建议，无论是通过一次或多次施用，施用于人类的肽或多肽活性剂(例如抗体、肽抑制剂、免疫粘附素等)的治疗有效量都在约0.01至约50mg/kg患者体重的范围内。在一些实施方案中，所使用的抗体以例如约0.01至约45mg/kg、约0.01至约40mg/kg、约0.01mg/kg至约35mg/kg、约0.01mg/kg至约30mg/kg、约0.01％至约25mg/kg、约0.01mg/kg至约20mg/kg、约0.01mg/kg至约15mg/kg、约0.01mg/kg至约10mg/kg、约0.01g/kg至约5mg/kg或约0.01mg/kg至约1mg/kg每日施用。在一些实施方案中，肽或多肽活性剂(例如抗体、肽抑制剂、免疫粘附素等)以15mg/kg的剂量施用。然而，其他剂量方案也可能有用。在一个实施方案中，在21天周期的第1天，以约100mg、约200mg、约300mg、约400mg、约500mg、约600mg、约700mg、约800mg、约900mg、约1000mg、约1100mg、约1200mg、约1300mg或约1400mg的剂量向人施用本文所述的抗PDL1抗体。该剂量可以单剂量或多剂量(例如2或3剂量)施用，如输注。与单一治疗相比，联合治疗中施用的肽或多肽活性剂(例如抗体、肽抑制剂、免疫粘附素等)的剂量可能会减少。这种疗法的进展很容易通过常规技术进行监测。
小分子化合物通常以每天约0.0001mg/kg至约1000mg/kg的初始剂量施用。可以使用约0.01mg/kg至约500mg/kg，或约0.1mg/kg至约200mg/kg，或约1mg/kg至约100mg/kg，或约10mg/kg至约50mg/kg的日剂量范围。然而，剂量可能因患者的要求、所治疗疾病的严重程度和所使用的化合物而异。
在任何情况下，考虑到特定患者诊断的疾病类型和阶段，都可以根据经验确定剂量。在本发明的背景下，施用于患者的剂量应足以随着时间的推移在患者体内产生有益的治疗反应。剂量的大小也将由向特定患者施用特定化合物时出现的任何不良副作用的存在、性质和程度决定。确定特定情况下的适当剂量是从业者的技能范围。通常，治疗以小于化合物最佳剂量的较小剂量开始。此后，剂量以小的增量增加，直到在特定情况下达到最佳效果。为了方便起见，如果需要，总日剂量可以在白天分次并按份施用。剂量可以每天施用，也可以由主治医生决定隔日施用。剂量也可以在更长的时间内(几周、几个月或几年)定期或连续施用，例如通过使用皮下胶囊、小袋或储库，或通过贴片或泵。在一些实施方案中，PI3K抑制剂、ICM结合拮抗剂和任选地辅助剂(例如化疗剂)按常规时间表施用。或者，当症状出现时，可以施用联合治疗。
本文使用的“例行时间表”是指预定的指定时间段。例程时间表可以包括长度相同或不同的时间段，只要时间表是预先确定的。例如，常规计划可能涉及每天、每两天、每三天、每四天、每五天、每六天、每周、每月或其间的任何设定天数或周数、每两个月、三个月、四个月、五个月、六个月、七个月、八个月、九个月、十个月、十一个月、十二个月等施用PI3K抑制剂、ICM结合拮抗剂和任选的辅助剂。或者，预定的例行时间表可能涉及在第一周每天同时施用PI3K抑制剂、ICM结合拮抗剂和任选的辅助剂，然后每月施用，进行几个月，然后每三个月施用一次。只要提前确定适当的时间表涉及某一天的施用，任何特定的组合都将被纳入例行时间表。
在一些实施方案中，治疗方法和用途还可以包括额外的治疗。额外的治疗可以是放射治疗、手术(例如乳房肿瘤切除术和乳房切除术)、化疗、基因治疗、DNA治疗、病毒治疗、RNA治疗、免疫治疗、骨髓移植、纳米治疗、单克隆抗体治疗或上述治疗的组合。在一些实施例中，附加治疗是放射治疗。在一些实施例中，额外的治疗是手术。在一些实施方案中，额外的治疗是放射治疗和手术的组合。在一些实施方案中，额外的治疗是伽马辐射。
本文所述的任何方法(例如，联合治疗，包括施用有效量的PI3K抑制剂、ICM-结合拮抗剂和任选地辅助剂的组合)的功效可在本领域已知的各种模型中进行测试，如临床或临床前模型。本文举例说明了合适的临床前模型，其进一步可包括但不限于ID8卵巢癌、GEM模型、B16黑色素瘤、RENCA肾细胞癌、CT26结直肠癌、MC38结直肠癌和克劳德曼黑色素瘤癌症模型。
本文所述的任何方法(例如，包括施用有效量的PI3K抑制剂、ICM-结合拮抗剂和任选地辅助剂的组合的组合治疗)的功效可以在发展肿瘤的GEM模型中测试，包括但不限于非小细胞肺癌、胰管腺癌或黑色素瘤的GEM模型。例如，如Jackson等人，2001Genes Dev.15(24):3243-8)(描述了KrasG12D)和Lee等人(2012Dis.Model Mech.5(3):397-402)(FRT介导的p53null等位基因)中所述，在腺病毒重组酶处理后，在p53null背景中表达KrasG12D的小鼠可被用作非小细胞肺癌的临床前模型。作为另一个实例，如Jackson等人(2001,supra)(描述了KrasG12D)和Aguirre等人(2003Genes Dev.17(24):3112-26)(p16/p19null等位基因)所述，在p16/p19null背景下表达KrasG12D的小鼠可以用作胰管腺癌(PDAC)的临床前模型。作为另一个实例，如Dankort等人(2007Genes Dev.21(4):379-84)(描述了Braf.sup.V600E)和Trotman等人(2003PLoS Biol.1(3):E59)(PTENnull等位基因)所述，在诱导型(例如4-OHT处理)重组酶处理后，在黑素细胞特异性PTENnull背景中具有表达BrafV600E的黑素细胞的小鼠可以用作黑色素瘤的临床前模型。对于这些示例性模型中的任何一种，在发生肿瘤后，将小鼠随机招募到接受PI3K抑制剂、ICM结合拮抗剂和任选地辅助剂治疗或对照治疗的治疗组中。在治疗过程中测量肿瘤大小(如肿瘤体积)，并监测总体存活率。
在本公开的方法的一些实施方案中，癌症(在一些实施方案中，使用诊断测试检查的患者癌症的样本，例如本文实施例所述)包括肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)，其中TIL在癌症组织内或以其他方式与之相关。在这些实施方案中，评估TIL是否表达本文公开的任何一种或多种T细胞功能生物标志物。例如，TBET、PD-1和EOMES可用作T细胞耗竭的生物标志物，其特征是例如高水平的抑制性共受体和缺乏产生效应细胞因子的能力(Wherry,E.J.2011Nature Immunology 12:492-499；Rabinovich等人，2007Annual ReviewofImmunology 25:267-296)。
在本公开方法的一些实施方案中，个体具有T细胞功能障碍，表现为T细胞功能障碍性疾病。T细胞功能障碍的特征可能是T细胞无能或分泌细胞因子、增殖或执行细胞溶解活性的能力降低。在本公开的方法的一些实施方案中，T细胞功能障碍性疾病的特征是T细胞免疫功能受到抑制。在本公开方法的一些实施方案中，T细胞功能障碍性疾病的特征是间充质表型的T细胞。在本公开方法的一些实施方案中，T细胞功能障碍性疾病的特征是T细胞耗竭。在本公开方法的一些实施方案中，T细胞是CD4+和/或CD8+T细胞。根据本发明，PI3K抑制剂治疗可增加T细胞激活和效应器能力的生物标志物(例如，IL-2、IFN-γ和TNF)的表达，减少T细胞效应器抑制和癌症进展的生物标志物(例如，ZEBl)的表达、减少T细胞衰竭的生物标志物(例如，PD-1和EOMES)的表达和/或增加转录因子TBET的表达，这增加了适应性和先天免疫系统细胞中IFN-γ的产生。值得注意的是，PI3K抑制剂治疗可能会增强耗竭T细胞对ICM结合拮抗剂重新激活的敏感性。因此，与施用组合之前相比，联合治疗PI3K抑制剂和ICM结合拮抗剂可以增加T细胞(例如CD4+T细胞、CD8+T细胞、记忆T细胞)的启动、激活和/或增殖。在一些实施方案中，T细胞是CD4+和/或CD8+T细胞。
在本公开的方法的一些实施方案中，与施用组合γ之前相比，个体中活化的CD4+和/或CD8+T细胞的特征在于是产生IFN-γ的CD4+和/或CD8+T细胞和/或增强细胞溶解活性。IFN-γ可以通过本领域已知的任何方法进行测量，包括例如细胞内细胞因子染色(ICS)，涉及细胞固定、渗透和用抗IFN-γ抗体染色。细胞溶解活性可以通过本领域已知的任何方法进行测量，例如使用混合效应细胞和靶细胞的细胞杀伤试验。
在一些实施方案中，CD8+T细胞的特征在于，例如，存在CD8b表达(例如，通过RT-PCR，例如，使用Fluidigm)(CD8b也称为T细胞表面糖蛋白CD8β链；CD8抗原，α多肽p3'7；登录号为NM_172213)。在一些实施方案中，CD8+T细胞来自外周血。在一些实施方案中，CD8+T细胞来自肿瘤。
在一些实施方案中，Treg细胞的特征在于，例如，存在Fox3p的表达(例如，通过RT-PCR，例如，使用Fluidigm)(Foxp3也称为叉头蛋白P3；scurfin；FOXP3delta7；免疫缺陷、多内分泌疾病、肠病、X连锁；登录号为NM_014009)。在一些实施方案中，Treg来自外周血。在一些实施方案中，Treg细胞来自肿瘤。
在一些实施方案中，炎性或活化的T细胞的特征在于，例如，TBET和/或CXCR3表达的存在，或与炎性或激活的T细胞相关的TBET:EOMES比率(例如，通过RT-PCR，例如，使用Fluidigm)。在一些实施方案中，炎性或激活的T细胞来自外周血。在一些实施方案中，炎性或激活的T细胞来自肿瘤。
在本公开方法的一些实施方案中，CD4+和/或CD8+T细胞表现出选自IFN-γ、TNF和白细胞介素如IL-2的细胞因子释放的增加。细胞因子释放可以通过本领域已知的任何方法进行测量，例如使用Westblot、ELISA或免疫组织化学测定来检测含有CD4+和/或CD8+T细胞的样本中释放的细胞因子的存在。
在本公开的方法的一些实施方案中，CD4+和/或CD8+T细胞是效应记忆T细胞。在本公开方法的一些实施方案中，CD4+和/或CD8+效应记忆T细胞的特征在于具有CD44高CD62L低的表达。CD44高CD62L低的表达可通过本领域已知的任何手段检测，例如，通过制备组织(例如癌症组织)的单细胞悬浮液，并使用针对CD44和CD62L的商业抗体进行表面染色和流式细胞术。在本公开的方法的一些实施方案中，CD4+和/或CD8+效应记忆T细胞的特征在于具有CXCR3(也称为C-X-C趋化因子受体3型、Mig受体、IPIO受体、G蛋白偶联受体9、干扰素诱导蛋白10受体，登录号NM_001504)的表达。在一些实施方案中，CD4+和/或CD8+效应记忆T细胞来自外周血。在一些实施方案中，CD4+和/或CD8+效应记忆T细胞来自肿瘤。
在本公开方法的一些实施方案中，与联合疗法施用前相比，向个体施用有效量的PI3K抑制剂和ICM结合拮抗剂以及任选地辅助剂的特征在于CD8+T细胞上的炎症标志物(例如CXCR3)水平升高。CXCR3/CD8+T细胞可以通过本领域已知的任何方法进行测量。在一些实施方案中，CXCR3/CD8～+T细胞来自外周血。在一些实施方案中，CXCR3/CD8+T细胞来自肿瘤。
