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CN120475977A - Car-t细胞、组合物及改善免疫细胞疗法的方法 - Google Patents

Car-t细胞、组合物及改善免疫细胞疗法的方法

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CN120475977A
CN120475977A CN202380090681.2A CN202380090681A CN120475977A CN 120475977 A CN120475977 A CN 120475977A CN 202380090681 A CN202380090681 A CN 202380090681A CN 120475977 A CN120475977 A CN 120475977A
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CN
China
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seq
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variable region
cell
variant
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Application number
CN202380090681.2A
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李烈涛
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Sino Biotech Pte Ltd
Original Assignee
Sino Biotech Pte Ltd
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Publication date
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Abstract

本公开涉及用于改善免疫细胞疗法的组合物；以及所述组合物单独或与免疫细胞组合用于细胞疗法(尤其是用于治疗癌症)的用途。本公开还涉及结合疱疹病毒抗原的嵌合抗原受体(CAR)和CAR‑T细胞。

Description

CAR-T细胞、组合物及改善免疫细胞疗法的方法
技术领域
本发明涉及用于改善免疫细胞疗法的组合物；以及用于细胞疗法的CAR和包含所述CAR的免疫细胞。本发明还涉及所述组合物或包含所述CAR的免疫细胞单独或在组合疗法中作为药物的用途，尤其用于治疗癌症。
背景技术
近年来，癌症治疗取得了进展。免疫细胞疗法的应用就是进展之一，该疗法利用患者的免疫反应来治疗癌症。这类免疫细胞疗法治疗方法包括使用基于细胞的免疫疗法，即利用免疫系统的细胞进行治疗性治疗。免疫系统细胞，例如T细胞和其他免疫细胞，可以被修饰以靶向肿瘤抗原。
嵌合抗原受体(CAR)修饰的T细胞(CART)疗法的最新进展依赖于将T细胞重定向到癌细胞上合适的细胞表面分子，在利用免疫系统的力量治疗癌症方面显示出良好的效果(例如参见Sadelain等人，Cancer Discovery 3:388-398(2013))。最值得注意的是，CD19特异性CAR(CD19CAR)T细胞疗法已取得显著效果，包括B细胞恶性肿瘤的长期缓解(例如Maude,Frey等人，2014)。尽管CAR疗法在B细胞白血病和淋巴瘤等血液系统癌症中取得了成功，但在实体瘤中仅取得了有限的成功。
虽然利用免疫细胞如T细胞的细胞疗法为癌症治疗提供了新的模式，但人们发现此类疗法的有效性存在局限性，尤其是在实体瘤治疗中。例如，癌细胞可以适应并产生免疫抑制微环境，从而保护所述细胞免受免疫识别和清除。这种微环境对涉及刺激免疫反应的治疗方法(包括靶向T细胞疗法等免疫治疗方法)提出了挑战。
鉴于对改进癌症治疗策略的持续需求，人们迫切需要改进基于细胞的免疫疗法，特别是CART疗法的新组合物和新方法。
发明内容
本公开提供了用于改善免疫细胞疗法的组合物。所述组合物可用于引发、诱导、增强和/或加强免疫反应，所述免疫反应可以是免疫细胞疗法介导的先天性和/或适应性免疫反应。在一些实施方案中，所述免疫细胞是表达嵌合抗原受体(CAR)分子的免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)，例如，结合肿瘤抗原(例如，在实体瘤或血液系统肿瘤表面表达的抗原)的CAR分子。
在一些方面，本公开涉及一种免疫原性组合物，其包含：(a)聚肌苷酸-聚胞苷酸(PIC)，(b)稳定剂，其为氨基糖苷类抗生素(优选卡那霉素)或非氨基糖苷类胺，(c)至少一种阳离子，如钙离子。在一些实施方案中，所述组合物还包含至少一种免疫原或抗原，其中所述免疫原或抗原是重组蛋白、病毒样颗粒(VLP)、肽、mRNA或疫苗。所述免疫原性组合物可用于诱导个体中免疫反应的激活和/或增强，例如用于癌症治疗的免疫细胞疗法(优选CAR-T细胞疗法)的免疫反应。所述免疫原性组合物可与工程化免疫细胞(例如CAR-T细胞或工程化TCR-T细胞)组合用于治疗癌症。在一些实例中，所述免疫原性组合物包含聚肌苷酸-聚胞苷酸、卡那霉素、钙和EB病毒(EBV)的VLP疫苗。在一些实例中，所述免疫原性组合物将与工程化免疫细胞(优选CAR-T细胞，更优选靶向EBV相关癌症的CAR-T细胞)组合施用(同时或依次)。
另一方面，本发明涉及包含EB病毒(EBV)VLP的免疫原性组合物。在一些实例中，所述VLP包含糖蛋白350/220(gp350)或其片段，任选地，其中所述VLP包含一个、两个、三个或更多个多肽序列，所述多肽序列与选自SEQ ID NO:102至117的多肽序列至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一。在一个优选实施方案中，所述VLP包含一个、两个、三个、四个或更多个选自gp350、BKRF4、BVRF1、BDLF3、BZLF2,BXLF2,BNRF1、BALF4和BZLF1的EBV蛋白；或其功能变体，其与本文所述的多肽序列至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一。在另一优选实施方案中，所述VLP包含gp350、BKRF4、BVRF1、BDLF3、BZLF2、BXLF2、BNRF1、BALF4和BZLF1的EBV蛋白；或其功能变体，其与本文所述的多肽序列至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一。在一些优选实施方案中，所述VLP不包含LMP1、EBNA2、EBNA3a、EBNA3b和EBNA3c。所述免疫原性组合物可用于诱导个体中免疫反应的激活和/或增强，例如用于癌症治疗的免疫细胞疗法(优选CAR-T细胞疗法)的免疫反应。所述免疫原性组合物可与工程化免疫细胞(例如CAR-T细胞或工程化TCR-T细胞)组合用于治疗癌症。在一些具体实例中，所述免疫原性组合物将与工程化免疫细胞(优选CAR-T细胞，更优选靶向EBV相关癌症的CAR-T细胞，甚至更优选结合糖蛋白350/220(gp350)蛋白的CAR-T细胞)组合施用(同时或依次)。
在另一方面，本公开提供了CAR或包含所述CAR的免疫细胞(优选CAR-T细胞)，其中所述CAR包含EBV糖蛋白350/220抗原结合结构域，其中所述抗原结合结构域包含重链可变区和/或轻链可变区，所述重链可变区具有与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、138、139或140中任一项至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的多肽序列，所述轻链可变区具有与SEQ ID NO:6、7、8、9、10、141、142或143中任一项至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的多肽序列。在一些实例中，结合EBV gp350/220的抗原结合结构域包含重链互补决定区1(HCDR1)、HCDR2、HCDR3，轻链互补决定区1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3，具有如下多肽序列：
(1)SEQ ID NO:11、12、13、26、27和28，分别地；
(2)SEQ ID NO:14、15、16、29、30和31，分别地；
(3)SEQ ID NO:17、18、19、32、33和34，分别地；
(4)SEQ ID NO:20、21、22、35、36和37，分别地；或
(5)SEQ ID NO:23、24、25、38、39和40，分别地；或
EBV糖蛋白350/220抗原结合结构域，其与其竞争或结合至与本文所述的CAR的抗原结合结构域(1)至(5)中的任一项所结合的EBV糖蛋白350/220中的表位相同的表位。
在一些实例中，所述EBV糖蛋白350/220抗原结合结构域包含以下任一项：
(1)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:1的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:6的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；
(2)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:2的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:7的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；
(3)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:3的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:8的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；
(4)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:4的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:9的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；
(5)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:5的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:10的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；
(6)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:138的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:141的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；
(7)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:138的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:142的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；
(8)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:138的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:143的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；
(9)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:139的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:141的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；
(10)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:139的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:142的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；
(12)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:139的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:143的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；
(13)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:140的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:141的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；
(14)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:140的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID No:142的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；或
(15)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:140的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:143的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体。
在一些方面，本公开提供：
[1]一种免疫原性组合物，其包含:
(a)聚肌苷酸-聚胞苷酸(PIC)；
(b)稳定剂，其为氨基糖苷类抗生素或非氨基糖苷类胺；
(c)至少一种阳离子；和
(d)任选地免疫原，其中所述免疫原是重组蛋白、病毒样颗粒(VLP)、肽、mRNA或疫苗。
[1A]一种包含EB病毒(EBV)的VLP的免疫原性组合物，优选地，所述VLP包含糖蛋白350/220(gp350)蛋白或其片段，任选地，其中所述VLP包含一个、两个、三个或更多个多肽序列，所述多肽序列与选自SEQ ID NO:102至117的多肽序列至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一。
[1B][1A]的组合物，其中VLP包含选自gp350、BKRF4、BVRF1、BDLF3、BZLF2、BXLF2、BNRF1、BALF4和BZLF1的一种、两种、三种、四种或更多种EBV蛋白；或其功能变体，其与本文所述的多肽序列至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一。
[1C][1A]的组合物，其中VLP包含gp350、BKRF4、BVRF1、BDLF3、BZLF2、BXLF2、BNRF1、BALF4和BZLF1的EBV蛋白；或其功能变体，其与本文所述的多肽序列至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一。
[1D][1A]至[1C]中任一项的组合物，其中VLP不包含LMP1、EBNA2、EBNA3a、EBNA3b和EBNA3c。
[1E][1A]的组合物，其中VLP包含(i)至少一种EBV结构多肽，(ii)至少一种EBV裂解多肽，(iii)膜脂，其中优选地所述VLP具有以下一种或多种特性：
(a)缺乏EBV DNA；
(b)B细胞转化所需的一种或多种EBV的B细胞转化能力被失活或去除，同时保留其免疫原性；和/或
(c)所述EBV不包含B细胞转化所需的一种或多种EBV多肽，所述EBV多肽选自LMP1、EBNA2、EBNA3a、EBNA3b和EBNA3c。
[2]根据[1]至[1E]中任一项的组合物，其用于癌症治疗。
[2A]根据[1]至[1E]中任一项的组合物，其用于诱导免疫反应，其中优选地所述免疫反应是CAR-T细胞针对肿瘤细胞的免疫反应。
[3]根据[1]至[2A]中任一项所述的组合物在制造用于癌症治疗的药物中的用途。
[4]根据[2]至[3]中任一项的组合物或用途，其中所述癌症治疗是免疫细胞疗法(优选CAR-T细胞疗法)，并且任选地所述组合物增强细胞疗法的抗癌效果。
[5]根据[2]至[4]中任一项的组合物或用途，用于与工程化的免疫细胞(优选CAR-T细胞或工程化的TCR-T细胞)组合使用，用于癌症治疗，其中任选地，所述免疫原性组合物在免疫细胞之前、之后或同时施用于受试者。
[6]根据[1]至[5]中任一项的组合物或用途，其中所述免疫原是肿瘤相关抗原、过敏原、与病毒相关的抗原或其片段。
[6A]根据[1]至[5]中任一项的组合物或用途，其中所述免疫原是重组蛋白、病毒样颗粒(VLP)、肽、mRNA、DNA、疫苗或树突状细胞疫苗。
[6B]根据[1]至[5]中任一项的组合物或用途，其中所述免疫原是病毒样颗粒(VLP)。
[6C]根据[6B]的组合物或用途，其中所述免疫原是EB病毒(EBV)的VLP，优选地所述VLP包含糖蛋白350/220(gp350)蛋白或其片段。
[6D]根据[6B]的组合物或用途，其中所述VLP还包含选自SEQ ID NO:102至117的一个、两个、三个或更多个蛋白质序列。
[7]根据[1]至[6D]中任一项的组合物或用途，其中所述稳定剂为氨基糖苷类抗生素，其选自卡那霉素、链霉素、双氢链霉素、甘露糖苷链霉素、阿米卡星、阿米卡星、地贝卡星、Vietomycin、庆大霉素及其任意组合；且优选地所述稳定剂为卡那霉素。
[7A]根据[1]至[7]中任一项的组合物或用途，其中所述组合物包含0.5mg/ml至10mg/ml的PIC。
[7B]根据[1]至[7A]中任一项的组合物或用途，其中所述PIC的分子量范围为约66,000至2,000,000道尔顿。
[7C]根据[1]至[7A]中任一项的组合物或用途，其中所述PIC的分子量范围为约300,000至1,200,000道尔顿或大小范围为约6.4至24.0斯维德伯格。
[7D]根据[1]至[7A]中任一项的组合物或用途，其中所述PIC的分子量范围为约66,000至660,000道尔顿或分子大小范围为约6.4至18.3斯维德伯格。
[7E]根据[1]至[7A]中任一项的组合物或用途，其中所述PIC的分子量范围为约300,000至660,000道尔顿或分子大小范围为约12.8至18.3斯维德伯格。
[7F]根据[1]至[7A]中任一项的组合物或用途，其中所述PIC具有等于或大于150,000道尔顿的平均分子量或等于或大于9.3斯维德伯格的平均分子大小。
[7G]根据[1]至[7A]中任一项的组合物或用途，其中所述PIC具有等于或大于250,000道尔顿的平均分子量或等于或大于11.8斯维德伯格的平均分子大小。
[7H]根据[1]至[7A]中任一项的组合物或用途，其中所述PIC具有等于或大于350,000道尔顿的平均分子量或等于或大于15.3斯维德伯格的平均分子大小。
[8]根据[1]至[6B]中任一项的组合物或用途，其中所述稳定剂是非氨基糖苷类胺，其选自聚乙二醇单甲醚、聚乙二醇、聚乙烯亚胺、叶酸、半乳糖、聚赖氨酸、鱼精蛋白、壳寡糖、壳聚糖、精胺、葡萄糖胺及其任意组合；优选地，所述稳定剂为聚赖氨酸、几丁质、壳聚糖或葡萄糖胺；更优选地，所述稳定剂为ε-聚赖氨酸、己基葡萄糖胺或乙酰葡萄糖胺。
[9]根据[1]至[8]中任一项的组合物或用途，其中所述阳离子选自钙、镉、锂、镁、铈、铯、铬、钴、氘、镓、碘、铁、锌及其任意组合；并且优选地所述阳离子为钙。
[10]根据[1]至[9]中任一项的组合物或用途，其中所述免疫细胞是表达CAR的T细胞，所述CAR包含胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域，其中胞外结构域包含特异性结合癌症表面表达的抗原的抗原结合结构域，其中优选地所述抗原结合结构域是scFv结构域。
[11]根据[1]的组合物或用途，其中所述胞内结构域包含至少一个共刺激结构域。
[12]根据[11]的组合物或用途，其中所述共刺激结构域是以下项或其任意组合的信号传导区：CD28、OX-40、4-1BB/CD137、CD2、CD7、CD27、CD30、CD40、程序性死亡-1(PD-1)、可诱导T细胞共刺激分子(ICOS)、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1(CD11a/CD18)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD247、CD276(B7-H3)、LIGHT(TNFSF14)、NKG2C、Igα(CD79a)、DAP-10、Fcγ受体、MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白、细胞因子受体、整合素、信号淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)、活化NK细胞受体、BTLA(一种Toll配体的受体)、ICAM-1、B7-H3、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAMI(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(触觉)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、与CD83特异性结合的配体。
[13]根据[12]的组合物或用途，其中所述共刺激结构域包含4-1BB/CD137的信号传导区。
[14]根据[12]的组合物或用途，其中所述共刺激结构域包含CD28的信号传导区。
[15]根据[11]至[14]中任一项的组合物或用途，其中所述CAR包含两个或更多个共刺激结构域。
[16]根据[15]的组合物或用途，其中所述CAR包含两个共刺激结构域，两个共刺激结构域之一为CD28，并且另一个共刺激结构域选自4-1BB/CD137或OX40。
[17]根据[10]至[16]中任一项的组合物或用途，其中所述CAR的胞内结构域包含至少一个激活结构域。
[18]根据[17]的组合物或用途，其中所述激活结构域包含CD3，优选地所述CD3为CD3ζ。
[19]根据[4]至[9]中任一项的组合物或用途，其中所述免疫细胞是T细胞、自然杀伤(NK)细胞、TCR表达细胞、树突状细胞、γδT细胞或NK-T细胞。
[20]根据[1]至[19]中任一项的组合物或用途，其中所述细胞是自体T细胞。
[21]根据[4]至[19]中任一项的组合物或用途，其中所述细胞是同种异体T细胞。
[22]根据[4]至[19]中任一项的组合物或用途，其中所述细胞被工程化以表达至少一种细胞因子。
[23]根据[22]的组合物或用途，其中所述至少一种细胞因子是选自由IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-15/IL-15sushi、IL-15/IL-15sushi anchor、IL-18、IL-21、GM-CSF和TGF-β中的至少一种。
[24]根据[4]至[19]中任一项的组合物或用途，其中所述细胞被工程化以进一步表达至少一种趋化因子。
[25]根据[24]的组合物或用途，其中所述至少一种趋化因子选自CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL19、CXCL1、CXCL2、CXCL9、CXCL10、CCL21和CXCL12。
[25A]根据[5]至[25]中任一项的组合物、用途或方法，其中所述细胞包含CAR，所述CAR包含结合EBV gp350/220的抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含如表1和表2所提供的重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，或如表1和表2所提供的特定VH和VL组合。
[25B]根据[5]至[25]中任一项的组合物、用途或方法，其中所述细胞包含CAR，所述CAR包含结合EBV gp350/220的抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含如表3和表4所提供的一个、两个、三个或更多个HCDR和/或一个、两个、三个或更多个LCDR，或如表3和表4所提供的特定的HCDR1-3和LCDR1-3组合。
[25C]根据[5]至[25]中任一项的组合物、用途或方法，其中所述细胞包含CAR，所述CAR包含如表5所提供的CAR氨基酸序列中的任一项。
[25D]根据[5]至[25]中任一项的组合物、用途或方法，其中所述细胞包含CAR，所述CAR包含结合EBV gp350/220的抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含重链互补决定区1(HCDR1)、HCDR2、HCDR3，轻链互补决定区1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3，具有以下多肽序列：
(1)SEQ ID NO:11、12、13、26、27和28，分别地；
(2)SEQ ID NO:14、15、16、29、30和31，分别地；
(3)SEQ ID NO:17、18、19、32、33和34，分别地；
(4)SEQ ID NO:20、21、22、35、36和37，分别地；
(5)SEQ ID NO:23、24、25、38、39和40，分别地；
(6)SEQ ID NO:118、119、120、121、122和123，分别地；或
(7)SEQ ID NO:124、125、126、127、128和129，分别地。
[25E]根据[5]至[25]中任一项的组合物、用途或方法，其中所述细胞包含CAR，所述CAR包含结合EBV gp350/220的抗原结合结构域，其中所述抗原结合结构域是这样的抗原结合结构域，其与其竞争或结合与[25D]中描述的CAR的抗原结合结构域(1)至(5)中的任一项结合的EB病毒(EBV)糖蛋白350/220中的表位相同的表位。
[25F]根据[5]至[25]中任一项的组合物、用途或方法，其中所述细胞包含CAR，所述CAR包含结合EBV gp350/220的抗原结合结构域，其中所述抗原结合结构域包含重链可变区和/或轻链可变区，所述重链可变区具有与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、138、139或140中任一项至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的多肽序列，所述轻链可变区具有与SEQ ID NO:6、7、8、9、10、141、142或143中任一项至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的多肽序列。
[25G]根据[5]至[25]中任一项的组合物、用途或方法，其中所述细胞包含CAR，所述CAR包含结合EBV gp350/220的抗原结合结构域，其中所述抗原结合结构域包含以下任一项：
(1)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:1的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:6的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；
(2)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:2的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:7的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；
(3)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:3的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:8的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；
(4)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:4的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:9的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；
(5)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:5的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:10的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；
(6)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:138的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:141的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；
(7)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:138的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:142的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；
(8)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:138的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:143的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；
(9)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:139的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:141的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；
(10)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:139的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:142的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；
(12)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:139的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:143的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；
(13)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:140的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:141的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；
(14)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:140的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:142的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；
(15)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:140的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:143的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；
(16)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:130的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:131的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；或
(17)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:132的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:133的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体。
在一些方面，本公开涉及：
[26]增强个体中免疫细胞疗法的抗癌反应的方法，该方法包括施用有效量的上述[1]至[25G]中任一项的免疫原性组合物至所述个体。
在一些方面，本公开涉及：
[27]治疗患有癌症个体的方法，该方法包括：
(a)施用有效量的上述[1]至[9]中任一项所述的免疫原性组合物至所述个体；并且
(b)施用有效量的上述[10]至[25G]中任一项所述的细胞至所述个体；其中任选地，所述免疫原性组合物在免疫细胞之前、之后或同时施用于受试者。
在一些进一步的方面，本公开涉及：
[28]EB病毒(EBV)的VLP，其用于癌症治疗，其中所述VLP与工程化的免疫细胞(优选CAR-T细胞或工程化的TCR-T细胞)在癌症治疗中组合施用，其中任选地，所述VLP在免疫细胞之前、之后或同时施用于受试者。
[29]用于[28]的VLP，其中所述VLP包含糖蛋白350/220(gp350)蛋白或其片段，其中优选地所述VLP还包含选自SEQ ID NO:102至117的一个、两个、三个或更多个蛋白质序列。
[30]用于[28]或[29]的VLP，其中所述免疫细胞是表达CAR的T细胞，所述CAR包含胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域，其中胞外结构域包含特异性结合癌症表面表达的抗原的抗原结合结构域，其中优选地所述抗原结合结构域是scFv结构域。
[31]用于[30]的VLP，其中所述CAR的胞内结构域包含至少一个共刺激结构域。
