CN120476312A - 猫的肾功能障碍的检查方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种用于检查猫的肾功能障碍的客观非侵入性方法。本发明的肾功能障碍的检查方法为检查猫的肾功能障碍的方法，且包括如下工序：对受验对象的尿测定选自D‑酪氨酸、D‑蛋氨酸、D‑色氨酸、D‑鸟氨酸及D‑组氨酸中的一种以上D‑氨基酸的水平。

Description

猫的肾功能障碍的检查方法

技术领域

本发明涉及一种使用尿中的D-氨基酸的猫的肾功能障碍的检查。

背景技术

猫由于原本于干燥地区进化而来，因此具有在肾脏高度浓缩尿的能力，是生来饮水量较少的动物。因此，猫特别容易发生由肾小管损伤引起的膀胱炎、尿路结石、尿道阻塞等泌尿系统症候群，进而容易发生肾衰竭等肾、泌尿系统疾病。进而，由于近年来干猫粮的普及，猫的水分摄取量不足的倾向进一步提高。水分摄取不足会增加年轻时患泌尿系统疾病、中老年时患肾病的风险，导致生活质量(QOL)下降。

先前，作为猫的肾功能下降的指标，测定血清中肌酸酐浓度或对称性二甲基精氨酸(SDMA)浓度。然而，直至肾功能丧失约75％时，血清中肌酸酐才会上升。另一方面，虽然SDMA在肾功能丧失40％的时间点开始上升，但不一定较肌酸酐更早显现出异常值，作为指标的可靠性不一定明确。另外，需要确立更简单且还能够现场监测的尿(非侵入)的指标，而非伴有压力或疼痛的血液(低侵入)。

另外，除甘氨酸以外的所有氨基酸存在D体及L体两种镜像异构物。随着近年来分析技术的进步引起的分离能力、灵敏度的提高，包括人类在内的哺乳类中的D-氨基酸的存在及其作用变得明确，也有报告称，血中或尿中的特定D-氨基酸含量与肾功能下降有关。例如，有报告(专利文献1、2)称，人血中的D-丝氨酸或D-丙氨酸可成为用于判定关键期肾损伤的标记。另外，有报告称，在肾功能下降的小鼠中，尿中的D-丝氨酸、D-组氨酸、D-天冬酰胺、D-精氨酸、D-别苏氨酸、D-谷氨酸、D-丙氨酸、D-脯氨酸、D-缬氨酸、D-别异亮氨酸、D-苯丙氨酸、D-赖氨酸的构成比率减少，这些可作为肾衰竭的早期诊断的指针(专利文献3)。另外，有报告称，在慢性肾病的狗、猫中，尿中的D-缬氨酸极度减少(非专利文献1)。

[专利文献1]国际公开第2020/080494号

[专利文献2]国际公开第2020/080488号

[专利文献3]日本专利第5740523号

[非专利文献1]宠物营养学会杂志，20(第19次大会号)，2017，47-48，池田等

发明内容

本发明涉及以下的1)～4)。

1)一种肾功能障碍的检查方法，其中，为检查猫的肾功能障碍的方法，且包括如下工序：对受验对象猫的尿测定选自D-酪氨酸、D-蛋氨酸、D-色氨酸、D-鸟氨酸及D-组氨酸中的一种以上D-氨基酸的水平。

2)一种对猫的肾功能障碍的预防或治疗性介入的效果的评估方法，其中，包括如下工序：在该介入的存在下，对受验对象猫的尿测定选自D-酪氨酸、D-蛋氨酸、D-色氨酸、D-鸟氨酸及D-组氨酸中的一种以上D-氨基酸的水平。

3)一种肾功能障碍的检查方法，其中，为检查猫的肾功能障碍的方法，且包括如下工序：通过使用D-氨基酸氧化酶的酶测定法，测定可通过该方法测定的受验对象猫的尿中的所有D-氨基酸的总浓度。

4)一种猫的肾功能障碍的检查用试剂盒，其中，为用于实施如1)至3)的方法的检查用试剂盒，且含有用于测定D-氨基酸的水平的试剂。

附图说明

图1-1为猫尿中的D-氨基酸浓度。

图1-2为猫尿中的D-氨基酸浓度。

图2-1为猫尿中的L-氨基酸浓度。

图2-2为猫尿中的L-氨基酸浓度。

图3-1为猫尿中的D-氨基酸的手性平衡。

图3-2为猫尿中的D-氨基酸的手性平衡。

图4为猫尿中的D-氨基酸及L-氨基酸的总浓度。

图5-1为猫尿中的D-氨基酸量与L-氨基酸量的比(D/L)。

图5-2为猫尿中的D-氨基酸量与L-氨基酸量的比(D/L)。

图5-3为猫尿中的D-氨基酸总浓度与L-氨基酸总浓度的比(D/L)。

图5-4为猫尿中的D-氨基酸总浓度的手性平衡。

图6为猫尿中的D-氨基酸(Tyr、Met、Trp、Orn及His)的总浓度。

图7-1为猫尿中的D-氨基酸的推移。

图7-2为猫尿中的D-氨基酸的推移。

图7-3为猫尿中的D-氨基酸的推移。

图8-1为通过酶法测得的猫尿中的D-氨基酸总浓度。

图8-2为通过酶法测得的猫尿中的D-氨基酸总浓度的手性平衡。

图8-3为通过酶法测得的猫尿中的D-氨基酸总浓度/尿中肌酸酐比。

图8-4为通过酶法测得的猫尿中的D-氨基酸总浓度/尿比重比。

具体实施方式

本发明涉及提供一种用于检查猫的肾功能障碍的客观非侵入性方法。

本发明人等鉴于该课题进行研究，结果发现在肾功能下降的猫中，尿中的特定D-氨基酸的存在量发生变化，从而能以该D-氨基酸水平为指标进行猫的肾功能障碍的有无或程度的评估、肾功能监测。

根据本发明的方法，可非侵入、客观且简便地检查猫的肾功能障碍的有无或程度，可确实地评估肾功能下降的早期变化。

本发明的猫的肾功能障碍的检查方法包括如下工序：对受验对象猫的尿测定选自D-酪氨酸、D-蛋氨酸、D-色氨酸、D-鸟氨酸及D-组氨酸中的一种以上D-氨基酸的水平。

在本发明中，“肾功能障碍”是指肾脏出现某种异常，肾脏功能发生损伤的状态，主要指猫容易罹患的慢性肾病。慢性肾病意味着肾脏的功能逐渐下降，导致肾衰竭的状态。

直到现在，猫的肾功能障碍是通过基于IRIS(International Renal InterestSociety，国际兽医肾病研究组)指南、物理辅助检查(色调、尿量、尿比重、pH值)、问诊的兽医综合判断来进行。尤其是，肾功能障碍的程度根据IRIS指南(2019年修正)，分类如下。

健康：血清肌酸酐值小于1.6(mg/dL)，或对称性二甲基精氨酸(SDMA)值小于14(μg/dL)。

阶段1(初期)：血清肌酸酐值小于1.6(mg/dL)，或对称性二甲基精氨酸(SDMA)值为14～17(μg/dL)。

阶段2(轻度)：血清肌酸酐值为1.6～2.8，或对称性二甲基精氨酸(SDMA)值为18～25。

阶段3(中度)：血清肌酸酐值为2.9～5.0，或对称性二甲基精氨酸(SDMA)值为26～38。

阶段4(重度)：血清肌酸酐值超过5.0，或对称性二甲基精氨酸(SDMA)值超过38。

在本发明中，“肾功能障碍的检查”包含肾功能障碍的有无、肾功能障碍的程度，优选为肾功能障碍的有无的检查。再者，本发明的肾功能障碍的检查当然包含定期进行的检查、或用于确认预防或治疗性介入效果的检查。