在本发明方法的一些实施方案中，与施用组合之前相比，Treg功能受到抑制。在一些实施方案中，与施用组合之前相比，T细胞耗竭减少。
在一些实施方案中，与施用组合之前相比，Treg的数量减少。在一些实施方案中，与施用组合之前相比，血浆IFN-γ水平升高。Treg数可以通过例如确定CD4+Fox3p+CD45+细胞的百分比(例如通过FACS分析)来评估。在一些实施方案中，确定例如样本中Treg的绝对数量。在一些实施方案中，Treg来自外周血。在一些实施方案中，Treg来自肿瘤。
在一些实施方案中，与施用组合之前相比，T细胞启动、激活和/或增殖增加。在一些实施方案中，T细胞是CD4+和/或CD8+T细胞。在一些实施方案中，通过测定Ki67+CD8+T细胞的百分比(例如，通过FACS分析)来检测T细胞增殖。在一些实施方案中，通过测定Ki67+CD4+T细胞的百分比(例如，通过FACS分析)来检测T细胞增殖。在一些实施方案中，T细胞来自外周血。在一些实施方案中，T细胞来自肿瘤。
5.检测和诊断方法
根据本发明，PD-1、TBET和EOMES可以如本领域已知的那样用于评估T细胞耗竭。T细胞可以从含有T细胞的患者样本中获得，这些样本是适当选择的组织样本，如肿瘤和流体样本，如外周血。在一些实施方案中，在用治疗组合治疗之前获得样本。在一些实施方案中，组织样本是福尔马林固定和石蜡包埋的，存档的，新鲜的或冷冻的。在一些实施方案中，样本是全血。在一些实施方案中，全血包括免疫细胞、循环肿瘤细胞及其任何组合。
生物标志物(例如TBET和EOMES中的任何一种或多种，本文统称为“T细胞功能生物标志物”)的存在和/或表达水平/量可以根据本领域已知的任何合适的标准进行定性和/或定量确定，包括但不限于DNA、mRNA、cDNA、蛋白质、蛋白质片段和/或基因拷贝数。在某些实施方案中，与第二样本中生物标志物的存在/不存在和/或表达水平/量相比(例如，在用治疗组合治疗之前)，第一样本中生物标志物的存在和/或者表达水平/数量增加或升高。在某些实施方案中，与第二样本中生物标志物的存在和/或表达水平/量相比，第一样本中生物标志物的存在/不存在和/或者表达水平/数量减少或降低。在某些实施方案中，第二样本是参考样本、参考细胞、参考组织、对照样本、对照细胞或对照组织。本文描述了用于确定基因存在/不存在和/或表达水平/量的其他公开内容。
在任何方法的一些实施方案中，与参考样本、参考细胞、参考组织、对照样本、对照细胞或对照组织相比，表达升高是指通过本文所述的标准技术已知方法检测到的生物标志物(例如蛋白质或核酸(例如基因或mRNA))水平总体增加约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高。在某些实施方案中，升高的表达是指样本中生物标志物的表达水平/量的增加，其中增加至少约为参考样本、参考细胞、参考组织、对照样本、对照细胞或对照组织中相应生物标志物表达水平/量的1.5倍、1.75倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、25倍、50倍、75倍或100倍。在一些实施方案中，与参考样本、参考细胞、参考组织、对照样本、对照细胞、对照组织或内部对照(例如，管家基因)相比，表达升高是指总体增加大于约1.5倍、约1.75倍、约2倍、约2.25倍、约2.5倍、约2.75倍、约3.0倍或约3.25倍。在任何方法的一些实施方案中，表达减少是指与参考样本、参考细胞、参考组织、对照样本、对照细胞或对照组织相比，通过本文所述的标准技术已知方法检测到的生物标志物(例如蛋白质或核酸(例如基因或mRNA))水平总体减少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高。在某些实施方案中，表达减少是指样本中生物标志物的表达水平/量的降低，其中降低为参考样本、参考细胞、参考组织、对照样本、对照细胞或对照组织中相应生物标志物表达水平/量的至少0.9倍、0.8倍、0.7倍、0.6倍、0.5倍、0.4倍、0.3倍、0.2倍、0.1倍、0.05倍或0.01倍。
样本中各种生物标志物的存在和/或表达水平/量可以通过多种方法进行分析，其中许多方法是本领域已知的，并且本领域技术人员可以理解，包括但不限于免疫组织化学(“IHC”)、Westernblot分析、免疫沉淀、分子结合分析、ELISA、ELIFA、荧光激活细胞分选(“FACS”)、MassARRAY、蛋白质组学、定量血液检测(如血清ELISA)、生化酶活性检测、原位杂交、Southern分析、Northern分析、全基因组测序、聚合酶链式反应(“PCR”)，包括定量实时PCR(“qRT-PCR”)和其他扩增型检测方法，例如，分支DNA、SISBA、TMA等)、RNA-Seq、FISH、微阵列分析、基因表达谱和/或基因表达系列分析(“SAGE”)，以及任何一种可以通过蛋白质、基因和/或组织阵列分析进行的广泛的分析。评估基因和基因产物状态的典型方案可见于Ausubel等人，eds.,1995,CurrentProtocols In MolecularBiology,Units2(NorthernBlotting),4(Southern Blotting),15(免疫印记)和18(PCR分析)。也可以使用多重免疫测定，如Rules Based Medicine或Meso Scale Discovery(“MSD”)中提供的那些。
在一些实施方案中，使用一种方法测定生物标志物的存在和/或表达水平/量，所述方法包括：(a)对样本(如受试者癌症样本)进行基因表达谱分析、PCR(如rtPCR或qRT-PCR)、RNA-seq、微阵列分析、SAGE、MassARRAY技术或FISH；和b)确定样本中生物标志物的存在和/或表达水平/量。在一些实施方案中，微阵列方法包括使用微阵列芯片，所述微阵列芯片具有一个或多个核酸分子，所述核酸分子可以在严格条件下与编码上述基因的核酸分子杂交，或者具有一种或多种多肽(如肽或抗体)，这些多肽可以与上述基因编码的一种或多种蛋白质结合。在一个实施方案中，PCR方法是qRT-PCR。在一个实施方案中，PCR方法是多重PCR。在一些实施方案中，通过微阵列测量基因表达。在一些实施方案中，通过qRT-PCR测量基因表达。在一些实施方案中，通过多重PCR测量表达。
评估细胞中mRNAs的方法是众所周知的，例如，包括使用互补DNA探针的杂交分析(如使用对一个或多个基因特异的标记核糖探针的原位杂交、Northern印迹和相关技术)和各种核酸扩增分析(如使用对一种或多种基因特异的互补引物的RT-PCR，以及其他扩增类型的检测方法，如分支DNA、SISBA、TMA等)。
哺乳动物样本可以使用Northern、斑点印迹或PCR分析方便地检测mRNA。此外，这些方法可以包括一个或多个步骤，允许确定生物样本中靶mRNA的水平(例如，通过同时检查“管家”基因(如肌动蛋白家族成员)的对比的对照mRNA序列的水平)。任选地，可以确定扩增的靶cDNA的序列。
任选方法包括通过微阵列技术检查或检测组织或细胞样本中的mRNA(如靶mRNA)的方案。使用核酸微阵列，对来自测试和对照组织样本的测试和对照mRNA样本进行逆转录和标记，以产生cDNA探针。然后将探针与固定在固体支持物上的核酸阵列杂交。阵列被配置为使得阵列的每个成员的顺序和位置是已知的。例如，其表达与抗血管生成治疗的增加或减少的临床益处相关的基因的选择可以排列在固体支持物上。标记探针与特定阵列成员的杂交表明，探针来自的样本表达该基因。
根据一些实施方案，通过观察上述基因的蛋白质表达水平来测量存在和/或表达水平/量。在某些实施方案中，所述方法包括在允许生物标志物结合的条件下，使生物样本与本文所述的生物标志物抗体(例如，抗PD-1抗体、抗PI3K抗体、抗TBET抗体、抗体、抗EOMES抗体)接触，并检测抗体和生物标志物之间是否形成复合物。这种方法可以是体外或体内方法。在一些实施方案中，使用一种或多种抗生物标志物抗体来选择有资格与PI3K抑制剂和ICM结合拮抗剂联合治疗的受试者。
在某些实施方案中，使用IHC和染色方案检查样本中生物标志物蛋白的存在和/或表达水平/量。组织切片的IHC染色已被证明是确定或检测样本中蛋白质存在的可靠方法。在一些实施方案中，来自个体的样本中T细胞功能生物标志物的表达是升高的蛋白质表达，在进一步的实施方案中使用IHC测定。在一个实施方案中，使用一种方法测定生物标志物的表达水平，所述方法包括：(a)用抗体对样本(例如受试者癌症样本)进行IHC分析；以及(b)确定样本中生物标志物的表达水平。在一些实施方案中，相对于参考来确定IHC染色强度。在一些实施方案中，参考是参考值。在一些实施方案中，参考是参考样本(例如，对照细胞系染色样本或来自非癌患者的组织样本)。
在一些实施方案中，在肿瘤或肿瘤样本上评估T细胞功能生物标志物的表达。如本文所使用的，肿瘤或肿瘤样本可以包括肿瘤细胞占据的部分或全部肿瘤区域。在一些实施方案中，肿瘤或肿瘤样本还可以包括由肿瘤相关的肿瘤内细胞和/或肿瘤相关的基质(例如，邻近的肿瘤周围促结缔组织增生基质)占据的肿瘤区域。肿瘤相关的瘤内细胞和/或肿瘤相关的基质可能包括紧邻和/或邻近主要肿瘤块的免疫浸润区域(例如，本文所述的肿瘤浸润免疫细胞)。在一些实施方案中，在肿瘤细胞上评估T细胞功能生物标志物的表达。在一些实施方案中，如上所述，在肿瘤区域内的免疫细胞(例如肿瘤浸润免疫细胞)上评估T细胞功能生物标志物的表达。
在替代方法中，样本可以在足以形成抗体-生物标志物复合物的条件下与对所述生物标志物特异性的抗体接触，然后检测所述复合物。生物标志物的存在可以通过多种方式检测，例如通过Westernblotting和ELISA程序来分析各种组织和样本，包括血浆或血清。使用这种测定格式的多种免疫测定技术是可用的，例如参见序列号为4016043、4424279和4018653的美国专利。这些包括非竞争性类型的单位点和双位点或“三明治”检测，以及传统的竞争性结合检测。这些测定还包括标记抗体与靶生物标志物的直接结合。
组织或细胞样本中选定的T细胞功能生物标志物的存在和/或表达水平/量也可以通过功能或基于活性的测定来检查。例如，如果生物标志物是酶(例如PI3K)，则可以进行本领域已知的测定(例如激酶测定)，以确定或检测组织或细胞样本中给定酶活性的存在。
在某些实施方案中，针对所测定的生物标志物的量的差异和所用样本质量的可变性以及测定运行之间的可变性将样本进行标准化。这种标准化可以通过检测和结合某些正常化生物标志物的表达来实现，包括众所周知的管家基因。
或者，标准化可以基于所有被测基因或其大部分子集的平均值或中值信号(全局标准化方法)。在逐个基因的基础上，将受试者肿瘤mRNA或蛋白质的测量标准化量与参考集的量进行比较。每个受试者每个受试肿瘤的每种mRNA或蛋白质的标准化表达水平可以表示为参考集测量的表达水平的百分比。在待分析的特定受试者样本中测量的存在和/或表达水平/量将落在该范围内的某个百分位数，这可以通过本领域熟知的方法来确定。
