CN120424938A - 一种高特异性识别麦角甾醇的寡核苷酸适配体m8及其验证 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高特异性识别麦角甾醇的寡核苷酸适配体M8及其验证，属于分子生物医学领域。所述寡核苷酸适配体M8的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明用麦角甾醇溶液对随机核苷酸进行筛选，反筛靶标不断更换，最终筛选得到多条寡核苷酸适配体序列，测序后进行序列比对并依据同源性构建家族树，确定出4条寡核苷酸适配体序列进行特异性和亲和力验证。结果发现，寡核苷酸适配体M58对麦角甾醇具有强亲和力和高特异性，通过截短得到寡核苷酸适配体M8验证其对麦角甾醇的亲和力和特异性。本发明可用于麦角甾醇类真菌感染的早期诊断。

Description

一种高特异性识别麦角甾醇的寡核苷酸适配体M8及其验证

技术领域

本发明属于分子生物医药技术领域，具体涉及一种高特异性识别麦角甾醇的寡核苷酸适配体M8及其验证。

背景技术

自然界中广泛存在着约300万种真菌，目前人类认识的菌种超过12万，其中与人类感染相关的大约有400种。全球每年约有300万人发生慢性重度真菌感染，近190万例患者会发展为急性侵袭性真菌感染，每年至少有160万例患者因真菌感染而失去生命，与感染疟疾和结核杆菌死亡的例数相当。侵袭性真菌感染是真菌入侵血液、脏器或全身播散引起的严重感染，因此真菌感染的及时检测对提高患者生存率具有重要意义。真菌类的特征甾体麦角甾醇（ergosterol）又称麦角固醇，是真菌细胞膜中最丰富的天然脂质，是构成真菌细胞膜的重要组分，在确保细胞膜结构完整性、膜通透性、物质运输、细胞活力等方面具有重要的生物学作用。基于当真菌死亡后麦角甾醇可迅速降解的假设，麦角甾醇常被用做测定活真菌生物量的标志物。目前麦角甾醇的检测方法主要有紫外分光光度法、薄层色谱扫描法、高效液相色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法-串联质谱法、定量核磁共振法，以上检测方法检测时间长，成本高，因此开发一种成本低、操作简便的方法检测麦角甾醇具有重要意义。

核酸适配体是一类从SELEX（Systematic Evolution of Ligands byExponential enrichment）进化而来的短DNA或RNA寡核苷酸，通过形成一些独特的结构，如茎（Stem）、环（Loop）、发夹（Hairpin）、隆起（Bulge）、假结（Pseudoknot）和G-四联体（G-quadruplex）结构，识别小分子、蛋白、离子等靶标分子。核酸适配体作为一种新型的识别元件，与靶标具有较高的亲和力和选择性，与抗体不同的是，它们具有制备简单、易修饰、稳定性高等独特的优点，因此被广泛应用于疾病早期诊断、细胞识别和靶向给药等研究领域。