此处，“检查”也可用“测定”、“检测”、“判定”、“评估”或“评估辅助”这样的用语来表述。

在本发明中，受验对象猫并无特别限定，优选可例举：疑有肾功能障碍的猫、肾功能下降的猫、正在实施肾功能障碍的预防或治疗性介入的猫等。再者，作为猫，为猫科动物，即哺乳纲食肉目猫科动物，优选可例举猫亚科猫属的猫，其品种并无特别限定，优选为家猫、荒漠猫、丛林猫、利比亚野猫、沙猫、黑足猫、欧洲野猫，更优选为家猫(Felissilvestris catus)。

关于用作样本的猫尿的采集，其采集方法并无特别限定，只要于能够测定D-氨基酸的状态下采集即可，就测定精度的方面而言，优选为新鲜的尿。作为猫尿的采集方法，优选可例举自然采尿(包括使用宠物用便盆等)、导管、膀胱穿刺、压迫采尿，特别优选为不易对猫施加压力的自然采尿。

如下述实施例所示，猫尿中检测出所有20种D-氨基酸。其远远多于人类血液(4个分子种类左右)或尿(10个分子种类左右)、小鼠血液、尿(10个分子种类左右)、大鼠血液、尿(6个分子种类左右)。

即，可知除D-天冬酰胺(D-Asn)及D-天冬氨酸(D-Asp)以外的17种(D-苯丙氨酸(D-Phe)、D-蛋氨酸(D-Met)、D-谷氨酸(D-Glu)、D-亮氨酸(D-Leu)、D-苏氨酸(D-Thr)、D-色氨酸(D-Trp)、D-脯氨酸(D-Pro)、D-丝氨酸(D-Ser)、D-丙氨酸(D-Ala)、D-赖氨酸(D-Lys)、D-精氨酸(D-Arg)、D-酪氨酸(D-Tyr)、D-谷氨酰胺(D-Gln)、D-别异亮氨酸(D-aIle)、D-别苏氨酸(D-aThr)、D-鸟氨酸(D-Orn)、D-缬氨酸(D-Val))的手性平衡及该D-氨基酸与其L-氨基酸的量比(D/L)在肾病群中显著降低，D-组氨酸(D-His)的手性平衡与上述专利文献3中所报告的小鼠的情形不同，在肾病群中显著增加，确认到与肾功能障碍有关(图3-1、3-2)。其中，D-酪氨酸、D-蛋氨酸、D-色氨酸及D-鸟氨酸是在猫尿中明显检测出，但无法自其它哺乳类、例如人类或小鼠的尿检测出的猫特有的氨基酸。

因此，猫尿中的D-酪氨酸、D-蛋氨酸、D-色氨酸及D-鸟氨酸加上D-组氨酸的D-氨基酸是用于检查猫的肾功能障碍的特有标记分子，可通过测定选自这些中的一种以上的存在水平，而评估受验对象猫的肾功能障碍。

作为在本发明中测定的D-氨基酸的水平，对于选自D-酪氨酸、D-蛋氨酸、D-色氨酸、D-鸟氨酸及D-组氨酸的各D-氨基酸的各者，可为该氨基酸的浓度，例如优选为该D-氨基酸相对于L-氨基酸的量比(D-氨基酸量/L-氨基酸量)、该D-氨基酸的手性平衡(D-氨基酸量/(D-氨基酸量+L-氨基酸量)×100)等，更优选为手性平衡。

关于猫尿中的D-氨基酸的手性平衡，可除了测定选自该D-酪氨酸、D-蛋氨酸、D-色氨酸、D-鸟氨酸及D-组氨酸中的一种以上，优选为选自D-酪氨酸、D-色氨酸及D-鸟氨酸中的一种以上，更优选为选自D-酪氨酸及D-色氨酸中的一种以上D-氨基酸的手性平衡以外，进而组合测定选自D-苯丙氨酸、D-谷氨酸、D-苏氨酸、D-脯氨酸、D-丝氨酸、D-丙氨酸、D-赖氨酸、D-精氨酸、D-谷氨酰胺、D-别异亮氨酸、D-别苏氨酸、D-缬氨酸及D-亮氨酸中的一种以上，优选为选自D-苯丙氨酸、D-谷氨酸、D-苏氨酸、D-脯氨酸、D-丙氨酸、D-谷氨酰胺、D-别异亮氨酸及D-缬氨酸中的一种以上，更优选为选自D-苯丙氨酸、D-谷氨酸、D-丙氨酸、D-别异亮氨酸及D-缬氨酸中的一种以上D-氨基酸的手性平衡。

另外，关于猫尿中的D-氨基酸相对于L-氨基酸的量比(D/L)，优选为测定选自该D-酪氨酸、D-色氨酸、D-鸟氨酸及D-蛋氨酸中的一种以上，优选为选自D-酪氨酸、D-色氨酸及D-鸟氨酸中的一种以上，更优选为选自D-酪氨酸及D-色氨酸中的一种以上D-氨基酸相对于L-氨基酸的量比(D/L)，除此以外，可进而组合测定选自D-苯丙氨酸、D-谷氨酸、D-苏氨酸、D-脯氨酸、D-丝氨酸、D-丙氨酸、D-赖氨酸、D-精氨酸、D-谷氨酰胺、D-别异亮氨酸、D-别苏氨酸、D-缬氨酸及D-亮氨酸中的一种以上，优选为选自D-苯丙氨酸、D-谷氨酸、D-脯氨酸、D-苏氨酸、D-丙氨酸、D-谷氨酰胺、D-别异亮氨酸及D-缬氨酸中的一种以上，更优选为选自D-苯丙氨酸、D-谷氨酸、D-脯氨酸、D-丙氨酸、D-别异亮氨酸及D-缬氨酸中的一种以上D-氨基酸相对于L-氨基酸的量比(D/L)。

另外，关于猫尿中的D-氨基酸浓度，优选为测定选自该D-酪氨酸、D-蛋氨酸、D-色氨酸及D-鸟氨酸中的一种以上，优选为选自D-酪氨酸、D-色氨酸及D-鸟氨酸中的一种以上D-氨基酸的浓度，除此以外，可进而组合测定选自D-苯丙氨酸、D-谷氨酸、D-苏氨酸、D-脯氨酸、D-丝氨酸、D-丙氨酸、D-赖氨酸、D-精氨酸、D-谷氨酰胺、D-别异亮氨酸、D-别苏氨酸、D-缬氨酸、D-天冬酰胺及D-亮氨酸中的一种以上，优选为选自D-苯丙氨酸、D-谷氨酸、D-苏氨酸、D-脯氨酸、D-丝氨酸、D-丙氨酸、D-赖氨酸、D-精氨酸、D-谷氨酰胺、D-别异亮氨酸、D-别苏氨酸、D-缬氨酸及D-天冬酰胺中的一种以上，更优选为选自D-苯丙氨酸、D-谷氨酸、D-苏氨酸、D-丝氨酸、D-丙氨酸、D-赖氨酸、D-精氨酸、D-谷氨酰胺、D-别异亮氨酸、D-别苏氨酸、D-缬氨酸及D-天冬酰胺中的一种以上D-氨基酸的浓度。

