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CN120536431A - 靶向酪氨酸酶的siRNA及其组合物和用途 - Google Patents

靶向酪氨酸酶的siRNA及其组合物和用途

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CN120536431A
CN120536431A CN202510492117.4A CN202510492117A CN120536431A CN 120536431 A CN120536431 A CN 120536431A CN 202510492117 A CN202510492117 A CN 202510492117A CN 120536431 A CN120536431 A CN 120536431A
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CN
China
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seq
nucleotide sequence
nucleotides
nucleotide
optionally
Prior art date
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Application number
CN202510492117.4A
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Inventor
袁野
简杰
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Shuyin Kaiwu Life Science Shanghai Co ltd
Original Assignee
Shuyin Kaiwu Life Science Shanghai Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by Shuyin Kaiwu Life Science Shanghai Co ltd filed Critical Shuyin Kaiwu Life Science Shanghai Co ltd
Publication of CN120536431A publication Critical patent/CN120536431A/zh
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Abstract

本发明提供了靶向酪氨酸酶的siRNA及其组合物和用途。本发明的siRNA对酪氨酸酶基因表达具有很高的抑制活性，能够有效地抑制皮肤中黑色素的生成和沉积。本发明的siRNA可以应用在皮肤护理、化妆品及药物领域，为皮肤黑色素相关问题的治疗提供了安全、有效的解决方案。

Description

靶向酪氨酸酶的siRNA及其组合物和用途
技术领域
本发明属于化妆品和药物技术领域，具体地涉及靶向酪氨酸酶(TYR)的siRNA及其组合物和用途。
背景技术
黑色素是人皮肤着色的主要原因，由皮肤黑色素细胞合成。在正常情况下，皮肤中的黑色素起到保护皮肤免受紫外光伤害的作用，减少紫外线对皮肤细胞DNA的损失，从而起到一定的保护作用。然而，皮肤中黑色素过量产生则会导致一系列的皮肤问题，例如雀斑，老年斑，黄褐斑甚至皮肤癌的风险。
在黑色素合成过程中，酪氨酸酶(Tyrosinase，TYR)是关键限速酶。在黑色素合成过程中，TYR作为羟化酶首先将L-酪氨酸转化为L-多巴，然后L-多巴进一步氧化后生成多巴醌。多巴醌再经过一系列的步骤最终生成黑色素。TYR的表达水平和活性直接决定黑色素的生成量，TYR表达量越高，活性越强，生产的黑色素的量就越多。
目前市面上主要的美白化妆品中添加包括氢醌、熊果苷、维甲酸、传明酸、杜鹃花酸、曲酸等成分，这些传统美白成分往往存在渗透性差、稳定性低或副作用大的问题，难以实现高效、安全、长效的美白效果。因此，基于小核酸(siRNA)的新型美白策略成为研究热点。
小干扰RNA(siRNA)是一种能够特异性沉默基因表达的短双链RNA(长度约21-23个碱基)。通过直接沉默黑色素生成相关的mRNA，使得黑色素的合成水平降低，从而实现美白效果，这种美白方式具有高特异性、强效持久性和良好安全性，相比传统美白成分更具优势。
发明内容
本发明提供了一种siRNA，其能够抑制细胞酪氨酸酶(TYR)的表达，从而减少黑色素生成，达到美白的效果。此外，siRNA由于其分子量较大(约13kDa)且带负电荷，难以透过皮肤屏障(角质层)，影响其在皮肤中的递送和应用。为了解决这一问题，使小核酸能够透过皮肤，本文通过化学修饰和离子液体包裹的方式作为递送策略，这些方法能够增强siRNA的稳定性，并且促进siRNA的透皮吸收，显著提高了siRNA的透皮渗透性，使得其能够有效穿透皮肤屏障，进入皮肤细胞，并精准作用于靶基因，提升美白效果。
因此，一方面，本发明提供一种siRNA或其盐，其含有正义链和反义链，所述siRNA中的每个核苷酸各自独立地为修饰或未修饰的核苷酸，其中，所述正义链含有核苷酸序列I，所述反义链含有核苷酸序列II，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II至少部分地反相互补形成双链区，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II选自如下(1)-(13)所示序列中的一组：
(1)所述核苷酸序列I包含与SEQ ID NO:4任选具有不多于3个(优选不多于1个)核苷酸差异的至少15个连续核苷酸，以及所述核苷酸序列II包含与SEQ ID NO:5任选具有不多于3个(优选不多于1个)核苷酸差异的至少15个连续核苷酸：
UGCCAAUUUCAGCUUUAGA(SEQ ID NO:4)
UCUAAAGCUGAAAUUGGCAdTdT(SEQ ID NO:5)；
(2)所述核苷酸序列I包含与SEQ ID NO:6任选具有不多于3个(优选不多于1个)核苷酸差异的至少15个连续核苷酸，以及所述核苷酸序列II包含与SEQ ID NO:7任选具有不多于3个(优选不多于1个)核苷酸差异的至少15个连续核苷酸：
CCAGCUUUCACGCAGAGGU(SEQ ID NO:6)
ACCUCUGCCUGAAAGCUGGdTdT(SEQ ID NO:7)；
(3)所述核苷酸序列I包含与SEQ ID NO:8任选具有不多于3个(优选不多于1个)核苷酸差异的至少15个连续核苷酸，以及所述核苷酸序列II包含与SEQ ID NO:9任选具有不多于3个(优选不多于1个)核苷酸差异的至少15个连续核苷酸：
GCCAAUUUCAGCUUUAGAA(SEQ ID NO:8)
UUCUAAAGCUGAAAUUGGCdTdT(SEQ ID NO:9)；
(4)所述核苷酸序列I包含与SEQ ID NO:10任选具有不多于3个(优选不多于1个)核苷酸差异的至少15个连续核苷酸，以及所述核苷酸序列II包含与SEQ ID NO:11任选具有不多于3个(优选不多于1个)核苷酸差异的至少15个连续核苷酸：
CCAAUUUCAGCUUUAGAAA(SEQ ID NO:10)
UUUCUAAAGCUGAAAUUGGdTdT(SEQ ID NO:11)；
(5)所述核苷酸序列I包含与SEQ ID NO:12任选具有不多于3个(优选不多于1个)核苷酸差异的至少15个连续核苷酸，以及所述核苷酸序列II包含与SEQ ID NO:13任选具有不多于3个(优选不多于1个)核苷酸差异的至少15个连续核苷酸：
UGACAUUUGCACAGAUGAG(SEQ ID NO:12)
CUCAUCUGUGCAAAUGUCAdTdT(SEQ ID NO:13)；
