CN120435565A - 腺相关病毒生产平台 - Google Patents

Abstract

本文提供了一种新的基于rAAV的HSV生产方法，该方法包括两种工程化细胞系：用于生产多种AAV血清型的工程化CHO细胞和用于生产rHSV‑1原液的工程化BHK‑21，其用于在CHO细胞中生产rAAV。所开发的方法提供了可扩展的无血清制造平台。

Description

腺相关病毒生产平台

背景技术

重组腺相关病毒载体(rAAV)是用于基因传递的主导平台，其中三种许可产品当前在2021年12月得到批准(Bulcha等人，2021年)。rAAV作为基因传递载体具有若干优点，包括与其他病毒载体相比，它们转导多种增殖和非增殖细胞、容纳细胞/组织特异性启动子并引发减弱的免疫应答的能力(Kang等人，2009年)。AAV是依赖病毒属(Dependovirus)细小病毒科(Parvoviridae)中的小的无包膜病毒(Srivastava等人，1983年；Daya和Berns，2008年)。AAV4.6-kb单链DNA基因组含有两个病毒基因：rep和cap。这些基因可以被去除并用表达治疗性转基因的盒以及以反式提供的必需rep和cap基因取代(Becerra等人，1988年)。AAV衣壳是二十面体的，并且由60个病毒蛋白(VP)单体组装而成，其中VP1具有约5个拷贝，VP2具有5个拷贝，并且VP3具有50个拷贝(Van Vliet等人，Methods Mol.Biol.2008；437：51-91.)

目前，rAAV有不同的细胞培养表达平台，包括表达所需rAAV血清型的rep和cap基因的稳定包装细胞系、稳定表达Rep、Cap和转基因的稳定原病毒细胞系、以及三重瞬时转染(Clark等人，1995年，Clark.，2002年，Qiao等人，2002年)。三重瞬时转染是最常见的生产rAAV的方法，该方法使用三种质粒：一种编码侧接AAV反向末端重复(ITR)的目的基因(GOI)，第二种编码AAV的rep和cap基因，第三种编码腺病毒辅助功能基因。通过在rep-cap质粒中包含辅助基因，可将这种三质粒系统简化为共转染(Grimm等人，1998年，和ClarkK.R.，2002年)。然而，三重瞬时转染方法对于非常高剂量的扩大生产是具有挑战性的，非常高的剂量导致感染性颗粒(ip)的低特异性产量，并且通常导致高抗DNA酶颗粒(DRP/ip)比率(50-100)(Grimm等人，Hum Gene Ther；9：2745-2760(1998)和Zolotukhin等人，2002Methods；28：158-167)。

与腺病毒一样，据报道重组HSV-1(rHSV-1)也可以支持rAAV复制成为辅助病毒系统的一部分(Buvler等人，1981J Virol；40：241-247)。rAAV复制所需的最小HSV辅助基因是HSV解旋酶引物酶复合物(UL5、UL8、UL52)、HSV DNA聚合酶、和HSV DNA结合蛋白(UL29)基因(Weindler和Heilbronn.，1991J Virol；65：2476-2483)。此外，据报道，使用两种HSV-1载体(一种编码所需的rAAV rep/cap血清型，并且第二种编码GOI)的rHSV共感染方法在各种细胞系中产生了多种不同血清型的rAAV的非常高的特异性产量，具有非常低的(DRP/ip)比率(Kang等人，2009年)。HSV辅助系统的另一个优点是HSV能够在不同的哺乳动物细胞中复制并提供辅助功能，这意味着与需要人细胞系而成功进行的腺病毒辅助rAAV生产相比，HSV辅助功能不受rAAV生产的宿主范围限制(Buller等人，1970J Gen Virol；43：663-672)。

中国仓鼠卵巢(CHO)细胞主要用作重组单克隆抗体(mAb)生产和其他治疗性蛋白生产的表达宿主，其构成生物制药工业中增长最快的部分(Walsh G.，2018Nat.Biotechnol；36：1136-1145)。由于CHO细胞相对于人细胞的法规可接受性和低制造成本，使用CHO细胞用于病毒生产是期望的。然而，在关于使用CHO细胞用于rAAV生产的文献中存在有限的经验(如果有的话)，可能是由于在这些细胞中的细胞限制因子可能影响rAAV生产并干扰病毒包装。例如，已经显示CHO细胞在病毒中间体蛋白合成阶段不支持痘苗病毒复制(Ramsey-Ewing和Moss.1995Virology.1995年2月1日；206(2)：984-93)。此外，由于缺乏HSV-1侵入和感染的关键受体，CHO细胞天然地对HSV-1生产性感染具有抗性(Montgomery等人，1996年)。因此，本领域需要工程化无血清适应性悬浮CHO CAT-S细胞，以允许用编码用于不同rAAV生产的必需元件的复制缺陷型HSV-1载体的感染。

发明内容

本公开涉及一种适于在无血清条件下生长的幼仓鼠肾(BHK)细胞，其中该细胞稳定表达仓鼠密码子优化的单纯疱疹病毒-1(HSV-1)ICP27开放阅读框，该开放阅读框包含非必需感染细胞蛋白27(ICP27)元件的缺失。在一个方面，细胞悬浮生长。在另一方面，非必需ICP27元件是5′和3′非翻译区(UTR)。

本公开还涉及包含本文所述BHK细胞的细胞系。

本公开还涉及一种生产重组腺相关病毒(rAAV)载体的方法，该方法包括将含有AAV rep和cap序列以及编码目标基因的序列的重组疱疹病毒(rHSV)载体引入到本文所述的BHK细胞或细胞系；以及在用于生产rAAV载体的条件下培养该细胞或细胞系。

本公开还涉及一种适于在无血清条件下生长的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，其中该细胞稳定表达一种或多种侵入和感染单纯疱疹病毒-1(HSV-1)所必需的多肽。在一个方面，CHO细胞稳定表达疱疹病毒侵入介质(HVEM)和/或Nectin-1。在另一方面，HVEM和/或nectin-1序列已经密码子优化以在CHO细胞中表达。

本公开还涉及本文所述的CHO细胞。

本公开还涉及一种生产重组腺相关病毒(rAAV)载体的方法，该方法包括将含有AAV rep和cap序列以及编码目标基因(GOI)的序列的重组疱疹病毒(rHSV)载体引入到本文所述的CHO细胞或细胞系；以及在用于生产rAAV载体的条件下培养该细胞或细胞系。在另一方面，以约4：1、6：1、8：1、或10：1的rHSV-rep/cap：rHSV-GOI的感染复数引入rHSV载体。在另一方面，AAV血清型是AAV6、AAV8或AAV9。在另一方面，目的基因编码任何治疗性生物化合物。在另一方面，治疗性生物化合物是抗体或嵌合抗原受体。

附图说明

图1示出了用于稳定转染并产生八个池的质粒构建。图1a示出了四个单独的盒；池1(CMV-HVEM)，其中在CMV启动子和上游SV40聚腺苷酸下构建HVEM ORF。池2(CMV-HVEM-CO)，其中在CMV启动子和上游SV40聚腺苷酸下构建密码子优化的HVEM ORF。池3(CMV-Nectin-1)，其中在CMV启动子和BGH聚腺苷酸下构建Nectin-1ORF。池4(CMV-Nectin-1-CO)，其中在CMV启动子和BGH聚腺苷酸下构建密码子优化的Nectin-1ORF。图1b示出了四个双盒；池5(CMV-HVEM-Nectin-1)，其中构建了HVEM和Nectin-1ORF，并且分别侧接CMV启动子和SV40聚腺苷酸以及CMV启动子和BGH聚腺苷酸。池6(CMV-HVEM-Nectin-1-CO)，其中分别在CMV启动子和上游SV40聚腺苷酸以及CMV启动子和上游BGH聚腺苷酸下构建密码子优化的HVEM和Nectin-1ORF。池7(Spro-HVEM-Nectin-1)，其中HVEM和Nectin-1ORF分别在合成启动子(Spro)和上游SV40聚腺苷酸以及Spro和BGH聚腺苷酸下构建。池8(Spro-HVEM-Nectin-1-CO)，其中构建了密码子优化的HVEM和Nectin-1ORF，并且分别侧接Spro和SV40聚腺苷酸以及Spro和BGH聚腺苷酸。图1c示出了检测到来自池(CMV-HVEM、CMV-HVEM-CO、CMV-HVEM-Nectin-1、CMV-HVEM-Nectin-1-CO、Spro-HVEM-Nectin-1和Spro HVEM-Nectin-1-Co)的高水平HVEM表面表达，并表示为平均荧光强度(MFI)。图1d示出了检测到来自池(CMV-Nectin-1、CMV-Nectin-1-CO、CMV-HVEM-Nectin-1、CMV-HVEM-Nectin-1-CO、Spro-HVEM-Nectin-1和Spro HVEM-Nectin-1-Co)的高水平Nectin-1表面表达，并表示为MFI。

图2示出了来自稳定的CHO细胞池的绿色荧光蛋白(GFP)表达和rAAV9-GFP生产。图2a示出了来自感染后总共六个时间点(12、24、36、48、72和96)的rHSV-nols-AAV-GFP感染的稳定细胞池(MOI＝10)的平均GFP表达。池1和池2优于所有其他池和感染的宿主。所有池均胜过野生型宿主感染的CHO(p<0.0001)。图2b示出了使用MOI 1：1的rHSV-nols-AAV-GFP和rHSV-AAV9载体，来自感染的稳定细胞池24hpi的上清液的qPCR rAAV9-GFP滴度(vg/mL)。在由八个测试池产生的rAAV9-GFP物理滴度中未观察到显著差异。与野生型宿主感染的细胞相比，所有共感染的细胞池产生更高的rAAV9-GFP物理滴度。在测试的池中没有检测到rAAV9-GFP滴度的显著差异(p＝0.0976)。所有样品一式两份进行测试，并且所有数据表示为平均±SD。

图3示出了通过流式细胞术分析的rHSV-GFP感染的高和中CHO-HVEM表达克隆的产生。

图4示出了所选的CHO-HVEM表达克隆对于rHSV-1-GFP感染的表征和测试。图4a示出了最终24个选择的回收克隆，它们具有高HVEM表达(表示为MFI)。这些克隆中的十个是高HVEM表达克隆(克隆1、7、21、23、24、33、36、40、63和64)。其他剩余的14个克隆是中HVEM表达克隆(克隆9、11、13、14、15、16、23、28、29、42、46、51、54、62)。图4b示出了使用IncuCyte对所有24个克隆的rHSV-1GFP载体侵入和感染进行重新测试(记录两个时间点)。所有感染的克隆在感染后显示高GFP表达。然而，在测试的克隆中没有观察到GFP表达的显著差异(p＝0.5251)。

图5示出了测试在所选的八个CHO-HVEM克隆中rAAV6.2-GFP的生产。图5a示出了在rHSV-1载体共感染后细胞活力下降。图5b示出了在rHSV-1载体共感染后的活细胞密度下降。图5c示出了使用MOI 1：1的来自八个测试的CHO-HVEM表达克隆的rAAV6.2-GFP滴度。图5d示出了测试在使用不同MOI的CHO-HV-C1和CHO-HV-C62克隆中的rAAV6.2-GFP生产。图5e示出了测试在使用MOI 4：1的CHO-HV-C1中的rAAV8-GFP和rAAV9-GFP生产。

