CN120458009B

CN120458009B - 一种葡萄体细胞胚再生的方法

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Publication number: CN120458009B
Application number: CN202510783042.5A
Authority: CN
Inventors: 李廷刚; 刘其宝; 韩星; 袁丽芳; 魏彦锋
Original assignee: Shandong Grape Research Institute
Current assignee: Shandong Grape Research Institute
Priority date: 2025-06-12
Filing date: 2025-06-12
Publication date: 2025-11-21
Anticipated expiration: 2045-06-12
Also published as: CN120458009A

Abstract

本发明提供了一种葡萄体细胞胚再生的方法，属于葡萄组织培养技术领域。本发明的葡萄体细胞胚再生的方法包括种子萌发、胚性愈伤组织诱导、胚性愈伤组织分化体细胞胚、诱导体细胞胚的生根和幼苗炼苗的步骤。本发明选择葡萄植株的胚轴作为外植体，并在诱导培养基和体细胞胚分化培养基中添加特定的植物生长调节剂，提高了愈伤诱导率和体细胞胚发生率。本发明可获得大量遗传基础一致的葡萄体细胞胚再生植株，可实现葡萄快速、稳定、高效地育苗，缩短了葡萄育种的周期，为制备葡萄体细胞胚再生植株提供了新方法。

Description

一种葡萄体细胞胚再生的方法

技术领域

本发明涉及葡萄组织培养技术领域，尤其涉及一种葡萄体细胞胚再生的方法。

背景技术

葡萄(Vitis vinifera L.)为葡萄科葡萄属木质藤本植物，是世界最古老的果树树种之一，原产于亚洲西部，现广泛种植于世界各地。葡萄属植物属于木质藤本植物，由于其生长周期较长以及基因组的高度杂合性，传统育种方法耗时较长。玫瑰香葡萄(学名：Muscat)，别名麝香葡萄、紫玫瑰香，属欧亚种，是世界上最古老的葡萄品种之一，果粒着生中等紧密，椭圆形，深紫红色，果皮中等厚，肉质中等，味甜，有浓郁的玫瑰香味，品质上等，原产于英国，以鲜食、酿酒、制汁“三栖”功能闻名，随着酿酒业的发展，对玫瑰香葡萄的需求日益增加。

当前，葡萄再生体系发生的途径主要有器官发生途径和体细胞胚发生途径，但与器官发生相比，体细胞胚发生产生的胚性细胞分散性好，生长旺盛、生理生化代谢活跃、生命力强且易于分化，以胚性愈伤组织作为遗传转化的受体，植株再生性高，遗传操作的效果较好，因此，在葡萄转基因技术研究过程中，再生体系主要以体细胞胚发生途径为主。虽然现有技术已有了大量的葡萄体细胞胚发生的研究，然而，葡萄体细胞胚再生体系受到基因型、外植体、培养基成分等多种因素的影响，导致该途径普遍面临诱导效率低、体细胞胚萌发成苗困难以及畸形胚发生率高等问题。因此，亟需提供一种针对“玫瑰香”葡萄体细胞胚再生体系的建立方法。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种葡萄体细胞胚再生的方法，解决体细胞胚萌发成苗困难的问题。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种葡萄体细胞胚再生的方法，包括以下步骤：