[32]用于[30]或[31]的VLP，其中所述共刺激结构域是以下项或其任意组合的信号传导区：CD28、OX-40、4-1BB/CD137、CD2、CD7、CD27、CD30、CD40、程序性死亡-1(PD-1)、可诱导T细胞共刺激分子(ICOS)、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1(CD11a/CD18)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD247、CD276(B7-H3)、LIGHT(TNFSF14)、NKG2C、Igα(CD79a)、DAP-10、Fcγ受体、MHCI类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白、细胞因子受体、整合素、信号淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)、活化NK细胞受体、BTLA(一种Toll配体的受体)、ICAM-1、B7-H3、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAMI(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(触觉)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、与CD83特异性结合的配体。
[33]用于[32]的VLP，其中所述共刺激结构域包含4-1BB/CD137的信号传导区。
[34]根据[32]使用的VLP，其中所述共刺激结构域包含CD28的信号传导区。
[35]根据[30]至[34]中任一项使用的VLP，其中所述CAR包含两个或更多个共刺激结构域。
[36]根据[35]使用的VLP，其中所述CAR包含两个共刺激结构域，两个共刺激结构域之一是CD28，并且另一个共刺激结构域选自4-1BB/CD137或OX40。
[37].根据[30]-[36]中任一项使用的VLP，其中所述CAR的胞内结构域包含至少一个激活结构域。
[38].根据[37]使用的VLP，其中所述激活结构域包含CD3，优选地所述CD3是CD3ζ。
[39].根据[34]至[38]中任一项使用的VLP，其中所述免疫细胞是T细胞、自然杀伤(NK)细胞、TCR表达细胞、树突状细胞、γδT细胞或NK-T细胞，优选地，所述免疫细胞是CAR-T细胞。
[40]根据[28]至[39]中任一项使用的VLP，其中所述癌症是EBV相关癌症，选自淋巴组织增殖性疾病(LPD)，例如B细胞淋巴瘤，包括伯基特淋巴瘤(BL)、霍奇金淋巴瘤(HL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、T细胞淋巴瘤、NK/T细胞淋巴瘤，或移植后淋巴组织增殖性疾病(PTLD)，或上皮癌(鼻咽癌、肺癌、乳腺癌)、淋巴上皮瘤、伴有淋巴样间质的癌(GCLS，例如胃癌)或胶质瘤。
[41]根据[28]至[40]中任一项使用的VLP，其中所述通过CAR识别的抗原是EB病毒抗原(EBV抗原)，其中优选地所述EBV抗原是EBV糖蛋白350/220(gp350/220)。
[42]根据[28]至[41]中任一项使用的VLP，其中所述细胞包含CAR，所述CAR包含结合EBV gp350/220的抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含如表1和表2所提供的重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，或如表1和表2所提供的特定VH和VL组合。
[43].根据[28]至[42]中任一项使用的VLP，其中所述细胞包含CAR，所述CAR包含结合EBV gp350/220的抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含如表3和表4所提供的一个、两个、三个或更多个HCDR和/或一个、两个、三个或更多个LCDR，或如表3和表4所提供的特定的HCDR1-3和LCDR1-3组合。
[44]根据[28]至[43]中任一项使用的VLP，其中所述细胞包含CAR，所述CAR包含如表5中提供的CAR氨基酸序列中的任一项。
[45]根据[28]至[43]中任一项使用的VLP，其中所述细胞包含CAR，所述CAR包含结合EBV gp350/220蛋白的抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含重链互补决定区1(HCDR1)、HCDR2、HCDR3，轻链互补决定区1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3，具有以下多肽序列：
(1)SEQ ID NO:11、12、13、26、27和28，分别地；
(2)SEQ ID NO:14、15、16、29、30和31，分别地；
(3)SEQ ID NO:17、18、19、32、33和34，分别地；
(4)SEQ ID NO:20、21、22、35、36和37，分别地；
(5)SEQ ID NO:23、24、25、38、39和40，分别地；
(6)SEQ ID NO:118、119、120、121、122和123，分别地；或
(7)SEQ ID NO:124、125、126、127、128和129，分别地。
[46]根据[28]至[43]中任一项使用的VLP，其中所述细胞包含CAR，所述CAR包含结合EBV gp350/220的抗原结合结构域，其中所述抗原结合结构域是这样的抗原结合结构域，其与其竞争或结合与[45]中描述的CAR的抗原结合结构域(1)至(5)中的任一项结合的EB病毒(EBV)抗原糖蛋白350/220中的表位相同的表位。
[47]根据[28]至[43]中任一项使用的VLP，其中所述细胞包含CAR，所述CAR包含结合EBV gp350/220的抗原结合结构域，其中所述抗原结合结构域包含重链可变区和/或轻链可变区，所述重链可变区具有与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、138、139或140中任一项至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的多肽序列，所述轻链可变区具有与SEQ ID NO:6、7、8、9、10、141、142或143中任一项至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的多肽序列。
[48]根据[28]至[43]中任一项使用的VLP，其中所述细胞包含CAR，所述CAR包含结合EBV gp350/220蛋白的抗原结合结构域，其中所述抗原结合结构域包含以下任一项：
(1)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:1的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:6的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；
(2)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:2的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:7的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；
(3)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:3的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:8的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；
(4)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:4的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:9的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；
(5)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:5的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:10的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；
(6)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:138的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:141的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；
(7)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:138的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:142的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；
(8)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:138的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:143的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；
(9)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:139的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:141的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；
(10)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:139的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:142的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；
(12)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:139的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:143的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；
(13)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:140的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:141的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；
(14)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:140的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:142的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；
(15)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:140的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:143的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；
(16)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:130的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:131的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；或
(17)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:132的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:133的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体。
在一些其他的方面，本公开提供了CAR，或包含CAR的免疫细胞(优选CAR-T细胞)，其中所述CAR包含EBV糖蛋白350/220抗原结合结构域，所述结构域包含如表1和表2所提供的重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，或如表1和表2所提供的特定的VH和VL组合。
在一些其他的方面，本公开提供了CAR，或包含CAR的CAR-T细胞，其中所述CAR包含EBV糖蛋白350/220抗原结合结构域，所述结构域包含如表3和表4所提供的一个、两个、三个或更多个HCDR和/或一个、两个、三个或更多个LCDR，或如表3和表4所提供的特定的HCDR1-3和LCDR1-3组合。
在一些其他的方面，本公开提供了CAR，或包含CAR的免疫细胞(优选CAR-T细胞)，所述CAR包含如表5所提供的CAR氨基酸序列中的任一项。
在一些其他的方面，本公开提供了CAR，或包含CAR的免疫细胞(优选CAR-T细胞)，其中所述CAR包含EBV糖蛋白350/220结合结构域，所述结构域包含重链互补决定区1(HCDR1)、HCDR2、HCDR3，轻链互补决定区1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3，具有如下多肽序列：
(1)SEQ ID NO:11、12、13、26、27和28，分别地；
(2)SEQ ID NO:14、15、16、29、30和31，分别地；
(3)SEQ ID NO:17、18、19、32、33和34，分别地；
(4)SEQ ID NO:20、21、22、35、36和37，分别地；
(5)SEQ ID NO:23、24、25、38、39和40，分别地；
(6)SEQ ID NO:118、119、120、121、122和123，分别地；或
(7)SEQ ID NO:124、125、126、127、128和129，分别地；
或者
EBV糖蛋白350/220抗原结合结构域，其与其竞争或结合至与本文所述的CAR的抗原结合结构域(1)至(7)中的任一项所结合的EBV糖蛋白350/220中的表位相同的表位。
在一些其他方面，本公开提供了CAR或包含CAR的免疫细胞(优选CAR-T细胞)，其中所述CAR包含EBV糖蛋白350/220抗原结合结构域，其中所述抗原结合结构域包含重链可变区和/或轻链可变区，所述重链可变区具有与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、138、139或140中任一项至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的多肽序列，所述轻链可变区具有与SEQ ID NO:6、7、8、9、10、141、142或143中任一项至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的多肽序列。
在一些其他的方面，本公开提供了CAR，或包含CAR的免疫细胞(优选CAR-T细胞)，其中CAR包含EBV糖蛋白350/220抗原结合结构域，其中所述抗原结合结构域包含以下任一项：
(1)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:1的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:6的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；
(2)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:2的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:7的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；
(3)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:3的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:8的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；
(4)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:4的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:9的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；
(5)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:5的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:10的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；
(6)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:138的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:141的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；
(7)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:138的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:142的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；
(8)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:138的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:143的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；
(9)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:139的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:141的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；
(10)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:139的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:142的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；
(12)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:139的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:143的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；
(13)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:140的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:141的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；
(14)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:140的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:142的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；
(15)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:140的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:143的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；
(16)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:130的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:131的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；或
(17)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:132的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:133的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；
或者
EBV糖蛋白350/220抗原结合结构域，其与其竞争或结合至与本文所述的CAR的抗原结合结构域(1)至(17)中的任一项所结合的EBV糖蛋白350/220中的表位相同的表位。
在一些其他的方面，本公开提供了如本文所述的免疫细胞或CAR-T细胞，用于癌症治疗，其中优选地所述癌症是EBV相关癌症，选自淋巴组织增殖性疾病(LPD)，例如B细胞淋巴瘤，包括伯基特淋巴瘤(BL)、霍奇金淋巴瘤(HL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、T细胞淋巴瘤、NK/T细胞淋巴瘤，或移植后淋巴组织增殖性疾病(PTLD)，或上皮癌(鼻咽癌、肺癌、乳腺癌)、淋巴上皮瘤、伴有淋巴样间质的癌(GCLS，例如胃癌)或胶质瘤。
在一些实施方案中，关于本公开所述的组合物、用途或方法，所述癌症选自B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、慢性粒细胞白血病(CML)、急性髓系白血病(AML)、骨髓增生异常综合征(MDS)、慢性骨髓增殖性肿瘤(MPN)、B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)、实体瘤、癌或肉瘤；优选地，所述癌症是实体瘤。在另一个实施方案中，所述癌症是病毒特异性癌症。
在一些实施方案中，所述癌症是EBV相关癌症，选自淋巴组织增殖性疾病(LPD)，例如B细胞淋巴瘤，包括伯基特淋巴瘤(BL)、霍奇金淋巴瘤(HL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、T细胞淋巴瘤、NK/T细胞淋巴瘤，或移植后淋巴组织增殖性疾病(PTLD)，或上皮癌(鼻咽癌、肺癌、乳腺癌)、淋巴上皮瘤、伴有淋巴样间质的癌(GCLS，例如胃癌)或胶质瘤。
在一些实施方案中，关于如上文[10]至[28]中任一项所描述的组合物、用途或方法，由CAR识别的所述抗原选自CD38、GD2、CD123、CLL-1、CD19、CD33、BCMA、CS1、CD4、CD5、CD7、CD20、DLL3、GPC3、GPC2、EpCAM、NY-ESO-1、甲胎蛋白(AFP)、Flt3受体、跨膜激活剂和钙调节剂和亲环蛋白配体相互作用物(TACI)、CEA、ERBB2、EGFR、GD2、MSCA、间皮素、MUC1、PSMA、HER2、Claudin-6、Trop2、MUC3A、Claudin18.2、gp100、MAGE-A1/3/4、LMP1、Nectin4/FAP、CD171、MUC16、CD20、CD80/86、c-MET、DR5、EpHA2、FR-α。
在一些实施方案中，CAR识别的所述抗原是病毒抗原。
在一些实施方案中，CAR识别的所述抗原是EB病毒抗原(EBV抗原)。
在一些实施方案中，所述EBV抗原可存在于EBV感染细胞的表面，优选EBV感染的癌细胞、EBV感染的B细胞或EBV感染的上皮细胞。EBV抗原可以是EBV病毒体包膜蛋白或EBV包膜复合物的蛋白(例如gB、gL或gH)。EBV病毒抗原优选为EBV糖蛋白350/220(gp350/220)。在优选实施方案中，本公开集中于靶向EBV抗原和治疗EBV相关的医疗状况。示例性EBV gp350蛋白显示在UniProt数据库P03200-1条目(1986年7月21日版本1)中。示例性EBV gp220显示在同一个数据库条目中，但缺失了502至750位。
在一些相关实施方案中，所述免疫细胞或CAR-T细胞包含CAR，所述CAR包含EBV糖蛋白350/220抗原结合结构域，所述结构域包含如表1和表2所提供的重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，或如表1和表2所提供的特定的VH和VL组合。在另一个实施方案中，所述CAR包含EBV糖蛋白350/220抗原结合结构域，该结构域包含与表1和表2中提供的VH和/或VL氨基酸序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％同一性的重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)。
在一些相关实施方案中，所述CAR包含EBV糖蛋白350/220抗原结合结构域，所述结构域包含如表3和表4所提供的一个、两个、三个或更多个HCDR和/或一个、两个、三个或更多个LCDR，或如表3和表4所提供的特定的HCDR1-3和LCDR1-3组合。
在一些相关实施方案中，所述细胞包含EBV糖蛋白350/220结合CAR，该CAR包含如表5所提供的氨基酸序列，优选地该CAR包含选自SEQ ID NO:144至161的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述CAR包含与表5所提供的任一CAR序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％同一性的氨基酸序列，优选地该CAR选自SEQ ID NO:144至161。
在一些实施方案中，关于上述[2]至[29]中任一项所描述的组合物、用途或方法，将所述组合物和细胞同时或依次施用，例如，在施用细胞之前或之后施用组合物。
在某些方面，本申请意外且出乎意料地发现，包含PIC和任选的免疫原的免疫原性组合物与免疫细胞疗法(例如CAR-T细胞)的组合疗法在治疗实体瘤方面特别有效。本文所述的免疫原性组合物预计能够改善、增强或提高患有对实体瘤的受试者所施用的免疫细胞(例如CAR-T细胞)的免疫反应和抗癌活性。不受理论束缚，预计PIC可以促进T细胞的活化和增殖(参见实施例5)。还预计PIC可以刺激toll样受体3(TLR-3)和其他细胞通路，增强抗原呈递细胞(APC)的抗原呈递，并诱导促炎细胞因子的产生。先前研究表明，PIC可以增强针对非癌症适应症(例如狂犬病毒、肝炎病毒和SAR-Cov)的免疫反应(Lau等人,2009,Lau等人,2010&Cell Mol Immunol.2007Apr；4(2):113-20)；VIROLOGICA SINICA,April 2011,26(2):81-94)。其次，PIC可以诱导B细胞和NK细胞的活化和增殖以及细胞因子如IFNγ和IL-2的分泌，从而可以增加肿瘤浸润，以及CAR-T细胞的刺激和扩增。此外，作为疫苗的免疫原的存在可以进一步增强抗原呈递细胞对靶抗原的呈递，从而增强所述CAR-T疗法的疗效。此外，本文描述的免疫原性组合物可能有助于克服免疫抑制肿瘤微环境，这是CAR-T疗法对实体肿瘤成功率有限的一个主要问题。
另一方面，本申请成功设计了靶向EBV的特定CAR，并生成了包含所述CAR的CAR-T细胞，其在治疗与EBV感染相关的癌症方面尤其有效。此外，本发明人出乎意料地发现，包含EBV VLP的免疫原性组合物与使用所述靶向EBV的CAR-T细胞的免疫细胞疗法的组合疗法在治疗与EBV感染相关的癌症方面尤其有效。包含本文所述的EBV VLP的免疫原性组合物能够改善、增强或提高对患有此类癌症的受试者所施用的免疫细胞(例如CAR-T细胞)的免疫反应和抗癌活性。不希望受理论束缚，可以设想EBV VLP可以促进T细胞的活化、增殖和杀伤活性(参见实施例7)。此外，作为疫苗的所述EBV-VLP的存在可以进一步增强抗原呈递细胞对EBV抗原的呈递，从而增强所述CAR-T疗法的疗效。因此，本文描述的免疫原性组合物可能有助于克服免疫抑制肿瘤微环境，这是CAR-T疗法对实体肿瘤成功率有限的一个主要问题。
附图说明
图1显示代表性抗EBV Gp350 CAR-T细胞对PCI-gp350细胞表现出强效杀伤，但在没有gp350表达的PCI细胞中未表现出可检测到的活性。
图2显示实施例1制备的代表性聚肌苷酸聚胞苷酸基佐剂组合物(命名为ZNP)与T细胞和PBMC共孵育，以ZNP浓度依赖的方式促进T细胞的活化和增殖，提示ZNP组合物(或ZNP-EBV-VLP)可用于增强包括CAR-T细胞在内的T细胞疗法的疗效。
图3显示，EBV VLP与Raji细胞共孵育，在VLP浓度方式下(PCI-g+1.25x107 VLP,PCI-g+1.25x108 VLP与PCI-g+0VLP相比)，显著增强了抗EBV Gp350 CAR-T细胞对靶细胞PCI-gp350细胞系(PCI-g)的细胞毒性(细胞溶解％)。相反，EBV VLP不增加抗EBV Gp350CAR-T细胞对对照PCI细胞的细胞毒性(细胞溶解％)。
图4显示，在EBV的VLP存在下，抗EBV Gp350 CAR-T细胞对靶细胞PCI-gp350细胞株的细胞毒性增强，依赖于与VLP靶向细胞Raji细胞的共孵育。添加1.25x108 VLP与Raji细胞共孵育(Raji+1.25x108 VLP)的样品的细胞毒性明显高于添加1.25x108 VLP但不与Raji细胞共孵育(Raji+0VLP)的样品。
图5显示，抗EBV Gp350 CAR-T细胞在不存在或存在EBV VLP的情况下，对不表达gp350抗原的PCI细胞系表现出很小或较低的细胞毒性。
图6显示，EBV VLP与Raji细胞共孵育，在VLP浓度方式下(CAR+VLPe7或CAR+VLPe8与仅CAR相比)，显著增强了抗EBV Gp350 CAR-T细胞对靶细胞PCI-gp350细胞系(PCI-g)的细胞毒性(细胞溶解％)。相反，EBV VLP不增加抗EBV Gp350 CAR-T细胞对对照PCI细胞的细胞毒性(细胞溶解％)。单独的EBV VLP不增加空白对照T细胞或无gp350表达的PCI细胞的细胞毒性(细胞溶解％)。
图7显示，Gp350 CAR-T细胞在体内抑制鼻咽癌细胞C666-1生长并抑制肿瘤形成。将C666-1细胞(经gp350和荧光素酶表达工程化)皮下注射到小鼠体内，随后施用4x106(4E6)或2x106(4E6)个gp350 CAR-T细胞或空白对照T细胞。图7A显示了在第0天、第7天、第14天、第18天(4x106组)或第21天(2x106和PBS组)时间点的肿瘤细胞生长荧光成像结果，并进行了比较，展示了gp350 CAR-T细胞对肿瘤形成的特异性抑制作用。图7B显示4x106(4E6)CAR-T细胞或空白对照T细胞治疗组在注射CAR-T细胞后第0、7、14、18或21天平均肿瘤细胞发光强度变化。图7C显示2x106(2E6)CAR-T细胞、空白对照T细胞或PBS治疗组在注射CAR-T细胞后第0、7、14、18或21天平均肿瘤细胞发光强度变化。图7D显示CAR-T注射后第0、7、14、18或21天平均肿瘤体积变化模式。图7E显示不同实验组小鼠肿瘤组织重量的解剖和评估，显示CAR-T治疗组肿瘤生长减少。
图8显示了第18天4x106(4E6)CAR-T细胞和空白对照T细胞治疗组血液或脾脏样本中人CD45+、CD8+、CAR+和CAR+/CD8+细胞百分比和计数比较(图8A)，以及第24天2x106(2E6)CAR T细胞和空白对照T细胞治疗组血液或脾脏样本中人CD45+、CD8+、CAR+和CAR+/CD8+细胞百分比和计数比较(图8B)。结果表明，CAR-T细胞在血液和脾脏中存在，同时抑制了肿瘤的形成。
图9显示gp350靶向的CAR-T细胞在体内抑制T细胞淋巴瘤细胞生长并抑制肿瘤形成。图9A显示了T细胞淋巴瘤小鼠模型的肿瘤概况，该模型注射了Jurkat-gp350-luc细胞5或7天以形成肿瘤。小鼠接受IVIS成像检查，并分别施用2x106(2E6)或1x106(1E6)个CAR-T细胞或空表白对照T细胞。分别于第0天、第7天、第14天、第21天、第28天、第32天时间点记录并比较肿瘤细胞生长荧光成像，显示gp350 CAR-T细胞对肿瘤形成的特异性抑制作用。图9B和9C分别显示了注射CAR-T细胞后，2x106(2E6)或1x106(1E6)个CAR-T细胞组或空白对照T细胞组小鼠肿瘤细胞平均荧光强度在时间过程中的变化。
图10显示在被诊断患有中枢神经系统受累的B细胞急性淋巴细胞白血病的患者中，包含抗EBV Gp350的CAR T细胞诱导的肿瘤缩小。图10(A)为MRI成像结果，显示治疗前(上图)和治疗后(下图)的脑部病变，病变在治疗后几乎消失；图10(B)显示治疗后血液中异常未成熟细胞比例下降。治疗后，该受试者出院，无CRS、ICANS，心脏、肝和肾功能检查无明显异常。
具体实施方式
除非另有限定，本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的那些普通技术人员通常理解的相同的含义。
如本文所用，术语“包含”或“包括”应解释为指定所提及的所述特征、整体、步骤或组分的存在，但不排除一个或多个特征、整体、步骤或组分或其群组的存在或添加。然而，在本公开的上下文中，术语“包含”或“包括”也包括“由......组成”。“包含(comprising)”一词的变体，例如“comprise”和“comprises”，以及“包括(including)”一词的变体，例如“include”和“includes”，其含义也相应变化。
术语“一(a)”或“一个(an)”指代该冠词的一个或一个以上(即至少一个)的语法对象。例如，“一个元件(an element)”指代一个或一个以上元件。
当提及可测量值(例如量、持续时间等)时，术语“约”旨在涵盖与指定值±20％或在某些情况下10％、或在某些情况下±5％、或在某些情况下±1％、或在某些情况下±0.1％的变化，因为这样的变化对于执行所公开的方法来说是适当的。
本文所用的“免疫原性组合物”是指当施用于宿主时引发免疫反应的物质。
术语“Poly I:C”或“PIC”是指包含聚肌苷酸和聚胞苷酸核酸的组合物，其也可分别称为聚肌苷酸-聚胞苷酸或聚肌苷酸-聚胞苷酸(polyinosinic acid-polycytidilic)。
术语“多肽”、“肽”、“寡肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，是指任意长度的氨基酸的聚合形式，其可以包括编码和非编码氨基酸、化学或生物化学修饰的或衍生的氨基酸以及具有修饰肽骨架的多肽。