在一些实施方案中，样本是临床样本。在其他实施方案中，样本用于诊断测定。在一些实施方案中，样本从原发性或转移性肿瘤获得。组织活检通常用于获得具有代表性的肿瘤组织。或者，肿瘤细胞可以以已知或被认为含有目标肿瘤细胞的组织或液体的形式间接获得。例如，肺癌病变的样本可以通过切除、支气管镜检查、细针穿刺、支气管刷取或从痰、胸腔液或血液中获得。基因或基因产物可以从癌症或肿瘤组织或其他身体样本(如尿液、痰、血清或血浆)中检测到。上述用于检测癌样本中靶基因或基因产物的相同技术可以应用于其他身体样本。癌症细胞可能从癌症病变脱落，并出现在此类身体样本中。通过筛查这些身体样本，可以对这些癌症进行简单的早期诊断。此外，通过检测这些身体样本中的靶基因或基因产物，可以更容易地监测治疗的进展。
在某些实施方案中，参考样本、参考细胞、参考组织、对照样本、对照细胞或对照组织是来自同一受试者或个体的单个样本或组合的多个样本，这些样本是在与获得测试样本时不同的一个或多个时间点获得的。例如，与获得测试样本时相比，在更早的时间点从同一受试者或个体获得参考样本、参考细胞、参考组织、对照样本、对照细胞或对照组织。如果在癌症的初始诊断期间获得参考样本并且随后在癌症转移时获得测试样本，则这种参考样本、参考细胞、参考组织、对照样本、对照细胞或对照组织可能是有用的。
在某些实施方案中，参考样本、参考细胞、参考组织、对照样本、对照细胞或对照组织是来自一个或多个非受试者或个体的健康个体的多个样本的组合。在某些实施方案中，参考样本、参考细胞、参考组织、对照样本、对照细胞或对照组织是来自不是受试者或个体的患有疾病或病症(例如癌症)的一个或多个个体的多个样本的组合。在某些实施方案中，参考样本、参考细胞、参考组织、对照样本、对照细胞或对照组织是来自一个或多个非受试者或个体的正常组织的混合RNA样本或混合血浆或血清样本。在某些实施方案中，参考样本、参考细胞、参考组织、对照样本、对照细胞或对照组织是来自不是受试者或个体的患有疾病或病症(例如癌症)的一个或多个个体的肿瘤组织的合并RNA样本或混合血浆或血清样本。
在一些实施方案中，样本是来自个体的组织样本。在一些实施方案中，组织样本是肿瘤组织样本(例如，活检组织)。在一些实施方案中，组织样本是肺组织。在一些实施方案中，组织样本是肾组织。在一些实施方案中，组织样本是皮肤组织。在一些实施方案中，组织样本是胰腺组织。在一些实施方案中，组织样本是胃组织。在一些实施方案中，组织样本是膀胱组织。在一些实施方案中，组织样本是食管组织。在一些实施方案中，组织样本是间皮组织。在一些实施方案中，组织样本是乳腺组织。在一些实施方案中，组织样本是甲状腺组织。在一些实施方案中，组织样本是结直肠组织。在一些实施方案中，组织样本是头颈部组织。在一些实施方案中，组织样本是骨肉瘤组织。在一些实施方案中，组织样本是前列腺组织。在一些实施方案中，组织样本是卵巢组织、HCC(肝脏)、血细胞、淋巴结和/或骨/骨髓组织。在一些实施方案中，组织样本是结肠组织。在一些实施方案中，组织样本是子宫内膜组织。在一些实施方案中，组织样本是脑组织(例如，胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤等)。
在一些实施方案中，肿瘤组织样本(术语“肿瘤样本”在本文中可互换使用)可以包括肿瘤细胞占据的部分或全部肿瘤区域。在一些实施方案中，肿瘤或肿瘤样本还可以包括由肿瘤相关的肿瘤内细胞和/或肿瘤相关的基质(例如，邻近的肿瘤周围促结缔组织增生基质)占据的肿瘤区域。肿瘤相关的瘤内细胞和/或肿瘤相关的基质可能包括紧邻和/或邻近主要肿瘤块的免疫浸润区域(例如，本文所述的肿瘤浸润免疫细胞)。
在一些实施方案中，肿瘤细胞染色以示出了任何强度的膜染色的全部肿瘤细胞的百分比表示。浸润性免疫细胞染色可以以显示任何强度染色的免疫细胞占总肿瘤面积的百分比表示。肿瘤总面积包括恶性细胞和肿瘤相关基质，包括与主要肿瘤块直接相邻和邻接的免疫浸润区域。此外，浸润免疫细胞染色可以以所有肿瘤浸润免疫细胞的百分比表示。
在任何方法的一些实施方案中，疾病或障碍是肿瘤。在一些实施方案中，肿瘤是恶性癌性肿瘤(即癌症)。在一些实施方案中，肿瘤和/或癌症是实体瘤。
实体瘤包括除血液、骨髓或淋巴系统以外的任何身体组织癌症。实体瘤可进一步分为上皮细胞来源的实体瘤和非上皮细胞来源的实体瘤。上皮细胞实体瘤的实例包括胃肠道、结肠、结肠直肠(例如基底样结肠直肠癌)、乳腺、前列腺、肺、肾、肝、胰腺、卵巢(例如子宫内膜样卵巢癌)、头颈部、口腔、胃、十二指肠、小肠、大肠、肛门、胆囊、阴唇、鼻咽、皮肤、子宫、男性生殖器官、泌尿器官(例如尿道上皮癌、异型增生性尿路上皮癌(dysplasticurothelium carcinoma)和移行细胞癌)、膀胱和皮肤的肿瘤。非上皮来源的实体瘤包括肉瘤、脑肿瘤和骨肿瘤。在一些实施方案中，所述癌症是非小细胞肺癌(NSCLC)。在一些实施方案中，所述癌症是二线或三线局部晚期或转移性非小细胞肺癌。在一些实施方案中，所述癌症是腺癌。在一些实施方案中，癌症是鳞状细胞癌。在一些实施方案中，所述癌症是非小细胞肺癌(NSCLC)、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤、乳腺癌(例如，癌症三阴性乳腺癌)、胃癌、结直肠癌或肝细胞癌。在一些实施方案中，所述癌症是原发性肿瘤。在一些实施方案中，所述癌症是在第二位点的来源于任何上述类型的癌症的转移性肿瘤。
在任何方法的一些实施方案中，所述癌症显示人效应细胞(例如，被人效应细胞浸润)。检测人类效应细胞的方法在本领域中是众所周知的，包括例如通过IHC。在一些实施方案中，所述癌症表现出高水平的人类效应细胞。在一些实施方案中，人效应细胞是NK细胞、巨噬细胞、单核细胞中的一种或多种。在一些实施方案中，所述癌症是本文所述的任何癌症。在一些实施方案中，所述癌症是非小细胞肺癌(NSCLC)、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤、乳腺癌(例如，三阴性乳腺癌)、胃癌、结直肠癌或肝细胞癌。
在任何方法的一些实施方案中，所述癌症显示表达FcR的细胞(例如，被表达FcR'的细胞浸润)。检测FcR的方法在本领域中是众所周知的，包括例如通过IHC。在一些实施方案中，癌症表现出高水平的表达FcR的细胞。在一些实施方案中，FcR是FcyR。在一些实施方案中，FcR正在激活FcyR。在一些实施方案中，癌症是非小细胞肺癌(NSCLC)、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤(neuroblastoma)、黑色素瘤、乳腺癌(例如，癌症三阴性乳腺癌)、癌症胃癌、癌症结直肠癌或肝细胞癌。
在一些实施方案中，使用选自FACS、Westernblot、ELISA、免疫沉淀、免疫组织化学、免疫荧光、放射免疫测定、斑点印迹、免疫检测方法、HPLC、表面等离子体共振、分光法、质谱、HPLC、qPCR、RT-qPCR、多重qPCR或RT-qPCR、RNA-seq、微阵列分析、SAGE、MassARRAY技术和FISH及其组合的方法在样本中检测T细胞功能生物标志物。在一些实施方案中，使用FACS分析检测T细胞功能生物标志物。在一些实施方案中，T细胞功能生物标志物是PD-1。在一些实施方案中，在血液样本中检测PD-1表达。在一些实施方案中，在血液样本中的循环免疫细胞上检测PD-1表达。在一些实施方案中，循环免疫细胞是CD3+/CD8+T细胞。在一些实施方案中，在分析之前，从血液样本中分离免疫细胞。可以使用分离/富集这种细胞群的任何合适的方法，包括但不限于细胞分选。在一些实施方案中，来自对PI3K抑制剂和/或ICM结合拮抗剂(如抗PD-1抗体)治疗有反应的个体的样本中的PD-1表达降低。在一些实施方案中，血液样本中循环免疫细胞(如CD3+/CD8+T细胞)上的PD-1表达升高。
本文还提供了监测ICM结合拮抗剂治疗的药效活性的方法，该方法通过测量一种或多种如本文所述的T细胞功能生物标志物在包含从受试者获得的白细胞的样本中的表达水平，其中受试者已用ICM结合拮抗剂和PI3K抑制剂治疗，并且其中一种或多种T细胞功能生物学标志物选自TBET、PD-1和EOMES，并基于与参考相比从受试者获得的样本中一种或几种T细胞功能生物医学标志物的表达水平确定治疗显示药效活性，其中与参考相比，一种或多种T细胞功能生化标志物表达水平的增加表明对PD-1拮抗剂治疗具有药效活性。这些方法还可以包括测量T细胞功能和/或细胞组成的一种或多种额外生物标志物的表达水平(例如，Treg的百分比和/或Treg的绝对数量；例如，CD8+效应T细胞的数量)，其中T细胞功能的额外生物标志物包括细胞因子，例如IFN-γ、T细胞标志物或记忆T细胞标记(例如，T效应记忆细胞的标志物)；并且基于与参考相比，从受试者获得的样本中一种或多种T细胞功能生物标志物、一种或多种额外的T细胞功能生物标志物和/或细胞组成的表达水平，确定治疗显示药效活性，其中与参考相比，一种或多种T细胞功能生物学标志物、一种或多种额外的T细胞功能生物标志物和/或细胞组成的表达水平增加表明对PD-1拮抗剂治疗的药效活性。生物标志物和/或细胞组成的表达水平可以通过本文所述的一种或多种方法进行测量。
如本文所使用的，“药效学(PD)活性”可以指治疗(例如，PI3K抑制剂与ICM结合拮抗剂治疗的组合)对受试者的影响。PD活性的一个实例可以包括调节一个或多个基因的表达水平。不希望受理论束缚，据认为，在检查PI3K抑制剂和ICM结合拮抗剂的临床试验中，监测PD活性，例如通过测量一种或多种T细胞功能生物标志物的表达，可能是有利的。例如，监测PD活性可用于监测对治疗的反应、毒性等。
在一些实施方案中，可以将一个或多个标记基因、蛋白质和/或细胞组成的表达水平与参考进行比较，所述参考可以包括来自未接受治疗(例如，PI3K抑制剂治疗与ICM结合拮抗剂的组合)的受试者的样本。在一些实施方案中，参考可以包括来自同一受试者的在接受治疗(例如，PI3K抑制剂治疗与ICM结合拮抗剂的组合)之前的样本。在一些实施方案中，参考可以包括来自接受治疗(例如，PI3K抑制剂治疗与ICM结合拮抗剂的组合)的其他受试者的一个或多个样本的参考值。例如，可以治疗一组患者，并从整个患者群体中生成一个或多个基因表达水平的平均值、均值或中值。从具有共同特征的癌症(例如，相同的癌症类型和/或阶段，或暴露于共同的治疗，如PI3K抑制剂与ICM-结合拮抗剂的联合治疗)获得的一组样本可以从人群中进行研究，例如临床结果研究。所述集合可用于推导参考值，例如参考数值，受试者的样本可以与之进行比较。本文所述的任何参考值都可以用作监测PD活动的参考。