图6示出了在CHO-HV-C1共感染后细胞活力(图6a)和rAAV6.2GFP载体生产(图6b)的显著改善。

图7示出了使用PEG-氯仿方法收获和纯化rAAV载体的过程的示意图。

图8示出了在CHO-HV-C1克隆中产生的rAAV的分析表征。图8a示出了VP1、VP2和VP3衣壳蛋白的良好表达，以上衣壳蛋白来自纯化的rAAV6.2-GFP(使用不同的MOI生产；4：2、6：2、8：2和10：2)和rAAV9-GFP载体(使用不同的MOI生产；4：2、6：2和8：2)。图8b示出了纯化的rAAV6.2-GFP的微型透射电子显微照片(miniTEM)，其显示出91％的完整衣壳，没有聚集体也没有细胞碎片。图8c示出了纯化的rAAV9-GFP的miniTEM，其显示出79.5％的完整衣壳。白色箭头用于指示完整的衣壳，而黑色箭头用于指示不完整的(空的)衣壳。图8d示出了使用CE-SDS方法的rAAV衣壳比率检测，并示出了来自在CHO-HV-C1克隆中生产的测试rAAV6.2-GFP和rAAV9-GFP的VP1、VP2和VP3的吸光度值，其中进行杂质检测。

图9示出了在V27细胞上测试纯化的rAAV中的感染性rHSV-1残留。测试稳定表达HSV-1ICP27蛋白的互补V27细胞的用于在CHO-HV-Cl克隆中生产rAAV的rHSV-1载体的任何感染性残留。在感染后2至4天，在接种PEG-氯仿纯化的rAAV6.2-GFP和/或rAAV9-GFP载体的孔中没有出现细胞病变效应(CPE)，表明与接种rHSV-AAV-GFP载体的孔相比，用于共感染的rHSV-1载体完全失活，其中清晰的CPE似乎指示细胞变圆和细胞膜片的脱离。

图10示出了在CHO-HV-C1细胞中产生的rAAV的感染性。图10a示出了在CHO-HV-Cl克隆中产生并用PEG-氯仿方法纯化并在Ad293细胞上测试的纯化rAAV6.2-GFP载体的感染性，并且与在HEK293细胞中产生并用色谱方法纯化的rAAV6.2-GFP载体的感染性进行比较。图10b示出了在CHO-HV-Cl克隆中产生并在Ad293细胞上测试的PEG-氯仿纯化的rAAV9-GFP载体的感染性，并且与在HEK293细胞中产生并用色谱方法纯化的rAAV9-ZsGreen载体的感染性进行比较，图10c示出了在CHO-HV-C1细胞中产生的rAAV的体外转导。将在CHO细胞中产生的经PEG-氯仿纯化的rAAV6.2和rAAV9-GFP的转导与在HEK293细胞中产生并用色谱方法纯化的rAAV6.2-GFP和rAAV9-ZsGreen的转导进行比较。

图11示出了来源于CHO细胞的rAAV的生物分布。图11a示出了实验设计。将小鼠分成五组。G1、G2、G3、G4分别用每只小鼠10¹¹vg/100μL的rAAV6.2-GFP-CHO、rAAV9-GFP-CHO、来自三重瞬时转染(TTT)的rAAV6.2-GFP、或来自TTT的rAAV9-ZsGreen接种。G5用无菌PBS接种。在尾静脉注射后三周，对所有小鼠实施安乐死，并收获组织(肝脏、心脏、肺、肾脏和骨骼肌)且通过qPCR测试GFP拷贝，并通过共聚焦显微镜进行表达。图11b示出了使用qPCR的来自Gl和G3组织的GFP滴度。图11c示出了使用qPCR的来自G2和G4组织的GFP/ZsGreen滴度。图11d示出了使用共聚焦显微镜的来自所有组的肝切片的GFP表达。

图12示出了HSV-1生产者CHO-ICP27池和克隆的开发和选择。图12a示出了使用随机整合的稳定CHO-HV1-ICP27池的开发。将中国仓鼠密码子优化的HSV-1ICP27ORF亚克隆到自制质粒中，用于在CMV启动子和上游SV40聚腺苷酸下的细胞系开发。相同质粒编码的嘌呤霉素盒由嘌呤霉素ORF下游CMV启动子和BGH聚腺苷酸构成。图12b示出了使用CRISPR/Cas9技术开发稳定的CHO-HV1-ICP27池。使用自制pCLD质粒骨架和编码的密码子优化的中国仓鼠ICP27ORF下游CMV启动子和上游SV40聚腺苷酸以及侧接SV40启动子和SV40聚腺苷酸的嘌呤霉素盒构建供体质粒。两个盒侧接右同源臂和左同源臂(各750个碱基对)。两个盒的总长度为4.1kb。图12c示出了来自最终选择的克隆的ICP27表达的平均荧光强度(MFI)。七个克隆是位点整合的，如C6-S，并且17个克隆是随机整合的，如C-11R。

图13示出了在CHO-HV1-ICP27-C11中的rHSV-AAV9生产。使用三种不同的MOI来测试在33℃使用自制培养基在选定的CHO-HVl-ICP27-C11克隆中的rHSV-AAV9生产。通过对V27细胞的空斑测定来滴定收获的rHSV-AAV9。

图14示出了BHK-21-ICP27表达池的构建。图14a示出了在HSV-1ICP27内源启动子下表达经密码子优化的ICP27ORF的池1，其中嘌呤霉素作为选择标记。图14b示出了在CMV启动子下表达经密码子优化的ICP27ORF的池2，其中嘌呤霉素作为选择标记。图14c示出了在CMV启动子下表达未经密码子优化的ICP27ORF的池3，其中新霉素作为选择标记。

图15示出了HSV-AAV6.2在BHK-21-ICP27池中的生产。在无血清或存在4％FBS的情况下，使用Xell HEK TF测试回收的BHK21-ICP27池的rHSV-AAV6.2生产(MOI0.15PFU/mL)。在感染后第3天，通过空斑测定在V27细胞上滴定纯化的病毒。

图16示出了来自经PEG-氯仿纯化的rAAV样品的杂质的银染结果。

具体实施方式

最近的研究已经表明，与通过常用的三重瞬时转染方法和/或基于杆状病毒的系统生产的rAAV相比，使用重组单纯疱疹病毒1(rHSV-1)载体来生产不同的重组腺相关病毒(rAAV)产生了具有更高物理和转导滴度的rAAV。然而，基于rAAV的HSV生产平台目前面临两个主要挑战：(1)为了高生产率而依赖于补充血清的商业培养基，导致大规模生产过于昂贵以及将外源性因子引入最终产物的高风险，和(2)在表达HSV-1ICP27蛋白的贴壁Vero细胞(例如V27细胞系)中扩大生产rHSV-1载体的挑战。为了解决第一个挑战，本公开提供了八种无血清适应性CHO细胞池，其表达HSV-1侵入和感染所必需的受体(HVEM和/或Nectin-1)。使用高通量方法，本公开提供了顶级HVEM受体表达克隆(称为CHO-HV-C1)。有趣的是，与用较高MOI共感染后48-72小时内报告10log₁₀vg/mL的不基于CHO的平台相比，在CHO-HV-C1克隆中共感染后24小时内产生的rAAV6.2-GFP、rAAV8-GFP和rAAV9-GFP载体的较高产量用较低的感染复数(MOI)实现，其中滴度分别为～9.21log₁₀、9.40log₁₀和9.61log₁₀病毒基因组/mL(vg/mL)(Kang等人，2009年.Gene Therapy 16，229-239)。此外，在CHO-HV-C1克隆中产生的rAAV具有与通过三重瞬时转染产生的那些相当的体外和体内转导效力。为了解决第二个挑战，本公开提供了经工程化以表达HSV-1ICP27蛋白的自制无血清悬浮BHK-21细胞池。有趣的是，在无血清培养基中生长的BHK-21-ICP27表达池产生与V27细胞相当的rHSV-1滴度。

基因治疗对于治疗目前没有可行治疗方案的多种不同疾病，例如囊性纤维化、心力衰竭和杜氏(Duchenne)肌营养不良具有非常有前途的潜力。近年来，基因治疗集中于rAAV载体的使用，因为它们在递送至靶器官后长期表达，并且它们在人类中无致病性。用于临床研究的rAAV的当前制造方法包括三重瞬时转染(最常见的方法)、包装或生产细胞系和辅助病毒系统，例如使用HSV-1、杆状病毒和/或人腺病毒-5的那些。基于转染的方法诸如三重瞬时转染难以扩大生产，并且导致感染性颗粒(ip)和抗DNA酶颗粒的低特异性产量(Grimm等人，1998.Hum Gene Ther；9：2745-2760；Zolotukhin等人，2002.Methods；28：158-167)。另一方面，包装或生产细胞系限于产生一种rAAV血清型/产物。最近的研究表明，rHSV-1辅助的rAAV生产提供了一种高效的制造方法(Kang等人，2009年)。然而，使用rHSV-1系统的rAAV的典型制造涉及在补充血清的培养基中用两种复制缺陷型rHSV-1载体感染病毒生产细胞如BHK-21细胞，这对于大规模生产来说是非常昂贵的并且可能将外源性病毒因子和/或朊病毒引入最终产物。使用rHSV-1系统制造rAAV的另一个缺点是rHSV-1载体原液扩大生产的挑战，因为当前的rHSV-1载体原液的生产取决于使用表达HSV-1ICP27蛋白的贴壁Vero细胞(称为V27细胞，Rice和Knipe J Virol.1990年4月；64(4)：1704-15)。

CHO细胞是用于生产重组蛋白生物制剂的主要哺乳动物细胞类型，因为它们具有正确折叠、组装和修饰重组蛋白的能力(Aggarwal，2014.Nat.Biotechnol.32，32-39；Jayapal等人，2007.Cell Engineering Progress，103，40-47；和Walsh，2018.Nat.Biotechnol；36：1136-1145)。某些动物细胞类型，诸如猪睾丸(ST)和CHO细胞，可以有效地结合HSV-1病毒，但限制病毒侵入(Shieh等人，1992.J.Cell Biol.116，1273-1281；Subramanian等人，1994.J.Virol.68，5667-5676)。此外，据报道，猪和CHO细胞在表达编码HVEM的人cDNA时变得易于HSV-1侵入(Montgomery等人，1996.Cell Vol.87，427-436)。本公开旨在使用HSV-1辅助系统(一种天然不感染野生型CHO细胞的病毒)工程化悬浮的、无血清适应性CHO细胞以生产不同的rAAV。

rAAV是用于基因传递的主导平台，其中三种许可产品在2021年底被批准(Bulcha等人，2021年)。rAAV作为基因传递载体具有若干优点，包括与其他病毒载体相比，它们转导多种增殖和非增殖细胞、容纳细胞/组织特异性启动子并引发减弱的免疫应答的能力(Kang等人，2009年)。

目前，rAAV有不同的细胞培养表达平台，包括表达所需rAAV血清型的rep和cap基因的稳定包装细胞系、稳定表达Rep、Cap和转基因的稳定原病毒细胞系、以及三重瞬时转染(Clark等人，1995.Hum Gene Ther；6：1329-1341，Clark.，2002.Kidney Int；61s：9-15，Qiao等人，2002.Kidney Int；61s：9-15)。三重瞬时转染是最常见的生产rAAV的方法，该方法使用三种质粒：一种编码侧接AAV反向末端重复(ITR)的目的基因(GOI)，第二种编码AAV的rep和cap基因，第三种编码腺病毒辅助功能基因。通过在rep-cap质粒中包含辅助基因，可将这种三质粒系统简化为共转染(Grimm等人，1998年，和Clark K.R.，2002年)。然而，三重瞬时转染方法对于非常高剂量的扩大生产是具有挑战性的，非常高的剂量导致感染性颗粒(ip)的低特异性产量，并且通常导致高抗DNA酶颗粒(DRP/ip)比率(50-100)(Grimm等人，1998.Hum Gene Ther；9：2745-2760；Zolotukhin等人，2002.Methods；28：158-167)。