术语“免疫原”是指能够在暴露于宿主生物体后引发免疫反应(例如B细胞(体液/抗体)和/或T细胞(细胞)适应性免疫反应)的抗原。术语“抗原”包括但不限于细胞；细胞提取物；蛋白质；脂蛋白；糖蛋白；核蛋白；多肽；肽；多糖；多糖缀合物；多糖的肽模拟物；脂质；糖脂；碳水化合物；病毒；病毒提取物；细菌；细菌提取物；真菌；真菌提取物；多细胞生物，例如寄生虫；以及过敏原。抗原可以是外源性的(例如，来自接受抗原的个体以外的来源，例如，来自不同的物种)或内源性的(例如，源自宿主内部，例如，身体的患病部位、癌症抗原、感染病毒的细胞产生的抗原等)。抗原可以是天然的(例如，天然存在的)、合成的或重组的。抗原包括粗提取物、全细胞和纯化抗原，其中“纯化”表示抗原相对于其正常存在的环境和/或相对于粗提取物(例如，抗原的培养形式)而言是富集的形式。
在一些实施方案中，免疫原是重组蛋白、病毒样颗粒(VLP)、肽、mRNA、DNA、疫苗或树突状细胞疫苗。在一些其他实施方案中，免疫原可以是一种或多种衍生自癌细胞的多肽/肽或其抗原片段或变体。应当理解，本文所述的免疫原还可以包含其他组分。例如，一种或多种免疫原可以包含在脂质或脂质体中。在一些实施方案中，对应于癌症抗原的肽或多肽通常长度为10-20个氨基酸残基，并且可以含有一个以上的肽决定簇或最多约30-50个残基。在一些实施方案中，所述多肽的长度为10至约150个残基或更多。在一些实施方案中，也可以制备更长的肽或多肽，例如通过重组方法。在某些实施方案中，编码本文所述抗原组合物和/或组分的核酸可用于例如在体外或体内制备用于本公开的各种组合物和方法的抗原组合物。例如，在某些实施方案中，编码抗原的核酸包含在例如重组细胞中的载体中。可以表达所述核酸以产生包含抗原序列的肽或多肽。该肽或多肽可以从细胞分泌，或作为细胞的一部分或包含在细胞内。
在一些实施方案中，免疫原是“肿瘤相关抗原”或“癌症抗原”，并且可以选自CTA、NY-ESO-1、LAGE-1、MAGE-A1、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A10、CT7、CT10、GAGE、PRAME；BAGE；RAGE、SAGE、HAGE、MPHOSPH1、DEPDC1、IMP3和MAGE-A，以及T抗原BK、p53、Ras、c-Myc、A-Raf、B-Raf、C-Raf、细胞周期蛋白依赖性激酶、MAGE-A2、MAGE-A6、MAGE-A10、MAGE-A12、MART-1、BAGE、DAM-6、-10、GAGE-1、-2、-8、GAGE-3、-4、-5、-6、-7B、NA88-A、MART-1、MC1R、Gp100、PSA、PSM、络氨酸酶、TRP-1、TRP-2、ART-4、CAMEL、CEA、Cyp-B、hTERT、hTRT、iCE、MUC1、MUC2、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、TRK、PRAME、P15、RU1、RU2、SART-1、SART-3受体、Wilms肿瘤抗原(WT1)、AFP、β-连环蛋白/ш、caspases-8/m、CEA、CDK-4/m、ELF2M、GnT-V、G250、HSP70-2M、HST-2、KIAA0205、MUM-1、MUM-2、MUM-3、肌球蛋白/m、RAGE、SART-2、TRP-2/INT2、707-AP、膜联蛋白II、CDC27/m、TPI/mbcr-abl、BCRABL、干扰素调节因子4(IRF4)、ETV6/AML、LDLR/FUT、Pml/RARa、肿瘤相关钙信号转导蛋白1(TACSTD1)TACSTD2受体酪氨酸激酶、表皮生长因子受体(EGFR)、EGFRvIII、血小板生长因子受体(PDGFR)、血管内皮生长因子受体ia(VEGFR)、细胞质酪氨酸激酶、src家族、syk-ZAP70、整合素连接激酶(ILK)、信号转导和转录激活因子STAT3、STAT5和STAT6、缺氧诱导的因子、HIF-1a和HIF-2a、核因子κB(NF-kB)、Notch、Notch1-4、c-Met受体、哺乳动物雷帕霉素靶点(mTOR)、WNT、细胞外信号调节激酶(ERK)、PMSA、PR-3、MDM2、间皮素、癌症肾细胞-5T4、SM22-α、碳酸酐酶I(CAI)和IX(CAIX)、STEAD、TEL/AML1，GD2、蛋白酶3、hTERT、肉瘤易位控制点、EphA2、ML-IAP、EpCAM、ERG(融合基因TMPRSS2 ETS)、NA17、PAX3、ALK、雄激素受体、zclin B1、多聚唾液酸、MYCN、RhoC、GD3、岩藻糖基GM1、间皮素、PSCA、sLe、PLAC1、GM3、BORIS、Tn、GLoboH、NYBR-1、RG SART3、STn、PAX5、OY-TES1、精子蛋白17、LCK、HMWMAA、AKAP-4、SSX2、XAGE 1、B7H3、legumain、TIE2、Page4、MAD-CT-1、FAP、MAD-CT-2和fos相关抗原1。
在另一实施方案中，免疫原是来自致癌病毒的病毒抗原。典型的致癌病毒包括但不限于EBV、HPV、HBV、HCV、HTLV和KSHV。来自本公开内容中可以使用的致癌病毒的典型病毒抗原包括但不限于EBV：EBNA-1、LMP-1、LMP-2A；HPV：E6、E7、E5；HBV：HBx；HCV：Core、NS3、Ns5A；HTLV：Tax、HBZ；KSHV：vFLIP、LANA、vGPCR、vIRF-1。
在一些实施方案中，所述免疫原是EB病毒抗原(EBV抗原)。EBV抗原可以是EBVVLP。在优选实施方案中，EBV病毒抗原优选为EBV糖蛋白350/220(gp350/220)。示例性EBVgp350蛋白显示在UniProt数据库P03200-1条目(1986年7月21日版本1)中。示例性EBVgp220显示在同一个数据库条目中，但缺失了502至750位。在一些实施方案中，所述免疫原是EBV VLP。
EBV VLP和包含EBV VLP的免疫原性组合物
在一些实施方案中，本公开的免疫原性组合物包含EB病毒(EBV)的VLP，即EBV-VLP。
在本公开的一些实施方案中，所述EBV-VLP包含(i)至少一种EBV结构多肽、(ii)至少一种EBV裂解多肽、(iii)膜脂，其中优选地所述VLP具有以下特性中的一种或多种：
(a)缺乏EBV DNA；
(b)B细胞转化所需的一种或多种EBV的B细胞转化能力被失活或去除，同时保留其免疫原性；和/或
(c)所述EBV不包含B细胞转化所需的一种或多种EBV多肽，所述EBV多肽选自LMP1、EBNA2、EBNA3a、EBNA3b和EBNA3c。
在本公开的EBV VLP的一些实施方案中，所述VLP包含gp350的至少一种EBV多肽和/或还包含至少一种EBV潜伏多肽。
EBV多肽gp350(糖蛋白350)是一种膜结合糖蛋白。所述gp350通过与B细胞表面的CD21结合，负责对B细胞的特异性(向性(tropism))。其他辅助病毒多肽可能有助于实现完全有效的感染(Chesnokova等人，2009；Omerovic等人，2005；Silva等人，2004；Sorem和Longnecker，2009)。此外，也已证实缺乏gp350的重组EBV颗粒也能以低效率感染(Janz等人，2000)。最近的研究还假定在病毒内化步骤之后，以及推测在病毒衣壳从内体区室释放期间，gp350可能起着作用(Busse等人，2010)。虽然对于本发明的VLP来说不是至关重要的，但优选将gp350包含在VLP颗粒的膜中，因为在施用疫苗后，产生的免疫反应更类似于野生型EBV感染引起的免疫反应，
本文中使用的术语“EBV”指任何野生型(即自然存在的)EBV毒株，并不局限于某一特定毒株。具体而言，EBV 1型和EBV 2型毒株在本领域中是众所周知的，并且已被广泛表征。这两种EBV类型在编码EBNA-LP、EBNA-2、EBNA-3A、EBNA-3B和EBNA-3C的核多肽基因上存在很大差异。除了与编码EBNA家族多肽的基因相关的差异外，1型和2型的基因组差异很小。1型在发达国家人群中占主导地位，而2型在赤道非洲和新几内亚也普遍存在(Kieff和Rickinson，2007，综述)。此外，术语“EBV多肽”还包括与野生型EBV毒株在序列上不同一的多肽，但包含与野生型EBV多肽具有至少(每个值)99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％、80％和至少75％序列同一性的蛋白质。本领域技术人员可以通过熟知的方法计算多肽序列的同一性程度，并且可以包括自动执行用于序列数据比对和序列同源性计算的算法。颗粒的EBV多肽可以源自不同的EBV毒株；优选地，它们源自同一毒株。如上所述，需要包含在颗粒中的EBV多肽属于EBV结构多肽和EBV裂解多肽两类。本领域技术人员应当理解，EBV的特定多肽可以属于上述多肽组中的一个以上的组。换句话说，EBV多肽既可以代表结构多肽，也可以代表裂解多肽，这一点从下文中提到的具体EBV多肽中可以看出。在后一种情况下，颗粒不需要包含其他的EBV多肽(无论是结构多肽还是裂解多肽)。优选地，颗粒包含至少一种针对上述每组EBV多肽的单独的EBV多肽，因为这通常会增强疫苗的抗原潜力。更优选的是，至少(对于每个值)2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或至少12种单独的多肽独立地是疫苗颗粒所包含的每种所述多肽组的一部分。
术语“潜伏多肽”指参与诱导和维持EBV潜伏周期和/或因潜伏周期诱导而表达的EBV多肽。优选地，至少一种潜伏多肽是LMP-1(也称为BNLF1)和/或L P-2。
术语EBV的“结构多肽”指参与EBV结构构建的多肽。所述多肽优选选自膜多肽、被膜多肽(tegument polypeptide)和衣壳多肽。EBV膜多肽包含选自BALF4、BLLF1(也称为gp350)、BDLF2、BDLF3、BKRF2、BLRF1、BNLF1(也称为LMP-1)、TP(也称为LMP-2a)、BXLF2、BZLF2及其任意组合的多肽。EBV被膜多肽包含选自BBRF2、BGLF2、B LF1、BNRF1、BOLF1、BPLF1、BTRF1、BVRF1及其任意组合的多肽。EBV衣壳多肽包含选自BBRF1、BcLF1、BDLF1、BFRF3及其任意组合的多肽。优选地，至少一种结构多肽选自BLLF1、BMLF1、BNRF1或其任意组合，例如BLLF1和BMLF1、BLLF1和BNRF1，或BMLF1和BNRF1。
术语“裂解多肽”指参与诱导和维持EBV裂解周期(本文也称为复制期)和/或因裂解周期诱导而表达的EBV多肽。所述裂解多肽优选选自立即早期基因、早期基因和晚期裂解基因(Kieff和Rickinson，2007)。裂解周期由BZLF1和BRLF1(均为立即早期蛋白)的表达启动，随后是早期和晚期蛋白的表达。诱导后，已允许病毒复制的细胞会发生疱疹病毒特征性的细胞病变(Kieff和Rickinson，2007)。根据本发明使用的示例性裂解多肽选自BZLF1、BRLF1、BMRF1、BMLF1、BALF2、BALF5、BGL2、BHRF1、BALF4、BDLF3及其任意组合。优选地，至少一种裂解多肽是BLLF1(也称为gp350)或其任意组合。
本发明中使用的术语“膜脂”是指能够自发排列形成脂质双层的脂质。此类膜脂是包含疏水区和亲水区的脂质，其中自组装后，膜脂的疏水区形成双层的内部，而亲水区形成膜的外表面。优选地，膜脂是天然形成细胞膜的脂质，例如两亲性磷脂。还优选所述膜脂源自野生型EBV能够复制的宿主细胞。更优选地，所述膜脂源自本发明的细胞。根据本发明，包含在颗粒中的膜以足以形成构成颗粒外壳的膜的量存在。颗粒必须具有所述膜外壳，其优选包含至少一种EBV结构多肽。如下所述，膜结合EBV结构多肽的优选实例是gp350多肽和LP-1多肽。如下文进一步详述，LMP-1的B细胞转化能力可能被失活。此外，优选颗粒膜包含EBV膜中天然存在的其他膜成分，例如，可能存在于膜内、膜外或跨膜的其他膜多肽。
在本发明的免疫原性组合物的一些实施方案中，所述EBV VLP包含糖蛋白350/220(gp350)或其片段，任选地，其中所述VLP包含一个、两个、三个或更多个多肽序列，所述多肽序列与选自SEQ ID NO:102至117的多肽序列至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一。
在一些实施方案中，所述EBV VLP包含EB病毒的gp350蛋白质序列，表示为：
MEAALLVCQYTIQSLIHLTGEDPGFFNVEIPEFPFYPTCNVCTADVNVTINFDVGGKKHQLDLDFGQLTPHTKAVYQPRGAFGGSENATNLFLLELLGAGELALTMRSKKLPINVTTGEEQQVSLESVDVYFQDVFGTMWCHHAEMQNPVYLIPETVPYIKWDNCNSTNITAVVRAQGLDVTLPLSLPTSAQDSNFSVKTEMLGNEIDIECIMEDGEISQVLPGDNKFNITCSGYESHVPSGGILTSTSPVATPIPGTGYAYSLRLTPRPVSRFLGNNSILYVFYSGNGPKASGGDYCIQSNIVFSDEIPASQDMPTNTTDITYVGDNATYSVPMVTSEDANSPNVTVTAFWAWPNNTETDFKCKWTLTSGTPSGCENISGAFASNRTFDITVSGLGTAPKTLIITRTATNATTTTHKVIFSKAPESTTTSPTLNTTGFADPNTTTGLPSSTHVPTNLTAPASTGPTVSTADVTSPTPAGTTSGASPVTPSPSPWDNGTESKAPDMTSSTSPVTTPTPNATSPTPAVTTPTPNATSPTPAVTTPTPNATSPTLGKTSPTSAVTTPTPNATSPTLGKTSPTSAVTTPTPNATSPTLGKTSPTSAVTTPTPNATGPTVGETSPQANATNHTLGGTSPTPVVTSQPKNATSAVTTGQHNITSSSTSSMSLRPSSNPETLSPSTSDNSTSHMPLLTSAHPTGGENITQVTPASISTHHVSTSSPAPRPGTTSQASGPGNSSTSTKPGEVNVTKGTPPQNATSPQAPSGQKTAVPTVTSTGGKANSTTGGKHTTGHGARTSTEPTTDYGGDSTTPRPRYNATTYLPPSTSSKLRPRWTFTSPPVTTAQATVPVPPTSQPRFSNLSMLVLQWASLAVLTLLLLLVMADCAFRRNLSTSHTYTTPPYDDAETYV(SEQ ID NO:102)；或其功能变体，其与本文描述的多肽序列至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一。
在一些实施方案中，所述EBV VLP包含EB病毒的gp350的截短的蛋白质序列，表示为：
MEAALLVCQYTIQSLIHLTGEDPGFFNVEIPEFPFYPTCNVCTADVNVTINFDVGGKKHQLDLDFGQLTPHTKAVYQPRGAFGGSENATNLFLLELLGAGELALTMRSKKLPINVTTGEEQQVSLESVDVYFQDVFGTMWCHHAEMQNPVYLIPETVPYIKWDNCNSTNITAVVRAQGLDVTLPLSLPTSAQDSNFSVKTEMLGNEIDIECIMEDGEISQVLPGDNKFNITCSGYESHVPSGGILTSTSPVATPIPGTGYAYSLRLTPRPVSRFLGNNSILYVFYSGNGPKASGGDYCIQSNIVFSDEIPASQDMPTNTTDITYVGDNATYSVPMVTSEDANSPNVTVTAFWAWPNNTETDFKCKWTLTSGTPSGCENISGAFASNRTFDITVSGLGTAPKTLIITRTATNATTTTHKVIFSKAPESTTTSPTLNTTGFADPNTTTGLPSSTHVPTNLTAPASTGPTVSTADVTSPTPAGTTSGASPVTPSPSPWDNGTES(SEQ ID NO:103)；或其功能变体，其与本文描述的多肽序列至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一。
在一些实施方案中，所述EBV VLP包含EB病毒的LMP1的蛋白质序列，表示为：
MEHDLERGPPGPRRPPRGPPLSSSLGLALLLLLLALLFWLYIVMSDWTGGALLVLYSFALMLIIIILIIFIFRRDLLCPLGALCILLLMITLLLIALWNLHGQALFLGIVLFIFGCLLVLGIWIYLLEMLWRLGATIWQLLAFFLAFFLDLILLIIALYLQQNWWTLLVDLLWLLLFLAILIWMYYHGQRHSDEHHHDDSLPHPQQATDDSGHESDSNSNEGRHHLLVSGAGDGPPLCSQNLGAPGGGPDNGPQDPDNTDDNGPQDPDNTDDNGPHDPLPQDPDNTDDNGPQDPDNTDDNGPHDPLPHSPSDSAGNDGGPPQLTEEVENKGGDQGPPLMTDGGGGHSHDSGHGGGDPHLPTLLLGSSGSGGDDDDPHGPVQLSYYD(SEQ ID NO:104)；或其功能变体，其与本文描述的多肽序列至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一。
在一些实施方案中，所述EBV VLP包含EB病毒的LMP2A的蛋白质序列，表示为：
MGSLEMVPMGAGPPSPGGDPDGYDGGNNSQYPSASGSSGNTPTPPNDEERESNEEPPPPYEDPYWGNGDRHSDYQPLGTQDQSLYLGLQHDGNDGLPPPPYSPRDDSSQHIYEEAGRGSMNPVCLPVIVAPYLFWLAAIAASCFTASVSTVVTATGLALSLLLLAAVASSYAAAQRKLLTPVTVLTAVVTFFAICLTWRIEDPPFNSLLFALLAAAGGLQGIYVLVMLVLLILAYRRRWRRLTVCGGIMFLACVLVLIVDAVLQLSPLLGAVTVVSMTLLLLAFVLWLSSPGGLGTLGAALLTLAAALALLASLILGTLNLTTMFLLMLLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLLLASALIAGGSILQTNFKSLSSTEFIPNLFCMLLLIVAGILFILAILTEWGSGNRTYGPVFMCLGGLLTMVAGAVWLTVMSNTLLSAWILTAGFLIFLIGFALFGVIRCCRYCCYYCLTLESEERPPTPYRNTV(SEQ ID NO:105)；或其功能变体，其与本文描述的多肽序列至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一。
在一些实施方案中，所述EBV VLP包含EB病毒的EBNA-1的蛋白质序列，表示为：
MSDEGPGTGPGNGLGEKGDTSGPEGSGGSGPQRRGGDNHGRGRGRGRGRGGGRPGAPGGSGSGPRHRDGVRRPQKRPSCIGCKGTHGGTGAGAGAGGAGAGGAGAGGGAGAGGGAGGAGGAGGAGAGGGAGAGGGAGGAGGAGAGGGAGAGGGAGGAGAGGGAGGAGGAGAGGGAGAGGGAGGAGAGGGAGGAGGAGAGGGAGAGGAGGAGGAGAGGAGAGGGAGGAGGAGAGGAGAGGAGAGGAGAGGAGGAGAGGAGGAGAGGAGGAGAGGGAGGAGAGGGAGGAGAGGAGGAGAGGAGGAGAGGAGGAGAGGGAGAGGAGAGGGGRGRGGSGGRGRGGSGGRGRGGSGGRRGRGRERARGGSRERARGRGRGRGEKRPRSPSSQSSSSGSPPRRPPPGRRPFFHPVGEADYFEYHQEGGPDGEPDVPPGAIEQGPADDPGEGPSTGPRGQGDGGRRKKGGWFGKHRGQGGSNPKFENIAEGLRALLARSHVERTTDEGTWVAGVFVYGGSKTSLYNLRRGTALAIPQCRLTPLSRLPFGMAPGPGPQPGPLRESIVCYFMVFLQTHIFAEVLKDAIKDLVMTKPAPTCNIRVTVCSFDDGVDLPPWFPPMVEGAAAEGDDGDDGDEGGDGDEGEEGQE(SEQ ID NO:106)；或其功能变体，其与本文描述的多肽序列至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一。
在一些实施方案中，所述EBV VLP包含EB病毒的截短的EBNA-1(326-641)的蛋白质序列，表示为：
GGGRGRGGSGGRGRGGSGGRGRGGSGGRRGRGRERARGGSRERARGRGRGRGEKRPRSPSSQSSSSGSPPRRPPPGRRPFFHPVGEADYFEYHQEGGPDGEPDVPPGAIEQGPADDPGEGPSTGPRGQGDGGRRKKGGWFGKHRGQGGSNPKFENIAEGLRALLARSHVERTTDEGTWVAGVFVYGGSKTSLYNLRRGTALAIPQCRLTPLSRLPFGMAPGPGPQPGPLRESIVCYFMVFLQTHIFAEVLKDAIKDLVMTKPAPTCNIRVTVCSFDDGVDLPPWFPPMVEGAAAEGDDGDDGDEGGDGDEGEEGQE(SEQ ID NO:107)；或其功能变体，其与本文描述的多肽序列至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一。
在一些实施方案中，所述EBV VLP包含EB病毒的截短的EBNA-1(326-641)-LMP2融合蛋白的蛋白质序列，表示为：
GGGRGRGGSGGRGRGGSGGRGRGGSGGRRGRGRERARGGSRERARGRGRGRGEKRPRSPSSQSSSSGSPPRRPPPGRRPFFHPVGEADYFEYHQEGGPDGEPDVPPGAIEQGPADDPGEGPSTGPRGQGDGGRRKKGGWFGKHRGQGGSNPKFENIAEGLRALLARSHVERTTDEGTWVAGVFVYGGSKTSLYNLRRGTALAIPQCRLTPLSRLPFGMAPGPGPQPGPLRESIVCYFMVFLQTHIFAEVLKDAIKDLVMTKPAPTCNIRVTVCSFDDGVDLPPWFPPMVEGAAAEGDDGDDGDEGGDGDEGEEGQEMGSLEMVPMGAGPPSPGGDPDGYDGGNNSQYPSASGSSGNTPTPPNDEERESNEEPPPPYEDPYWGNGDRHSDYQPLGTQDQSLYLGLQHDGNDGLPPPPYSPRDDSSQHIYEEAGRGSMNPVCLPVIVAPYLFWLAAIAASCFTASVSTVVTATGLALSLLLLAAVASSYAAAQRKLLTPVTVLTAVVTFFAICLTWRIEDPPFNSLLFALLAAAGGLQGIYVLVMLVLLILAYRRRWRRLTVCGGIMFLACVLVLIVDAVLQLSPLLGAVTVVSMTLLLLAFVLWLSSPGGLGTLGAALLTLAAALALLASLILGTLNLTTMFLLMLLWTLVVLLICSSCSSCPLSKILLARLFLYALALLLLASALIAGGSILQTNFKSLSSTEFIPNLFCMLLLIVAGILFILAILTEWGSGNRTYGPVFMCLGGLLTMVAGAVWLTVMSNTLLSAWILTAGFLIFLIGFALFGVIRCCRYCCYYCLTLESEERPPTPYRNTV(SEQ ID NO:108)；或其功能变体，其与本文描述的多肽序列至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一。
在一些实施方案中，所述EBV VLP包含EB病毒的糖蛋白H(或BXLF2)的蛋白质序列，表示为：
MQLLCVFCLVLLWEVGAASLSEVKLHLDIEGHASHYTIPWTELMAKVPGLSPEALWREANVTEDLASMLNRYKLIYKTSGTLGIALAEPVDIPAVSEGSMQVDASKVHPGVISGLNSPACMLSAPLEKQLFYYIGTMLPNTRPHSYVFYQLRCHLSYVALSINGDKFQYTGAMTSKFLMGTYKRVTEKGDEHVLSLVFGKTKDLPDLRGPFSYPSLTSAQSGDYSLVIVTTFVHYANFHNYFVPNLKDMFSRAVTMTAASYARYVLQKLVLLEMKGGCREPELDTETLTTMFEVSVAFFKVGHAVGETGNGCVDLRWLAKSFFELTVLKDIIGICYGATVKGMQSYGLERLAAMLMATVKMEELGHLTTEKQEYALRLATVGYPKAGVYSGLIGGATSVLLSAYNRHPLFQPLHTVMRETLFIGSHVVLRELRLNVTTQGPNLALYQLLSTALCSALEIGEVLRGLALGTESGLFSPCYLSLRFDLTRDKLLSMAPQEATLDQAAVSNAVDGFLGRLSLEREDRDAWHLPAYKCVDRLDKVLMIIPLINVTFIISSDREVRGSALYEASTTYLSSSLFLSPVIMNKCSQGAVAGEPRQIPKIQNFTRTQKSCIFCGFALLSYDEKEGLETTTYITSQEVQNSILSSNYFDFDNLHVHYLLLTTNGTVMEIAGLYEERAHVVLAIILYFIAFALGIFLVHKIVMFFL(SEQ ID NO:109)；或其功能变体，其与本文描述的多肽序列至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一。
在一些实施方案中，所述EBV VLP包含EB病毒的截短的糖蛋白H的蛋白质序列，表示为：
MQLLCVFCLVLLWEVGAASLSEVKLHLDIEGHASHYTIPWTELMAKVPGLSPEALWREANVTEDLASMLNRYKLIYKTSGTLGIALAEPVDIPAVSEGSMQVDASKVHPGVISGLNSPACMLSAPLEKQLFYYIGTMLPNTRPHSYVFYQLRCHLSYVALSINGDKFQYTGAMTSKFLMGTYKRVTEKGDEHVLSLVFGKTKDLPDLRGPFSYPSLTSAQSGDYSLVIVTTFVHYANFHNYFVPNLKDMFSRAVTMTAASYARYVLQKLVLLEMKGGCREPELDTETLTTMFEVSVAFFKVGHAVGETGNGCVDLRWLAKSFFELTVLKDIIGICYGATVKGMQSYGLERLAAMLMATVKMEELGHLTTEKQEYALRLATVGYPKAGVYSGLIGGATSVLLSAYNRHPLFQPLHTVMRETLFIGSHVVLRELRLNVTTQGPNLALYQLLSTALCSALEIGEVLRGLALGTESGLFSPCYLSLRFDLTRDKLLSMAPQEATLDQAAVSNAVDGFLGRLSLEREDRDAWHLPAYKCVDRLDKVLMIIPLINVTFIISSDREVRGSALYEASTTYLSSSLFLSPVIMNKCSQGAVAGEPRQIPKIQNFTRTQKSCIFCGFALLSYDEKEGLETTTYITSQEVQNSILSSNYFDFDNLHVHYLLLTTNGTVMEIAGLYEERAH(SEQ ID NO:110)；或其功能变体，其与本文描述的多肽序列至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一。
在一些实施方案中，所述EBV VLP包含EB病毒的糖蛋白L前体的蛋白质序列，表示为：
MRAVGVFLAICLVTIFVLPTWGNWAYPCCHVTQLRAQHLLALENISDIYLVSNQTCD GFSLASLNSPKNGSNQLVISRCANGLNVVSFFISILKRSSSALTGHLRELLTTLETLYGSFSVE DLFGANLNRYAWHRGG(SEQID NO:111)；或其功能变体，其与本文描述的多肽序列至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一。
在一些实施方案中，所述EBV VLP包含EB病毒的截短的糖蛋白L前体的蛋白质序列，表示为：
YPCCHVTQLRAQHLLALENISDIYLVSNQTCDGFSLASLNSPKNGSNQLVISRCANGLN VVSFFISILKRSSSALTGHLRELLTTLETLYGSFSVEDLFGANLNRYAWHRGG(SEQ ID NO:112)；或其功能变体，其与本文描述的多肽序列至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一。
在一些实施方案中，所述EBV VLP包含EB病毒的糖蛋白B前体的蛋白质序列，表示为：
MTRRRVLSVVVLLAALACRLGAQTPEQPAPPATTVQPTATRQQTSFPFRVCELSSHGDLFRFSSDIQCPSFGTRENHTEGLLMVFKDNIIPYSFKVRSYTKIVTNILIYNGWYADSVTNRHEEKFSVDSYETDQMDTIYQCYNAVKMTKDGLTRVYVDRDGVNITVNLKPTGGLANGVRRYASQTELYDAPGWLIWTYRTRTTVNCLITDMMAKSNSPFDFFVTTTGQTVEMSPFYDGKNKETFHERADSFHVRTNYKIVDYDNRGTNPQGERRAFLDKGTYTLSWKLENRTAYCPLQHWQTFDSTIATETGKSIHFVTDEGTSSFVTNTTVGIELPDAFKCIEEQVNKTMHEKYEAVQDRYTKGQEAITYFITSGGLLLAWLPLTPRSLATVKNLTELTTPTSSPPSSPSPPAPSAARGSTPAAVLRRRRRDAGNATTPVPPTAPGKSLGTLNNPATVQIQFAYDSLRRQINRMLGDLARAWCLEQKRQNMVLRELTKINPTTVMSSIYGKAVAAKRLGDVISVSQCVPVNQATVTLRKSMRVPGSETMCYSRPLVSFSFINDTKTYEGQLGTDNEIFLTKKMTEVCQATSQYYFQSGNEIHVYNDYHHFKTIELDGIATLQTFISLNTSLIENIDFASLELYSRDEQRASNVFDLEGIFREYNFQAQNIAGLRKDLDNAVSNGRNQFVDGLGELMDSLGSVGQSITNLVSTVGGLFSSLVSGFISFFKNPFGGMLILVLVAGVVILVISLTRRTRQMSQQPVQMLYPGIDELAQQHASGEGPGINPISKTELQAIMLALHEQNQEQKRAAQRAAGPSVASRALQAARDRFPGLRRRRYHDPETAAALLGEAETEF(SEQ ID NO:113)；或其功能变体，其与本文描述的多肽序列至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一。
在一些实施方案中，所述EBV VLP包含EB病毒的BNRF1的蛋白质序列，表示为：
MEERGRETQMPVARYGGPFIMVRLFGQDGEANIQEERLYELLSDPRSALGLDPGPLIAENLLLVALRGTNNDPRPQRQERARELALVGILLGNGEQGEHLGTESALEASGNNYVYAYGPDWMARPSTWSAEIQQFLRLLGATYVLRVEMGRQFGFEVHRSRPSFRQFQAINHLVLFDNALRKYDSGQVAAGFQRALLVAGPETADTRPDLRKLNEWVFGGRAAGGRQLADELKIVSALRDTYSGHLVLQPTETLDTWKVLSRDTRTAHSLEHGFIHAAGTIQANCPQLFMRRQHPGLFPFVNAIASSLGWYYQTATGPGADARAAARRQQAFQTRAAAECHAKSGVPVVAGFYRTINATLKGGEGLQPTMFNGELGAIKHQALDTVRYDYGHYLIMLGPFQPWSGLTAPPCPYAESSWAQAAVQTALELFSALYPAPCISGYARPPGPSAVIEHLGSLVPKGGLLLFLSHLPDDVKDGLGEMGPARATGPGMQQFVSSYFLNPACSNVFITVRQRGEKINGRTVLQALGRACDMAGCQHYVLGSTVPLGGLNFVNDLASPVSTAEMMDDFSPFFTVEFPPIQEEGASSPVPLDVDESMDISPSYELPWLSLESCLTSILSHPTVGSKEHLVRHTDRVSGGRVAQQPGVGPLDLPLADYAFVAHSQVWTRPGGAPPLPYRTWDRMTEKLLVSAKPGGENVKVSGTVITLGEQGYKVSLDLREGTRLAMAEALLNAACAPILDPEDVLLTLHLHLDPRRADNSAVMEAMTAASDYARGLGVKLTFGSASCPETGSSASNFMTVVASVSAPGEFSGPLITPVLQKTGSLLIAVRCGDGKIQGGSLFEQLFSDVATTPRAPEALSLKNLFRAVQQLVKSGIVLSGHDISDGGLVTCLVEMALAGQRGVTITMPVASDYLPEMFAEHPGLVFEVEERSVGEVLQTLRSMNMYPAVLGRVGEQGPDQMFEVQHGPETVLRQSLRLLLGTWSSFASEQYECLRPDRINRSMHVSDYGYNEALAVSPLTGKNLSPRRLVTEPDPRCQVAVLCAPGTRGHESLLAAFTNAGCLCRRVFFREVRDNTFLDKYVGLAIGGVHGARDSALAGRATVALINRFPALRDAILKFLNRPDTFSVALGELGVQVLAGLGAVGSTDNPPAPGVEVNVQRSPLILAPNASGMFESRWLNISIPATTSSVMLRGLRGCVLPCWVQGSCLGLQFTNLGMPYVLQNAHQIACHFHSNGTDAWRFAMNYPRNPTEQGNIAGLCSRDGRHLALLCDPSLCTDFWQWEHIPPAFGHPTGCSPWTLMFQAAHLWSLRHGRPSE(SEQ ID NO:114)；或其功能变体，其与本文描述的多肽序列至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一。
在一些实施方案中，所述EBV VLP包含BNRF1-EBNA1(387-513aa)融合蛋白的蛋白质序列，表示为：
MEERGRETQMPVARYGGPFIMVRLFGQDGEANIQEERLYELLSDPRSALGLDPGPLIAENLLLVALRGTNNDPRPQRQERARELALVGILLGNGEQGEHLGTESALEASGQSSSSGSPPRRPPPGRRPFFHPVGEADYFEYHQEGGPDGEPDVPPGAIEQGPADDPGEGPSTGPRGQGDGGRRKKGGWFGKHRGQGGSNPKFENIAEGLRALLARSHVERTTDEGTWVAGVFVYGGSASGNNYVYAYGPDWMARPSTWSAEIQQFLRLLGATYVLRVEMGRQFGFEVHRSRPSFRQFQAINHLVLFDNALRKYDSGQVAAGFQRALLVAGPETADTRPDLRKLNEWVFGGRAAGGRQLADELKIVSALRDTYSGHLVLQPTETLDTWKVLSRDTRTAHSLEHGFIHAAGTIQANCPQLFMRRQHPGLFPFVNAIASSLGWYYQTATGPGADARAAARRQQAFQTRAAAECHAKSGVPVVAGFYRTINATLKGGEGLQPTMFNGELGAIKHQALDTVRYDYGHYLIMLGPFQPWSGLTAPPCPYAESSWAQAAVQTALELFSALYPAPCISGYARPPGPSAVIEHLGSLVPKGGLLLFLSHLPDDVKDGLGEMGPARATGPGMQQFVSSYFLNPACSNVFITVRQRGEKINGRTVLQALGRACDMAGCQHYVLGSTVPLGGLNFVNDLASPVSTAEMMDDFSPFFTVEFPPIQEEGASSPVPLDVDESMDISPSYELPWLSLESCLTSILSHPTVGSKEHLVRHTDRVSGGRVAQQPGVGPLDLPLADYAFVAHSQVWTRPGGAPPLPYRTWDRMTEKLLVSAKPGGENVKVSGTVITLGEQGYKVSLDLREGTRLAMAEALLNAACAPILDPEDVLLTLHLHLDPRRADNSAVMEAMTAASDYARGLGVKLTFGSASCPETGSSASNFMTVVASVSAPGEFSGPLITPVLQKTGSLLIAVRCGDGKIQGGSLFEQLFSDVATTPRAPEALSLKNLFRAVQQLVKSGIVLSGHDISDGGLVTCLVEMALAGQRGVTITMPVASDYLPEMFAEHPGLVFEVEERSVGEVLQTLRSMNMYPAVLGRVGEQGPDQMFEVQHGPETVLRQSLRLLLGTWSSFASEQYECLRPDRINRSMHVSDYGYNEALAVSPLTGKNLSPRRLVTEPDPRCQVAVLCAPGTRGHESLLAAFTNAGCLCRRVFFREVRDNTFLDKYVGLAIGGVHGARDSALAGRATVALINRFPALRDAILKFLNRPDTFSVALGELGVQVLAGLGAVGSTDNPPAPGVEVNVQRSPLILAPNASGMFESRWLNISIPATTSSVMLRGLRGCVLPCWVQGSCLGLQFTNLGMPYVLQNAHQIACHFHSNGTDAWRFAMNYPRNPTEQGNIAGLCSRDGRHLALLCDPSLCTDFWQWEHIPPAFGHPTGCSPWTLMFQAAHLWSLRHGRPSE(SEQ ID NO:115)；或其功能变体，其与本文描述的多肽序列至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一。
