CN120400239B

CN120400239B - 大豆耐低磷基因GsMYB7在提高植物耐低磷胁迫能力中的应用

Info

Publication number: CN120400239B
Application number: CN202510567205.6A
Authority: CN
Inventors: 马启彬; 杜鹏鑫; 王宏杰; 年海; 程艳波; 蔡占东
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2025-04-30
Filing date: 2025-04-30
Publication date: 2026-01-30
Anticipated expiration: 2045-04-30
Also published as: CN120400239A

Abstract

本发明涉及植物基因工程技术领域，公开了一种植物耐低磷重要基因GsMYB7及其应用。本发明首次在大豆中克隆得到一个MYB家族GsMYB7基因。研究显示GsMYB7基因受低磷胁迫诱导表达上调，在不同磷浓度处理条件下，超表达GsMYB7明显能增加转基因植物的生物量，在低磷条件下促进植物生长；同时，超表达GsMYB7能提高植物对低磷胁迫能力的耐受能力，减少低磷对植物根系生长的抑制作用。表明GsMYB7对植物适应低磷胁迫具有重要作用，能通过转基因技术提高植物对酸性土壤低磷胁迫的适应能力。

Description

大豆耐低磷基因GsMYB7在提高植物耐低磷胁迫能力中的应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及大豆耐低磷基因GsMYB7在提高植物耐低磷胁迫能力中的应用。

背景技术

大豆(Glycine max(L.)Merr)是豆科属一年生草本植物，原产于中国，是一种重要的农产品和工业原料。由于其丰富的蛋白质和脂肪含量，大豆被广泛用作食品加工、饲料生产等行业的优质原料。所以，加强大豆种植、提高其产量和品质，对于大豆的稳定供应、满足国内市场需求以及减少进口依赖具有重要意义。

磷作为植物生长发育过程中必不可少的大量营养元素之一，在植物的生长发育过程中具有不可替代的作用。对于豆类作物而言，缺磷会导致植物矮小、叶片生长受阻，从而影响植株的生长发育。此外，缺磷还会影响植物的根系形态：一方面，主根的发育受到抑制，其长度和体积减小，降低了植物吸收水分和养分的能力；另一方面，根瘤的发育也会受到抑制，导致其体积减小、固氮效率降低，进而影响植物对氮素的获取。不仅如此，磷的缺乏还会进一步影响植株的生殖生长以及抗逆能力。然而一般土壤中全磷含量较少，自然状态下土壤全磷含量大约在0.02％～0.25％之间，其中能被植物吸收利用的磷含量更少。

因此，解决磷缺失问题是提高豆类作物产量和品质的重要途径之一，针对大豆在低磷胁迫条件下的生理响应和适应机制进行研究，对于提高大豆的磷利用效率、增强其抗逆能力以及实现高产优质栽培具有重要意义。

发明内容

为了解决上述背景技术中的问题，本发明目的一，在于提供一种大豆耐低磷基因GsMYB7在提高植物耐低磷胁迫能力中的应用。

本申请通过在植物内过表达基因GsMYB7，从而提高植物的耐低磷胁迫能力。

进一步的，所述植物为大豆。

本发明的目的二，在于提供一种提高植物耐低磷胁迫能力的方法，所述方法为提高受体植物中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的表达量；其具体步骤包括：将SEQ ID NO.1所示的大豆耐低磷基因GsMYB7导入受体植物，获得转基因植物，所述转基因植物的耐低磷胁迫能力高于所述受体植物；或在受体植物中过表达如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

进一步的，所述植物的耐低磷胁迫能力的提高体现为其主根长或者侧根数量的增加。

本发明的目的三，在于提供一种提高植物耐低磷胁迫能力的制剂，所述制剂的活性成分包含大豆耐低磷基因GsMYB7或大豆耐低磷基因GsMYB7编码的蛋白。

本发明的目的四，在于提供大豆耐低磷基因GsMYB7的重组载体在提高植物耐低磷胁迫能力中的应用。

本发明的目的五，在于提供一种大豆耐低磷基因GsMYB7在培育耐低磷胁迫大豆植物中的应用。

本申请研究大豆耐低磷基因GsMYB7促进植物在低磷胁迫环境中生长的方法，包括以下具体步骤：

以大豆为材料，利用农杆菌介导的大豆子叶节转化法，将GsMYB7基因遗传转化到大豆中，得到GsMYB7基因过表达的大豆植株，通过对比转基因植株与野生型植株在低磷胁迫条件下的生长表现、磷吸收效率及根系发育等指标，验证了GsMYB7基因在提高大豆低磷耐受性方面的功能和应用潜力。

