CN120399107A - 固定化d-泛解酸内酯水解酶融合蛋白生产d-泛解酸 - Google Patents

Abstract

本发明公开了固定化D‑泛解酸内酯水解酶融合蛋白生产D‑泛解酸，属于生物技术领域。本发明从籽用南瓜果肉这一农用废弃物中提取不溶性籽用南瓜酸性多糖PPFS3，同时提供一种碳水化合物结合模块与D‑泛解酸内酯水解酶连接构建的融合蛋白，该融合蛋白与籽用南瓜酸性多糖PPFS3具有特异性的结合能力，可以建立一种简便、低成本的固定化酶和重组蛋白纯化方法。形成的固定化融合蛋白可以用于D‑泛解酸的高效、连续生产。

Description

固定化D-泛解酸内酯水解酶融合蛋白生产D-泛解酸

技术领域

本发明涉及固定化D-泛解酸内酯水解酶融合蛋白生产D-泛解酸，属于生物技术领域。

背景技术

D-泛解酸是生产D-泛酸的重要中间体，制备D-泛解酸的方法有许多，目前工业主要通过D-泛解酸内酯水解酶Dlac拆分DL型泛解酸内酯中的D-泛解酸内酯得到。然而该方法存在固定化酶活性不高、人工操作强度大、固定化酶重复性不佳的问题。CBM是广泛存在于碳水化合物活性酶中，具有独立的折叠和功能的结构域，无催化活性但具有特异性结合特定碳水化合物(特别是不溶性底物)的活性，且特异性识别和结合底物能力达100％。近年来，CBM与蛋白质融合表达的策略已被证明在酶的一步纯化和固定化中是有效的。

籽用南瓜是以种子作为主要加工对象的栽培品种，目前我国年产量30-40万吨，位居世界首位。籽用南瓜富含蛋白质、氨基酸、脂肪酸、维生素、矿物质、类胡萝卜素和多糖等多种营养物质，具有极高的食用价值和药用价值。但该南瓜破瓜取籽后，果肉被遗弃田间或者直接焚烧，造成了大量的资源浪费且危害了生态环境，提高籽用南瓜副产物的价值能有效增加种植户的收入，对籽用南瓜产业发展也有重大意义。将籽用南瓜果肉进行处理后用于固定化生产D-泛酸，有助于提高籽用南瓜副产物的价值，并有望克服D-泛酸生产过程中固定化酶活性不高、人工操作强度大、固定化酶重复性不佳等技术难题。

发明内容

本发明从籽用南瓜果肉这一农用废弃物中提取不溶性籽用南瓜酸性多糖PPFS3，同时提供一种碳水化合物结合模块与D-泛解酸内酯水解酶连接构建的融合蛋白，该融合蛋白与籽用南瓜酸性多糖PPFS3具有特异性的结合能力，可以建立一种简便、低成本的固定化酶和重组蛋白纯化方法。形成的固定化融合蛋白可以用于D-泛解酸的高效、连续生产。

本发明提供了一种南瓜酸性多糖PPFS3，所述多糖PPFS3的单糖组成摩尔比为，(1.0-1.5)岩藻糖Fuc：(6.0-8.0)阿拉伯糖Ara：(7.5-11.0)鼠李糖Rha：(5.5-9.0)半乳糖Gal：(1.0-1.4)葡萄糖Glc：(0.5-0.8)木糖Xyl：(0.3-1.0)甘露糖Man：(60-100)半乳糖醛酸Gal-UA：(1.0-2.0)葡萄糖醛酸Glc-UA。

在某些实施方式中，岩藻糖(Fuc)、阿拉伯糖(Ara)、鼠李糖(Rha)、半乳糖(Gal)、葡萄糖(Glc)、木糖(Xyl)、甘露糖(Man)、半乳糖醛酸(Gal-UA)、葡萄糖醛酸(Glc-UA)以摩尔比为1.2:7.2:9.85:7.16:1.16:0.74:0.52:71.21:1.41结合。

在某些实施方式中，所述多糖PPFS3的峰位分子量为100000～300000Da，优选202873Da。

在某些实施方式中，所述多糖PPFS3的主要糖苷键连接方式为→6)-β-D-Galp-(1→6)-β-D-Galp-(1→6)-β-D-Galp-(1→3)-α-L-Rha-(1→4)-α-D-GalAp-(1→的糖苷键，而支链Ara，Gal片段通过→3,6)-β-D-Galp-(1→的O-3键，→3,4)-α-L-Rha-(1→的O-3键和连接在主链上，所述的PPFS3的结构单元如下：