(6)所述核苷酸序列I包含与SEQ ID NO:14任选具有不多于3个(优选不多于1个)核苷酸差异的至少15个连续核苷酸，以及所述核苷酸序列II包含与SEQ ID NO:15任选具有不多于3个(优选不多于1个)核苷酸差异的至少15个连续核苷酸：
GACAUUUGCACAGAUGAGU(SEQ ID NO:14)
ACUCAUCUGUGCAAAUGUCdTdT(SEQ ID NO:15)；
(7)所述核苷酸序列I包含与SEQ ID NO:16任选具有不多于3个(优选不多于1个)核苷酸差异的至少15个连续核苷酸，以及所述核苷酸序列II包含与SEQ ID NO:17任选具有不多于3个(优选不多于1个)核苷酸差异的至少15个连续核苷酸：
GACAUUGAUUUUGCCCAUG(SEQ ID NO:16)
CAUGGGCAAAAUCAAUGUCdTdT(SEQ ID NO:17)；
(8)所述核苷酸序列I包含与SEQ ID NO:18任选具有不多于3个(优选不多于1个)核苷酸差异的至少15个连续核苷酸，以及所述核苷酸序列II包含与SEQ ID NO:19任选具有不多于3个(优选不多于1个)核苷酸差异的至少15个连续核苷酸：
ACAUUGAUUUUGCCCAUGA(SEQ ID NO:18)
UCAUGGGCAAAAUCAAUGUdTdT(SEQ ID NO:19)；
(9)所述核苷酸序列I包含与SEQ ID NO:20任选具有不多于3个(优选不多于1个)核苷酸差异的至少15个连续核苷酸，以及所述核苷酸序列II包含与SEQ ID NO:21任选具有不多于3个(优选不多于1个)核苷酸差异的至少15个连续核苷酸：
CAUUGAUUUUGCCCAUGAA(SEQ ID NO:20)
UUCAUGGGCAAAAUCAAUGdTdT(SEQ ID NO:21)；
(10)所述核苷酸序列I包含与SEQ ID NO:22任选具有不多于3个(优选不多于1个)核苷酸差异的至少15个连续核苷酸，以及所述核苷酸序列II包含与SEQ ID NO:23任选具有不多于3个(优选不多于1个)核苷酸差异的至少15个连续核苷酸：
AUUGAUUUUGCCCAUGAAG(SEQ ID NO:22)
CUUCAUGGGCAAAAUCAAUdTdT(SEQ ID NO:23)；
(11)所述核苷酸序列I包含与SEQ ID NO:24任选具有不多于3个(优选不多于1个)核苷酸差异的至少15个连续核苷酸，以及所述核苷酸序列II包含与SEQ ID NO:25任选具有不多于3个(优选不多于1个)核苷酸差异的至少15个连续核苷酸：
CAGCUUUCAGGCAGAGGUU(SEQ ID NO:24)
AACCUCUGCCUGAAAGCUGdTdT(SEQ ID NO:25)；
(12)所述核苷酸序列I包含与SEQ ID NO:26任选具有不多于3个(优选不多于1个)核苷酸差异的至少15个连续核苷酸，以及所述核苷酸序列II包含与SEQ ID NO:27任选具有不多于3个(优选不多于1个)核苷酸差异的至少15个连续核苷酸：
CUUUCAGGCAGAGGUUCCU(SEQ ID NO:26)
AGGAACCUCUGCCUGAAAGdTdT(SEQ ID NO:27)；
(13)所述核苷酸序列I包含与SEQ ID NO:28任选具有不多于3个(优选不多于1个)核苷酸差异的至少15个连续核苷酸，以及所述核苷酸序列II包含与SEQ ID NO:29任选具有不多于3个(优选不多于1个)核苷酸差异的至少15个连续核苷酸：
UUUCAGGCAGAGGUUCCUG(SEQ ID NO:28)
CAGGAACCUCUGCCUGAAAdTdT(SEQ ID NO:29)。
在一些实施方式中，所述siRNA具有选自以下组合的正义链和反义链组合：
在一些实施方式中，本发明的siRNA中，每个核苷酸各自独立地为修饰或未修饰的核苷酸。在一些实施方式中，本发明的siRNA可以包含至少一个修饰的核苷酸和/或至少一个链间修饰。
在一些实施方式中，正义链上全部的核苷酸是修饰的核苷酸。
在一些实施方式中，反义链上全部的核苷酸是修饰的核苷酸。
在一些实施方式中，正义链和反义链的基本上全部的核苷酸是修饰的核苷酸。
在一些实施方式中，正义链的全部核苷酸和反义链的全部核苷酸是修饰的核苷酸。
所述修饰的核苷酸包括但不限于，2’-F、2’-OME、2’-MOE、GNA、UNA、PNA、5’-VP等修饰的核苷酸。
2’-F、2’-OME、2’-MOE修饰分别指的是核苷酸的呋喃糖基环的2′位的羟基被氟(F)、甲氧基(OMe)、或甲氧基乙氧基(MOE)取代。
GNA修饰指的是甘油核苷酸，是由甘油(DNA与RNA为五碳糖)经由磷酸酯键的连结所组成。
UNA修饰指的是开环核苷酸，UNA缺乏RNA核糖环的C2’与C3’化学键，但结合到RNA双链结构上仍然可以模仿未修饰的RNA。
PNA修饰指的是肽核酸，一类以多肽骨架取代糖磷酸主链的DNA类似物。
5’-VP修饰指的是siRNA5’端经由乙烯基-磷酸修饰。
所述的链间修饰，包括但不限于硫代磷酸(PS)修饰、甲基膦酸酯(MP)修饰、甲氧基丙基膦酸酯(MOP)修饰等。硫代磷酸修饰指的是磷酸骨架上的羟基被巯基取代，MP修饰指的是磷酸骨架上羟基被甲基取代，MOP修饰指的是磷酸骨架上羟基被取代甲氧基丙基取代。
在一些实施方式中，化学修饰的siRNA具有以下的结构：
ss：正义链；as：反义链；大写字母A、C、G、U代表核苷酸的碱基组成；小写字母m表示该字母m左侧相邻的一个核苷酸为2′-甲氧基修饰的核苷酸；小写字母f表示该字母f左侧相邻的一个核苷酸为2′-氟修饰的核苷酸；小写字母s表示与该字母s左右相邻的两个核苷酸之间的连接为硫代磷酸酯基连接。
本发明的siRNA可以化学合成，也可以通过一个重组核酸结构里的表达盒转录成单链RNA之后进行制备。siRNA(或含有siRNA的构建物或表达载体)等的核酸抑制物，可通过采用适当的转染试剂被输送到细胞内，或还可采用本领域已知的多种技术被输送到细胞内。
例如，可采用本领域熟知的亚磷酰胺固相合成方法合成本文的寡核苷酸。按照寡核苷酸的核苷酸种类和顺序，以3′到5′方向将核苷单体依次连接，每个核苷单体的连接都要经过一个相同的循环，包括脱保护、偶联、盖帽、氧化或硫化四步反应。
在一些具体的实施方案中，配制核苷单体的乙腈溶液，其浓度可为0.01～0.10mol/L。
脱保护步骤中，脱保护试剂可选自三氟乙酸，三氯乙酸，二氯乙酸，一氯乙酸中的一种或多种。在一些实施方案中，脱保护试剂为二氯乙酸。可将脱保护试剂溶剂在适当的有机溶剂中。合适的有机溶剂为二氯甲烷。在一些实施方案中，使用脱保护试剂的二氯甲烷溶液进行脱保护，溶液中脱保护试剂的浓度可为1～5％(v/v)。通常，可进行1～5次脱保护处理，每次的反应时间可为20～40秒。
本文中，偶联步骤所用的偶联剂可选自1H-四氮唑、5-乙硫基1H-四氮唑和5-苄硫基1H-四氮唑中的一种或多种。在一些实施方案中，偶联剂为5-乙硫基1H-四氮唑。可将偶联剂溶解在合适的有机溶剂中。在一些实施方案中，该有机溶剂是乙腈。在一些实施方案中，使用偶联剂的乙腈溶液进行偶联，溶液中偶联剂的浓度可为0.1～0.5摩尔/升。偶联反应可进行1～5次，每次的反应时间为可为1～5分钟。偶联反应可在有机溶剂中进行。合适的有机溶剂包括但不限于无水乙腈、无水DMF和无水二氯甲烷中的一种或者多种。在一些实施方案中，该有机溶剂为无水乙腈。
本文中，盖帽步骤可在醋酸酐-乙腈溶液和N-甲基咪唑/吡啶/乙腈溶液中进行。该醋酸酐-乙腈溶液中，醋酸酐的浓度可为10～30％(v/v)。所述N-甲基咪唑/吡啶/乙腈溶液中，N-甲基咪唑的体积浓度可为15～25％，吡啶的体积浓度可为25～35％，乙腈的体积浓度可为45～55％。盖帽的次数可为1～3次。
本文中，氧化步骤可使用浓度为0.01～0.10摩尔/升的碘的吡啶/水溶液(90/10，v/v)，硫代步骤可使用浓度为0.10～0.30摩尔/升的5-亚氨基-1,2,4-二噻唑烷-3-硫酮/吡啶溶液，硫代可实施1～3次。
完成最后一个核苷的连接后进行氨解。可通过将氨解使寡核苷酸与固相载体分离。氨解步骤中，可使用浓氨水(例如浓度为25～28％)与反应产物混合，然后在60～80℃的温度下反应1～8小时，过滤得到含有寡核苷酸的滤液。可浓缩该滤液，获得粗产品。