综上所述，本发明的有益效果为：

本发明提供了一种GsMYB7基因在调控大豆对低磷胁迫耐受性方面的应用，GsMYB7基因可以增强大豆对低磷胁迫耐受性，GsMYB7基因过表达可使植株耐低磷能力增强。

此外，本申请构建了GsMYB7过表达的大豆材料：采用农杆菌介导的大豆子叶节转化方法，可成功地将GsMYB7基因整合到大豆基因组中并稳定表达。

上述说明仅是本发明的技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，而可依照说明书的内容予以实施，并且为了让本发明的上述和其他目的、特征和优点能够更明显易懂，以下特举较佳实施例，并配合附图，详细说明如下。

附图说明

图1为GsMYB7蛋白结构域图；

图2为GsMYB7进化树分析图；

图3为GsMYB7基因的克隆和GsMYB7基因过表达载体菌液PCR鉴定；

图4为GsMYB7转基因大豆品系的检测，其中(A)部分为使用Bar基因引物的PCR鉴定，(B)部分为qRT-PCR检测转基因大豆品系的基因表达图，(C)部分为转基因植物对除草剂的耐受性检测；

图5为35S的序列设计引物的PCR鉴定图；

图6为GsMYB7基因耐低磷表达模式分析；

图7为GsMYB7转基因大豆总磷含量测试；

图8为GsMYB7转基因大豆苗期水培耐低磷表型鉴定；

图9为GsMYB7转基因大豆全生育期表型鉴定；

图10为GsMYB7转基因大豆苗期土培表型鉴定和观测指标分析。

具体实施方式

为了使本发明的内容能更容易被清楚的理解，下面根据具体实施例并结合附图，对本发明作进一步说明。

实验一：GsMYB7蛋白的结构与功能分析

本申请的GsMYB7基因全长编码序列2179bp，编码区(coding DNA sequence，CDS)序列长度为1002bp，编码333个氨基酸。

S1，保守结构域分析：如图1所示，本申请的GsMYB7蛋白包含两个保守的DNA结合域，分别由46个氨基酸(位于第10-60位氨基酸残基)和44个氨基酸(位于第70-120位氨基酸残基)组成。该结构特征符合典型的R2R3-MYB转录因子(TF)的保守结构模式。

S2，进化树与同源性分析：如图2所示，GsMYB7蛋白的相关同源物主要分布于豆科植物中。尽管GsMYB7与拟南芥中的同源蛋白序列同源性较低，但两者均具有典型的MYB DNA结合域，表明其在进化过程中保留了关键的DNA结合功能。

S3：功能推测与调控机制：GsMYB7基因起始密码子上游1500bp的启动子区域包含多种与胁迫响应相关的顺式作用元件，包括但不限于：AE-box(光响应元件)、ERE(乙烯响应元件)、TGA(生长素响应元件)、HSE(热胁迫响应元件)、TC-rich重复序列(逆境响应元件)。这些元件的存在提示GsMYB7可能在光、乙烯、生长素、热及逆境胁迫等多种环境信号传导途径中发挥调控作用。

本实施例中，GsMYB7基因的候选序列信息通过美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库进行检索，其登录号为XP_003527079.1；此外，本实验利用DNAMAN软件来完成大豆GsMYB7蛋白与R2R3-MYB家族成员的多序列比对，使用MAGE软件并通过邻近法(Neighbor-Joining,NJ)构建系统发育树。

实施例二：GsMYB7表达载体的构建和大豆的遗传转化

S1中间载体pUC18-GsMYB7的构建：通过PCR扩增GsMYB7的CDS序列，扩增引物：

Forward Primer(SEQ ID NO.3)：5’-GGACCACTATCTCCGACCTG-3’