在某些实施方式中，Rha、Gal、Glc、Xyl、Man、Gal-UA、Glc-UA是PPFS3的主要单糖组分。在多糖中主要以Araf-(1→、Rhap-(1→、Xylp-(1→、Glcp-(1→、Manp-(1→、Galp-(1→、→4)-Xylp-(1→、→3,4)-Rhap-(1→、→4)-Galp-(1→、→4)-Glcp-(1→、→3)-Galp-(1→、→6)-Galp-(1→、→3,4)-Galp-(1→、→2,4)-Manp-(1→、→3,4)-Manp-(1→、→4,6)-Galp-(1→、→3,6)-Galp-(1→连接形式存在，他们的摩尔比为0.098：0.022：0.016:0.01：0.035：0.053:0.017：0.009:0.038：0.067：0.039：0.168：0.038：0.01：0.014：0.01：0.015。

本发明还提供了所述多糖PPFS3的制备方法，所述方法包括以下步骤：

(1)将南瓜去籽后洗净、切片、烘干、粉碎；

(2)将粉碎的南瓜与深共熔溶剂混合，经超声辅助提取，获得多糖；

(3)将步骤(2)得到的多糖依次经过醇沉、抽滤、去蛋白、醇沉、透析、干燥后，得到南瓜粗多糖；

(4)将步骤(3)得到的南瓜粗多糖经阴离子交换柱和凝胶过滤柱纯化，得到多糖PPFS3。

在某些实施方式中，步骤(1)将南瓜粉碎后，可过212μm孔径的筛子。

在某些实施方式中，步骤(2)所述深共熔溶剂是以氯化胆碱为受氢体(HBA)，柠檬酸、尿素、1,4-丁二醇或乳酸为供氢体(HBD)；HBD与HBA摩尔比为(2:1)～(7:1)，深共熔溶剂水分含量为10％～50％。

在某些实施方式中，粉碎的南瓜与深共熔溶剂混合的料液比为(1：10)～(1：60)(g/mL)。

在某些实施方式中，所述超声辅助提取的条件为：超声波功率120～240w，提取时间为10～60min，温度为40～70℃。

在某些实施方式中，步骤(3)所述醇沉为加入终浓度为50～90％的无水乙醇，于4～20℃静置12h以上。

在某些实施方式中，步骤(3)所述透析为，用截留分子量为8000～14000Da的透析膜反应12～48h。

在某些实施方式中，步骤(3)所述去蛋白为，加入3-5％三氯乙酸，静置过夜后离心去除沉淀蛋白。

本发明提供了用多糖PPFS3特异性结合D-泛解酸内酯水解酶的方法，所述方法为在毕赤酵母GS115中融合表达D-泛解酸内酯水解酶和CBM结合模块，利用CBM和多糖PPFS3的特异性结合作用实现D-泛解酸内酯水解酶与多糖PPFS3的特异性结合，实现了融合蛋白的胞外过表达、一步纯化和固定化并实现D-泛解酸的高效、连续生产。

在某些实施方式中，所述融合表达D-泛解酸内酯水解酶和CBM结合模块为：

(1)所述CBM结合模块为CBM60，来自于Clostridium cellulovorans 743B(CP002160.1)，合成具有刚性连接子的CBM60结合模块的编码序列(SEQ ID No.1所示)，并将其插入携带D-泛解酸内酯水解酶编码序列(SEQ ID No.3所示)的pPIC9K载体，以构建得到pPIC9K-CBM60-Dlac；其中，CBM60连接至Dlac的C端；所述CBM60的氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示，所述Dlac的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示；

(2)用SacI对pPIC9K-CBM60-Dlac进行线性化处理，然后将其转化至Pichiapastoris GS115感受态细胞中，筛选得到阳性克隆子GS115-pPIC9K-CBM60-Dlac；

