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CN120346163A - 水包油乳液 - Google Patents

水包油乳液

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CN120346163A
CN120346163A CN202410089002.6A CN202410089002A CN120346163A CN 120346163 A CN120346163 A CN 120346163A CN 202410089002 A CN202410089002 A CN 202410089002A CN 120346163 A CN120346163 A CN 120346163A
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CN
China
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oil
antigen
water emulsion
emulsion
lipid
Prior art date
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Application number
CN202410089002.6A
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English (en)
Inventor
夏宇飞
马光辉
宋畑畑
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Institute of Process Engineering of CAS
Original Assignee
Institute of Process Engineering of CAS
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Publication date
Application filed by Institute of Process Engineering of CAS filed Critical Institute of Process Engineering of CAS
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Priority to PCT/CN2025/073731 priority patent/WO2025157144A1/zh
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Abstract

本申请提供了一种水包油乳液，其包括油相和水相，所述水相包括：1‑100mg/mL的PEG脂质或脂质类物质，和10‑1000μg/mL的抗原或10‑10000μg/mL的天然蛋白或者100‑10000μg/mL的抗体；以及所述油相包括：50‑1000μg/mL的阳离子聚合物或可电离脂质或蛋白，所述阳离子聚合物或可电离脂质或蛋白的pKa小于6.8，和基于水包油乳液体积计的1‑25v/v％的可代谢油脂；其中所述水包油乳液的杨氏模量为20‑800MPa；所述水包油乳液中乳滴的平均粒径为50‑800nm。

Description

水包油乳液
技术领域
本申请属于生物医药领域，具体涉及药物递送，尤其是对于黏膜的渗透和递送。
背景技术
现有的疫苗或者药物无法达到预期的免疫效果，例如COVID-19疫苗，包括腺病毒载体疫苗，RNA疫苗，灭活或减毒疫苗以及亚单位疫苗，皮下注射后，虽然血清中产生了显著的结合抗体和中和抗体，病毒依然可以感染呼吸道黏膜，进而在人群中传播，因此需要黏膜免疫预防黏膜病毒入侵，实现真正的免疫保护。然而对于黏膜免疫来说，由于存在黏液和纤毛等结构，能够快速清除外来抗原或者药物，从而导致了极低的免疫或者治疗效果。此外，即使有少数的抗原或者药物保留下来，黏膜上皮细胞间的紧密连接也不利于其进一步递送。综上，对于黏膜病毒来说，包括呼吸道黏膜，阴道黏膜等，合理化设计的疫苗或者药物载体，除了具备高效的药物或者抗原以及生物活性成分的装载效率、良好的生物安全性以外，还必须有强效的黏液稳定性、延长的黏膜停留时间和穿过黏膜上皮细胞间隙的能力，以实现高效的黏膜递送或黏膜免疫效果。
对于柔性乳液穿过细胞紧密连接间隙富集至特定组织，已申请的专利CN112999154B公开了一种可发生柔性形变的白蛋白水包油乳液的制备方法及应用。该体系中利用白蛋白作为水相，以及角鲨烯等作为油相，超声制备得到水包油乳液，该体系中的乳液具备良好的形变能力，在组织间质压的作用下能过穿过细胞间隙，从而富集至特定组织。因此水包油乳液体系解决了细胞紧密连接间隙难以穿过的问题。但是该体系的黏膜递送尚未有研究，对于黏膜递送来说，首要解决的问题是躲避黏液和纤毛的清除，以及停留时间的延长。
目前已经公开的黏膜疫苗递送系统，分为细胞或者病毒载体重组蛋白纯化或者多肽抗体以预防或者治疗流感、胃肠炎，幽门螺旋杆菌感染或者HIV等。例如专利CN114806994A公开了表达SAT2型口蹄疫病毒结构蛋白VP1的枯草芽孢杆菌及应用，该发明将表达SAT2型口蹄疫病毒结构蛋白VP3的重组质粒转化至枯草芽孢杆菌WB800N，对于口蹄疫病毒感染具有良好的免疫效果。还可以作为黏膜疫苗，经口服免疫后，产生较高水平的抗原特异性IgG抗体及黏膜sIgA抗体以及细胞免疫响应。但是这些专利都同样忽略了黏膜黏液纤毛清除和停留时间的关键性问题。
目前广泛采用壳聚糖颗粒稳定乳液，从而使得乳液携带正电荷，能够延长其黏膜停留时间，或者瞬时打开细胞紧密连接。例如，CN111617241A和CN107625961A，提供了一种壳聚糖纳米颗粒黏膜免疫佐剂。这两项专利中强调了壳聚糖纳米粒的延长黏附时间和通过黏膜上皮的作用。但是携带正电荷的壳聚糖颗粒在上皮细胞上层的黏液和纤毛中是无法稳定存在的，因此其极有可能被清除或者破坏，其免疫或者治疗效果是大打折扣的。除此之外，CN113679831A中公开了一种注射用水包油型乳剂黏膜疫苗。所述注射用水包油型乳剂黏膜疫苗包括：初乳、全反式维甲酸、金属离子化合物、抗原。该发明在体系中加入黏膜佐剂全反式维甲酸，通过注射免疫的方式，实现黏膜免疫。从免疫方式上就避开了黏膜免疫中要克服的困难，结合COVID-19疫苗的应用，相比于注射免疫，黏膜免疫才能够实现真正的免疫保护。
