CN120535601B

CN120535601B - 一种水稻淀粉合成相关的基因OsFLO17及其编码蛋白质和应用

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Publication number: CN120535601B
Application number: CN202511050617.9A
Authority: CN
Inventors: 万建民; 任玉龙; 于鸣洲; 吕瑛莉; 王益华; 刘世家; 王昕�; 王洁; 雷财林; 赵志超; 朱杉杉; 林启冰; 程治军; 郭秀平
Original assignee: Nanjing Agricultural University; Institute of Crop Sciences of CAAS
Current assignee: Nanjing Agricultural University; Institute of Crop Sciences of CAAS
Priority date: 2025-07-29
Filing date: 2025-07-29
Publication date: 2025-10-31
Anticipated expiration: 2045-07-29
Also published as: CN120535601A

Abstract

本发明公开了一种水稻淀粉合成相关的基因OsFLO17及其编码蛋白质和应用。本发明通过水稻胚乳粉质突变体flo17的表型分析和目标基因的初步定位，最终克隆得到淀粉合成相关的蛋白OsFLO17，该相关蛋白由SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列组成。本发明的淀粉颗粒发育相关蛋白影响水稻胚乳淀粉的合成过程，将所述蛋白的编码基因导入淀粉颗粒异常的植物中，可以得到淀粉填充正常的转基因植物。因此，本发明所述蛋白及其编码的基因可以应用于植物遗传改良。

Description

一种水稻淀粉合成相关的基因OsFLO17及其编码蛋白质和应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种水稻淀粉合成相关基因OsFLO17及其编码蛋白质和应用。

背景技术

水稻（Oryza sativa L.）是重要的粮食作物。随着经济增长与生活水平的提高，对优质稻米的需求日益增加。因此，在高产基础上提升稻米品质已成为我国水稻科学研究与产业发展的重要目标。

水稻胚乳是决定水稻产量和品质的关键组织。胚乳中淀粉含量约为80%，蛋白含量约为8%~10%，其余为脂肪、膳食纤维、维生素等。淀粉是水稻胚乳中的主要储藏物质，与水稻产量和品质直接相关。此外，胚乳中贮藏的淀粉是种子萌发和幼苗初期生长的核心供能物质，对水稻生长发育具有关键作用。因此，解析水稻淀粉合成的分子调控机制对稻米品质的遗传改良具有重要意义。

通过胚乳异常突变体克隆胚乳发育关键基因，是深入解析水稻籽粒品质形成的有效手段。经过长期的研究，科学家们已经对稻米储藏物质积累的调控网络有了一定的认识，但鉴于胚乳发育及其内部物质运输过程的复杂性，未来仍需开展更多深入研究以揭示其内在机制。

发明内容

本发明人从宁粳3号MNU诱变库中筛选得到粉质胚乳突变体flo17，克隆了造成该突变体淀粉合成和胚乳发育缺陷的基因OsFLO17。因此，本发明的目的在于提供一种水稻淀粉合成相关基因OsFLO17及其编码蛋白质和应用。

本发明提供的基因OsFLO17，其核苷酸序为如下1）或2）所示：

1）SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

2）SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

序列表中的SEQ ID NO.2，由3747个核苷酸组成。

本发明还提供上述基因OsFLO17编码的蛋白质。具体的，本发明提供的蛋白质，选自如（a）或（b）所示的任一种：

（a）由SEQ ID NO.3 所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（b）将SEQ ID NO.3 的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与淀粉合成相关的由SEQ ID NO.3衍生的蛋白质。序列表中的SEQ ID NO.3，由1248个氨基酸组成。

为了使（b）中的OsFLO17便于纯化，可在由SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1 标签的序列

上述（b）中的OsFLO17蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述（b）中的OsFLO17蛋白的编码基因可通过将SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5´端和/或3´端连上表1所示的标签的编码序列得到。

含有以上任一所述基因的重组表达载体也属于本发明的保护范围。

可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。

所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因（如大豆贮存蛋白基因）3’端转录的非翻译区均具有类似功能。

使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒（CAMV）35S启动子、玉米的泛素启动子（Ubiquitin），它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因（GUS基因、萤光素酶基因等）、具有抗性的抗生素标记物（庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等）或是抗化学试剂标记基因（如抗除莠剂基因）等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

所述重组过表达载体可为在限制性内切酶HindⅢ 和BamHⅠ双酶切载体pCAMBIA1390的重组位点插入所述基因（OsFLO17）得到的重组质粒。将含有OsFLO17的pCAMBIA1390命名为pCAMBIA1390-OsFLO17。所述pCAMBIA1390-OsFLO17是将由OsFLO17基因组编码序列连同上游2007 bp的启动子区和下游9671 bp的片段通过重组技术插入到pCAMBIA1390多克隆位点HindⅢ 和BamHⅠ之间得到的(Clontech公司，Infusion重组试剂盒)。