(3)对阳性克隆子GS115-pPIC9K-CBM60-Dlac进行高密度发酵，并利用甲醇诱导，获得含有大量融合酶CBM60-Dlac的发酵上清；

(4)收集阳性克隆子发酵液的上清液，用于制备固定化融合蛋白。

本发明提供了利用多糖PPFS3固定化D-泛解酸内酯水解酶实现连续水解D-泛解酸内酯的方法。

在某些实施方式中，构建多糖PPFS3固定化融合蛋白填充床反应器，填充床反应器中装设有聚砜中空纤维膜，所述聚砜中空纤维膜设有梯度孔，所述梯度孔为孔径沿所述聚砜中空纤维膜径向截面从外表层到内表层梯度增大的微纳珠状网络结构，且所述聚砜中空纤维膜孔中填充有PPFS3。聚砜中空纤维膜外表层的孔径为0.01～2.0μm，内表层与外表层的孔径之比为10:1～200:1，孔隙率为40～80％。以GS115-pPIC9K-CBM60-Dlac为菌种经高密度发酵获得含有大量融合酶CBM60-Dlac的发酵上清，将发酵上清与填充在聚砜中空纤维膜中的多糖PPFS3混合反应，利用多糖PPFS3吸附融合酶即可快速实现一步纯化、固定化D-泛解酸内酯水解酶的制备。

在某些实施方式中，包括如下步骤：

(1)将多糖PPFS3填充至装在填充床反应器的聚砜中空纤维膜中，即得PPFS3聚砜膜填充床反应器，多糖PPFS3的装填量为0.3-0.8g/g中空纤维膜；

(2)将含有融合D-泛解酸内酯水解酶CBM60-Dlac的发酵上清液加载到PPFS3聚砜膜填充床反应器中，然后在35℃下保温孵育，使发酵上清液中的CBM60-Dlac在填充床反应器中被多糖PPFS3充分吸附，孵育结束后，用Tris-HCl缓冲液平衡填充床反应器，以除去未结合的Dlac-CBM和其他杂蛋白，获得固定化D-泛解酸内酯水解酶填充床反应器。融合D-泛解酸内酯水解酶CBM60-Dlac的装载量为150～200U/g PPFS3；

(3)向步骤(2)所述固定化D-泛解酸内酶水解酶填充床反应器中添加DL-泛解酸内酯溶液进行反应。

在某些实施方式中，步骤(2)中，发酵上清液的流速是20～40mL/min，发酵上清液的酶活是500-1200U/mL。

在某些实施方式中，步骤(2)中，孵育时间为30～100min。

在某些实施方式中，步骤(2)中，孵育结束后，用600mM、pH 7.5的Tris-HCl缓冲液以10mL/min的流速平衡填充床反应器。

在某些实施方式中，步骤(3)中，将DL-泛解酸内酯溶液流经所述填充床反应器，其中含有未反应的DL-泛解酸内酯溶液流回填充床反应器。

在某些实施方式中，步骤(3)中，DL-泛解酸内酯溶液的流速为20～50mL/min，DL-泛解酸内酯溶液的浓度为15～50g/L。

在某些实施方式中，步骤(3)中，填充床反应器的反应液pH始终维持在7.0～7.5之间。

在某些实施方式中，步骤(3)中，填充床反应器的温度控制在25～40℃。

在某些实施方式中，步骤(3)中，CBM60-Dlac的浓度优选为0.1-10mg/mL。

在某些实施方式中，步骤(3)所述反应中，当D-泛解酸内酯浓度低于30g/L时，补加(90～150)g/L的DL-泛解酸内酯溶液使得D-泛解酸内酯浓度不低于40g/L。

有益效果：

(1)从籽用南瓜果肉中提取得到的南瓜酸性多糖PPFS3具有特殊活性，与D-泛解酸内酯水解酶融合蛋白具有特异性的结合能力用于D-泛解酸的高效、连续生产。反应器在连续运行1000h后保留28％以上的水解率。

(2)成本低，不采用商品化固定化酶，依靠酶与吸附剂发生物理吸附作用或弱化学吸附作用，有效提高酶活性，并且反应中酶不易漏出，也不造成额外的环境污染。

(3)本发明提供的固定化D-泛解酸内酯水解酶填充床反应器生产成本大幅降低，无需反复拆卸安装，因而也节约了拆装时间，提高了生产效率，产生良好的经济和社会效益。

附图说明

图1是PPFS3的GPC色谱图；

图2是PPFS3的离子色谱图；

图3是PPFS3的GC-MS色谱图；

图4是PPFS3的1HNMR图谱；

图5是PPFS3的13C NMR图谱；

图6是PPFS3的Dept135图谱；

图7是PPFS3的HH-COSY图谱；

图8是PPFS3的HSQC图谱；

图9是PPFS3的HMBC图谱；

图10是PPFS3的NOESY图谱；

图11为质粒pPIC9K-CBM60-Dlac；

图12为本发明固定化融合蛋白填充床反应器生产D-泛解酸的流程图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步的阐述。对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。