因此，提供一种根据疫苗或药物制剂的需求来进行设计、优化以增强药物或者疫苗在黏膜组织中稳定存在和黏膜黏附效果，对于黏膜病原感染和黏膜系统疾病而言具有重要意义。
目前本领域中关注细胞紧密连接间隙的穿透，而没有涉及黏膜体系中黏液纤毛清除和黏膜黏附增强以及穿过紧密连接三者同时满足的黏膜递送系统。本发明成功构建了此体系，以用于生物医药领域黏膜病原感染或者黏膜系统疾病的预防和治疗。
发明内容
第一方面，本申请提供了一种水包油乳液，其包括油相和水相，
所述水相包括：1-100mg/mL的PEG脂质或脂质类物质，和10-1000μg/mL的抗原或10-10000μg/mL的天然蛋白或者100-10000μg/mL的抗体；以及所述油相包括：50-1000μg/mL的阳离子聚合物或可电离脂质或蛋白，所述阳离子聚合物或可电离脂质或蛋白的pKa小于6.8；和基于水包油乳液体积计的1-25v/v％的可代谢油脂；其中所述水包油乳液的杨氏模量为20-800MPa；所述水包油乳液中乳滴的平均粒径为50-800nm。
在一些实施方案中，所述水相还包括黏蛋白。
在一些实施方案中，所述水相包括1-100mg/mL的黏蛋白。
在一些实施方案中，所述PEG脂质或脂质类物质选自以下中的一种或多种：N-(羰基－甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-二硬酯酰-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺(DSPE-PEG-2000)、DSPE-PEG5000、DSPE-PEG1000、DSPE-PEG-脂质体，1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱(DPPC)，1,2-二棕榈酰基-sn-丙三基-3-和磷酸乙氨醇(DPPE)，脂质体，LNP(脂质纳米粒)和细胞外泌体。
在一些实施方案中，所述抗体或抗原或天然蛋白选自以下中的一种或多种：重组流感病毒、COVID-19病毒、手足口病毒、轮状病毒、病毒重组蛋白抗原、人血清白蛋白、基因重组的或纯化的抗体IgG、IgM、IgA、纳米抗体、二联抗体、药用蛋白(例如，IFN-r、IL-2)。
在一些实施方案中，所述抗原选自以下中的一种或多种：肿瘤抗原、细菌抗原(例如，幽门螺旋杆菌抗原)、真菌抗原、病毒抗原和寄生虫抗原。
在一些实施方案中，所述肿瘤抗原是人类抗原或者非人类抗原。
在一些实施方案中，所述抗原选自以下中的一种或多种：化学合成的抗原、选自鸡胚培养、细胞培养、携带者体液、器官或组织中纯化分离所得的抗原、重组基因表达的抗原、重组亚单位疫苗、减毒疫苗、灭活疫苗、裂解疫苗、多糖结合疫苗、核酸疫苗和合成肽抗原。
在一些实施方案中，所述抗原的N端或C端可偶联荧光标记物或脂质链，所述脂质链包括疏水性的单链或多接枝的碳链和嵌段共聚物中的一种或多种，例如所述抗原是棕榈酸修饰合成肽段。
在一些实施方案中，所述阳离子聚合物或可电离脂质或蛋白选自以下中的一种或多种：双十二烷基二甲基溴化铵(DDAB)、十二烷基氯化铵、十六烷基三甲基溴化铵、十六烷基溴化吡啶、阳离子聚丙烯酰胺(CPAM)、1,2-二油醇-3－二甲基氨基-丙烷(DODMA)、3β-[N-(N',N'-二甲基胺乙基)氨基甲酰基]胆固醇盐酸盐(DC-CHO)、十八烷基胺聚氧乙烯醚双季铵盐、(2,3-二油酰基-丙基)-三甲基铵-氯盐(DOTAP)、1,2-双十八烯氧基-3-甲基铵丙烷(氯盐，DOTMA)、鱼精蛋白或阳离子多肽、PEI和可电离脂质。
在一些实施方案中，所述阳离子多肽选自以下中的一种或多种：RALA、KL4及含有3个以上R或K的多肽衍生物。
在一些实施方案中，所述可电离脂质选自以下中的一种或多种：4-(N,N-二甲基氨基)丁酸(二亚油基)甲酯、DLin-MC3-DMA和SM-102。
在一些实施方案中，所述可代谢油脂选自以下中的一种或多种：玉米油、角鲨烯、橄榄油、大豆油、维生素E(生育酚)、油酸乙酯、油酸、乳酸乙酯、二甲基硅油、月桂酸异丙酯和癸酸甘油三酯。
在一些实施方案中，所述可代谢油脂选自以下中的一种或多种：角鲨烯、橄榄油和二甲基硅油。
在一些实施方案中，所述水包油乳液进一步包括：
(E)Toll样受体激动剂，例如TLR4、7、8、9、5的激动剂、单磷酰脂质A(MPLA)、CpG、R837、鞭毛蛋白及它们的类似物；和/或
(F)STING激动剂，例如cGAMP；和/或
(G)锰佐剂；和/或
(H)皂苷类及其类似物，例如QS-21；和/或
(I)疏水性药物，例如紫杉醇、全反式维甲酸、阿那曲唑和阿霉素中的一种或多种；和/或
(J)亲水性药物，例如来曲唑、白介素和干扰素中的一种或多种。
在一些实施方案中，所述水包油乳液不包括：
(E)Toll样受体激动剂，例如TLR4、7、8、9、5的激动剂、单磷酰脂质A(MPLA)、CpG、R837、鞭毛蛋白及它们的类似物；和/或
(F)STING激动剂，例如cGAMP；和/或
(G)锰佐剂；和/或
(H)皂苷类及其类似物，例如QS-21。
在一些实施方案中，所述水包油乳液的电位为-20mV至70mV。
第二方面，本申请提供了第一方面所述的水包油乳液作为药物缓释系统、药物递送系统或药物载体在制备疫苗或药物中的用途。
在一些实施方案中，所述疫苗或药物通过黏膜递送，例如鼻黏膜递送或肺黏膜递送。
作为非限制性实例，本申请提供了以下实施方案：
实施方案1.水包油乳液，其包括油相和水相，
所述水相包括：
1-100mg/mL的PEG脂质或脂质类物质，和
10-1000μg/mL的抗原或10-10000μg/mL的天然蛋白或者100-10000μg/mL的抗体；以及
所述油相包括：
50-1000μg/mL的阳离子聚合物或可电离脂质或蛋白，所述阳离子聚合物或可电离脂质或蛋白的pKa小于6.8；和
基于水包油乳液体积计的1-25v/v％的可代谢油脂；
其中所述水包油乳液的杨氏模量为20-800MPa；所述水包油乳液中乳滴的平均粒径为50-800nm。
实施方案2.如实施方案1所述的水包油乳液，其中所述水相还包括黏蛋白。
实施方案3.如实施方案2所述的水包油乳液，其中所述水相包括1-100mg/mL的黏蛋白。
实施方案4.如实施方案1所述的水包油乳液，其中所述PEG脂质或脂质类物质，选自以下中的一种或多种：N-(羰基－甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-二硬酯酰-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺(DSPE-PEG-2000)、DSPE-PEG5000、DSPE-PEG1000、DSPE-PEG-脂质体，1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱(DPPC)，1,2-二棕榈酰基-sn-丙三基-3-和磷酸乙氨醇(DPPE)，脂质体，LNP和细胞外泌体。