在一些实施方案中，所述EBV VLP包含BNRF1-EBNA1(497-619aa)融合蛋白的蛋白质序列，表示为：
MEERGRETQMPVARYGGPFIMVRLFGQDGEANIQEERLYELLSDPRSALGLDPGPLIAENLLLVALRGTNNDPRPQRQERARELALVGILLGNGEQGEHLGTESALEASGTTDEGTWVAGVFVYGGSKTSLYNLRRGTALAIPQCRLTPLSRLPFGMAPGPGPQPGPLRESIVCYFMVFLQTHIFAEVLKDAIKDLVMTKPAPTCNIRVTVCSFDDGVDLPPWFPPMVEGAAAASGNNYVYAYGPDWMARPSTWSAEIQQFLRLLGATYVLRVEMGRQFGFEVHRSRPSFRQFQAINHLVLFDNALRKYDSGQVAAGFQRALLVAGPETADTRPDLRKLNEWVFGGRAAGGRQLADELKIVSALRDTYSGHLVLQPTETLDTWKVLSRDTRTAHSLEHGFIHAAGTIQANCPQLFMRRQHPGLFPFVNAIASSLGWYYQTATGPGADARAAARRQQAFQTRAAAECHAKSGVPVVAGFYRTINATLKGGEGLQPTMFNGELGAIKHQALDTVRYDYGHYLIMLGPFQPWSGLTAPPCPYAESSWAQAAVQTALELFSALYPAPCISGYARPPGPSAVIEHLGSLVPKGGLLLFLSHLPDDVKDGLGEMGPARATGPGMQQFVSSYFLNPACSNVFITVRQRGEKINGRTVLQALGRACDMAGCQHYVLGSTVPLGGLNFVNDLASPVSTAEMMDDFSPFFTVEFPPIQEEGASSPVPLDVDESMDISPSYELPWLSLESCLTSILSHPTVGSKEHLVRHTDRVSGGRVAQQPGVGPLDLPLADYAFVAHSQVWTRPGGAPPLPYRTWDRMTEKLLVSAKPGGENVKVSGTVITLGEQGYKVSLDLREGTRLAMAEALLNAACAPILDPEDVLLTLHLHLDPRRADNSAVMEAMTAASDYARGLGVKLTFGSASCPETGSSASNFMTVVASVSAPGEFSGPLITPVLQKTGSLLIAVRCGDGKIQGGSLFEQLFSDVATTPRAPEALSLKNLFRAVQQLVKSGIVLSGHDISDGGLVTCLVEMALAGQRGVTITMPVASDYLPEMFAEHPGLVFEVEERSVGEVLQTLRSMNMYPAVLGRVGEQGPDQMFEVQHGPETVLRQSLRLLLGTWSSFASEQYECLRPDRINRSMHVSDYGYNEALAVSPLTGKNLSPRRLVTEPDPRCQVAVLCAPGTRGHESLLAAFTNAGCLCRRVFFREVRDNTFLDKYVGLAIGGVHGARDSALAGRATVALINRFPALRDAILKFLNRPDTFSVALGELGVQVLAGLGAVGSTDNPPAPGVEVNVQRSPLILAPNASGMFESRWLNISIPATTSSVMLRGLRGCVLPCWVQGSCLGLQFTNLGMPYVLQNAHQIACHFHSNGTDAWRFAMNYPRNPTEQGNIAGLCSRDGRHLALLCDPSLCTDFWQWEHIPPAFGHPTGCSPWTLMFQAAHLWSLRHGRPSE(SEQ ID NO:116)；或其功能变体，其与本文描述的多肽序列至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一。
在一些实施方案中，所述EBV VLP包含BNRF1-EBNA3C-EBNA1融合蛋白的蛋白质序列，表示为：
MEERGRETQMPVARYGGPFIMVRLFGQDGEANIQEERLYELLSDPRSALGLDPGPLIAENLLLVALRGTNNDPRPQRQERARELALVGILLGNGEQGEHLGTESALEASGNNAPPNENPYHARRGIKEHVIQNAFRASGIMAPPVVRMFMRERQLPQSTGRKPASGPKFENIAEGLRALLARSHVERTTDEGTWVARGTALAIPQCRLTPLSRLPFGMAPGNYVYAYGPDWMARPSTWSAEIQQFLRLLGATYVLRVEMGRQFGFEVHRSRPSFRQFQAINHLVLFDNALRKYDSGQVAAGFQRALLVAGPETADTRPDLRKLNEWVFGGRAAGGRQLADELKIVSALRDTYSGHLVLQPTETLDTWKVLSRDTRTAHSLEHGFIHAAGTIQANCPQLFMRRQHPGLFPFVNAIASSLGWYYQTATGPGADARAAARRQQAFQTRAAAECHAKSGVPVVAGFYRTINATLKGGEGLQPTMFNGELGAIKHQALDTVRYDYGHYLIMLGPFQPWSGLTAPPCPYAESSWAQAAVQTALELFSALYPAPCISGYARPPGPSAVIEHLGSLVPKGGLLLFLSHLPDDVKDGLGEMGPARATGPGMQQFVSSYFLNPACSNVFITVRQRGEKINGRTVLQALGRACDMAGCQHYVLGSTVPLGGLNFVNDLASPVSTAEMMDDFSPFFTVEFPPIQEEGASSPVPLDVDESMDISPSYELPWLSLESCLTSILSHPTVGSKEHLVRHTDRVSGGRVAQQPGVGPLDLPLADYAFVAHSQVWTRPGGAPPLPYRTWDRMTEKLLVSAKPGGENVKVSGTVITLGEQGYKVSLDLREGTRLAMAEALLNAACAPILDPEDVLLTLHLHLDPRRADNSAVMEAMTAASDYARGLGVKLTFGSASCPETGSSASNFMTVVASVSAPGEFSGPLITPVLQKTGSLLIAVRCGDGKIQGGSLFEQLFSDVATTPRAPEALSLKNLFRAVQQLVKSGIVLSGHDISDGGLVTCLVEMALAGQRGVTITMPVASDYLPEMFAEHPGLVFEVEERSVGEVLQTLRSMNMYPAVLGRVGEQGPDQMFEVQHGPETVLRQSLRLLLGTWSSFASEQYECLRPDRINRSMHVSDYGYNEALAVSPLTGKNLSPRRLVTEPDPRCQVAVLCAPGTRGHESLLAAFTNAGCLCRRVFFREVRDNTFLDKYVGLAIGGVHGARDSALAGRATVALINRFPALRDAILKFLNRPDTFSVALGELGVQVLAGLGAVGSTDNPPAPGVEVNVQRSPLILAPNASGMFESRWLNISIPATTSSVMLRGLRGCVLPCWVQGSCLGLQFTNLGMPYVLQNAHQIACHFHSNGTDAWRFAMNYPRNPTEQGNIAGLCSRDGRHLALLCDPSLCTDFWQWEHIPPAFGHPTGCSPWTLMFQAAHLWSLRHGRPSE(SEQ IDNO:117)；或其功能变体，其与本文描述的多肽序列至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一。
在本发明的免疫原性组合物的一些优选实施方案中，EBV-VLP包含选自gp350(UniProt条目P03200)、BKRF4(UniProt条目P30117)、BVRF1(UniProt条目P03233)、BDLF3(UniProt条目P03224),BZLF2(UniProt条目P03205)、BXLF2(UniProt条目P03231)、BNRF1(UniProt条目P03179)、BALF4(UniProt条目P03188)和BZLF1(UniProt条目P03206)的一种、两种、三种、四种或更多种EBV蛋白；或其与本文描述的多肽序列至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一的功能变体。
在本发明的免疫原性组合物的一些优选实施方案中，EBV-VLP包含gp350(UniProt条目P03200)、BKRF4(UniProt条目P30117)、BVRF1(UniProt条目P03233)、BDLF3(UniProt条目P03224)、BZLF2(UniProt条目P03205)、BXLF2(UniProt条目P03231)、BNRF1(UniProt条目P03179)、BALF4(UniProt条目P03188)和BZLF1(UniProt条目P03206)的EBV蛋白，或其与本文描述的多肽序列至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一的功能变体，其中存在多于一个的所述EBV蛋白有助于增强VLP疫苗的免疫原性。
在本发明的免疫原性组合物的一些优选实施方案中，EBV-VLP不包含LMP1(UniProt条目P03230)、EBNA2(UniProt条目P12978)、EBNA3a(UniProt条目P12977)、EBNA3b(UniProt条目P03203)和EBNA3c(UniProt条目P03204)，其中这些B细胞转化EBV蛋白的不存在有助于增强VLP疫苗的安全性。
表A总结了本发明的一个优选的EBV VLP中包含的一些EBV蛋白：
术语“个体”在本文中可与“宿主”、“受试者”互换使用，包括人类、非人类灵长类动物、所有家畜和宠物、野生哺乳动物和家禽，包括但不限于牛、马、母牛、猪、绵羊、山羊、狗、猫、兔子、鹿、貂、鸡、鸭、鹅、火鸡、野鸡(game hen)等。
术语“癌症”是指以异常细胞快速且不受控制的生长为特征的疾病。癌细胞可以局部扩散或通过血液和淋巴系统扩散到身体的其他部位。本文描述了各种癌症的例子，包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等。在一些实例中，所述癌症选自B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、慢性粒细胞白血病(CML)、急性髓系白血病(AML)、骨髓增生异常综合征(MDS)、慢性骨髓增殖性肿瘤(MPN)、B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)、实体瘤、癌或肉瘤；优选地，所述癌症是实体瘤。在另一个实例中，所述癌症是病毒特异性癌症。在一些实例中，所述癌症是EBV相关癌症，选自淋巴组织增殖性疾病(LPD)，例如B细胞淋巴瘤，包括伯基特淋巴瘤(BL)、霍奇金淋巴瘤(HL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、T细胞淋巴瘤、NKT细胞淋巴瘤、NK细胞淋巴瘤，或移植后淋巴组织增殖性疾病(PTLD)，或上皮癌(鼻咽癌、肺癌、乳腺癌)、淋巴上皮瘤、伴有淋巴样间质的癌(GCLS，例如胃癌)或胶质瘤。
DLBCL是一种B细胞癌症。DLBCL通常起源于正常B细胞，但也可能由其他类型的淋巴瘤或白血病恶性转化而来。潜在的免疫缺陷是重要的风险因素，并且已发现EB病毒感染也会导致DLBCL的进展。在一个实施方案中，疱疹病毒相关癌症是DLBCL。
伯基特淋巴瘤是一种淋巴系统癌症，尤其生发中心的B淋巴细胞癌症。伯基特淋巴瘤可分为三种主要临床变体：地方性变体、散发性变体和免疫缺陷相关变体。几乎所有地方性变体都存在EBV感染。在一个实施方案中，疱疹病毒相关癌症是伯基特淋巴瘤。
本公开内容还涉及移植后淋巴组织增殖性疾病(PTLD)、上皮癌(鼻咽癌、肺癌、乳腺癌)、淋巴上皮瘤、伴有淋巴样间质的癌(GCLS，例如胃癌)或胶质瘤的治疗或预防。PTLD是指器官移植后治疗性免疫抑制导致的B细胞增生。这些患者可能出现传染性单核细胞增多症样病变或多克隆多形性B细胞增生。因此，本公开内容还涉及化疗、放疗、免疫抑制或移植后免疫缺陷或免疫功能低下患者的治疗。在一个实施方案中，疱疹病毒相关癌症是PTLD。
鼻咽癌(Nasopharynx cancer)或鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma)(NPC)是起源于鼻咽部的最常见癌症，最常发生在鼻咽部后外侧或咽隐窝，占50％病例。NPC可发生于儿童和成人。在世界卫生组织(WHO)II型和III型肿瘤中，EB病毒与鼻咽癌的关联已得到明确。在一个实施方案中，疱疹病毒相关癌症是NPC。
淋巴上皮瘤是一种低分化鼻咽癌，其特征是肿瘤涉及区域淋巴细胞显著浸润。淋巴上皮瘤在WHO分类系统中也称为“III类鼻咽癌”。在一个实施方案中，疱疹病毒相关癌症是淋巴上皮瘤。
伴有淋巴样间质的癌(GCLS)是胃癌的一种独特组织学亚型，其特征是未分化癌混合显著的淋巴组织浸润。超过80％的GCLS病例与EBV感染有关，但尚不清楚该病毒是否会影响疾病进展。在一个实施方案中，疱疹病毒相关癌症是GCLS。
胶质瘤是一种起源于脑或脊髓胶质细胞的肿瘤。胶质瘤约占所有脑肿瘤和中枢神经系统肿瘤的30％，占所有恶性脑肿瘤的80％。研究表明，EBV在胶质瘤患者中存在频率较高，这表明利用本公开内容可潜在靶向EBV相关的胶质瘤。在一个实施方案中，疱疹病毒相关癌症是胶质瘤。
术语“肿瘤”和“癌症”在本文中可互换使用，例如，这两个术语均涵盖实体和液体肿瘤，例如弥漫性或循环性肿瘤。如本文所用，术语“癌症”或“肿瘤”包括恶化前的以及恶性癌症和肿瘤。
“抗癌效应”是指一种生物学效应，其可通过多种方式体现，包括但不限于：例如，肿瘤体积缩小、癌细胞数量减少、转移灶数量减少、预期寿命延长、癌细胞增殖减少、癌细胞存活降低，或与癌症病况相关的各种生理症状改善。“抗癌效应”还可以体现为组合物、肽和/或细胞能从一开始就预防癌症发生的能力。
术语“特异性结合”是指抗原结合结构域(抗体)或配体能够识别并与样品中存在的同源结合配偶体(例如，T细胞上存在的刺激和/或共刺激分子)蛋白结合，但该抗原结合结构域(抗体)或配体基本上不识别或结合样品中的其他分子。
术语“嵌合抗原受体”或“CAR”是指一种重组多肽构建体，其包含至少一个胞外结构域(包含抗原结合结构域)、一个跨膜结构域和一个胞质信号传导结构域(本文也称为“胞内信号传导结构域”或“胞内结构域”)，该胞质信号传导结构域包含一个衍生自下文定义的刺激分子的功能性信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR多肽构建体中的结构域位于同一条多肽链上，例如，包含一个嵌合融合蛋白。
一方面，胞内结构域包含至少一个激活结构域(例如，CD3-ζ的激活结构域)。一方面，胞内结构域还包含一个或多个共刺激分子，所述共刺激分子衍生自至少一种如下定义的共刺激分子。一方面，共刺激分子选自41BB(即CD137)、CD27、ICOS和/或CD28。一方面，CAR包含嵌合融合蛋白，该嵌合融合蛋白包含胞外抗原识别结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域，该胞内信号传导结构域包含衍生自刺激分子的功能性信号传导结构域。一方面，CAR包含嵌合融合蛋白，该嵌合融合蛋白包含胞外抗原识别结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域，该胞内信号传导结构域包含衍生自共刺激分子的功能性信号传导结构域和衍生自刺激分子的功能性信号传导结构域。一方面，CAR包含嵌合融合蛋白，该嵌合融合蛋白包含胞外抗原识别结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域，该胞内信号传导结构域包含衍生自一个或多个共刺激分子的两个功能性信号传导结构域和衍生自刺激分子的功能性信号传导结构域。一方面，CAR包含嵌合融合蛋白，该嵌合融合蛋白包含胞外抗原识别结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域，该胞内信号传导结构域包含衍生自一个或多个共刺激分子的至少两个功能性信号传导结构域和衍生自刺激分子的功能性信号传导结构域。在一个方面，CAR包含在CAR融合蛋白的氨基末端(N端)的可选的前导序列。在一个方面，CAR还包含在胞外抗原识别结构域的N末端的前导序列，其中在细胞加工和CAR定位至细胞膜期间，前导序列任选地从抗原识别结构域(例如，scFv)上切割。
包含靶向特定肿瘤标志物X的抗原结合结构域(例如，scFv、单结构域抗体或TCR(例如，TCRα结合结构域或TCRβ结合结构域))的CAR也称为XCAR，其中X可以是如本文所述的肿瘤标志物。例如，包含靶向CD 19的抗原结合结构域的CAR称为CD19CAR。CAR可以在任何细胞中表达，例如本文所述的免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)。
术语“信号传导结构域”指蛋白质的功能性部分，其作用是在细胞内传递信息，经由限定的信号传导通路通过产生第二信使或响应这些信使作为效应子行使功能来调节细胞活性。如本文所用，术语“抗体”指衍生自免疫球蛋白分子的蛋白质或多肽序列，其特异性结合抗原。抗体可以是多克隆或单克隆、多链或单链或完整的免疫球蛋白，并且可以衍生自天然来源或重组来源。抗体可以是免疫球蛋白分子的四聚体。
术语“抗体片段”指完整抗体或其重组变体的至少一部分，指足以使抗体片段识别并特异性结合靶标(例如抗原)的抗原结合结构域(例如完整抗体的抗原决定可变区)。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段、scFv抗体片段、线性抗体、单结构域抗体如sdAb(VF或VH)、骆驼科动物VHH结构域，以及由抗体片段形成的多特异性分子，所述抗体片段例如包含两个或多个(例如两个)通过铰链区二硫键连接的Fab片段的二价片段，或连接的抗体的两个或更多个(例如两个)分离的CDR或其它表位结合片段。抗体片段还可以整合到单结构域抗体、超大抗体(maxibody)、微小抗体(minibody)、纳米抗体、胞内抗体、双抗体、三抗体、四抗体、v-NAR和bis-scFv中(参见例如Hollinger和Hudson，NatureBiotechnology 23:1126-1136,2005)。抗体片段还可以移植到基于多肽(例如III型纤连蛋白(Fn3))的支架上(参见美国专利号6,703,199，其中描述了纤连蛋白多肽微小抗体)。
术语“scFv”指包含至少一个包含轻链可变区的抗体片段和至少一个包含重链可变区的抗体片段的融合蛋白，其中轻链和重链可变区通过短的柔性多肽接头连续连接，并且能够表达为单链多肽，并且其中scFv保留了其来源的完整抗体的特异性。除非另有说明，否则本文中使用的scFv可以以任意顺序具有VF和VH可变区，例如，就多肽的N末端和C末端而言，scFv可以包含VF-接头-VH，或可以包含VH-接头-VF。
本文所用的术语“互补决定区”或“CDR”是指抗体可变区内赋予抗原特异性和结合亲和力的氨基酸序列。例如，通常每个重链可变区有三个CDR(例如，HCDR1、HCDR2和HCDR3)，每个轻链可变区有三个CDR(FCDR1、FCDR2和FCDR3)。可以使用多种已知方案的任意方案确定给定CDR的精确氨基酸序列边界，包括由Rabat等人(1991),“Sequences of Proteins ofImmunological Interest”,第5版.美国国立卫生研究院公共卫生服务部,Bethesda,MD(“Rabat”编号方案)、Al-Fazikani等人,(1997)JMB 273,927-948(“Chothia”编号方案)描述的方案，或其组合。根据Kabat编号方案，在一些实施方案中，重链可变结构域(VH)中的CDR氨基酸残基编号为31-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)；并且轻链可变结构域(VL)中的CDR氨基酸残基编号为24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。
根据Chothia编号方案，在一些实施方案中，VH中的CDR氨基酸编号为26-32(HCDR1)、52-56(HCDR2)和95-102(HCDR3)；VL中的CDR氨基酸残基编号为26-32(LCDR1)、50-52(LCDR2)和91-96(LCDR3)。在Kabat和Chothia组合编号方案中，在一些实施方案中，CDR对应于属于Kabat CDR、Chothia CDR或两者的氨基酸残基。例如，在一些实施方案中，CDR对应于VH(例如，哺乳动物VH，例如，人类VH)中的氨基酸残基26-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)；以及VL(例如哺乳动物VL，例如人类VL)中的氨基酸残基24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。
本公开的CAR组合物中包含抗体或其抗体片段的部分可以以多种形式存在，例如，其中抗原结合结构域表达为多肽链的一部分，包括例如，单结构域抗体片段(sdAb)、单链抗体(scFv)或例如人源化抗体(Harlow等人,1999,在:Using Antibodies:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY；Harlow等人,1989,在:Antibodies:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor,New York；Houston等人,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；Bird等人,1988,Science 242:423-426)。在一个方面，本公开的CAR组合物的抗原结合结构域包含抗体片段。在其他方面中，CAR包含含有scFv的抗体片段。
本文所用的术语“结合结构域”或“抗体分子”(本文也称为“抗靶标结合结构域”)是指包含至少一个免疫球蛋白可变结构域序列的蛋白质，例如免疫球蛋白链或其片段。术语“结合结构域”或“抗体分子”涵盖抗体和抗体片段。在一个实施方案中，抗体分子是多特异性抗体分子，例如，它包含多个免疫球蛋白可变结构域序列，其中多个中的第一免疫球蛋白可变结构域序列对第一表位具有结合特异性，多个中的第二免疫球蛋白可变结构域序列对第二表位具有结合特异性。在一些实施方案中，所述抗原结合结构域是scFv结构域。
术语“自体”是指衍生自同一个体的任何材料，后来被重新引入到该个体体内。
“同种异体”是指衍生自与被引入个体同种不同动物的任何材料。当两个或多个个体在一个或多个基因座上的基因不同一时，被称为彼此是同种异体。在某些方面，来自相同物种个体的同种异体材料可能在基因上足够不同，从而产生抗原性相互作用。
如本文所用的术语“衍生自”表示第一和第二分子之间的关系。它通常指第一分子和第二分子之间的结构相似性，并不暗示或包括对衍生自第二分子的第一分子的过程或来源的限制。例如，对于衍生自CD3ζ分子的胞内信号传导结构域，该胞内信号传导结构域保留了足够的CD3ζ结构，使其具有所需的功能，即在适当条件下产生信号的能力。它并不暗示或包含对产生胞内信号传导结构域的特定过程的限制，例如，这并不意味着为了提供胞内信号传导结构域，必须从CD3ζ序列开始，然后删除不需要的序列或施加突变以得到胞内信号传导结构域。
术语“刺激分子”是指由T细胞表达的分子，其提供一级胞质信号传导序列，该序列以刺激方式调节TCR复合物的一级活化，至少在T细胞信号传导通路的某些方面起作用。在一些实施方案中，CAR内部含ITAM的结构域独立于内源性TCR复合物重现一级TCR的信号传导。在一个方面，一级信号由例如TCR/CD3复合物与负载肽的MF1C分子结合启动，并导致介导T细胞应答，包括但不限于增殖、活化、分化等。以刺激方式起作用的一级胞质信号传导序列(也称为“一级信号传导结构域”)可能包含一个信号传导基序，该基序被称为免疫受体酪氨酸活化基序或ITAM。本公开内容中特别有用的含有一级胞质信号传导序列的ITAM的实例包括但不限于衍生自TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278(也称为“ICOS”)、FceRI和CD66d、DAP10和DAP12的那些。在本公开内容的特定CAR中，本公开内容的任何一个或多个CARS中的胞内信号传导结构域包含胞内信号传导序列，例如CD3-ζ的一级信号传导序列。术语“抗原呈递细胞”或“APC”是指免疫系统细胞，例如辅助细胞(例如，B细胞、树突状细胞等)，其在其表面展示与主要组织相容性复合体(MHC)复合的外来抗原。T细胞可能利用其T细胞受体(TCR)识别这些复合物。APC处理抗原并将其呈递给T细胞。
本文使用的术语“胞内信号传导结构域”或“胞内结构域”是指分子的胞内部分。在一些实施方案中，胞内信号结构域转换效应功能信号并指导细胞执行特定功能。虽然可以使用整个胞内信号传导结构域，但在许多情况下不必要使用整条链。在使用胞内信号传导结构域的截短部分时，只要该截短部分能够转换效应功能信号，即可代替完整的链。因此，术语胞内信号传导结构域旨在包括足以转换效应功能信号的胞内信号传导结构域的任何截短部分。
胞内信号传导结构域产生信号，促进含CAR的细胞(例如CART细胞)的免疫效应功能。例如，在CART细胞中，免疫效应功能的实例包括细胞溶解活性和辅助活性，包括细胞因子的分泌。
在一个实施方案中，胞内信号传导结构域可以包含一级胞内信号传导结构域。示例性的一级胞内信号传导结构域包括衍生自负责一级刺激或抗原依赖性刺激的分子的结构域。在一个实施方案中，胞内信号传导结构域可以包含共刺激胞内结构域。示例性的共刺激胞内信号传导结构域包括衍生自负责共刺激信号或抗原非依赖性刺激的分子的结构域。例如，在CART的情况下，一级胞内信号传导结构域可以包含T细胞受体的胞质序列，而共刺激胞内信号传导结构域可以包含来自共受体或共刺激分子的胞质序列。
一级胞内信号传导结构域可包含信号基序，该基序被称为免疫受体酪氨酸活化基序或ITAM。含有一级胞质信号传导序列的ITAM的实例包括但不限于衍生自CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278(也称为“ICOS”)、FceRI、CD66d、DAP 10和DAP12的那些。术语“ζ”或“ζ链”、“CD3-ζ”或“TCR-ζ”指的是CD247。Swiss-Prot登录号P20963提供了示例性的人类CD3ζ氨基酸序列。“ζ刺激结构域”或可替代地“CD3-ζ刺激结构域”或“TCR-ζ刺激结构域”是指CD3-ζ的刺激结构域或其变体(例如，具有突变(例如，点突变、片段、插入或缺失)的分子)。在一个实施方案中，ζ的胞质结构域包含GenBank登录号BAG36664.1的第52至164位残基或其变体(例如，具有突变(例如，点突变、片段、插入或缺失)的分子)。在一个实施方案中，“ζ刺激结构域”或“CD3-ζ刺激结构域”是SEQ ID NO:641或643所提供的序列或其变体(例如，具有突变(例如，点突变、片段、插入或缺失)的分子)。
术语“共刺激分子”是指T细胞上的同源结合配偶体，其与共刺激配体特异性结合，从而介导T细胞的共刺激反应，例如(但不限于)增殖。共刺激分子是除抗原受体或其配体之外的细胞表面分子，是有效免疫反应所必需的。共刺激分子包括但不限于MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整合素、信号淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)、活化NK细胞受体、BTLA、Toll配体受体、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、4-1BB(CD137)、B7-H3、CDS、ICAM-1、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(触觉)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A,Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a以及与CD83特异性结合的配体。
共刺激胞内信号传导结构域是指共刺激分子的胞内部分。
胞内信号传导结构域可以包含其从其衍生的分子的完整胞内部分或完整天然胞内信号传导结构域，或其功能性片段。术语“4-1BB”指CD137或肿瘤坏死因子受体超家族成员9。Swiss-Prot登录号P20963提供了示例性人4-1BB氨基酸序列。“4-1BB共刺激结构域”指4-1BB的共刺激结构域或其变体(例如，具有突变(例如点突变、片段、插入或缺失)的分子)。
本文中使用的术语“免疫效应细胞”是指参与免疫反应(例如促进免疫效应反应)的细胞。免疫效应细胞的实例包括T细胞(例如α/βT细胞和γ/δT细胞)、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、肥大细胞和髓源性吞噬细胞。
术语“内源性”是指来自或在生物体、细胞、组织或系统内部产生的任何物质。
术语“外源性”是指从生物体、细胞、组织或系统外部引入或产生的任何物质。
术语“表达”指特定核苷酸序列的转录和/或翻译。在一些实施方案中，表达包含引入细胞的mRNA的翻译。
术语“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包含可操作地连接至待表达的核苷酸序列的表达控制序列。
术语“核酸”或“多核苷酸”指单链或双链形式的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其聚合物。除非另有规定，该术语涵盖含有已知天然核苷酸类似物的核酸，所述类似物具有与参考核酸相似的结合特性，并以与天然存在的核苷酸相似的方式代谢。除非另有说明，特定核酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代，例如，保守替换)、等位基因、直系同源物、SNP和互补序列以及明确指出的序列。具体而言，简并密码子替换，例如保守替换，可以通过生成其中一个或多个选定(或所有)密码子的第三位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现(Batzer等人,Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；和Rossolini等人,Mol.Cell.Probes 8:91-98(1994))。
术语“癌症相关抗原”或“肿瘤抗原”可互换使用，指在癌细胞表面表达的分子(通常为蛋白质、碳水化合物或脂质)，其整体或以片段(例如，MHC/肽)的形式表达，并且可用于将药剂优先靶向癌细胞。在一些实施方案中，肿瘤抗原是正常细胞和癌细胞均表达的标志物，例如谱系标志物，例如B细胞上的CD19。在一些实施方案中，肿瘤抗原是与正常细胞相比在癌细胞中过表达的细胞表面分子，例如，与正常细胞相比，1倍过表达、2倍过表达、3倍过表达或更多。在一些实施方案中，肿瘤抗原是指癌细胞中合成不当的细胞表面分子，例如，与正常细胞表达的分子相比，含有缺失、添加或突变的分子。在一些实施方案中，肿瘤抗原将完全或以片段(例如，MHC/肽)的形式仅在癌细胞表面表达，而不在正常细胞表面合成或表达。在一些实施方案中，本公开的CAR包括包含与MHC呈递肽结合的抗原结合结构域(例如，抗体或抗体片段)的CAR。通常，衍生自内源性蛋白质的肽填充主要组织相容性复合体(MHC)I类分子的口袋，并被CD8+T淋巴细胞上的T细胞受体(TCR)识别。MHC I类复合物由有核细胞组成性表达。在癌症中，病毒特异性和/或肿瘤特异性肽/MHC复合物代表了一类独特的免疫疗法细胞表面靶点。已经描述了在人类白细胞抗原(HLA)-Al或HLA-A2背景下靶向衍生自病毒或肿瘤抗原的肽的TCR样抗体(参见例如Sastry等人,J Virol.2011 85(5):1935-1942；Sergeeva等人,Blood,2011 117(16):4262-4272；Verma等人,J Immunol 2010184(4):2156-2165；Willemsen等人,Gene Ther 2001 8(21):1601-1608；Dao等人,Sci TranslMed2013 5(176):l76ra33；Tassev等人,Cancer Gene Ther 2012 19(2):84-100)。例如，可以通过筛选文库(例如人类scFv噬菌体展示文库)来鉴定TCR样抗体。
术语“受试者”旨在包括可引发免疫反应的生物体(例如哺乳动物、人类)
术语“转染”、“转化”或“转导”是指将外源核酸转移或引入宿主细胞的过程。“转染”、“转化”或“转导”的细胞是指已被外源核酸转染、转化或转导的细胞。所述细胞包括原代受试者细胞及其子代。
组合物和医疗用途
在一些方面，本公开提供了用于改善免疫细胞疗法的组合物，其中所述组合物包含：(a)聚肌苷酸-聚胞苷酸(PIC)，(b)稳定剂，(c)至少一种阳离子。在一些实施方案中，所述组合物可用于引发、诱导、增强和/或加强免疫反应，所述免疫反应可以是免疫细胞疗法介导的先天性和/或适应性免疫反应。在一些实施方案中，所述免疫细胞是表达嵌合抗原受体(CAR)分子的免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)，例如，结合肿瘤抗原(例如，在实体瘤或血液系统肿瘤表面表达的抗原)的CAR分子。
在一些实施方案中，本公开提供了免疫原性组合物，其包含：(a)聚肌苷酸-聚胞苷酸(PIC)，(b)稳定剂，其为氨基糖苷类抗生素或非氨基糖苷类胺，(c)至少一种阳离子，优选为钙。在一些实施方案中，所述组合物还包含至少一种免疫原或抗原。在一些实施方案中，所述免疫原或抗原是重组蛋白、病毒样颗粒(VLP)、肽、mRNA或疫苗。
在一些实施方案中，本发明涉及包含EB病毒(EBV)VLP的免疫原性组合物。所述免疫原性组合物可用于诱导个体中免疫反应的激活和/或增强，例如用于癌症治疗的免疫细胞疗法(优选CAR-T细胞疗法)的免疫反应。所述免疫原性组合物可与工程化免疫细胞(例如CAR-T细胞或工程化TCR-T细胞)组合用于治疗癌症。在一些实例中，所述免疫原性组合物将与工程化免疫细胞(优选CAR-T细胞，更优选靶向EBV相关癌症的CAR-T细胞)组合施用(同时或依次)。
在一些实施方案中，所述免疫原性组合物可用于诱导个体中免疫反应的激活和/或增强，例如用于癌症治疗的免疫细胞疗法(优选CAR-T细胞疗法)的免疫反应。在一些其他实施方案中，所述免疫原性组合物还可用于与工程化免疫细胞(优选CAR-T细胞或工程化TCR-T细胞)组合还可用于用于治疗癌症。在一个实施方案中，所述免疫原性组合物增强细胞疗法的抗癌效果。