进而，本发明中的D-氨基酸的水平的测定也可通过如下方式进行：测定由D-酪氨酸、D-蛋氨酸、D-色氨酸、D-鸟氨酸及D-组氨酸构成的5种D-氨基酸的总浓度，或上述5种D-氨基酸加上选自D-苯丙氨酸、D-谷氨酸、D-亮氨酸、D-苏氨酸、D-脯氨酸、D-丝氨酸、D-丙氨酸、D-赖氨酸、D-精氨酸、D-谷氨酰胺、D-别异亮氨酸、D-别苏氨酸、D-缬氨酸、D-天冬酰胺及D-天冬氨酸中的一种以上D-氨基酸的6种以上D-氨基酸的总浓度，优选为测定20种D-氨基酸(D-酪氨酸、D-蛋氨酸、D-色氨酸、D-鸟氨酸、D-组氨酸、D-苯丙氨酸、D-谷氨酸、D-亮氨酸、D-苏氨酸、D-脯氨酸、D-丝氨酸、D-丙氨酸、D-赖氨酸、D-精氨酸、D-谷氨酰胺、D-别异亮氨酸、D-别苏氨酸、D-缬氨酸、D-天冬酰胺、D-天冬氨酸)的总浓度。另外，包含上述6种以上D-氨基酸的猫尿中的D-氨基酸的总浓度也可为可通过以氨基酸为底物的酶反应而测定的所有D-氨基酸(除酸性氨基酸以外的所有D-氨基酸)的总浓度。

进而，也可算出该D-氨基酸的总浓度相对于L-氨基酸的总浓度的比(D-氨基酸的总浓度/L-氨基酸的总浓度)、或该D-氨基酸的总浓度的手性平衡(D-氨基酸的总浓度/(D-氨基酸的总浓度+L-氨基酸总浓度))，将这些作为本发明的D-氨基酸的水平。

另外，对于D-氨基酸的总浓度，也可进而算出该D-氨基酸的总浓度相对于尿比重的比(D-氨基酸的总浓度/尿比重)、或该D-氨基酸的总浓度相对于尿中肌酸酐浓度的比(D-氨基酸的总浓度/尿中肌酸酐浓度)，将这些作为本发明的D-氨基酸的水平。

在本发明中，关于D-氨基酸或L-氨基酸的测定，其方法并无限定，只要能够将尿中的D-氨基酸与L-氨基酸分离而进行测定即可，一般可采用分离定量方法，该分离定量方法使用将液相色谱法(LC)及质谱分析(MS)组合而成的LC-MS、LC-MS/MS等。另外，测定氨基酸总浓度时，也可使用：利用了使用以D-氨基酸为底物的D-氨基酸氧化酶、以L-氨基酸为底物的L-氨基酸氧化酶等的酶反应(比色、荧光、化学发光等)的定量方法(酶法)、或通过以酶为元件的生物传感器(电化学检测等)的生物传感方法，就简便性、迅速性的方面而言，更优选为酶法。

使用D或L-氨基酸氧化酶的酶测定法是如下方法，即，利用比色/荧光探针检测、测定于通过D或L-氨基酸氧化酶对D或L-氨基酸进行氧化脱氨基化时生成的过氧化氢；由此，可测定猫尿中除酸性氨基酸以外的所有D-氨基酸的总浓度或所有L-氨基酸的总浓度。

再者，在测定尿中的氨基酸时，优选为对在家中或医疗机关等中采集的尿(导管、膀胱穿刺、自然采尿等)进行冻结融解、离心分离、超滤、凝胶过滤、去除蛋白质、稀释、固相提取、液液分配、衍生化等用于分析的预处理。较理想为在用于酶测定法的预处理中不含本酶反应抑制物质。采集尿的输送形式包括常温～冷冻邮寄等，其方法并无限定。

作为手性氨基酸的分离方法，例如已知有：在使用4-氟-7-硝基-2,1,3-苯并噁二唑(NBD-F)试剂将氨基酸制成NBD衍生物之后，使用反向柱(第一维：分子种类分离)及具有担载有手性标识符的固定相的手性柱(第二维：手性分离)，通过二维液相色谱(LC)法进行的分离定量(J Chromatogr A.2010Feb 12；1217(7):1056-62.doi:10.1016/j.chroma.2009.09.002.Epub 2009Sep 6)；或使用一根反向柱(ODS柱)的一维LC法(AnalChim Acta.2015May 22；875:73-82.doi:10.1016/j.aca.2015.02.054.Epub 2015Feb23)；将氨基酸进行6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯(AQC)衍生化，使用一根手性柱的一维LC法(J Pharm Biomed Anal.2015Nov 10；115:123-9.doi:10.1016/j.jpba.2015.05.024.Epub 2015Jun 16)，除此以外，已知有在对氨基进行AQC衍生化之后，使用将具有弱阴离子交换型手性固定相的第一手性柱与具有两性离子交换型手性固定相的第二手性柱连接所得的液相色谱仪进行分离的方法(日本专利第6764778号公报)，优选为使用日本专利第6764778号公报的方法。

如此，通过将测得的D-氨基酸的水平与基准值进行比较，可对该受验对象猫的肾功能障碍进行评估。

此处，基准值例如可根据该D-氨基酸的水平与肾功能障碍的关联，以如下方式设定。

通过上述IRIS指南等方法对肾功能障碍进行评估。基于其评估结果，分为健康群及肾功能障碍群，上述健康群由判断无肾功能障碍(健康)的猫构成，上述肾功能障碍群由判断有肾功能障碍的猫构成。另外，通过上述方法测定本发明的D-氨基酸的水平。然后，基于肾功能障碍的评估结果与D-氨基酸的水平的相关性，确定适合评估肾功能障碍的基准值。具体而言，基于属于各群的D-氨基酸的水平的统计分析结果，确定表征各群的D-氨基酸的水平的数值范围。该数值范围通过设定为以各群的平均值为中心的上下的一定范围而确定。此处，“一定范围”可使用标准偏差(SD)等统计数值、或1/2SD值、1/3SD值等，也可为以各群的中央值为中心的上下的一定范围(第1四分位数或第3四分位数等)。

并且，例如，在由受验对象猫获得的尿中的本发明的D-氨基酸的水平属于肾功能障碍群的D-氨基酸的水平的范围内的情形时，该猫可评估“肾功能下降”、“有肾功能障碍”或“有肾功能障碍的可能性较高”。

另外，基准值可基于由统计分析获得的临界值确定。

作为临界值，例如可例示：生物指标算出值中的中央值或平均值、基于ROC曲线分析的值(例如使用约登指数(Youden's index)、区分有肾功能障碍的群及无肾功能障碍的群的判别式制作的ROC曲线中距左上角坐标(0,1)的距离值等)。临界值也可设定多个。例如，在以手性平衡为指标的情形时，设定如下述表2所示的进行ROC曲线分析而求出的临界值；在以D-氨基酸总浓度(5种、20种)为指标的情形时，设定如下述表3所示的进行ROC曲线分析而求出的临界值；在以D-氨基酸浓度为指标的情形时，设定如下述表4所示的进行ROC曲线分析而求出的临界值；在以D-氨基酸与L-氨基酸的量比(D/L)为指标的情形时，设定如下述表5所示的进行ROC曲线分析而求出的临界值；在以通过酶法测得的D-氨基酸总浓度为指标的情形时，设定如下述表8所示的进行ROC曲线分析而求出的临界值。

例如，在D-酪氨酸的手性平衡为0.55％以下，D-蛋氨酸的手性平衡为3.9％以下，D-色氨酸的手性平衡为0.10％以下，D-鸟氨酸的手性平衡为40％以下，D-组氨酸的手性平衡为2.2％以上，D-谷氨酸的手性平衡为4.8％以下，D-缬氨酸的手性平衡为8.9％以下，D-苯丙氨酸的手性平衡为0.52％以下，D-别异亮氨酸的手性平衡为9.8％以下，D-丙氨酸的手性平衡为43％以下，D-脯氨酸的手性平衡为5.5％以下，D-谷氨酰胺的手性平衡为1.2％以下，D-苏氨酸的手性平衡为0.91％以下，D-丝氨酸的手性平衡为71％以下，D-别苏氨酸的手性平衡为4.0％以下，D-精氨酸的手性平衡为3.0％以下，D-赖氨酸的手性平衡为20％以下，D-亮氨酸的手性平衡为0.16％以下的情形时，可评估“肾功能下降”、“有肾功能障碍”或“有肾功能障碍的可能性较高”。