实施例1籽用南瓜酸性多糖PPFS3的制备和性质表征

1、籽用南瓜酸性多糖PPFS3的制备：

(1)将南瓜去籽后洗净，切成薄片，放入烘箱中烘干，烘干后利用粉碎机粉碎成粉末，过212μm孔径的筛子。

(2)将过筛后细粉按合适的料液的重量体积比加入深共熔溶剂，采用超声波辅助在一定时间和温度下进行粗多糖提取得到提取液。深共熔溶剂是以氯化胆碱为受氢体(HBA)，1,4-丁二醇为供氢体(HBD)制备，HBD与HBA摩尔比为4:1，深共熔溶剂水分含量为30％，液料比为40:1(mL/g)，超声波功率为180w，提取时间为40min，温度为40℃。

(3)将提取液进行室温冷却，冷却后加入终浓度为80％的无水乙醇置于4℃冰箱中醇沉12h以上，离心(8000r/min,10min)，取沉淀用去离子水进行复溶，抽滤得到籽用南瓜粗多糖水溶液，加入3-5％三氯乙酸，静置过夜后离心去除沉淀蛋白，加入终浓度为80％无水乙醇，静置过夜，离心，取下层沉淀经纯水复溶后用8000～14000Da透析膜透析12h，透析液冷冻干燥，即为籽用南瓜粗多糖PFFS。

(4)将粗多糖过阴离子交换柱阴离子交换柱和凝胶过滤柱纯化，具体方式如下：

DEAE-52纤维素柱层析：

将步骤(3)得到的粗多糖PFFS溶于超纯水中(浓度为5mg/mL)，搅拌至完全溶解，随后将溶液在室温下通过蠕动泵(BT01-100)调节上样速度为10s/滴进样，开始进样后按5mL/管收集流出液，待所有多糖溶液进样完毕后，依次用去离子水、NaCl溶液(浓度为0.00mol/L)、0.10mol/L、0.20mol/L、0.30mol/L、0.50mol/L和1.00mol/L的NaCl溶液进行梯度洗脱。收集0.2M NaCl洗脱部分，转移至8000-14000Da透析袋中去离子水透析12h。透析完毕后收集透析液经冷冻干燥后获得纯化组分。

Sephadex G-100葡聚糖凝胶柱层析：

将上述纯化组分溶于超纯水中(5mg/mL)，随后将溶液在室温下通过蠕动泵(BT01-100)调节上样速度为10s/滴进样，开始进样后按5mL/管收集流出液，待所有多糖溶液进样完毕后以去离子水为洗脱液进行洗脱，洗脱液转移至8000-14000Da透析袋中用去离子水透析24h。透析完毕后收集透析液经冷冻干燥后获得纯化组分PPFS3。

如附图1所示，上述方法制备的PPFS3经HPGPC分离后只得到一个单峰，PPFS3MN和MW比值≈1说明其分布均匀，纯度高。

2、籽用南瓜酸性多糖PPFS3的结构分析

(1)PPFS3单糖组成

采用离子色谱法进行PPFS3单糖组成测定，其离子色谱图如附图2所示，单糖组成分析结果表明，PPFS3是由岩藻糖(Fuc)、阿拉伯糖(Ara)、鼠李糖(Rha)、半乳糖(Gal)、葡萄糖(Glc)、木糖(Xyl)、甘露糖(Man)、半乳糖醛酸(Gal-UA)、葡萄糖醛酸(Glc-UA)九种单糖组成其摩尔比为1.2:7.2:9.85:7.16:1.16:0.74:0.52:71.21:1.41。

(2)甲基化分析

PPFS3经甲基化、水解、还原、和乙酰化处理后进行GC-MS分析，其GC-MS色谱图见附图3，结合PPFS3的单糖组成及标准质谱图库对含量较高的峰进行归属，甲基化分析结果见表1。