本公开的某些方面涉及样本中一种或多种生物标志物(例如，包括mRNA和蛋白质的基因表达产物)的表达水平的测量。在一些实施方案中，样本可以包括白细胞。在一些实施方案中，样本可以是外周血样本(例如，来自患有肿瘤的患者)。在一些实施方案中，样本是肿瘤样本。肿瘤样本可包括癌症细胞、淋巴细胞、白细胞、间质、血管、结缔组织、基底层和与肿瘤相关的任何其他细胞类型。在一些实施方案中，样本是含有肿瘤浸润白细胞的肿瘤组织样本。在一些实施方案中，可以处理样本以分离(separate)或分离(isolate)一种或多种细胞类型(例如白细胞)。在一些实施方案中，样本可以在不分离或分离细胞类型的情况下使用。
肿瘤样本可以通过本领域已知的任何方法从受试者身上获得，包括但不限于活检、内窥镜或外科手术。在一些实施方案中，肿瘤样本可以通过冷冻、固定(例如，通过使用福尔马林或类似的固定剂)和/或包埋在石蜡中等方法制备。在一些实施方案中，可以对肿瘤样本进行切片。在一些实施方案中，可以使用新鲜的肿瘤样本(即，尚未通过上述方法制备的样本)。在一些实施方案中，可以通过在溶液中孵育来制备肿瘤样本，以保持mRNA和/或蛋白质的完整性。
在一些实施方案中，样本可以是外周血样本。外周血样本可以包括白细胞、PBMC等。可以使用本领域已知的从外周血样本中分离白细胞的任何技术。例如，可以抽取血液样本，溶解红细胞，分离白细胞颗粒并用做样本。在另一个实例中，密度梯度分离可用于从红细胞中分离白细胞(如PBMC)。在一些实施方案中，可以使用新鲜的外周血样本(即，尚未通过上述方法制备的样本)。在一些实施方案中，可以通过在溶液中孵育来制备外周血样本，以保持mRNA和/或蛋白质的完整性。
在一些实施方案中，对治疗的反应性可以指以下中的任何一个或多个：延长生存期(包括总生存期和无进展生存期)；导致客观反应(包括完全反应或部分反应)；或改善癌症的体征或症状。在一些实施方案中，反应性可指根据已公布的RECIST指南集用于确定癌症患者中肿瘤的状态的一个或多个因素的改善，即，缓解(responding)、稳定或进展。关于这些指南的更详细讨论，参见Eisenhauer等人，(2009Eur J Cancer45:228-47)，Topalian等人(2012N Engl J Med 366:2443-54)，Wolchok等人(2009Clin Can Res 15:7412-20)和Therasse等人(2000J.Natl.Cancer Inst.92:205-16)。反应性受试者可指癌症表现出改善(例如，根据基于RECIST标准的一个或多个因素)的受试者。非反应性受试者可指癌症未表现出改善(例如，根据RECIST标准的一个和多个因素)的受试者。
常规反应标准可能不足以表征本发明治疗剂的抗肿瘤活性，这些治疗剂可能会产生延迟反应，而延迟反应之前可能会出现最初的明显影像学进展，包括新病变的出现。因此，已经制定了修改后的反应标准，该标准考虑了新病变的可能出现，并允许在后续评估中确认影像学进展。因此，在一些实施方案中，反应性可以指根据免疫相关反应标准(irRC)对一个或多个因素的改善。例如，参见Wolchok等人(2009，同上)。在一些实施方案中，新的病变被计入定义的肿瘤负荷中并随访，例如后续评估中确认影像学进展。在一些实施方案中，非靶病变的存在被包括在完全缓解的评估中，而不包括在影像学进展的评估中。在一些实施方案中，影像学进展可以仅基于可测量的疾病来确定，和/或可以通过自首次记录之日起≥4周的连续评估来确认。
在一些实施方案中，反应性可能包括免疫激活。在一些实施方案中，反应性可以包括治疗功效。在一些实施方案中，反应性可以包括免疫激活和治疗功效。
6.试剂盒
在本发明的其他方面，提供了包含PI3K抑制剂和ICM结合拮抗剂的治疗试剂盒。在一些实施方案中，所述治疗试剂盒还包括使用说明书，所述使用说明书包括指导材料，用于同时施用PI3K抑制剂和ICM-结合拮抗剂以治疗患有癌症的个体中的T细胞功能失调病症、或增强其免疫功能(例如免疫效应器功能、T细胞功能等)、或治疗或延迟癌症进展、或治疗个体中的感染。本文所述或本领域已知的PI3K抑制剂和ICM结合拮抗剂中的任何一种都可以包含在试剂盒中。
在一些实施方案中，PI3K抑制剂和ICM结合拮抗剂在同一容器或单独的容器中。合适的容器包括，例如，瓶子、小瓶、袋子和注射器。容器可由多种材料制成，如玻璃、塑料(如聚氯乙烯或聚烯烃)或金属合金(如不锈钢或哈氏合金)。在一些实施方案中，容器容纳制剂，容器上或与容器相关的标签可以指示使用说明。试剂盒还可以包括从商业和用户的角度来看所需的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针头、注射器和带有使用说明材料的包装插页。在一些实施方案中，试剂盒还包括一种或多种其他试剂(例如化疗剂和抗肿瘤剂)。用于一种或多种试剂的合适容器包括，例如，瓶子、小瓶、袋子和注射器。
在本发明的其他实施方案中，提供了用于确定生物标志物表达的诊断试剂盒，包括本文公开的T细胞功能生物标志物，其包括试剂，所述试剂允许检测和/或定量生物标志物。此类试剂包括，例如，化合物或材料，或化合物或材料组，它们允许对生物标志物进行定量。在具体实施方案中，化合物、材料或化合物或材料组允许确定基因(例如T细胞功能生物标志物基因)的表达水平，包括但不限于提取RNA材料、确定相应RNA的水平等、用于合成相应cDNA的引物、用于扩增DNA的引物和/或能够与基因编码的RNA(或相应cDNA)特异性杂交的探针、TaqMan探针、邻近分析探针(proximity assayprobe)、连接酶、抗体等。
试剂盒还可以任选地包括用于检测标签、阳性和阴性对照、洗涤溶液、印迹膜、微量滴定板、稀释缓冲液等的适当试剂。例如，基于核酸的检测试剂盒可以包括(i)T细胞功能生物标志物多核苷酸(其可以用作阳性对照)，(ii)与T细胞功能生物学标志物多核苷酸特异性杂交的引物或探针。还包括适用于扩增核酸的酶，包括各种聚合酶(逆转录酶、Tag、SequenaseTM、DNA连接酶等，具体取决于所采用的核酸扩增技术)、脱氧核苷酸和缓冲液，以提供扩增所需的反应混合物。此类试剂盒通常还将以适当的方式包括用于每种单独试剂和酶以及每种引物或探针的不同容器。或者，基于蛋白质的检测试剂盒可以包括(i)T细胞功能生物标志物多肽(可用作阳性对照)，(ii)特异性结合T细胞功能生物学标志物多肽的抗体。该试剂盒还可以具有用于进行本文所述的一种测定的各种装置(例如，一个或多个)和试剂(例如一种或多种)；和/或印刷指导材料，用于使用试剂盒定量T细胞功能生物标志物基因表达。本文所述的试剂，其可以任选地与可检测标记相关联，可以微流体卡、芯片或腔室、微阵列或试剂盒的形式呈现，适用于实施方案或下文所述的测定，例如本文描述的RT-PCR或Q PCR技术。
适用于包装诊断试剂盒组件的材料可能包括晶体、塑料(聚乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯等)、瓶子、小瓶、纸张、信封等。此外，本发明的试剂盒可以包含用于同时、顺序或单独使用试剂盒中包含的不同成分的指导材料。指导材料可以是印刷材料的形式，也可以是能够存储指令的电子支持的形式，以便受试者可以阅读，例如电子存储介质(磁盘、磁带等)、光学介质(CD-ROM、DVD)等。
作为替代或补充，介质可以包含提供指导材料的互联网地址。
为了使本发明易于理解并付诸实践，现在将通过以下非限制性实验示例描述特别优选的实施方案。
实施例
实施例1
PI3K表达与癌症存活率降低有关。
PI3KCA是细胞质/质膜PI3KCA/AKT/MTOR信号通路的一部分(Hassan等人，2013)。PI3KCA突变负荷通过AKT途径(在促进侵袭和转移中发挥作用)与癌症进展相关(Jiang等人，2020)。最近的研究表明，PI3KCA信号通路与癌症干细胞(CSC)和EMT有关(Chen等人，2020；Xia等人，2015)。PI3KCA通过磷酸化AKT(P)诱导PDL1表达和介导免疫逃避在免疫逃避中发挥作用(Yang等人，2017)。35％的乳腺癌患者患有突变阳性肿瘤(Fusco等人，2021)，在TNBC中，约6％的患者存在PI3KCA突变(Mosele等人，2020)。这并不能解释大多数患者的复发或免疫治疗耐受性。
发明人使用网络工具KM绘图仪(Lanczky和Gyorffy，2021)绘制了PI3K低和高蛋白表达的总体存活概率(图1)。该分析显示，在转移性乳腺癌和非小细胞肺癌患者队列中，PI3K高表达队列的存活率显著降低。该分析旨在证明PI3K富集与多种癌症类型的存活概率显著降低相关。
基于液体活检的分层检测患者液体活检中PI3K CSC和CD8 T细胞特征的富集以及 PI3K靶点CSC复发特征和耗竭T细胞特征。
发明人在来自IV期实体瘤队列(即黑色素瘤、NSCLC、RCC、HCC、乳腺癌、GBM)的患者液体活检中鉴定出双重CSC和T细胞特征。使用我们的新型液体活检平台，在IV期癌症患者中鉴定了一个新型的、富含PI3K的癌症干细胞、干细胞样间充质特征(图2)。这些CSC是癌症复发的关键细胞类型，不受化疗、免疫疗法或放疗(即常规癌症治疗)的靶向。然而，发明人假设这些患者会对本发明的单药治疗和/或联合治疗方法产生反应。这些CTC对间充质标志物、CSC标志物CSV和ABCB5呈阳性。
发明人还鉴定了一种富含检查点蛋白(TIM3、TIGIT、PD1)和耗竭标志物(TOX1、EOMES)的新型T细胞耗竭/功能失调特征。
分析显示，在GDC-0084处理的样本中，使用数字病理系统对CSV和ABCB5进行免疫荧光分析测量的总体表达强度显著降低(图3A)。相比之下，EpCAM是非间充质上皮细胞的标志物，其表达变化很小(图3A)。使用数字病理系统的群体动态分析显示，CSV和ABCB5阳性细胞群体减少了约56％，而EpCAM增加了38％(图3B)。GDC-0084对PI3KCA的抑制也抑制了AKT1阳性细胞的百分比(AKT1有助于间充质转移特征)以及AKT1的总体表达(AKT1是PI3KCA调节的关键肿瘤发生标志物)。这表明靶向PI3KCA还靶向转移、间充质转化和癌症干细胞特征(CSC)的关键调节。
来自IV期实体瘤癌症患者的基于液体活检的测定表明PI3K抑制抑制T细胞功能障 碍并诱导效应特征
使用发明人实验室的数字病理系统通过免疫荧光分析测量CD8+T细胞的总体表达强度。耗竭组显示GDC-0084显著抑制NS和ST样本中EOMES和PD1的表达(图4A)。免疫检查点抑制剂组显示，GDC-0084治疗对NS和ST CD8+T细胞中的TIM3均有显著抑制作用，而GDC-0084仅显著抑制NS CD8+T细胞的TIGIT(图4B)。图4C显示了效应器特征组，与图4A和4B相反，显示了NS和ST组GDC-0084处理的CD8+T细胞中穿孔素和GZNb的表达显著增加。
在具有富集的间充质CSC特征的癌症细胞系中PI3K富集。
使用ASI数字病理系统，根据标准化设置，进行全细胞强度分析。对乳腺癌细胞系中PI3KCA表达的分析(图5A)揭示了一种表达增加的模式，即细胞系从上皮特征转变为更具间充质、转移性和免疫疗法耐药的特征(MCF7是具有低CSC群的乳腺癌上皮细胞系，MDA-MB-231是具有>90％间充质CSC的TNBC细胞系，MDRA-MB-231-BR是MDA-MB-231具有>90％的间充质干细胞的脑转移性癌症克隆，最后4T1是具有>90％CSC的免疫疗法耐药、转移性高侵袭性的乳腺癌模型)。