另外，例如，在通过酶法测得的D-氨基酸总浓度为380.0μM以下，该D-氨基酸总浓度的手性平衡(通过酶法测得的D-氨基酸的总浓度/(通过酶法测得的D-氨基酸的总浓度+通过酶法测得的L-氨基酸的总浓度))为0.54％以下，该D-氨基酸总浓度相对于尿比重的比为350.0μM以下，该D-氨基酸总浓度相对于尿中肌酸酐浓度的比为1.84mmol/10g的Cre以下的情形时，可评估为“肾功能下降”、“有肾功能障碍”或“有肾功能障碍的可能性较高”。

如此，根据本发明的方法，可非侵入、简便且确实地评估受验对象猫有无肾功能障碍、肾功能障碍的状态或程度。

再者，本发明的检查方法可与除本发明以外的其它肾功能障碍的诊断指针组合使用，由此，可更多方面且更适当地评估肾功能障碍。

作为其它肾功能障碍的诊断指针，例如可例举：血中肌酸酐(Cre)、尿中肌酸酐、血中尿素氮(BUN)、血中对称性二甲基精氨酸(SDMA)、血中胱抑素C、尿中胱抑素C、尿中中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)、尿中L型脂肪酸结合蛋白(L-FABP)、尿蛋白、尿蛋白/肌酸酐比(UPC)、尿白蛋白等。另外，也可与使用特定采尿容器的简易尿比重评估方法(日本专利第7084128号公报)、尿颜色(日本专利第7216529号公报)、尿渗透压、各种电解质的区分排泄率、血压或影像检查等物理指标等组合。

本发明的检查方法可通过定期实施，追踪该D-氨基酸的水平的变动，而用于检测受验对象猫的肾功能障碍的推移。

另外，本发明的检查方法可通过在对猫的肾功能障碍的预防或治疗性介入的存在下实施，而用于评估该介入的效果。

即，本发明的介入效果的评估方法包括如下工序：在对猫的肾功能障碍的预防或治疗性介入的存在下，对受验对象猫的尿测定选自D-酪氨酸、D-蛋氨酸、D-色氨酸、D-鸟氨酸及D-组氨酸中的一种以上D-氨基酸的水平。

此处，对猫的肾功能障碍的预防或治疗性介入是对猫的肾功能障碍期待预防或治疗效果而实施的介入，包括化学介入、物理机械介入或膳食疗法。作为化学介入，可例举天然物质、合成物质、组合物等物质的给药，作为物理或机械介入，可例举透析等处理。作为膳食疗法，可例举低卡路里食品、低脂肪食品、维生素及矿物质量经调节的补充品、及低盐调节食品等的接种。

关于介入效果的评估，可基于由介入引起的受验对象猫的该D-氨基酸的水平进行评估。例如可例举通过将介入存在下的受验对象猫的该D-氨基酸的水平与对照(不存在介入下)进行比较，而对其效果进行评估。

本发明的猫的肾功能障碍的检查用试剂盒是用于实行本发明的猫的肾功能障碍的检查方法的试剂盒。因此，该试剂盒可含有采集猫尿所需的用具、用于保存猫尿或含有猫尿的砂或片材等的容器、用于测定一种以上D-氨基酸的水平的试剂、用于将D-氨基酸的水平与基准值进行比较的指标或导引等。

作为用于测定D-氨基酸的水平的试剂，可例举：以D或L-氨基酸为底物的酶(例如D或L-氨基酸氧化酶)、比色或荧光探针、及过氧化物酶。

关于上述实施方式，在本发明中进而公开以下方式。

＜1＞一种肾功能障碍的检查方法，其中，为检查猫的肾功能障碍的方法，且包括如下工序：对受验对象猫的尿测定选自D-酪氨酸、D-蛋氨酸、D-色氨酸、D-鸟氨酸及D-组氨酸中的一种以上D-氨基酸的水平。

＜2＞如＜1＞的方法，其中，进而测定选自D-苯丙氨酸、D-谷氨酸、D-亮氨酸、D-苏氨酸、D-脯氨酸、D-丝氨酸、D-丙氨酸、D-赖氨酸、D-精氨酸、D-谷氨酰胺、D-别异亮氨酸、D-别苏氨酸、D-缬氨酸、D-天冬酰胺及D-天冬氨酸中的一种以上D-氨基酸的水平。

＜3＞如＜1＞的方法，其中，测定D-氨基酸的水平的工序为测定选自D-酪氨酸、D-蛋氨酸、D-色氨酸、D-鸟氨酸及D-组氨酸中的一种以上D-氨基酸的手性平衡的工序。

＜4＞如＜3＞的方法，其中，进而包括如下工序：测定选自D-苯丙氨酸、D-谷氨酸、D-苏氨酸、D-脯氨酸、D-丝氨酸、D-丙氨酸、D-赖氨酸、D-精氨酸、D-谷氨酰胺、D-别异亮氨酸、D-别苏氨酸、D-缬氨酸及D-亮氨酸中的一种以上，优选为选自D-苯丙氨酸、D-谷氨酸、D-苏氨酸、D-脯氨酸、D-丙氨酸、D-谷氨酰胺、D-别异亮氨酸及D-缬氨酸中的一种以上，更优选为选自D-苯丙氨酸、D-谷氨酸、D-丙氨酸、D-别异亮氨酸及D-缬氨酸中的一种以上D-氨基酸的手性平衡。

＜5＞如＜1＞的方法，其中，测定D-氨基酸的水平的工序为测定选自D-酪氨酸、D-色氨酸、D-鸟氨酸及D-蛋氨酸中的一种以上D-氨基酸相对于L-氨基酸的量比的工序。

＜6＞如＜5＞的方法，其中，进而包括如下工序：测定选自D-苯丙氨酸、D-谷氨酸、D-苏氨酸、D-脯氨酸、D-丝氨酸、D-丙氨酸、D-赖氨酸、D-精氨酸、D-谷氨酰胺、D-别异亮氨酸、D-别苏氨酸、D-缬氨酸及D-亮氨酸中的一种以上，优选为选自D-苯丙氨酸、D-谷氨酸、D-脯氨酸、D-苏氨酸、D-丙氨酸、D-谷氨酰胺、D-别异亮氨酸及D-缬氨酸中的一种以上，更优选为选自D-苯丙氨酸、D-谷氨酸、D-脯氨酸、D-丙氨酸、D-别异亮氨酸及D-缬氨酸中的一种以上D-氨基酸相对于L-氨基酸的量比。

＜7＞如＜1＞的方法，其中，测定D-氨基酸的水平的工序为测定选自D-酪氨酸、D-蛋氨酸、D-色氨酸及D-鸟氨酸中的一种以上D-氨基酸的浓度的工序。

＜8＞如＜7＞的方法，其中，进而包括如下工序：测定选自D-苯丙氨酸、D-谷氨酸、D-苏氨酸、D-脯氨酸、D-丝氨酸、D-丙氨酸、D-赖氨酸、D-精氨酸、D-谷氨酰胺、D-别异亮氨酸、D-别苏氨酸、D-缬氨酸、D-天冬酰胺及D-亮氨酸中的一种以上，优选为选自D-苯丙氨酸、D-谷氨酸、D-苏氨酸、D-脯氨酸、D-丝氨酸、D-丙氨酸、D-赖氨酸、D-精氨酸、D-谷氨酰胺、D-别异亮氨酸、D-别苏氨酸、D-缬氨酸及D-天冬酰胺中的一种以上，更优选为选自D-苯丙氨酸、D-谷氨酸、D-苏氨酸、D-丝氨酸、D-丙氨酸、D-赖氨酸、D-精氨酸、D-谷氨酰胺、D-别异亮氨酸、D-别苏氨酸、D-缬氨酸及D-天冬酰胺中的一种以上D-氨基酸的浓度。