含有以上任一所述基因（OsFLO17）的表达盒、转基因细胞系及重组菌均属于本发明的保护范围。

本发明的另一个目的是提供一种水稻胚乳淀粉合成填充正常的转基因植物的方法。

本发明提供的培养水稻胚乳淀粉合成填充正常的转基因植物的方法，是将所述基因导入胚乳淀粉合成填充异常的植物中，得到胚乳淀粉合成填充正常的转基因植物；所述胚乳淀粉合成和填充正常的转基因植物为胚乳淀粉合成和填充正常能形成成熟透明胚乳的转基因植物。具体来说，所述基因通过所述重组表达载体导入胚乳淀粉合成填充异常植物中；所述胚乳淀粉合成填充异常植物可为flo17突变体。

所述蛋白、所述基因、所述重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌或所述方法均可应用于水稻育种。

利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将编码所述蛋白的基因导入植物细胞，可获转基因细胞系及转基因植株。携带有所述基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：烟草、百脉根、拟南芥、水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜宿等。

本发明的水稻淀粉合成相关蛋白影响水稻胚乳中淀粉的积累过程。将所述蛋白的编码基因导入水稻胚乳粉质的植物中，可以得到胚乳淀粉填充正常的转基因植物。因此，本发明所述蛋白及其编码基因可以应用于植物遗传改良。

附图说明

图1显示野生型宁粳3号和突变体flo17的外观表型。其中，a、c为宁粳3号干种子以及胚乳横切表型，b、d为突变体flo17干种子以及胚乳横切表型，e和f分别为宁粳3号和突变体flo17胚乳横切扫描电镜图片。

图2显示野生型宁粳3号和突变体flo17粒型性状测定和品质分析结果。其中，a为种子粒长、粒宽、粒厚测定，b、c、d、e、f为种子的总淀粉含量、直链淀粉含量、蔗糖含量、果糖含量、葡萄糖含量，g为淀粉链长分布，h为种子的淀粉黏滞性谱，即RVA谱。

图3显示野生型宁粳3号和突变体flo17发育胚乳的半薄切片观察结果。其中，a为野生型宁粳3号胚乳切片碘-碘化钾染色图，a1和a2为a图的区域放大图，b为突变体flo17碘-碘化钾染色图，b1和b2为b图的区域放大图。

图4显示突变基因的图位克隆。其中，a为flo17精细定位图，b为flo17克隆得到的基因及其突变位点；c为宁粳3号（WT）和转基因互补株系（L1，L2）干种子的横切面表型图；d为宁粳3号（WT）和转基因互补株系（L1，L2）胚乳横切面扫描电镜图片。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1、水稻淀粉合成相关位点及其编码基因的发现

一、水稻淀粉合成填充异常突变体flo17的表型分析

在粳稻品种宁粳3号的MNU化学诱变突变体库中筛选出籽粒粉质皱缩的突变株系flo17。野生型籽粒透明（见图1中a、c），而flo17则表现出籽粒粉质皱缩的表型（见图1中b、d）。flo17的胚乳是粉质且腹部凹陷，这说明基因突变影响了淀粉的填充，导致淀粉颗粒的结构和性质发生了变化，使胚乳在表观上表现出差异。对野生型和突变体flo17种子的横截面进行了扫描电镜观察，野生型种子横截面的淀粉粒规则整齐，排列比较紧密（见图1中e），而突变体flo17中心部分的淀粉颗粒排列松散，颗粒间存在大量空隙（见图1中f）。

对野生型和突变体flo17成熟种子的粒型性状进行考察。与野生型相比，flo17粒厚降低，粒长和粒宽没有显著差异（见图2中a）。种子的总淀粉和直链淀粉测定发现，flo17中胚乳总淀粉含量和直链淀粉含量明显下降（见图2中b、c）。与野生型成熟籽粒相比，flo17种子的蔗糖含量、果糖含量、葡萄糖含量显著升高（见图2中d、e、f）。

胚乳淀粉的链长分布显示突变体中短链淀粉明显增多，聚合度大于16的分支链含量显著减少（见图2中g）。测定野生型和突变体的稻米品质发现，突变体flo17的RVA谱（见图2中h）与野生型相比发生了巨大的变化。