有趣的是，H1299(上皮性肺癌)、CT26(IO反应性，上皮性结肠癌)和LLC(高度侵袭性，转移性肺癌模型)也出现了类似的模式(图5B)。H1299和CT26都是上皮样免疫原性细胞系，而LLC对免疫疗法具有高度耐药，并且具有攻击性。总体而言，这些数据表明，从全细胞表达的角度来看，PI3KCA在转移性、耐药的癌症细胞系中富集。这表明靶向PI3KCA对治疗转移性、耐药的癌症的重要性，这是一个重大的未解决的难题。
·MCF7上皮性乳腺癌细胞系；
·MDAMB231间充质/CSC乳腺癌细胞系；
·MDAMB231-Br脑癌版MDA-MB-231；
·4T1高侵袭性、IO耐药小鼠乳腺癌模型；
·H1299：上皮样肺癌细胞系；
·CT26：上皮样、高度免疫原性的小鼠结肠肿瘤细胞系；和
·LLC：具有高度耐药性的Lewis肺癌细胞系，对免疫疗法具有耐药性(Li等人，2021)。
PI3K抑制剂GDC-0084对MDA-MB-231和CT26细胞迁移和侵袭的影响。
有趣的是，在高达70％的乳腺癌脑转移患者中，PI3K/Akt/mTOR通路被激活。该通路的上调与更差的预后有关；然而，目前没有获批的药物可用于这些患者。GDC-0084是一种PI3K抑制剂，是一种脑渗透剂，在胶质母细胞瘤的临床前模型中显示出有前景的活性。GDC-0084在其IC25(1.25μM)和IC50(2.5μM)下抑制乳腺癌细胞迁移，IC25浓度对MDA-MB231细胞迁移具有更大的抑制作用(图6)。伤口愈合分析表明，经GDC-0084(PI3K抑制剂)处理后，CT26细胞迁移受到抑制。DMSO处理被用作对照。这些数据显示，与较低浓度(即0.2μM)相比，0.3μM的GDC-0084对伤口愈合的影响更显著(图6C)。这表明GDC-0084在较高浓度下能够抑制癌症细胞迁移。GDC-0084对响应性结肠癌细胞系CT26具有最大的抑制作用。发明人使用DMSO处理作为对照。
测定GDC-0084对不同癌症细胞系的IC50 。
数据清楚地显示了GDC-0084在不同细胞系中的EC50数据。CT26、4T1、MDA-MB-231和MDA-MB-231-Brm的个体剂量反应曲线如图7所示为MCF7。获得这些数据是为了证明与免疫疗法耐药或间充质癌症细胞系(4T1，MDA-MB-231细胞系)相比，GDC-0084在免疫疗法应答者或上皮癌症细胞系(CT26，MCF7)中靶向PI3KCA的功效。这些数据表明，GDC-0084靶向PI3K能够显著抑制上皮和间充质癌症细胞系的增殖。
PARP抑制对间充质、CSC特征的影响。
奥拉帕尼和维利帕尼是PARP抑制剂，已用于治疗某些类型的乳腺癌和卵巢癌。然而，奥拉帕尼不靶向癌干细胞(CSC)或间充质特征，也不影响ABCB5或ALDH1A(图8)。发明人接下来研究了奥拉帕尼和维利帕尼对间充质TNBC细胞系MDA-MB-231的CSC特征或增殖的影响，这两种药物都没有抑制CSC特征或增殖(图9)。接下来，为了进一步研究PARP单药治疗靶向的重要性，发明人研究了PARP的siRNA敲除(图10)对间充质、CSC特征的影响。经鉴定，PARP敲除对间充质、CSC特征的这些标志物没有抑制作用(图11)。PI3K通路抑制剂GDC-0084和PARP抑制剂奥拉帕尼的联合治疗限制了MDA-MB-231细胞的迁移(图17)。发明人证明GDC-0084和奥拉帕尼的组合抑制乳腺癌细胞迁移，组合“2”(即1.25μM GDC-0084+250nM奥拉帕尼)对MDA-MB-231迁移具有最大的抑制作用。这表明PARP抑制剂不是有效的单药治疗药物，但与PI3K抑制剂联合使用可能有益。
在结肠癌CT26模型和乳腺癌4T1模型中的αPD1疗法。
发明人试图证明，与4T1乳腺癌模型相比，αPD1单药治疗导致免疫疗法应答性CT26结肠癌模型中肿瘤体积显著减少(图12)。这些数据表明CT26是一种免疫治疗反应系，而4T1模型清楚地表明4T1是一种免疫治疗耐受模型，这通过其对αPD1免疫疗法的原发瘤负荷疗效得以证明。
PI3K抑制剂靶向并抑制间充质耐药标志物的表达
接下来，发明人证明，用GDC-0084治疗显著抑制了CSC/间充质标志物，诱导了上皮标志物EpCAM的表达，也增加了病毒模拟/免疫可见性标志物MDA5的表达(图13和14)。这表明，靶向PI3KCA还可以抑制转移和治疗耐受性特征，并使肿瘤更具免疫可见性，因此对与免疫疗法的联合治疗更有反应。
接下来，发明人对靶向PI3K的不同抑制剂进行了进一步的抑制分析，以确认靶向PI3K抑制间充质CSC特征的有效性。使用了两种不同的PI3K抑制剂(图15)，艾代拉里斯已被用于治疗某些血液癌症，如复发后的慢性淋巴细胞白血病，LY294002是一种PI3K的强抑制剂，目前正在复发或进展性HNSCC患者以及PI3KCA和/或PI3K通路基因突变的患者中进行试验。用两种PI3K抑制剂中的任何一种(图15)在两种不同的低剂量下治疗，可显著抑制CSC/干样癌症复发标志物CSV、SoX9、ABCB5和SNAIL。剂量为12.5μM的艾代拉里斯的效果最不显著。此外，全部25μm的艾代拉里斯和两种浓度的LY294002均诱导上皮标志物EpCAM的表达。该数据表明，用GDC-0084的替代抑制剂靶向PI3K在抑制间充质癌症干细胞特征和诱导上皮特征方面是有效的。
施用7.5mg/kg的GDC-0084可减少4T1同基因肿瘤模型中的临床异常。
接下来，发明人证明了使用7.5mg/kg的GDC-0084单药治疗减少了在4T1乳腺癌模型中观察到的临床异常。接受高剂量(即15mg/kg)的小鼠组出现了多例活动减少、驼背姿势和明显竖毛的情况(图16)。与15mg/kg相比，以7.5mg/kg施用GDC-0084可减少先前在较高剂量下观察到的临床异常。虽然用15mg/kg GDC-0084治疗的小鼠中有40％表现出活动减少、驼背姿势、竖毛和体重减轻，但7.5mg/kg治疗组没有出现临床异常。这些数据强调了较低剂量的毒性降低。
GDC-0084以7.5mg/kg的剂量施用可消除肿瘤负荷。
发明人接下来证明了“低剂量”GDC-0084治疗(7.5mg/kg)消除了4T1乳腺癌模型中的原发性肿瘤负荷(见图17)。在4T1乳腺癌模型中，以7.5mg/kg的GDC-0084单药治疗和与αPD1联合施用可显著减少肿瘤体积，最终肿瘤重量减少了50％以上。令人惊讶的是，在施用15mg/kg GDC-0084的小鼠中，施用或不施用αPD1，都没有观察到肿瘤负荷的显著减轻。
以7.5mg/kg的剂量施用GDC-0084可减少肿瘤炎症，包括单核细胞和中性粒细胞浸 润。
施用“低剂量”的GDC-0084(即7.5mg/kg)可减少肿瘤炎症，包括单核细胞和中性粒细胞浸润(图18)。以7.5mg/kg的GDC-0084单药治疗和与αPD1联合施用，可显著减少与4T1乳腺癌模型相关的肿瘤炎症。虽然对照组和αPD1治疗组的肿瘤炎症评分为“中度”和“重度”，但当以7.5mg/kg的剂量与GDC-0084联合施用时，只观察到轻度炎症。
此外，病理学家注意到，在施用7.5mg/kgGDC-0084的治疗组中，髓系细胞群(包括单核细胞和中性粒细胞)大幅减少。值得注意的是，在每天施用15mg/kg GDC-0084的小鼠中没有观察到炎症的显著减少。
在4T1同基因肿瘤模型中，以7.5mg/kg的剂量施用GDC-0084可减少脾肿大。
以7.5mg/kg施用GDC-0084可减少4T1乳腺癌模型中的脾肿大。与高剂量相比，低剂量GDC时的脾脏大小和外观正常(图19)。7.5mg/kg的GDC施用减少了通常与4T1乳腺癌模型相关的脾肿大。
虽然15mg/kg处理组和相应对照组的脾脏重量没有显著差异，但在较低剂量的GDC-0084(7.5mg/kg)下，无论是作为单药疗法还是与αPD1联合施用，都观察到脾肿大的显著减少。
以7.5mg/kg的剂量施用GDC-0084可降低SOX9和TOX1的表达。
两个实验中的联合治疗显著降低了SOX9(SOX9是间充质、治疗耐受癌症干细胞的标志物)的表达，然而，7.5mg/kg的GDC-0084在联合治疗中具有更显著的效果，并且作为单药治疗时，尤其降低。有趣的是，15mg/kg GDC-0084在CD8+T细胞中显示出诱导TOX1(TOX1是T细胞耗竭和功能障碍的标志物)，而7.5mg/kg时，CD8+T细胞的TOX1显著降低(图20)。这些数据表明，“高剂量”GDC-0084诱导了失调炎症，并增加了T细胞功能障碍(TOX1的更高表达)，并且不能控制SOX9，SOX9是癌症干细胞样间充质特征、转移和癌症复发的标志物。相反“低剂量”GDC-0084作为单药疗法或联合疗法显著抑制了SOX9+的表达，并显著降低了CD8+T细胞中TOX1的表达。值得注意的是，抗PD1和“低剂量”GDC-0084(7.5mg)的组合在消除TOX1表达方面效果最强(图20)。
PI3K单药抑制或联合抑制靶向间充质特征，并在IO抗药小鼠模型中诱导上皮表型。
GDC-0084和抗PD1的联合治疗显著抑制了PI3KCA、间充质标志物CSV和EGFR，并且这种联合治疗也能更好地诱导上皮标志物E-钙粘蛋白的表达(图21)。
GDC-0084单药疗法和包含GDC-0084和抗PD1的联合治疗均显著诱导了上皮标志物E-钙粘蛋白阳性的细胞群(见图22)。GDC-0084伴随或不伴随αPD1治疗对4T1同基因肿瘤模型中的小鼠体重没有影响(图17)。GDC-0084与αPD1的联合治疗显著抑制了肿瘤负荷，但高剂量单药则不能，而低剂量单药能够抑制肿瘤负荷(图17)。值得注意的是，这种组合也适用于4T1免疫治疗耐受肿瘤模型。GDC-0084和抗PD1抑制剂联合治疗显著抑制PI3KCA和癌症干细胞样间充质标志物CSV和EGFR，诱导上皮标志物E-钙粘蛋白的表达(图21)。引人注目的是，GDC-0084单药治疗或与GDC-0084和抗PD1抑制剂的联合治疗显著诱导了上皮标志物E-钙粘蛋白阳性的细胞群(图22)。这些数据表明，与单独的免疫疗法相比，PI3KCA抑制剂与免疫疗法联合能够显著影响肿瘤负荷，并且能够将癌症细胞或肿瘤微环境特征重新编程为更具上皮特征和治疗响应性的特征。这表明这是一种可行的治疗方法，可增强免疫疗法的持久反应。
PI3K单药或联合疗法诱导效应器和TRM特征。
联合治疗优于单药治疗，显著增加CD8+IFNγ+的浸润T细胞进入肿瘤(图23A)。此外，在总CD8 T细胞群中，与PI3K抑制剂单药治疗相比，联合治疗组表达TRM标志物(即CD44、CD103、CD69)的CD8+T细胞比例也显著增加，其诱导作用更强(图23B)。联合治疗也显著增加了CD8+IFNγ+ T细胞阳性细胞向肿瘤的浸润(图23A)。此外，在总CD8 T细胞群中，联合组表达TRM标志物(即CD44、CD103、CD69)的CD8+T细胞比例也显著增加(图23B)。进行该测定是为了了解PI3K抑制单药治疗或联合免疫疗法是否重新编程了除了癌症细胞特征之外的免疫细胞特征。联合治疗能够显著影响和诱导免疫效应器特征，提高抗肿瘤免疫力。