在所合成的核苷酸序列上存在至少一个2′-TBDMS保护时，需脱除2′-TBDMS保护。脱除所用的试剂可以是三乙胺三氢氟酸盐。在一些实施方案中，将该滤液或粗产品与N-甲基咪唑/三乙胺氢氟酸盐/三乙胺溶液接触，在60～70℃下中反应1～4小时。N-甲基咪唑/三乙胺氢氟酸盐/三乙胺溶液中，N-甲基咪唑、三乙胺氢氟酸盐和三乙胺的体积占比可分别为55～65％、25～35％和35～45％。
脱保护后可进行纯化和脱盐处理。可采用本领域熟知的纯化和脱盐的方法进行。例如，可利用制备型离子色谱纯化柱，通过NaCl的梯度洗脱，完成核酸的纯化；产品收集合并后，可采用反相色谱纯化柱进行脱盐。收集纯度大于95％的馏分浓缩干燥。
可采用上述方法分别制备得到正义链和反义链，然后混合正义链和反义链，进行退火，制备得到本发明的双链siRNA。通常，将正义链和反义链分别溶解在PBS溶液中，然后混合两者的PBS溶液，进行退火。正义链和反义链的混合摩尔比可为1～1.2：1。退火可在83～87℃下进行，退火时间可为3～5分钟。退火结束后，可自然冷却至室温，需要时可冻干。
还一方面，本发明提供一种组合物，所述的组合物包括本文提供的siRNA或其盐和任选的化妆品或药品中可接受的载体。
该化妆品或药品中可接受的载体是指与该siRNA或其盐及其他成分兼容并且对使用者无害的任何载体、稀释剂、或赋形剂。
在一些实施方式中，赋形剂包括微晶纤维素、硬脂酸镁、硬脂酸钙、任何可接受的糖(例如，甘露糖、木糖醇)、油类的赋形剂，但不限于此。
在一些实施方式中，所述载体选自烃油、酯、高级脂肪酸和高级脂肪醇中的一种或几种。所述烃油是指碳氢化合物类油性物质，其实例包括但不限于矿油、凡士林、异构烷烃(如异十六烷)和聚异丁烯。所述酯是指由脂肪酸与醇类缩合形成的酯类化合物，其实例包括但不限于异丙醇棕榈酸酯、辛酸/癸酸三酸甘油酯、硬脂酸异丙酯、辛酸/癸酸异丙酯和十六烷基乙基己酸酯。所述高级脂肪酸是指碳链长度为C12及以上的脂肪酸，其实例包括但不限于硬脂酸、棕榈酸、油酸和亚油酸。所述高级脂肪醇是指碳链长度较长的脂肪醇，其实例包括但不限于鲸蜡醇、硬脂醇、十六十八醇和辛基十二醇。
在一些实施方式中，所述载体为递送运载体，其选自例如，离子液体、脂质体、卡波姆、脂质纳米粒、透明质酸等中的一种或多种，以通过所述递送运载体使得siRNA能够达到皮肤内或皮肤深层目标区域。
在一些实施方式中，所述离子液体是基于胆碱的离子液体。所述基于胆碱的离子液体的阳离子包含胆碱阳离子，阴离子是羧酸阴离子，特别是氨基酸或α-羟基酸阴离子，更特别地，所述离子液体包含胆碱阳离子和峰王酸阴离子，还特别地，所述离子液体是胆碱-峰王酸离子液体。
在一些实施方式中，所述组合物还可以包括其他美白活性成分。所述美白活性成分指的是有助于减轻或减缓皮肤色素沉着，达到皮肤美白增白效果的活性成分，也可称为美白剂，例如，氢醌、熊果苷、维生素C及其衍生物(维生素C脂肪酸酯(3-邻-乙基抗坏血酸、抗坏血酸葡糖苷)和维生素C磷酸酯盐(抗坏血酸磷酸酯镁等)、维甲酸、传明酸、杜鹃花酸、曲酸、烟酰胺、光甘草定、苯乙基间苯二酚、凝血酸、甲氧基水杨酸钾、万养鸡水杨酸、红没药醇、鞣花酸、美白植物成分等，但不限于此。美白植物成分主要包括油溶性甘草提取物、构树叶提取物、桑树提取物、绣球提取物、花红提取物、母菊花提取物等，但不限于此。
本文所描述的组合物可以以任何美容方面和/或皮肤病学适合的形式(例如，乳剂、乳膏、摩丝、凝胶、泡沫、洗液、面罩、软膏、香膏、溶液、浆液、喷雾、面膜等)被提供。
本发明的siRNA及其组合物能够抑制酪氨酸酶(TYR)的表达，从而减少黑色素生成，达到美白的效果。
组合物中siRNA或其盐的实际剂量水平可以变化，以便获得siRNA或其盐的量，所述siRNA或其盐的量对特定使用者带来满意的效果，而不产生毒性和副作用。
再一方面，本发明提供上述siRNA或其盐或者上述组合物在制备药物或化妆品中的用途。
在一些实施方式中，所述药物或化妆品具有选自以下效果中的至少一种：
(1)抑制皮肤细胞中TYR的表达；
(2)减少黑色素生成；
(3)具有美白效果。
再一方面，本发明提供上述siRNA或其盐或者上述组合物，其用于制备药物或化妆品，或者其用于抑制TYR的表达，或者其用于抑制或祛除黑色素生成和沉积，或者其用于美白皮肤。
再一方面，本发明提供一种抑制TYR表达的方法，或者一种抑制或祛除黑色素生成和沉积的方法，或者一种美白皮肤的方法，所述方法包括向有此需要的对象或皮肤施用根据本发明的siRNA或其盐或者上述组合物。
附图说明
图1显示未修饰的siRNA在人黑色素细胞系MNT1中对hTYR mRNA表达的抑制。
图2显示修饰的siRNA在人黑色素细胞系MNT1中对hTYR mRNA表达的抑制。
图3显示修饰的siRNA在人黑色素细胞系MNT1中对黑色素生成的抑制。
图4显示siRNA离子液体对小鼠皮肤中TYR表达的抑制作用。
具体实施方式
在下文中，将对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
实施例1siRNA的制备
1.正义链(SS链)和反义链(AS链)的合成
通过固相亚磷酰胺合成法，利用空白的CPG固相载体作为起始循环，按照核苷酸顺序，自3′到5′方向将核苷单体依次连接，每个核苷单体的连接都要经过一个相同的循环，包括脱保护、偶联、盖帽、氧化或硫化四步反应。合成规模为500nmol的寡核苷酸合成条件如下：
核苷单体配制成0.10mol/L的乙腈溶液，并通过分子筛干燥，每一步反应的条件相同。脱保护试剂选用浓度为3％的三氯乙酸/二氯甲烷溶液，脱保护进行三次，每次反应时间为30秒。偶联剂选用5-乙硫基1H-四氮唑的浓度为0.25摩尔/升的乙腈溶液，偶联三次，反应时间为3分钟。盖帽使用20％醋酸酐-乙腈溶液和N-甲基咪唑/吡啶/乙腈溶液(20/30/50，v/v/v)，盖帽2次；氧化使用0.05摩尔/升的碘的吡啶/水溶液(90/10，v/v)；硫代使用0.20摩尔/升的5-亚氨基-1,2,4-二噻唑烷-3-硫酮/吡啶溶液，硫代2次。
2.寡核苷酸的纯化与退火
2.1氨解
将完成合成步骤的CPG载体加入到5mL的离心管中，加入1毫升的25％～28％的浓氨水，鼓风烘箱中加热80℃反应2小时或加热60℃反应6小时，然后过滤，固体载体用水洗涤三次，滤液通过浓缩仪浓缩后得到粗产品进行下一步纯化。
2.2脱保护
在所合成的核苷酸序列上存在至少一个2′-TBDMS保护时，所述方法还包括氨解步骤完成后的粗产品与三乙胺三氢氟酸盐接触，以脱除2′-TBDMS保护。脱保护的试剂使用N-甲基咪唑/三乙胺氢氟酸盐/三乙胺溶液(6/3/4，v/v/v)，在65℃中反应2.5小时。
2.3纯化
纯化和脱盐的方法是本领域技术人员熟知的。例如，可利用制备型离子色谱纯化柱，通过NaBr或NaCl的梯度洗脱，完成核酸的纯化；产品收集合并后，可采用反相色谱纯化柱进行脱盐。收集纯度大于95％的馏分浓缩干燥，配成浓度为100μM的PBS溶液。
2.4退火
在离心管内将正义链(SS链)和反义链(AS链)的PBS溶液以摩尔比(SS链/AS链＝1.1/1)混合，加热至85℃，保持3-5分钟后，自然冷却至室温，将体系冻干得到产品。
本发明高效筛选出了靶向酪氨酸酶TYR共13对siRNA，核酸序列列在表1中。
表1.未经修饰的TYR siRNA的正义链、反义链序列。
按照上述方法合成得到表2所示的修饰的siRNA。
表2本发明的化学修饰的TYR siRNA的反义链和正义链序列。
注：ss：正义链；as：反义链；大写字母A、C、G、U代表核苷酸的碱基组成；小写字母m表示该字母m左侧相邻的一个核苷酸为2′-甲氧基修饰的核苷酸；小写字母f表示该字母f左侧相邻的一个核苷酸为2′-氟修饰的核苷酸；小写字母s表示与该字母s左右相邻的两个核苷酸之间的连接为硫代磷酸酯基连接。
实施例2TYR siRNA双链体的体外筛选
选取人黑色素细胞系MNT1(购自中国科学院细胞库)进行实验，检测表1和2所示的siRNA对mTYR表达的抑制作用以及对黑色素含量的影响。