表1多糖甲基化结果分析

甲基化结果表明PPFS3的主要单糖组分，在多糖中主要以Araf-(1→、Rhap-(1→、Xylp-(1→、Glcp-(1→、Manp-(1→、Galp-(1→、→4)-Xylp-(1→、→3,4)-Rhap-(1→、→4)-Galp-(1→、→4)-Glcp-(1→、→3)-Galp-(1→、→6)-Galp-(1→、→3,4)-Galp-(1→、→2,4)-Manp-(1→、→3,4)-Manp-(1→、→4,6)-Galp-(1→、→3,6)-Galp-(1→连接形式存在，他们的摩尔比为0.098：0.022：0.016：0.01：0.035：0.053:0.017：0.009:0.038：0.067：0.039：0.168：0.038：0.01：0.014：0.01：0.015。

(3)PPFS31H NMR分析

如附图4所示，氢谱信号主要集中在3.0～6.0ppm之间。δ3.2-4.0ppm为糖环质子信号，主要端基质子峰δ4.87、4.60、5.16、4.98、4.41、4.97、4.44、4.88、4.83的信号峰集中分布在4.3～6.0ppm区域内。

(4)PPFS313C NMR分析

如附图5所示，核磁碳谱信号主要集中在60-120ppm之间。通过观察碳谱，可以看到主要异头碳信号峰δ105.14、106.10、104.69、110.62、108.77、100.38、101.34、98.81、101.17异头碳区域主要在δ93～180之间。而δ71.69、69.77、74.80、74.81、72.16、73.93、74.96、69.79、

71.31、81.50、69.82、74.81、82.62、77.97、85.22、62.64、82.70、77.80、85.10、62.33、69.40、70.05、79.15、72.65、72.70、82.55、80.28、71.83、72.60、77.00、79.90、71.30、69.60、75.93、72.10、69.91主要信号峰分布在60～180ppm区域。

(5)PPFS3DEPT分析

如附图6所示，发现δ62.44、70.76、70.76、62.64、62.33倒峰，表明为C6或C5的信号峰。

(6)PPFS3HSQC分析

如附图8所示，可以观察到异头碳信号为δ110.61，HSQC图谱中对应的异头氢信号是δ5.16，通过HH-COSY，H1-2的信号为5.17/4.13；H2-3的信号为4.13/3.87；H3-4的信号为3.87/4.06；H4-5a的信号为4.06/3.76；我们可以推断出H1，H2，H3，H4，H5a分别为δ5.17、4.13、3.87、4.06、3.76。对应的C1-C5为110.62、82.62、77.97、85.23、62.64；因此，该信号应归属于糖苷键α-L-Araf-(1→。

通过HSQC图谱，可以观察到异头碳信号为δ104.69，HSQC图谱中对应的异头氢信号是δ4.44，通过HH-COSY，H1-2的信号为4.41/3.57；H2-3的信号为3.57/3.68；H3-4的信号为3.68/4.05；H4-5的信号为4.05/3.87；H5-6a的信号为3.87/3.96我们可以推断出H1，H2，H3，H4，H5，H6a分别为δ4.44、3.57、3.68、4.05、3.87、3.96。对应的C1-C5为104.69、71.31、81.50、69.82、74.81、70.76；因此，该信号应归属于糖苷键→3,6)-Galp-(1→。

根据类似规律并结合HMBC和NOESY，对所有糖苷键信号进行归属，如表2：

表2：碳、氢信号归属

(7)PPFS3NOESY分析

如附图10所示，糖苷键→6)-β-D-Galp-(1→的异头氢与其→3,6)-β-D-Galp-(1→的H6有相关信号峰；表明存在→6)-β-D-Galp-(1→3,6)-β-D-Galp-(1→的链接方式。糖苷键→6)-β-D-Galp-(1→的异头氢与→3,6)-β-D-Galp-(1→的H6有相关信号峰；表明存在→6)-β-D-Galp-(1→3,6)-β-D-Galp-(1→的链接方式。糖苷键→3,6)-β-D-Galp-(1→的异头氢与其→3,4)-α-L-Rha-(1→的H3有相关信号峰；表明存在→3,6)-β-D-Galp-(1→3,4)-α-L-Rha-(1→的链接方式。糖苷键→3,4)-α-L-Rha-(1→的异头氢与其→3,4)-α-D-GalAp-(1→的H3有相关信号峰；表明存在→3,4)-α-L-Rha-(1→3,4)-α-D-GalAp-(1→的链接方式。糖苷键→3,4)-α-D-GalAp-(1→的异头氢与其→4)-α-D-GalAp-(1→的H4有相关信号峰；表明存在→3,4)-α-D-GalAp-(1→4)-α-D-GalAp-(1→的链接方式。糖苷键→4)-α-D-GalAp-(1→的异头碳与其自身的H4有相关信号峰；表明存在→4)-α-D-GalAp-(1→4)-α-D-GalAp-(1→的链接方式。α-L-Araf-(1→的异头氢与其→3,6)-β-D-Galp-(1→的H3有相关信号峰；表明存α-L-Araf-(1→3,6)-β-D-Galp-(1→的链接方式。糖苷键β-D-Galp-(1→的异头氢与其→3,6)-β-D-Galp-(1→的H3有相关信号峰；表明存在β-D-Galp-(1→3,6)-β-D-Galp-(1→的链接方式。糖苷键α-L-Rha-(1→的异头氢与其→3,4)-α-L-Rha-(1→的H4有相关信号峰；表明存在α-L-Rha-(1→3,4)-α-L-Rha-(1→的链接方式。α-L-Araf-(1→的异头氢与其→3,4)-α-L-Rha-(1→的H4有相关信号峰；表明存在α-L-Araf-(1→3,4)-α-L-Rha-(1→的链接方式。