与腺病毒一样，据报道重组HSV-1(rHSV-1)也可以支持rAAV复制成为辅助病毒系统的一部分(Buller等人，1981年)。rAAV复制所需的最小HSV辅助基因是HSV解旋酶引物酶复合物(UL5、UL8、UL52)、HSV DNA聚合酶、和HSV DNA结合蛋白(UL29)基因(Weindler和Heilbronn.，1991.J Virol；65：2476-2483)。此外，据报道，使用两种HSV-1载体(一种编码所需AAV的AAV2rep和cap，并且第二种编码GOI)的rHSV共感染方法在各种细胞系中产生了多种不同血清型的rAAV的非常高的特异性产量，具有非常低的(DRP/ip)比率(Kang等人，2009年)。HSV辅助系统的另一个优点是HSV能够在不同的哺乳动物细胞中复制并提供辅助功能，这意味着与需要人细胞系而进行的腺病毒辅助rAAV生产相比，HSV辅助功能不受rAAV生产的宿主范围限制(Buller等人，1970.J Gen Virol；43：663-672)。

中国仓鼠卵巢(CHO)细胞主要用作重组单克隆抗体(mAb)和治疗性蛋白生产的表达宿主，其构成生物制药工业中增长最快的部分(Walsh G.，2018年)。由于CHO细胞相对于人细胞的法规可接受性和低制造成本，使用CHO细胞用于病毒生产是期望的。然而，在关于使用CHO细胞用于rAAV生产的文献中存在有限的经验(如果有的话)，可能是由于在这些细胞中的细胞限制因子可能影响rAAV生产并干扰病毒包装。例如，已经显示CHO细胞在病毒中间体蛋白合成阶段不支持痘苗病毒复制(Ramsey-Ewing和Moss.Virology.1995年2月1日；206(2)：984-93)。此外，由于缺乏用于非复制型HSV-1感染的关键受体，CHO细胞天然地对HSV-1生产性感染具有抗性(Montgomery等人，1996.Cell Vol.87，427-436)。本公开提供了经工程化以允许HSV-l侵入和感染的无血清适应性悬浮CHO-CAT-S细胞，用于使用HSV-1系统生产不同的rAAV。

定义

为了能够更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如在本说明书中所使用的，除非在本文中另外明确地提供，否则以下术语中的每个术语应具有下文阐述的含义。在整个说明书中阐述了附加的定义。

需注意，术语“一个”或“一种”是指一个或多个该实体；例如，“补料培养基”应理解为表示一种或多种补料培养基。因此，术语“一个”(或“一种”)、“一个或多个”和“至少一个”在本文中可互换使用。

本文使用的术语“和/或”应理解为具体披露了两个指定特征或组分中的每一者，无论是否有另一者。因此，如本文在诸如“A和/或B”之类的短语中使用的术语“和/或”旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独)和“B”(单独)。同样，如在诸如“A、B和/或C”之类的短语中使用的术语“和/或”旨在涵盖以下方面中的每一方面：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。

应当理解，本文中无论何处用语言“包含”描述各方面，也提供了依据“由……组成”和/或“基本上由……组成”描述的其他类似方面。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所涉及的领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。例如，Concise Dictionary of Biomedicine andMolecular Biology，Juo，Pei-Show，第2版，2002，CRC Press；The Dictionary of Celland Molecular Biology，第3版，1999，Academic Press；以及Oxford Dictionary ofBiochemistry And Molecular Biology，修订版，2000，Oxford University Press为技术人员提供了本公开中使用的许多术语的通用词典。

单位、前缀和符号以其国际单位制(SI)公认形式表示。数值范围包括限定该范围的数值。本文提供的标题不是对本公开的各个方面的限制，这些方面可通过参考整个说明书来获得。因此，下文立即定义的术语通过参考说明书的全部内容被更充分地定义。

另选方案(例如，“或”)的使用应理解为意指另选方案中的任一者、两者或它们的任何组合。如本文所用，不定冠词“一个”或“一种”应理解为是指任何列举或枚举的组分的“一个或多个”。

术语“约”或“基本上包含”是指值或组成在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内，这将部分地取决于如何测量或确定该值或组成，即，测量系统的限制。例如，“约”或“基本上包含”可意指根据本领域的实践在1个或超过1个标准偏差内。另选地，“约”或“基本上包含”可意指至多20％的范围。此外，特别是关于生物系统或过程，这些术语可意指至多一个数量级或至多5倍的值。当在本申请和权利要求中提供特定值或组成时，除非另有说明，否则“约”或“基本上包含”的含义应被假定为在该特定值或组成的可接受误差范围内。

如本文所述，除非另外指明，否则任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围应理解为包括所列举的范围内的任何整数的值，并且在适当时包括其分数(诸如整数的十分之一和百分之一)。

术语“腺相关病毒”、“AAV病毒”、“AAV病毒粒子”、“AAV病毒颗粒”和“AAV颗粒”在本文中用作同义词，是指由AAV的至少一种衣壳蛋白和对应于AAV基因组的包封多核苷酸组成的病毒颗粒。野生型AAV是指属于依赖病毒属(Dependovirus)细小病毒科(Parvoviridae)的病毒。野生型AAV基因组长度约为4.7kb，并且由单链脱氧核糖核酸(ssDNA)组成，其可以是正义或负义的。野生型基因组包括在DNA链两端的反向末端重复(ITR)和三个开放阅读框(ORF)。ORF rep编码AAV生命周期必需的四种Rep蛋白。ORF cap含有编码衣壳蛋白VP1、VP2和VP3的核苷酸序列，其相互作用形成二十面体对称的衣壳。最后，与cap ORF重叠的装配激活蛋白(aap)ORF编码看起来促进衣壳组装的AAP蛋白。如果颗粒包含侧接AAV ITR的异源多核苷酸(即，不同于野生型AAV基因组的多核苷酸，例如待递送至哺乳动物细胞的转基因)，则其通常称为“AAV载体颗粒”或“AAV病毒载体”或“AAV载体”或“重组AAV载体”。本发明还包括双链AAV或自互补AAV(也称为dsAAV或scAAV)的使用。

“AAV病毒”或“AAV病毒颗粒”是指由至少一种AAV衣壳蛋白(优选地由野生型AAV的所有衣壳蛋白)和衣壳化多核苷酸组成的病毒颗粒。如果该颗粒包含异源多核苷酸(即，除野生型AAV基因组之外的多核苷酸，如待递送至哺乳动物细胞的转基因)，则其通常称为“rAAV载体颗粒”或简称为“rAAV载体”。

“包装”是指一系列细胞内事件，其导致衣壳蛋白的组装和载体基因组的衣壳化以形成AAV颗粒。

AAV“rep”和“cap”基因分别指编码腺相关病毒的复制和衣壳化蛋白的多核苷酸序列。它们已经在所有检测的AAV血清型中发现，并在下文和本领域中进行描述。AAV rep和cap在本文中称为AAV“包装基因”。

如本文所用，术语“杂合AAV”是指包含一种AAV血清型的衣壳蛋白和来自另一种AAV血清型的基因组材料的AAV。

如本文所用，术语“嵌合AAV”是指包含来源于两种或更多种AAV血清型的基因序列和/或蛋白质序列的AAV，并且可以包括对那两种或更多种AAV血清型的基因序列进行的突变。示例性嵌合AAV可包含嵌合AAV衣壳，例如具有来源于两种或更多种AAV血清型的一个或多个氨基酸区域的衣壳蛋白。

如本文所用，术语“AAV变体”是指与其亲本AAV相比在其基因组或蛋白质中包含一个或多个氨基酸突变的AAV，例如与其亲本AAV相比在其衣壳蛋白中包含一个或多个氨基酸突变。

术语“病毒载体”是指来源于病毒的基因转移载体或基因传递系统。可以使用本领域已知的重组技术构建此类载体。在一些方面，用于衍生此类载体的病毒选自AAV、辅助依赖性腺病毒、杂合腺病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Bar virus)、逆转录病毒、慢病毒、单纯疱疹病毒、仙台病毒(hemaglutinating virus of Japan，HVJ)、莫洛尼鼠白血病病毒(Moloney murine leukemia virus)、痘病毒、和基于HIV的病毒。

如本文所用，术语“AAV病毒粒子”或“AAV颗粒”是指包含衣壳的病毒颗粒，该衣壳包含至少一种AAV衣壳蛋白，其衣壳化如本文所述的AAV载体，其中在一些实施方案中，载体还可以包含异源多核苷酸序列或转基因。

如本文所用，术语“工程化细胞”及其语法等同形式是指在细胞基因组内包含至少一个核酸改变或包含至少一个外源核酸或蛋白质的细胞。改变包括核酸序列内的添加、缺失、和/或取代。因此，工程化细胞包括含有添加、缺失和/或改变的基因的细胞。

在以下小节中更详细地描述本公开的各个方面。

腺相关病毒(Adeno-Associated Virus，AAV)

腺相关病毒(AAV)是非致病性的单链DNA细小病毒。AAV具有约20nm的衣壳直径。单链DNA基因组的每一端含有反向末端重复(ITR)，其是基因组复制和包装所需的唯一顺式作用元件。AAV基因组携带两个病毒基因：rep和cap。该病毒利用两个启动子和选择性剪接来产生复制所需的四种蛋白质(Rep78、Rep 68、Rep 52和Rep 40)。第三启动子通过选择性剪接和交替翻译起始密码子的组合产生三种结构病毒衣壳蛋白1、2和3(VP1、VP2和VP3)的转录物(Berns KI等人，Bioessays.1995；17：237-45)。三种衣壳蛋白共享相同的C末端533个氨基酸，而VP2和VP1分别含有65个和202个氨基酸的其他N末端序列。AAV病毒粒子含有VP1、VP2和VP3的总共60个拷贝，它们在粗提取物中已经观察到为1：l：5(Aucoin MG等人，Biotechnol Adv.2008年；26(1)：73-88)或通过光密度测定法在1：1：8至1：1：20的范围内(Grimm D等人，Gene Ther，1999年；6(7)：1322-1330；Kronenbera S等人，EMBO Rep.2001；2(11)：997-1002)，以T＝1二十面体对称排列(Rose JA等人，J Virol.1971；8：766-70)。AAV需要腺病毒(Adenovirus，Ad)、单纯疱疹病毒(Herpes Simplex Virus，HSV)或其他病毒作为辅助病毒来完成其裂解生命周期(AtchisonRW等人，Science.1965；149：754-6；HogganMD等人，Proc Natl Acad SciUS A.1966；55：1467-74)。此外，在不存在辅助病毒的情况下，野生型(wt)AAV通过ITR与染色体的相互作用，在Rep蛋白的辅助下整合来实现潜伏状态(Berns等人，1995)。

AAV血清型

存在多种不同的AAV血清型，包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、和rh-AAV-10。体内研究已经表明各种AAV血清型显示不同的组织嗜性或细胞嗜性。例如，AAV1和AAV6是对骨骼肌转导有效的两种血清型(Gao GP等人，ProcNatlAcad SciUSA.2002；99：11854-11859；Xiao W等人，J Virol.1999；73：3994-4003；ChaoH等人，Mol Ther.2000；2：619-623)。