实验步骤如下：将人黑色素细胞系MNT1以2.5万个细胞每孔的数量接种至48孔板中，用含10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基培养，在37℃，5％ CO2条件下培养过夜。转染：根据制造商的建议，使用RNAiMAX(Invitrogen,13778)转染siRNA，siRNA转染的终浓度为10nM，一式三份，阴性对照组中未加siRNA药物。在37℃,5％ CO2条件下继续孵育48小时后收获细胞，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后加入Trizol(Invitrogen 15596018)进行RNA提取。使用反转录试剂盒(Takara PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA SynthesisKit；6210A)按照说明书将提取的总RNA逆转录为cDNA，接着用荧光定量PCR试剂盒(TBPremix ExTaqTMII，Takara，RR820A)检测TYR表达量。在该荧光定量PCR法中，以人36B4基因作为内参基因，使用针对人TYR的引物以及针对人36B4的引物分别对TYR和36B4进行扩增。引物的序列如表3所示。PCR如下进行：在95℃下进行30秒，然后以在95℃下10秒、在60℃下30秒的循环进行40个循环。
表3：检测引物的序列
在该荧光定量PCR法中，siRNA抑制活性用TYR基因表达剩余量2-△△Ct表示，△△Ct＝[(Ct实验组目的基因-Ct实验组内参)–(Ct阴性对照组目的基因-Ct阴性对照组内参)]。随后根据下式计算mRNA抑制率：mRNA抑制率＝(1-mTYR基因表达剩余量)×100％。
TYR mRNA表达情况如图1和2所示，抑制率结果如表4-5所示。
表4未修饰的siRNA在人黑色素细胞系MNT1中对TYR mRNA表达的相对抑制
表5修饰的siRNA在人黑色素细胞系MNT1中对TYR mRNA表达的相对抑制
从表4和表5以及图1和图2可以看出，本发明的siRNA在人黑色素细胞系MNT1中对靶基因TYR的表达具有很强的抑制作用。
实施例3siRNA对细胞中黑色素含量的影响
以人黑色素细胞系MNT1为模型，使用RNAiMAX(Invitrogen,13778)对DG010001.1和DG010001.2转染。对照组为RNAiMAX转染试剂中不加入siRNA。转染6天后收获细胞，每组计数10e6个细胞后用PBS洗涤，离心沉淀后加入120μL裂解液(1M氢氧化钠加入10％DMSO)，80℃裂解2小时后使用酶标仪对裂解液进行吸光度检测(OD 400nm)。实验结果如表6和图3所示。从表6和图3可以看出，本发明的DG010001.1和DG010001.2在人黑色素细胞系MNT1中对黑色素含量达到了超过70％的抑制率。
表6：siRNA在人黑色素细胞系MNT1中对黑色素表达的抑制
实施例4蜂王酸-胆碱离子液体包裹siRNA的制备及对小鼠皮肤中TYR的表达的影响
参考文献：Mandal A,Kumbhojkar N,Reilly C,et al.Treatment of psoriasiswith NFKBIZ siRNA using topical ionic liquid formulations[J].Scienceadvances,2020,6(30):eabb6049。
将蜂王酸(购自上海毕得医药科技股份有限公司，23.3g，0.10mmol)加入到一个500mL的圆底烧瓶中，将烧瓶放在20℃的水浴中，并进行搅拌。然后使用加液漏斗缓慢滴加胆碱碳酸氢盐80％水溶液(购自Sigma-Aldrich公司，24.8g，0.12mmol)，滴加完后在室温下搅拌过夜，将生产的二氧化碳排出。然后将圆底烧瓶放在旋转蒸发器上，在室温和低真空(30mbar)条件下去除残余的二氧化碳，当不再观察到二氧化碳的泡沫溢出后，将水浴加热至60℃，并将旋转蒸发器上的真空度降低至5mbar，除去瓶中的水。等水旋干后，在真空烘箱中继续干燥36小时，得到最终产品。
同时将siRNA溶解在无酶水中，然后加入上述制备的离子液体，siRNA水溶液和离子液体体积比为1:1，然后搅拌混合均匀，调整siRNA终浓度为100μM。
选取C57/BL6小鼠(实验动物由浙江维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号为SCXK(浙)2024-0001)在上海交大动物实验中心SPF级动物房进行动物试验，考察siRNA离子液体组合物对小鼠皮肤中TYR表达的抑制作用。实验步骤如下：以C57/BL6小鼠为模型，在试验前一天剔除小鼠背部两侧毛发，把上述所制备不含siRNA的离子液体和siRNA离子液体组合物分别均匀涂在小鼠背部皮肤的左右两侧上(约100μL)，左侧为空白对照，右侧为siRNA离子液体组合物，每天涂抹2次，共涂16天。然后处死小鼠并取出皮肤，先用冰的PBS洗涤，再用液氮速冻后研磨成粉末，然后使用Trizol(Invitrogen 15596018)进行RNA提取。将提取的总RNA使用反转录试剂盒(Takara PrimeScriptTMII 1st Strand cDNASynthesisKit:6210A)按照说明书逆转录为cDNA，接着用荧光定量PCR试剂盒(TBPremix ExTaqTMII,Takara,RR820A)检测TYR mRNA表达的抑制率。TYR mRNA表达情况如图4和表7所示。从表7和图4可以看出，DG010001.1和DG010001.2均能有效地抑制对小鼠皮肤中的mTYR的表达，其中DG010001.2抑制效果表现的更好。
表7：siRNA离子液体对小鼠皮肤中黑色素表达的抑制
SEQ ID NO:1是人酪氨酸酶(TYR)mRNA[NCBI参考序列：NM_000372.5]
ACTGTAGTAGTAGCTGGAAAGAGAAATCTGTGACTCCAATTAGCCAGTTCCTGCAGACCTTGTGAGGACTAGAGGAAGAATGCTCCTGGCTGTTTTGTACTGCCTGCTGTGGAGTTTCCAGACCTCCGCTGGCCATTTCCCTAGAGCCTGTGTCTCCTCTAAGAACCTGATGGAGAAGGAATGCTGTCCACCGTGGAGCGGGGACAGGAGTCCCTGTGGCCAGCTTTCAGGCAGAGGTTCCTGTCAGAATATCCTTCTGTCCAATGCACCACTTGGGCCTCAATTTCCCTTCACAGGGGTGGATGACCGGGAGTCGTGGCCTTCCGTCTTTTATAATAGGACCTGCCAGTGCTCTGGCAACTTCATGGGATTCAACTGTGGAAACTGCAAGTTTGGCTTTTGGGGACCAAACTGCACAGAGAGACGACTCTTGGTGAGAAGAAACATCTTCGATTTGAGTGCCCCAGAGAAGGACAAATTTTTTGCCTACCTCACTTTAGCAAAGCATACCATCAGCTCAGACTATGTCATCCCCATAGGGACCTATGGCCAAATGAAAAATGGATCAACACCCATGTTTAACGACATCAATATTTATGACCTCTTTGTCTGGATGCATTATTATGTGTCAATGGATGCACTGCTTGGGGGATCTGAAATCTGGAGAGACATTGATTTTGCCCATGAAGCACCAGCTTTTCTGCCTTGGCATAGACTCTTCTTGTTGCGGTGGGAACAAGAAATCCAGAAGCTGACAGGAGATGAAAACTTCACTATTCCATATTGGGACTGGCGGGATGCAGAAAAGTGTGACATTTGCACAGATGAGTACATGGGAGGTCAGCACCCCACAAATCCTAACTTACTCAGCCCAGCATCATTCTTCTCCTCTTGGCAGATTGTCTGTAGCCGATTGGAGGAGTACAACAGCCATCAGTCTTTATGCAATGGAACGCCCGAGGGACCTTTACGGCGTAATCCTGGAAACCATGACAAATCCAGAACCCCAAGGCTCCCCTCTTCAGCTGATGTAGAATTTTGCCTGAGTTTGACCCAATATGAATCTGGTTCCATGGATAAAGCTGCCAATTTCAGCTTTAGAAATACACTGGAAGGATTTGCTAGTCCACTTACTGGGATAGCGGATGCCTCTCAAAGCAGCATGCACAATGCCTTGCACATCTATATGAATGGAACAATGTCCCAGGTACAGGGATCTGCCAACGATCCTATCTTCCTTCTTCACCATGCATTTGTTGACAGTATTTTTGAGCAGTGGCTCCGAAGGCACCGTCCTCTTCAAGAAGTTTATCCAGAAGCCAATGCACCCATTGGACATAACCGGGAATCCTACATGGTTCCTTTTATACCACTGTACAGAAATGGTGATTTCTTTATTTCATCCAAAGATCTGGGCTATGACTATAGCTATCTACAAGATTCAGACCCAGACTCTTTTCAAGACTACATTAAGTCCTATTTGGAACAAGCGAGTCGGATCTGGTCATGGCTCCTTGGGGCGGCGATGGTAGGGGCCGTCCTCACTGCCCTGCTGGCAGGGCTTGTGAGCTTGCTGTGTCGTCACAAGAGAAAGCAGCTTCCTGAAGAAAAGCAGCCACTCCTCATGGAGAAAGAGGATTACCACAGCTTGTATCAGAGCCATTTATAAAAGGCTTAGGCAATAGAGTAGGGCCAAAAAGCCTGACCTCACTCTAACTCAAAGTAATGTCCAGGTTCCCAGAGAATATCTGCTGGTATTTTTCTGTAAAGACCATTTGCAAAATTGTAACCTAATACAAAGTGTAGCCTTCTTCCAACTCAGGTAGAACACACCTGTCTTTGTCTTGCTGTTTTCACTCAGCCCTTTTAACATTTTCCCCTAAGCCCATATGTCTAAGGAAAGGATGCTATTTGGTAATGAGGAACTGTTATTTGTATGTGAATTAAAGTGCTCTTATTTTAAAAAATTGAAATAATTTTGATTTTTGCCTTCTGATTATTTAAAGATCTATATATGTTTTATTGGCCCCTTCTTTATTTTAATAAAACAGTGAGAAATCTA
SEQ ID NO:2是食蟹猴酪氨酸酶(TYR)mRNA[NCBI参考序列：XM_001105033.4]
ATATGGAGTTCTTCAAATATTGTAGCCTGTTTACGGTCTCTGAGAAATAACTAGCTAAAACCCATAATCTTTAATACTTCCTAAACTTTGTTAATAAGAGAAGCTCTATTCCTGACACTACCTCTCATCTGCAAGTTCAAATCATCATTAATTTTGTAGTCTATTAACTGGGTTTGCTTAGGTCAGGCATTATTATTATTAATCTTATTGTTAATATTCTAACCATAAGAATTAAACTATTAAAGGTGAATAGAGTTTTTCACTTTAACATAGACCTATCCTACTGGTGGGATATGAGCCAATTCCAAAGAAAAGTCAGTCATGTGCTTTTCAGAGGATGAAAGCTTAAGATAAAGACTAAAAGTGTTTGATGCTGGAGGTGGGAGTGGTATTATATAGGTCTCAGCCAAGACATGTGATAATCACTGTAGGAGTAGCTGGAAAGAGAAGTCTGTGACTCCAATTAGCCAGTTTCAGCAGACCTTGTGAGGACTAGAGGAAGAATGATCCTGGCTGTTTTGTACTGCCTGCTGTGGAGTTTCCAGACCTCCGCTGGCCATTTCCCTCGAGCCTGTGTCTCCTCTAAGAACCTGATGGAAAAGGAATGCTGCCCACCATGGAGTGGGGACGGGAGTCCCTGTGGCCAACTTTCAGGCAGAGGTTCCTGTCAGAATATCCTTCTGTCCAATGCACCACTTGGGCCTCAATTTCCCTTCACAGGGGTGGATGACCGGGAGTCGTGGCCTTCCATCTTTTATAATAGGACCTGCCAGTGCTCTGGCAACTTCACGGGATTCGACTGTGGAAACTGCAAGTTTGGCTTTTGGGGACCAAACTGCACAGACAGACGACTCTTGGTGAGAAGAAACATCTTTGATTTGAGTGCCCCAGAGAAGGACAAATTTTTTGCCTACCTCACTTTAGCAAAGCATACCATCAGCTCAGACTATGTCATCCCCATAGGGACGTACGGCCAAATGAAAAATGGGTCAACACCCATGTTTAGTGATATCAACATTTATGACCTCTTTGTCTGGATCCATTATTATGTGTCAATGGATGCACTGCTTGGGGGATCTGAAATCTGGAGAGACATTGATTTTGCCCATGAAGCACCAGCTTTTCTGCCTTGGCATAGACTCTTCTTGTTGCGGTGGGAACAAGAAATCCAGAAGCTGACAGGAGATGAAAACTTCACTATTCCATATTGGGACTGGCGGGATGCAGAAAAGTGTGACATTTGCACAGATGAGTACATGGGAGGTCAGCACCCCGCAAATCCTAACCTACTCAGCCCAGCATCATTCTTCTCCTCTTGGCAGATTATCTGTAGCCGATTGGAGGAGTACAACAGCCATCAGTCTTTATGCAATGGAATGCCCGAGGGACCTTTACGGCGCAATCCTGGAAACCATGACAAATCCAGAACCCCAAGGCTCCCCTCTTCAGCTGACGTAGAATTTTGCCTGAGTTTGACCCAGTATGAATCTGGTTCCATGGATAAAGCTGCCAATTTCAGCTTTAGAAATACACTGGAAGGATTTGCTAGTCCACTTACTGGGATAGCAGATGCCTCTCAAAGCAGCATGCACAATGCCTTGCACATCTATATGAATGGAACAATGTCCCAGGTCCAGGGATCTGCCAACGATCCCATCTTCCTTCTTCACCATGCATTTGTTGACAGTATTTTTGAGCAGTGGCTCCGAAGGCACCATCCTCTTCAAGAAGTTTATCCAGAAGCCAATGTACCCATTGGACATAACCGGGAATCCTACATGGTTCCTTTTATACCACTGTACAGAAACGGTGATTTCTTTATTTCATCCAAAGATCTGGGCTATGACTATAGCTACCTACAAGATTCAGGCTCAGACTCTTTTCAAGACTACATTAAGTCCTATCTGGAACAAGCCGGTCGGATCTGGTCATGGCTCCTTGGGGCGGCGATGGTAGGAGCCGCCCTCACTGCCCTGCTGGCAGGGCTTGTGAGCTTGCTGTGTGGTCACAAGAGAAAGCACCTTGCTGAAGAAAGGCAGCCACTCCTCATGGAGAAAGAGGATTACCACAACTTGTTGTATCAGAGCCATTTATAAAAGGCTTAGGCAATAGAGTAGGGTAAAAAGTTAGAGTGACCTCACTCTAACTCAAAGTAATGTCCAGGTTCCCACAGAATATCTGCTGATATTTTTCTGTAAAGACCATTTGCAAAATTGCAACCTAATACAAAGTGTACCCTTCTTCCAGCTCAGGTAGAACACGCCTGTCTTTGTCTTGCTGTTTTCACTCAGCCCTTTTAACATTTTCCCCTAAGCCCACATGTCTAAGGAAAGGATGCTATTTGGTAATGAGGAACTGTTATTTGTATCTGAATTAAAGTGCTCTTATTTTACAAAAAGGAAATAATTTTGATTTTTGCCTTCTGATTATTTATATATATATTTTATTGGTTCCTTTTTTATTTTAATAAAACAGTGACAAATCTA