对发育早期的胚乳进行了半薄切片观察，发现野生型的淀粉颗粒发育正常，大小均匀，造粉体的龟甲结构清晰（见图3中a、a1、a2）。而在突变体flo17中，可以看到发育异常的复合淀粉粒，多数淀粉粒小而松散，不规则（见图3中b、b1、b2）。由此可知，突变体由于FLO17基因突变导致了水稻胚乳淀粉填充异常，并且淀粉颗粒的发育也受到了影响，从而导致胚乳呈现粉质皱缩的表型。

二、突变基因位点的图位克隆

1、目标基因的初步定位

利用突变体flo17与籼稻品种N22杂交，在flo17/N22的F2分离群体中选取10粒flo17表型（籽粒粉质皱缩）的隐性极端个体，抽提种子DNA。利用覆盖水稻全基因组的分子标记进行连锁分析，将负责flo17突变体表型的突变基因定位在第2号染色体InDel标记Y1和Y2之间，区间在染色体长臂端，物理距离为0.82Mb。

2、目标基因的精细定位

据初定位结果，在InDel标记Y1和Y2之间寻找公共图谱上的分子标记，并依据NCBI公布的水稻基因组序列信息在此区间自行开发SSR标记（见表1）。将公共图谱的SSR标记与水稻基因组序列进行整合，下载突变位点附近的BAC/PAC克隆序列。用SSRHunter（李强等，遗传，2005，27(5):808-810）或SSRIT在线软件（http://archive.gramene.org/db/markers/ssrtool）搜索克隆中潜在的SSR序列（重复次数≥6）；将这些SSR及其邻近400～500bp的序列在NCBI通过BLAST程序在线与相应的籼稻序列进行比较，如果两者的SSR重复次数有差异，初步推断该SSR引物的PCR产物在籼、粳间存在多态性；再利用Primer Premier5.0软件设计SSR引物，并由上海英骏生物技术有限公司合成。将自行设计的SSR成对引物等比例混合，检测其在N22和宁粳3号之间的多态性，表现多态者用作精细定位的分子标记。利用1000个隐性极端个体对目标基因进行了精细定位（用于精细定位的分子标记见表2）。

表2用于精细定位的分子标记

最终将目标基因OsFLO17精细定位在标记Y5和Y6之间，物理距离为56kb（见图4中a）。经过对该区间内基因进行测序，发现第6个ORF的第7个外显子上存在单碱基的替换，使得目标蛋白翻译提前终止（图4中b）。

三、粉质基因OsFLO17的获得

提取粳稻品种宁粳3号叶片cDNA，以cDNA为模板，采用引物primer1和引物primer2进行PCR扩增，对扩增产物进行测序，测序结果如SEQ ID NO.2所示，其编码的蛋白质如SEQID NO.3所示。

primer1：5'-ATGATGTTCACGGAGGGGC-3'（SEQ ID NO.19）；

primer2：5'-TCAGTAATAGAAGCTAGAGTTC-3'（SEQ ID NO.20）。

将序列表的SEQ ID NO.3所示的蛋白质命名为OsFLO17蛋白，由1248个氨基酸残基组成。将编码OsFLO17蛋白的基因命名为OsFLO17基因，其开放阅读框如SEQ ID NO.2所示。

实施例2、OsFLO17蛋白及其编码基因的应用

一、重组表达载体构建（用HindⅢ和BamHⅠ酶切载体）

以宁粳3号（来自南京农业大学水稻所种质资源库）的基因组DNA为模板，进行PCR扩增获得OsFLO17基因，PCR引物序列如下：

primer3：5'-TCGGTGGAGCGTTCTTGATATTGTTTTGTACAGGT-3'（SEQ ID NO.21）；

primer4：5'-ATACTCCATGAACTTCGCCAGAATCTCTAGCATAGT-3'（SEQ ID NO.22）；

上述引物扩增产物包括该基因的全基因组和2007bp启动子区域（序列表中SEQ IDNO.1），采用INFUSION重组试剂盒（日本Takara公司）将PCR产物克隆到载体pCAMBIA1390（用HindⅢ和BamHⅠ酶切载体）中。Infusion重组反应体系(10μL)：PCR 产物1.0μL，pCAMBIA13906.0μL，5×infusion buffer 2.0μL，infusion enzyme mix 1μL。短暂离心后将混合体系50℃水浴20分钟，取2.5μL反应体系用热激法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞（北京Tiangen公司）。将全部转化细胞均匀涂布在含50mg/L卡那霉素的LB固体培养基上。37℃培养16h后，挑取克隆阳性克隆，进行测序。测序结果表明，得到了含有SEQ ID NO.1所示基因的重组表达载体，将含有OsFLO17的pCAMBIA1390命名为pCAMBIA1390-OsFLO17，OsFLO17基因片段利用Infusion重组试剂盒插入到该载体的HindIII和BamHI酶切位点之间。