由于天然存在的AAV血清型发展成基因治疗载体，许多努力已经集中在理解每种血清型的嗜性，使得可对病毒进行进一步修饰以增强基因转移的效率。一种方法是将结构域从一种血清型衣壳交换到另一种，从而从每个亲本产生具有所需质量的杂合载体。由于病毒衣壳负责细胞受体结合，因此理解对结合至关重要的病毒衣壳结构域是重要的。在晶体结构可用之前对病毒衣壳(主要对AAV2)进行的突变研究主要基于衣壳表面官能化，其通过吸附外源部分、在随机位置插入肽或在氨基酸水平上进行全面诱变(Choi等人，CurrGene Ther.2005年6月；5(3)：299-310)。

在一些方面，本公开提供了一种用于生产具有由多种AAV血清型表达的衣壳蛋白的rAAV颗粒的方法。这通过用rHSV表达病毒和rHSV-rep2capX辅助病毒共感染生产细胞来实现，其中cap基因产物衍生自非AAV2的AAV血清型或除AAV2之外的AAV血清型。重组AAV载体已经通常基于AAV2衣壳。近来已经证明，基于来自AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV8或AAV9血清型的衣壳的rAAV载体在它们的嗜性方面不同于AAV2。

来自其他AAV血清型的衣壳在某些体内应用中提供优于基于AAV2衣壳的rAAV载体的优点。首先，适当使用具有特定血清型的rAAV载体可以提高体内基因传递至某些靶细胞的效率，该靶细胞很难被基于AAV2的载体感染或根本不被其感染。其次，如果rAAV载体的重新施用在临床上变得必要，则使用基于其他AAV血清型的rAAV载体可能是有利的。已经证明，具有相同衣壳的rAAV载体的重新施用可能是无效的，可能是由于针对载体产生的中和抗体的产生。该问题可通过施用rAAV颗粒来避免，该rAAV颗粒的衣壳由来自不同AAV血清型的蛋白质组成，不受针对第一rAAV载体的中和抗体的存在的影响。将认识到，使用本文所述的方法生产rHSV，可以实现类似于rHSV但编码来自其他AAV血清型(例如，AAV1、AAV2、AAV3、AAV5至AAV9)的cap基因的重组HSV载体的构建。在某些方面，使用来自不同AAV的cap基因来构建重组AAV载体。

实施例

实验方法

稳定CHO池的产生

人HVEM和Nectin-1的开放阅读框(ORF)从NCBI数据库(分别为GenBank U70321.1和AF060231.1)下载。使用在线工具(分别为https：//www.idtdna.com/CodonOpt和https：//www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cloning/gene-synthesis/geneart-gene-synthesis/geneoptimizer.html)对HVEM和Nectin-1ORF进行密码子优化以在仓鼠细胞中表达。将编码HVEM或Nectin-1的传递质粒亚克隆到增强的人巨细胞病毒(CMV)启动子和/或合成启动子(Brown等人，2017年)下游的自制质粒中，产生八种不同的构建体。所有构建的质粒在SV40启动子的控制下编码谷胱甘肽合成酶(GS)，从而允许在甲硫氨酸亚砜亚胺中选择被转染的细胞(Bebbington等人，1992.Bio/technology(NaturePublishing Company)，10(2)，169-175)。所有最终质粒通过全质粒测序(Macrogen)进行验证。将专有的自制的悬浮无血清适应性CHO细胞解冻到125mL摇瓶中，并在30mL CD-CHO培养基(Thermo Fisher)中培养，该培养基补充有6mML-谷氨酰胺(Gibco)、硫酸葡聚糖(50mg/mL，Sigma-Adrich)，并在37℃、120rpm搅拌下在6％CO₂加湿培养箱中孵育。每天使用Vi-Cell自动细胞计数器(Beckman Coulter)测量活细胞密度(VCD)和活力。

根据标准自制方案产生稳定的CHO细胞池。简而言之，将八等份的CHO CAT-S细胞(1×10⁷个活细胞/等份)以200×g沉淀5分钟。将细胞沉淀与7μg的每种纯化的线性化自制pCLD质粒混合，然后根据制造商的说明书使用Amaxa细胞系nucleofector试剂盒V(Lonza)进行转染。在转染24小时后，测量细胞活力，并将75μM/mL MSX(Sigma-Aldrich)添加到每个池中用于重组细胞选择。使用FACS染色测试来自回收的细胞池的等分试样(每个池1×10⁶个活细胞)的HVEM和/或Nectin-1受体表达。简而言之，将细胞与150μL的1：200稀释的抗CD270(HVEM)eBioscience PE克隆eBioHVEM-122(Invitrogen)和/或1：200稀释的Nectin-1单克隆抗体克隆R1.302-PE(Invitrogen)在补充有1％牛血清白蛋白(BSA)(Invitrogen)的PBS(Gibco)中，在室温、暗处孵育15分钟。在孵育后，倒出稀释的抗体，然后用Fix和Perm培养基A(Life Technologies)固定细胞，并在室温、暗处孵育15分钟。然后将染色的细胞用PBS洗涤两次，然后重悬于FACS缓冲液(补充有0.1％BSA的PBS)中，用于使用LSR II仪器(BDBiosciences)进行流式细胞术。用FlowJo v10.0软件(Tree Star，Inc)分析流式数据。

在稳定CHO池中的rHSV-1感染

在37℃的加湿5％CO₂培养箱中，在6孔细胞培养板(Corning)中用rHSV-GFP(MOI＝10)感染来自每个回收细胞池和CHO CAT-S宿主细胞的等分试样(1×10⁶个活细胞)1小时以进行病毒吸附。在1小时后，将感染的细胞池以1200rpm离心5分钟，并弃去过量的病毒上清液。将感染的细胞沉淀重悬于CD-CHO培养基中，并在37℃、在与IncuCyte(Sartorius)连接的5％CO₂加湿培养箱中孵育。使用IncuCyte默认设置确定来自感染池的GFP表达的细胞成像，并且每12小时从每个感染细胞池捕获GFP表达，总共五个时间点。

在稳定CHO池中的rAAV9-GFP载体生产

将每个细胞池的等分试样(1×10⁶个活细胞)用来自rHSV-AAV9rep/cap：rHSV-AAV-GFP载体的MOI 1：1感染到6孔培养板(Corning)中。将感染的细胞池在37℃的5％CO₂加湿培养箱中孵育24小时。在24小时后，收集感染的细胞上清液，并使用qPCR测试rAAV9-GFP滴度。简而言之，将收集的上清液用DNase I(200U/μL，Invitrogen)在37℃消化1小时，然后在95℃孵育10分钟以使酶失活。然后将消化的样品与等体积的蛋白酶K消化混合物(200mMNaCl，20mM Tris-HCl，pH 8.0，2mM乙二胺四乙酸，pH 8.0；0.5％十二烷基硫酸钠和蛋白酶K(20mg/mL)在55℃孵育1小时，然后在95℃进行酶灭活10分钟。使用PCR热循环仪(QuantaBioQ，Qiagen)，使用自制标准线性化AAV质粒，在20μL反应物中进行绝对qPCR定量反应，该反应物除了5μL稀释模板之外，还含有TaqMan快速通用PCR 2x主混合物(Applied Biosystems)和20μM的每种CMV-正向引物(5’-TTCCTACTTGGCAGTACATCTACG’-3)、CMV-反向引物(5’-GTCAATGGGGTGGAGACTTGG-’3)和CMV探针(5’-FAM-TGAGTCAAACCGCTATCCACGCCCA-NFQ-‘3)。PCR循环曲线为95℃2分钟和40个循环的95℃5秒以及60℃30秒。

在CHO-HVEM表达克隆中产生和测试rHSV-GFP感染

根据Evans等人，2015年(Biotechnology Progress，31(5)，1172-1178)，使用BDInflux细胞分选仪(BD Biosciences)进行单细胞沉积克隆。简而言之，将含有3×10⁶个活的HVEM CHO表达细胞的等分试样用1：200PBS稀释的抗人CD270(HVEM)-PE(Invitrogen)抗体在室温、暗处染色15分钟。将染色的细胞用无菌PBS洗涤两次，以200×g沉淀5分钟，然后重悬于lmL分选缓冲液中。将细胞从PE门控级分分选到两个384孔板(Agilent)中，该板含有补充有50μMMSX/mL的自制条件培养基。进一步测试所选的回收克隆的rHSV-GFP感染，并如前文所述使用IncuCyte从两个时间点(24和48)hpi计算平均GFP表达。

在最终CHO-HVEM克隆中生产rAAV6.2-GFP载体

还使用1：1的MOI对rHSV-AAV6.2rep/cap：rHSV-GFP进一步测试所选克隆的rAAV6.2-GFP载体生产。将所有感染的克隆在37℃的5％CO₂加湿培养箱中以120rpm搅拌孵育三天。在共感染后24小时和48小时从每个共感染的克隆收获等分试样(1mL)，并以200×g离心5分钟。然后使用qPCR制备收获的样品(细胞沉淀)，用于rAAV滴定。简而言之，收集感染的细胞沉淀，与AAV裂解缓冲液(50mM Tris，pH 8.0，150mM NaCl)混合，并在异丙醇干冰浴中进行三个冻/融循环，然后在4℃以12000rpm离心30分钟。在离心后，收集上清液，并如前所述使用qPCR测定rAAV6.2-GFP滴度。在随后的实验中，使用不同的MOI和孵育温度进一步测试最终选择的克隆中的两个的rAAV6.2-GFP载体生产。如前文所述，在共感染后24小时从收获的细胞沉淀测定rAAV6.2-GFP滴度，并使用qPCR进行滴定。完成在最终选择的CHO克隆中生产的rAAV的纯化，根据(Negrini等人，CurT Protoc Neurosci.2020年9月；93(1)：e103)。使用根据Negrini等人的聚乙二醇(PEG)氯仿方法纯化在最终选择的CHO克隆中生产的rAAV，其中进行了一些修改(Negrini等人，2020年)，包括使用0.5％Triton X-100(v/v)进行细胞裂解和rHSV-1灭活，然后使用8％聚乙二醇8000和150mM NaC1进行沉淀。病毒沉淀物进一步用Benzonase(Sigma；50U/mL)和RNA酶(Invitrogen；10μg/mL)在37℃处理1小时，然后用1：1氯仿(Sigma)处理。收集氯仿处理后的水层，并使用AMICON过滤器(Sigma)浓缩。将浓缩的病毒储存在-80℃直至使用。

CHO来源的rAAV的分析表征

使用Westem印迹法测试纯化的rAAV的衣壳蛋白表达。简而言之，通过添加适当体积的4×NuPAGE十二烷基硫酸锂(LDS)样品缓冲液(Life Technologies)和10×NuPAGE样品还原剂(Thermo Fisher)，制备使用不同MOI的rHSV-1载体在最终选择的克隆中生产的纯化rAAV6.2-GFP和rAAV9-GFP载体用于SDS-PAGE凝胶。然后将样品在70℃孵育10分钟。对于每种血清型，将等体积的rAAV加载到Bolt 4-12％Bis-Tris plus 12孔凝胶(Invitrogen)上，并使用1×NuPAGE运行缓冲液(Thermo Fisher)运行。在运行后，使用iBolt 2NC ministack(Invitrogen)对凝胶进行干式转移，然后在室温条件下、在用TBS(Bio-Rad)稀释的5％脱脂乳(Amresco)中封闭1小时。在封闭后，将膜与1：200AAVVP1、VP2、VP35％脱脂乳稀释的抗体(Genentech，USA)在4℃温和振荡孵育过夜。在孵育后，将印迹膜用补充有0.1％吐温的TBS(Life Technologies)洗涤三次，然后与1：100山羊抗小鼠IgG(Thermo Scientific)一起孵育1小时，然后洗涤。将膜与Supersignal West Pico Plus底物(Thermo Scientific)一起孵育，然后使用Amersham Imager 680(GE Healthcare)进行图像检测。在随后的实验中，来自最终选择的CHO克隆的纯化rAAV使用微型透射电子显微镜(Mini-TEM；Vironova)进行可视化。简而言之，通过首先倒置网格并将其放置在沉积在石蜡膜上的10μL rAAV液滴的顶部上方30秒，将PEG-氯仿纯化的rAAV6.2-GFP和rAAV9-GFP样品放置在400目辉光放电碳网格上。通过轻柔地使网格边缘接触Whatman滤纸来吸去过量的样品。然后用两个20μL液滴的双蒸水洗涤网格两次。然后将含有样品的网格用20μL 1.5％乙酸双氧铀液滴染色10秒。通过轻柔地使网格边缘接触Whatman滤纸来吸去过量的染色剂。然后使用Mini-TEM仪器使rAAV样品可视化。在另一个单独的实验中，使用自己开发的毛细管电泳十二烷基硫酸钠(CE-SDS)方法进行rAAV衣壳蛋白(VP1：VP2：VP3)比率分析，根据Kurasawa等人，(Mol TherMethods Clin Dev.2020年10月4日；19：330-340)。