SEQ ID NO:3是鼠酪氨酸酶(TYR)mRNA[NCBI参考序列：NM_001317397.2]
ACTCCAGGGGTTGCTGGAAAAGAAGTCTGTGACACTCATTAACCTATTGGTGCAGATTTTGTATGATCTAAAGGAGAAAATGTTCTTGGCTGTTTTGTATTGCCTTCTGTGGAGTTTCCAGATCTCTGATGGCCATTTTCCTCGAGCCTGTGCCTCCTCTAAGAACTTGTTGGCAAAAGAATGCTGCCCACCATGGATGGGTGATGGGAGTCCCTGCGGCCAGCTTTCAGGCAGAGGTTCCTGCCAGGATATCCTTCTGTCCAGTGCACCATCTGGACCTCAGTTCCCCTTCAAAGGGGTGGATGACCGTGAGTCCTGGCCCTCTGTGTTTTATAATAGGACCTGCCAGTGCTCAGGCAACTTCATGGGTTTCAACTGCGGAAACTGTAAGTTTGGATTTGGGGGCCCAAATTGTACAGAGAAGCGAGTCTTGATTAGAAGAAACATTTTTGATTTGAGTGTCTCCGAAAAGAATAAGTTCTTTTCTTACCTCACTTTAGCAAAACATACTATCAGCTCAGTCTATGTCATCCCCACAGGCACCTATGGCCAAATGAACAATGGGTCAACACCCATGTTTAATGATATCAACATCTACGACCTCTTTGTATGGATGCATTACTATGTGTCAAGGGACACACTGCTTGGGGGCTCTGAAATATGGAGGGACATTGATTTTGCCCATGAAGCACCAGGGTTTCTGCCTTGGCACAGACTTTTCTTGTTATTGTGGGAACAAGAAATTCGAGAACTAACTGGGGATGAGAACTTCACTGTTCCATACTGGGATTGGAGAGATGCAGAAAACTGTGACATTTGCACAGATGAGTACTTGGGAGGTCGTCACCCTGAAAATCCTAACTTACTCAGCCCAGCATCCTTCTTCTCCTCCTGGCAGATCATTTGTAGCAGATCAGAAGAGTATAATAGCCATCAGGTTTTATGCGATGGAACACCTGAGGGACCACTATTACGTAATCCTGGAAACCATGACAAAGCCAAAACCCCCAGGCTCCCATCTTCAGCAGATGTGGAATTTTGTCTGAGTTTGACCCAGTATGAATCTGGATCAATGGATAGAACTGCCAATTTCAGCTTTAGAAACACACTGGAAGTATTTTTGAACAATGGCTGCGAAGGCACCGCCCTCTTTTGGAAGTTTACCCAGAAGCCAATGCACCTATCGGCCATAACAGAGACTCTTACATGGTTCCTTTCATACCGCTCTATAGAAATGGTGATTTCTTCATAACATCCAAGGATCTGGGATATGACTACAGCTACCTCCAAGAGTCAGATCCAGGCTTTTACAGAAATTATATTGAGCCTTACTTGGAACAAGCCAGTCGTATCTGGCCATGGCTTCTTGGGGCAGCACTGGTGGGAGCTGTTATTGCTGCAGCTCTCTCTGGGCTTAGCAGTAGGCTATGCCTTCAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGCAACCCCAGGAGGAAAGGCAGCCACTCCTCATGGACAAAGACGACTACCACAGCTTGCTGTATCAGAGCCATCTGTGAACATCCTAGGAAACAGAGTGGGACTGAAAGGTTTTACCTCACTCGACCTATTTGTTGGTGTTTCTACAAATTTAAACTAGTATAAAACATAGACCATAGCTGTTTGGCTTTTTTTCAGACCCATGTTTTTTCCTAAGTCCTAGTTTCTAAGAAATGACTGGGATTTGCTAAAATATATATATATATATAAATAATAACTTACTAATAGCTAAATAAAATTTCCTCTTACAACTAATTGAGCTGGTTTTTATGAATGTGTCTTAATTATTTAAACTTGAGGCACATTTTTGTTTTCCTTACTTCATTGTGAATTTCCAAGAAAAATATTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCGTGTGTTTGTGTGTATGTGTGTGTTAACTGATTCAAACAATTTTGAAAATCTTGGATTGATAGAAATGATTCATTAATTTATGAAATTATTTCATTAATGATTAGGAAAGACGAATAATTACTAAATTAGTAACAGAGGAGAACATCTGCCAGCTTTTATTAATTGTCATTTAAGTTACCTTATCTACCTTCTGTGACTGGTGGAAAAATATCAGGCAAGAGATGGGAATGCTCTGCCTAATAGGATAGTGGCTCCTGGAAGGAGTGGGTTATTACTAGAGATTATTACCTGAAGTTTACCATAGCCAGAAAATTAATCAAAACAGATGACTCAGTAACATCTGAAGCTTCAAGTCGGCTTGACTGCAATCTGAAATCATCAAGCCCAAGAGCCAAAGGAATGGGAACAGCGATGGGAAACTATCTGAATCAGATTCTAGTGTGATAGTGTCAGGGGCACATGGGTCATCTTTGAGACCTTCACACCTGTTGAGTCACCAAAATTTGCTGTGAATGTAAATTTTTACTGTAAATTAATTTTTTCTTTTCTTTTTAAAAAGATTTATTTATTATTATACATAAGTACACTGTAGCTGTCTTCAGACACACCAGAAGAGGGTGTCAGATCTCATTACAGATGGTTGTGAGCCACCATGTGGTTGCTGGGATTTGAACTCAGGACCTCTGGAAGAACAGTCAGTGCTCTTACCCGCTGAGCCATCTCGCCAGCCCAGTAAATTTTTACTTTAGTGAAAGTAAAATTTAAGTTTTAGTTTTTAGTTTAGTAAAATTTTAGGAAGCAAATTTTTAGTTTTCTAAACTAATTTTTTTTTCTAGTACTGGACATCAACCCAGTGCCTTGTATATGCAATGCAAGCATTTTCTTGTACTCTGCTACCTAGCATGTATATATAAATCTACCCAACAAATGTTCATTACAGCTGACAAGGGTCTTTATAAACTCAGTGTTTCCCTTTATCACAATACAATTCCCTCCTTTGCCACTTCATGTCATCATAGAATATTGTTTTTTTCTCTAGCGGTTCAAGGTATGTATTTGTATAGCAGTCACACCTTTGATAAAAGTTACCATCTCTTTGATTATATATTCTCATTATGGTAACAAAATTATATTATGACTATTTCAATATATCTGAAAGTTTCATTAAATTCTCATTAACTTTGTATATTTCAGTCTTGCTTATTGTGAAGCTTTTATAAATTGCTTCACTTTTTTCTGAAATTGTCCTGTTGCTACATCATTCTGTTAAGAAATAAATAAGTGGCAATATTTTCCCCCTTTCTTCTTCCTCTAGGCTTTTAAAATTAATTTTAGTATTCATATATTTTTATCAAATCAAACATGCAATTCTCTATCTGTAGAGATTAACCTGTGATCGATACAAGTCATTTTAACTAGTGTCCTTATGAGGCTGACAGCAAGCATAAATCATTGATGTTCAGCATTTATATAAGCTTTCATTTATGAGTAGAGTTTGTCAGTTTATACAATAGAATATAAATTATAAACAAGCTATTAATACCACAAAAGCCTTAACATTATTTAGCTGTTGCAAACTACATATGAACAACTTTAGTAATTTTCATGTTCTATTTAAGTTTTATATGCTTCAAATTTATTATTTGGGGCCTCTTATTGTTTTTTTATATGGCAGCATTCTAGGATGGAGTGTGAAGAGATTTCTTAGCCTCAATCCCCATCTGATGCCCTATGGGCAGTGATGGCTTCTGTTTGAGGGACACTCAGTTTTCTATTCGAGTCCTGGTAGAGTTATCATGTTCTGGTAGAAGGATTCAAGCCCAGTAGTATAGGTACACCATGCCTTATAATGACTGAGCTATTACATTTAAAAAAGAATAAAAGCATGAAGCTGAGGAGGCAGTGAGGTGGGGGTGGATCTGCGGAGAGTCACATGGAGAAGTGGAGGGCAGATTTACATTATATCAAATTTTCAAAAAATAATAAAATATTTATAAAATGTAATTGAACGAACAATATGTGGGTTGGAATCAAAACTCATGTAGAACTTTCTTCAGTCACTAGATCTGATTGATTGTGAATTGATTATTAGCCATTTAAACTAGTAGACTCGAGACTTACCTTAATTATTTAGTTGCCAAATTTGGGATCACAATTGAATATGTCTCCTCAAAAAATATCTTAAAAATTCATAGTAATCACTTTCACTTTCCTTTTGCCTATTTTAAAATATATGCATTCTCTTTAATTAAACAGCTCTGCATCCTGTTTGTCCCATAGGTAAATAAAATGTTGAGTGTGAATATTTAGTGAAATATAGTTCTTAATAAATTTGCTTTACTAAAATTATTTTTACTTTCTTAGTCTTTTTTTTTTTTAGAAAATTAAAAGTAAATGTATAGAAGTAAAAAGTTTGTTTTCTAAATCAGTGTTCTATATGTTGCATAAACTGGTTCCTACTGCTGGATTTTGTTGGCTTTCCAGTCTCAGAGCAGTGTCTGGATTACAGGTAGATATTGCTGTACTAGGATGAAAGTAGACTGTTTTAATGAGAGATACTTTCAATTTCACAGGAAAGGTGATTTCTATTATGTTAGGCCAATAATCCTAACTTTAATGGCATTTCATAATGGGTGCTGAGTTAACTGTCTGATGCTGAAATTATACTAAAAATAATGTGGTGATCATGGAACCTCAAAATAAAACAAAATAAACTAAAAATTTATCACCTTTTAAAAATCTAGTATTATCTTTTCATTAACTAGAAAACAAATGTTGAAATGTTTAAAAAGAAATATTTAGCAATATACACAATAATTGATTAATTTCAGTTTAATTTTTAAAATATTTTATTCTTTCTTAATGACAACTACTGTATGATCTGGCTCATAAGTAGTAGCGGTAGCAGCTTTTGCAGAGCATATACCCCCTAAAATCTGTGTCAATATACTATTTGAGTTCCCTGAACATCTGTTTATTACAGTGCTACTCACAACAACTAGGTTGTGGAGACACCCCAGATGTCTATCCACAGACAAATGGATAGAGAAACCATGGCATGTATACATGGTGGAGGTTTGTTCAGCCATAAAGAAGAATTAAATTATGTCATTTGCAAGAAAACTAATGTATTTATAATTCATGATGATGAATGCAATAGGTCACACTAAAAATCACGTTTTTCTATATTATATATACATATAAGTGTATACATGCACATTTTCAGGAGGAACTATTTGTTTTTTTTTTAACGCATTCTAGAATGTAGCAGGAAAGACAATATTGTGGGTAGTTTGGGGTTGCATCAGTATAAGCAAAGAAAAAGTTATACAAGTATGAAAATTTTATAATGAGTACATTATAAAATTTGTAATGTGTACAATAAATATATACCAATATGCTGTATAATAAATATATACCAATGATTAAAGAAAAAATCCAAGTAGTTATGTATTTTACTTATAAAGACAAAATGAAATCAGCATTAACTTATTTCACAGATATTTCCTAGAATTTGGGGGTATAAAGATGATTAAGACACATAAACCATATGCTACATTGAAAAATGCAAGTGGGGTAATAGGAAAGTAGATAACTACTTATAAAATTATGATGGAAATAATCATTCTAGAGTAATATTCTAAAACACAATTTAAAAAGTAAGGTCATAAAATAGAAAAATAATTACCCATCTCAATTCTAAGACATAATTTTTTAGATTAGATTAATCTCTTCTTTAACAATTATAATAGAACCTTTTCATCATTTATATACTGGATGCATGTCTAAGCACTACTCTATATAATTTCTGCTTGTCATATGAACACTGAGTATGGTTATATTACTTTATTTTAATGATGAAGAAGCTTGAATAACAAAGATATTTTAAGAAGTCAAAAACCCTATTAAATTGTATGTATCACAATTTTT
以上SEQ ID NO:1至3中用“T”代表“U”。

Claims (10)

1.一种siRNA或其盐，其含有正义链和反义链，所述siRNA中的每个核苷酸各自独立地为修饰或未修饰的核苷酸，其中，所述正义链含有核苷酸序列I，所述反义链含有核苷酸序列II，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II至少部分地反相互补形成双链区，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II选自如下(1)-(13)所示序列中的一组：
(1)所述核苷酸序列I包含与SEQ ID NO:4任选具有不多于3个(优选不多于1个)核苷酸差异的至少15个连续核苷酸，以及所述核苷酸序列II包含与SEQ ID NO:5任选具有不多于3个(优选不多于1个)核苷酸差异的至少15个连续核苷酸：
UGCCAAUUUCAGCUUUAGA(SEQ ID NO:4)
UCUAAAGCUGAAAUUGGCAdTdT(SEQ ID NO:5)；
(2)所述核苷酸序列I包含与SEQ ID NO:6任选具有不多于3个(优选不多于1个)核苷酸差异的至少15个连续核苷酸，以及所述核苷酸序列II包含与SEQ ID NO:7任选具有不多于3个(优选不多于1个)核苷酸差异的至少15个连续核苷酸：
CCAGCUUUCACGCAGAGGU(SEQ ID NO:6)
ACCUCUGCCUGAAAGCUGGdTdT(SEQ ID NO:7)；