＜9＞如＜1＞的方法，其中，测定D-氨基酸的水平的工序包括如下工序：测定由D-酪氨酸、D-蛋氨酸、D-色氨酸、D-鸟氨酸及D-组氨酸构成的5种D-氨基酸的总浓度，或上述5种D-氨基酸加上选自D-苯丙氨酸、D-谷氨酸、D-亮氨酸、D-苏氨酸、D-脯氨酸、D-丝氨酸、D-丙氨酸、D-赖氨酸、D-精氨酸、D-谷氨酰胺、D-别异亮氨酸、D-别苏氨酸、D-缬氨酸、D-天冬酰胺及D-天冬氨酸中的一种以上D-氨基酸的6种以上D-氨基酸的总浓度。

＜10＞如＜9＞的方法，其中，进而包括算出上述D-氨基酸的总浓度相对于L-氨基酸的总浓度的比的工序。

＜11＞如＜9＞的方法，其中，进而包括算出上述D-氨基酸的总浓度的手性平衡的工序。

＜12＞如＜9＞至＜11＞中任一项的方法，其中，6种以上D-氨基酸的总浓度的测定是通过利用了以D-氨基酸为底物的酶反应的定量方法进行。

＜13＞一种对猫的肾功能障碍的预防或治疗性介入效果的评估方法，其中，包括如下工序：在该介入的存在下，对受验对象猫的尿测定选自D-酪氨酸、D-蛋氨酸、D-色氨酸、D-鸟氨酸及D-组氨酸中的一种以上D-氨基酸的水平。

＜14＞如＜13＞的方法，其中，进而测定选自D-苯丙氨酸、D-谷氨酸、D-亮氨酸、D-苏氨酸、D-脯氨酸、D-丝氨酸、D-丙氨酸、D-赖氨酸、D-精氨酸、D-谷氨酰胺、D-别异亮氨酸、D-别苏氨酸、D-缬氨酸、D-天冬酰胺及D-天冬氨酸中的一种以上D-氨基酸的水平。

＜15＞如＜13＞的方法，其中，测定D-氨基酸的水平的工序为测定选自D-酪氨酸、D-蛋氨酸、D-色氨酸、D-鸟氨酸及D-组氨酸中的一种以上D-氨基酸的手性平衡的工序。

＜16＞如＜15＞的方法，其中，进而包括如下工序：测定选自D-苯丙氨酸、D-谷氨酸、D-苏氨酸、D-脯氨酸、D-丝氨酸、D-丙氨酸、D-赖氨酸、D-精氨酸、D-谷氨酰胺、D-别异亮氨酸、D-别苏氨酸、D-缬氨酸及D-亮氨酸中的一种以上，优选为选自D-苯丙氨酸、D-谷氨酸、D-苏氨酸、D-脯氨酸、D-丙氨酸、D-谷氨酰胺、D-别异亮氨酸及D-缬氨酸中的一种以上，更优选为选自D-苯丙氨酸、D-谷氨酸、D-丙氨酸、D-别异亮氨酸及D-缬氨酸中的一种以上D-氨基酸的手性平衡。

＜17＞如＜13＞的方法，其中，测定D-氨基酸的水平的工序为测定选自D-酪氨酸、D-色氨酸、D-鸟氨酸及D-蛋氨酸中的一种以上D-氨基酸相对于L-氨基酸的量比的工序。

＜18＞如＜17＞的方法，其中，进而包括如下工序：测定选自D-苯丙氨酸、D-谷氨酸、D-苏氨酸、D-脯氨酸、D-丝氨酸、D-丙氨酸、D-赖氨酸、D-精氨酸、D-谷氨酰胺、D-别异亮氨酸、D-别苏氨酸、D-缬氨酸及D-亮氨酸中的一种以上，优选为选自D-苯丙氨酸、D-谷氨酸、D-脯氨酸、D-苏氨酸、D-丙氨酸、D-谷氨酰胺、D-别异亮氨酸及D-缬氨酸中的一种以上，更优选为选自D-苯丙氨酸、D-谷氨酸、D-脯氨酸、D-丙氨酸、D-别异亮氨酸及D-缬氨酸中的一种以上D-氨基酸相对于L-氨基酸的量比。

＜19＞如＜13＞的方法，其中，测定D-氨基酸的水平的工序为测定选自D-酪氨酸、D-蛋氨酸、D-色氨酸及D-鸟氨酸中的一种以上D-氨基酸的浓度的工序。

＜20＞如＜19＞的方法，其中，进而包括如下工序：测定选自D-苯丙氨酸、D-谷氨酸、D-苏氨酸、D-脯氨酸、D-丝氨酸、D-丙氨酸、D-赖氨酸、D-精氨酸、D-谷氨酰胺、D-别异亮氨酸、D-别苏氨酸、D-缬氨酸、D-天冬酰胺及D-亮氨酸中的一种以上，优选为选自D-苯丙氨酸、D-谷氨酸、D-苏氨酸、D-脯氨酸、D-丝氨酸、D-丙氨酸、D-赖氨酸、D-精氨酸、D-谷氨酰胺、D-别异亮氨酸、D-别苏氨酸、D-缬氨酸及D-天冬酰胺中的一种以上，更优选为选自D-苯丙氨酸、D-谷氨酸、D-苏氨酸、D-丝氨酸、D-丙氨酸、D-赖氨酸、D-精氨酸、D-谷氨酰胺、D-别异亮氨酸、D-别苏氨酸、D-缬氨酸及D-天冬酰胺中的一种以上D-氨基酸的浓度。

＜21＞如＜13＞的方法，其中，测定D-氨基酸的水平的工序包括如下工序：测定由D-酪氨酸、D-蛋氨酸、D-色氨酸、D-鸟氨酸及D-组氨酸构成的5种D-氨基酸的总浓度，或上述5种D-氨基酸加上选自D-苯丙氨酸、D-谷氨酸、D-亮氨酸、D-苏氨酸、D-脯氨酸、D-丝氨酸、D-丙氨酸、D-赖氨酸、D-精氨酸、D-谷氨酰胺、D-别异亮氨酸、D-别苏氨酸、D-缬氨酸、D-天冬酰胺及D-天冬氨酸中的一种以上D-氨基酸的6种以上D-氨基酸的总浓度。

＜22＞如＜21＞的方法，其中，进而包括算出上述D-氨基酸的总浓度相对于L-氨基酸的总浓度的比的工序。

＜23＞如＜21＞的方法，其中，进而包括算出上述D-氨基酸的总浓度的手性平衡的工序。

＜24＞一种肾功能障碍的检查方法，其中，为检查猫的肾功能障碍的方法，且包括如下工序：通过使用D-氨基酸氧化酶的酶测定法，测定可通过该方法测定的受验对象猫的尿中的所有D-氨基酸的总浓度。