(1)种子萌发：将葡萄种子播种于固体培养基中，光照培养32～36天，获得未长出真叶的葡萄植株；

(2)胚性愈伤组织诱导：切取植株胚轴，接种至诱导培养基，黑暗条件下培养24～28天，获得愈伤组织；

(3)胚性愈伤组织分化体细胞胚：将所述愈伤组织转入体细胞胚分化培养基，于黑暗环境下培养；待子叶胚长出后转为光照培养，30～40天后，获得体细胞胚；

(4)诱导体细胞胚的生根：待体细胞胚的胚轴和胚根分化时，转接到生根培养基中，光照培养30～40天，得到生根后的植株；

(5)幼苗炼苗：将生根后的植株转移到栽培基质中，炼苗20～30天，获得葡萄再生植株；

所述体细胞胚分化培养基包括以下组分：MS+2,4-D 0.5～1mg/L+IBA 3～5mg/L+蔗糖25～35g/L+琼脂6～8g/L，pH＝6.0±0.2。

优选的，所述固体培养基包括以下组分：MS+蔗糖25～35mg/L+琼脂6～8mg/L，pH＝6.0±0.2。

优选的，所述诱导培养基包括以下组分：MS+6-BA 1～3mg/L+蔗糖25～35mg/L+琼脂6～8mg/L，pH＝6.0±0.2。

优选的，所述生根培养基包括以下组分：MS+NAA 1～2mg/L+蔗糖25～35g/L+琼脂6～8g/L，pH＝6.0±0.2。

优选的，步骤(3)和步骤(4)每天光照的时间为14～18h，光照强度为1500～2000Lx。

优选的，步骤(1)～(5)的培养温度为22～26℃。

优选的，所述栽培基质包括泥炭土、珍珠岩和蛭石，所述泥炭土、珍珠岩和蛭石的质量比为3～4:1:1。

优选的，所述炼苗在温室中于自然光照下培养生长。

通过采用上述技术方案，本发明具有如下有益效果：本发明的葡萄体细胞胚再生的方法包括种子萌发、胚性愈伤组织诱导、胚性愈伤组织分化体细胞胚、诱导体细胞胚的生根和幼苗炼苗的步骤。本发明选择葡萄植株的胚轴作为外植体，并在诱导培养基和体细胞胚分化培养基中添加特定的植物生长调节剂，提高了愈伤诱导率和体细胞胚发生率。本发明可获得大量遗传基础一致的葡萄体细胞胚再生植株，可实现葡萄快速、稳定、高效地育苗，缩短了葡萄育种的周期，为制备葡萄体细胞胚再生植株提供了新方法。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

本发明实施例中的葡萄品种为“玫瑰香”。

实施例1

(1)种子萌发：将葡萄种子消毒后，播种于固体培养基中，光照培养36天，获得未长出真叶的葡萄植株；

(2)胚性愈伤组织诱导：切取植株胚轴，接种至诱导培养基，黑暗条件下培养28天，获得愈伤组织；

(3)胚性愈伤组织分化体细胞胚：将所述愈伤组织转入体细胞胚分化培养基，于黑暗环境下培养；待子叶胚长出后转为光照培养，40天后，获得体细胞胚；

(4)诱导体细胞胚的生根：待体细胞胚的胚轴和胚根分化时，转接到生根培养基中，光照培养40天，得到生根后的植株；

(5)幼苗炼苗：将生根后的植株转移到栽培基质中，在温室中于自然光照下炼苗30天，获得葡萄再生植株；

步骤(1)～(5)的培养温度为22～26℃，步骤(3)和步骤(4)每天光照的时间为14h，光照强度为2000Lx。

固体培养基包括以下组分：MS+蔗糖25mg/L+琼脂6mg/L，pH＝5.8；

诱导培养基包括以下组分：MS+6-BA 1mg/L+蔗糖25mg/L+琼脂6mg/L，pH＝5.8；

体细胞胚分化培养基包括以下组分：MS+2,4-D 0.5mg/L+IBA 3mg/L+蔗糖25g/L+琼脂6g/L，pH＝5.8；

所述生根培养基包括以下组分：MS+NAA 1mg/L+蔗糖25g/L+琼脂6g/L，pH＝5.8；

所述栽培基质包括泥炭土、珍珠岩和蛭石，所述泥炭土、珍珠岩和蛭石的质量比为3:1:1。

实施例2

步骤(1)～(5)的培养温度为22～26℃，步骤(3)和步骤(4)每天光照的时间为16h，光照强度为1800Lx。

固体培养基包括以下组分：MS+蔗糖30mg/L+琼脂7mg/L，pH＝6.0；

诱导培养基包括以下组分：MS+6-BA2mg/L+蔗糖30mg/L+琼脂7mg/L，pH＝6.0；

体细胞胚分化培养基包括以下组分：MS+2,4-D 0.8mg/L+IBA4 mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH＝6.0；

所述生根培养基包括以下组分：MS+NAA 1.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH＝6.0；