实施方案5.如实施方案1所述的水包油乳液，其中所述抗体或抗原或天然蛋白选自以下中的一种或多种：重组流感病毒、COVID-19病毒、手足口病毒、轮状病毒、病毒重组蛋白抗原、人血清白蛋白、基因重组的或纯化的抗体IgG、IgM、IgA、纳米抗体、二联抗体、药用蛋白。
实施方案6.如实施方案1所述的水包油乳液，其中所述抗原选自以下中的一种或多种：肿瘤抗原、细菌抗原、真菌抗原、病毒抗原和寄生虫抗原。
实施方案7.如实施方案6所述的水包油乳液，其中所述肿瘤抗原是人类抗原。
实施方案8.如实施方案1所述的水包油乳液，其中所述抗原选自以下中的一种或多种：化学合成的抗原、选自鸡胚培养、细胞培养、携带者体液、器官或组织中纯化分离所得的抗原、重组基因表达的抗原、重组亚单位疫苗、减毒疫苗、灭活疫苗、裂解疫苗、多糖结合疫苗、核酸疫苗和合成肽抗原。
实施方案9.如实施方案1所述的水包油乳液，其中所述抗原的N端或C端可偶联荧光标记物或脂质链，所述脂质链包括疏水性的单链或多接枝的碳链和嵌段共聚物中的一种或多种，例如所述抗原是棕榈酸修饰合成肽段。
实施方案10.如实施方案1所述的水包油乳液，其中所述阳离子聚合物或可电离脂质或蛋白选自以下中的一种或多种：双十二烷基二甲基溴化铵(DDAB)、十二烷基氯化铵、十六烷基三甲基溴化铵、十六烷基溴化吡啶、阳离子聚丙烯酰胺(CPAM)、1,2-二油醇-3－二甲基氨基-丙烷(DODMA)、3β-[N-(N',N'-二甲基胺乙基)氨基甲酰基]胆固醇盐酸盐(DC-CHO)、十八烷基胺聚氧乙烯醚双季铵盐、(2,3-二油酰基-丙基)-三甲基铵-氯盐(DOTAP)、1,2-双十八烯氧基-3-甲基铵丙烷(氯盐，DOTMA)、鱼精蛋白或阳离子多肽和PEI。
实施方案11.如实施方案10所述的水包油乳液，其中所述阳离子多肽选自以下中的一种或多种：RALA、KL4及含有3个以上R或K的多肽衍生物。
实施方案12.如实施方案1所述的水包油乳液，其中所述可电离脂质选自以下中的一种或多种：DLin-MC3-DMA和SM-102。
实施方案13.如实施方案1所述的水包油乳液，其中所述可代谢油脂选自以下中的一种或多种：玉米油、角鲨烯、橄榄油、大豆油、维生素E、油酸乙酯、油酸、乳酸乙酯、二甲基硅油、月桂酸异丙酯和癸酸甘油三酯。
实施方案14.如实施方案1所述的水包油乳液，其中所述可代谢油脂选自以下中的一种或多种：角鲨烯、橄榄油和二甲基硅油。
实施方案15.如实施方案1所述的水包油乳液，其中所述水包油乳液进一步包括：
(E)Toll样受体激动剂；和/或
(F)STING激动剂；和/或
(G)锰佐剂；和/或
(H)皂苷类及其类似物；和/或
(I)疏水性药物；和/或
(J)亲水性药物。
实施方案16.如实施方案1所述的水包油乳液，其中所述水包油乳液不包括：
(E)Toll样受体激动剂；和/或
(F)STING激动剂；和/或
(G)锰佐剂；和/或
(H)皂苷类及其类似物。
实施方案17.如实施方案1所述的水包油乳液，其中所述水包油乳液的电位为-20mV至70mV。
实施方案18.如实施方案1所述的水包油乳液，其中所述水包油乳液包括6v/v％的玉米油、20mg/mL的DSPE-PEG 2000、30μg/mL的流感重组蛋白抗原、600μg/mL的DOTAP。
实施方案19.如实施方案1所述的水包油乳液，其中所述水包油乳液包括8v/v％的维生素E、90mg/mL的DSPE-PEG 2000、300μg/mL的COVID-19灭活病毒抗原、200μg/mL的COVID-19重组蛋白抗原、800μg/mL的SM102。
实施方案20.如实施方案1所述的水包油乳液，其中所述水包油乳液包括10v/v％的大豆油、3mg/mL的DSPE-PEG 2000、20μg/mL的RSV重组蛋白抗原、2mg/mL的黏蛋白、200μg/mL的鱼精蛋白。
实施方案21.如实施方案1所述的水包油乳液，其中所述水包油乳液包括5v/v％的角鲨烯、4mg/mL的DSPE-PEG 2000、500μg/mL的COVID-19重组病毒抗原、200μg/mL的DDAB。
实施方案22.如实施方案1所述的水包油乳液，其中所述水包油乳液包括12v/v％的橄榄油、10mg/mL的DSPE-PEG 2000、60μg/mL的轮状病毒抗原、20μg/mL的脂质体、60μg/mL的DLin-MC3-DMA。
实施方案23.如实施方案1所述的水包油乳液，其中所述水包油乳液包括2v/v％的油酸、50mg/mL的DSPE-PEG 2000、10μg/mL的COVID-19灭活抗原、10μg/mL的IgA抗体、200μg/mL的DOTMA。
实施方案24.如实施方案1所述的水包油乳液，其中所述水包油乳液包括16v/v％的角鲨烯、80mg/mL的DSPE-PEG 5000、50μg/mL的流感重组蛋白抗原、4mg/mL的白蛋白、300μg/mL的SM102。
实施方案25.如实施方案1所述的水包油乳液，其中所述水包油乳液包括8v/v％的橄榄油、60mg/mL的DSPE-PEG 5000、30μg/mL的轮状病毒抗原、100μg/mL的DLin-MC3-DMA。
实施方案26.如实施方案1所述的水包油乳液，其中所述水包油乳液包括5v/v％的玉米油、10mg/mL的DSPE-PEG 5000、8mg/mL的黏蛋白、100μg/mL的DDAB。
实施方案27.如实施方案1所述的水包油乳液，其中所述水包油乳液包括15v/v％的维生素E、20mg/mL的DSPE-PEG 5000、40μg/mL的带状疱疹病毒抗原、300μg/mL的DOTAP。
实施方案28.如实施方案1所述的水包油乳液，其中所述水包油乳液包括5v/v％的大豆油、8mg/mL的DSPE-PEG 5000、30μg/mL的RSV重组蛋白抗原、20μg/mL的IgA抗体、400μg/mL的鱼精蛋白。
实施方案29.如实施方案1所述的水包油乳液，其中所述水包油乳液包括18v/v％的油酸、6mg/mL的DSPE-PEG 5000、500μg/mL的COVID-19重组蛋白抗原、40μg/mL的脂质体、600μg/mL的DOTMA。
实施方案30.如实施方案1所述的水包油乳液，其中所述水包油乳液包括8v/v％的玉米油、8mg/mL的DSPE-PEG 1000、100μg/mL的COVID-19重组蛋白抗原、600μg/mL的SM102。