筛选小分子适配体的方法通常包含氧化石墨烯-SELEX（GO-SELEX）、毛细管电泳-SELEX（CE-SELEX）。 GO-SELEX是基于氧化石墨烯对ssDNA的非特异性吸附，而且ssDNA链越短，吸附能力越强。当ssDNA与靶分子结合后，由于其构象发生了改变，与GO的吸附能力也就相对减弱。GO-SELEX无需对文库或靶标固定，且核酸适配体与靶标的结合在均相中进行。这样无需考虑固定引起的结构变化等因素对结合的影响。但是氧化石墨烯在生物效应和安全性能方面的研究目前还是比较少，如果其运用于生物体，是否会结合DNA等生物大分子，影响生物体正常的生理功能，这些问题仍需解决。毛细管电泳-SELEX可直接在溶液中借助毛细管电泳的高效分离能力将迁移效率不同的物质进行分离，反应体系中的游离核酸与核酸-靶标复合物的迁移能力不同，借助毛细管电泳-SELEX技术可实现快速分离，从而提高了SELEX的筛选效率。但是该筛选方式对筛选设备的要求高，不适用于基础实验室研究。麦角甾醇是一种脂溶性且特征官能团少的小分子，因此选择适合麦角甾醇的核酸适配体筛选方法至关重要。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一种固定文库的筛选方法，本研究基于捕获-SELEX（Capture-SELEX）技术，使用链霉亲和素琼脂糖磁性微球固定带有生物素的随机文库互补链，通过互补链与随机文库核酸杂交固定核酸文库筛选麦角甾醇的适配体，为了提高适配体的特异性，引入两种反筛靶标分别是维生素D2、胆固醇，正筛和反筛交替进行,通过qPCR法验证得到对麦角甾醇具有高亲和力、高特异性的适配体M58，为了提高适配体构象稳定性将M58截短得到M8，SYBR Green Ⅱ染料法验证M8对麦角甾醇具有高亲和力、高特异性。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种高特异性识别麦角甾醇的寡核苷酸适配体M8，其特征在于所述寡核苷酸M8的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述的一种高特异性识别麦角甾醇的寡核苷酸适配体M8，其特征在于所述寡核苷酸适配体M8的衍生物包括对寡核苷酸适配体M8的 5’端或3’端结合生物素、地高辛、荧光物质/纳米发光材料、酶标记中的一种或一种以上的化合物，优选所示化学修饰包括磷酸骨架修饰、截断、延长或颠换。

所述的一种高特异性识别麦角甾醇的寡核苷酸适配体M8，其特征在于所述寡核苷酸适配体M8是通过分子生物学方法制备得到寡核苷酸适配体M8，所述分子生物学方法优选为体外化学合成、PCR。

所述的一种高特异性识别麦角甾醇的寡核苷酸适配体M8，其特征在于所述寡核苷酸适配体M8的序列还包括以下三种序列中的一种：

（ = 1 \* roman i）与所述寡核苷酸适配体M8同源性在80%以上的寡核苷酸序列；

（ = 2 \* roman ii）与所述寡核苷酸适配体M8进行杂交的序列；

（ = 3 \* roman iii）所述寡核苷酸适配体M8转录的RNA序列。

任一所述的一种高特异性识别麦角甾醇的寡核苷酸适配体M8的筛选方法，其特征在于利用消减SELEX技术，以麦角甾醇为正筛靶标，以胆固醇、维生素D2为反筛靶标，经过反复孵育、洗脱、扩增，从随机文库中筛选出一条特异性结合麦角甾醇的寡核苷酸适配体M58，通过截短方式得到寡核苷酸适配体M8并采用SYBR Green Ⅱ染料法进行验证。

任一所述的寡核苷酸适配体M8在特异性识别麦角甾醇的应用。

所述的应用，其特征在于所述特异性识别麦角甾醇的过程中采用探针分子进行识别。

任一所述的寡核苷酸适配体M8在临床诊断真菌感染的应用。

一种抗真菌药物，其中特征在于所述抗真菌药物的有效成分包含任一所述的寡核苷酸适配体M8。

一种试剂盒，包含任一所述的寡核苷酸适配体M8。

本发明用麦角甾醇溶液对随机核苷酸进行筛选，反筛靶标不断更换，最终筛选得到多条寡核苷酸适配体序列，测序后进行序列比对并依据同源性构建家族树，确定出4条寡核苷酸适配体序列进行特异性和亲和力验证。结果发现，寡核苷酸适配体M58对麦角甾醇具有强亲和力和高特异性，通过截短得到寡核苷酸适配体M8验证其对麦角甾醇的亲和力和特异性。本发明可用于麦角甾醇类真菌感染的早期诊断。