(3)所述核苷酸序列I包含与SEQ ID NO:8任选具有不多于3个(优选不多于1个)核苷酸差异的至少15个连续核苷酸，以及所述核苷酸序列II包含与SEQ ID NO:9任选具有不多于3个(优选不多于1个)核苷酸差异的至少15个连续核苷酸：
GCCAAUUUCAGCUUUAGAA(SEQ ID NO:8)
UUCUAAAGCUGAAAUUGGCdTdT(SEQ ID NO:9)；
(4)所述核苷酸序列I包含与SEQ ID NO:10任选具有不多于3个(优选不多于1个)核苷酸差异的至少15个连续核苷酸，以及所述核苷酸序列II包含与SEQ ID NO:11任选具有不多于3个(优选不多于1个)核苷酸差异的至少15个连续核苷酸：
CCAAUUUCAGCUUUAGAAA(SEQ ID NO:10)
UUUCUAAAGCUGAAAUUGGdTdT(SEQ ID NO:11)；
(5)所述核苷酸序列I包含与SEQ ID NO:12任选具有不多于3个(优选不多于1个)核苷酸差异的至少15个连续核苷酸，以及所述核苷酸序列II包含与SEQ ID NO:13任选具有不多于3个(优选不多于1个)核苷酸差异的至少15个连续核苷酸：
UGACAUUUGCACAGAUGAG(SEQ ID NO:12)
CUCAUCUGUGCAAAUGUCAdTdT(SEQ ID NO:13)；
(6)所述核苷酸序列I包含与SEQ ID NO:14任选具有不多于3个(优选不多于1个)核苷酸差异的至少15个连续核苷酸，以及所述核苷酸序列II包含与SEQ ID NO:15任选具有不多于3个(优选不多于1个)核苷酸差异的至少15个连续核苷酸：
GACAUUUGCACAGAUGAGU(SEQ ID NO:14)
ACUCAUCUGUGCAAAUGUCdTdT(SEQ ID NO:15)；
(7)所述核苷酸序列I包含与SEQ ID NO:16任选具有不多于3个(优选不多于1个)核苷酸差异的至少15个连续核苷酸，以及所述核苷酸序列II包含与SEQ ID NO:17任选具有不多于3个(优选不多于1个)核苷酸差异的至少15个连续核苷酸：
GACAUUGAUUUUGCCCAUG(SEQ ID NO:16)
CAUGGGCAAAAUCAAUGUCdTdT(SEQ ID NO:17)；
(8)所述核苷酸序列I包含与SEQ ID NO:18任选具有不多于3个(优选不多于1个)核苷酸差异的至少15个连续核苷酸，以及所述核苷酸序列II包含与SEQ ID NO:19任选具有不多于3个(优选不多于1个)核苷酸差异的至少15个连续核苷酸：
ACAUUGAUUUUGCCCAUGA(SEQ ID NO:18)
UCAUGGGCAAAAUCAAUGUdTdT(SEQ ID NO:19)；
(9)所述核苷酸序列I包含与SEQ ID NO:20任选具有不多于3个(优选不多于1个)核苷酸差异的至少15个连续核苷酸，以及所述核苷酸序列II包含与SEQ ID NO:21任选具有不多于3个(优选不多于1个)核苷酸差异的至少15个连续核苷酸：
CAUUGAUUUUGCCCAUGAA(SEQ ID NO:20)
UUCAUGGGCAAAAUCAAUGdTdT(SEQ ID NO:21)；
(10)所述核苷酸序列I包含与SEQ ID NO:22任选具有不多于3个(优选不多于1个)核苷酸差异的至少15个连续核苷酸，以及所述核苷酸序列II包含与SEQ ID NO:23任选具有不多于3个(优选不多于1个)核苷酸差异的至少15个连续核苷酸：
AUUGAUUUUGCCCAUGAAG(SEQ ID NO:22)
CUUCAUGGGCAAAAUCAAUdTdT(SEQ ID NO:23)；
(11)所述核苷酸序列I包含与SEQ ID NO:24任选具有不多于3个(优选不多于1个)核苷酸差异的至少15个连续核苷酸，以及所述核苷酸序列II包含与SEQ ID NO:25任选具有不多于3个(优选不多于1个)核苷酸差异的至少15个连续核苷酸：
CAGCUUUCAGGCAGAGGUU(SEQ ID NO:24)
AACCUCUGCCUGAAAGCUGdTdT(SEQ ID NO:25)；
(12)所述核苷酸序列I包含与SEQ ID NO:26任选具有不多于3个(优选不多于1个)核苷酸差异的至少15个连续核苷酸，以及所述核苷酸序列II包含与SEQ ID NO:27任选具有不多于3个(优选不多于1个)核苷酸差异的至少15个连续核苷酸：
CUUUCAGGCAGAGGUUCCU(SEQ ID NO:26)
AGGAACCUCUGCCUGAAAGdTdT(SEQ ID NO:27)；
(13)所述核苷酸序列I包含与SEQ ID NO:28任选具有不多于3个(优选不多于1个)核苷酸差异的至少15个连续核苷酸，以及所述核苷酸序列II包含与SEQ ID NO:29任选具有不多于3个(优选不多于1个)核苷酸差异的至少15个连续核苷酸：
UUUCAGGCAGAGGUUCCUG(SEQ ID NO:28)
CAGGAACCUCUGCCUGAAAdTdT(SEQ ID NO:29)。
2.根据权利要求1所述siRNA或其盐，其中，所述siRNA具有选自以下组合的正义链和反义链组合：
3.根据权利要求1或2所述siRNA或其盐，其中，所述siRNA包含至少一个修饰的核苷酸和/或至少一个链间修饰，
优选地，正义链上全部的核苷酸是修饰的核苷酸，和/或反义链上全部的核苷酸是修饰的核苷酸，
更优选地，正义链和反义链的基本上全部的核苷酸是修饰的核苷酸，
还更优选地，正义链的全部核苷酸和反义链的全部核苷酸是修饰的核苷酸，特别地，所述修饰的核苷酸选自2’-F、2’-OME、2’-MOE、GNA、UNA、PNA、5’-VP修饰的核苷酸；所述链间修饰选自硫代磷酸(PS)修饰、甲基膦酸酯(MP)修饰、甲氧基丙基膦酸酯(MOP)修饰。
4.根据权利要求3所述的siRNA或其盐，其中：
所述修饰的siRNA的正义链为UmGfCmCfAmAfUmUfUmCfAmGfCmUfUmUfAmGfAm，反义链为UmCfUmAfAmAfGmCfUmGfAmAfAmUfUmGfGmCfAmdTsdT；或
所述修饰的siRNA的正义链为UmsGmsCmCmAmAmUfUfUfCmAmGmCmUmUmUmAmGmAm，其反义链为UmsCfsUmAmAfAfGfCmUmGmAmAmAmUfUmGfGmCmAmsGmsCm，
其中，小写字母m表示该字母m左侧相邻的一个核苷酸为2′-甲氧基修饰的核苷酸；小写字母f表示该字母f左侧相邻的一个核苷酸为2′-氟修饰的核苷酸；小写字母s表示与该字母s左右相邻的两个核苷酸之间的连接为硫代磷酸酯基连接。
5.一种组合物，所述组合物包含：根据权利要求1-5中任一项所述siRNA或其盐；和任选的化妆品或药品中可接受的载体。
6.根据权利要求5所述的组合物，其中，所述载体选自烃油、酯、高级脂肪酸和高级脂肪醇中的一种或几种。
7.根据权利要求5或6所述的组合物，其中，所述组合物还含有其他活性成分，所述其他活性成分包括选自熊果苷、烟酰胺、光甘草定、苯乙基间苯二酚、抗坏血酸、抗坏血酸葡糖苷、3-邻-乙基抗坏血酸、抗坏血酸磷酸酯镁、凝血酸、甲氧基水杨酸钾、红没药醇、美白植物成分中的一种或多种，优选地，所述美白植物成分主要包括油溶性甘草提取物、构树叶提取物、母菊花提取物。
8.根据权利要求5-7中任一项所述的组合物，其中，所述载体为递送运载体，优选递送运载体选自离子液体、脂质体、卡波姆、脂质纳米粒、透明质酸中的一种或多种，更优选离子液体，以通过所述递送运载体使得siRNA能够达到皮肤内或皮肤深层目标区域。
9.根据权利要求8所述组合物，其中，所述离子液体是基于胆碱的离子液体，特别地所述离子液体包含胆碱阳离子和峰王酸阴离子，更特别地，所述离子液体是胆碱-峰王酸离子液体。
10.权利要求1-4中任一项所述的siRNA或其盐，或者权利要求5-9中任一项所述的组合物在制备药物或化妆品中的用途，特别地，所述药物或化妆品具有选自以下效果中的至少一种：(1)抑制皮肤细胞中TYR的表达；(2)抑制或祛除黑色素生成和沉积；(3)具有美白效果。
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