实施方案31.如实施方案1所述的水包油乳液，其中所述水包油乳液包括6v/v％的橄榄油、10mg/mL的DSPE-PEG 1000、80μg/mL的带状疱疹蛋白抗原、10mg/mL的白蛋白、400μg/mL的DOTMA。
实施方案32.如实施方案1所述的水包油乳液，其中所述水包油乳液包括4v/v％的维生素E、6mg/mL的DSPE-PEG 1000、800μg/mL的COVID-19灭活病毒抗原、15μg/mL的VLP、200μg/mL的DOTAP。
实施方案33.如实施方案1所述的水包油乳液，其中所述水包油乳液包括15v/v％的大豆油、5mg/mL的DSPE-PEG 1000、60μg/mL的RSV重组蛋白抗原、15μg/mL的IgA抗体、100μg/mL的鱼精蛋白。
实施方案34.如实施方案1所述的水包油乳液，其中所述水包油乳液包括8v/v％的油酸、40mg/mL的DSPE-PEG 1000、100μg/mL轮状病毒抗原、16μg/mL的细胞外泌体、120μg/mL的DLin-MC3-DMA。
实施方案35.如实施方案1所述的水包油乳液，其中所述水包油乳液包括10v/v％的角鲨烯、2mg/mL的DSPE-PEG 1000、30μg/mL的COVID-19重组蛋白抗原、50μg/mL的COVID-19灭活病毒抗原、600μg/mL的DDAB。
实施方案36.如实施方案1所述的水包油乳液，其中所述水包油乳液包括2v/v％的玉米油、12mg/mL的DSPE-PEG 1000、100μg/mL的流感重组蛋白抗原、4mg/mL的黏蛋白、100μg/mL的SM102。
实施方案37.如实施方案1所述的水包油乳液，其中所述水包油乳液包括4v/v％的橄榄油、5mg/mL的DME-PEG 1000、20μg/mL的轮状病毒抗原、8mg/mL的白蛋白、500μg/mL的DOTMA。
实施方案38.如实施方案1所述的水包油乳液，其中所述水包油乳液包括20v/v％的维生素E、60mg/mL的DPPC、120μg/mL的RSV重组蛋白抗原、400μg/mL的DOTAP。
实施方案39.如实施方案1所述的水包油乳液，其中所述水包油乳液包括2v/v％的大豆油、80mg/mL的DPPE、60μg/mL的IgA抗体、300μg/mL的鱼精蛋白。
实施方案40.如实施方案1所述的水包油乳液，其中所述水包油乳液包括4v/v％的油酸、16mg/mL的DSPE-PEG 1000、200μg/mL的带状疱疹抗原、60μg/mL的脂质体、200μg/mL的DLin-MC3-DMA。
实施方案41.如实施方案1所述的水包油乳液，其中所述水包油乳液包括20v/v％的角鲨烯、50mg/mL的DSPE-PEG 1000、200μg/mL的流感重组蛋白抗原、300μg/mL的DDAB。
实施方案42.实施方案1-41中任一项所述的水包油乳液作为药物缓释系统、药物递送系统或药物载体在制备疫苗或药物中的用途。
实施方案43.如实施方案42所述的用途，其中所述疫苗或药物通过黏膜递送。
附图说明
图1为表3中方案(4)不同含量A组分与C组分的乳液粒径和电位图。图1示出了单组份条件优化，在只添加C组分时为正电荷；在确认C组分的正电荷作用以及用量后，再与A组分联用，确认A组分的作用以及用量。
图2为表3中不同方案(1、2、4、8、9、16、20、13和18)的抗原装载效率。
图3为表3中方案3、26和27制备的乳液图，以及乳液在黏液缓冲液中的稳定性比较；
图4为表3中不同方案(19、13、6、23、15、8、2和27，以及作为对照的抗原)制备的乳液中抗原的黏膜中停留时间折线图。
图5为表3中不同方案(1、4、8、13、17、21、2和27，以及作为对照的颗粒)制备的乳液变形穿过细胞间隙效率图。
图6为表3中不同方案(2、12、13和18，以及作为阳性对照的铝佐剂和作为阴性对照的抗原)制备的乳液对COVID-19抗原滴鼻免疫的黏膜免疫和系统性免疫效果评价。
图7为表3中不同方案(1、7、19和24，以及作为阳性对照的铝佐剂和作为阴性对照的抗原)制备的乳液对流感抗原滴鼻免疫的黏膜免疫和系统性免疫效果评价。
图8为表3中不同方案(2、12、13和18，以及作为阳性对照的铝佐剂和作为阴性对照的抗原)制备的乳液雾化肺部的黏膜免疫效果。
图9为表3中不同方案(5、8、17和20，以及作为阳性对照的铝佐剂和作为阴性对照的抗原)制备的乳液对肠道病毒抗原的黏膜免疫效果评价。
图10为表3中方案4制备的乳液对不同小分子的黏膜免疫和系统性免疫效果评价。
图11为表3中方案4制备的乳液在体内的安全性效果评价。
具体实施方式
本申请中的“PEG脂质”是指将PEG与脂质结合的化合物。本申请中的“PEG脂质”可以例如是DSPE-PEG-2000、DSPE-PEG5000、DSPE-PEG1000和DSPE-PEG-脂质体。
本申请中的“脂质类物质”是指一类由脂质分子组成的化合物或结构，由长链脂肪酸和其他小分子(如甘油、磷酸等)通过化学键连接而成。本申请中的“脂质类物质”可以例如是DPPC、DPPE、脂质体，LNP(脂质纳米粒)和细胞外泌体。
本申请中的“抗原”是指所有能诱导机体发生免疫应答的蛋白类物质。抗原能被T或B淋巴细胞表面的抗原受体特异性识别与结合，产生免疫应答产物，并能与相应产物在体内外发生特异性结合的物质。免疫原性是指抗原诱导机体发生特异性免疫应答，产生抗体和/或致敏淋巴细胞的能力；免疫反应性是指能与相应的免疫效应物质在体内外发生特异性结合反应的能力。本申请中的“抗原”可以例如是重组流感病毒、COVID-19病毒、手足口病毒、轮状病毒和病毒重组蛋白抗原等。
本申请中的“天然蛋白”是指从天然来源中纯化的蛋白。天然蛋白可存在修饰，例如前体蛋白裂解、二硫键形成、糖基化或磷酸化等。本申请中的“天然蛋白”可以例如是人血清白蛋白、药用蛋白和黏蛋白。
本申请中的“抗体”是指能与抗原特异性结合的免疫球蛋白。抗体具有结合部位，能与相对应的抗原决定簇结合。本申请中的“抗体”可以例如是基因重组的或纯化的抗体IgG、IgM、IgA、纳米抗体和二联抗体。
本申请中的“可电离脂质”是指一类在特定pH条件下可以带有正电荷或负电荷的脂质分子。本申请中的“可电离脂质”可以例如是双十二烷基二甲基溴化铵(DDAB)、十二烷基氯化铵、十六烷基三甲基溴化铵、十六烷基溴化吡啶、十八烷基胺聚氧乙烯醚双季铵盐、(2,3-二油酰基-丙基)-三甲基铵-氯盐(DOTAP)、1,2-双十八烯氧基-3-甲基铵丙烷(氯盐，DOTMA)。