实施例2菌株GS115-pPIC9K-Dlac-CBM的高密度表达及固定化融合蛋白填充床反应器的制备方法

1、重组菌GS115-pPIC9K-CBM60-Dlac的构建及Dlac-CBM酶的表达

pPIC9K-Dlac质粒来源：公开在专利文件CN112553226A一种毕赤酵母基因工程菌及其制备D泛解酸内酯水解酶的方法。合成含有刚性连接肽编码序列的CBM60(如SEQ IDNo.1所示)，利用重叠延伸PCR技术将该模块插入至Dlac核酸序列的C端。通过同源重组策略将融合基因片段克隆至毕赤酵母表达载体pPIC9K多克隆位点中EcoR I和Not I之间，成功构建重组质粒pPIC9K-CBM60-Dlac。用SacI对pPIC9K-CBM60-Dlac进行线性化处理，然后将其转化至Pichia pastoris GS115感受态细胞中，筛选得到阳性克隆子GS115-pPIC9K-CBM60-Dlac。

高密度发酵方法和培养基配方参照毕赤酵母发酵工艺指南(Invitrogen)。简单地说，将单个GS115-pPIC9K-CBM60-Dlac接种于10mLYPD(蛋白胨20.0g，酵母浸粉10.0g，葡萄糖20.0g，琼脂15.0g，添加1L蒸馏水，pH6.5±0.2)培养基中，于28℃、220rpm振荡培养12h。然后，将10mL种子液接种到200毫升YPD培养基中培养24h获得二级种。将二级种接种到装有1升BSM培养基的3L发酵罐中，pH控制在5.0-6.0，温度28-30℃，搅拌速度为500rpm，通气比为1-1.5vvm，培养至溶氧DO反弹，在DO反弹后的4-6h内缓慢加入50％(w/v)的甘油120ml。当溶氧再次反弹后，将细胞饥饿1.5-2h，然后控制溶氧不低于20％，缓慢加入120mL 100％甲醇，调节pH至5.5，转速保持在800rpm诱导表达5d。发酵结束，通过离心或者过滤的手段除去菌体，收集发酵上清液即为融合D-泛解酸内酯水解Dlac-CBM粗酶液，经检测，粗酶液的酶活是760.1U/mL，酶蛋白含量是1.8mg/mL，比酶活是422.27U/mg。CBM60序列以及质粒pPIC9K-CBM60-Dlac示意图见图11。

2、填充PPFS3的聚砜膜中空纤维膜反应器的构建

填充床反应器中装设有聚砜中空纤维膜，所述聚砜中空纤维膜设有梯度孔，所述梯度孔为孔径沿所述聚砜中空纤维膜径向截面从外表层到内表层梯度增大的微纳珠状网络结构，且所述聚砜中空纤维膜孔中填充有PPFS3。聚砜中空纤维膜外表层的孔径为1.0μm，内表层与外表层的孔径之比为10:1～200:1，孔隙率为70％。