＜25＞如＜24＞的方法，其中，进而包括算出上述D-氨基酸的总浓度相对于尿比重的比的工序。

＜26＞如＜24＞的方法，其中，进而包括算出上述D-氨基酸的总浓度相对于尿中肌酸酐浓度的比的工序。

＜27＞如＜24＞的方法，其中，进而包括如下工序：通过使用L-氨基酸氧化酶的酶测定法，测定上述受验对象猫的尿中的L-氨基酸的总浓度。

＜28＞如＜27＞的方法，其中，进而包括算出上述D-氨基酸的总浓度的手性平衡的工序。

＜29＞如＜27＞的方法，其中，进而包括算出上述D-氨基酸的总浓度相对于L-氨基酸的总浓度的比的工序。

＜30＞一种猫的肾功能障碍的检查用试剂盒，其中，用于实施如＜1＞至＜29＞的方法的检查用试剂盒，且含有用于测定D-氨基酸的水平的试剂。

＜31＞如＜30＞的试剂盒，其中，用于测定D-氨基酸的水平的试剂包含D-氨基酸氧化酶。

＜32＞如＜31＞的试剂盒，其中，进而含有比色或荧光探针、及过氧化物酶。

[实施例]

以下，示出实施例，对本发明更具体地进行说明。

试验例1罹患肾病的猫的尿中的手性氨基酸的同步分离解析

(1)关于猫试验

以健康群(N＝17)及肾功能下降群(N＝11，以下记载为肾病群)的猫(表1)为对象，进行肾功能及尿成分相关解析。再者，在采集尿之后，根据基于作为目前的标准的IRIS(International Renal Interest Society：国际兽医肾病研究组)指南、物理辅助检查(色调、尿量、尿比重、pH值)及兽医问诊的综合判断而进行分类。关于健康群及肾病群的分配，尤其是根据IRIS指南，将血中(血清)肌酸酐值为1.6(mg/dL)以上或对称性二甲基精氨酸(SDMA)值为18(μg/dL)以上的个体视为肾病群(相当于阶段2)。

[表1]

(2)试样溶液及标准品的制备

将猫尿(自然采尿)10μL放入至10mL尖底玻璃管(Spitch Glass)(商品名：强化硬质螺口试管)中，混合甲醇:水(9:1，v/v)溶液490μL之后，利用离心机(HITACHI制造/CF5RE)，于冷藏(4℃)下以2130×g(3000rpm)进行5分钟的离心分离而去除蛋白质，采集上清液的氨基酸。接着，另外于10mL尖底玻璃管中依次混合0.2mol/L的硼酸缓冲液(pH值8.9)、采集溶液、AccQ·Tag Ultra衍生化试剂即AQC溶液(AdipoGen制造：将AQC粉末以3mg/1mL、即10mmol/L的浓度溶解于超脱水乙腈中)各70μL、10μL、20μL(7:1:2)，立即进行搅拌，之后于55℃下加热10分钟，由此制备衍生化试样溶液。

同样地，依次混合0.2mol/L的硼酸缓冲液(pH值8.9)、100μmol/L的D、L-氨基酸标准溶液(氨基酸：Ala/丙氨酸、Arg/精氨酸、Asn/天冬酰胺、Asp/天冬氨酸、Cys/半胱氨酸、Gln/谷氨酰胺、Glu/谷氨酸、Gly/甘氨酸、His/组氨酸、Ile/异亮氨酸、allo-Ile/别异亮氨酸、Leu/亮氨酸、Lys/赖氨酸、Met/蛋氨酸、Phe/苯丙氨酸、Pro/脯氨酸、Ser/丝氨酸、Thr/苏氨酸、allo-Thr/别苏氨酸、Trp/色氨酸、Tyr/酪氨酸、Val/缬氨酸、Cit/瓜氨酸、Orn/鸟氨酸溶解于0.2mol/L的硼酸缓冲液中)、AQC溶液各70μL、10μL、20μL(7:1:2)，立即进行搅拌，之后于55℃下加热10分钟，由此制备衍生化氨基酸标准溶液。

(3)LC-MS/MS分析

在下述条件下(依据日本专利第6764778号)，对(2)中制备的衍生化试样溶液及衍生化氨基酸标准溶液进行LC-MS/MS分析，进行各种手性氨基酸的分离检测及定量。

(装置)

Exion LC系列(AB SCIEX公司)、质谱分析仪/QTRAP6500⁺线性离子阱型(AB SCIEX公司)

(色谱分离)

分离手性柱：将2.1mm内径×150mm、粒径5μm的CHIRALPAK QN-AX＜DAICEL公司＞(第一手性柱)、及3.0mm内径×150mm、粒径3μm的CHIRALP AK ZWIX(+)＜DAICEL公司＞(第二手性柱)依次串联连接(40℃)

洗脱液：0.1％(v/v)的甲酸、及55mM含甲酸铵的甲醇:水(90:10，v/v)溶液

洗脱法：等度洗脱

流动相流速：0.25mL/min

进样量：5μL

(质谱分析)

离子化法：电喷雾电离法(ESI)

极性：正离子

气帘气(CUR)：30psi

离子喷雾电压(IS)：4500V

温度(TEM)：600℃

离子源气体1(GS1)：80psi

离子源气体1(GS2)：80psi

碰撞气体(CAD)：10

(检测模式)

通过设定质子离子附加分子([M+H]⁺)为前体离子，设定AQC碎片离子(m/z＝171)为产物离子的正离子模式进行SRM(Selected Reaction Monitoring，选择反应监测)检测。

(4)数据解析

1)手性氨基酸的解析

将(3)中获得的数据展开为具有保留时间及离子强度两个轴的色谱图，对猫尿中的AQC衍生化的各种手性氨基酸进行解析。测定健康群及肾病群中的尿中手性氨基酸浓度(将D-氨基酸(DAA)：D-Pro、D-Ser、D-Ala、D-Lys、D-Arg、D-His、D-Tyr、D-Gln、D-allo-Ile(aIle)、D-Thr、D-allo-Thr(aThr)、D-Orn、D-Val、D-Phe、D-Met、D-Glu、D-Asp、D-Asn、D-Leu、D-Trp的测定值示于图1-1及图1-2。另外，将L-氨基酸(LAA)：L-Pro、L-Ser、L-Ala、L-Lys、L-Arg、L-His、L-Tyr、L-Gln、L-Ile、L-Thr、L-Orn、L-Val、L-Phe、L-Met、L-Glu、L-Asp、L-Asn、L-Leu、L-Trp)的测定值示于图2-1及图2-2)。

并且，将由这些尿中手性氨基酸浓度算出的各手性平衡(D体存在比率：D/(D+L)×100(％))示于图3-1及图3-2。

可知除D-Asn及D-Asp以外的17种(D-Phe、D-Met、D-Glu、D-Leu、D-Thr、D-Trp、D-Pro、D-Ser、D-Ala、D-Lys、D-Arg、D-Tyr、D-Gln、D-allo-Ile(aIle)、D-allo-Thr(aThr)、D-Orn、D-Val)的手性平衡在肾病群中显著降低，D-His的手性平衡在肾病群中显著增加，确认到与肾功能有关。其中，D-Tyr、D-Met、D-Trp、D-Orn是在猫尿中明显检测出的猫尿特有的氨基酸。

进而，将DAA或LAA总浓度示于图4，将各D/L示于图5-1、5-2，将总浓度的D/L示于图5-3，将总浓度的手性平衡(D体存在比率：D/(D+L)×100(％))示于图5-4。除上述各手性平衡及浓度以外，总浓度、各DAA与LAA的量比(D/L)也在肾病群与健康群中确认到有显著差异(D-Phe、D-Glu、D-Thr、D-Trp、D-Pro、D-Ser、D-Ala、D-Tyr、D-Gln、D-aIle、D-aThr、D-Orn、D-Val)，由DAA与LAA的总浓度比(D/L)及总浓度算出的手性平衡也确认到显著降低，显示可用作肾功能障碍的指标。再者，仅提取出D-Tyr、D-Met、D-Trp、D-Orn及D-His的总浓度也示于图6。同样地，在肾病群中确认到显著的降低。