本申请中的“阳离子聚合物”是一类具有阳离子性质的高分子化合物，其分子结构中含有正电荷基团，可以通过与负电荷的物质相互作用，形成稳定的络合物或复合物。本申请中的“阳离子聚合物”可以例如是阳离子聚丙烯酰胺(CPAM)、1,2-二油醇-3－二甲基氨基-丙烷(DODMA)、3β-[N-(N',N'-二甲基胺乙基)氨基甲酰基]胆固醇盐酸盐(DC-CHO)、鱼精蛋白或阳离子多肽和PEI。
本申请中的“蛋白”是指由许多氨基酸通过肽键相连形成的具有特定结构的含氮生物大分子。本申请中的“蛋白”可以例如是鱼精蛋白。
本申请中的“可代谢油脂”是指一类可以被生物体内的代谢途径分解和利用脂质分子，通常是由甘油和脂肪酸组成的，可以在生物体内被酶类降解为能量或其他代谢产物。本申请中的“可代谢油脂”可以例如是角鲨烯、橄榄油、大豆油、维生素E、油酸乙酯、油酸、乳酸乙酯、二甲基硅油、月桂酸异丙酯和癸酸甘油三酯。
本申请中的“阳离子多肽”是一类具有正电荷的多肽分子，通常具有良好的细胞渗透性和细胞内靶向能力。本申请中的“阳离子多肽”可以例如是RALA、KL4及含有3个以上R或K的多肽衍生物。
第一方面，本申请提供了一种水包油乳液，其包括油相和水相，所述水相包括：1-100mg/mL的PEG脂质或脂质类物质，和10-1000μg/mL的抗原或10-10000μg/mL的天然蛋白或者100-10000μg/mL的抗体；以及所述油相包括：50-1000μg/mL的阳离子聚合物或可电离脂质或蛋白，所述阳离子聚合物或可电离脂质或蛋白的pKa小于6.8；和基于水包油乳液体积计的1-25v/v％的可代谢油脂；其中所述水包油乳液的杨氏模量为20-800MPa；所述水包油乳液中乳滴的平均粒径为50-800nm。
在一些实施方案中，各组分的浓度基于最终乳液的体积计算。
在一些实施方案中，所述水相包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100mg/mL的PEG脂质或脂质类物质(表3中的A组分)或上述数值之间任意范围的PEG脂质或脂质类物质。
在一些实施方案中，所述水相包括10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990或1000μg/mL的抗原(表3中的B组分之一)或上述数值之间任意范围的抗原。
在一些实施方案中，所述抗原是蛋白类抗原。
在一些实施方案中，所述水相包括10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000或10000μg/mL的天然蛋白(表3中的B组分之一)或上述数值之间任意范围的天然蛋白。
在一些实施方案中，所述水相包括100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000或10000μg/mL的抗体(表3中的B组分之一)或上述数值之间任意范围的抗体。
在一些实施方案中，所述油相包括50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990或1000μg/mL的阳离子聚合物或可电离脂质或蛋白(表3中的C组分)或上述数值之间任意范围的阳离子聚合物或可电离脂质或蛋白。
在一些实施方案中，所述油相包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25％(v/v)的可代谢油脂(表3中的D组分)或上述数值之间任意范围的可代谢油脂。
在一些实施方案中，所述可电离脂质或高分子物质或蛋白的pKa小于6.8、小于6.7、小于6.6、小于6.5、小于6.4、小于6.3、小于6.2、小于6.1、小于6、小于5.9、小于5.8、小于5.7、小于5.6、小于5.5、小于5.4、小于5.3、小于5.2、小于5.1、小于5。
在一些实施方案中，所述可电离脂质或高分子物质或蛋白的pKa为6.7、6.6、6.5、6.4、6.3、6.2、6.1、6、5.9、5.8、5.7、5.6、5.5、5.4、5.3、5.2、5.1、5或上述数值之间任意范围。
在一些实施方案中，所述水包油乳液的杨氏模量为20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790或800MPa或上述数值之间任意范围。
在一些实施方案中，所述水包油乳液中乳滴的平均粒径为50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790或800nm或上述数值之间任意范围。
在一些实施方案中，所述水包油乳液中的表面活性剂的含量小于2％。
在一些实施方案中，所述水包油乳液中的表面活性剂的含量小于1.9％、小于1.8％、小于1.7％、小于1.6％、小于1.5％、小于1.4％、小于1.3％、小于1.2％、小于1.1％、小于1％、小于0.9％、小于0.8％、小于0.7％、小于0.6％、小于0.5％、小于0.4％、小于0.3％、小于0.2％、小于0.1％。
在一些实施方案中，所述水包油乳液中的表面活性剂的含量为1.9％、1.8％、1.7％、1.6％、1.5％、1.4％、1.3％、1.2％、1.1％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％或上述数值之间任意范围。
在一些实施方案中，所述水相还包括黏蛋白。
在一些实施方案中，所述水相包括1-100mg/mL的黏蛋白。
在一些实施方案中，所述PEG脂质或脂质类物质选自以下中的一种或多种：N-(羰基－甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-二硬酯酰-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺(DSPE-PEG-2000)、DSPE-PEG5000、DSPE-PEG1000、DSPE-PEG-脂质体，1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱(DPPC)，1,2-二棕榈酰基-sn-丙三基-3-和磷酸乙氨醇(DPPE)，脂质体，LNP(脂质纳米粒)和细胞外泌体。
在一些实施方案中，所述抗体或抗原或天然蛋白选自以下中的一种或多种：重组流感病毒、COVID-19病毒、手足口病毒、轮状病毒、病毒重组蛋白抗原、人血清白蛋白、基因重组的或纯化的抗体IgG、IgM、IgA、纳米抗体、二联抗体、药用蛋白(例如，IFN-r、IL-2)。
在一些实施方案中，所述抗原选自以下中的一种或多种：肿瘤抗原、细菌抗原(例如，幽门螺旋杆菌抗原)、真菌抗原、病毒抗原和寄生虫抗原。
在一些实施方案中，所述肿瘤抗原是人类抗原或者非人类抗原。