PIC通常是双链聚合物，包含一条链的肌苷酸聚合物(聚肌苷酸；polyI)和一条链的胞苷酸聚合物(聚胞苷酸聚肌苷酸polyC)。聚合物骨架可以是脱氧核糖核酸骨架或核糖核酸骨架。PIC可以是寡核苷酸类似物。在一个优选实施方案中，聚肌苷酸优选为聚核糖肌苷酸。在一个优选实施方案中，聚胞苷酸优选为聚核糖胞苷酸。在优选实施方案中，PIC为聚核糖肌苷酸：聚核糖胞苷酸，即双链RNA(dsRNA)样聚合物。
在一些实施方案中，PIC的浓度为0.5mg/ml至10mg/ml。
在一些实施方案中，PIC的分子量不均一，其中平均分子量等于或大于66,000道尔顿。66,000道尔顿对应的分子大小为6.4个沉降单位(斯维德伯格)。在一些实施方案中，PIC具有等于或大于150,000道尔顿的平均分子量或等于或大于9.3斯维德伯格的平均分子大小。在一些实施方案中，PIC具有等于或大于250,000道尔顿的平均分子量或等于或大于11.8斯维德伯格的平均分子大小。在一些实施方案中，PIC具有等于或大于350,000道尔顿的平均分子量或等于或大于15.3斯维德伯格的平均分子大小。
在一些实施方案中，PIC的分子量为66,000至2,000,000道尔顿。在一些实施方案中，PIC的分子量为66,000至1,200,000道尔顿(相当于6.4至24.0沉降单位)。在一些实施方案中，PIC的分子量为66,000至660,000道尔顿，或分子大小范围为约6.4至18.3斯维德伯格。在一些实施方案中，PIC的分子量范围为约300,000至1,200,000道尔顿，或大小范围为约6.4至24.0斯维德伯格。在一些实施方案中，PIC的分子量范围为约300,000至660,000道尔顿或分子大小范围为约12.8至18.3斯维德伯格。在一些其他实施方案中，PIC的分子量为100,000至200,000道尔顿，或300,000至4,000,000道尔顿，或500,000至1,000,000道尔顿，或1,000,000至1,500,000道尔顿，或1,500,000至2,000,000道尔顿，或2,000,000至2,500,000道尔顿，或2,500,000至3,000,000道尔顿，或3,000,000至3,500,000道尔顿，或3,500,000至4,000,000道尔顿，或4,000,000至4,500,000道尔顿，或4,500,000至5,000,000道尔顿。
在一些实施方案中，PIC组合物通过按一定比例混合聚肌苷酸和聚胞苷酸获得。优选地，所述比例可为0.5:1.0、0.6:1.0、0.7:1.0、0.8:1.0、0.9:1.0、1.0:1.0、1.0:1.1、1.0:1.2、1.0:1.3、1.0:1.4、1.0:1.5、1.5:1.0、1.4:1.0、1.3:1.0、1.2:1.0、1.1:1.0、1.0:0.9、1.0:0.8、1.0:0.7、1.0:0.6、或1.0:0.5。在一个优选的实施方案中，所述比例是1:1。此外，所述混合物还混合有200至2000IU的卡那霉素，以及0.02至10mM的CaCl2。
在一些具体实施方案中，所述稳定剂选自他克罗霉素(tacrolamycin)、蒽环类药物、硫酸丁酸甘油酯(butyrin sulphate)、庆大霉素、潮霉素、阿米卡星、双脱氧卡那霉素、尼拉霉素、β-内酰胺、新霉素、嘌呤霉素、链霉素、链脲佐菌素及其任意组合。所述多胺化合物选自精氨酸盐、亚精胺、N-(3-氨基丙基)、N-(3-氨基丙基)-1,4-丁二胺、精胺、OS-二甲氨基硫代磷酸酯、聚赖氨酸、氨基糖苷及其任意组合。在一些具体实施方案中，所述稳定剂为卡那霉素。在另一具体实施方案中，所述稳定剂为ε-聚赖氨酸、己基葡萄糖胺、聚乙二醇单甲醚、聚乙二醇、聚乙烯亚胺、叶酸、半乳糖或乙酰葡萄糖胺。在一些实施方案中，所述组合物中稳定剂的浓度为10单位/ml至100,000单位/ml，优选为100单位/ml至10,000单位/ml，更优选为500单位/ml至5,000单位/ml。
在一些实施方案中，所述正离子为阳离子，选自钙、镉、锂、镁、铈、铯、铬、钴、氘、镓、碘、铁、锌及其任意组合。在一些具体实施方案中，所述正离子为钙。所述正离子可以为任何合适的盐或有机复合物的形式，包括但不限于氯化物、氟化物、氢氧化物、磷酸盐或硫酸盐。例如，当所述正离子为钙时，所述钙离子可以为碳酸钙、氯化钙、氟化钙、氢氧化钙、磷酸钙或硫酸钙的形式。在一些实施方案中，组合物中阳离子的浓度为0.01pmol至10mmol/ml，优选0.02pmol至5mmol/ml，更优选0.1pmol至1mmol/ml，最优选0.1pmol至100pmol/ml。
在一些实施方案中，免疫原是重组蛋白。在一些实施方案中，免疫原是病毒样颗粒(VLP)。在一些实施方案中，免疫原是肽疫苗。在一些实施方案中，免疫原是mRNA疫苗。在一些其他实施方案中，免疫原可以是一种或多种衍生自癌细胞的多肽/肽或其抗原片段或变体。应当理解，本文所述的免疫原还可以包含其他组分。例如，一种或多种免疫原可以包含在脂质或脂质体中。在一些实施方案中，对应于癌症抗原的肽或多肽通常长度为10-20个氨基酸残基，并且可以含有一个以上的肽决定簇或最多约30-50个残基。在一些实施方案中，所述多肽的长度为10至约150个残基或更多。在一些实施方案中，也可以制备更长的肽或多肽，例如通过重组方法。在某些实施方案中，编码本文所述抗原组合物和/或组分的核酸可用于例如在体外或体内制备用于本公开的各种组合物和方法的抗原组合物。例如，在某些实施方案中，编码抗原的核酸包含在例如重组细胞中的载体中。可以表达所述核酸以产生包含抗原序列的肽或多肽。该肽或多肽可以从细胞分泌，或作为细胞的一部分或包含在细胞内。在一些实施方案中，免疫原与CAR识别的抗原同一或衍生自相同的抗原。
在一些实施方案中，免疫原是“肿瘤相关抗原”或“癌症抗原”，并且可以选自CTA、NY-ESO-1、LAGE-1、MAGE-A1、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A10、CT7、CT10、GAGE、PRAME；BAGE；RAGE、SAGE、HAGE、MPHOSPH1、DEPDC1、IMP3和MAGE-A，以及T抗原BK、p53、Ras、c-Myc、A-Raf、B-Raf、C-Raf、细胞周期蛋白依赖性激酶、MAGE-A2、MAGE-A6、MAGE-A10、MAGE-A12、MART-1、BAGE、DAM-6、-10、GAGE-1、-2、-8、GAGE-3、-4、-5、-6、-7B、NA88-A、MART-1、MC1R、Gp100、PSA、PSM、络氨酸酶、TRP-1、TRP-2、ART-4、CAMEL、CEA、Cyp-B、hTERT、hTRT、iCE、MUC1、MUC2、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、TRK、PRAME、P15、RU1、RU2、SART-1、SART-3受体、Wilms肿瘤抗原(WT1)、AFP、β-连环蛋白/ш、caspases-8/m、CEA、CDK-4/m、ELF2M、GnT-V、G250、HSP70-2M、HST-2、KIAA0205、MUM-1、MUM-2、MUM-3、肌球蛋白/m、RAGE、SART-2、TRP-2/INT2、707-AP、膜联蛋白II、CDC27/m、TPI/mbcr-abl、BCRABL、干扰素调节因子4(IRF4)、ETV6/AML、LDLR/FUT、Pml/RARa、肿瘤相关钙信号转导蛋白1(TACSTD1)TACSTD2受体酪氨酸激酶、表皮生长因子受体(EGFR)、EGFRvIII、血小板生长因子受体(PDGFR)、血管内皮生长因子受体ia(VEGFR)、细胞质酪氨酸激酶、src家族、syk-ZAP70、整合素连接激酶(ILK)、信号转导和转录激活因子STAT3、STAT5和STAT6、缺氧诱导的因子、HIF-1a和HIF-2a、核因子κB(NF-kB)、Notch、Notch1-4、c-Met受体、哺乳动物雷帕霉素靶点(mTOR)、WNT、细胞外信号调节激酶(ERK)、PMSA、PR-3、MDM2、间皮素、癌症肾细胞-5T4、SM22-α、碳酸酐酶I(CAI)和IX(CAIX)、STEAD、TEL/AML1，GD2、蛋白酶3、hTERT、肉瘤易位控制点、EphA2、ML-IAP、EpCAM、ERG(融合基因TMPRSS2 ETS)、NA17、PAX3、ALK、雄激素受体、zclin B1、多聚唾液酸、MYCN、RhoC、GD3、岩藻糖基GM1、间皮素(mesotheliana)、PSCA、sLe、PLAC1、GM3、BORIS、Tn、GLoboH、NYBR-1、RGSART3、STn、PAX5、OY-TES1、精子蛋白17、LCK、HMWMAA、AKAP-4、SSX2、XAGE 1、B7H3、legumain、TIE2、Page4、MAD-CT-1、FAP、MAD-CT-2和fos相关抗原1。
在另一实施方案中，免疫原是来自致癌病毒的病毒抗原。典型的致癌病毒包括但不限于EBV、HPV、HBV、HCV、HTLV和KSHV。来自本公开内容中可以使用的致癌病毒的典型病毒抗原包括但不限于EBV：EBNA-1、LMP-1、LMP-2A；HPV：E6、E7、E5；HBV：HBx；HCV：Core、NS3、Ns5A；HTLV：Tax、HBZ；KSHV：vFLIP、LANA、vGPCR、vIRF-1。
在一些实施方案中，免疫原是病毒样颗粒(VLP)。在另一实施方案中，所述免疫原是EB病毒(EBV)的VLP，优选地所述VLP包含糖蛋白350/220(gp350)蛋白或其片段。
在一些实施方案中，所述组合物通过肠胃外施用、肌肉注射、腹腔灌注、胸膜内灌注、静脉灌注、皮下注射、心包内注射、吸入、直肠内灌注、栓剂、鼻内、眼部、透皮或口服施用来施用。
在一些实施方案中，PIC优选为合成的，并且优选通过从头化学合成获得。合成的PIC分子可从商业供应商处获得(例如Sigma或Midland Certified)。PIC分子可以合成或化学修饰，以包含2'位修饰，例如2’O-甲基、2'-氟或2’-NH2。
在一些实施方案中，本文所述的免疫细胞可选自T淋巴细胞、NK细胞、巨噬细胞和树突状细胞，其中T淋巴细胞优选为细胞毒性T淋巴细胞或辅助性T淋巴细胞，更优选为细胞毒性T淋巴细胞。所述免疫细胞可以是T淋巴细胞。所述T淋巴细胞可以是细胞毒性T淋巴细胞。所述T淋巴细胞可以是辅助性T淋巴细胞。所述免疫细胞可以是NK细胞。所述免疫细胞可以是巨噬细胞。所述免疫细胞可以是树突状细胞。本领域已知这些免疫细胞能够响应不需要的因子、细胞或病原体(例如被疱疹病毒感染的细胞)而表现出细胞毒性和/或其他有益活性。通过将这些细胞的活性导向特定的免疫原性靶点，即本文所述的疱疹病毒抗原，可以通过本文所述的免疫细胞的相应活性消除受感染的致病细胞。
嵌合抗原受体(CAR)
一方面，本文公开了使用表达CAR分子的细胞(例如，细胞群体)的方法。一方面，示例性CAR构建体包含任选的前导序列(例如，本文所述的前导序列)、抗原结合结构域(例如，本文所述的抗原结合结构域)、铰链区(例如，本文所述的铰链区)、跨膜结构域(例如，本文所述的跨膜结构域)和胞内刺激结构域(例如，本文所述的胞内刺激结构域)。一方面，示例性CAR构建体包含任选的前导序列(例如，本文所述的前导序列)、胞外抗原结合结构域(例如，本文所述的抗原结合结构域)、铰链区(例如，本文所述的铰链区)、跨膜结构域(例如，本文所述的跨膜结构域)、胞内共刺激信号传导结构域(例如，本文所述的共刺激信号传导结构域)和/或胞内一级信号传导结构域(例如，本文所述的一级信号传导结构域)。
CAR抗原结合结构域
在一个方面，包含抗原结合结构域的CAR部分包含靶向肿瘤抗原(例如本文所述的肿瘤抗原)的抗原结合结构域。在一些实施方案中，所述抗原结合结构域结合至：CD19；CD123；CD22；CD30；CD171；CS-1；C型凝集素样分子-1，CD33；表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII)；神经节苷脂G2(GD2)；神经节苷脂GD3；TNF受体家族成员；B细胞成熟抗原(BCMA)；Tn抗原((TnAg)或(GalNAca-Ser/Thr))；前列腺特异性膜抗原(PSMA)；受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)；Fms-Fike酪氨酸激酶3(FFT3)；肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)；CD38；CD44v6；癌胚抗原(CEA)；上皮细胞粘附分子(EPCAM)；B7H3(CD276)；KIT(CD 117)；白细胞介素13受体亚基α-2；间皮素；白细胞介素11受体α(IL-11Ra)；前列腺干细胞抗原(PSCA)；丝氨酸蛋白酶21；血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)；Lewis(Y)抗原；CD24；血小板衍生的生长因子受体β(PDGFR-β)；阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA-4)；CD20；叶酸受体α；受体酪氨酸蛋白激酶ERBB2(Her2/neu)；粘蛋白1，细胞表面相关(MUC1)；表皮生长因子受体(EGFR)；神经细胞粘附分子(NCAM)；前列腺酶；前列腺酸性磷酸酶(PAP)；延伸因子2突变(ELF2M)；肝配蛋白B2；成纤维细胞活化蛋白α(FAP)；胰岛素样生长因子1受体(IGF-1受体)，碳酸酐酶IX(CAIX)；蛋白酶体(Prosome，Macropin)亚基，β型，9(LMP2)；糖蛋白100(gp100)；由断点簇区域(BCR)和Abelson鼠白血病病毒致癌基因同源物1组成的致癌基因融合蛋白；酪氨酸酶；ephrin A型受体2(EphA2)；岩藻糖基GM1；唾液酸化的Lewis粘附分子(sLe)；神经节苷脂GM3；谷氨酰胺转氨酶5(TGS5)；高分子量黑色素瘤相关抗原(HMWMAA)；o-乙酰-GD2神经节苷脂(OAcGD2)；叶酸受体β；肿瘤内皮细胞标志物1(TEM1/CD248)；肿瘤内皮细胞标志物7相关(TEM7R)；紧密连接蛋白6(CLDN6)；促甲状腺激素受体(TSHR)；G蛋白偶联受体C类第5组，成员D(GPRC5D)；X染色体开放阅读框61(CXORF61)；CD97；CD179a；间变性淋巴瘤激酶(ALK)；多聚唾液酸；胎盘特异性1(PLAC1)；globoH糖神经酰胺的六糖部分(GloboH)；乳腺分化抗原(NY-BR-1)；尿斑块蛋白2(UPK2)；甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1)；肾上腺素能受体β3(ADRB3)；泛素连接蛋白3(PANX3)；G蛋白偶联受体20(GPR20)；淋巴细胞抗原6复合物，基因座K 9(LY6K)；嗅觉受体51E2(OR51E2)；TCRγ交替阅读框架蛋白(TARP)；Wilms肿瘤蛋白(WT1)；癌症/睾丸抗原1(NY-ESO-1)；癌症/睾丸抗原2(LAGE-la)；黑色素瘤相关抗原1(MAGE-A1)；ETS易位变异基因6，位于12p染色体上(ETV6-AML)；精子蛋白17(SPA 17)；X抗原家族，成员1A(XAGE1)；血管生成素结合细胞表面受体2(Tie2)；黑素瘤癌睾丸抗原-1(MAD-CT-1)；黑素瘤癌睾丸抗原-2(MAD-CT-2)；Fos相关抗原1；肿瘤蛋白p53(p53)；p53突变体；前列腺癌标志物(prostein)；存活蛋白(surviving)；端粒酶；前列腺癌肿瘤抗原-1，T细胞识别的黑素瘤抗原1；大鼠肉瘤(Ras)突变体；人类端粒酶逆转录酶(hTERT)；肉瘤易位断点(sarcoma translocation breakpoints)；黑素瘤凋亡抑制剂(ML-IAP)；ERG(跨膜蛋白酶，丝氨酸2(TMPRSS2)ETS融合基因)；N-乙酰葡糖胺基转移酶V(NA17)；配对盒蛋白Pax-3(PAX3)；雄激素受体；细胞周期蛋白Bl；v-myc禽类髓细胞瘤病毒致癌基因神经母细胞瘤衍生同源物(MYCN)；Ras同源物家族成员C(RhoC)；酪氨酸酶相关蛋白2(TRP-2)；细胞色素P4501B1(CYP1B1)；CCCTC-结合因子(锌指蛋白)-Fike，T细胞识别的鳞状细胞癌抗原3(SART3)；配对盒蛋白Pax-5(PAX5)；前顶体素结合蛋白sp32(OY-TES1)；淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(FCK)；A激酶锚定蛋白4(AKAP-4)；滑膜肉瘤，X断点2(SSX2)；晚期糖基化终产物受体(RAGE-l)；肾普遍存在1(renal ubiquitous 1)(RU1)；肾普遍存在2(RU2)；天冬酰胺内切肽酶(legumain)；人乳头瘤病毒E6(HPV E6)；人乳头瘤病毒E7(HPV E7)；肠道羧基酯酶；热休克蛋白70-2突变(mut hsp70-2)；CD79a；CD79b；CD72；白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)；IgA受体的Fc片段(FCAR或CD89)；白细胞免疫球蛋白样受体亚家族A成员2(LILRA2)；CD300分子样家族成员f(CD300LF)；C型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A)；骨髓基质细胞抗原2(BST2)；含EGF样模块的粘蛋白样激素受体样2(EMR2)；淋巴细胞抗原75(LY75)；磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)；Fc受体样5(FCRL5)；或免疫球蛋白λ样多肽1(IGLL1)。
在一些实施方案中，CAR识别的所述抗原是病毒抗原。在一些实施方案中，CAR识别的所述抗原是EB病毒抗原(EBV抗原)。在一些实施方案中，所述EBV抗原可存在于EBV感染细胞的表面，优选EBV感染的癌细胞、EBV感染的B细胞或EBV感染的上皮细胞。EBV抗原可以是EBV病毒体包膜蛋白或EBV包膜复合物的蛋白(例如gB、gL或gH)。EBV病毒抗原优选为EBV糖蛋白350/220(gp350/220)。在优选实施方案中，本公开集中于靶向EBV抗原和治疗EBV相关的医疗状况。示例性EBV gp350蛋白显示在UniProt数据库P03200-1条目(1986年7月21日版本1)中。示例性EBV gp220显示在同一个数据库条目中，但缺失了502至750位。
在一些实施方案中，本公开的CAR包含抗原结合结构域，该抗原结合结构域包含如表1和表2所提供的重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，或如表1和表2所提供的特定的VH和VL组合。在另一个实施方案中，所述CAR包含抗原结合结构域，该结构域包含与表1和表2中提供的VH和/或VL氨基酸序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％同一性的重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)。在另一个实施方案中，所述CAR包含与EBV gp350上的相同表位结合或竞争性结合EBV gp350的抗原结合结构域，其包含含有如表1和表2中提供的VH和VL特异性组合的抗原结合结构域。
在一些实施方案中，本公开的CAR包含结合EBV糖蛋白350/220(gp350/220)的抗原结合结构域，其中所述抗原结合结构域包含：
(1)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:1的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:6的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；
(2)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:2的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:7的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；
(3)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:3的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:8的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；
(4)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:4的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:9的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；
(5)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:5的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:10的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；
(6)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:138的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:141的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；
(7)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:138的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:142的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；
(8)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:138的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:143的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；
(9)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:139的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:141的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；
(10)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:139的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:142的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；
(12)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:139的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:143的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；
(13)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:140的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:141的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；
(14)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:140的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID No:142的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；或
(15)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:140的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:143的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体。
在一些实施方案中，本公开的CAR包含抗原结合结构域，所述结构域包含如表3和表4所提供的一个、两个、三个或更多个HCDR和/或一个、两个、三个或更多个LCDR，或如表3和表4所提供的特定的HCDR1-3和LCDR1-3组合。
在一些实施方案中，所述CAR包含结合EBV糖蛋白350/220(gp350/220)的抗原结合结构域，其中所述抗原结合结构域包含重链互补决定区1(HCDR1)、HCDR2、HCDR3，轻链互补决定区1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3，具有如下多肽序列：
(1)SEQ ID NO:11、12、13、26、27和28，分别地；
(2)SEQ ID NO:14、15、16、29、30和31，分别地；
(3)SEQ ID NO:17、18、19、32、33和34，分别地；
(4)SEQ ID NO:20、21、22、35、36和37，分别地；或
(5)SEQ ID NO:23、24、25、38、39和40，分别地；或
EBV糖蛋白350/220抗原结合结构域，其与其竞争或结合至与本文所述的CAR的抗原结合结构域(1)至(5)中的任一项所结合的EBV糖蛋白350/220中的表位相同的表位。
在一些实施方案中，本公开的CAR包含如表5所提供的氨基酸序列，优选地该CAR包含选自SEQ ID NO:144至161的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述CAR包含与表5所提供的CAR序列至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的同一性，优选地该CAR选自SEQ ID NO:144至161
在又一个实施方案中，本公开的CAR的特征在于抗原结合结构域包含可变重链(VH)，所述VH包含：
根据SEQ ID NO:118(GLSLTSN)的重链互补决定区H-CDR1，根据SEQ ID NO:119(WSNGG)的H-CDR2，和根据SEQ ID NO:120(PRYNSGYFFDY)的H-CDR3，或一个或多个与SEQ IDNO 118至120具有至少80％序列同一性的相应CDR序列；
以及可变轻链(VL)，所述VL包含：
根据SEQ ID NO:121(KASESVSTRMH)的轻链互补决定区L-CDR1，根据SEQ ID NO:122(KTSNLAS)的L-CDR2，和根据SEQ ID NO:123(QQSWNGPLT)的L-CDR3，或一个或多个与SEQID NO 121至123具有至少80％序列同一性的相应CDR序列。
在又一个实施方案中，本公开的CAR的特征在于抗原结合结构域包含可变重链(VH)，所述VH包含：
根据SEQ ID NO:124(GFSLTSY)的重链互补决定区H-CDR1，根据SEQ ID NO:125(WSDGD)的H-CDR2，和根据SEQ ID NO:126(LQSEDTATYYCARLQVFGYPGIRDYVMDA)的H-CDR3，或一个或多个与SEQ ID NO 124至126具有至少80％序列同一性的相应CDR序列；
以及可变轻链(VL)，所述VL包含：
根据SEQ ID NO:127(KSSQSLLSSRHQKNFLA)的轻链互补决定区L-CDR1，根据SEQ IDNO:128(HASTRQS)的L-CDR2，和根据SEQ ID NO:129(LQHYTSPYT)的L-CDR3，或多个与SEQ IDNO 127至129具有至少80％序列同一性的相应CDR序列。
在又一个实施方案中，本公开的CAR包含根据以下的VH结构域：SEQ ID NO 130:
(QVQLKESGPGLVQPSQTLSLTCTVSGLSLTSNGVSWIRQPPGKGLEWLGVIWSNGGTDYN SAIKSRLSFSRDTSKSQVFLKMNSLQTEDTAMYFCARPRYNSGYFFDYWGQGVMVIVSS)
和根据以下的VL结构域：(7A1)SEQ ID NO:131
(DTVLTQSPALAVSPGERVTISCKASESVSTRMHWYRQKPGQQPKLLIYKTSNLASGVPARFSGSGSGTDFTLTIDPVEADDTATYFCQQSWNGPLTFGSGTKLEIKR)，或
根据以下的VH结构域：(6G4)SEQ ID NO:132
(QVQLKESGPGLVQPSQTLSLTCTVSGFSLTSYHVHWVRQPPGKGLEWMGVMWSDGDTLYNSALKSRLSISRDTSKSQVLLQMDSLQSEDTATYYCARLQVFGYPGIRDYVMDAWGQGASVTVSS)
和根据以下的VL结构域：(6G4)SEQ ID NO:133
(DLVMTQSPFSLAVSEGEMVTIKCKSSQSLLSSRHQKNFLAWYRQKPGQSPKLLIYHASTRQSGVPDRFIGSGSGTDFTLTI SDVQAEDLADYYCLQHYTSPYTFGAGTKLELKR)。
在又一个实施例中，本公开的CAR包含根据以下的序列或由根据以下的序列组成：SEQ ID NO:134:
MEFGLSWLFLVAILKGVQCQVQLKESGPGLVQPSQTLSLTCTVSGLSLTSNGVSWIRQPPGKGLEWLGVIWSNGGTDYNSAIKSRLSFSRDTSKSQVFLKMNSLQTEDTAMYFCARPRYNSGYFFDYWGQGVMVTVSSSGGGGSGGGGSGGGGSDTVLTQSPALAVSPGERVTISCKASESVSTRMHWYRQKPGQQPKLLIYKTSNLASGVPARFSGSGSGTDFTLTIDPVEADDTATYFCQQSWNGPLTFGSGTKLEIKGDPAESKYGPPCPPCPGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDPKFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR，或
SEQ ID NO:135
MEFGLSWLFLVAILKGVQCQVQLKESGPGLVQPSQTLSLTCTVSGFSLTSYHVHWVRQPPGKGLEWMGVMWSDGDTLYNSALKSRLSISRDTSKSQVLLQMDSLQSEDTATYYCARLQVFGYPGIRDYVMDAWGQGASVTVSSSGGGGSGGGGSGGGGSDLVMTQSPFSLAVSEGEMVTIKCKSSQSLLSSRHQKNFLAWYRQKPGQSPKLLIYHASTRQSGVPDRFIGSGSGTDFTLTISDVQAEDLADYYCLQHYTSPYTFGAGTKLELKGDPAESKYGPPCPPCPGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDPKFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDPTTPFTCRPCPL，或
SEQ ID NO:136
MEFGLSWLFLVAILKGVQCQVQLKESGPGLVQPSQTLSLTCTVSGLSLTSNGVSWIRQPPGKGLEWLGVIWSNGGTDYNSAIKSRLSFSRDTSKSQVFLKMNSLQTEDTAMYFCARPRYNSGYFFDYWGQGVMVTVSSSGGGGSGGGGSGGGGSDTVLTQSPALAVSPGERVTISCKASESVSTRMHWYRQKPGQQPKLLIYKTSNLASGVPARFSGSGSGTDFTLTIDPVEADDTATYFCQQSWNGPLTFGSGTKLEIKGDPAEPKSPDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDPKFWVISTSGRPWPGLVGSFSCHWLSPFTATTGKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR，或
SEQ ID NO:137:
MEFGLSWLFLVAILKGVQCQVQLKESGPGLVQPSQTLSLTCTVSGFSLTSYHVHWVRQPPGKGLEWMGVMWSDGDTLYNSALKSRLSISRDTSKSQVLLQMDSLQSEDTATYYCARLQVFGYPGIRDYVMDAWGQGASVTVSSSGGGGSGGGGSGGGGSDLVMTQSPFSLAVSEGEMVTIKCKSSQSLLSSRHQKNFLAWYRQKPGQSPKLLIYHASTRQSGVPDRFIGSGSGTDFTLTISDVQAEDLADYYCLQHYTSPYTFGAGTKLELKGDPAEPKSPDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDPKFWVISTSGRPWPGLVGSFSCHWLSPFTATTGKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCERVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLY。
抗原结合结构域可以是结合抗原的任何结构域，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体及其功能片段，包括但不限于单结构域抗体(例如重链可变结构域(VH)、轻链可变结构域(VL)和骆驼科动物衍生的纳米抗体的可变结构域(VHH))，以及本领域中已知可充当抗原结合结构域的替代支架(例如重组纤连蛋白结构域、T细胞受体(TCR)或其片段，例如单链TCR等)。在某些情况下，抗原结合结构域衍生自CAR最终将用于的同一物种是有益的。例如，为了在人类中使用，CAR的抗原结合结构域包含抗体或抗体片段的抗原结合结构域的人类或人源化残基可能是有益的。
CAR跨膜结构域
关于跨膜结构域，在多种实施方案中，CAR可设计为包含附于CAR胞外结构域的跨膜结构域。跨膜结构域可包含一个或多个与跨膜区相邻的另外的氨基酸，例如，与跨膜蛋白衍生自的蛋白质胞外区相关的一个或多个氨基酸(例如，胞外区的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10至最多15个氨基酸)和/或与跨膜蛋白衍生自的蛋白质胞内区相关的一个或多个另外的氨基酸(例如，胞内区的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10至最多15个氨基酸)。在一个方面，所述跨膜结构域是与CAR的其他结构域之一相关的结构域。在某些情况下，可以通过氨基酸取代来选择或修饰跨膜结构域，以避免此类结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，例如，以尽量减少与受体复合物其他成员的相互作用。一方面，跨膜结构域能够与CAR表达细胞表面上的另一个CAR发生同源二聚化。另一方面，可以修饰或取代跨膜结构域的氨基酸序列，以尽量减少与相同CART中存在的天然结合配偶体的结合结构域的相互作用。