PI3K单药或联合疗法抑制CD8+T细胞中的检查点耗竭特征。
与单独使用PD1或GDC-0084单药疗法相比，GDC-0084和抗PD1抑制剂联合治疗显著降低了TIM3和LAG3阳性CD8+T细胞的数量(图24)。进行该检测是为了研究功能失调的免疫CD8+T细胞的特征是否被重新编程。分析显示，联合治疗能够显著减少免疫功能失调的特征。
PI3K抑制剂和免疫疗法的组合消除了4T1-IO耐受模型中的转移扩散。
GDC-0084与αPD1的联合疗法显著抑制了转移性肿瘤负荷，但单一药物则不能。这种组合在4T1免疫治疗耐受肿瘤模型中也是有效的(图25)。这些数据表明，与单独的免疫疗法相比，PI3K抑制剂与免疫疗法结合可以显著影响肿瘤负荷，并且能够重新编程癌症细胞或肿瘤微环境特征，以在免疫治疗耐受的小鼠乳腺癌模型(4T1)中变得更具治疗响应性，并消除癌症向肺部的转移扩散。这表明了这是一种可行的治疗方法，可以增强免疫治疗的持久反应。
讨论
发明人获得了一种新方法，既能降低PI3K抑制剂(如GDC-0084)的总体毒性，又能提高治疗的总体疗效。这是通过施用减少的GDC-0084，即7.5mg(正常剂量为单次15mg)来实现的，这减少了总体不良副作用，并提高了GDC-0084疗法的总体疗效。此外，发明人发现，PI3K抑制剂与免疫疗法联合使用的疗效同样得到了增强。低浓度的GDC-0084治疗性施用与免疫疗法联合使用，可以进一步降低免疫疗法(如抗PD1)的剂量，从而减少不良事件，并在剂量显著降低的情况下提高整体疗效。
单药疗法与联合疗法的疗效总结
较低剂量的单药疗法抑制检查点蛋白(图4:TIGIT、Tim3、PD1)并诱导效应器特征(图4)。重编程耗竭特征(EOMES)图4。
较低剂量的单药疗法临床异常明显较少(图12)。
较低剂量的单药疗法GDC-0084能够显著抑制肿瘤重量(图13)。
然而，与较低剂量的联合治疗显示出持续控制肿瘤的特征。此外，低剂量联合治疗在抑制炎症方面更有效(图14和图15)。
较低剂量的联合治疗在抑制癌症干细胞(对复发和转移很重要)、重新编程和抑制功能失调的T细胞特征和诱导效应T细胞特征方面更有效(图16，19-20)。
与“高剂量”或“有效剂量”相比，“低剂量”与免疫疗法联合治疗在诱导上皮特征方面更有效(图17-18)。所述联合治疗在抑制转移方面也更为优越(图21)。
以15mg/kg施用表示高剂量的GDC-0084(即，在临床上，人类通常施用20-60mg)，我们的低剂量仅占该剂量的50％。25％的原始剂量作为单药和组合药物预计也会有效。
材料与方法
除非另有说明，否则用于合成和测试所述组合物的所有材料和试剂均可从Sigma-Aldrich公司、Novabiochem、Abeam和美国典型培养物保藏中心(ATCC)购得。
体内动物研究。
每个处理组5只雌性BALB/c小鼠用于异种移植物研究。将4T1乳腺癌症细胞(1×105)注射进六周龄BALB/c裸鼠的右侧腹股沟第四对乳腺脂肪垫中。对于4T1肿瘤细胞注射，每只小鼠使用PBS制备的1×105个细胞。
对于CT26结肠癌小鼠模型，通过腹腔注射将5×105个细胞注射到6周龄BALB/c裸鼠的腹部。每周通过卡尺测量三次肿瘤生长。在第0天和第5天，通过腹腔注射10mg/kg抗PD-1处理小鼠。使用数字卡尺测量肿瘤体积(1/2(长×宽2))，并以平均值±SEM表示。
六周龄雌性Balb/c小鼠购自动物资源中心(ARC)，并在使用前适应环境一周。所有实验程序均按照QIMR Berghofer动物伦理委员会批准的指南和规定进行。于接种部位剃毛，然后将100μlPBS中的1×1054T1细胞皮下注射到小鼠右侧乳腺。当肿瘤达到约100mm3时开始处理。使用外部卡尺测量肿瘤，并使用修改后的椭圆公式1/2(a/b2)计算体积，其中a＝最长边，b＝最短边。对于联合治疗实验，小鼠用指定剂量的载体(生理盐水)或GDC-0084(经口强饲)处理并与抗PD1或同种型对照(10mg/kg)联合处理，每周两次通过腹腔内注射。每天监测小鼠的临床异常(活动减少、驼背姿势、竖毛、体重减轻和转移)，每周测量三次肿瘤体积和体重。一旦溶剂组的肿瘤达到最大限度(1000mm3)，所有肿瘤和相关转移器官(肺、肝、脾)都会被采集、称重、成像并固定在4％多聚甲醛中进行相关分析。
WST-1细胞增殖试验。
将贴壁细胞系CT26、4T1和MCF7以优化的细胞密度(分别为每孔100、100、3000和300个)接种在96孔平底组织培养板中，总体积为100μl/孔，一式三份。将细胞在37℃和5％CO2下贴壁过夜。然后用一系列不同浓度的抑制剂处理细胞，并在37℃和5％CO2的培养箱中放置72小时，之后取出培养基，用100μl/孔的WST-1细胞增殖试剂(Sigma-Aldrich，11644807001)在完全细胞培养基中以1:10的最终稀释度替换。WST-1试剂含有水溶性四唑盐，其被细胞线粒体脱氢酶裂解以产生甲臜。然后使用微孔板分光光度计对每次反应产生的甲臜量进行定量，以测量代谢活性。测量的吸光度与培养物中代谢活性细胞的数量直接相关。使用微孔板分光光度计记录在孵育期0.5、1和2小时的(在30秒的混合时间后)在450nm处的吸光度。通过从样本吸光度中减去背景对照(空白)的平均吸光度来计算增殖百分比。使用GraphPad Prism 8软件通过log(抑制剂)与反应-可变斜率(四个参数)确定每种抑制剂的EC50值。
划痕伤口愈合试验
在96细胞Image Lock板中，在低血清培养基(2％)中，以每孔2500个细胞的优化细胞密度，一式三份接种贴壁乳腺癌细胞系MDA-MB-231，总体积为100μl/孔。将细胞在37℃和5％CO2下贴壁过夜。检查细胞是否处于100％融合状态，以确保产生一致的伤口。24小时后，使用96针WoundMaker Tool制造伤口。受伤后，用低血清培养基洗涤细胞以去除非贴壁细胞，然后用在低血清培养基制备的一系列不同浓度的抑制剂(IC25和IC50)处理。然后将该板放入活细胞分析系统中，使用Zoom活细胞分析设备每6小时扫描一次，跟踪伤口愈合情况。
体外转移性癌PI3K抑制特征
4T1或CT26癌症细胞系用对照或GDC-0084(浓度为0.2μM或0.3μM)、艾代拉里斯(两种低浓度，12.5μM或25μM的)或LY294002(两种低浓度，2.5μM或5μM)处理。然后用Triton X-100渗透样本，用CSV或EpCAM的小鼠一级抗体、EGFR或FOXN2或MDA5的兔一级抗体或ABCB5的山羊一级抗体染色，用驴AF抗小鼠488、抗兔568或抗山羊647二级抗体检测。使用100倍物镜的ASI数字病理系统对蛋白质靶点进行成像。上图描绘了带有比例尺(橙色)的示例图像视野。对EGFR的荧光强度、CSV的细胞质荧光强度(CFI)或ABCB5的整体荧光强度进行了比较分析。数据用PRISM绘制，用Kruskal-Wallis进行单因素方差分析。绘制了显著差异。
OPAL组织显微术。
按照制造商的说明使用自动BONDRX平台的OPAL染色试剂盒进行自动染色。然后安装蛋白质并定位。通过数字病理学激光扫描显微术对蛋白质靶点进行定位。使用ASI数字病理显微术，使用运行ASI软件的100倍油浸物镜获得单个0.5μm切片。最终图像是通过对同一切片的四个连续图像进行平均获得的。使用自动ASI软件(Applied Spectral Imaging，加利福尼亚州卡尔斯班)分析数字图像，通过自动阈值和平均荧光强度的背景校正自动确定分布和强度，从而可以特异性靶向目标蛋白质表达。
从IV期转移性癌症患者的液体活检中分离CTC的方法I。
使用我们优化的实验室方案，对癌症患者的液体活检进行CD45+细胞耗竭处理，以富集循环肿瘤细胞(CTC)，或不进行耗尽处理，在液体活检中分离PBMC。简而言之，我们优化的实验室方案是：将全血储存在EDTA管中，用于循环肿瘤细胞鉴定。RosetteSepTM人CD45耗尽鸡尾酒用于通过耗尽CD45+细胞从全血中富集肿瘤细胞(CTC)。用识别红细胞(RBC)上CD45、CD66b和血型糖蛋白A的四聚体抗体复合物靶向耗尽不需要的细胞。然后通过在浮力密度培养基LymphoprepTM(目录#07801)上离心去除不需要的细胞。然后从血浆和浮力密度培养基之间的界面提取纯化的肿瘤细胞作为高度富集的群体，并在含20％FBS的PBS中收获。
然后对样本中CSV(CTC的间充质、转移标志物)、ABCB5(癌症干细胞标志物和化疗耐药性标志物)和EpCAM(上皮细胞标志物)进行染色。使用ProLong nucblueclearAntifade试剂(Life Technologies)将盖玻片安装在玻璃显微镜载玻片上。通过共聚焦激光扫描显微镜对蛋白质靶点进行定位。使用ASI数字病理系统，使用运行ASI软件的100倍油浸物镜获得单个0.5μm切片。最终图像是通过对同一切片的四个连续图像进行平均获得的。使用ASI软件进行群体动态分析，并使用ImageJ软件(ImageJ,美国国立卫生研究院,美国马里兰州贝塞斯达)进行总细胞计数和荧光强度(蛋白质表达)分析。
从IV期转移性癌症患者的液体活检中分离CTC的方法II
使用我们优化的实验室方案(如上文在液体活检方法I下所述)，对癌症患者的液体活检进行CD45+细胞耗竭处理，以富集液体活检中的循环肿瘤细胞(CTC)。然后对样本中CSV(CTC的间充质、转移标志物)、ABCB5(癌症干细胞标志物和化疗耐药性标志物)和PI3K(激酶)进行染色。使用ProLong nucblue clearAntifade试剂(Life Technologies)将盖玻片安装在玻璃显微镜载玻片上。通过共聚焦激光扫描显微镜对蛋白质靶点进行定位。使用ASI数字病理系统，使用运行ASI软件的40x油浸物镜获得单个0.5μm切片。最终图像是通过对同一切片的四个连续图像进行平均获得的。使用ASI软件进行群体动态分析，并使用ImageJ软件(ImageJ,美国国立卫生研究院,美国马里兰州贝塞斯达)进行总细胞计数和荧光强度(蛋白质表达)分析。
实施例2
确定PI3K-mTOR抑制剂疗效的最佳治疗剂量。
为了确定GDC-0084PI3K-mTOR抑制剂的最佳治疗剂量，发明人使用高度侵袭性免疫疗法耐受的4T1乳腺癌模型。肿瘤一旦形成(约100mm3)，每天通过口服管饲施用GDC-0084联合αPD1免疫疗法(图26A)。实验按顺序进行，初步研究使用每天15mg/kg+/-αPD1的高起始剂量的GDC。随后进行了分次剂量递减研究，其中每日GDC剂量从1.875mg/kg到15mg/kg，间隔4小时分剂量施用，并与αPD1联用；最后进行单次剂量递减研究，其中每日GDC剂量为3.75和7.5mg/kg，单剂量施用，并与αPD1联用(图26B)。