来自纯化的CHO来源的rAAV的感染性rHSV-1残留

将表达rHSV-1ICP27蛋白的稳定拷贝的V27细胞以0.5×10⁶个活细胞/孔接种在6孔培养板中，在补充有10％FBS(Gibco)和500μg/mL遗传霉素(Gibco)的DMEM中过夜。在16小时后，将细胞用无菌PBS洗涤两次，然后用纯化的rAAV6.2-GFP和rAAV9-GFP载体以1：100的稀释度(～10¹⁰vg/mL)感染。rHSV-AAV-GFP载体用作阳性对照(MOI＝0.15PFU/细胞)。将感染的细胞在37℃孵育2小时以进行病毒吸附。在孵育后，除去过量的病毒并添加感染培养基(补充有2％FBS的DMEM)，将板与IncuCyte一起孵育并监测4天以捕获任何细胞病变效应。

CHO来源的rAAV的感染性和体外转导

对于感染性，将Ad293细胞接种在96孔培养板中(2×104个细胞/孔)，并在37℃的加湿5％CO₂培养箱中孵育过夜。进行在CHO克隆中生产并用PEG-氯仿纯化和/或使用三重转染在HEK293细胞中生产(Kimura等人，Sci Rep 9，13601，2019年)并用亲和色谱法纯化的rAAV6.2-GFP、rAAV9-GFP和/或rAAV9-ZsGreen的十倍稀释。每种病毒稀释液用于感染四个孔，并且将感染的细胞在37℃、5％CO₂培养箱中孵育5天。在感染后第5天，使用IncuCyte默认设置对感染的细胞进行GFP/Zs-Green表达成像，并使用Reed和Muench方法计算病毒滴度(Reed和Muench，American Joumal of Epidemiology；27；3；493-497，1938。对于转导分析，如上所述培养Ad293细胞，然后用来自CHO来源的rAAV和/或使用如上所述的三重转染在HEK293细胞中生产的类似载体的不同转导复数(MOT)进行感染。

CHO来源的rAAV的生物分布

所有动物实验均由AstraZeneca的机构动物管理及使用委员会(InstitutionalAnimal Care and Use Committee)(Gaithersburg，MD.USA)批准。八周龄雄性C57bl/6小鼠购自Jackson Laboratory(Bar Harbor，ME)。将小鼠分成五组(每组n＝5)，并使用胰岛素BD注射器(Becton Dickinson)通过尾静脉向所有小鼠接种1×10¹¹vg/100μL的适当rAAV载体(或盐水)。每天监测接种小鼠的任何疾病临床症状。在注射后三周，通过CO₂对小鼠实施安乐死，并收获器官。将收获组织的一半切片在微量离心管中的干冰中冷冻，用于qPCR分析，并且将另一半固定在10％中性缓冲福尔马林中，用于组织学工作。使用All-Prep DNA/RNAMini试剂盒(Qiagen)，根据制造商的说明书从收获的组织中提取DNA。使用自制线性化质粒，在QuantStudio 7Flex上进行qPCR反应：对于组1、组2和组3使用pAAV-GFP，对于组4使用pAAV-ZsGreen。以提取的基因组DNA(100ng)为模版，使用特异性GFP引物和探针(正向5’-GAACCGCATCGAGCTGAA-‘3、反向5’-TGCTTGTCGGCCATGATATAG-‘3和探针5’/56-FAM/ATCGACTTC/ZEN/AAGGAGGACGGCAAC/3IABkFQ‘3和ZsGreen引物及探针正向5’-GTACCACGAGTCCAAGTTCTAC-‘3、反向5’-CACGTCGCCCTTCAAGAT-‘3和探针5’/56-FAM/CCCGTGATG/ZEN/AAGAAGATGACCGACAA/3IABkFQ/‘3)。循环条件是95℃3秒的初始变性，95℃10秒的40个循环，60℃20秒的退火/延伸。对于组织学，使用Leica 3050s切片机(德国)制备来自收集组织的薄肝组织切片、染色、封片，并使用共聚焦显微镜评估GFP检测。使用axioscanner完成来自肝载玻片的GFP定量。

工程化rHSV-1载体生产细胞池

选择两个专有的悬浮细胞系；基于CHO-K1和BHK-21的，用于工程化工作。对于悬浮的CHO细胞，使用两种策略：(1)随机整合，其中HSV-l ICP27ORF(GenBank AB235845.1)序列通过IDT针对仓鼠细胞表达进行密码子优化、化学合成、然后在CMV启动子的下游亚克隆到编码嘌呤霉素盒的自制质粒中用于选择。对于位点整合，选择来自CHO基因组(GenBank XM027430029)的C12Orf35基因座的外显子1作为转录热点之一(Zhao等人，Appl MicrobiolBiotechnol.2018年7月；102(14)：6105-6117)。根据(Ronda等人，2014年)，使用具有默认参数的CRISPy生物信息学工具来选择sgRNA靶序列。根据制造商的说明书，使用GeneArtCRISPR CD4试剂盒(Invitrogen)，通过IDT合成所选gRNA靶(5’GGACTTAACCACTCGATGGC-‘3)并作为gblocks传递、退火、并亚克隆到线性化的CRISPR核酸酶表达载体(GeneArt CRISPRCD4)骨架中，以产生sgRNA表达载体。使用自制质粒的骨架构建供体DNA质粒，避免与gRNA靶相同的任何前间区序列邻近基序(PAM)位点。化学合成(IDT)侧接sgRNA靶序列的5′和3′同源臂(每个臂750个碱基对)，其间含有110个核苷酸作为基因接头，含有不同的限制性位点用于克隆。最终的AAV CHO克隆的转染依照如前文所述的过程。使用5μg嘌呤霉素/mL选择经转染的细胞池，持续两周。基于前文描述的方法(Evans等人，2015年)，使用抗HU CD270(HVEM)eBioscience PE克隆eBioHVEM-122，在384孔板中使用BDInflux细胞分选仪(BDBiosciences)经由单细胞沉积产生克隆。(2)对于BHK-21悬浮细胞，适当地将自制无血清悬浮适应性BHK-21细胞维持在Xell HEK TF培养基(XellAG，德国)中。将细胞以(0.3×106个细胞/ml)的密度接种在125ml摇瓶中的30ml培养基中(Nunc，Denmark)，并在振荡培养器中在120rpm搅拌、5％CO₂条件下孵育三天。下载来自HSV-1基因组(GenBank KM222723.1)的ICP27(ORF)并使用在线IDT工具(https：//www.idtdna.com/CodonOpt)进行密码子优化、合成并以商业质粒传递。将密码子优化的ICP27基因亚克隆到CMV启动子或内源ICP27启动子下游的自制质粒中，使用限制性酶克隆分别产生pCLD-CMV-ICP27和pCLD-EN-ICP27。上文构建的pCLD质粒含有用于选择的嘌呤霉素盒。另一种形式的ICP27(未经密码子优化的)ORF由GeneArt(Thermo Fisher，USA)合成，使用BamHI-NotI限制性克隆亚克隆到CMV启动子下游的商业表达质粒中，产生第三质粒(称为pCDNA-ICP27)。pCDNA-ICP27含有用于选择的新霉素盒。在感受态DH5α中扩增三种质粒，并使用maxiprep(Qiagen，USA)进行纯化。通过sanger测序(Macrogen，USA)确认最终质粒。根据制造商的说明书，使用Amaxa核转染试剂盒L(Lonza，USA)，在nucleofector II中用线性化质粒(各2.5μg)转染BHK-21细胞的等分试样(每个等分试样7x106个细胞)。在转染后四十八小时，将转染的细胞置于400μg/ml遗传霉素(Gibco，USA)和/或10μg嘌呤霉素(Gibco，USA)选择条件下三周。

在所选的CHO-ICP27克隆中的rHSV-1感染

测试最终选择的克隆的rHSV-1感染。简而言之，使用(MOI＝10)在无抗生素的DMEM中用rHSV-AAV9感染等分试样(1×10⁶个活细胞)，然后在冰上孵育20分钟，然后在37℃孵育2小时。在孵育后，滗析过量的病毒，并用无菌PBS洗涤感染的细胞两次以去除任何残留的rHSV-AAV9载体。在洗涤后，将感染的细胞在6孔板中用自制培养基(2mL/孔)覆盖，并在37℃的5％CO₂加湿培养箱中孵育24小时。在24小时后，收集1mL来自感染细胞的上清液并接种在V27细胞上以测定细胞病变效应。通过超速离心纯化从接种的V27细胞中收获的病毒，并使用抗HSV-1糖蛋白D抗体(EMD Millipore Corp)进行Western印迹检测。在单独的实验中，使用上述相同的方法，用rHSV-AAV9的不同MOI感染最终的CHO克隆和/或V27细胞。然后将感染的细胞在含有自制培养基(用于CHO)或用于V27的DMEM-2％FBS的6孔板中，在33℃的5％CO₂加湿培养箱中孵育两天。收获来自裂解培养物的澄清病毒，并通过空斑测定在V27细胞上进行滴定(Kang等人，2009.Gene Therapy 16，229-239)。

在BHK-21-ICP27池中生产rHSV-1

测试回收的BHK--ICP27池的rHSV-1产量。简而言之，通过在补充有4％FBS的XellHEK TF培养基中或在无血清条件下直接接种，用rHSV-AAV6.2载体(MOI＝0.15PFU)感染细胞。将感染的细胞在37℃、120rpm、5％CO₂加湿培养箱中孵育3至4天。感染后每天使用Vi-Cell测量细胞活力和密度。在3-4天后，将感染的培养物在异丙醇干冰浴中进行三个冻融循环，然后在4℃以4500rpm离心15分钟。在离心后，使用JA 20转子，在4℃以10，000rpm对上清液超速离心75分钟。根据(Kang等人，2009年)，使用空斑测定在V27细胞上滴定重悬浮的病毒。