跨膜结构域可以衍生自天然或重组来源。当来源为天然时，该结构域可以衍生自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。在一个方面，无论何时CAR结合至靶标时，跨膜结构域能够信号传导至细胞内结构域。本公开中特别使用的跨膜结构域可以至少包括例如T细胞受体的α、β或ζ链，CD28、CD27、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD 134、CD 137、CD 154的跨膜区。在一些实施方案中，跨膜结构域可以至少包括例如KIR2DS2、OX40、CD2、CD27、LFA-l(CDl la、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Ra、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(触觉)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Lyl08)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKG2D、NKG2C的跨膜区。
在某些情况下，跨膜结构域可以通过铰链(例如来自人类蛋白质的铰链)附于CAR的胞外区(例如CAR的抗原结合结构域)。例如，在一个实施方案中，铰链可以是人类Ig(免疫球蛋白)铰链，例如IgG4铰链或CD8a铰链。
一方面，铰链或间隔区包含IgG4铰链。一方面，铰链或间隔区包含IgD铰链。一方面，跨膜结构域可以是重组的，在这种情况下，其将主要包含疏水残基，例如亮氨酸和缬氨酸。一方面，在重组跨膜结构域的每一端都可以发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。任选地，长度在2至10个氨基酸之间的短寡核苷酸或多肽接头可以形成跨膜结构域和CAR胞质区之间的连接。甘氨酸-丝氨酸双联体提供了特别合适的接头。一方面，铰链或间隔区包含KIR2DS2铰链。
胞质结构域
CAR的胞质结构域或区域包括胞内信号传导结构域。胞内信号传导结构域通常负责激活已引入CAR的免疫细胞的至少一种正常效应功能。
用于本文所述CAR的信号传导结构域的实例包括T细胞受体(TCR)和辅助受体的胞质序列(它们协同作用以在抗原受体接合后启动信号转导)，以及这些序列的任何衍生物或变体和具有相同功能能力的任何重组序列。
已知仅通过TCR产生的信号不足以完全激活T细胞，还需要二级和/或共刺激信号。因此，T细胞活化可以说由两类不同的胞质信号传导序列介导：一类是通过TCR启动抗原依赖性一级活化(一级胞内信号传导结构域)的序列，另一类是以抗原非依赖的方式起作用以提供二级或共刺激信号的序列(二级胞质结构域，例如共刺激结构域)。
一级信号传导结构域以刺激或抑制的方式调控TCR复合物的一级活化。以刺激方式发挥作用的一级胞内信号传导结构域可含有被称为免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)的信号传导基序。
在本公开内容中特别有用的含有一级胞内信号传导结构域的ITAM的实例包括TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278(也称为“ICOS”)、FceRI、DAP 10、DAP12和CD66d。在一个实施方案中，本公开的CAR包含胞内信号传导结构域，例如CD3-ζ的一级信号传导结构域，例如本文所述的CD3-ζ序列。
在一个实施方案中，一级信号传导结构域包含经修饰的ITAM结构域，例如，与天然ITAM结构域相比，活性发生改变(例如，增加或降低)的突变ITAM结构域。在一个实施方案中，一级信号传导结构域包含经修饰的含ITAM的一级胞内信号传导结构域，例如，优化和/或截短的含ITAM的一级胞内信号传导结构域。在一个实施方案中，一级信号传导结构域包含一个、两个、三个、四个或更多个ITAM基序。
共刺激信号传导结构域
CAR的胞内信号传导结构域可以单独包含CD3-ζ信号传导结构域，也可以与本公开CAR上下文中可用的任何其他所需胞内信号传导结构域组合。例如，CAR的胞内信号传导结构域可以包含CD3ζ链部分和共刺激信号传导结构域。共刺激信号传导结构域是指CAR中包含共刺激分子胞内结构域的部分。在一个实施方案中，胞内结构域被设计为包含CD3-ζ信号传导结构域和CD28信号传导结构域。在一个方面，胞内结构域被设计为包含CD3-ζ信号传导结构域和ICOS信号传导结构域。
共刺激分子可以是除抗原受体或其配体之外的细胞表面分子，其是淋巴细胞对抗原有效应答所必需的。此类分子的实例包括CD28、OX-40、4-1BB/CD137、CD2、CD7、CD27、CD30、CD40、程序性死亡-1(PD-1)、可诱导T细胞共刺激分子(ICOS)、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1(CD11a/CD18)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD247、CD276(B7-H3)、LIGHT(TNFSF14)、NKG2C、Igα(CD79a)、DAP-10、Fcγ受体、MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白、细胞因子受体、整合素、信号淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)、活化NK细胞受体、BTLA(一种Toll配体的受体)、ICAM-1、B7-H3、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAMI(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(触觉)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、与CD83特异性结合的配体，或其任意组合。例如，CD27共刺激已被证实可在体外提升人CART细胞的扩增、效应功能和存活，并增强人T细胞在体内的持久性和抗肿瘤活性(Song等人Blood.2012；H9(3):696-706)。此类共刺激分子的其他实例包括CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、F1VEM(LIGF1TR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp30、NKp44、NKp46、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(触觉)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Lyl08)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、NKG2D、NKG2C和PAG/Cbp。CAR胞质部分内的胞内信号传导序列可以以随机或特定的顺序相互连接。任选地，短的寡肽或多肽接头，例如长度在2至10个氨基酸之间(例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸)可以形成细胞内信号传导序列之间的连接。在一个实施方案中，甘氨酸-丝氨酸双链体可用作合适的接头。在一个实施方案中，单个氨基酸，例如丙氨酸、甘氨酸，可用作合适的接头。
在一个方面，胞内信号传导结构域被设计为包含两个或更多个共刺激信号传导结构域，例如2、3、4、5或更多个。在一个实施方案中，所述两个或更多个(例如2、3、4、5或更多个)共刺激信号传导结构域，由接头分子(例如本文所述的接头分子)隔开。在一个实施方案中，胞内信号传导结构域包含两个共刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，接头分子是甘氨酸残基。在一些实施方案中，接头是丙氨酸残基。
一方面，胞内信号传导结构域被设计为包含CD3-ζ信号传导结构域和CD28信号传导结构域。一方面，胞内信号传导结构域被设计为包含CD3-ζ信号传导结构域和4-1BB信号传导结构域。
一方面，胞内信号传导结构域被设计为包含CD3-ζ信号传导结构域和CD27信号传导结构域。
在一个方面，本文所述的CAR表达细胞还可以包含第二CAR，例如，包含不同抗原结合结构域的第二CAR，例如针对相同靶标或不同靶标(例如，本文所述的癌症相关抗原以外的靶标或本文所述的不同癌症相关抗原，例如CD19、CD33、CLL-1、CD34、FLT3或叶酸受体β)。在一个实施方案中，第二CAR包括针对与癌症相关抗原相同的癌细胞类型表达的靶标的抗原结合结构域。在一个实施方案中，CAR表达细胞包含靶向第一抗原的第一CAR，并且包括具有共刺激信号传导结构域但不具有一级信号传导结构域的胞内信号传导结构域，和靶向第二不同抗原的第二CAR，并且包括具有一级信号传导结构域但不具有共刺激信号传导结构域的胞内信号传导结构域。不希望受理论束缚，将共刺激信号传导结构域(例如4-1BB、CD28、ICOS、CD27或OX-40)置于第一CAR上，并将一级信号传导结构域(例如CD3ζ)置于第二CAR上，可以将CAR活性限制在同时表达两种靶标的细胞中。在一个实施方案中，表达CAR的细胞包含第一癌症相关抗原CAR，该CAR包含结合本文所述靶标抗原的抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激结构域；以及第二CAR，该CAR靶向不同的靶标抗原(例如，在与第一靶标抗原相同的癌细胞类型上表达的抗原)，并包含抗原结合结构域、跨膜结构域和主要信号传导结构域。在另一实施方案中，CAR表达细胞包含第一CAR，其包括结合本文所述靶抗原的抗原结合结构域、跨膜结构域和一级信号传导结构域，以及靶向除第一靶抗原之外的抗原(例如，在与第一靶抗原相同的癌细胞类型上表达的抗原)的第二CAR，并且包括针对抗原的抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激信号传导结构域。
另一方面，本公开描述了CAR表达细胞群，例如CART细胞。在一些实施方案中，CAR表达细胞群包含表达不同CAR的细胞的混合。例如，在一个实施方案中，CART细胞群可以包括第一细胞，其表达具有针对本文所述癌症相关抗原的抗原结合结构域的CAR；以及第二细胞，其表达具有不同抗原结合结构域的CAR，例如，针对本文所述不同癌症相关抗原的抗原结合结构域，例如，针对与第一细胞表达的CAR的抗原结合结构域所结合的癌症相关抗原不同的本文所述癌症相关抗原的抗原结合结构域。作为另一个实例，CAR表达细胞群可以包括第一细胞，其表达包括针对本文所述癌症相关抗原的抗原结合结构域的CAR；以及第二细胞，其表达包含针对本文所述癌症相关抗原以外的靶标的抗原结合结构域的CAR。在一个实施方案中，所述CAR表达细胞群包括，例如表达包括第一胞内信号传导结构域的CAR的第一细胞，和表达包括第二信号传导结构域的CAR的第二细胞。
另一方面，本公开内容描述了细胞群，其中该细胞群中至少一个细胞表达具有针对本文所述癌症相关抗原的抗原结合结构域的CAR，并且第二细胞表达另一种药剂，例如，增强CAR表达细胞活性的药剂。例如，在一个实施方案中，所述药剂可以是抑制抑制性分子的药剂。在一些实施方案中，抑制分子(例如PD-1)可以降低CAR表达细胞发起免疫效应反应的能力。抑制性分子的实例包括PD-1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷和TGF(例如TGFβ)。在一个实施方案中，抑制抑制性分子的药剂包含第一多肽(例如，抑制性分子)，所述第一多肽与向细胞提供正信号的第二多肽(例如，本文所述的胞内信号传导结构域)相关联。在一个实施方案中，所述药剂包含第一多肽，例如抑制分子(PD-1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4和TGFβ)的多肽，或这些中的任一个的片段，以及第二多肽，该第二多肽是本文描述的胞内信号传导结构域(例如，包含共刺激结构域(例如，41BB、CD27、OX40或CD28，例如，如本文所述)和/或一级信号传导结构域(例如，本文描述的CD3ζ信号传导结构域)。在一个实施方案中，所述药剂包含PD-1或其片段的第一多肽，以及本文描述的胞内信号传导结构域(例如，本文描述的CD28信号传导结构域和/或本文描述的CD3ζ信号传导结构域)的第二多肽。
编码CAR的核酸构建体
本公开还提供编码本文所述一种或多种CAR构建体的核酸分子。一方面，所述核酸分子以信使RNA转录本的形式提供。另一方面，所述核酸分子以DNA构建体的形式提供。
在一些实施方案中，本公开涉及编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸分子，其中所述CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域，所述胞内信号传导结构域包含刺激结构域，例如共刺激信号传导结构域和/或一级信号传导结构域，例如ζ链。
编码所需分子的核酸序列可以通过使用本领域已知的重组方法获得，例如，通过从表达该基因的细胞筛选文库、通过从已知包含该基因的载体中衍生该基因，或通过使用标准技术直接从含有该基因的细胞和组织中分离。或者，目的基因可以通过合成而非克隆的方式获得。
本公开内容还提供了插入本公开的DNA的载体。衍生自逆转录病毒(例如慢病毒)的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因长期稳定地整合并在子细胞中增殖。与衍生自肿瘤逆转录病毒(例如鼠白血病病毒)的载体相比，慢病毒载体具有额外的优势，因为它们可以转导非增殖细胞，例如肝细胞。它们还具有低免疫原性的额外优势。逆转录病毒载体也可以是例如γ逆转录病毒载体。γ逆转录病毒载体可以包括例如启动子、包装信号(γ)、引物结合位点(PBS)、一个或多个(例如两个)长末端重复序列(LTR)以及目的转基因，例如编码CAR的基因。γ逆转录病毒载体可缺乏病毒结构基因，例如gag、pol和env。示例性的γ逆转录病毒载体包括鼠白血病病毒(MLV)、脾脏-病灶形成病毒(Spleen-Focus Forming Virus,SFFV、骨髓增殖性肉瘤病毒(MPSV)及其衍生载体。其他γ逆转录病毒载体已在例如Tobias Maetzig等人,“Gammaretroviral Vectors:Biology,Technologyand Application”Viruses.2011Jun；3(6):677-713中描述的。
在另一实施方案中，包含编码本发明所需CAR的核酸的载体是腺病毒载体(A5/35)。在另一实施方案中，编码CAR的核酸的表达可以利用转座子(例如睡美人转座子)、CRISPR、CAS9和锌指核酸酶来完成。参见下文，June等人2009Nature Reviews Immunology9.10:704-716，其通过引用并入本文。简而言之，编码CAR的天然或合成核酸的表达通常通过将编码CAR多肽或其部分的核酸可操作地连接至启动子，并将该构建体并入到表达载体中来实现。这些载体可适用于真核生物的复制和整合。典型的克隆载体含有转录和翻译终止子、起始序列以及用于调控所需核酸序列表达的启动子。
本公开的表达构建体也可用于核酸免疫和基因疗法，采用标准基因递送方案。基因递送的方法是本领域已知的，参见例如，美国专利号5,399,346、5,580,859和5,589,466，其全文以引用的方式并入本文。在另一个实施方案中，本公开提供了一种基因疗法载体。
核酸可以克隆到多种类型的载体中。例如，核酸可以克隆到包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒的载体中。特别感兴趣的载体包括表达载体、复制载体、探针生成载体和测序载体。
此外，表达载体可以以病毒载体的形式提供给细胞。病毒载体技术在本领域中是众所周知的，例如在Sambrook等人,2012,MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL(第1-4卷，冷泉港出版社，纽约)以及其他病毒学和分子生物学手册中有所描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体含有在至少一种生物体中具有功能的复制起点、启动子序列、方便的限制性内切酶位点以及一个或多个选择标记(例如，WO 01/96584；WO 01/29058；以及美国专利号6,326,193)。
已经开发出多种基于病毒的系统用于将基因转移到哺乳动物细胞中。例如，逆转录病毒为基因递送系统提供了一个便捷的平台。可以使用本领域已知的技术将选定的基因插入载体并包装到逆转录病毒颗粒中。然后可以分离重组病毒并将其递送到受试者的细胞中(无论是体内还是体外)。本领域已知多种逆转录病毒系统。在一些实施方案中，使用腺病毒载体。
本领域已知多种腺病毒载体。在一个实施方案中，使用慢病毒载体。
其他启动子元件，例如增强子，可调节转录起始的频率。通常，它们位于起始位点上游30-110bp的区域，尽管已证实许多启动子在起始位点下游也含有功能性元件。启动子元件之间的间距通常具有灵活性，因此当元件彼此倒置或相对移动时，启动子功能仍能保留。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间距可增加至50bp，活性才会开始下降。根据启动子的不同，各个元件似乎可以协同或独立地发挥作用来激活转录。
能够在哺乳动物T细胞中表达CAR转基因的启动子的实例是EF1a启动子。天然EF1a启动子驱动延伸因子-1复合物α亚基的表达，该复合物负责将氨酰tRNA通过酶促方式递送至核糖体。EF1a启动子已广泛应用于哺乳动物表达质粒，并已被证明可有效驱动克隆到慢病毒载体中的转基因表达CAR。参见，例如Milone等人,Mol.Ther.17(8):1453-1464(2009)。
启动子的另一个实例是立即早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列是一种强组成型启动子序列，能够驱动与其可操作地连接的任何多核苷酸序列的高水平表达。然而，也可以使用其他组成型启动子序列，包括但不限于猿猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子、MoMuLV启动子、禽白血病病毒启动子、EB病毒立即早期启动子、劳斯肉瘤病毒启动子，以及人类基因启动子，例如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、延伸因子-la启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。此外，本公开不应仅限于使用组成型启动子。诱导型启动子也被考虑作为本公开的一部分。使用诱导型启动子提供了一种分子开关，当需要表达时，该开关能够开启与其可操作连接的多核苷酸序列的表达；当不需要表达时，则关闭表达。诱导型启动子的实例包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。另一个启动子的实例是磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子。在一些实施方案中，可能需要截短的PGK启动子(例如，与野生型PGK启动子序列相比，具有一个或多个(例如1、2、5、10、100、200、300或400个)核苷酸缺失的PGK启动子)。
载体还可以包括例如促进分泌的信号序列、多聚腺苷酸化信号和转录终止子(例如来自牛生长激素(BGH)基因)、允许附加型复制和在原核生物中复制的元件(例如SV40来源或本领域中已知的其他来源)和/或允许选择的元件(例如氨苄青霉素抗性基因和/或博莱霉素(zeocin)标记)。
为了评估CAR多肽或其部分的表达，待导入细胞的表达载体还可以含有选择标记基因或报告基因，或两者兼有，以便从待转染或通过病毒载体感染的细胞群中识别和筛选出表达细胞。在其他方面，选择标记可以携带在单独的DNA片段上，并用于共转染程序。选择标记和报告基因均可侧接适当的调控序列，以使其能够在宿主细胞中表达。有用的选择标记包括例如抗生素抗性基因，例如neo等。
报告基因用于识别潜在转染细胞并评估调控序列的功能。通常，报告基因是指在受体生物体或组织中不存在或不表达的基因，其编码的多肽的表达通过一些易于检测的特性(例如酶活性)表现出来。在DNA引入受体细胞后的适当时间检测报告基因的表达。合适的报告基因可以包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌性碱性磷酸酶的基因或绿色荧光蛋白基因(例如，Ui-Tei等人,2000FEBS Letters 479:79-82)。合适的表达系统是众所周知的，可以使用已知技术制备或商业化获得。通常，具有最小5'侧翼区且表现出最高报告基因表达水平的构建体被鉴定为启动子。此类启动子区域可以与报告基因连接并用于评估药剂调节启动子驱动转录的能力。
在一个实施方案中，该载体还可以包含编码第二CAR的核酸。在一个实施方案中，第二CAR包括针对在急性髓系白血病细胞上表达的靶标(例如CD123、CD34、CLL-1、叶酸受体β或FLT3)或在B细胞上表达的靶标(例如CD10、CD19、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b或CD79a)的抗原结合结构域。在一个实施方案中，该载体包含编码第一CAR的核酸序列，所述第一CAR特异性结合第一抗原，并包含具有共刺激信号传导结构域但不具有一级信号传导结构域的胞内信号传导结构域；以及编码第二CAR的核酸，所述第二CAR特异性结合第二不同的抗原，并包含具有一级信号传导结构域但不具有共刺激信号传导结构域的胞内信号传导结构域。
在一个实施方案中，该载体包含编码本文所述CAR的核酸和编码抑制性CAR的核酸。在一个实施方案中，所述抑制性CAR包含与在正常细胞而非癌细胞上发现的抗原结合的抗原结合结构域。在一个实施方案中，所述抑制性CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域和抑制性分子的胞内结构域。例如，抑制性CAR的胞内结构域可以是以下项的胞内结构域：PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHCI类、MHCII类、GAL9、腺苷和TGFRβ。
在实施方案中，载体可以包含编码CAR(例如本文所述的CAR)和第二CAR(例如抑制性CAR或特异性结合不同抗原的CAR)的两个或更多个核酸序列。在此类实施方案中，编码CAR的两个或多个核酸序列由单个核酸分子以同一读码框编码，并作为一条多肽链。在这方面，两个或多个CAR可以例如被一个或多个肽切割位点(例如，自切割位点或胞内蛋白酶的底物)隔开。
将基因引入细胞并表达的方法是本领域已知的。就表达载体而言，该载体可以通过本领域的任何方法轻松地引入宿主细胞，例如哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，可以通过物理、化学或生物手段将表达载体转移到宿主细胞中。
将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质体转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。用于产生包含载体和/或外源核酸的细胞的方法是本领域所熟知的。参见，例如，Sambrook等人,2012,MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,第1 -4卷,冷泉港出版社,纽约)将多核苷酸引入宿主细胞的优选方法是磷酸钙转染。将目标多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，尤其是逆转录病毒载体，已成为将基因插入哺乳动物(例如人类)细胞的最广泛使用的方法。其他病毒载体可以衍生自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺相关病毒等。参见例如，美国专利号5,350,674和5,585,362。
将多核苷酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散系统，例如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠粒和基于脂质的系统，包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内递送媒介物的示例性胶体系统是脂质体(例如，人工膜囊泡)。其他最先进的核酸靶向递送方法也已可用，例如使用靶向纳米颗粒或其他合适的亚微米级递送系统递送多核苷酸。在使用非病毒递送系统的情况下，示例性递送媒介物是脂质体。考虑使用脂质制剂将核酸引入宿主细胞(体外、离体或体内)。另一方面，核酸可以与脂质相关联。与脂质关联的核酸可以包封在脂质体的水性内部，散布在脂质体的脂质双层内，通过与脂质体和寡核苷酸均结合的连接分子附着在脂质体上，包埋在脂质体中，与脂质体复合，分散在含有脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质结合，悬浮在脂质中，包含在胶束中或与胶束复合，或以其他方式与脂质关联。脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体相关的组合物在溶液中不限于任何特定结构。例如，它们可以存在于双层结构中，作为胶束，或具有“塌陷”结构。它们也可以简单地散布在溶液中，可能形成大小或形状不均匀的聚集体。脂质是脂肪物质，可以是天然存在的或合成的。例如，脂质包括细胞质中天然存在的脂肪滴以及含有长链脂肪族烃及其衍生物的化合物类别，例如脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛。
适用的脂质可从商业来源获得。例如，二肉豆蔻基磷脂酰胆碱(“DMPC”)可从Sigma,St.Louis,MO获得；磷酸二鲸蜡酯(“DCP”)可从K&K Laboratories(Plainview,NY)获得；胆固醇(“Choi”)可从Calbiochem-Behring获得；二肉豆蔻酰磷脂酰甘油酯(dimyristylphosphatidylglycerol)(“DMPG”)和其他脂质可从Avanti Polar Lipids,Inc.(Birmingham,AL.)获得。脂质的氯仿或氯仿/甲醇储液可储存于约-20℃。氯仿作为唯一溶剂，因为它比甲醇更容易蒸发。“脂质体”是一个通用术语，涵盖了各种由封闭的脂质双层或聚集体的生成形成的单层和多层脂质媒介物。
脂质体的特征在于具有囊泡结构，其包含磷脂双层膜和内部水性介质。多层脂质体具有多个脂质层，这些脂质层由水性介质隔开。当磷脂悬浮于过量水溶液中时，它们会自发形成。脂质组分在形成封闭结构之前会进行自我重排，并将水和溶解的溶质困在脂质双层之间(Ghosh等人,1991Glycobiology 5:505-10)。然而，也涵盖在溶液中具有与正常囊泡结构不同的结构的组合物。例如，脂质可能呈现胶束结构，或仅作为脂质分子的不均匀聚集体存在。脂质转染-核酸(lipofectamine-nucleic acid)复合物也考虑在内。
无论使用何种方法将外源核酸引入宿主细胞或以其他方式将细胞暴露于本公开的抑制剂，为了确认重组DNA序列在宿主细胞中的存在，可以进行多种测定。此类测定包括，例如，本领域技术人员熟知的“分子生物学”测定，例如Southern印迹法和Northern印迹法、RT-PCR和PCR；“生物化学”测定，例如检测特定肽的存在与否，例如通过免疫学手段(ELISA和Western印迹法)或通过本文所述的测定来鉴定落入本公开范围内的药剂。
本发明还提供了一种包含CAR编码核酸分子的载体。一方面，CAR载体可以直接转导至细胞，例如T细胞或NK细胞。
在一个方面，所述载体是克隆载体或表达载体，例如包括但不限于一种或多种质粒(例如，表达质粒、克隆载体、微环、微载体、双微体(double minute chromosomes))、逆转录病毒和慢病毒载体构建体的载体。在一个方面，所述载体能够在哺乳动物T细胞或NK细胞中表达CAR构建体。在一个方面，所述哺乳动物T细胞是人类T细胞。在一个方面，所述哺乳动物NK细胞是人类NK细胞。在一个实施方案中，所述载体选自DNA载体、RNA载体、质粒载体、慢病毒载体、腺病毒载体或逆转录病毒载体。
本发明还公开了一种载体，其包含编码本文公开的RNA分子(例如本文公开的免疫刺激RNA分子)的核酸分子。在一个实施方案中，所述载体可以直接转导至细胞中，例如T细胞或NK细胞。在一个方面，所述载体是克隆载体或表达载体，例如包括但不限于一种或多种质粒(例如，表达质粒、克隆载体、微环、微载体、双微体)、逆转录病毒和慢病毒载体构建体的载体。在一个方面，所述载体能够在哺乳动物T细胞或NK细胞中表达RNA分子。在一个方面，所述哺乳动物T细胞是人类T细胞。在一个方面，所述哺乳动物NK细胞是人类NK细胞。在一个实施方案中，所述载体选自DNA载体、RNA载体、质粒载体、慢病毒载体、腺病毒载体或逆转录病毒载体。在一些实施方案中，编码CAR的核酸分子和编码RNA分子(例如免疫刺激性RNA分子)的核酸分子位于单个载体上。在一些实施方案中，编码CAR的核酸分子和编码RNA分子(例如免疫刺激性RNA分子)的核酸分子位于分开的载体上。
在一些实施方案中，本公开提供了编码多肽的核酸分子(或载体)，所述多肽包含如表1和表2所提供的重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，或如表1和表2所提供的特定的VH和VL组合。在另一个实施方案中，本公开提供了编码多肽的核酸分子，所述多肽包含与表1和表2中提供的VH和/或VL氨基酸序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％同一性的重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)。
在一些实施方案中，本公开提供了编码多肽的核酸分子(或载体)，所述多肽包含如表3和表4所提供的一个、两个、三个或更多个HCDR和/或一个、两个、三个或更多个LCDR，或如表3和表4所提供的特定的HCDR1-3和LCDR1-3组合。
在一些实施方案中，本公开提供了编码包含如表5所提供的氨基酸序列的多肽的核酸分子(或载体)。在另一个实施方案中，所述多肽包含如表5所提供的CAR序列的至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％同一性。在另一个实施方案中，所述多肽是CAR。
在一些实施方案中，本公开提供了包含如表6所提供的核酸序列的核酸分子(或载体)。在另一个实施方案中，本公开提供了包含与表6所提供的核酸序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％同一性的核酸序列的核酸分子(或载体)。
组合疗法
本文所述的包含PIC的组合物或免疫原性组合物可与CAR表达细胞组合使用(CAR疗法)。在一些实施方案中，除了与CAR表达细胞组合使用外，所述组合物或免疫原性组合物还可与其他已知药剂和疗法组合使用。本文所用的“组合”施用，是指在受试者罹患该疾病的过程中，向受试者递送两种(或两种以上)不同的治疗，例如，在受试者被诊断患有该疾病之后，且在该疾病被治愈或消除之前，或因其他原因停止治疗之前，递送两种或两种以上治疗。在一些实施方案中，当开始递送第二种治疗时，第一种治疗递送仍在进行中，因此在施用方面存在重叠。本文有时将此称为“同时”或“并发递送”。在其他实施方案中，一种治疗的递送在另一种治疗的递送开始之前结束。在任一情况的一些实施方案中，由于组合施用，治疗效果更佳。例如，第二种治疗更有效，例如，与如果在没有第一种治疗的情况下施用第二种治疗所将看到的相比，用较少的第二种治疗看到等效的效果，或第二种治疗更大程度地减轻症状，或对于第一种治疗看到类似的情况。在一些实施方案中，递送使得症状或与病症相关的其他参数的减少大于在不存在另一种治疗的情况下递送的一种治疗所观察到的减少。两种治疗的效果可以是部分叠加的、完全叠加的或大于叠加的。递送应使在递送第二种治疗时，仍然可以检测到递送的第一种治疗的效果。
本文所述的与CAR表达细胞组合的组合物或免疫原性组合物以及至少一种另外的治疗剂可以同时、以相同或分开的组合物施用，或依次施用。对于依次施用，可以先施用本文所述的与CAR表达细胞组合的组合物或免疫原性组合物，然后再施用另外的治疗剂，或者可以颠倒施用顺序。
CAR疗法和/或其他治疗剂、程序或治疗方式可在疾病活动期、缓解期或活动性较低时期施用。CAR疗法可在其他治疗之前、治疗期间、治疗后或在疾病缓解期施用。
当以组合、组合物或免疫原性组合物形式施用时，CAR疗法和另外的药剂(例如，第二或第三药剂)或全部可以以高于、低于或等于单独使用(例如，作为单一疗法)的每种药剂的量或剂量施用。在某些实施方案中，组合物或免疫原性组合物、CAR疗法、另外的药剂(例如，第二或第三药剂)或全部的施用量或剂量低于各药剂单独使用(例如，作为单一疗法)时的用量或剂量(例如，至少20％、至少30％、至少40％或至少50％)。在其他实施方案中，导致期望效果(例如，治疗癌症)的组合物或免疫原性组合物、CAR疗法、另外的药剂(例如，第二或第三药剂)或全部的量或剂量比单独使用(例如，作为单一疗法)以实现相同的治疗效果的每种药剂的量或剂量低(例如，至少20％、至少30％、至少40％或至少50％)。
在一些实施方案中，本公开内容公开了一种组合疗法，包括本文所述的组合物或免疫原性组合物、本文所述的CAR表达细胞疗法和另外的治疗剂。
PD-1抑制剂
在一些实施方案中，所述另外的治疗剂是PD-1抑制剂。在一些实施方案中，所述PD-1抑制剂选自PDR001(诺华)、纳武单抗(Nivolumab)(百时美施贵宝)、帕博利珠单抗(Pembrolizumab)(默克)、皮地利珠单抗(Pidilizumab)(CureTech)、MEDI0680(Medimmune)、REGN2810(再生元)、TSR-042(Tesaro)、PF-06801591(辉瑞)、BGB-A317(百济神州)、BGB-108(百济神州)、INCSHR1210(Incyte)或AMP-224(Amplimmune)。在一个实施方案中，所述PD-1抑制剂是抗PD-1抗体分子。在一个实施方案中，PD-1抑制剂是如US2015/0210769中所述的抗PD-1抗体分子，该专利于2015年7月30日公开，标题为“针对PD-1的抗体分子及其用途”，其全文通过引用并入。在一个实施方案中，该抗PD-1抗体分子包含US2015/0210769中公开的BAP049-Clone-E或B AP049-Clone-B的CDR、可变区、重链和/或轻链。本文所述的抗体分子可以通过US2015/0210769中所述的载体、宿主细胞和方法制备，该专利全文通过引用并入。
在一个实施方案中，抗PD-1抗体分子是纳武单抗(百时美施贵宝)，也称为MDX-1106、MDX-l 106-04、ONO-4538、BMS-936558或纳武单抗(克隆5C4)和其他抗PD-1抗体公开于US 8,008,449和WO 2006/121168中，其全文通过引用并入。在一个实施方案中，抗PD-1抗体分子是帕博利珠单抗(默克)，也称为Lambrolizumab、MK-3475、MK03475、SCH-900475或帕博利珠单抗和其他抗PD-1抗体公开于Hamid,O.等人(2013)NewEngland Journal of Medicine 369(2):134-44、US 8,354,509和WO 2009/114335中，其全部内容通过引用并入。在一个实施方案中，抗PD-1抗体分子是皮地利珠单抗(CureTech)，也称为CT-011。皮地利珠单抗和其他抗PD-1抗体公开于Rosenblatt,J.等人(2011)JImmunotherapy 34(5):409-18、US 7,695,715、US 7,332,582和US 8,686,119，其全部内容通过引用并入。在一个实施方案中，抗PD-1抗体分子是MEDI0680(Medimmune)，也称为AMP-514。MEDI0680和其他抗PD-1抗体公开于US 9,205,148和WO 2012/145493，其全部内容通过引用并入。在一个实施方案中，抗PD-1抗体分子是REGN2810(再生元)。在一个实施方案中，抗PD-1抗体分子是PF-06801591(辉瑞)。在一个实施方案中，抗PD-1抗体分子是BGB-A317或BGB-108(百济神州)。在一个实施方案中，抗PD-1抗体分子是INCSHR1210(Incyte)，也称为INCSHR01210或SHR-1210。在一个实施方案中，抗PD-1抗体分子是TSR-042(Tesaro)，也称为ANB011。其他已知的抗PD-1抗体分子包括例如在WO 2015/112800、WO 2016/092419、WO2015/085847、WO 2014/179664、WO 2014/194302、WO 2014/209804、WO 2015/200119、US 8,735,553、US 7,488,802、US 8,927,697、US 8,993,731和US 9,102,727中描述的那些，其全文通过引用并入。