在一些实施方案中，所述抗原选自以下中的一种或多种：化学合成的抗原、选自鸡胚培养、细胞培养、携带者体液、器官或组织中纯化分离所得的抗原、重组基因表达的抗原、重组亚单位疫苗、减毒疫苗、灭活疫苗、裂解疫苗、多糖结合疫苗、核酸疫苗和合成肽抗原。
在一些实施方案中，所述抗原的N端或C端可偶联荧光标记物或脂质链，所述脂质链包括疏水性的单链或多接枝的碳链和嵌段共聚物中的一种或多种，例如所述抗原是棕榈酸修饰合成肽段。
在一些实施方案中，所述阳离子聚合物或可电离脂质或蛋白选自以下中的一种或多种：双十二烷基二甲基溴化铵(DDAB)、十二烷基氯化铵、十六烷基三甲基溴化铵、十六烷基溴化吡啶、阳离子聚丙烯酰胺(CPAM)、1,2-二油醇-3－二甲基氨基-丙烷(DODMA)、3β-[N-(N',N'-二甲基胺乙基)氨基甲酰基]胆固醇盐酸盐(DC-CHO)、十八烷基胺聚氧乙烯醚双季铵盐、(2,3-二油酰基-丙基)-三甲基铵-氯盐(DOTAP)、1,2-双十八烯氧基-3-甲基铵丙烷(氯盐，DOTMA)、鱼精蛋白或阳离子多肽、PEI和可电离脂质。
在一些实施方案中，所述阳离子多肽选自以下中的一种或多种：RALA、KL4及含有3个以上R或K的多肽衍生物。
在一些实施方案中，所述可电离脂质选自以下中的一种或多种：4-(N,N-二甲基氨基)丁酸(二亚油基)甲酯、DLin-MC3-DMA和SM-102。
在一些实施方案中，所述可代谢油脂选自以下中的一种或多种：玉米油、角鲨烯、橄榄油、大豆油、维生素E(生育酚)、油酸乙酯、油酸、乳酸乙酯、二甲基硅油、月桂酸异丙酯和癸酸甘油三酯。
在一些实施方案中，所述可代谢油脂选自以下中的一种或多种：角鲨烯、橄榄油和二甲基硅油。
在一些实施方案中，所述水包油乳液进一步包括：
(E)Toll样受体激动剂，例如TLR4、7、8、9、5的激动剂、单磷酰脂质A(MPLA)、CpG、R837、鞭毛蛋白及它们的类似物；和/或
(F)STING激动剂，例如cGAMP；和/或
(G)锰佐剂；和/或
(H)皂苷类及其类似物，例如QS-21；和/或
(I)疏水性药物，例如紫杉醇、全反式维甲酸、阿那曲唑和阿霉素中的一种或多种；和/或
(J)亲水性药物，例如来曲唑、白介素和干扰素中的一种或多种。
在一些实施方案中，所述水包油乳液不包括：
(E)Toll样受体激动剂，例如TLR4、7、8、9、5的激动剂、单磷酰脂质A(MPLA)、CpG、R837、鞭毛蛋白及它们的类似物；和/或
(F)STING激动剂，例如cGAMP；和/或
(G)锰佐剂；和/或
(H)皂苷类及其类似物，例如QS-21。
在一些实施方案中，所述水包油乳液的电位为-20mV至70mV。
在一些实施方案中，所述水包油乳液的电位为-20、-19、-18、-17、-16、-15、-14、-13、-12、-11、-10、-9、-8、-7、-6、-5、-4、-3、-2、-1、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70mV，或上述数值之间任意范围。
第二方面，本申请提供了第一方面所述的水包油乳液作为药物缓释系统、药物递送系统或药物载体在制备疫苗或药物中的用途。
在一些实施方案中，所述疫苗或药物通过黏膜递送，例如鼻黏膜递送或肺黏膜递送。
实施例
实施例1：乳液的制备
实施例所用的试剂和耗材如表1所示，所用仪器如表2所示。若无特殊说明，其他未提及的试剂及耗材均购自本领域常规试剂厂商。
表1
名称 规格 生产厂家
无水乙醇 分析纯 北京化工厂
角鲨烯 纯度≥98％ Sigma Aldrich
维生素E 纯度≥99％ 国药集团化学试剂有限公司
油酸 分析纯 国药集团化学试剂有限公司
玉米油 纯度≥98％ Sigma Aldrich
大豆油 纯度≥98％ Sigma Aldrich
橄榄油 纯度≥98％ Sigma Aldrich
DOTAP 分析纯 艾伟拓医药科技有限公司
DDAB 分析纯 艾伟拓医药科技有限公司
DPTMA 分析纯 艾伟拓医药科技有限公司
DLin-MC3-DMA 分析纯 艾伟拓医药科技有限公司
SM102 分析纯 艾伟拓医药科技有限公司
DSPE-PEG 2000 分析纯 艾伟拓医药科技有限公司
DSPE-PEG 5000 分析纯 艾伟拓医药科技有限公司
DSPE-PEG 1000 分析纯 艾伟拓医药科技有限公司
DMG-PEG 2000 分析纯 艾伟拓医药科技有限公司
DC-Chol 分析纯 艾伟拓医药科技有限公司
氢氧化铝 分析纯 北京化学试剂公司
氢氧化钠 分析纯 北京化学试剂公司
明胶 分析纯 国药集团化学试剂有限公司
RALA 95％ 南京源肽生物科技有限公司
KL4 95％ 南京源肽生物科技有限公司
表2
实施例所用实验方法及检测方法如下：
(1)乳液的制备
按照不同组分配方，通过超声方法制备乳液，120w，超声2秒停2秒。
(2)乳液的粒径与电位分布测定
乳液的粒径与电位分布通过动态光散射采用Zeta电位及粒度分析仪进行测定，具体测定步骤为：将制备好的乳液稀释50～100倍，取稀释后的乳液1～2mL加入到样品池中，放入Zeta电位仪及粒度仪(Nano Zeta Sizer，Malvern)中进行测定。
(3)乳滴上吸附抗原或药物的组装和包埋效率的测定
将吸附抗原或药物后的乳液，离心取下清(根据乳液的大小和密度选择合适的离心条件)，测量下清中抗原或药物浓度，从而间接计算出吸附到乳液表面的抗原或药物的量；
抗原或药物含量采用BCA或micro-BCA试剂盒或其他适宜的检测方法测定；抗原或药物吸附率按以下公式计算：
吸附率＝(吸附前抗原或药物浓度—吸附后下清中抗原或药物浓度)/吸附前抗原或药物浓度×100％
(4)黏液稳定性的测定
将制备好的乳液，与黏液缓冲液1：1混匀，观察乳液的状态。
(5)乳液变形性的测定
将Caco-2细胞培养在Transwell板上，加入带荧光抗原的乳液，测定下室培养液中抗原的荧光强度以计算乳液的变形效率。
(6)动物实验测定
实验所采用的Balb/c小鼠由维通利华公司提供。所涉及的免疫步骤基本如下：
a.先将小鼠随机分组，每组采用6只以上的小鼠进行实验，根据实施例的具体说明对小鼠进行分组和免疫接种。在不同时间段对小鼠鼻子进行免疫荧光成像，观察抗原在免疫后不同时间段在鼻腔的停留量；
b.先将小鼠随机分组，每组采用6只以上的小鼠进行实验，根据实施例的具体说明对小鼠进行分组和免疫接种。取小鼠的血清和鼻肺灌洗液，离心，10,000g，10min，用酶联免疫吸附(ELISA)检测分别检测血清中的IgG和灌洗液中IgA分泌情况，以判定黏膜免疫和系统性免疫效果评价。
实施例所用组分方案如表3所示。
表3
按表3中不同组分制备乳液，a和b组分溶解于水中，超声1min使其分散均匀，得到分散有a和b组分的水相悬浮液，c组分溶于油相中；