统计分析

使用具有Tukey-Kramer事后的单因素方差分析(One-wayANOVA)来比较CHO细胞池中rHSV-1感染后的GFP表达，并比较从不同细胞池产生的rAAV9-GFP滴度。使用双因素方差分析(Two-Way ANOVA)来比较在两个不同时间点从不同克隆产生的rAAV6.2-GFP滴度。使用双尾曼-惠特尼(Mann-Whitney)检验比较在CHO中产生的rAAV6.2-GFP和rAAV9-GFP或通过三重瞬时转染产生的rAAV6.2-GFP和rAAV9-ZsGreen的感染性滴度。使用克-瓦(Kruskal-Wallis)检验和用于校正的邓氏(Dunn)检验比较收获的小鼠组织中的rAAV6.2-GFP、rAAV9-GFP和/或rAAV9-ZsGreen滴度。GraphPad Prism 9.1.2版(GraphPad Software Inc)用于所有测试，并且认为p值≤0.05是显著差异。

结果

稳定CHO池的产生

成功构建了使用自制质粒骨架的八种不同载体：(1)编码侧接CMV启动子和SV40聚腺苷酸的经密码子优化的或未经密码子优化的HVEM ORF的两种载体；(2)编码侧接CMV启动子和BGH聚腺苷酸的经密码子优化的或未经密码子优化的Nectin-1ORF的两种载体；(3)编码分别侧接CMV启动子和SV40聚腺苷酸的经密码子优化的或未经密码子优化的HVEM和Nectin-1ORF的两种载体；以及(4)编码分别侧接合成启动子(Spro)、SV40聚腺苷酸和BGH聚腺苷酸的经密码子优化的或未经密码子优化的HVEM和Nectin-1ORF的两种载体(图1a和图b)。在MSX选择十天后，使用FACS染色测试每个回收的稳定细胞池的等分试样(1×106个活细胞/池)的HVEM和/或Nectin-1受体表达。池1(CMV-HVEM)、池2(CMV-HVEM-Co)、池5(CMV-HVEM-Nectin-1)、池6(CMV-HVEM-Co-Nectin-1-Co)、池7(Spro-HVEM-Nectin-1)和池8(Spro-HVEM-Co-Nectin-l-Co)分别显示出32.35％、65％、60.9％、51％、60％、53.8％的HVEM表达细胞(图1c)，而池3(CMV-Nectin-1)、池4(CMV-Nectin-1-Co)、池5(CMV-HVEM-Nectin-1)、池6(CMV-HVEM-Co-Nectin-1-Co)、池7(Spro-HVEM-Nectin-1)和池8(Spro-HVEM-Co-Nectin-1-Co)分别显示出69.75％、53.45％、61.3％、49.3％、63.7％和53.8％的Nectin-1表达细胞(图1d)。有趣的是，双池(如池5、池6、池7和池8)显示出HVEM和Nectin-1的良好表达，表明CMV和合成启动子在驱动HVEM和Nectin-1蛋白的高水平表达方面是相当的。此外，使用未经密码子优化的和/或经密码子优化的蛋白形式，未观察到HVEM和Nectin-1受体表达的显著差异。

在稳定CHO池中的rHSV-1感染和rAAV9-GFP生产

由于这些受体在这些CHO池中稳定表达，因此了解哪种构建体提供最佳的rHSV-1感染以及与rHSV-1载体共感染后的后续rAAV表达是至关重要的。用rHSV-GFP以MOI＝10感染上文产生的每个稳定池，其中感染的宿主CHO细胞作为阴性对照。在感染后每12小时至总计60小时从所有感染的稳定细胞池(n＝8)收集GFP表达数据。与显示最低GFP表达的感染的宿主CHO细胞相比，所有八个感染的细胞池在感染后12小时(hpi)开始显示显著的平均GFP表达(图2a)。在12hpi时，仅在HVEM表达池中观察到最高水平的GFP表达，其中池1和池2显示出最高的GFP表达(与感染的宿主CHO细胞相比，p值＜0.0001)，随后是池4和池3(与感染的宿主CHO细胞相比，经密码子优化的p值＜0.01)。此外，稳定的细胞池1和池2显示出最高的总体GFP表达，其中池1在总体平均GFP表达方面优于池2。

在共感染后一天，收集细胞上清液，并使用qPCR滴定rAAV9-GFP载体。与其他池号相比，池1显示出最高的rAAV9-GFP物理滴度，平均为8.2log1₀vg/mL；池2、池3、池4、池5、池6、池7和池8分别显示出平均7.97、7.76、7.99、8.07、7.68、7.71和7.99log₁₀vg/mL。然而，与其他池中产生的滴度相比，池1中产生的rAAV9-GFP载体的qPCR滴度的差异是不显著的。与从感染的宿主CHO细胞获得的rAAV9-GFP滴度(6.84log₁₀vg/mL)相比，从所有池产生的rAAV9-GFP滴度是显著的，其中p<0.0001(图2b)。这些数据表明，池1显示出rHSV-GFP载体感染后最高的平均GFP表达和最高的rAAV9-GFP滴度，因此选择该池用于单细胞克隆。

产生和测试CHO-HVEM表达克隆的rHSV-GFP感染

选择单个高和中HVEM表达的CHO克隆(图3)，并使用自制条件培养基将其沉积到两个384孔板中两周。通过使用Cellavista成像来验证单细胞/孔的沉积(Evans等人，2015年)。在两周后回收了六十四个克隆，它们显示出高活力(90-95％)和良好的生长曲线。将所选的克隆在含有补充有MSX的自制培养基的96深孔板中进一步传代三次。在三次传代后，通过FACS染色，最初64个克隆中的二十四个显示出良好的HVEM表达(图4a)。扩增这些克隆并进一步测试rHSV1-GFP载体感染。从两个时间点(24和48)hpi计算平均GFP表达。在测试的克隆中没有检测到平均GPF表达水平的统计学显著差异(图4b)。

CHO-HVEM表达克隆中的rAAV生产

选择在rHSV-GFP载体感染后显示最高平均GFP表达的八个克隆(称为CHO-HV-C1、CHO-HV-C13、CHO-HV-C15、CHO-HV-C23、CHO-HV-C24、C CHO-HV-C46、CHO-HV-C62和CHO-HV-C64)以评估它们通过与两种rHSV-1载体共感染生产rAAV的能力，一种载体含有AAV2rep和AAV6.2cap基因，而另一种载体含有GFP基因，MOI为1：1。在感染后，八个克隆的活力在数天内迅速下降，与之相比，当在37℃孵育时，在共感染过程中受感染的宿主CHO细胞仅略微下降(3-7％)(图5a)。因此，与感染的宿主CHO细胞的略微下降(0.3×10⁶/mL)相比，所有共感染克隆的活细胞密度(VCD)也显示出显著下降(图5b)。如与宿主CHO细胞相比以及如细胞活力和VCD的急剧下降所示，似乎AAV rep蛋白对感染的工程化CHO细胞的代谢产生有害影响，其中当在37℃孵育共感染的细胞时，rHSV-1载体在细胞侵入后经历降解。因此，设想通过降低孵育温度来最小化这种有害影响。

有趣的是，克隆#1(称为CHO-HV-C1)产生每1mL细胞裂解物最高的rAAV6.2-GFP载体滴度(～8.83log₁₀vg/mL；1×10⁶个细胞)，时间为24hpi，与之相比，其他克隆产生7.74至8.34log₁₀vg/mL。然而，在CHO-HV-C1克隆中产生的rAAV6.2-GFP滴度与由其他测试克隆产生的那些滴度的差异不显著(p＝0.89)。然而，它们都显著高于24hpi产生6.241og₁₀vg/mL的共感染的宿主CHO细胞。(图5c)。来自所有八个共感染克隆的rAAV6.2-GFP滴度在48hpi时略微下降(图5c)。

克隆CHO-HV-C1和CHO-HV-C62产生rAAV6.2-GFP载体的最高滴度。克隆CHO-HV-C1是高HVEM表达克隆，而CHO-HV-C62克隆是中HVEM表达克隆。在随后的实验中，分别使用rHSV-AAV6.2和rHSV-GFP的2：1、3：1和4：1的MOI，测试最终选择的克隆(CHO-HV-C1和CHO-HV-C62)的rAAV6.2-GFP载体生产。

有趣的是，与使用MOI 1：1获得的滴度相比，MOI 2：1和3：1在24hpi时每10⁶个细胞裂解物的rAAV6.2-GFP滴度没有显示出显著改善(数据未显示)。另一方面，MOI 4：1显著改善了CHO-HV-C1和CHO-HV-C62克隆中产生的rAAV6.2-GFP物理滴度(p＝0.0211)。此外，CHO-HV-C1克隆在MOI 4：1下生产rAAV6.2-GFP载体方面优于CHO-HV-C62，并且在24hpi时每10⁶个细胞裂解物分别产生9.89和9.37log₁₀vg/mL(p＝0.0261)(图5d)，表明rHSV-1的MOI对CHO细胞中的rAAV6.2-GFP具有重大影响。

由于CHO-HV-C1是用于rAAV6.2-GFP生产的最具生产性的克隆，因此进一步测试了其生产表达GFP转基因的其他AAV血清型8和9的能力。使用与先前实验所述相同的最佳感染参数，在24hpi分别产生rAAV8-GFP和rAAV9-GFP载体的每1×10⁶个细胞9.21和9.4log₁₀vg/mL的平均滴度。在30hpi时的收获显示rAAV8-GFP和rAAV9-GFP载体的滴度分别降低至8.36和8.98log1₀vg/mL(图5e)。这些数据表明上述感染参数跨测试的血清型起作用。另外，与在30hpi和48hpi时的滴度相比，细胞裂解物在24hpi时产生最高的AAV测试血清型的物理滴度。

用于生产rAAV8-GFP和/或rAAV9-GFP载体的共感染的CHO-HV-C1细胞的细胞活力在24hpi时急剧下降，类似于rAAV6.2-GFP载体生产的情况，这表明细胞活力下降不是AAV血清型特异性的。在rHSV-1载体共感染后细胞活力的急剧下降可能影响最终的rAAV滴度，因此测试了从37℃至33℃的温度变化的影响，其显示了共感染后细胞活力和rAAV6.2-GFP滴度的显著改善(图6)。因此，测试了在33℃用MOI 4：1(rHSV-1AAV6.2：rHSV-1-GFP)的共感染。与在37℃孵育的培养物相比，在24hpi时共感染的培养物的细胞活力仅略微下降(5-7％)，裂解物的rAAV6.2-GFP滴度略微改善，并且培养基中的滴度增加约两倍(数据未显示)。此发现表明，在共感染后的孵育温度是CHO平台中细胞活力和/或rAAV产生的必需因素。

CHO来源的rAAV的分析表征

收获和纯化rAAV载体的整个过程需要一天以执行自己开发的PEG-氯仿方法(图7)。简而言之，在温和振荡条件下用0.5％Triton X-100(v/v)裂解全部感染的培养物1小时至3小时。然后将用Triton处理的培养物以1200rpm离心5分钟，随后使用PES过滤器对上清液进行0.2μm过滤。将滤液与1/4体积的40％PEG8000/5M NaCl在冰上混合1小时，然后在4℃以4500rpm离心40分钟。将PEG病毒沉淀物重悬于重悬浮缓冲液中，并在37℃用Benzonase(50U/ml)、RNase A(20μg/ml)处理1小时，每15分钟进行管混合。在Benzonase处理之后，将混合物与氯仿以1：1的比例混合，并在12000rpm下离心5分钟。在离心后，在生物安全柜下蒸发氯仿，收集含水层，然后浓缩。将最终纯化的rAAV储存在-80℃。