Reverse Primer(SEQ ID NO.4)：5’-GCCCATCTGTTACCCAAA-3’

并将其插入到经修饰的中间载体pUC18的BamHI和KpnI限制性位点之间，构建中间载体pUC18-GsMYB7。

pUC18-GsMYB7_F(SEQ ID NO.5)：5’-ATACTAGTGGCGCGCCGGGTGGTAGT GATG-3’；pUC18-GsMYB7_R(SEQ ID NO.6)：5’-CCGAGCTCGCCTAGGACTGTGGCTT GCTC-3’，

按照下列表1的反应体系扩增GsMYB7的CDS全长序列，反应程序为：预变性95℃，3min；34个循环(变性95℃，15s；退火55℃，15s；延伸72℃，1min/kb)；终延伸72℃，5min；12℃保存；

表1片段扩增反应体系

S2目标片段的回收：用HindI I I限制性内切酶消化pUC18-GsMYB7，回收包含35S-GsMYB7-NOS终止子的目标片段。

S3表达载体pZY101-GsMYB7的构建与转化：将上述目标片段插入到pZY101载体的HindI I I位点，构建表达载体pZY101-GsMYB7；随后将构建的表达载体转化到大肠杆菌DH5α的感受态细胞中。大肠转化的步骤为：吸取10μL连接产物加入至100μL DH5α大肠杆菌感受态中，轻轻吸打混匀，随后冰浴30min，再于42℃下进行热激45s后，立刻转至冰上冷却2min；随后将连接产物移至超净工作台中，往连接产物内加入500-700μL LB液体培养基，再于37℃摇床220rpm培养1h，获得菌液，将菌液涂于含Amp的平板上，于37℃下培养过夜，挑单克隆摇菌，进行检测和测序。

S4阳性克隆的鉴定：通过菌液PCR、限制性酶切及DNA测序对pZY101-GsMYB7阳性克隆进行鉴定，确保载体构建的正确性。

pZY101-GsMYB7_F(SEQ ID NO.7)：5’-GGCAGAGGCATCTTCAACG-3’；

pZY101-GsMYB7_R(SEQ ID NO.8)：5’-GCTCACTCATTAGGCACCC-3’，

S5根癌农杆菌转化与大豆遗传转化：将pZY101-GsMYB7表达质粒转化到根癌农杆菌EHA101中，并利用大豆子叶节遗传转化方法将GsMYB7基因导入大豆受体品种华春6号中。

a农杆菌电激感受态的制备

1)挑取乳白且饱满的单菌落接种于含5μL壮观霉素、5μL链霉素、5μL氯霉素的5mLYEP液体培养基中，28℃，250rpm摇床中培养过夜；

2)吸取2mL培养物于50mLYEP液体培养基中，于28℃、250rpm的摇床中培养至OD值约为0.6；

3)将菌液转至无菌离心管中，再于冰上放置30min，随后放入离心机中进行离心，离心机的温度设置为4℃，转速为4000rpm，离心时间为10min；

4)弃掉上清液，用少量预冷的灭菌水重悬菌体，添加预冷的无菌水至50mL，随后放入离心机中进行离心，离心机的温度设置为4℃，转速为4000rpm，离心时间为10min；