将多糖PPFS3填充至装在填充床反应器的聚砜中空纤维膜中，即得PPFS3聚砜膜填充床反应器，多糖PPFS3的装填量为0.6g/g中空纤维膜。

3、PPFS3固定化D-泛解酸内酯水解酶聚砜膜中空纤维膜反应器的构建

将GS115-pPIC9K-CBM60-Dlac上罐发酵液12000×g离心10min并将上清用0.45μm滤膜过滤后，将其通过蠕动泵加载到填充了PPFS3聚砜膜中空纤维膜反应器中，将反应器在35℃下孵育约90min，使CBM60-Dlac完全吸附到PPFS3上，以废液中的蛋白浓度不再变化为准；将反应器用Tris-HCl缓冲液(0.6mM，pH 7.5)以1mL/min的速率平衡以去除未结合的CBM60-Dlac和其他蛋白质。最后，如图12所示，构建了PPFS3固定化D-泛解酸内酯水解酶聚砜膜中空纤维膜反应器。

实施例3连续水解D-泛解酸内酯

蠕动泵将150mL浓度为40g/L的DL-泛解酸内酯(DL-PL)底物溶液以30ml/min的速率源源不断地加入反应器当中，并且在出液口形成循环，未反应的DL-PL将被再次通入反应器当中，在其路径上不断被固定化融合蛋白水解，整个反应过程由温控装置控制在35℃左右，同时为保证反应液中pH始终维持在7.0-7.5之间，使用pH自动控制加液系统流加氨水。当D-泛解酸内酯浓度低于30g/L时候，添加100g/L的高浓度DL-泛解酸内酯溶液使得D-泛解酸内酯浓度为40g/L，继续进行水解反应。通过考马斯亮兰法(Bradford法)测定反应液中蛋白浓度(0.08mg/mL)，确定聚砜膜没有使酶漏出，由于CBM60和PPFS3的特异性结合识别作用使酶和纤维素结合十分紧密，同时在聚砜膜特别的防漏结构，其中PPFS3固定化酶也减少了一定的活动，因此不会导致酶泄漏。

结果是：反应器连续运行1000h，对D-泛解酸内酯的水解率保持在28％以上。

对比例1：

具体实施方式如实施例1，区别在于，改变南瓜多糖的提取方法为：新鲜南瓜清洗、切块后打成浆(1600g南瓜浆与4800mL水混合)。85℃水浴提取4h，离心取上清液。采用Sevag法去除游离蛋白质。加入4倍体积无水乙醇(4℃静置12h)，离心获得沉淀。透析(截留分子量8000–14,000Da)72h后冻干，得到粗多糖CMDP，产率为1.60％(w/w)，所得到的南瓜多糖的单糖组成仅含葡萄糖(Glc)，为中性多糖。主链结构为→4)-α-D-Glcp-(1→，C-6位连接α-Glcp-(1→分支。参照实施例3的方法，将得到的南瓜多糖用于水解D-泛解酸内酯，结果如下：

反应器总共可以连续运行420h，对D-泛解酸内酯的水解率均值为24.3％；延长运行时间，固定化酶无法进行水解D-泛解酸内酯，分析其原因可能是结构中的葡萄糖单糖与融合蛋白的特异性结合效果不如PPFS3明显，且中性多糖对于D-泛解酸内酯水解产生的D-泛解酸耐受性不足，使得多糖发生变性，进一步限制了反应器的运行效率。

对比例2：

具体实施方式如实施例1，区别在于，改变南瓜多糖的提取方法为：粉碎的南瓜用1MNaOH溶液浸泡，固液比1：30(w/v)，50℃搅拌4h。离心8000r/min，15min，收集上清液。Sevag法去除蛋白质。加入乙醇至终浓度80％(v/v)，4℃静置12h，8000r/min离心25min得粗多糖。粗多糖通过DEAE Sepharose Fast Flow柱层析：洗脱液：0、0.1、0.2、0.3、0.5M NaCl溶液，分段收集。目标组分：0.2M NaCl洗脱部分，经透析(截留分子量1000Da)、冻干得纯化多糖PPc。产率：从粗多糖中纯化得PPc 1.25g(1.25％)。单糖组成：鼠李糖(Rha):半乳糖醛酸(GalA):半乳糖(Gal):阿拉伯糖(Ara)＝7.4:25:28:2.6。主链结构：→4)-α-GalpA-(1→2)-α-Rhap-(1→交替连接。侧链结构：β-1,4-Gal侧链(部分C-3连接α-Ara)。参照实施例3的方法，将得到的南瓜多糖用于水解D-泛解酸内酯，结果如下：

反应器连续运行1000h，对D-泛解酸内酯的水解率均值为21.5％。分析其原因可能是此案例中多糖结构不如PPFS3丰富，PPFS3中丰富的单糖种类与糖苷键连接方式使得其与融合蛋白的特异性结合更加稳定，且进一步保护了融合蛋白的有利构象，从而有利于反应器的运行。