二、重组农杆菌的获得

将pCAMBIA1390-OsFLO17转化农杆菌EHA105菌株（购自美国英俊公司），得到重组菌株，提取质粒进行PCR及酶切鉴定。将PCR及酶切鉴定正确的重组菌株命名为EH-pCAMBIA1390-OsFLO17。

三、转基因植物的获得

将EH-pCAMBIA1390-OsFLO17转化水稻造粉体发育异常的突变体flo17，具体方法为：

（1）28℃培养EH-pCAMBIA1390-OsFLO17 16小时，收集菌体，并稀释到N6液体培养基（Sigma公司，C1416）重悬并调整菌液OD_600nm为0.5；

（2）将培养至一个月的flo17（突变体）水稻成熟胚胚性愈伤组织与步骤（1）的菌液混合侵染30min，滤纸吸干菌液后转入共培养培养基（N6固体共培养培养基，Sigma公司）中，24℃共培养3天；

（3）将步骤（2）的愈伤接种在含有100mg/L潮霉素的N6固体筛选培养基上第一次筛选（16天）；

（4）挑取健康愈伤转入含有100mg/L潮霉素的N6固体筛选培养基上第二次筛选，每15天继代一次；

（5）挑取健康愈伤转入含有50mg/L潮霉素的N6固体筛选培养基上第三次筛选，每15天继代一次；

（6）挑取抗性愈伤转入分化培养基上分化；得到分化成苗的T₀代阳性植株。

四、转基因植株的鉴定

1、PCR 分子鉴定

本研究中利用潮霉素标记鉴定转基因植株。

标记分析的PCR反应体系：DNA(20ng/μL)2μL，Primer5(10pmoL/μL)2μL，Primer6(10pmol/μL)2μL，10xBuffer(MgCl₂ free)2μL，dNTP(10mM)0.4μL，MgCl₂(25mM)1.2μL，rTaq(5U/μL)0.4μL，ddH₂O 10μL，总体积20μL。

扩增反应在PCR仪上进行：94℃ 3min；94℃ 30 sec，56℃（引物不同，有所调整）30sec，72℃ 1.5min，34个循环；72℃ 5min。

PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析（1%的琼脂糖），根据条带有无，确定转基因阳性植株。

Primer5：5'-TAGGAGGGCGTGGATATGTC-3'（SEQ ID NO.23）；

Primer6：5'-TACACAGCCATCGGTCCAGA-3'（SEQ ID NO.24）。

2、表型鉴定

分别将T₀代转pCAMBIA1390-OsFLO17阳性植株、突变体flo17和宁粳3号种植在中国农业科学院转基因试验田内。种子成熟后，收取各材料种子，观察到pCAMBIA1390-OsFLO17植株的种子中出现了透明的种子（见图4中c、d）。因此证明flo17中的突变表型是由OsFLO17的突变造成的。pCAMBIA1390-OsFLO17可以使flo17株系的种子恢复透明的表型。

Claims

1.一种水稻淀粉合成相关的蛋白，或其编码基因，或含有所述编码基因的重组表达载体，或含有所述编码基因的重组菌在水稻育种中的应用；

所述的应用是在将由SEQ ID NO.2所示的基因突变导致的淀粉合成异常的水稻培育成淀粉合成正常的优良品质转基因植物中的应用；

所述水稻淀粉合成相关的蛋白是由SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：在所述水稻淀粉合成相关的蛋白的末端增加有标签序列，所述标签序列为Poly-Arg、Poly-His、FLAG、Strep-tag II或c-myc。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述编码基因的核苷酸序列如下1）或2）所示：

1）SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

2）SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述重组表达载体是在pCAMBIA1390载体的多克隆位点HindⅢ和BamHⅠ之间插入所述编码基因得到的重组质粒。

5.一种培育水稻淀粉合成通路正常的转基因水稻的方法，其特征在于：将水稻淀粉合成相关的蛋白的编码基因导入淀粉合成异常的水稻中，得到淀粉合成正常的转基因水稻；其中所述淀粉合成异常为胚乳填充不充分，且淀粉合成异常的水稻是由SEQ ID NO.2所示的基因突变导致的；

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述水稻淀粉合成相关的蛋白的编码基因的核苷酸序列如下1）或2）所示：

1）SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

2）SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述编码基因通过重组表达载体导入淀粉合成异常的水稻中。