5)步骤4)重复三次后，除去上清液，重悬菌体，用10％的甘油悬浮沉淀，最后分装后保存在-80℃的冰箱中备用。

b电击法转化

1)电击杯从70％乙醇中的电击杯中取出放在超净工作台中吹干，吹干后用干净的手套把电击杯包好放在冰上预冷备用；

2)在-80℃冰箱拿出农杆菌感受态细胞并放在冰面上解冻，然后把质粒加入到解冻的感受态细胞中，用移液器轻轻吹打混匀后转移至点击杯中；

3)将电击杯放在电击仪中电击，参数设为：电压1800V，时间5ms；

4)电击完成后，向电击杯中缓缓加入1mL的不含抗生素的YEP液体培养基，用移液器轻轻吸打几次，将菌体悬浮混匀；

5)将菌液从电击杯中吸出放在离心管中，再于温度为28℃，转速为250rpm的摇床中培养3h；

6)吸取50μl菌液涂布在含有壮观霉素、链霉素、氯霉素的YEP固体平板上，放在28℃，250rpm摇床中培养36h左右，直至长出单菌落。

大豆遗传转化

1)萌发：a.种子消毒：从-20℃冰箱中取出筛选储存的华春6号种子，75％酒精浸泡1min后擦干，单层排列在培养皿中后放到通风橱干燥器中；将100mL次氯酸钠与5mL浓盐酸在通风橱中混合，迅速移入250mL烧杯并置于干燥器内，密封灭菌13.5小时，随后取出在超净工作台中吹风，放置于4℃的冰箱保存备用。b.播种：种脐朝下将种子轻轻按在萌发培养基上，子叶变绿后进行侵染实验。

2)浸泡种子：大豆用灭菌ddH₂O进行浸泡，置于无光条件24℃环境下10-16h。

3)菌液制备取出已转化目的质粒的EHA101菌液，加入含有100mg/LSpe、30mg/LRif的YEP液体培养基中；恒温摇床设置28℃，240rpm，过夜培养，次日测定菌液的吸光值OD600＝0.8-1.0；菌液倒入无菌的50mL离心管中，5000rpm，离心10min；倒上清，CCM液体培养基重悬菌体，使OD600＝0.6-0.8，4℃保存等待下一步实验。

4)外植体的制备及转化：超净工作台中将浸泡好的种子使用镊子和解剖刀将下胚轴划开，沿着子叶垂直剖开种子，去除子叶上的幼芽、上胚轴和种皮。

5)侵染与共培养将外植体浸泡在已经配置好的CCM重悬液中，超声波3min，真空10min，摇床120-150rpm，28℃，振荡40min；侵染结束将菌液倒出，外植体用镊子平铺到铺滤纸的CCM固体培养基上；医用胶带封口，放置组培间，温度设为22℃，暗培养48h，光培养3-5天至子叶完全变绿。

6)幼芽的诱导用解剖刀切除生长过长的下胚轴，将外植体斜插到芽诱导培养基上，医用胶带封口，放置组培间，设置温度为22℃，光照时间为16/8h，培养14天；随后将无菌的平板更换到新的芽诱导培养基中，丢弃没有长出簇生芽的外植体，每个培养基放置6-7个外植体，医用胶带封口，放置到组培间，诱导14天。

7)幼芽的生长幼芽诱导4周后，丢弃未分化材料，将长出簇生芽的外植体切去子叶，转移到芽生长培养基中，切口与培养基贴合，每个培养皿放置6-7个外植体，放置组培间，14天更换一次培养基。

8)生根后，将芽伸长大于3cm的幼苗使用解剖刀将芽从组织的根部切下来，放在生长素中浸泡1min，转移到生根培养基中，放到组培间中继续生长，长出5-6条根，并且还有侧根长出的时轻轻将植株从生根培养基中取出，使用自来水小心的冲洗掉根部的培养基；将苗移栽到经高温高压灭菌的营养土(蛭石:基质土＝1：2)里，将其放到保温保湿育苗盘中，育苗盘放置于培养箱，设置温度为26℃，光照时间为12/12h。浇营养液进行培养，直到结荚。

鉴定结果

如图3所示，其中a部分的M为DL2000 DNA Marker，泳道1为GsMYB7全长克隆片段，☆所指为目的条带，大约为1002bp；

b部分的M为DL5000 DNA Marker，-为H₂O对照，泳道1、2、3、4为pZY101-GsMYB7大肠杆菌菌液PCR检测，☆所指为目的条带，大约为2000bp；

c部分的M为DL15000 DNA Marker，泳道1为pZY101-GsMYB7重组质粒，泳道2为GsMYB7全长BamHΙ、KpnΙ双酶切片段，泳道3为pZY101-GsMYB7重组质粒BamHΙ、KpnΙ双酶切，☆所指为目的条带，大约为1002bp。