对比例3：

具体实施方式参考实施例2，区别在于，改变CBM60为来自Ruminiclostridiumthermocellum(CCV01467.1)的CBM 67，其核酸序列如SEQ ID NO.5所示。构建GS115-pPIC9K-CBM67-Dlac进而得到PPFS3固定化D-泛解酸内酯水解酶聚砜膜中空纤维膜反应器，反应器运行1000h，对D-泛解酸内酯的水解率均值为12.0％，分析其原因可能是CBM67与Dlac结合形成的融合蛋白活性不高，难以维持D-泛解酸内酯的高水解率。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种南瓜酸性多糖PPFS3，其特征在于，所述多糖PPFS3的单糖组成摩尔比为，

(1.0-1.5)岩藻糖Fuc：(6.0-8.0)阿拉伯糖Ara：(7.5-11.0)鼠李糖Rha：(5.5-9.0)半乳糖Gal：(1.0-1.4)葡萄糖Glc：(0.5-0.8)木糖Xyl：(0.3-1.0)甘露糖Man：(60-100)半乳糖醛酸Gal-UA：(1.0-2.0)葡萄糖醛酸Glc-UA。

2.如权利要求1所述多糖PPFS3，其特征在于，所述多糖PPFS3的单糖组成摩尔比为：1.2岩藻糖Fuc：7.2阿拉伯糖Ara：9.85鼠李糖Rha：7.16半乳糖Gal：1.16葡萄糖Glc：0.74木糖Xyl：0.52甘露糖Man：71.21半乳糖醛酸Gal-UA：1.41葡萄糖醛酸Glc-UA。

3.如权利要求1所述多糖PPFS3，其特征在于，所述多糖PPFS3的峰位分子量为100000-300000Da；所述多糖PPFS3的结构单元为：

4.制备权利要求1～3任一所述多糖PPFS3的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将南瓜去籽后洗净、切片、烘干、粉碎；

(2)将粉碎的南瓜与深共熔溶剂以(1：10)～(1：60)g/mL混合，经超声辅助提取，获得多糖；所述超声辅助提取是在超声120～240w，40～70℃的条件下，提取10～60min；

(3)将步骤(2)得到的多糖依次经过醇沉、抽滤、去蛋白、醇沉、透析、干燥后，得到南瓜粗多糖；

(4)将步骤(3)得到的南瓜粗多糖经阴离子交换柱和凝胶过滤柱纯化，得到多糖PPFS3。

5.如权利要求4所述方法，其特征在于，步骤(2)所述深共熔溶剂含有受氢体HBA和供氢体HBD；所述HBA包括氯化胆碱，所述HBD包括柠檬酸、尿素、1,4-丁二醇或乳酸；所述HBD与HBA摩尔比为(2:1)～(7:1)。

6.如权利要求5所述方法，其特征在于，步骤(3)所述透析的截留分子量为8000-14000Da，透析12～48h。

7.利用权利要求1～3任一所述多糖PPFS3水解D-泛解酸内酯的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)构建多糖PPFS3固定化融合蛋白填充床反应器；所述填充床反应器中装设有聚砜中空纤维膜，将多糖PPFS3以0.3～0.8g/g中空纤维膜的装填量添加至所述填充床反应器中；

(2)向步骤(1)所述填充床反应器中以150～200U/g PPFS3的装载量添加融合酶CBM60-Dlac，获得固定化D-泛解酸内酯水解酶填充床反应器；所述融合酶CBM60-Dlac是将CBM60连接至Dlac的C端获得；所述CBM60的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，所述Dlac的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示；

(3)向步骤(2)所述固定化D-泛解酸内酶水解酶填充床反应器中，以15～50g/L的浓度、20～50mL/min的流速添加DL-泛解酸内酯溶液进行反应；所述反应的pH为7.0～7.5。

8.如权利要求7所述方法，其特征在于，步骤(2)中，将融合酶CBM60-Dlac装载至反应器中，于25～40℃孵育30-100min。

9.如权利要求8所述方法，其特征在于，步骤(3)所述反应中，当D-泛解酸内酯浓度低于30g/L时，补加90～150g/L的DL-泛解酸内酯溶液使得D-泛解酸内酯浓度不低于40g/L。

10.如权利要求9所述方法，其特征在于，步骤(3)所述反应中，CBM60-Dlac的浓度为0.1～10mg/mL。