在一个实施方案中，PD-1抑制剂是抑制PD-1信号传导通路的肽，例如US 8,907,053中所述，其全文通过引用并入。在一个实施方案中，PD-1抑制剂是免疫粘附素(例如，包含与恒定区(例如，免疫球蛋白序列的Fc区)融合的PD-L1或PD-L2的胞外部分或PD-1结合部分的免疫粘附素)。在一个实施方案中，PD-1抑制剂是AMP-224(B7-DCIg(Amplimmune)，例如，公开于WO 2010/027827和WO 2011/066342中，其全文通过引用并入)。
PD-L1抑制剂
在一些实施方案中，所述另外的治疗剂是PD-L1抑制剂。在一些实施方案中，所述PD-L1抑制剂选自FAZ053(诺华)、Atezolizumab(基因泰克/罗氏)、阿维鲁单抗(Avelumab)(默克雪兰诺和辉瑞)、度伐利尤单抗(Durvalumab)(Medlmmune/阿斯利康)或BMS-936559(百时美施贵宝)。
在一个实施方案中，PD-L1抑制剂是抗PD-L1抗体分子。在一个实施方案中，PD-L1抑制剂是如US2016/0108123中公开的抗PD-L1抗体分子，该专利于2016年4月21日公开，标题为“针对PD-L1的抗体分子及其用途”，其全文以引用的方式并入。在一个实施方案中，抗PD-L1抗体分子包含US2016/0108123中公开的BAP058-Clone O或BAP058-Clone N的CDR、可变区、重链和/或轻链。
在一个实施方案中，抗PD-L1抗体分子是Atezolizumab(基因泰克/罗氏)，也称为MPDL3280A、RG7446、R05541267、YW243.55.S70或TECENTRIQTM。Atezolizumab及其他抗PD-L1抗体公开于US 8,217,149，其全文通过引用并入。在一个实施方案中，抗PD-L1抗体分子是阿维鲁单抗(默克雪兰诺和辉瑞)，也称为MSB0010718C。阿维鲁单抗及其他抗PD-L1抗体公开于WO 2013/079174，其全文通过引用并入。在一个实施方案中，抗PD-L1抗体分子是度伐利尤单抗(Medlmmune/阿斯利康)，也称为MEDI4736。度伐利尤单抗和其他抗PD-L1抗体公开于US 8,779,108，其全文通过引用并入。在一个实施方案中，抗PD-L1抗体分子为BMS-936559(百时美施贵宝)，也称为MDX-1105或12A4。BMS-936559和其他抗PD-L1抗体公开于US7,943,743和WO 2015/081158，其全文通过引用并入。其他已知的抗PD-L1抗体包括例如在WO 2015/181342、WO 2014/100079、WO 2016/000619、WO 2014/022758、WO 2014/055897、WO2015/061668、WO 2013/079174、WO 2012/145493、WO 2015/112805、WO 2015/109124、WO2015/195163、US 8,168,179、US 8,552,154、US 8,460,927和US 9,175,082中描述的那些，其全文通过引用并入。
LAG-3抑制剂
在一些实施方案中，所述另外的治疗剂是LAG-3抑制剂。在一些实施方案中，LAG-3抑制剂选自LAG525(诺华)、BMS-986016(百时美施贵宝)或TSR-033(Tesaro)。
在一个实施方案中，LAG-3抑制剂为抗LAG-3抗体分子。在一个实施方案中，LAG-3抑制剂为US2015/0259420中公开的抗LAG-3抗体分子，该专利于2015年9月17日公开，标题为“针对LAG-3的抗体分子及其用途”，其全文通过引用并入。在一个实施方案中，所述抗LAG-3抗体分子包含US2015/0259420中公开的BAP050-Clone I或BAP050-Clone J的CDR、可变区、重链和/或轻链。
在一个实施方案中，抗LAG-3抗体分子是BMS-986016(百时美施贵宝)，也称为BMS986016。BMS-986016和其他抗LAG-3抗体公开于WO 2015/116539和US 9,505,839，其全文通过引用并入。在一个实施方案中，抗LAG-3抗体分子是TSR-033(Tesaro)。在一个实施方案中，抗LAG-3抗体分子是IMP731或GSK2831781(GSK和PrimaBioMed)。IMP731和其他抗LAG-3抗体公开于WO 2008/132601和US 9,244,059，其全文通过引用并入。在一个实施方案中，抗LAG-3抗体分子为IMP761(Prima BioMed)。其他已知的抗LAG-3抗体包括例如在WO 2008/132601、WO 2010/019570、WO 2014/140180、WO 2015/116539,WO 2015/200119、WO 2016/028672、US 9,244,059、US 9,505,839中描述的抗体，其全文通过引用并入。在一个实施方案中，抗LAG-3抑制剂为可溶性LAG-3蛋白质，例如IMP321(Prima BioMed)，例如公开于WO2009/044273，其全文通过引用并入。
TIM-3抑制剂
在一些实施方案中，所述另外的治疗剂是TIM-3抑制剂。在一些实施方案中，TIM-3抑制剂是MGB453(诺华)或TSR-022(Tesaro)。
在一个实施方案中，TIM-3抑制剂是抗TIM-3抗体分子。在一个实施方案中，TIM-3抑制剂是如US2015/0218274中公开的抗TIM-3抗体分子，该专利于2015年8月6日公开，标题为“针对TIM-3的抗体分子及其用途”，其全文通过引用并入。在一个实施方案中，抗TIM-3抗体分子包含US2015/0218274中公开的ABTIM3-huml 1或ABTIM3-hum03的CDR、可变区、重链和/或轻链。
在一个具体实施方案中，抗TIM-3抗体分子为TSR-022(AnaptysBio/Tesaro)。在一个实施方案中，抗TIM-3抗体分子包含APE5137或APE5121的一个或多个CDR序列(或统称所有CDR序列)、重链或轻链可变区序列、或重链或轻链序列。APE5137、APE5121和其他抗TIM-3抗体公开于WO 2016/161270中，其全文通过引用并入。在一个实施方案中，抗TIM-3抗体分子为抗体克隆F38-2E2。另外已知的抗TIM-3抗体包括例如在WO 2016/111947、WO 2016/071448、WO 2016/144803、US 8,552,156、US 8,841,418和US 9,163,087中描述的那些，其全文通过引用并入。
促M2巨噬细胞分子的抑制剂
在一些实施方案中，所述另外的治疗剂是促M2巨噬细胞分子的抑制剂。已知具有M2表型的巨噬细胞在抑制T细胞功能(包括细胞毒功能)中发挥作用。某些细胞因子，例如IL-13、IL-4、IL-10、CSF-1、TGF-β和GM-CSF，已知能够使巨噬细胞极化为M2表型，例如(在IL-13和/或IL-4的情况下)，通过与巨噬细胞上表达的IL-13Ra1链和/或IL-4Ra链相互作用。阻断此类分子的分子可用于本文所述的方法和组合物中。促M2巨噬细胞分子的示例性抑制剂包括IL-13的抑制剂、IL-4的抑制剂、IL-13Ra1的抑制剂和/或IL-4Ra的抑制剂，例如本文所述。
促M2巨噬细胞分子的抑制剂包括，例如小分子。可以与本文公开的CAR表达细胞和本文公开的RNA分子一起施用的小分子抑制剂的一个实例是紫檀芪(参见例如Huang等人,Oncotarget.2016Jun 28；7(26):39363-39375)，其通过引用整体并入本文。
促M2巨噬细胞分子的抑制剂包括例如抗体分子、多肽(例如融合蛋白)或抑制性核酸(例如siRNA或shRNA)或结合MDSC或TAM上的一种或多种表面抗原的CAR表达细胞。
一方面，促M2巨噬细胞分子的抑制剂是抗IL-13抗体。此类抗体的生成可以通过本领域已知方法进行。抗IL-13抗体的实例包括，例如，来瑞组单抗(lebrikizumab)(参见CAS编号953400-68-5)。另一个抗IL-13抗体的实例是曲罗芦单抗(tralokinumab)(CAS编号1044515-88-9)。另一个抗IL-13抗体的实例是或包含GSK2434735的抗IL-13结合结构域。另一个抗IL-13抗体的实例是QAX576(参见例如，Rothenberg等人,J.AllergyClin.Immunol.,2015,135(2),第500-507页，其通过引用整体并入本文)。
在另一个方面，促M2巨噬细胞分子的抑制剂是抗IL-4抗体或抗IL-4Ra抗体。此类抗体的生成可以通过本领域已知方法进行。抗IL-4抗体的实例包括，例如，GSK2434735的抗IL-4结合结构域。另一个抗IL-4抗体的实例是，例如，度普利尤单抗(参见CAS编号1190264-60-8)。
在另一实施方案中，促M2巨噬细胞的抑制剂是IL-13和/或IL-4的抑制剂。可以与本文公开的CAR表达细胞和本文公开的组合物或免疫原性组合物一起施用的IL-13和IL-4抑制剂的实例是维生素A衍生物芬维A胺((例如，4-HPR)参见例如Dong等人CancerLetters.March 1,2017.第388卷，第43-53页，其通过引用整体并入本文)。
在另一个方面，促M2巨噬细胞分子的抑制剂是抗CSF-1抗体或CSF-1的小分子抑制剂。此类抗体的生成可以通过本领域已知方法进行。抗CSF-1抗体的一个实例是emactuzumab。CSF-1抑制剂的另一个实例是BLZ945(参见例如Strachan,DC等人,Oncoimmunology,2013Dec.1,2(12):e26968，其通过引用整体并入本文)。可与本文公开的CAR表达细胞和本文公开的组合物或免疫原性组合物一起施用的CSF-1的抑制剂的另一个实例是尼达尼布(nintedanib)(参见例如，Tandon等人American Journal of Respiratoryand Critical Care Medicine 2017；195:A2397，其通过引用整体并入本文)。BLZ945是集落刺激因子1受体(CSF1R)的小分子抑制剂。参见例如，Pyonteck等人Nat.Med.19(2013):1264-72。BLZ945的结构如下所示。
在另一个方面，促M2巨噬细胞分子的抑制剂是CAR表达细胞，所述CAR表达细胞结合在MDSC或TAM表面表达的抗原(即TAM抗原)，例如，相对于其他巨噬细胞，在MDSC或TAM表面上调的抗原。在实施方案中，结合MDSC或TAM抗原的CAR表达细胞与CD123结合。在实施方案中，结合MDSC或TAM抗原的CAR表达细胞与CSF1R结合。在实施方案中，结合MDSC或TAM抗原的CAR表达细胞与CD68结合。在实施方案中，结合MDSC或TAM抗原的CAR表达细胞与CD206结合。
在另一实施方案中，促M2巨噬细胞的抑制剂是JAK2抑制剂。可以与本文公开的CAR表达细胞和本文公开的组合物或免疫原性组合物一起施用的JAK2抑制剂的一个实例是鲁索利替尼(Ruxolitinib)(参见例如Chen等人Clinical Lymphoma,Myeloma and Leukemia,第17卷，第1期，e93，2017，其通过引用整体并入本文)。在另一实施方案中，促M2巨噬细胞分子的抑制剂是细胞表面分子。可以与本文公开的CAR表达细胞和本文公开的组合物或免疫原性组合物一起施用的细胞表面分子的实例是二肽基肽酶4(DPP-4)或CD26(参见例如Zhuge等人Diabetes 2016Oct；65(10):2966-2979，其通过引用整体并入本文)。
在另一实施方案中，促M2巨噬细胞分子的抑制剂是HD AC抑制剂。可以与本文公开的CAR表达细胞和本文公开的组合物或免疫原性组合物一起施用的HD AC抑制剂的一个实例是伏立诺他(suberanilohydroxamic acid，SAHA)。在另一实施方案中，促M2巨噬细胞分子的抑制剂是糖酵解途径的抑制剂。可以与本文公开的CAR表达细胞和本文公开的组合物或免疫原性组合物一起施用的糖酵解途径抑制剂的实例是2-脱氧-D-葡萄糖((2-DG)，参见例如Zanganeh,Nat Nanotechnol.2016Nov；11(11):986-994，其通过引用整体并入本文)。
在另一实施方案中，促M2巨噬细胞分子的抑制剂是靶向线粒体的抗氧化剂。可与本文公开的CAR表达细胞和本文公开的组合物或免疫原性组合物一起施用的靶向线粒体的抗氧化剂的实例是MitoQ(Formentini等人,Cell Reports，第19卷，第6期，2017年5月9日，第1202-1213页，其通过引用整体并入本文)。在另一实施方案中，促M2巨噬细胞分子的抑制剂是铁氧化物。可以与本文公开的CAR表达细胞和本文公开的组合物或免疫原性组合物一起施用的氧化铁的实例是非莫妥尔(ferumoxytol)(参见例如Zanganeh,NatNanotechnol.2016Nov；11(11):986-994，其通过引用整体并入本文)。
在实施方案中，本公开内容包括包含促M2巨噬细胞分子的抑制剂和药学上可接受的载体的组合物。
Flt3配体多肽
在一些实施方案中，所述另外的治疗剂是Fms样酪氨酸激酶3配体(Flt3配体)多肽。Flt3配体是一种影响造血谱系细胞生长、存活和/或分化的细胞因子。与其他生长因子组合，Flt3配体可以刺激多种细胞类型的增殖和发育，包括干细胞、髓系和淋巴系前体细胞、树突状细胞和NK细胞。示例性Flt3配体多肽公开于US5554512、US6291661、US7294331、US7361330和US9486519，其通过引用整体并入本文。
化疗剂
在一些实施方案中，另外的治疗剂是化疗剂。示例性化疗剂包括蒽环类药物(例如，阿霉素(例如，脂质体阿霉素))、长春花生物碱(例如，长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨)、烷化剂(例如，环磷酰胺、达卡巴嗪、美法仑、异环磷酰胺、替莫唑胺)、免疫细胞抗体(例如，阿仑单抗、吉妥珠单抗、利妥昔单抗、托西莫单抗)、抗代谢物(包括，例如，叶酸拮抗剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物和腺苷脱氨酶抑制剂(例如，氟达拉滨))、mTOR抑制剂、TNFR糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR)激动剂、蛋白酶体抑制剂(例如，阿克拉霉素A、胶霉毒素或硼替佐米)、免疫调节剂如沙利度胺或沙利度胺衍生物(例如来那度胺)。考虑用于组合疗法的一般化疗剂包括阿那曲唑比卡鲁胺硫酸博来霉素白消安白消安注射液卡培他滨N4-戊氧羰基-5-脱氧-5-氟胞苷、卡铂卡莫司汀苯丁酸氮芥顺铂克拉屈滨环磷酰胺(或)、阿糖胞苷(cytarabine,cytosine arabinoside)(Cytosar-)、阿糖胞苷脂质体注射液达卡巴嗪(DTIC-)、更生霉素(dactinomycin)(放线菌素D(Actinomycin D)，Cosmegan)、盐酸柔红霉素枸橼酸柔红霉素脂质体注射液地塞米松、多西他赛盐酸阿霉素依托泊苷磷酸氟达拉滨5-氟尿嘧啶氟他胺替扎西替滨、吉西他滨(二氟脱氧胞苷)、羟基脲伊达比星异环磷酰胺伊立替康L-天冬酰胺酶亚叶酸钙、美法仑6-巯基嘌呤甲氨蝶呤米托蒽醌吉妥单抗(mylotarg)、紫杉醇phoenix(Yttrium90/MX-DTPA)、喷司他丁、polifeprosan 20卡莫司汀植入剂枸橼酸他莫昔芬替尼泊苷6-硫鸟嘌呤、噻替派、替拉扎明注射用盐酸拓扑替康长春花碱长春新碱和长春瑞滨
示例性烷化剂包括但不限于氮芥类物质(nitrogen mustard)、乙烯亚胺衍生物、烷基磺酸盐、亚硝脲和三氮烯)：尿嘧啶氮芥(Aminouracil Uracil nitrogen)、氮芥(chlormethine)环磷酰胺(RevimmuneTM)、异环磷酰胺美法仑苯丁酸氮芥哌泊溴烷三亚乙基蜜胺(triethylenemelamine)三乙烯硫代磷胺、替莫唑胺噻替派白消安卡莫司汀洛莫司汀链脲佐菌素和达卡巴嗪(DTIC-)。其他示例性烷化剂包括但不限于奥沙利铂替莫唑胺(和)；更生霉素(也称为放线菌素-D，)；美法仑(也称为L-PAM、L-sarcolysin和苯丙氨酸氮芥，)；六甲蜜胺(也称为六甲三聚氰胺(HMM)，)；卡莫司汀苯达莫司汀白消安(和)；卡铂洛莫司汀(也称为CCNU，)；顺铂(也称为CDDP、和-AQ)；苯丁酸氮芥环磷酰胺(和)；达卡巴嗪(也称为DTIC、DIC和咪唑甲酰胺，DTIC-)；六甲蜜胺(也称为六甲三聚氰胺(HMM)，)；异环磷酰胺泼尼莫司汀；丙卡巴肼氮芥(Mechlorethamine)(也称为氮芥(nitrogenmustard)、莫司汀和盐酸氮芥，)；链脲佐菌素噻替派(也称为硫代磷酰胺、TESPA和TSPA，)；环磷酰胺 和苯达莫司汀HC1
示例性的mTOR抑制剂包括，例如，替西罗莫司；地磷莫司(正式名称为deferolimus，(lR,2R,45)-4-[(2R)-2[(1R,95,125,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24￡,26￡,28Z,30S,32S,35R)-l,18-二羟基-19,30-二甲氧基-15,17,21,23,29,35-六甲基-2,3,10,14,20-五氧代-l l,36-二氧杂-4-氮杂三环[30.3.1.04,9]三十六碳-16,24,26,28-四烯-12-基]丙基]-2-甲氧基环己基二甲基亚膦酸酯,也称为AP23573和MK8669，并描述于PCT公开号WO 03/064383中)；依维莫司(或RAD001)；雷帕霉素(AY22989，)；simapimod(CAS164301-51-3)；emsirolimus，(5-{2,4-双[(3S)-3-甲基吗啉-4-基]吡啶并[2,3-i]嘧啶-7-基}-2-甲氧基苯基)甲醇(AZD8055)；2-氨基-8-|s-4-(2-羟基乙氧基)环己基]-6-(6-甲氧基-3-吡啶基)-4-甲基-吡啶并|2,3-r/]嘧啶-7(8//)-酮(PF04691502,CAS1013101-36-4)；以及/V2-|1,4-二氧代-4-||4-(4-氧代-8-苯基-4//-1-苯并吡喃-2-基)吗啉-4-基]甲氧基]丁基]-L-精氨酰甘氨酰-L-天冬氨酰-L-丝氨酸-(SEQ ID NO:846)，内盐(SF1126，CAS 936487-67-1)和XL765。
示例性免疫调节剂包括，例如，afutuzumab(可从获得)；pegfilgrastim来那度胺(CC-5013，)；沙利度胺actimid(CC4047)；和IRX-2(包括白细胞介素1，白细胞介素2和干扰素g的人类细胞因子混合物，CAS 951209-71-5，可从IRX Therapeutics获得)。
示例性蒽环类药物包括，例如，阿霉素(和)；博来霉素柔红霉素(盐酸柔红霉素、daunomycin和盐酸红比霉素，)；柔红霉素脂质体(枸橼酸柔红霉素脂质体、)；米托蒽醌(DHAD、)；表柔比星(EllenceTM)；伊达比星 丝裂霉素C格尔德霉素；除莠霉素；ravidomycin；和desacetylravidomycin。
示例性的长春花生物碱包括，例如，酒石酸长春瑞滨长春新碱和长春地辛)；长春花碱(也称为硫酸长春花碱、vincaleukoblastine和VLB，Alkaban-和)；和长春瑞滨
示例性的蛋白酶体抑制剂包括硼替佐米卡非佐米(PX-171-007，(S)-4-甲基-/V-((S)-l-(((S)-4-甲基-1-((R)-2-甲基环氧乙烷-2-基)-l-氧代戊-2-基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)-2-((S)-2-(2-吗啉代乙酰胺基)-4-苯基丁酰胺基)-戊酰胺)；marizomib(NPI-0052)；枸橼酸伊沙佐米(MLN-9708)；德兰佐米(CEP-18770)；和0-甲基-/V-[(2-甲基-5-噻唑基)羰基]-L-丝氨酰-0-甲基-/V-[(lS)-2-[(2R)-2-甲基-2-环氧乙烷基]-2-氧代-l-(苯基甲基)乙基]-L-丝氨酰胺(ONX-0912)。
药物组合物和治疗
本公开的药物组合物可包含CAR表达细胞(例如，多个CAR表达细胞)，与本文所述的组合物或免疫原性组合物组合，与一种或多种药学上或生理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合。此类组合物可包含缓冲液，例如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，例如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，例如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；以及防腐剂。本公开的组合物一方面配制用于静脉内施用。本公开的药物组合物可以以适合待治疗(或预防)疾病的方式施用。虽然可以通过临床试验确定适当的剂量，但施用的数量和频率将由患者的状况以及患者疾病的类型和严重程度等因素决定。
在一个实施方案中，所述药物组合物基本不含，例如，没有可检测水平的污染物，例如选自以下的污染物：内毒素、支原体、可复制慢病毒(RCL)、p24、VSV-G核酸、HIV gag、残留的抗CD3/抗CD28包被珠、小鼠抗体、混合人血清、牛血清白蛋白、牛血清、培养基组分、载体包装细胞或质粒组分、细菌和真菌。在一个实施方案中，所述细菌为选自以下的至少一种：粪产碱杆菌、白色念珠菌、大肠杆菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌和A组化脓性链球菌。
当提及“免疫有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤抑制有效量”或“治疗量”时，本公开组合物的确切施用量可由医生考虑个体差异(年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移程度以及患者(受试者)的状况)确定。一般而言，可以说包含本文所述的T细胞的药物组合物可以以104至109个细胞/kg体重的剂量施用，在某些情况下为105至106个细胞/kg体重，包括这些范围内的所有整数值。T细胞组合物也可以这些剂量多次给药。可以使用免疫疗法中常用的输注技术来施用(例如，参见Rosenberg等人,New Eng.J.of Med.319:1676,1988)。
在某些方面，可能需要先将活化的T细胞施用于受试者，然后重新抽血(或进行血液成分单采)，根据本公开内容从中激活T细胞，并将这些激活和扩增的T细胞重新输注给患者。该过程可以每隔几周进行多次。在某些方面，可以从10cc至400cc的抽血中激活T细胞。在某些方面，可以从20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc或100cc的血液中激活T细胞。
本发明组合物的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过气雾吸入、注射、摄食、输血、植入或移植。本文所述的组合物可以通过动脉、皮下、皮内、肿瘤内、结节内、髓内、肌肉内、静脉(i.v.)注射或腹膜内施用于患者。在一个方面，本公开的T细胞组合物通过皮内或皮下注射施用于患者。在一个方面，本公开的CAR表达细胞(例如，T细胞或NK细胞)组合物通过静脉注射施用。所述CAR表达细胞(例如，T细胞或NK细胞)的组合物可以直接注射到肿瘤、淋巴结或感染部位。
在具体的示例性方面，受试者可以接受白细胞分离术，其中在体外收集、富集或耗竭白细胞以选择和/或分离目标细胞，例如免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)。这些免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)分离物可以通过本领域已知的方法扩增并处理，以便引入本公开内容的一种或多种CAR构建体，从而产生本公开的CAR表达细胞(例如，CAR T细胞或CAR表达NK细胞)。有需要的受试者随后可以接受高剂量化疗的标准治疗，然后进行外周血干细胞移植。在某些方面，在移植之后或同时，受试者接受扩增的CAR表达细胞(例如，CAR T细胞或NK细胞)与本公开的组合物或免疫原性组合物的组合的输注。在另一个方面，在手术之前或之后施用与本文所述的RNA分子组合的扩增细胞。在实施方案中，在受试者身上进行淋巴细胞清除，例如在施用一种或多种表达CAR的细胞与本文所述的组合物或免疫原性组合物的组合之前。在实施方案中，所述淋巴细胞清除包括施用美法仑、cytoxan、环磷酰胺和氟达拉滨中的一种或多种。
上述治疗对患者的施用剂量将随所治疗病症的确切性质和治疗接受者而变化。人体施用剂量的调整可根据本领域公认的实践进行。例如，CAMPATH的剂量通常对于成人患者为1至约100毫克，通常每日施用，持续1至30天。优选每日剂量为1至10毫克每天，但在某些情况下，也可使用高达40毫克每天的更大剂量(描述与美国专利号6,120,766)。
在一个实施方案中，例如使用体外转录将CAR引入免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)，并且受试者(例如，人)接受本公开的CAR免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)的初始施用，以及本公开内容的CAR免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)的一次或多次后续施用，其中一次或多次后续施用在前次施用后少于15天施用，例如，14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2天。在一个实施方案中，每周向受试者(例如，人)施用一次以上本公开的CAR免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)，例如，每周施用2、3或4次本公开的CAR免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)。在一个实施方案中，受试者(例如，人类受试者)每周接受一次以上CAR免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)的施用(例如，每周2、3或4次施用)(本文中也称为一个周期)，随后一周不施用CAR免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)，然后向受试者另外施用一次或多次CAR免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)(例如，每周向受试者施用一次以上CAR免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)。在另一个实施方案中，受试者(例如，人类受试者)接受一个以上周期的CAR免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)，并且每个周期之间的时间少于10、9、8、7、6、5、4或3天。在一个实施方案中，CAR免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)每隔一天施用一次，每周施用3次。在一个实施方案中，将本公开的CAR免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)施用至少两周、三周、四周、五周、六周、七周、八周或更多周。
一方面，使用慢病毒载体(例如慢病毒)生成CAR表达细胞(例如，CART或CAR表达NK细胞)。以此方式生成的CAR表达细胞(例如，CART或CAR表达NK细胞)将具有稳定的CAR表达。一方面，本公开描述了一种表达本文公开的刺激性RNA分子(例如，免疫刺激性RNA分子)的细胞，其中所述细胞是使用慢病毒载体(例如慢病毒)生成的。
一方面，CAR表达细胞，例如CART，是使用病毒载体(例如γ逆转录病毒载体，例如本文所述的γ逆转录病毒载体)生成的。使用这些载体生成的CART具有稳定的CAR表达。一方面，表达本文公开的刺激性RNA分子(例如免疫刺激性RNA分子)的细胞，是使用病毒载体(例如γ逆转录病毒载体，例如本文所述的γ逆转录病毒载体)生成的。
一方面，CAR表达细胞(例如，CART或CAR表达NK细胞)在转导后瞬时表达CAR载体4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15天。CAR的瞬时表达可以通过RNA CAR载体递送实现。一方面，通过电穿孔将CAR RNA转导到细胞(例如，T细胞或NK细胞)中。一方面，表达本文公开的刺激性RNA分子(例如，免疫刺激性RNA分子)的细胞瞬时表达该RNA分子。一方面，通过电穿孔将刺激性RNA分子递送到细胞中。使用瞬时表达的CAR表达细胞(例如，CART或CAR表达NK细胞)(尤其是使用携带鼠源scFv的CAR表达细胞(例如，CART或CAR表达NK细胞))治疗的患者，可能出现的一个问题是多次治疗后出现过敏反应。不受此理论的束缚，据信这种过敏反应可能是由患者产生的体液抗CAR反应引起的，即具有抗IgE同型的抗CAR抗体。人们认为，在暴露于抗原中断10到14天后，患者的抗体产生细胞会发生从IgG同型(不会引起过敏反应)到IgE同型的类别转换。
如果患者在瞬时CAR疗法过程中产生抗CAR抗体反应(例如通过RNA转导产生的那些)的风险很高，则CAR表达细胞(例如CART或CAR表达NK细胞)输注中断不应超过十至十四天。
本文引用的每一项专利、专利申请和出版物的公开内容均通过引用整体并入本文。尽管本公开内容已参考特定方面进行了披露，但显然，本领域技术人员可以在不脱离本公开内容的真实精神和范围的情况下设计出本公开内容的其他方面和变体。所附权利要求旨在被解释为包括所有此类方面及其等效变体。
实施例
本发明将通过以下实验实施例进一步详细描述。这些实施例仅用于说明目的，除非另有说明，否则不构成限制。因此，本发明不应被理解为仅限于以下实施例，而应被理解为涵盖根据本文提供的教导而显而易见的任何及所有变体。
无需进一步说明，本领域技术人员相信，通过前述说明和以下说明性实施例，即可制备和使用本公开的组合物，并实践权利要求中要求保护的方法。以下工作实施例具体指出了本公开的各个方面，但不应理解为以任何方式限制本公开的其余部分。
实施例1：制备包含聚肌苷酸-聚胞苷酸(PIC)、卡那霉素和氯化钙或ZNP(聚肌苷酸 聚胞苷酸佐剂)的免疫原性组合物
聚肌苷酸聚胞苷酸佐剂(ZNP)是一种免疫原性组合物，包含聚肌苷酸-聚胞苷酸(PIC)、卡那霉素和氯化钙，其制备方法如先前报道(Cell Mol Immunol.2007 Apr；4(2):113-20)。ZNP组合物在无菌条件下配制于生理可接受的缓冲液中。可根据待施用对象(包括但不限于年龄、性别、体重、健康状况)、癌症状况(包括但不限于癌症类型、严重程度)、施用途径和施用频率等因素调整待配制组合物的浓度和体积。对于相同的治疗有效量，当组合物浓度高时，施用体积较小；当组合物浓度低时，施用体积较大。
PIC在人体内不稳定，可被核酸酶快速降解，限制了其在人体的有效应用。在本公开中，本发明人设想，ZNP组合物中抗生素(或多胺化合物)和阳离子(钙离子)的存在可以与PIC形成稳定的三维结构，从而提高ZNP组合物的PIC稳定性，实现其在人体中的有效治疗用途。
在以下说明性实施例中，代表性的ZNP组合物以0.5mg/ml至10mg/ml的浓度制备，其中所述PIC的分子量范围为66,000至2,000,000道尔顿。
实施例2A:制备包含EBV VLP的免疫原性组合物
EB病毒(EBV)是一种广泛传播的人类γ-疱疹病毒，可导致超过95％的世界人口持续感染。原发性EBV感染通常无症状，且常发生于儿童时期。EBV是传染性单核细胞增多症和多种恶性肿瘤的致病病原体，包括淋巴瘤如霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤和恶性B细胞淋巴瘤、年龄相关性EBV阳性B淋巴细胞增殖性疾病(LPD)、T细胞和自然杀伤(NK)细胞LPD、NK/T细胞淋巴瘤、平滑肌肉瘤以及癌症，如鼻咽癌(NPC)和EBV相关胃癌(EBV-GC)，以及乳腺癌、肺癌、结肠癌和肾癌。EBV编码多种包膜糖蛋白。gp350是病毒粒子表面最丰富的糖蛋白，也是开发预防性亚单位疫苗以中和B细胞感染的研究最多的靶点之一。
制备包含EBV VLP的免疫原性组合物。EB病毒的病毒样颗粒(EB-VLP)的制备方法参见WO2022/084373。简而言之，将EB-VLP生产细胞87H7接种于添加10％FBS、青霉素(100U/ml)、链霉素(100mg/ml)和嘌呤霉素(0.5pg/ml)的RPMI 1640细胞培养基中，培养24小时。之后，将细胞转入含有1pM 4-羟基他莫昔芬不含其它补充成分的RPMI 1640细胞培养基中，诱导EB-VLP产生4天。然后，收集含有分泌的EB-VLP的上清液，并先在300g离心10min后2，000g离心20min除去任何细胞和碎片。经0.45-μm低蛋白结合滤膜过滤后，分别以100,000g超速离心2h和以160,000g超速离心1.5h，纯化条件培养基中的EB-VLP，然后重悬于过滤的PBS中保存。
在一个说明性实例中，产生的EB-VLP颗粒包含大多数EBV编码蛋白，包括gp350、BKRF4、BVRF1、BDLF3、BZLF2、BXLF2、BNRF1、BALF4和BZLF1，但不包括LMP1、EBNA2、EBNA3a、EBNA3b和EBNA3c。在另一个实例中，全长或截短的蛋白质与NDV-M、NP、F、HN蛋白质融合表达。
实施例2B：制备包含聚肌苷酸-聚胞苷酸(PIC)卡那霉素和氯化钙(即ZNP)以及EBV VLP的免疫原性组合物，形成ZNP-EBV VLP疫苗
将实施例1所述的ZNP组合物(ZNP)与实施例2A所述的EB病毒(EBV)的病毒样颗粒(VLP)混合，形成包含聚肌胞苷酸(PIC)卡那霉素和氯化钙(即ZNP)以及EB-VLP的EBV疫苗组合物(简称“ZNP-EB-VLP疫苗”)。
实施例3：构建包含抗EBV Gp350 scFv的嵌合CAR构建体
设计并生成了包含特异性结合gp350蛋白的抗EBV Gp350 scFv的嵌合CAR构建体(表5和表6)。抗EBV Gp350 scFv的重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)和各自的CDR的氨基酸序列具有VH-接头-VL或VL-接头-VH的通用结构，分别示于表1至表4。所用的接头是S(G4S)3(SEQ ID NO:101)。V01、V02和V04各自是包含/编码CAR的铰链区、跨膜区和胞质区的序列(表5和6中带下划线的序列)。V01序列的铰链区包含TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD，V02的铰链区包含ESKYGPPCPPCP，V04序列的铰链区包含ESKYGPPCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK。
表1：示例性抗EBV Gp350 scFv的重链可变区(VH)
表2:示例性抗EBV Gp350 scFv的轻链可变区(VL)
表3:抗EBV Gp350 scFv的重链CDR区1-3
表4:抗EBV Gp350 scFv的轻链CDR区1-3
表5:CAR氨基酸序列
表6:CAR核苷酸序列
实施例4：包含抗EBVGp350scfv的CAR-T细胞的生成