2)有用性验证

使用excel统计处理软件(BellCurve for Excel，Social Survey ResearchInformation株式会社)，描绘健康群对肾病群(手性平衡、总浓度、D-氨基酸浓度、D-氨基酸与L-氨基酸的量比(D/L)的ROC(Receiver Operating Characteristic，受试者工作特征曲线)曲线，分别算出临界点(Cut off)、ROC曲线下面积(AUC)、灵敏度(Sensitivity)、特异度(Specificity)、p值(诊断能力)(表2：各手性平衡，表3：总浓度，表4：D-氨基酸浓度，表5：D-氨基酸与L-氨基酸的量比(D/L))。再者，临界点设为最靠近左上角的点，在将零假设(NullHypothesis)设为AUC＝0.50时的检验中，确认到在手性平衡、(总)浓度、D-氨基酸与L-氨基酸的量比(D/L)方面具有显著的结果，具有诊断能力。也检测出许多AUC为0.90以上的DAA分子种类。发现简易的总浓度(DAA(D-Tyr、D-Trp、D-Orn、D-Met、D-His)；DAA(全部)：D-Pro、D-Ser、D-Ala、D-Lys、D-Arg、D-His、D-Tyr、D-Gln、D-aIle、D-Thr、D-aThr、D-Orn、D-Val、D-Phe、D-Met、D-Glu、D-Asp、D-Asn、D-Leu、D-Trp；LAA(全部)：L-Pro、L-Ser、L-Ala、L-Lys、L-Arg、L-His、L-Tyr、L-Gln、L-Ile、L-Thr、L-Orn、L-Val、L-Phe、L-Met、L-Glu、L-Asp、L-Asn、L-Leu、L-Trp)也可用于肾功能评估，确认到尿中手性氨基酸(尤其是尿中DAA)的有用性。

[表2]

健康群(N＝17)vs肾病群(N＝11)

[表3]

健康群(N＝17)vs肾病群(N＝11)

[表4]

健康群(N＝17)vs肾病群(N＝11)

[表5]

健康群(N＝17)vs肾病群(N＝11)试验例2猫尿中的D-氨基酸的经时推移

对于下述表6所示的病例1～3，以与试验例1同样的方式进行肾功能及尿成分相关解析(猫种类(1)：阿比西尼亚猫(去势3～6岁)于2019年9月的血液检查中诊断为阶段2的肾病，猫种类(2)：暹罗猫(3～4岁)于2020年11月的血液检查中诊断为阶段2的肾病，猫种类(3)：孟加拉猫(去势4～7岁)于2016年11月的血液检查中诊断为阶段2的肾病)。

在经时变化中，即，不仅在横向研究中，而且在纵向研究中，也确认到尿中手性平衡(例如D-His、D-aIle、D-Val等)及尿中DAA浓度(总浓度)与肾功能有关，再次确认到在肾功能的非侵入评估、非侵入监测中有用(图7-1、7-2、7-3)。尿中DAA是能够精密地评估以各个体为对象的肾病情严重度(病情)、超早期风险的肾监测指标。

[表6]

试验例3通过酶法的猫尿中D,L-氨基酸解析

(1)关于猫试验

以健康群(N＝14)及肾功能下降群(N＝4，以下记载为肾病群)的猫为对象(表7)，进行肾功能及尿成分相关解析。

与试验例1同样地，在采集尿之后，根据基于作为目前的标准的IRIS(International Renal Interest Society：国际兽医肾病研究组)指南及兽医问诊的综合判断而进行分类。作为猫尿辅助检查，也一并测定pH值(株式会社堀场制作所公司制造，小型pH计，LAQUAtwin)、尿比重(USG)(株式会社Atago公司制造，PAL-狗猫尿比重计)、尿中肌酸酐浓度(CRE)(Arkray株式会社制造，尿化学分析装置thinka RT-4010)。

[表7]

(2)猫尿中D-氨基酸(DAA)总浓度测定

校准曲线的制作及定量值的算出

依据D-氨基酸分析试剂盒(MET-5136，Colorimetric，Cell Biolabs公司制造)操作说明。描绘在使用时制备试剂盒内置标准品(D-丙氨酸)的0、1.56、3.13、6.25、12.5、25、50、100μM的校准曲线，测定猫尿中的D-氨基酸总浓度(除酸性氨基酸以外的所有D-氨基酸)。

具体而言，将猫尿10μL放入至10mL尖底玻璃管(商品名：强化硬质螺口试管)中，混合试剂盒内置分析缓冲液(缓冲液)90μL之后，利用离心机(HITACHI制造/CF5RE)，在冷藏(4℃)下以2130×g(3000rpm)进行5分钟离心分离而去除蛋白质，采集上清液的氨基酸。接着，将上述在使用时制备的标准液50μL及猫尿50μL分别添加至96孔微孔板(No.655801，Greiner bio-one公司制造)中。接着，向各者中添加试剂盒内置酶反应液(比色探针、HRP、D-氨基酸氧化酶混合液)50μL，立即在遮光下进行混合，之后于37℃下保温1小时(D-氨基酸氧化酶(DAO)反应)。最终，使用酶标仪(SH-9000Lab，Corona Electric株式会社制造)，测定酶反应液中的DAA总浓度(波长570nm)。

(3)猫尿中L-氨基酸(LAA)总浓度测定

校准曲线的制作及定量值的算出

依据L-氨基酸分析试剂盒(MET-5054，Colorimetric，Cell Biolabs公司制造)操作说明。描绘在使用时制备试剂盒内置标准品(L-丙氨酸)的0、62.5、125、250、500、1000μM的校准曲线，测定猫尿中的所有L-氨基酸总浓度。

具体而言，将猫尿10μL放入至10mL尖底玻璃管(商品名：强化硬质螺口试管)中，混合试剂盒内置分析缓冲液(缓冲液)990μL之后，利用离心机(HITACHI制造/CF5RE)，于冷藏(4℃)下以2130×g(3000rpm)进行5分钟离心分离而去除蛋白质，采集上清液的氨基酸。接着，将上述在使用时制备的标准液50μL及猫尿50μL分别添加至96孔微孔板(No.655801，Greiner bio-one公司制造)中。接着，向各者中添加试剂盒内置酶反应液(比色探针、HRP、L-氨基酸氧化酶混合液)50μL，立即在遮光下进行混合，之后于37℃下保温3小时(L-氨基酸氧化酶(LAO)反应)。

最终，使用酶标仪(SH-9000Lab，Corona Electric株式会社制造)，测定酶反应液中的LAA总浓度(波长570nm)。

(4)数据解析

1)猫尿中DAA相关指标的解析

示出健康群及肾病群的通过酶法测得的DAA总浓度、总浓度的手性平衡(D体存在比率：通过酶法测得的DAA总浓度/(通过酶法测得的DAA总浓度+通过酶法测得的LAA总浓度)×100(％)，具有与总浓度比(通过酶法测得的DAA总浓度/通过酶法测得的LAA总浓度)相同的关联性)、通过酶法测得的DAA总浓度/尿中CRE浓度比及通过酶法测得的DAA总浓度/USG比(图8-1、8-2、8-3、8-4)。

2)有用性验证

使用excel统计处理软件(BellCurve for Excel，Social Survey ResearchInformation株式会社)，描绘健康群对肾病群(猫尿中DAA相关指标)的ROC(ReceiverOperating Characteristic)曲线，分别算出临界点(Cut off)、ROC曲线下面积(AUC)、灵敏度(Sensitivity)、特异度(Specificity)、p值(诊断能力)(表8)。再者，临界点设为最靠近左上角的点，在将零假设设为AUC＝0.50时的检验中，确认到猫尿中DAA相关指标具有诊断能力。发现通过酶法所得的DAA总浓度及其相关比率尤其是在肾功能评估中有用。