使用HSV-1的不同MOI在CHO-HV-C1克隆中产生的等体积纯化rAAV的蛋白质印迹显示VP1、VP2和VP3衣壳蛋白的相当的表达(图8a)。此外，使用mini-TEM对纯化的rAAV6.2-GFP和rAAV9-GFP载体进行的检查分别显示rAAV6.2-GFP和rAAV9-GFP的91％和79.5％的完整衣壳(图8b和图8c)。另外，这些rAAV的VP1：VP2：VP3摩尔比的分析与文献中报道的那些一致(图8d)。这些数据显示，在CHO细胞中产生的rAAV载体具有衣壳蛋白的良好表达，具有高百分比的AAV完整衣壳。然而，获得的高百分比的完整衣壳可能与所用的纯化方法有关，因此在使用其他纯化方法(例如色谱法)后，重新调查完整衣壳百分比是值得的。

来自CHO来源的rAAV的残留感染性HSV-1

用rHSV-GFP载体(MOI0.15PFU/细胞)作为阳性对照，通过将10log₁₀vg/mL的每种载体接种在HSV-1互补细胞系(V27)上，检查纯化的rAAV6.2-GFP和rAAV9-GFP载体在纯化的药物物质中的任何残留的感染性HSV-1载体。在感染后第4天，在用纯化的rAAV6.2一GFP或rAAV9-GFP载体接种的孔中没有出现细胞病变效应，而在感染后第2天开始，在接种rHSV-GFP载体的孔中出现了典型的细胞病变效应，其形式为感染的细胞变圆和细胞膜片脱离，导致在感染后第3天细胞膜片完全脱离(图9)。这些数据表明，自己开发的纯化方法在灭活rHSV-1载体方面是高效的，并且在纯化的rAAV中没有检测到残留的感染性rHSV-1。

CHO来源的rAAV的感染性和体外转导

测试在CHO细胞中产生并使用PEG-氯仿纯化的rAAV的感染性和体外转导效力，从而将它们与使用标准三重瞬时转染方法产生并用亲和色谱法纯化的rAAV的感染性和体外转导效力进行比较。对于感染性，使用IncuCyte默认设置在感染后第5天记录来自感染孔的GFP表达。在CHO-HV-C1克隆中产生的rAAV6.2-GFP载体(称为rAAV6.2-CHO)和在HEK293细胞中产生的rAAV6.2-GFP(称为rAAV6.2-GFP TTT)分别显示出与1.65×10⁷和1.1×10⁷的组织培养感染剂量50(TCID₅₀/mL)相当的感染性滴度(图10a)。另一方面，在CHO-HV-C1克隆中产生的rAAV9-GFP载体(称为rAAV9-GFPCHO)显示6×10⁶TCID₅₀/mL，相比之下，使用三重瞬时转染在HEK293细胞中产生的rAAV9-ZsGreen载体(称为rAAV9-Zs-Green-TTT)显示6×10⁵TCID₅₀/mL(图10b)。

在Ad293细胞中测试来自上述四种载体制剂的不同的转染复数(MOT)，范围从2×10⁵低至1×10³vg/细胞，用于比较转导，并且使用IncuCyte默认设置在感染后第3天记录平均GFP表达。rAAV6.2-GFP-CHO和rAAV6.2-GFP-TTT在所有测试的MOT下均显示出有效的转导。另一方面，与rAAV9-ZsGreen-TTT相比，rAAV9-GFP-CHO显示出更高的转导效力(图10c)，与观察到的感染性数据一致。这些数据表明rAAV6.2-GFP-CHO和rAAV9-GFP-CHO具有良好的体外感染性和转导活性。另外，与本文观察到的rAAV9-Zs-Green-TTT相比，rAAV9-GFP-CHO的更高感染性和转导可能与用于不同样品制剂中的每一种的完整衣壳、纯化方法和制剂缓冲液的百分比差异有关。

CHO来源的AAV的生物分布

评估与rAAV6.2-GFP-TTT和rAAV9-Zs-Green-TTT平行的rAAV6.2-GFP-CHO和rAAV9-GFP-CHO的生物分布，以确定体内行为是否模拟体外数据。将二十五只三周龄小鼠分成五组(每组n＝5)。用rAAV6.2-GFP-CHO(G1)、rAAV9-GFP-CHO(G2)、rAAV6.2-GFP-TTT(G3)、rAAV9-Zs-Green-TTT(G4)或PBS(G5)接种小鼠。根据它们的分组，使所有小鼠在尾静脉中静脉内接种10¹¹vg rAAV或100μL PBS。在接种后三周，将接种的小鼠安乐死，并从每只接种过的动物中收获对这些组织具有高嗜性的组织(心脏、肝脏、肺、肾脏和骨骼肌)(图11a)。使用qPCR(靶向GFP和/或Zs-Green基因)评估这些组织的均质化组织中的rAAV滴度，并使用共聚焦显微镜进行组织病理学检查。对于qPCR，在除肾脏之外的所有收获组织中，来自G1的小鼠显示比来自G3的小鼠更低的GFP拷贝数，其中来自G1的小鼠显示出与～3.89×10⁴AAV基因组/mg DNA相比更高的平均GFP拷贝数/mg～5.38×10⁴AAV基因组/mg DNA(图11b)，尽管这些差异不是统计学显著的。另外，与来自两组的其他组织的滴度相比，来自G1和G3的肝脏的rAAV6.2-GFP拷贝数在所有接种的小鼠中显示最高的GFP拷贝。有趣的是，G2中的小鼠在心脏、肺、肾脏和骨骼肌中显示出比G4中的小鼠更高的平均GFP拷贝数/mg DNA。然而，来自G4的肝显示比来自G2的肝更高的平均GFP拷贝数/mg DNA，并且平均滴度分别为3.79×10⁶和2.11×10⁶vg/mg DNA。此外，与来自其他组织的滴度相比，来自G2和/或G4的肝脏的GFP滴度在来自两组的所有接种小鼠中显示出最高的GFP拷贝(图11c)。

制备来自五组的薄肝组织切片，并使用共聚焦显微镜检查GFP表达。如从qPCR数据所预期的，在除G5之外的所有接种组的肝脏中观察到清晰的GFP和/或Zs-Green信号(图11d)。另外，使用具有自己开发的脚本的载玻片扫描仪对来自肝载玻片的GFP和Zs-Green的定量显示与来自G1的肝切片相比，来自G3的肝切片显示出显著的生物分布，这与qPCR数据相关。另外，来自G4的肝切片也显示比来自G2的GFP信号更高的Zs-Green信号；然而，差异不是显著的。从接种无菌PBS的模拟感染组(G5)中未检测到GFP信号。这些数据表明，在CHO细胞中产生的rAAV在尾静脉注射后显示出良好的体内转导。另外，在肝切片中较低的GFP，特别是来自G1的GFP，可能与几个因素有关，例如存在不能用PEG-氯仿方法完全消除的杂质。

工程化CHO-HV-C1细胞用于rHSV-1生产

对于随机整合，自己构建的线性化质粒含有CMV启动子下游和SV40聚腺苷酸上游的合成中国仓鼠密码子优化的HSV-1ICP27ORF，以及CMV启动子和BGH聚腺苷酸下游的嘌呤霉素ORF，用于转染(图12a)。

对于位点整合，构建两个质粒，第一个质粒包含CMV启动子下游和SV40聚腺苷酸上游的经密码子优化的ICP27ORF，随后是侧接SV40启动子和SV40聚腺苷酸的嘌呤霉素盒。两个盒的总长度为4.1kb，侧接右同源臂和左同源臂(各750bp)(图12b)。第二个质粒含有CHO外显子1C12orf35的合成sgRNA。在使用5μg/mL嘌呤霉素和50μM MSX/mL双重选择3周后，回收来自随机整合和/或位点整合的池。在自制培养基中进行三次传代和双重选择后，选择了二十四个克隆，包括七个位点编辑的克隆(克隆1-7)和17个显示出高生长活力和ICP27表达的随机整合克隆(图12c)。选择显示最高生长曲线和ICP27表达的随机整合克隆#11(称为CHO-HV-ICP27-C11)，用于针对rHSV-l载体生产的进一步测试。

在CHO-HV-ICP27-C11细胞中的rHSV-1载体感染和生产

用rHSV-AAV9(MOI＝10)感染CHO-HV-ICP27-C11克隆，并在37℃孵育2小时以进行病毒吸附。在2小时后，用无菌1×PBS洗涤感染的细胞两次以除去任何病毒残留。然后将感染的细胞在37℃的5％CO₂静态加湿培养箱中孵育24小时。在第二天，将1mL来自感染细胞的澄清上清液在V27细胞上传代。在感染后两天出现细胞变圆和感染细胞膜片脱离的外观。另外，在用CHO-HV-ICP27-C11克隆中繁殖的rHSV-1病毒感染后，在V27细胞裂解物中观察到HSV-1糖蛋白D(gD)的表达(数据未显示)。此结果表明CHO-HV-ICP27-C11克隆支持rHSV-1载体的生产性感染。

因此，比较了V27细胞的CHO-HV-ICP27-C11克隆的生产能力。分别使用无血清自制培养基或补充有2％(v/v)FBS的DMEM，使用不同MOI(0.2、0.5和1PFU/细胞)的rHSV-AAV9感染CHO-HV-ICP27-C11或V27细胞。将感染的细胞培养物在加湿培养箱中在33℃、5％CO₂条件下孵育4-5天。通过三次冻融循环从感染的细胞培养物中释放rHSV-AAV9，并通过对V27细胞的空斑测定进行滴定。在感染后第2天，在0.2、0.5和l PFU/细胞的MOI下，CHO-HV-ICP27-C11细胞生产的rHSV-AAV9滴度显著低于V27细胞，其中CHO-HV-ICP27-C11克隆生产5×10³、4×10⁴、和3.2×10⁵PFU/mL，与之相比，V27细胞分别生产1×10⁶、6.75×10⁶和2×10⁶PFU/mL(图13)。

在BHK-21-ICP27池中生产HSV-AAV6.2载体

扩增并储存三个回收的BHK21-ICP27池(图14)。在4％FBS存在下或在无血清条件下，测试在30ml摇瓶中的池的等分试样(1×106个活细胞/mL)的HSV-AAV6.2载体生产。对于分别补充有4％FBS和0％FBS的培养物，感染的培养物的活力百分比在感染后第1天从87％分别略微下降至85.5％和84.4％。在感染后第2天，对于补充有4％FBS和0％FBS的培养物，细胞活力分别下降至71.6％和65.1％。在感染后第3天，对于补充有4％FBS和0％FBS的培养物，细胞活力分别显著下降至45.1％和44％。此外，对于两种感染的培养物，在感染后活细胞密度每天平均下降1×10⁵个细胞/ml(数据未显示)。

使用空斑测定在V27细胞上滴定收获的病毒。补充有4％FBS的感染的BHK-21-CMV-ICP27池生产3.5×10⁶PFU/ml，相比之下，无血清感染的BHK-21-CMV-ICP27池生产1.2×10⁶PFU/ml(图15)。

成功地工程化了表达rHSV-1侵入和感染必需的HVEM和/或Nectin-1的悬浮无血清适应性CHO细胞池。与野生型CHO细胞相比，所有工程化稳定CHO池均显示出对rHSV-1-GFP载体侵入和感染的显著易感性，如GFP表达所证明的。与野生型感染的CHO细胞相比，对于rHSV-GFP载体感染后的五个不同时间点，分别表达未经密码子优化的和经CHO密码子优化的HVEM基因的CMV-HVEM池和CMV-HVEM-CO池在GFP表达方面优于所有其他池。这些数据与先前的公布一致，该公布报道了工程化CHO表达HVEM受体，允许HSV-1侵入和感染(Montgomery等人，CellVol.87，427-436.)。