用移液枪吸取表3中相对应体积比的已经溶解c组分的油相(D)。例如，5％角鲨烯表示1mL体系中需要加入50μl的角鲨烯，加入到上述水相悬浮液中，总体积为1mL，采用超声(120W，2min，超声4秒停4秒)乳化的方法，制备水包油乳液，最终乳液中a组分约为1-100mg/mL，c组分约为1-1000μg/mL。
实施例2：不同浓度的A组分与C组分对于乳液电位与粒径的影响
按照表3中不同组分配方，设置不同浓度的a组分和c组分，a组分浓度分别设置为0.5，1，3，4，5mg/mL，c组分浓度设置为80，120，160，200，240μg/mL，a组分溶解于水中，c组分溶于油相中，超声1min使其分散均匀，乳液体系总体积为1mL，采用超声(120W，2min，超4秒停4秒)乳化的方法，制备水包油乳液，本实施例中选择的a组分为DSPE-PEG-2k，c组分为DDAB。
将制备成功的乳液稀释约100-300倍，通过动态光散射采用Zeta电位及粒度分析仪对乳液的粒径与电位进行测定，具体测定步骤为：取稀释后的乳液1-2mL加入到样品池中，放入Zeta电位仪及粒度仪(Nano Zeta Sizer，Malvern)中进行测定。结果如图1所示。
实施例3：不同方案的乳液的抗原的组装和包埋效率
按照表3中不同组分配制乳液，横坐标为表3中相对应的方案编号，a组分溶解于水中，c组分溶于油相中，超声1min使其分散均匀，乳液体系总体积为1mL，采用超声(120W，2min，超4秒停4秒)乳化的方法，制备水包油乳液。利用检测方法3检测抗原装载效率。结果如图2所示。
实施例4：粘液稳定性
粘液稳定性结果如图3所示，当仅有C组分时，乳液与黏液共混时发生破乳现象(表3,图3，26号样品)，表明当体系中仅存在C组分时体系在黏液体系中不稳定，无法进行进一步递送；当仅有A组分时，27号样品，可以在黏液体系中稳定存在，但乳液自身不稳定，且容易分层，而且在图4的黏膜停留时间中，27号样品与单纯抗原一样，几乎没有显著增长，同时，在图5的穿膜效率中，27号样本与3号样本相比，效率显著降低。而当使用具有A组分和C组分的方案时(表3，图3，3号样品)，乳液与黏液共混时体系保持稳定，表明A+C组分共同保持乳液在黏液中的稳定以进行进一步的递送。该实施例表明，A+C组分是维持乳液在黏液中稳定存在和延长黏膜停留时间所必需的。其他配方的粘液稳定性检测如表4所示，可以看出表3配方中带有peg脂质和双亲性磷脂的成分，可以获得更好的粘液稳定性。
打分标准如下所示：
破乳：1分(例如，图3，26号样本)
乳液不稳定且容易分层：3分(例如，图3，27号样本)
乳液完好：5分(例如，图3，3号样本)
表4.粘液稳定性检测
实施例5：黏膜停留时间测定
按照表3中不同组分配制乳液，组别为表3中相对应的方案编号，A组分溶解于水中，C组分溶于油相中，超声1min使其分散均匀，乳液体系总体积为1mL，采用超声(120W，2min，超声4秒停4秒)乳化的方法，制备水包油乳液。利用检测方法6检测装载乳液的黏膜停留时间。结果如图4所示。
实施例6：穿黏膜递送(变形)
按照表3中不同组分配制乳液，组别为表3中相对应的方案编号，将a组分溶解于水中，c组分溶于油相中，超声1min使其分散均匀，乳液体系总体积为1mL，采用超声(120W，2min，超声4秒停4秒)乳化的方法，制备水包油乳液。利用检测方法6检测Transwell下室中的荧光强度。
采用与乳液粒径相近的硬颗粒作为对比，采用的原材料为白蛋白，具体制备方法为：使用pH值为9.8的10mM NaCl水溶液作为缓冲液制备20mg/mL白蛋白溶液；然后将2mL白蛋白溶液与2mL无水乙醇混合，磁力搅拌10分钟，然后以2mL/min的速度滴加4mL无水乙醇(总乙醇:白蛋白＝3:1体积比)；之后加入160μL的8％戊二醛水溶液，交联并固化24小时；将获得的样品以2,000g离心20分钟，再将上清液以20,000g离心20min，并将获得的样品洗涤两次以获得固体白蛋白颗粒，根据检测方法2中测定颗粒的粒径，结果表明约为300nm，与乳液粒径相似。结果如图5所示。
值得注意的是，当体系中缺乏阳离子性脂质成分的时候(即表3，27号样品)，乳液的传膜效率明显降低(如图5所示)。这表明，阳离子脂质对于本发明所述的乳液的穿膜效率是非常重要的。
实施例7：喷鼻免疫的黏膜免疫及系统性免疫效果
按照表3中不同组分配制乳液，组别为表3中相对应的方案编号，将a组分溶解于水中，c组分溶于油相中，超声1min使其分散均匀，乳液体系总体积为1mL，采用超声(120W，2min，超声4秒停4秒)乳化的方法，制备水包油乳液。超声过程中加入COVID-19重组spike蛋白。其粒径为：300±50nm，电位为0±10mV：，杨氏模量为20-400MPa。以鼻腔滴注或喷雾的方式，于第0天和第14天接种小鼠鼻腔，每鼻孔10微升乳液。于第28天取小鼠血清检测IgG滴度。并分离鼻肺灌洗液检测其中IgA滴度。利用酶联免疫吸附检测抗体滴度。铝佐剂为阳性对照组。结果如图6所示。
实施例8：基于流感抗原的黏膜疫苗效果
按照表3中不同组分配制乳液，组别为表3中相对应的方案编号，将a组分溶解于水中，c组分溶于油相中，超声1min使其分散均匀，乳液体系总体积为1mL，采用超声(120W，2min，超声4秒停4秒)乳化的方法，制备水包油乳液，超声过程中加入流感重组抗原。以鼻腔滴注的方式，于第0天和第14天接种小鼠鼻腔，每鼻孔10微升乳液。于第28天取小鼠血清检测IgG滴度。并分离鼻肺灌洗液检测其中IgA滴度。利用酶联免疫吸附检测抗体滴度。铝佐剂为阳性对照组。结果如图7所示。
实施例9：雾化肺部递送的黏膜免疫效果
按照表3中不同组分配制乳液，组别为表3中相对应的方案编号，将a组分溶解于水中，c组分溶于油相中，超声1min使其分散均匀，乳液体系总体积为1mL，采用超声(120W，2min，超4秒停4秒)乳化的方法，制备水包油乳液，超声过程中加入COVID-19重组抗原。以喷雾的方式，于第0天和第14天接种小鼠鼻腔，每鼻孔10微升乳液。于第28天分离肺灌洗液检测其中IgA滴度。利用酶联免疫吸附检测抗体滴度。铝佐剂为阳性对照组。结果如图8所示。
实施例10：B组分为肠道病毒抗原(轮状病毒抗原)时，实现阴道和肠粘膜的黏膜免疫(远端黏膜免疫)
按照表3中不同组分配制乳液，组别为表3中相对应的方案编号，将a组分溶解于水中，c组分溶于油相中，超声1min使其分散均匀，乳液体系总体积为1mL，采用超声(120W，2min，超声4秒停4秒)乳化的方法，制备水包油乳液，超声过程中加入肠道病毒抗原。以滴鼻的方式，于第0天和第14天接种小鼠鼻腔，每鼻孔10微升乳液。于第28天分离小肠灌洗液检测其中IgA滴度。利用酶联免疫吸附检测抗体滴度。铝佐剂为阳性对照组。结果如图9所示。