9)通过除草剂耐受性、DNA和RNA分析对获得的转基因植物进行鉴定，对GsMYB7过量表达的转基因T₄代植株叶片提取基因组总DNA，用Bar基因引物进行PCR鉴定。Bar基因引物如下所示：

Forward Primer(SEQ ID NO.9)：5'-AAGTCCAGCTGCCAGAAACC-3'

Reverse Primer(SEQ ID NO.10)：5'-AAGCACGGTCAACTTCCGTA-3'

Bar基因引物的PCR鉴定结果如图4中的A部分所示，GsMYB7过量表达的转基因株系能够扩增出大小约为488bp的Bar基因特异条带。

qRT-PCR检测转基因大豆品系的基因表达结果如图4中的B部分所示，转基因株系比野生型(wild type，WT)植株中的GsMYB7相对表达量(Reletive expression)更高。

除草剂耐受性鉴定结果如图4中的C部分所示，带有勾号的叶片是施用除草剂的一侧，左侧未施用除草剂，实验表明转基因株系比WT植株的除草剂耐受性更强。

用35S和目的基因的序列设计引物进行PCR鉴定，结果如图5中的a和b部分所示，实验表明GsMYB7过量表达的转基因株系能够扩增出大小约为1110bp的条带，证明GsMYB7基因序列已整合在大豆转化体植株的基因组中。

在以上三个独立的生物学实验中，通过2^-△△CT方法计算华春6号WT和GsMYB7转基因大豆品系的相对基因表达水平。L1、L2、L3、L4、L5为GsMYB7转基因大豆T₄代株系。

实施例三：GsMYB7水培验证和表达模式分析

BX13大豆种子用75％乙醇消毒后，于22℃的蛭石中光照16/8h，萌发4天之后，子叶完全展开，收取长势一致的苗，移至1/2Hoagland溶液中进行培养，并区分为两组处理组：实验组和对照组，其中实验组为低磷浓度(5μmol/L K₂HPO₄)培养，对照组为正常磷浓度(500μmol/L K₂HPO₄)培养，随后分别在处理0h、3h、6h、12h、24h、36h、48h、7d、14d后采取根部样品，提取RNA并反转录为cDNA，通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)观察以上时段该基因的表达量变化。

实验步骤

定量PCR引物设计：从Phytozome数据库查找基因序列，网站下载GsMYB7基因组CDS序列如SEQ ID NO.1所示，GsMYB7蛋白序列如SEQ ID NO.2所示；并根据基因组序列在NCBI网站上设计引物并合成其特异的定量扩增引物：

Forward Primer(SEQ ID NO.11)：5’-GGACCAACTATCTCCGACCTG-3’；

Reverse Primer(SEQ ID NO.12)：5’-GCCCATCTGTTACCCAAA-3’。

实时荧光定量PCR：

①以Actin3作为内参基因，

正向引物(SEQ ID NO.13)：5'-GCACCACCGGAGAGAAAATA-3'；

反向引物(SEQ ID NO.14)：5'-GTGCACAATTGATGGACCAG-3'；

②将全部样品的cDNA用ddH₂O稀释1倍作为定量PCR反应的模板；

③实时荧光定量PCR系统按照下列表2反应体系进行，反应程序为：预变性95℃，30s；39个循环(变性95℃，5s；退火60℃，30s)；溶解曲线95℃，10s；54.3℃，5s；94.3℃，5s；

表2实时荧光定量PCR反应体系

④处理数据，相对表达量分析采取2^^-△△CT法。

实验结果如图6所示，低磷环境能促进GsMYB7的表达。

GsMYB7转基因种子用75％乙醇消毒后，在22℃的蛭石中光照时间16/8h培养，萌发4天之后，子叶完全展开，收取长势一致的苗，移至1/2Hoagland溶液中进行培养，并区分为两组处理组：实验组和对照组，其中实验组为低磷浓度(5μmol/L K₂HPO₄)培养，对照组为正常磷浓度(500μmol/L K₂HPO₄)培养，其中，每组包括野生型(Wi ld type，WT)和转基因株系，WT作为组内对照(CK)，转基因株系具体包括Gm7A、Gm7C和Gm7H三个株系，每组设置3次重复，每两天更新一下水培营养液，并在14天之后观测水培表型，考种和测总磷含量(总磷含量为全磷含量乘以地上下部干重)。