所述栽培基质包括泥炭土、珍珠岩和蛭石，所述泥炭土、珍珠岩和蛭石的质量比为3.5:1:1。

实施例3

步骤(1)～(5)的培养温度为26℃，步骤(3)和步骤(4)每天光照的时间为18h，光照强度为1500Lx。

固体培养基包括以下组分：MS+蔗糖35mg/L+琼脂8mg/L，pH＝6.2；

诱导培养基包括以下组分：MS+6-BA 3mg/L+蔗糖35mg/L+琼脂8mg/L，pH＝6.2；

体细胞胚分化培养基包括以下组分：MS+2,4-D 1mg/L+IBA 5mg/L+蔗糖35g/L+琼脂8g/L，pH＝6.2；

所述生根培养基包括以下组分：MS+NAA2 mg/L+蔗糖35g/L+琼脂8g/L，pH＝6.2；

所述栽培基质包括泥炭土、珍珠岩和蛭石，所述泥炭土、珍珠岩和蛭石的质量比为4:1:1。

对比例1

与实施例2不同的是，选择植株的子叶为外植体。

对比例2

与实施例2不同的是，将诱导培养基中的6-BA用2,4-D替换。

对比例3

与实施例2不同的是，诱导培养基中的6-BA浓度为0.5mg/L。

对比例4

与实施例2不同的是，诱导培养基中的6-BA浓度为4mg/L。

对比例5

与实施例2不同的是，将体细胞胚分化培养基中的IBA替换成NAA。

对比例6

与实施例2不同的是，将体细胞胚分化培养基中的2,4-D替换成6-BA。

实验例1

实验分为7组，分别按照实施例1～3和对比例1～4中的方法进行葡萄体细胞胚再生培养，每组接种100个外植体，将外植体接种至诱导培养基，黑暗条件下培养28天后，统计愈伤诱导率，结果如表1所示。

愈伤诱导率＝形成愈伤植株数/接种的外植体总数×100％

表1各组愈伤诱导率

组别	愈伤诱导率(％)
		实施例1	96
实施例2	98
		实施例3	99
对比例1	65
		对比例2	76
对比例3	80
		对比例4	88

由实施例1～3可知，在胚性愈伤组织诱导阶段，采用胚根作为外植体，以本发明的诱导培养基进行诱导分化，诱导在96％以上；由实施例2、对比例1可知，选择子叶作为外植体，愈伤组织诱导率降低，仅为65％；由对比例2～4可知，改变诱导培养基中植物生长调节剂的种类或浓度，愈伤组织诱导率降低。

实验例2

实验分为5组，分别按照实施例1～3和对比例5、6中的方法进行葡萄体细胞胚再生培养，将外植体接种至诱导培养基，黑暗条件下培养，获得愈伤组织，每组将100个愈伤组织转入体细胞胚分化培养基，于黑暗环境下萌发；待子叶胚长出后转为光照培养，40天后，统计体细胞胚发生率，结果如表2所示。

体细胞胚发生率＝形成体细胞胚植株数/接种的愈伤组织总数×100％

表2各组体细胞胚发生率

根据表2中的结果显示，本发明实施例1～3的体细胞胚发生率高于对比例5和对比例6，说明本发明的体细胞胚分化培养基是愈伤组织诱导较佳的培养基配方，有利于葡萄体细胞胚的形成。

由以上实施例可知，本发明提供了一种葡萄体细胞胚再生的方法，可获得大量遗传基础一致的葡萄体细胞胚再生植株，可实现葡萄快速、稳定、高效地育苗。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种葡萄体细胞胚再生的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)种子萌发：将葡萄种子播种于固体培养基中，光照培养32~36天，获得未长出真叶的葡萄植株；

(2)胚性愈伤组织诱导：切取植株胚轴，接种至诱导培养基，黑暗条件下培养24~28天，获得愈伤组织；

(3)胚性愈伤组织分化体细胞胚：将所述愈伤组织转入体细胞胚分化培养基，于黑暗环境下培养；待子叶胚长出后转为光照培养，30~40天后，获得体细胞胚；

(4)诱导体细胞胚的生根：待体细胞胚的胚轴和胚根分化时，转接到生根培养基中，光照培养30~40天，得到生根后的植株；

(5)幼苗炼苗：将生根后的植株转移到栽培基质中，炼苗20~30天，获得葡萄再生植株；

所述体细胞胚分化培养基为：MS+2 ,4-D 0 .5~1mg/L+IBA 3~5mg/L+蔗糖25~35g/L+琼脂6~8g/L，pH=6.0±0.2；

所述诱导培养基为：MS+6-BA 1~3mg/L+蔗糖25~35mg/L+琼脂6~8mg/L，pH=6.0±0.2。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固体培养基为：MS+蔗糖25~35mg/L+琼脂6~8mg/L，pH=6.0±0.2。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生根培养基为：MS+NAA 1~2mg/L+蔗糖25~35g/L+琼脂6~8g/L，pH=6.0±0.2。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)和步骤(4)每天光照的时间为14~18h，光照强度为1500~2000Lx。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)~(5)的培养温度为22~26℃。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述栽培基质包括泥炭土、珍珠岩和蛭石，所述泥炭土、珍珠岩和蛭石的质量比为3~4:1:1。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述炼苗在温室中于自然光照下培养生长。