实施例11：递送小分子(以表3中的方案4为例)
CpG(TLR9激动剂)和MPLA(单磷酰脂质A)可以通过吸附、包埋等方式，在乳液形成之前之后加入方案中，对乳液粒径和稳定性均无影响。且加入亲水和疏水小分子之后，对乳液稳定性并无影响。
将a组分溶解于水中，c组分溶于油相中，超声1min使其分散均匀，乳液体系总体积为1mL，采用超声(120W，2min，超声4秒停4秒)乳化的方法，制备水包油乳液，该实验中选择的a组分为DSPE-PEG-2k,c组分为DDAB，超声过程中加入COVID-19重组抗原。以鼻腔滴注的方式，于第0天和第14天接种小鼠鼻腔，每鼻孔10微升乳液。于第28天取小鼠血清检测IgG滴度。并分离鼻肺灌洗液检测其中IgA滴度。利用酶联免疫吸附检测抗体滴度。铝佐剂为阳性对照组。结果如图10所示。
实施例12：安全性表征(以表3中的方案4为例)
将a组分溶解于水中，c组分溶于油相中，超声1min使其分散均匀，乳液体系总体积为1mL，采用超声(120W，2min，超声4秒停4秒)乳化的方法，制备水包油乳液，该实验中选择的a组分为DSPE-PEG-2k,c组分为DDAB，超声过程中加入COVID-19重组抗原。以鼻腔滴注的方式，于第0天和第14天接种小鼠鼻腔，每鼻孔10微升乳液。于第28天取小鼠取血检测小鼠血清生化指标。对照组为PBS组，即阴性对照组，铝佐剂为阳性对照组。结果如图11所示。与PBS滴鼻组和铝佐剂注射组相比，乳液滴鼻组未出现明显的心、肝、脾、肺以及肾毒性。

Claims (10)

1.水包油乳液，其包括油相和水相，
所述水相包括：
1-100mg/mL的PEG脂质或脂质类物质，和
10-1000μg/mL的抗原或10-10000μg/mL的天然蛋白或者100-10000μg/mL的抗体；以及
所述油相包括：
50-1000μg/mL的阳离子聚合物或可电离脂质或蛋白，所述阳离子聚合物或可电离脂质或蛋白的pKa小于6.8；和
基于水包油乳液体积计的1-25v/v％的可代谢油脂；
其中所述水包油乳液的杨氏模量为20-800MPa；所述水包油乳液中乳滴的平均粒径为50-800nm。
2.如权利要求1所述的水包油乳液，其中所述PEG脂质或脂质类物质，选自以下中的一种或多种：N-(羰基－甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-二硬酯酰-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺(DSPE-PEG-2000)、DSPE-PEG5000、DSPE-PEG1000、DSPE-PEG-脂质体，1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱(DPPC)，1,2-二棕榈酰基-sn-丙三基-3-和磷酸乙氨醇(DPPE)，脂质体，LNP和细胞外泌体。
3.如权利要求1所述的水包油乳液，其中所述抗体或抗原或天然蛋白选自以下中的一种或多种：重组流感病毒、COVID-19病毒、手足口病毒、轮状病毒、病毒重组蛋白抗原、人血清白蛋白、基因重组的或纯化的抗体IgG、IgM、IgA、纳米抗体、二联抗体、药用蛋白。
4.如权利要求1所述的水包油乳液，其中所述抗原选自以下中的一种或多种：肿瘤抗原、细菌抗原、真菌抗原、病毒抗原和寄生虫抗原。
5.如权利要求1所述的水包油乳液，其中所述抗原选自以下中的一种或多种：化学合成的抗原、选自鸡胚培养、细胞培养、携带者体液、器官或组织中纯化分离所得的抗原、重组基因表达的抗原、重组亚单位疫苗、减毒疫苗、灭活疫苗、裂解疫苗、多糖结合疫苗、核酸疫苗和合成肽抗原。
6.如权利要求1所述的水包油乳液，其中所述阳离子聚合物或可电离脂质或蛋白选自以下中的一种或多种：双十二烷基二甲基溴化铵(DDAB)、十二烷基氯化铵、十六烷基三甲基溴化铵、十六烷基溴化吡啶、阳离子聚丙烯酰胺(CPAM)、1,2-二油醇-3－二甲基氨基-丙烷(DODMA)、3β-[N-(N',N'-二甲基胺乙基)氨基甲酰基]胆固醇盐酸盐(DC-CHO)、十八烷基胺聚氧乙烯醚双季铵盐、(2,3-二油酰基-丙基)-三甲基铵-氯盐(DOTAP)、1,2-双十八烯氧基-3-甲基铵丙烷(氯盐，DOTMA)、鱼精蛋白或阳离子多肽和PEI。
7.如权利要求1所述的水包油乳液，其中所述可代谢油脂选自以下中的一种或多种：玉米油、角鲨烯、橄榄油、大豆油、维生素E、油酸乙酯、油酸、乳酸乙酯、二甲基硅油、月桂酸异丙酯和癸酸甘油三酯。
8.如权利要求1所述的水包油乳液，其中所述水包油乳液的电位为-20mV至70mV。
9.权利要求1-8中任一项所述的水包油乳液作为药物缓释系统、药物递送系统或药物载体在制备疫苗或药物中的用途。
10.如权利要求9所述的用途，其中所述疫苗或药物通过黏膜递送。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002521423A (ja) * 1998-07-31 2002-07-16 コリア インスティチュート オブ サイエンス アンド テクノロージ 遺伝子又は薬物運搬体としての脂質エマルジョン及び固形脂質微粒子
DK2086582T3 (da) * 2006-10-12 2013-02-04 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine omfattende en olie-i-vand-emulsionsadjuvans
CN108042799A (zh) * 2010-07-06 2018-05-18 诺华股份有限公司 阳离子水包油乳液
CN104013955B (zh) * 2014-06-18 2016-02-24 中国科学院过程工程研究所 一种不含表面活性剂的水包油乳液及其用途
CN112999154B (zh) * 2021-03-16 2022-07-29 中国科学院过程工程研究所 一种可发生柔性形变的白蛋白水包油乳液及其制备方法和应用
CN113171450A (zh) * 2021-04-20 2021-07-27 浙江大学 调控适应性细胞与体液免疫的纳米载体的构建与应用
CN114984201B (zh) * 2022-04-24 2025-10-17 国药中生生物技术研究院有限公司 类天然脂滴纳米乳佐剂及其制备方法

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