需要注意的是，P浓度应根据相应的试验处理来调节，如果用KH₂PO₄进行P处理，应用K₂SO₄或者KCl将相应的K补充回去。

1、植物全磷钼锑抗比色测定方法:

本实验所使用的试剂均为分析纯，水为去离子水或蒸馏水或相当纯度的水。

(1)硫酸；

(2)30％过氧化氢；

(3)10％氢氧化钠；

(4)0.2％二硝基酚指示剂；

(5)0.5％石酸锑钾溶液：称取化学纯酒石酸锑钾0.5g溶于100mL水中；

(6)硫酸钼锑贮备液：量取126mL浓硫酸，缓缓加入到100mL水中，不断搅拌，冷却。另称取经磨细的钼酸铵10g溶于温度约60℃300mL水中，冷却。然后将硫酸溶液缓缓倒入钼酸铵溶液中。再加入0.5％石酸锑钾溶液100mL，冷却后，加水稀释至1000mL，摇匀，贮于棕色试剂瓶中，此贮备液含钼酸铵1％，硫酸2.25mol/L；

(7)钼锑抗显色剂：称取1.5g抗坏血酸溶于100mL钼锑贮备液中，此溶液有效期不长，宜用时现配；

(8)磷标准贮备液：准确称取经105℃下烘干2h的磷酸二氢钾0.4390g，用水溶解后，加入5mL浓硫酸，然后加水定容至1000mL，该溶液含磷100mg/L，放入冰箱可供长期使用；

(9)5mg/L磷标准溶液：吸取5mL磷贮备液，放入100mL容量瓶中，加水定容，该溶液用时现配。

2、实验步骤

(1)试样溶液制备

称取适量样品，精确至0.001g，置于500mL消煮管中(勿将样品粘附在瓶颈上)。先滴入少些水湿润样品，然后加6mL硫酸，轻轻摇匀并放置过夜。在管口放一弯颈小漏斗，在消煮炉上先250℃消煮(温度稳定后计时，时间约30min)，待H₂SO₄分解冒出大量白烟后再升高温度至400℃，当溶液呈均匀的棕黑色时取下。

稍冷后加10滴H₂O₂，摇匀，再加热至微沸，消煮约5min，取下稍冷后，重复加H₂O₂5-10滴，再消煮。如此重复3-5次，每次添加的H₂O₂的量应逐次减少，消煮到溶液呈无色或清亮，下部为灰白色后，再加热约5-10min，以除尽剩余的H₂O₂。

将消煮管取下，冷却。并用少量水冲洗弯颈漏斗，洗液流入消煮管。将消煮液无损的洗入100mL容量瓶中，用水定容，摇匀。过滤或放置澄清后供磷的测定。

(2)空白溶液制备

除不加试样外，应用的试剂和操作步骤同上。

(3)绘制标准曲线

分别吸取5mg/L磷标准溶液0、2、4、6、8、10、14、20mL于50mL容量瓶中，同时加入与显色测定所用的样品溶液等体积的空白溶液及二硝基酚指示剂2-3滴。并用10％碳酸钠溶液或5％硫酸溶液调节溶液至刚呈微黄色，准确加入钼锑抗显色剂5mL，摇匀，加水定容，即得含磷量分别为0.0、0.2、0.4、0.8、1.0、1.4、2.0、mg/L的标准溶液系列。摇匀，15℃以上温度放置30min后，在波长880nm处，测定其吸光度。在方格坐标纸上以吸光度为纵坐标，磷浓度(mg/L)为横坐标，绘制校准曲线。

(4)样品溶液中磷的测定

吸取待测样品溶液2-10mL(含磷0.04-1.0g)于50mL容量瓶中。加入二硝基酚指示剂2-3滴，并用10％碳酸钠溶液或5％硫酸溶液调节溶液至刚呈微黄色。准确加入5mL钼锑抗显色剂，摇匀，加水定容。在室温15℃以上条件下，放置30min。