与现有技术相比，本研究具有以下有益效果：

1、本发明筛选的寡核苷酸适配体M8是一种灵敏的分子识别元件，性质稳定，无毒性，易于合成，生产成本低。

2、本发明筛选的寡核苷酸适配体M8能特异性识别麦角甾醇。因此，M8序列在麦角甾醇类真菌感染临床诊断及相关领域有一定的应用价值。

附图说明

图1为寡核苷酸适配体筛选结合比监测图

图2为qPCR法验证候选寡核苷酸适配体M1、M3、M58、M103与麦角甾醇结合的特异性；

图3为寡核苷酸适配体M58与麦角甾醇结合的Kd解离常数；

图4为SYBR Green Ⅱ染料法验证寡核苷酸适配体M8与麦角甾醇的亲和力。

图5为SYBR Green Ⅱ染料法验证寡核苷酸适配体M8与麦角甾醇的特异性。

具体实施方式

如无特殊要求，本发明所用试剂均为本领域技术人员常规购买所得。以下将通过实施例和附图对本发明作进一步说明。附图中相同的附图标记表示功能相同或相似的元件。尽管在附图中展示出了实施例的各种方面，但是除非特别指出，不必按比例绘制附图。

实施例1寡核苷酸适配体M58的制备

（1）构建初始寡核苷酸文库：

5’- CTATAGCAATGGTACGGTACTTCC -（40N）- CAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA - 3’

其中N代表A,T,C,G中任意碱基。所述的寡核苷酸文库固定序列为PCR扩增引物结合区，中间为40个碱基的随机序列。

（2）麦角甾醇溶液的配制：取0.024 g麦角甾醇粉末溶于30 mL无水乙醇中，浓度为0.002 M，将其用DEPC水稀释成0.2μM。

（3）维生素D2、胆固醇溶液的配制：维生素D2、胆固醇溶液配制方法同麦角甾醇溶液配制一致。

（4）文库的处理：灭菌水溶解步骤（1）的寡核苷酸文库，95°C变性5 min，冰浴5min，室温5 min，使ssDNA形成特定的三级结构。

（5）链霉亲和素（SA）磁珠的制备：用1mL MES溶液洗涤100 mg琼脂糖羧基磁珠3遍，先加入EDC，再加入NHS混匀，室温旋转孵育30 min,弃上清，用MES溶液洗涤磁珠3次后，加入500μL 0.1 mg/mL SA溶液,37℃旋转孵育30 min。

（6）ssDNA随机文库的固定：设计一条与随机ssDNA文库引物区互补的互补链P4，将其进行生物素标记。将5 pmol ssDNA文库与P4以物质的量比1：2加入350μL结合缓冲液（Binding buffer，BB）（0.05 mM HEPES, 0.1 mM NaCl, 0.001 mM MgCl₂, 0.02 mM KCl,0.001 mM CaCl₂,）中混匀，在PCR仪中进行慢速变复性(95 ℃ 10 min,60 ℃ 1 min,25 ℃1 min,降温速率0.1 ℃/s)。互补后ssDNA文库-P4复合物与SA磁珠孵育结合，37 ℃，130 r/min反应1 h，弃上清，得到ssDNA文库磁珠，用BB缓冲液清洗3次，去除未结合在磁珠上的ssDNA。

（7）反筛：在随机文库磁珠中加入250μL,0.2μM 维生素D2溶液和250μL,0.2μM 胆固醇溶液，37℃旋转孵育1h。保留磁珠，1mL BB缓冲溶液清洗磁珠一次。

（8）正筛：在反筛后的随机文库磁珠中加入500μL,0.2μM 麦角甾醇溶液，37℃旋转孵育1h，上清中核酸含量通过qPCR进行监测。

（9）链霉亲和素磁珠法制备次级库：与正筛靶标结合的文库通过 PCR扩增，下游引物带有生物素，因此文库的互补链有生物素（Bio）进行标记，将PCR扩增产物与链霉亲和素磁珠37 ℃孵育30 min后,弃上清，加入1 mL 5%的甲酰胺在40 ℃水浴5 min后，加250μL0.1 M的NaOH溶液，95 ℃变性5 min，冰浴5 min，用0.1 M的HCl中和后收集上清，即为制备的次级库，用于下一轮筛选。

（10）使用步骤（9）制备的次级库重复步骤（5）-（8）的筛选流程，共进行8轮筛选。其中，前5轮只进行正筛，剩下3轮均为先反筛再正筛。筛选PCR监测结果如图1所示，前5轮筛选将文库与正筛靶标结合的核酸序列进行富集，第4轮筛选结合比达到最大值，将第4轮的产物制备次级库先进行反筛，结合比下降，再继续3轮筛选，结合比保持不变。高通量测序第4轮和第8轮的寡核苷酸库，挑选得到寡核苷酸适配体M58。