为了生成抗EBV Gp350 CAR-T细胞，首先使用Ficoll梯度密度培养基从血沉棕黄层样本中纯化PBMC。使用市售T细胞分离试剂盒从PBMC中纯化T细胞。简而言之，采用第三代重组慢病毒包装系统制备CAR编码慢病毒载体。转移质粒和3个辅助质粒共转染HEK293T细胞72小时后，用Takara Lenti-XTM浓缩仪按照产品说明书浓缩培养上清中的病毒颗粒。然后将慢病毒用于感染富集的T细胞以生成CART细胞，这些T细胞已用TransACT(MiltenyiBiotec)在分别添加了10ng/ml或5ng/ml IL-7和IL-15的TexMACS培养基中预激活2天。使用BioLengend和Jackson Immunoresearch Laboratories的抗体分析CART细胞在制备过程中的免疫表型特征，以研究效应/记忆和耗竭状态(CD3、CD4、CD8、CD45RA、CD62L、CCR7、Lags、Tim3、PD-1)，并使用LIVE/DEADTMViolet Viability试剂盒进行活细胞分组(ChimericAntigen Receptor T Cells,Development and Production,Springer(2020))。FACS研究证实，抗EBV Gp350 CAR已成功转导T细胞，所述CAR在原代T细胞表面表达，并能识别重组EBV Gp350(数据未显示)。
评估了示例性抗EBV Gp350 CAR-T细胞(CAR_EBV-Gp350-003)的细胞毒活性。具体而言，将抗EBV Gp350 CAR-T细胞与表达gp350的PCI-gp350细胞系(或不表达gp350的PCI细胞系)在T细胞扩增培养基中以效靶比(E:T)在5:1至10:1范围内进行孵育。测量细胞活力，并以细胞毒性％计算细胞毒活性。
如图1所示，示例性抗EBV Gp350 CAR-T细胞(CAR_EBV-Gp350-003)表现出对PCI-gp350细胞的强效杀伤力，但在没有gp350表达的PCI-g细胞中未表现出可检测的活性。
实施例5：ZNP组合物(和ZNP-EBV-VLP组合物)体外促进T细胞增殖、细胞因子释放 和/或细胞毒性
按照制造商的说明，将来自人外周血单核细胞(PBMC)(或CAR-T细胞)的纯化T细胞用CellTrace CFSE(羧基荧光素琥珀酰亚胺酯)染色溶液进行预染色，以进行体外标记T细胞，从而通过流式细胞术利用染料稀释来追踪T细胞增殖(多细胞代)。将T细胞与PBMCs和实施例1中所述的ZNP组合物(以规定的工作浓度(50、100或200μg/ml))或ZNP-EBV-VLP共孵育4天。使用流式细胞仪分析T细胞增殖，该流式细胞仪配备适用于荧光素的488nm激发和发射滤光片。
如图2所示，实施例1制备的ZNP组合物与T细胞和PBMC共孵育以ZNP浓度依赖性方式促进T细胞的活化和增殖，提示ZNP组合物(或ZNP-EBV-VLP)可用于增强包括CAR-T细胞在内的T细胞疗法的疗效。
将通过与ZNP组合物(或ZNP-EBV-VLP)共处理来促进活化T细胞(或CAR-T细胞)的细胞因子释放和体外细胞毒性。活化T细胞(或CAR-T细胞)与靶癌细胞共培养24小时，然后使用酶联免疫吸附试验(ELISA)对上清液进行分析，用ELISA MAXTM标准试剂盒定量释放的细胞因子。xCELLigence系统将用于评估不同效靶比(E:T)下T细胞介导的细胞毒性。细胞介导的杀伤作用将在接下来的48小时内通过每30分钟读取一次电阻抗进行量化。特定百分比的裂解值将使用GraphPad Prism软件v6在每个时间点的每个重复实验中计算。
实施例6：细胞因子释放试验和细胞杀伤试验，以评估抗EBVGp350CART细胞单独使 用以及与ZNP组合物或ZNP-EBV-VLP组合物组合使用的活性
xCELLigence实时细胞分析用于细胞毒性试验：xCELLigence系统用于评估T细胞介导的细胞毒性。将1X104个靶表达细胞接种到E-Plate的每个孔中并培养过夜，然后使用RTCA SP分析仪系统定量电阻抗。约24小时后，将50μL抗EBV Gp350将以不同的效靶比(E:T)加入CAR-T细胞，或分别加入50μL培养基或10％Triton-X 100作为阴性对照和阳性对照。细胞介导的杀伤作用将在接下来的48小时内通过每30分钟读取一次电阻抗进行量化。特定百分比的裂解值将使用GraphPad Prism软件v6在每个时间点的每个重复实验中计算。
细胞因子释放试验：CAR-T细胞和靶癌细胞将按设定的E:T比例在96孔板中共培养24小时。然后，按照ELISA MAXTMStandard Set制造商的说明，使用酶联免疫吸附试验(ELISA)分析上清液，以定量释放的细胞因子。如有必要，将离心上清液以去除细胞碎片，然后再进行分析。
实施例7：EB病毒(EBV)的VLP增强抗EBVGp350CAR-T细胞的细胞毒性
评价了示例抗EBV Gp350 CAR-T细胞(CAR_EBV-Gp350-003)与或不与实施例2中制备的EBV VLP(包含gp350、BKRF4、BVRF1、BDLF3、BZLF2、BXLF2、BNRF1、BALF4和BZLF1的EBV-VLP颗粒)组合的细胞毒活性。xCELLigence系统用于评估T细胞介导的细胞毒性。
具体来说，首先将靶细胞(表达gp350的PCI-gp350细胞系，或阴性对照PCI细胞)提前一天接种于xCELLigence E-plate 96中，密度为1x106个细胞/孔，培养基为130μl DMEM培养基+10％ FBS。分别将1x104个Raji细胞(人B淋巴母细胞系，作为VLP的靶细胞)与1.25x106个、1.25x107个或1.25x108个EBV VLP在50μl RPMI培养基+10％ FBS中37℃孵育1小时，然后上样至xCELLigence E-plate。孵育后，将抗EBV Gp350 CAR-T细胞和Raji细胞(1x104个细胞)接种到xCELLigence E-plate中，以5:1的效靶比与靶细胞共培养。在接下来的68小时内，通过每30分钟读取一次电阻抗来定量细胞介导的杀伤作用。使用GraphPadPrism软件v6计算每个时间点每次重复的特异性细胞溶解(％)。
如图3所示，EBV VLP与Raji细胞共培养以VLP数量相关的方式显著增强了抗EBVGp350 CAR-T细胞对靶细胞PCI-gp350细胞系的细胞毒性(细胞溶解％)，(PCI-g+1.25x107VLP，PCI-g+1.25x108 VLP相比PCI-g+0VLP)。相反，EBV VLP不增加抗EBV Gp350 CAR-T细胞对对照PCI细胞的细胞毒性(细胞溶解％)。
图4进一步表明，在EBV VLP存在的情况下，抗EBV Gp350 CAR-T细胞对靶PCI-gp350细胞的增强的细胞毒性依赖于与VLP靶向Raji细胞的共孵育。与Raji细胞共孵育的1.25x108 VLP样本(Raji+1.25x108 VLP)表现出比未与Raji细胞共孵育的1.25x108 VLP样本(无Raji+1.25x108 VLP)高得多的细胞毒性。
图5显示，抗EBV Gp350 CAR-T细胞对不含gp350抗原的PCI细胞系，在存在或不存在EBV VLP时均表现出几乎没有或较低的细胞毒性。
图6显示了另一组实验的结果，将EBV的VLP与Raji细胞共孵育，以VLP浓度方式(CAR+VLPe7或CAR+VLPe8，相比仅CAR)显著增强了抗EBV Gp350 CAR-T细胞对靶细胞PCI-gp350细胞系(PCI-g)的细胞毒性(细胞溶解％)。相反，EBV VLP不增加抗EBV Gp350 CAR-T细胞对对照PCI细胞的细胞毒性(细胞溶解％)。单独的EBV VLP不增加空白对照T细胞或无gp350表达的PCI细胞的细胞毒性(细胞溶解％)。
实施例8：包含抗EBV Gp350 scfv的CAR-T细胞在小鼠肿瘤模型中的体内评估
通过将4X106/100μl鼻咽癌细胞(C666-1，经过工程化以表达gp350蛋白和荧光素酶追踪剂)皮下(s.c)注射到6周大的NOD-scid IL2Rγnull小鼠(NOG)小鼠(CharlesRiver)中，建立鼻咽癌异种移植模型。次日，对小鼠进行IVIS成像检查，然后分组进行T细胞静脉注射。
为进行成像检查，小鼠吸入异氟烷麻醉，并在成像过程中维持1.5-2％异氟烷浓度。使用配备摄像箱和升温台的IVIS Lumina SeriesIII成像系统进行基于荧光素酶的生物发光成像。腹腔注射溶于磷酸盐缓冲液(PBS)的150mg/kg D-荧光素15分钟后，捕获小鼠图像，定量分析生物发光强度。选择每只小鼠的相同目的区域(ROI)来确定总通量值，以光子(p)/秒(sec)表示。
Gp350靶向的CAR-T细胞采用来自健康供体的外周血单核细胞(PBMC)按照内部方案制备。T细胞施用后，将4x106/100μl或2x106/100μl CAR-T细胞、空白对照T细胞或PBS静脉注射到C666-1小鼠模型中。每周监测2至3次体重和肿瘤生长情况。在第7、14、18或21天，检测生物发光强度水平以监测肿瘤细胞的变化。在第18或24天进行尸检，采集血液进行FACS检测；取出肿瘤和主要器官并称重。
图7显示，Gp350 CAR-T细胞在体内抑制鼻咽癌细胞C666-1生长并抑制肿瘤形成。将C666-1细胞(经gp350和荧光素酶表达工程化)皮下注射到小鼠体内，随后施用4x106(4E6)或2x106(4E6)个gp350 CAR-T细胞或空白对照T细胞。图7A显示了在第0天、第7天、第14天、第18天(4x106组)或第21天(2x106和PBS组)时间点的肿瘤细胞生长荧光成像结果，并进行了比较，展示了gp350 CAR-T细胞对肿瘤形成的特异性抑制作用。图7B显示4x106(4E6)CAR-T细胞或空白对照T细胞治疗组在注射CAR-T细胞后第0、7、14、18或21天平均肿瘤细胞发光强度变化。图7C显示2x106(2E6)CAR-T细胞、空白对照T细胞或PBS治疗组在注射CAR-T细胞后第0、7、14、18或21天平均肿瘤细胞发光强度变化。图7D显示CAR-T注射后第0、7、14、18或21天平均肿瘤体积变化模式。图7E显示不同实验组小鼠肿瘤组织重量的解剖和评估，显示CAR-T治疗组肿瘤生长减少。
图8进一步显示了第18天4x106(4E6)CAR-T细胞和空白对照T细胞治疗组血液或脾脏样本中人CD45+、CD8+、CAR+和CAR+/CD8+细胞百分比和计数比较(图8A)，以及第24天2x106(2E6)CAR T细胞和空白对照T细胞治疗组血液或脾脏样本中人CD45+、CD8+、CAR+和CAR+/CD8+细胞百分比和计数比较(图8B)。结果表明，CAR-T细胞在血液和脾脏中存在，同时抑制了肿瘤的形成。
在T细胞淋巴瘤模型的小鼠体内研究中，在gp350靶向CAR-T细胞治疗前，在小鼠体内注射2ⅹ106/100μl Jurkat-gp350-luc细胞5天或7天以形成肿瘤。前组小鼠进行IVIS成像检查并施用1x106(1E6)/100μl CAR-T细胞或空白对照T细胞；后组小鼠进行IVIS成像检查并分别施用2x106(2E6)/100μl CAR-T或空白对照T细胞。每周称重并观察小鼠2至3次。在第7、14和21天，检测生物发光强度以监测肿瘤细胞的变化。结果表明，Gp350 CAR-T细胞能够抑制T细胞淋巴瘤细胞生长并抑制体内肿瘤的形成(图9)。图9A显示了T细胞淋巴瘤小鼠模型的肿瘤概况，该模型注射了Jurkat-gp350-luc细胞5或7天以形成肿瘤。小鼠接受IVIS成像检查，并分别施用2x106(2E6)或1x106(1E6)个CAR-T细胞或空表白对照T细胞。分别于第0天、第7天、第14天、第21天、第28天、第32天时间点记录并比较肿瘤细胞生长荧光成像，显示gp350CAR-T细胞对肿瘤形成的特异性抑制作用。图9B和9C分别显示了注射CAR-T细胞后，2x106(2E6)或1x106(1E6)个CAR-T细胞组或空白对照T细胞组小鼠肿瘤细胞平均荧光强度在时间过程中的变化。
实施例9：在被诊断患有中枢神经系统受累的B细胞急性淋巴细胞白血病的患者 中，包含抗EBV Gp350的CAR T细胞诱导的肿瘤缩小
进行了一项试验研究，以测试EBV Gp350特异性CAR-T细胞治疗人类受试者的安全性和有效性。ZYH，一名36岁的男性，被诊断患有中枢神经系统受累的B细胞急性淋巴细胞白血病，被施用了约2.87x106个EBV Gp350特异性CAR-T细胞。图10(A)为MRI成像结果，显示治疗前(上图)和治疗后(下图)的脑部病变，病变在治疗后几乎消失；图10(B)显示治疗后CSF中异常未成熟细胞比例从第1天到第129天下降。治疗后，该受试者出院，无CRS、ICANS，心脏、肝和肾功能检查无明显异常。

Claims (36)

1.一种免疫原性组合物，其包含：
(a)聚肌苷酸-聚胞苷酸(PIC)；
(b)稳定剂，其为氨基糖苷类抗生素或非氨基糖苷类胺；
(c)至少一种阳离子；和
(d)任选地免疫原，其中所述免疫原是重组蛋白、病毒样颗粒(VLP)、肽、mRNA或疫苗。
2.一种包含EB病毒(EBV)的VLP的免疫原性组合物，优选地，所述VLP包含糖蛋白350/220(gp350)蛋白或其片段，其中优选地所述VLP还包含一个、两个、三个或更多个多肽序列，所述多肽序列与选自SEQ ID NO:102至117的多肽序列至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一；其中更优选所述EBV-VLP包含gp350、BKRF4、BVRF1、BDLF3、BZLF2、BXLF2、BNRF1、BALF4和BZLF1的EBV蛋白，或其功能变体，其与本文所述的多肽序列至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其用于癌症治疗。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物在制造用于癌症治疗的药物中的用途。
5.根据权利要求3至4中任一项所述的组合物或用途，其中所述癌症治疗是免疫细胞疗法(优选CAR-T细胞疗法)，并且任选地所述组合物增强细胞疗法的抗癌效果。
6.根据权利要求3至5中任一项所述的组合物或用途，用于与工程化的免疫细胞(优选CAR-T细胞或工程化的TCR-T细胞)组合使用，用于癌症治疗，其中任选地，所述免疫原性组合物在免疫细胞之前、之后或同时施用于受试者。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的组合物或用途，其中所述免疫原是肿瘤相关抗原或与病毒相关的抗原，优选地，所述免疫原是包含糖蛋白350/220(gp350)蛋白或其片段的EB病毒(EBV)的VLP。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的组合物或用途，其中所述稳定剂为氨基糖苷类抗生素，其选自卡那霉素、链霉素、双氢链霉素、甘露糖苷链霉素、阿米卡星、阿米卡星、地贝卡星、Vietomycin、庆大霉素及其任意组合；且优选地所述稳定剂为卡那霉素。
9.根据权利要求1至7中任一项所述的组合物或用途，其中所述稳定剂是非氨基糖苷类胺，其选自聚乙二醇单甲醚、聚乙二醇、聚乙烯亚胺、叶酸、半乳糖、聚赖氨酸、鱼精蛋白、壳寡糖、壳聚糖、精胺、葡萄糖胺及其任意组合；优选地，所述稳定剂为聚乙二醇单甲醚、聚乙二醇、聚乙烯亚胺、叶酸、半乳糖、聚赖氨酸、几丁质、壳聚糖或葡萄糖胺；更优选地所述稳定剂为聚乙二醇单甲醚、聚乙二醇、聚乙烯亚胺、ε-聚赖氨酸、己基葡萄糖胺或乙酰葡萄糖胺。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的组合物或用途，其中所述阳离子选自钙、镉、锂、镁、铈、铯、铬、钴、氘、镓、碘、铁、锌及其任意组合；并且优选地所述阳离子为钙。
11.根据权利要求5至10中任一项所述的组合物或用途，其中所述免疫细胞是表达CAR的T细胞，所述CAR包含胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域，其中胞外结构域包含特异性结合癌症表面表达的抗原的抗原结合结构域，其中优选地所述抗原结合结构域是scFv结构域。
12.根据权利要求11所述的组合物或用途，其中所述胞内结构域包含至少一个共刺激结构域。
13.根据权利要求12所述的组合物或用途，其中所述共刺激结构域是以下项或其任意组合的信号传导区：CD28、OX-40、4-1BB/CD137、CD2、CD7、CD27、CD30、CD40、程序性死亡-1(PD-1)、可诱导T细胞共刺激分子(ICOS)、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1(CD11a/CD18)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD247、CD276(B7-H3)、LIGHT(TNFSF14)、NKG2C、Igα(CD79a)、DAP-10、Fcγ受体、MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白、细胞因子受体、整合素、信号淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)、活化NK细胞受体、BTLA(一种Toll配体的受体)、ICAM-1、B7-H3、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAMI(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(触觉)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、与CD83特异性结合的配体。
14.根据权利要求13所述的组合物或用途，其中所述共刺激结构域包含4-1BB/CD137的信号传导区。
15.根据权利要求13所述的组合物或用途，其中所述共刺激结构域包含CD28的信号传导区。
16.根据权利要求12至15中任一项所述的组合物或用途，其中所述CAR包含两个或更多个共刺激结构域。
17.根据权利要求16所述的组合物或用途，其中所述CAR包含两个共刺激结构域，两个共刺激结构域之一为CD28，并且另一个共刺激结构域选自4-1BB/CD137或OX40。
18.根据权利要求11至17中任一项所述的组合物或用途，其中所述CAR的胞内结构域包含至少一个激活结构域。
19.根据权利要求18所述的组合物或用途，其中所述激活结构域包含CD3，优选地所述CD3为CD3ζ。
20.根据权利要求5至10中任一项所述的组合物或用途，其中所述免疫细胞是T细胞、自然杀伤(NK)细胞、TCR表达细胞、树突状细胞、γδT细胞或NK-T细胞，优选地，所述免疫细胞是CAR-T细胞。
21.一种增强个体中免疫细胞疗法的抗癌反应的方法，该方法包括施用有效量的权利要求1至20中任一项的免疫原性组合物至所述个体。
22.一种治疗患有癌症个体的方法，该方法包括：
(a)施用有效量的权利要求1至10中任一项的免疫原性组合物至所述个体；并且
(b)施用有效量的权利要求11至20中任一项所述的细胞至所述个体。
23.根据权利要求3至22中任一项的组合物、用途或方法，其中所述癌症是EBV相关癌症，选自淋巴组织增殖性疾病(LPD)，例如B细胞淋巴瘤，包括伯基特淋巴瘤(BL)、霍奇金淋巴瘤(HL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、T细胞淋巴瘤、NK/T细胞淋巴瘤，或移植后淋巴组织增殖性疾病(PTLD)，或上皮癌(鼻咽癌、肺癌、乳腺癌)、淋巴上皮瘤、伴有淋巴样间质的癌(GCLS，例如胃癌)或胶质瘤。
24.根据权利要求3至23中任一项所述的组合物、用途或方法，其中所述通过CAR识别的抗原是EB病毒抗原(EBV抗原)，其中优选地所述EBV抗原是EBV糖蛋白350/220(gp350/220)。
25.根据权利要求5至24中任一项所述的组合物、用途或方法，其中所述细胞包含CAR，所述CAR包含抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含如表1和表2所提供的重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，或如表1和表2所提供的特定VH和VL组合；其中优选地，所述抗原结合结构域包含：
(1)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:1的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:6的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；
(2)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:2的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:7的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；
(3)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:3的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:8的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；
(4)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:4的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:9的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；
(5)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:5的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:10的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；
(6)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:138的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:141的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；
(7)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:138的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:142的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；
(8)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:138的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:143的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；
(9)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:139的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:141的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；
(10)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:139的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:142的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；
(12)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:139的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:143的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；
(13)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:140的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:141的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；
(14)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:140的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID No:142的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；或
(15)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:140的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:143的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体。
26.根据权利要求5至24中任一项所述的组合物、用途或方法，其中所述细胞包含CAR，所述CAR包含抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含如表3和表4中提供的一个、两个、三个或更多个HCDR和/或一个、两个、三个或更多个LCDR，或如表3和表4中提供的特定HCDR1-3和LCDR1-3组合；其中优选地，所述结合EBV gp350/220的抗原结合结构域包含重链互补决定区1(HCDR1)、HCDR2、HCDR3，轻链互补决定区1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3，所述互补决定区具有以下多肽序列：
(1)SEQ ID NO:11、12、13、26、27和28，分别地；
(2)SEQ ID NO:14、15、16、29、30和31，分别地；
(3)SEQ ID NO:17、18、19、32、33和34，分别地；
(4)SEQ ID NO:20、21、22、35、36和37，分别地；或
(5)SEQ ID NO:23、24、25、38、39和40，分别地；或
EBV糖蛋白350/220抗原结合结构域，其与其竞争或结合至与本文所述的CAR的抗原结合结构域(1)至(5)中的任一项所结合的EBV糖蛋白350/220中的表位相同的表位。
27.根据权利要求5至24中任一项所述的组合物、用途或方法，其中所述细胞包含CAR，所述CAR包含如表5所提供的CAR氨基酸序列中的任一项。
28.根据权利要求3至24中任一项所述的组合物、用途或方法，其中将所述组合物和细胞同时或依次施用，例如，在施用细胞之前或之后施用组合物。
29.一种CAR，或包含所述CAR的免疫细胞(优选CAR-T细胞)，其中所述CAR包含EBV糖蛋白350/220抗原结合结构域，其中所述抗原结合结构域包含重链可变区和/或轻链可变区，所述重链可变区具有与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、138、139或140中任一项至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的多肽序列，所述轻链可变区具有与SEQ ID NO:6、7、8、9、10、141、142或143中任一项至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的多肽序列。
30.根据权利要求29所述的CAR或免疫细胞(优选CAR-T细胞)，其中结合EBV gp350/220的抗原结合结构域包含重链互补决定区1(HCDR1)、HCDR2、HCDR3，轻链互补决定区1(LCDR1)、LCDR2和LCDR3，所述互补决定区具有如下多肽序列：
(1)SEQ ID NO:11、12、13、26、27和28，分别地；
(2)SEQ ID NO:14、15、16、29、30和31，分别地；
(3)SEQ ID NO:17、18、19、32、33和34，分别地；
(4)SEQ ID NO:20、21、22、35、36和37，分别地；或
(5)SEQ ID NO:23、24、25、38、39和40，分别地；或
EBV糖蛋白350/220抗原结合结构域，其与其竞争或结合至与本文所述的CAR的抗原结合结构域(1)至(5)中的任一项所结合的EBV糖蛋白350/220中的表位相同的表位。
31.根据权利要求29或30所述的CAR或免疫细胞(优选CAR-T细胞)，其中EBV糖蛋白350/220抗原结合结构域包含以下任一项：
(1)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:1的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:6的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；
(2)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:2的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:7的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；
(3)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:3的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:8的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；
(4)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:4的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:9的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；
(5)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:5的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID No:10的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；或
(6)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:138的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:141的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；
(7)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:138的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:142的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；
(8)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:138的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:143的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；
(9)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:139的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:141的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；
(10)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:139的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:142的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；
(12)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:139的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:143的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；
(13)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:140的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:141的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；
(14)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:140的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID No:142的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体；或
(15)重链可变区(VH)，其具有SEQ ID NO:140的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体，以及轻链可变区(VL)，其具有SEQ ID NO:143的多肽序列或与该序列相关的其中1、2或3个氨基酸被取代的变体。
32.根据权利要求29至31中任一项所述的CAR或免疫细胞(优选CAR-T细胞)，其中所述EBV糖蛋白350/220抗原结合结构域包含如表1和表2所提供的重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，或如表1和表2所提供的特定的VH和VL组合。
33.根据权利要求29至32中任一项所述的CAR或免疫细胞(优选CAR-T细胞)，其中所述EBV糖蛋白350/220抗原结合结构域包含如表3和表4所提供的一个、两个、三个或更多个HCDR和/或一个、两个、三个或更多个LCDR，或如表3和表4所提供的特定的HCDR1-3和LCDR1-3组合。
34.根据权利要求29至33中任一项所述的CAR或免疫细胞(优选CAR-T细胞)，其中所述EBV糖蛋白350/220抗原结合结构域包含与表5所提供的任一CAR序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列，优选地该CAR选自SEQ ID NO:144至161。
35.根据权利要求29至34中任一项所述的免疫细胞(优选CAR-T细胞)，其用于癌症治疗，其中优选地所述癌症是EBV相关癌症，例如，选自淋巴组织增殖性疾病(LPD)，例如B细胞淋巴瘤，包括伯基特淋巴瘤(BL)、霍奇金淋巴瘤(HL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、T细胞淋巴瘤、NK/T细胞淋巴瘤，或移植后淋巴组织增殖性疾病(PTLD)，或上皮癌(鼻咽癌、肺癌、乳腺癌)、淋巴上皮瘤、伴有淋巴样间质的癌(GCLS，例如胃癌)或胶质瘤。
36.一种分离的核酸分子，优选地为分离的载体的形式，例如分离的病毒载体，其包含编码根据前述权利要求中任一项的CAR多肽的核苷酸序列。
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