显色的样品溶液在分光光度计上，用880nm、1cm光径比色皿，以空白试验为参比液调节仪器零点，进行比色测定，读取吸光度。从标准曲线上查得相应的含磷量。

3、结果计算

式中:

C——从校准曲线或回归方程求得的显色液中磷的质量浓度，μg/L；

C0——空白值

V——显色液体积；

D——分取倍数，消煮液定容体积/吸取消煮液体积；

m——称取试样质量，g；

1000——将单位mL换算为L的换算因数。所得结果应保留小数点后三位。

总磷含量测试实验结果如图7所示，在NP和LP条件下，转基因植株的地上部总磷含量和地下部总磷含量均高于WT植株。

水培表型如图8所示，相较于WT，转基因植株的根长增多，相较于WT，转基因植株的地上鲜重以及地下鲜重明显增加。

实施例四：全生育期土培磷高效表型鉴定

将GsMYB7转基因大豆于2024年8月种植于华南农业大学网室内，大豆品种为华春6号。实验条件：日均温28-32℃、日均日照10-12小时、相对湿度75-90％且伴有短时强降雨(50mm/h)的高温高湿强光胁迫的室外环境。

将大豆设置成以下处理组：低磷(Low Phosphorus，LP)处理实验组、正常磷(Normal Phosphorus，NP)处理对照组，其中，每组包括野生型(Wild type，WT)和转基因株系，WT作为组内对照(CK)，转基因株系具体包括Gm7A、Gm7C和Gm7H三个株系，每组设置3次重复。

处理组处理方法

低磷处理实验组：在苗期均匀喷洒含5μmol/L K₂HPO₄的1/2Hoagland溶液，在开花期、结荚期分别向根系灌溉含5μmol/L K₂HPO₄的1/2Hoagland溶液。正常磷处理组：在苗期均匀喷洒含500μmol/L K₂HPO₄的1/2Hoagland溶液，在开花期、结荚期分别向根系灌溉含500μmol/L K₂HPO₄的1/2Hoagland溶液。一共处理三次，喷洒一次，浇灌两次。苗期喷洒用量低磷和正常磷1/2Hoagland溶液分别7L左右，开花期、结荚期浇灌每次用量低磷和正常磷1/2Hoagland溶液分别15L。

待大豆成熟后拍照记录期生长情况，如图9所示，产量性状分析得：转基因植株单株荚数、底荚高度在LP处理下均高于对照组；在低磷(LP)和正常磷(NP)处理条件下，转基因株系Gm7H的百粒重显著高于对照组(CK)，其他株系无明显变化。主茎节数无明显变化，以上结果证明GsMYB7可以提高植物的耐低磷能力。

实施例五：苗期土培磷高效表型鉴定

将GsMYB7转基因大豆种植于华南农业大学试验网室内，大豆品种为华春6号。实验条件：日均温28-32℃、日均日照10-12小时、相对湿度75-90％且伴有短时强降雨(50mm/h)的高温高湿强光胁迫的室外环境。

将大豆设置成以下处理组：低磷(Low Phosphorus，LP)处理实验组、正常磷(Normal Phosphorus，NP)处理对照组，具体的，每组包括野生型(Wild type，WT)和转基因株系，WT作为组内对照(CK)，转基因株系具体包括Gm7A、Gm7C和Gm7H三个株系，每组设置3次重复。

处理组处理方法

低磷、正常磷处理实验组：在苗期均匀喷洒含5μmol/L K₂HPO₄的1/2Hoagland溶液。正常磷处理组：在苗期均匀喷洒含500μmol/L K₂HPO₄的1/2Hoagland溶液。