实施例2通过qPCR法验证寡核苷酸适配体M58与麦角甾醇溶液的特异性

配制固定浓度的寡核苷酸适配体M58，根据实施例1所述的方法制备三份相同的随机文库磁珠，分别加入等物质的量麦角甾醇溶液、维生素D2溶液、胆固醇溶液室温旋转孵育1h，收集上清，进行qPCR监测，将Ct值作为监测指标，结果如图3所示，寡核苷酸适配体M58对麦角甾醇溶液具有强特异性。

实施例3通过qPCR法检测寡核苷酸适配体M58与麦角甾醇溶液的结合能力

配制等体积不同浓度梯度的寡核苷酸适配体M58，根据实施例1所述的方法与麦角甾醇溶液室温旋转孵育1 h，收集上清，进行qPCR监测，将相对荧光强度RFU（1/Ct×10³）作为监测指标，结果如图2所示，得到寡核苷酸适配体M58与麦角甾醇溶液的平衡解离常数（Kd）为20.36±2.813 nM。

实施例4通过计算机模拟技术截短寡核苷酸适配体M58得到M8

保留M58中与麦角甾醇结合的结构域，将多余的碱基进行裁剪得到M8核酸适配体，所述寡核苷酸序列如SEQ ID NO.1。

实施例5通过SYBR Green Ⅱ验证核酸适配体M8的亲和力

准备7个2 mL离心管，每管中加入70μL 1μM核酸适配体与5μL SYBR Green Ⅱ（100x），于室温下避光孵育15 min，使适配体与染料充分结合。取96孔黑色酶标板，将孵育好的核酸适配体与染料的复合物加到酶标孔里，分别加入5μL 0、0.5、1、2、3、4、5μM的靶标溶液，将酶标板置于37℃避光孵育30 min，使适配体与靶标充分结合，以激发波长490 nm，发射波长550 nm下的荧光强度为监测指标，验证适配体与靶标的平衡解离常数（Kd）为62.05±0.1249 nM。

实施例6通过SYBR Green Ⅱ验证核酸适配体M8的特异性

准备4个2mL离心管，每管中加入70μL 1μM核酸适配体与5μL SYBR Green Ⅱ（100x），于室温下避光孵育15min，使适配体与染料充分结合。取96孔黑色酶标板，将孵育好的核酸适配体与染料的复合物加到酶标孔里，分别加入5μL DEPC水、5μM麦角甾醇溶液、5μM维生素D2溶液、5μM胆固醇溶液，将酶标板置于37℃避光孵育30 min，使适配体与靶标充分结合，以激发波长490 nm，发射波长550 nm下的荧光强度为监测指标，验证适配体与靶标的亲和力。

SEQUENCE LISTING

<1> DNA（人工序列）

<2> 核苷酸适配体M8

<3> ggttacgaaaacc。

Claims (5)

1.一种寡核苷酸适配体M8，其特征在于，所述寡核苷酸适配体M8的核酸序列如SEQ IDNO.1所示。

2.根据权利要求1所述的寡核苷酸适配体M8，其特征在于，所述寡核苷酸适配体M8可以特异识别麦角甾醇。

3.根据权利要求1所述的寡核苷酸适配体M8，其特征在于，所述寡核苷酸适配体M8可以是体外化学合成的，也可以是通过PCR或其他分子生物学方法制备的。

4.根据权利要求1所述的寡核苷酸适配体M8，其特征在于，对寡核苷酸适配体M8可以通过磷酸骨架修饰、截断、延长、颠换，或对寡核苷酸适配体碱基进行化学修饰，或在寡核苷酸适配体M8的5’端或3’端结合生物素、地高辛、荧光物质及纳米发光材料或者酶标记。

5.寡核苷酸适配体M8在制备真菌诊断试剂中的应用。