[表8]

健康群(N＝14)vs肾病群(N＝4)

Claims (27)

1.一种肾功能障碍的检查方法，其中，

为检查猫的肾功能障碍的方法，且包括如下工序：对受验对象猫的尿测定选自D-酪氨酸、D-蛋氨酸、D-色氨酸、D-鸟氨酸及D-组氨酸中的一种以上D-氨基酸的水平。

2.如权利要求1所述的方法，其中，

进而测定选自D-苯丙氨酸、D-谷氨酸、D-亮氨酸、D-苏氨酸、D-脯氨酸、D-丝氨酸、D-丙氨酸、D-赖氨酸、D-精氨酸、D-谷氨酰胺、D-别异亮氨酸、D-别苏氨酸、D-缬氨酸、D-天冬酰胺及D-天冬氨酸中的一种以上D-氨基酸的水平。

3.如权利要求1所述的方法，其中，

测定D-氨基酸的水平的工序为测定选自D-酪氨酸、D-蛋氨酸、D-色氨酸、D-鸟氨酸及D-组氨酸中的一种以上D-氨基酸的手性平衡的工序。

4.如权利要求3所述的方法，其中，

进而包括如下工序：测定选自D-苯丙氨酸、D-谷氨酸、D-苏氨酸、D-脯氨酸、D-丝氨酸、D-丙氨酸、D-赖氨酸、D-精氨酸、D-谷氨酰胺、D-别异亮氨酸、D-别苏氨酸、D-缬氨酸及D-亮氨酸中的一种以上D-氨基酸的手性平衡。

5.如权利要求1所述的方法，其中，

测定D-氨基酸的水平的工序为测定选自D-酪氨酸、D-色氨酸、D-鸟氨酸及D-蛋氨酸中的一种以上D-氨基酸相对于L-氨基酸的量比的工序。

6.如权利要求5所述的方法，其中，

进而包括如下工序：测定选自D-苯丙氨酸、D-谷氨酸、D-苏氨酸、D-脯氨酸、D-丝氨酸、D-丙氨酸、D-赖氨酸、D-精氨酸、D-谷氨酰胺、D-别异亮氨酸、D-别苏氨酸、D-缬氨酸及D-亮氨酸中的一种以上D-氨基酸相对于L-氨基酸的量比。

7.如权利要求1所述的方法，其中，

测定D-氨基酸的水平的工序为测定选自D-酪氨酸、D-蛋氨酸、D-色氨酸及D-鸟氨酸中的一种以上D-氨基酸的浓度的工序。

8.如权利要求7所述的方法，其中，

进而包括如下工序：测定选自D-苯丙氨酸、D-谷氨酸、D-苏氨酸、D-脯氨酸、D-丝氨酸、D-丙氨酸、D-赖氨酸、D-精氨酸、D-谷氨酰胺、D-别异亮氨酸、D-别苏氨酸、D-缬氨酸、D-天冬酰胺及D-亮氨酸中的一种以上D-氨基酸的浓度。

9.如权利要求1所述的方法，其中，

测定D-氨基酸的水平的工序包括如下工序：测定由D-酪氨酸、D-蛋氨酸、D-色氨酸、D-鸟氨酸及D-组氨酸构成的5种D-氨基酸的总浓度，或测定所述5种D-氨基酸加上选自D-苯丙氨酸、D-谷氨酸、D-亮氨酸、D-苏氨酸、D-脯氨酸、D-丝氨酸、D-丙氨酸、D-赖氨酸、D-精氨酸、D-谷氨酰胺、D-别异亮氨酸、D-别苏氨酸、D-缬氨酸、D-天冬酰胺及D-天冬氨酸中的一种以上D-氨基酸的6种以上D-氨基酸的总浓度。

10.如权利要求9所述的方法，其中，

进而包括算出所述D-氨基酸的总浓度相对于L-氨基酸的总浓度的比的工序。

11.如权利要求9所述的方法，其中，

进而包括算出所述D-氨基酸的总浓度的手性平衡的工序。

12.一种对猫的肾功能障碍的预防或治疗性介入的效果的评估方法，其中，

包括如下工序：在该介入的存在下，对受验对象猫的尿测定选自D-酪氨酸、D-蛋氨酸、D-色氨酸、D-鸟氨酸及D-组氨酸中的一种以上D-氨基酸的水平。

13.如权利要求12所述的方法，其中，

测定D-氨基酸的水平的工序为测定选自D-酪氨酸、D-蛋氨酸、D-色氨酸、D-鸟氨酸及D-组氨酸中的一种以上D-氨基酸的手性平衡的工序。

14.如权利要求12所述的方法，其中，

测定D-氨基酸的水平的工序为测定选自D-酪氨酸、D-色氨酸、D-鸟氨酸及D-蛋氨酸中的一种以上D-氨基酸相对于L-氨基酸的量比的工序。

15.如权利要求12所述的方法，其中，

测定D-氨基酸的水平的工序为测定选自D-酪氨酸、D-蛋氨酸、D-色氨酸及D-鸟氨酸中的一种以上D-氨基酸的浓度的工序。

16.如权利要求12所述的方法，其中，

测定D-氨基酸的水平的工序包括如下工序：测定由D-酪氨酸、D-蛋氨酸、D-色氨酸、D-鸟氨酸及D-组氨酸构成的5种D-氨基酸的总浓度，或测定所述5种D-氨基酸加上选自D-苯丙氨酸、D-谷氨酸、D-亮氨酸、D-苏氨酸、D-脯氨酸、D-丝氨酸、D-丙氨酸、D-赖氨酸、D-精氨酸、D-谷氨酰胺、D-别异亮氨酸、D-别苏氨酸、D-缬氨酸、D-天冬酰胺及D-天冬氨酸中的一种以上D-氨基酸的6种以上D-氨基酸的总浓度。

17.如权利要求16所述的方法，其中，

进而包括算出所述D-氨基酸的总浓度相对于L-氨基酸的总浓度的比的工序。

18.如权利要求16所述的方法，其中，

进而包括算出所述D-氨基酸的总浓度的手性平衡的工序。

19.一种肾功能障碍的检查方法，其中，

为检查猫的肾功能障碍的方法，且包括如下工序：通过使用D-氨基酸氧化酶的酶测定法，测定可通过该方法测定的受验对象猫的尿中的所有D-氨基酸的总浓度。

20.如权利要求19所述的方法，其中，

进而包括算出所述D-氨基酸的总浓度相对于尿比重的比的工序。

21.如权利要求19所述的方法，其中，

进而包括算出所述D-氨基酸的总浓度相对于尿中肌酸酐浓度的比的工序。

22.如权利要求19所述的方法，其中，

进而包括如下工序：测定可通过使用L-氨基酸氧化酶的酶测定法测定的所述受验对象猫的尿中的所有L-氨基酸的总浓度。

23.如权利要求22所述的方法，其中，

进而包括算出所述D-氨基酸的总浓度的手性平衡的工序。

24.如权利要求22所述的方法，其中，

进而包括算出所述D-氨基酸的总浓度相对于L-氨基酸的总浓度的比的工序。

25.一种猫的肾功能障碍的检查用试剂盒，其中，

为用于实施权利要求1～24中任一项所述的方法的检查用试剂盒，且含有用于测定D-氨基酸水平的试剂。

26.如权利要求25所述的试剂盒，其中，

用于测定D-氨基酸水平的试剂包含D-氨基酸氧化酶。

27.如权利要求26所述的试剂盒，其中，

进而含有比色探针或荧光探针、及过氧化物酶。