待大豆成熟后拍照记录期生长情况，实验结果如图10所示，在低磷(LP)和正常磷(NP)处理条件下，转基因株系的地上重量显著高于对照组(CK)。

上述实验的验证表明，GsMYB7基因可以增强大豆对低磷胁迫耐受性。GsMYB7基因过表达可使植株耐低磷能力增强。

GsMYB7基因序列及氨基酸序列

GsMYB7的基因序列如SEQ ID NO.1所示：

ATGGGAAGACCACCTTGCTGTGATAAAATTGGGATTAAGAAAGGGCCTTGGACTCCTGAGGAAGACA

TCATCTTGGTCTCTTACATTCAAGAACATGGACCCGGAAATTGGAGATCGGTTCCCAGTAACACAGG

TTTGATGAGATGCAGCAAAAGCTGCAGACTCAGATGGACCAACTATCTCCGACCTGGTATCAAACGA

GGCAATTTCACCGATCATGAAGAGAAAATGATAATCCACCTCCAAGCTCTTTTGGGTAACAGATGGG

CTGCTATAGCTTCCTACCTTCCACAAAGGACAGACAATGACATAAAGAACTATTGGAACACCCATTT

GAAGAAGAAGCTGAAGAAGATGCAAATTGGGGGTGGTAGTGATGATGATAATAATGATGACAAATCA

AACTCTTCTAACAATTCACAAATAAAGGGTCAATGGGAAAGAAGACTTCAAACAGATATCCACATGG

CCAAACAAGCCTTATGTGAGGCCCTATCTCTTGACAAACCAACCCAAATTTTCCCAGAGACCAAATT

ACCCTCCACTTCTTCACACCACCACCCCACAACAACAACAACACCAAACCAAACAACATCCTTGTAT

GCATCAAGCACAGAAAACATAGCCAGATTGTTGGAGAATTGGATGAAGAAATCACCAAATATGACGA

CCACGACGACAACAACAATGGAGACAAAACCCTTCAGCAATAATAACATGGTAATAACCACAGGGTC

TAGTTCTAGTGAGGGAACACAAAGCACAATCACATGCACACAGGAGTATGCCCTTGACTCCTTGTGG

AGCTTCAACTCTGAACGCTCTTCTCAATCTGAAGAAAACACCAACTTGGGTGAGAGCAAGCCACAGT

ACCAAGAGCCTCAAGAGACACAAGTCCCTCTCATGTTGCTGGAGAATTGGCTCTTTGATGATGCTGC

ACCTCAATGCAATGAAGATCTAATGAACATGTCACTCGAGGAAAGTACAGAAGGGTTGTTCTAA

GsMYB7基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：

MGRPPCCDKIGIKKGPWTPEEDI ILVSYIQEHGPGNWRSVPSNTGLMRCSKSCRLRWTNYLRPGIKR

GNFTDHEEKMIIHLQALLGNRWAAIASYLPQRTDNDIKNYWNTHLKKKLKKMQIGGGSDDDNNDDKSNS

SNNSQI KGQWERRLQTDI HMAKQALCEALSLDKPTQI FPETKLPSTSSHHHPTTTTTPNQTTSLYASST

ENIARLLENWMKKSPNMTTTTTTTMETKPFSNNNMVITTGSSSSEGTQSTITCTQEYALDSLWSFNSERSSQSEENTNLGESKPQYQEPQETQVPLMLLENWLFDDAAPQCNEDLMNMSLEESTEGLF*

以上所述的实施例仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明的保护范围，本领域的技术人员在发明的基础上所做的任何非实质性的变化和修改，均属于本发明的保护范围。

Claims

1.大豆耐低磷基因GsMYB7在提高大豆耐低磷胁迫能力中的应用，其特征在于：所述大豆耐低磷基因GsMYB7的核苷酸基因序列如SEQ ID NO.1所示，或所述大豆耐低磷基因GsMYB7编码如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

2.一种提高大豆耐低磷胁迫能力的方法，其特征在于，所述方法为提高受体大豆中SEQID NO.2所示的氨基酸序列的表达量；

其具体步骤包括：将SEQ ID NO.1所示的大豆耐低磷基因GsMYB7导入受体大豆，获得转基因大豆，所述转基因大豆的耐低磷胁迫能力高于所述受体大豆。

3.大豆耐低磷基因GsMYB7在培育耐低磷胁迫大豆中的应用，其特征在于：所述的大豆耐低磷基因GsMYB7的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；或所述的大豆耐低磷基因GsMYB7编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。