有趣的是，在从细胞裂解24hpi时产生高rAAV9-GFP载体物理滴度方面，池#1(称为CMV-HVEM)也优于所有其他稳定的CHO细胞池，这导致从该池产生单克隆细胞，尽管在滴度方面与其他池的差异不显著。使用高通量方法，选择前24个CHO-HVEM表达克隆，它们显示高；生长曲线和HVEM表达。这些克隆被缩窄到八个克隆(C#1、C#13、C#15、C#23、C#24、C#62和C#64)，它们在不同时间点显示rHSV-nols-AAV-GFP感染后最高的GFP表达。在37℃，在自制培养基中进一步测试这些最终八个克隆的rAAV6.2-GFP载体生产，以MOI 1：1的(rHSV-AAV6.2：rHSV-nols-AAV-GFP)开始，持续三天。从24hpi开始，细胞活力和活细胞密度都迅速下降。在24hpi和48hpi时间点收获细胞培养基和细胞裂解物，然后使用Q-PCR测试它们的rAAV6.2-GFP物理滴度。在24hpi时，从所有共感染克隆的细胞裂解物中检测到最高的rAAV6.2-GFP物理滴度，然后在48hpi时滴度略微下降。检测到来自在不同时间点的所有共感染克隆的培养基中较低的rAAV6.2-GFP物理滴度(数据未显示)，这表明rAAV6.2-GFP载体主要是来自CHO平台的细胞相关载体。此外，与在24hpi时获得的收获相比，在不同时间点(如30hpi)的收获未显示最终rAAV6.2-GFP物理滴度的改善。这些发现不同于使用基于AAV-HSV-1的生产的其他系统，例如HEK293，其中rAAV生产的峰值在共感染后52小时达到(Kang等人，2009年)。有趣的是，这些测试的最终八个克隆在HVEM表达方面是可变的。例如，克隆号(C#1、C#23和C#24)是高HVEM表达克隆，而克隆号(C#13、C#15、C#46、C#62和C#64)是中HVEM表达克隆，其可能对rAAV生产具有影响。

克隆C#1(称为CHO-HV-C1)和C#62(称为CHO-HV-C62)在24hpi时产生rAAV6.-GFP载体的最高物理滴度，因此在这两个克隆上测试不同的MOI以提高最终rAAV6.2-GFP滴度。测试MOI(分别来自rHSV-AAV6.2和rHSV-GFP的2：1、3：1和4：1：6：1、8：1和10：1)。与MOI 1：1相比，MOI2：1和3：1不产生显著改善的滴度。有趣的是，MOI 4：1从克隆产生～x 10¹⁰vg/mL(10¹³vg/L)和～10^9.37vg/mL(10^12.37vg/L)；CHO-HV-C1(高HVEM表达)和CHO-HV-C62(中HVEM表达)分别表明HVEM表达和rAAV生产之间的正相关性。有趣的是，与MOI 4：1相比，未检测到使用MOI 6：1、8：1和10：1产生的rAAV6.2-GFP的滴度的显著增加(数据未显示)。因此，进一步选择CHO-HV-C1以测试使用不同MOI(如1：1、2：1、3：1和4：1)生产其他AAV血清型，如AAV8和AAV9。MOI 1：1、2：1和3：1生产～10⁸vg/mL(10¹¹vg/L)，而MOI 4：1将rAVV8-GFP和rAAV9-GFP的最终滴度分别改善至10^12.21和10^12.40vg/L。有趣的是，使用MOI 4：1从细胞培养基中检测到在24hpi时的良好rAAV8和rAAV9滴度(数据未显示)，这表明rAAV8-GFP和rAAV9-GFP在CHO平台中不像rAAV6.2-GFP那样与细胞相关。因此，对于CHO平台，仅需要低MOI来产生rAAV6.2-GFP、rAAV8-GFP和rAAV9-GFP，这与报道高MOI的其他研究相反，例如12：2作为产生rAAV的最佳MOI(Kang等人，2009年)。

来自用于rAAV8-GFP和/或rAAV9-GFP载体生产的CHO-HV-C1的共感染细胞的细胞活力在24hpi时急剧下降，类似于rAAV6.2-GFP载体生产的情况，这表明这种下降不是AAV血清型特异性的。据信在rHSV-1载体共感染后细胞活力的急剧下降可能影响最终的rAAV滴度，因此测试了从37℃至33℃的温度变化的影响，并且显示出共感染后细胞活力和rAAV6.2-GFP滴度的显著改善(数据未显示)。已经报道了HSV-1载体在温度为33℃情况下的稳定性是温度为37℃情况下的2.5倍，并且在33℃孵育的HSV-1同步感染产生的载体量是在37℃孵育产生的载体量的2倍(Wechuck等人，2002年)。因此，在33℃、120rpm振荡下测试了用MOI 4：1(分别为rHSV-1AAV6.2：rHSV-1-nols-AAV-GFP)的共感染。有趣的是，与在37℃孵育的培养物相比，发现在33℃、在24hpi时的共感染培养物的细胞活力略微下降(5-7％)，来自裂解物的rAAV6.2-GFP物理滴度略微改善，并且产生的培养基中rAAV6.2-GFP滴度增加约两倍(数据未显示)。这一发现表明，将共感染后的温度改变为33℃增强了细胞活力和来自CHO平台的最终rAAV6.2-GFP生产。

使用自己开发的PEG-氯仿纯化方法，然后进行Amicon浓缩，生产了纯化的rAAV6.2-GFP和rAAV9-GFP载体，它们在体外和体内研究中均显示出高效力。该纯化方法对于生产具有特别适合于临床前研究的滴度的rAAV是简单、廉价和快速的，并且与更耗时的碘克沙醇超速离心方法相当，并且这与其他研究一致(Wu等人，2001.Chin.Sci.Bull.46，485-488；Negrini等人，Curr Protoc Neurosci.2020年9月；93(1)：e103)。然而，在CE-SDS测试期间在纯化的样品中发现杂质。这些杂质通过相同样品的银染得到确认(图16)，这表明PEG-氯仿对于制备用于体外研究的rAAV样品是理想的，但对于制备用于体内或临床研究的样品是不理想的。我们的观察与最近的研究一致(Kimura等人，Sci Rep.2019年9月19日；9(1)：13601)。

使用自己开发的CE-SDS方法对在CHO-HV-Cl细胞中生产的不同rAAV(例如rAAV6.2-GFP和rAAV9-GFP)的衣壳蛋白比率(VP1：VP2：VP3)的分析显示，与通过三重瞬时转染系统生产的阳性AAV6.2对照相比，源自CHO的rAAV具有非常相当的VP1：VP2：VP3衣壳比率。这表明，与报告需要基因工程以使用杆状病毒系统增强昆虫细胞中一些AAV血清型生产的VP表达的其他平台相比，在CHO-HV-C1细胞中生产的rAAV得到完整包装。例如，使用杆状病毒系统使AAV-5适于在昆虫细胞中生产的早期试验显示低水平的VPl掺入衣壳中(Urabe等人，J Virol.2006；80：1874-85；Mietzsch等人，Hum Gene Ther.2014；25：212-22)。有趣的是，对CHO-HV-Cl克隆中生产的rAAV的完整/空衣壳的检查显示出比之前已经报道的更高的完整衣壳百分比(Small等人，Mol Ther Methods Clin Dev.2016年5月11日；3：16031)。此外，与通过三重瞬时转染产生的那些相比，测试源自CHO细胞的rAAV体外显示出高感染性滴度。此外，与通过三重瞬时转染产生的那些相比，源自CHO的rAAV在小鼠中显示出非常相当的生物分布，特别是对于rAAV9-GFP。

为了解决扩大生产rHSV1载体原液中的第二个挑战，使用随机整合和/或CRISPR/Cas9技术将CHO-HV-C1细胞重新工程化以表达rHSV-1中国仓鼠密码子优化的ICP27蛋白。使用自制培养基，最终选择的克隆(称为CHO-HV1-ICP27-C11)显示出rHSV-1生产性感染，如在V27细胞中在CHO-HV1-ICP27-C11克隆上繁殖的病毒的复制所示。然而，与V27细胞相比，来自CHO-HV1-ICP27-C11的rHSV-1载体的生产能力更低。与早期病毒基因和中期病毒基因的表达相比，在感染的CHO-HV1-ICP27C11细胞中晚期HSV-1病毒蛋白的表达似乎很少或低于正常水平(数据未显示)。此外，似乎CHO细胞不提供许多HSV基因(特别是晚期基因)的最佳表达所必需的元件，因为CHO细胞可能表达一些干扰或阻断HSV-1晚期病毒基因表达的抑制因子，并且我们的结果与(Shieh等人，JCellBiol.1992年3月；116(5)：1273-81)一致。其他因素可能与所使用的自制培养基有关，其可能对rHSV-1载体生产具有一些抑制作用。因此，将自制无血清适应性BHK-21细胞进行工程化以表达HSV-1ICP27蛋白，用于生产rHSV-1载体。有趣的是，稳定转染的BHK-21-ICP27池在存在或不存在FBS的情况下，在Xell培养基中产生相当的rHSV-1滴度。

因此，本公开提供了在经工程化的CHO细胞中的基于rAAV的HSV生产平台，其提供了可扩大生产的无血清制造平台，该制造平台将促进以低成本方式制造未来的基于rAAV的生物治疗剂。

Claims (14)

1.一种适于在无血清条件下生长的幼仓鼠肾细胞，其中所述细胞稳定表达仓鼠密码子优化的单纯疱疹病毒-1(HSV-1)ICP27开放阅读框，所述开放阅读框包含非必需感染细胞蛋白27(ICP27)元件的缺失。

2.根据权利要求1所述的细胞，其中所述细胞悬浮生长。

3.根据权利要求1或2所述的细胞，其中所述非必需ICP27元件是5′和3′非翻译区(UTR)。

4.一种细胞系，所述细胞系包含根据权利要求1至3中任一项所述的细胞。

5.一种生产重组腺相关病毒(rAAV)载体的方法，所述方法包括：

将含有AAV rep和cap序列以及编码目的基因的序列的重组疱疹病毒(rHSV)载体引入到根据权利要求1至3中任一项所述的细胞或根据权利要求4所述的细胞系中；以及在用于生产所述rAAV载体的条件下培养所述细胞或细胞系。

6.一种适于在无血清条件下生长的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，其中所述细胞稳定表达一种或多种侵入和感染单纯疱疹病毒-1(HSV-1)所必需的多肽。

7.根据权利要求5所述的CHO细胞，其中所述CHO细胞稳定表达疱疹病毒侵入介质(HVEM)和/或Nectin-1。

8.根据权利要求6所述的CHO细胞，其中所述HVEM和/或nectin-1序列已经密码子优化以在CHO细胞中表达。

9.一种细胞系，所述细胞系包含根据权利要求5或6所述的CHO细胞。

10.一种生产重组腺相关病毒(rAAV)载体的方法，所述方法包括：

将含有AAV rep和cap序列以及编码目的基因(GOI)的序列的重组疱疹病毒(rHSV)载体引入到根据权利要求5至7中任一项所述的细胞或根据权利要求8所述的细胞系中；以及在用于生产所述rAAV载体的条件下培养所述细胞或细胞系。

11.根据权利要求5或9所述的方法，其中以约4：1、6：1、8：1、或10：1的rHSV-rep/cap：rHSV-GOI的感染复数引入所述rHSV载体。

12.根据权利要求5、9或10中任一项所述的方法，其中所述AAV血清型是AAV6、AAV8或AAV9。

13.根据权利要求5或9所述的方法，其中所述目的基因编码任何治疗性生物化合物。

14.根据权利要求12所述的方法，其中所述生物化合物是抗体或嵌合抗原受体。