当与免疫疗法联合使用时，以15mg/kg的高日剂量施用GDC-0084可显著减少69％的肿瘤体积(图26C，图1)。分次剂量实验显示，在GDC剂量为15mg/kg和7.5mg/kg的情况下，与抗PD1联合使用时，肿瘤体积相应减少(图26C，图2)。在最后单剂量递减研究中，以较低剂量7.5mg/kg的GDC联合αPD1施用将原发性肿瘤体积减少到与高剂量相同的程度(图26C，图3)，因此7.5mg/kg被确认为最佳治疗剂量。
减少GDC-0084的剂量可以预防毒性并发症。
发明人接下来试图通过监测起始剂量、分次剂量和单剂量减量实验中的小鼠体重和肝脏重量，进一步研究GDC-0084处理的毒性相关并发症(图27)。以15mg/kg GDC-0084αPD1的高日剂量处理的小鼠在处理第4天后体重减轻，最终导致起始剂量和分次剂量递减实验中的小鼠死亡(图27A，图1和2)。然而，在最佳治疗剂量7.5mg/kg下，小鼠在整个实验期间保持体重，没有发生小鼠死亡(图27A，图2和3)。
肝脏增大或肝肿大与器官损伤有关。为了确定GDC-0084处理是否诱导肝毒性，发明人测量了收获时的肝脏重量(图2B)。以15mg/kg的高日剂量施用GDC-0084，到处理结束时，肝脏重量增加了约20％(图27B，图1)。相反，当以7.5mg/kg的较低剂量施用时，没有观察到肝脏重量的差异(图27B，组2和3)。综上所述，我们的数据证实，以7.5mg/kg的最佳治疗剂量施用GDC-0084没有毒性相关并发症。
减少PI3K-mTOR抑制剂的剂量可以减轻肝脏炎症。
为了评估GDC处理后肝脏病理的变化，检查了H&E染色的肝脏切片(图28)。使用既定的评分标准，对炎症、髓外造血和肝细胞损伤的变化进行评分：每个参数1＝轻度、2＝中度或3＝重度。重要的是，将GDC-0084的剂量减少到7.5mg/kg可显著减少肝脏炎症(图28A，图2)。GDC-0084在最佳治疗剂量下的处理也减少了髓外造血，这通常与4T1模型有关(图28B，图2)。最后，支持我们的肝脏重量数据，GDC-0084以15mg/kg的高日剂量处理诱导了肝细胞损伤，证实了肝毒性(图28C，图1)。值得注意的是，在GDC-0084的最佳治疗剂量下，肝细胞没有观察到显著变化(图28C，图2)。
GDC-0084αPD1处理可减少4T1相关的脾肿大和髓外造血。
除了髓外造血外，脾脏增大或脾肿大通常与4T1模型有关。为了检查GDC-0084处理后脾脏的变化，发明人在分次剂量和单剂量递减实验中测量了脾脏重量。在两种施用方案中，以7.5mg/kg的较低剂量施用GDC-0084可减少脾肿大(图29A)。此外，脾脏病理学评估还显示，在以7.5mg/kg的最佳治疗剂量GDC-0084处理后，髓外造血显著减少(图29B，图2)。
GDC-0084αPD1处理后抑制肺白细胞浸润。
鉴于上述数据表明GDC-0084αPD1处理可减少肺转移，发明人接下来试图评估GDC-0084处理后肺免疫细胞群的变化。肺部病理检查显示，在所有浓度下，包括7.5mg/kg的最佳治疗剂量，白细胞浸润肺部的情况都显著减少(图30)。这强调GDC-0084处理不仅影响原发性肿瘤和转移，还影响炎症。
GDC-0084αPD1处理可减少淋巴结转移。
除了肺转移外，4T1模型还与淋巴结转移有关。为了评估GDC-0084处理后的淋巴结转移情况，独立专家病理学家对H&E染色的淋巴结切片进行了检查，并给出了评分：1＝1-3个微小部位(宽度/长度<<0.5mm)；2＝1-3个，其中至少一个直径为0.5-1mm；或3＝2-3个或更多部位，所有部位都肉眼可见，有白细胞浸润和/或出血。在没有GDC-0084处理的情况下，观察到大面积的转移性肿瘤生长，但当免疫治疗与GDC-0084(7.5mg/kg)联合使用时，这些区域是不可见的(图31A)。因此，GDC-0084αPD1处理的小鼠淋巴结转移评分显著降低，证实GDC-0084不仅抑制肺转移，而且抑制淋巴结转移(图31B)。
PI3K-mTOR处理可减少原发性肿瘤体积。
为了确定GDC-0084与PARP抑制剂、奥拉帕尼联合施用时是否显示出疗效，发明人随后采用了TNBC的4T1模型。在最初的实验中，GDC-0084在奥拉帕尼之前或之后施用，然后根据最佳施用方案在第二次实验中重复施用(图32A)。GDC-0084每日经口灌胃施用，最佳治疗剂量为7.5mg/kg，并每日腹腔注射奥拉帕尼(图32B)。PARP抑制剂前和后进行GDC-0084处理，肿瘤体积分别大幅减少53％和60％(图32C，图1)。然后，发明人在第二次实验中使用奥拉帕尼30分钟后施用GDC-0084的最佳施用方案证实了这些结果(图32C图2)。综上所述，这些数据表明，除了免疫疗法外，GDC-0084在与PARP抑制剂联合使用时也显示出疗效，从而增强了其应用。
GDC-0084和PARP抑制剂联合治疗不会引起毒性。
为了检查与毒性相关的并发症，发明人在PARP抑制剂实验中监测了小鼠的体重和肝脏重量(图33)。在7.5mg/kg的最佳治疗剂量下，GDC-0084在奥拉帕尼后施用时不会改变小鼠体重(图33A)。同样，没有观察到肝脏重量的变化，证实没有毒性问题(图33B)。
GDC-0084和奥拉帕尼联合治疗后抑制肺部和肝脏炎症。
鉴于GDC-0084和免疫疗法对炎症的影响，发明人接下来试图在PARP抑制剂研究中检查肝脏和肺部病理。当以7.5mg/kg的剂量奥拉帕尼后施用时，GDC-0084显著降低了肝脏炎症和髓外造血(图34A)。肺部病理学检查还强调，GDC-0084和奥拉帕尼处理的小鼠肺部白细胞增多显著减少(图34B)，证实了GDC-0084不仅对原发性肿瘤有影响，还对转移部位的炎症有影响。
最后，脾脏病理学评估表明，GDC-0084和奥拉帕尼治疗后，除了脾脏重量外，髓外造血也减少了(图35A和35B)。
PI3K-mTOR抑制剂减少癌症细胞增殖。
然后，发明人试图比较PI3K-mTOR抑制剂如GDC-0084的疗效，并因此使用大量抑制剂进行增殖试验，包括更通用的PI3K抑制剂：渥曼青霉素(通用PI3K抑制剂)、艾代拉里斯(p110δ、γ抑制剂)、阿培利司(Alpelisib)(p110α抑制剂)和LY294002(p110α、β、δ抑制剂)，以及PI3K-mTOR抑制剂：奥米利塞(omipalisib)、apitolisib、dactorisib和GDC-0084(p110α、β、δ、γ、mTOR抑制剂)(图36)。PI3K-mTOR抑制剂对MDA-MB-231细胞增殖的影响最为显著，其中奥米利塞、apitolisib和dactolisib的IC50值均低于1.0μM(表16)。相反，GDC-0084的IC50值为2.5μM。更通用的PI3K抑制剂显示出显著更高的值，证实PI3K和mTOR的抑制在预防癌症细胞增殖中是至关重要的。
表16
未测定
抑制PI3K和mTOR影响癌症细胞迁移。
为了确定PI3K-mTOR抑制对癌症细胞迁移的影响，发明人使用用PMA-TGFβ预刺激的人乳腺癌细胞系MCF-7进行了划痕测定，以诱导间充质表型(图37A)。在GDC-0084剂量反应实验中，处理24小时后，在1.25μM和2.5μM的浓度下观察到约50％的抑制作用(图37B)。
同样，为了比较GDC-0084与其他PI3K-mTOR抑制剂的疗效，发明人使用增殖试验的IC50浓度对apitolisib、dactolisib和omipalisib进行了第二次实验(图38A)。与GDC-0084类似，所有PI3K-mTOR抑制剂都显著降低了伤口愈合密度(图38B)，证实了抑制PI3K和mTOR都会阻碍细胞迁移。
材料与方法
动物研究
6-8周龄的雌性BALB/c小鼠购自动物资源中心(ARC)。采集后，小鼠在QIMRBerghofer医学研究所(QIMRB)的隔离室中进行了一周的适应期。所有实验程序均按照QIMRB伦理委员会认可的指南和规定进行。将悬浮在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的1x 105个4T1细胞施用到BALB/c小鼠的乳腺脂肪垫中。当肿瘤达到约50-100mm3时开始处理。在4T1模型中，小鼠每天口服指定剂量的GDC，并结合在第0天和第4天腹腔注射抗PD-1治疗(10mg/kg)或每天服用奥拉帕尼(50mg/kg)。使用外部卡尺测量肿瘤，并使用修改后的椭圆公式1/2(a/b2)计算体积，其中a＝最长边，b＝最短边。每天监测小鼠的临床异常(活动减少、驼背姿势、竖毛、体重减轻和转移)，每周测量三次肿瘤体积。一旦溶剂组的肿瘤达到最大限度(1000mm3)，所有肿瘤和相关转移器官(肺、肝、脾)都会被采集、称重、成像并固定在4％多聚甲醛中进行相关分析。
病理分析
独立专家病理学家对H&E染色的FFPE肝脏、肺、淋巴结和脾脏进行了病理分析。炎症、髓外造血(EMH)、肝细胞和肺白细胞增多的变化被评分：1＝轻度、2＝中度或3＝重度。淋巴结切片的评分为1＝1-3个微小部位(宽度/长度<<0.5mm)；2＝1-3个，其中至少一个直径为0.5-1mm；或3＝2-3个或更多部位，所有部位都肉眼可见，无白细胞浸润和/或出血。
WST-1细胞增殖试验。
将MDA-MB-231细胞以优化的密度接种在96孔平底组织培养板中，总体积为100μL/孔。将细胞在37℃和5％CO2下贴壁过夜。然后用指定剂量的PI3K抑制剂处理细胞，并在37℃和5％CO2的培养箱中放置72小时，之后取出培养基，用100μL/孔的WST-1细胞增殖试剂(Sigma-Aldrich，11644807001)替换，在完全细胞培养基中以1:10的最终稀释度稀释。WST-1试剂含有水溶性四唑盐，其被细胞线粒体脱氢酶裂解以产生甲臜。然后使用微孔板分光光度计对每次反应产生的甲臜量进行定量，以测量代谢活性。测量的吸光度与培养物中代谢活性细胞的数量直接相关。使用微孔板分光光度计在孵育期0.5、1和2小时(在30秒的混合时间后)在450nm处记录吸光度。通过从样本吸光度中减去背景对照(空白)的平均吸光度来计算增殖百分比。使用GraphPadPrism 8软件通过log(抑制剂)与反应-可变斜率(四个参数)确定每种抑制剂的IC50值。
划痕伤口愈合试验。
在接种前，用PMA/TGFβ刺激MCF7细胞24小时，然后以优化的细胞密度接种在96孔Image Lock板中，每孔总体积为100μL，使用低血清培养基(2％)。将细胞在37℃和5％CO2下贴壁过夜。检查细胞是否处于100％融合状态，以确保产生一致的伤口。24小时后，使用96针WoundMaker Tool制造伤口。受伤后，用低血清培养基洗涤细胞以去除非贴壁细胞，然后用低血清培养基中制备的指定剂量的PI3K抑制剂处理。然后将该板放入活细胞分析系统中，使用IncucyteTMZoom活细胞分析设备每4小时扫描一次，跟踪伤口愈合情况。
参考文献
Hassan B,Akcakanat A,Holder AM,Meric-Bernstam F.Targeting the PI3-kinase/Akt/mTOR signaling pathway.Surg Oncol Clin NAm.2013 Oct；22(4):641-64.
Jiang,N.,Dai,Q.,Su,X.et al.Role ofPI3K/AKT pathway in cancer:theframework ofmalignant behavior.Mol Biol Rep 47,4587-4629(2020).
Chen X,Cao Y,Sedhom W,Lu L,Liu Y,Wang H,Oka M,Bornstein S,Said S,SongJ,Lu SL.Distinct roles of PI3KCA in the enrichment and maintenance of cancerstem cells in head and neck squamous cell carcinoma.Mol Oncol.2020 Jan；14(1):139-158.
Xia P,Xu XY.PI3K/Akt/mTOR signaling pathway in cancer stem cells:frombasic research to clinical application.Am J Cancer Res.2015 Apr 15；5(5):1602-9.
Yang L,Huang F,Mei J,Wang X,Zhang Q,Wang H,Xi M,YouZ.Posttranscriptional Control of PD-L1Expression by 17β-Estradiol via PI3K/Akt Signaling Pathway in ERα-Positive Cancer Cell Lines.Int J GynecolCancer.2017 Feb；27(2):196-205.
Fusco N,Malapelle U,Fassan M,MarchiòC,Buglioni S,Zupo S,CriscitielloC,Vigneri P,Dei Tos AP,Maiorano E,Viale G.PI3KCA Mutations as a MolecularTarget for Hormone Receptor-Positive,HER2-Negative Metastatic BreastCancer.Front Oncol.2021 Mar 25；11:644737.
Mosele F,Stefanovska B,Lusque A,et al.Outcome and molecular landscapeofpatients with PI3KCA-mutated metastatic breast cancer.Annals ofOncology；Published online 24 January 2020.
Lanczky A,Gyorffy B:Web-Based Survival Analysis Tool Tailored forMedical Research(KMplot):Development and Implementation,J Med Internet Res,2021 Jul 26；23(7):e27633.

Claims (35)

1.一种改变PI3K过表达细胞的肿瘤细胞的上皮细胞向间充质细胞转化或间充质向上皮细胞转化的方法，包括使PI3K过表达细胞与包含PI3K抑制剂和不靶向癌症干细胞(CSC)的免疫疗法的组合物接触。
2.一种治疗或预防受试者中癌症的方法，其中所述癌症包括至少一种PI3K过表达细胞，所述方法包括向所述受试者施用包含PI3K抑制剂和不靶向癌症干细胞(CSC)的免疫疗法的组合物。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述PI3K过表达细胞是CSC。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述PI3K过表达细胞是CSC肿瘤细胞。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述PI3K过表达细胞表达选自CSV、EGRF和ABCB5、SoX9、SNAIL和AKT1的一种或多种间充质/癌症干细胞标志物。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述上皮细胞的特征在于EpCAM和MDA5中的一种或两种的表达。
7.根据权利要求2至6中任一项所述的方法，其中所述受试者包括表达TIM3、TIGIT、PD1、TOX1和EOMES中的一种或多种的CD8+T细胞群。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述上皮细胞表达上皮细胞标志，所述上皮细胞标志包含E-钙黏蛋白。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述靶向CSC的免疫疗法是免疫检查点分子(ICM)拮抗剂。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述ICM拮抗剂是PD1拮抗剂、PD-L1拮抗剂、CTLA4拮抗剂或PD-L2拮抗剂。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述ICM拮抗剂是抗原结合分子(例如抗体)。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述免疫疗法是PARP抑制剂。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述PI3K抑制剂是催化的PI3K抑制剂。
14.根据权利要求10所述的方法，其中所述PARP抑制剂选自奥拉帕尼、他拉唑帕利、维利帕尼、尼拉帕利和鲁卡帕尼。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述PI3K抑制剂选自paxalisib(GDC-0084)、艾代拉里斯、LY294002、3-甲基腺嘌呤、阿培利司、槲皮素、渥曼青霉素、GNE-490、PI3K-IN-36、740Y-P、AZD-7648、布帕尼西、伊那利塞、达克利司、库潘尼西、eganelisib、匹替利司、SAR405、度维利塞、taselisib、recilisib、YM-201636、奥米帕利西布(omipalisib)、PI-103、α-亚麻酸、非美诺司他和异鼠李素。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述PI3K抑制剂是paxalisib(GDC-0084)。
17.根据权利要求2-16中任一项所述的方法，其中在向受试者施用所述组合物之前，筛选所述受试者的一种或多种生物标志物CSV、EGRF、ABCB5、SoX9、SNAIL、AKT1、EpCAM、MDA5、TIM3、TIGIT、PD1、TOX1、EOMES和E-钙黏蛋白的表达。
18.PI3K抑制剂和不靶向癌症干细胞(CSC)的免疫疗法在用于治疗患有癌症的个体中的T细胞功能失调病症，或用于增强免疫功能(例如免疫效应器功能、T细胞功能等)，用于治疗或延迟癌症的进展，或用于治疗癌症的复发中的用途。
19.PI3K抑制剂和不靶向癌症干细胞(CSC)的免疫疗法在制备用于治疗患有癌症的个体的T细胞功能失调病症，或用于增强其免疫功能(例如免疫效应器功能、T细胞功能等)，用于治疗或延迟癌症的进展，或用于治疗癌症的复发的药物中的用途。
20.根据权利要求18或19所述的用途，其中所述PI3K抑制剂和所述免疫疗法被配制用于同时施用。
21.PI3K抑制剂、不靶向癌症干细胞(CSC)的免疫疗法和辅助剂(例如，化学治疗剂)在用于治疗或辅助治疗患有癌症的个体的T细胞功能失调病症，或用于增强免疫功能(例如，免疫效应器功能、T细胞功能等)，用于治疗或延迟癌症的进展，或用于治疗癌症的复发中的用途。
22.PI3K抑制剂、不靶向癌症干细胞(CSC)的免疫疗法和辅助剂(例如，化学治疗剂)在制备用于治疗或辅助治疗患有癌症的个体的T细胞功能失调病症或用于增强其免疫功能(例如，免疫效应器功能、T细胞功能等)、用于治疗或延迟癌症的进展或用于治疗癌症复发的药物中的用途。
23.根据权利要求21或22所述的用途，其中所述PI3K抑制剂、免疫疗法和辅助剂(例如化疗剂)被配制用于同时施用。
24.根据权利要求18至23中任一项所述的方法，还包括在同时施用之前检测从受试者获得的样本中T细胞中TIM3、TIGIT、PD1、TOX1和EOMES中的一种或多种的升高水平(例如，相对于激活的T细胞中的TIM3、TIGIT、PD1、TOX1和EOMES的水平)。
25.根据权利要求18至24中任一项所述的方法，还包括在同时施用之前检测从受试者获得的样本中T细胞中TIM3、TIGIT、PD1、TOX1和EOMES中的一种或多种的升高水平(例如，相对于激活的T细胞中的TIM3、TIGIT、PD1，TOX1和EOMES的水平)。
26.一种试剂盒，其包含药物，所述药物包含PI3K抑制剂和任选的药学上可接受的载体，以及使用说明书，所述使用说明书包含指导材料，用于将所述药物与另一药物同时施用，所述另一药物包含不靶向癌症干细胞(CSC)的免疫疗法和任选的医学上可接受载体，用于治疗患有癌症的个体中的T细胞功能失调病症，或用于增强其免疫功能(例如，免疫效应器功能、T细胞功能等)，用于治疗或延迟癌症的进展，或用于治疗个体中的癌症复发。
27.一种试剂盒，所述试剂盒包含药物，所述药物包含不靶向癌症干细胞(CSC)的免疫疗法和任选的药学上可接受的载体，以及使用说明书，所述使用说明书包含指导材料，用于将所述药物与另一药物同时施用，所述另一药物包含PI3K抑制剂和任选的医学上可接受载体，用于治疗患有癌症的个体中的T细胞功能失调病症，或用于增强其免疫功能(例如，免疫效应器功能、T细胞功能等)，用于治疗或延迟癌症的进展，或用于治疗个体中的癌症复发。
28.一种试剂盒，其包含第一药物和第二药物，所述第一药物包含PI3K抑制剂和任选的药学上可接受的载体，所述第二药物包含不靶向癌症干细胞(CSC)的免疫疗法和任选的医学上可接受载体，用于治疗患有癌症的个体中的T细胞功能失调病症，或用于增强其免疫功能(例如，免疫效应器功能、T细胞功能等)，用于治疗或延迟个体中癌症的进展，或用于治疗个体中的癌症复发。
29.根据权利要求28所述的试剂盒，其进一步包含使用说明书，所述使用说明书包含指导材料，用于同时施用所述第一药物和所述第二药物以治疗患有癌症的个体中的T细胞功能失调病症、或用于增强其免疫功能(例如免疫效应器功能、T细胞功能等)、用于治疗或延迟个体中的癌症的进展、或用于治疗个体中的癌症复发。
30.一种用于治疗受试者癌症的药物组合物，所述组合物包含单位剂量的PI3K抑制剂，其中当单独施用时，所述PI3K抑制剂的单位剂量小于治疗剂量的75％。
31.根据权利要求30所述的组合物，其中所述PI3K抑制剂是GDC-0084，并且所述单位剂量对应于向所述受试者施用约11.25mg/kg或更低。
32.根据权利要求30或权利要求31所述的组合物，其中所述PI3K抑制剂是GDC-0084，并且所述单位剂量对应于向所述受试者施用约7.5mg/kg或更低。
33.根据权利要求30至32中任一项所述的组合物，其中所述PI3K抑制剂是GDC-0084，并且所述单位剂量相当于向所述受试者施用约4mg/kg或更低。
34.根据权利要求30至31中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包括不靶向癌症干细胞(CSC)的免疫疗法。
35.根据权利要求24所述的组合物，其中所述免疫疗法是ICM拮抗剂(例如PD1拮抗剂、PDL1拮抗剂、CTLA4拮抗剂等)或PARP抑制剂。
CN202380091985.0A 2022-11-21 2023-11-21 用于改进癌症治疗的组合物和方法 Pending CN120569200A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU2022903523A AU2022903523A0 (en) 2022-11-21 Compositions and methods for improved cancer treatment
AU2022903523 2022-11-21
PCT/AU2023/051187 WO2024108256A1 (en) 2022-11-21 2023-11-21 Compositions and methods for improved cancer treatment

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN120569200A true CN120569200A (zh) 2025-08-29

Family

ID=91194764

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202380091985.0A Pending CN120569200A (zh) 2022-11-21 2023-11-21 用于改进癌症治疗的组合物和方法

Country Status (7)

Country Link
EP (1) EP4618997A1 (zh)
JP (1) JP2025539129A (zh)
KR (1) KR20250111349A (zh)
CN (1) CN120569200A (zh)
AU (1) AU2023386202A1 (zh)
MX (1) MX2025005903A (zh)
WO (1) WO2024108256A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN119410582B (zh) * 2025-01-09 2025-04-15 赛德特生物制药有限公司 干细胞样记忆性t淋巴细胞的培养基和培养方法

Also Published As

Publication number Publication date
JP2025539129A (ja) 2025-12-03
WO2024108256A1 (en) 2024-05-30
MX2025005903A (es) 2025-09-02
EP4618997A1 (en) 2025-09-24
AU2023386202A1 (en) 2025-06-19
KR20250111349A (ko) 2025-07-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20240200146A1 (en) Diagnostic and therapeutic methods for cancer
AU2018377852B2 (en) Enhancing T-cell function and treating a T-cell dysfunctional disorder with a combination of an LSD inhibitor and a PD1 binding antagonist
US20190032150A1 (en) Diagnostic and therapeutic methods for cancer
US20210338684A1 (en) Diagnostic and therapeutic methods for cancer
CN107667119A (zh) 用于癌症的治疗和诊断方法
US20240060135A1 (en) Therapeutic and diagnostic methods for cancer
CN120569200A (zh) 用于改进癌症治疗的组合物和方法
JP2015511598A (ja) Ｐａｋ１阻害剤を用いて黒色腫を治療する方法
AU2018363880B2 (en) Immunogenic compositions and uses therefor

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination