CN120303392A - 来源于多能细胞的髓系谱系 - Google Patents

Abstract

本公开提供了用于从人类诱导多能干细胞(iPSC)产生髓系细胞谱系的高效体外方法。根据本公开在各种实施例中产生的细胞是功能性的和/或更接近地类似于从外周血、骨髓或其他组织中分离的对应谱系。本发明在一些方面提供了通过本文公开的方法产生的经分离的细胞和细胞组合物，以及用于细胞疗法的方法。

Description

来源于多能细胞的髓系谱系

相关申请的交叉引用

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序列表

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背景技术

先天髓系谱系细胞在组织维持中发挥着至关重要的作用，并有助于协调免疫反应。然而，它们的临床使用受到可以从常规白细胞去除产品中分离的此类细胞小的数量的阻碍。因此，开发大规模、现成的髓系谱系细胞(例如像单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、和嗜中性粒细胞及其前体)是一种颇具吸引力的免疫疗法，以开发为对抗炎症、自身免疫性疾病、癌症、抗菌疾病等的工具。

发明内容

本公开在各个方面和实施例中提供了用于产生用于细胞疗法的造血谱系的方法，包括先天髓系谱系，诸如单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞和嗜中性粒细胞、以及其前体。在各种实施例中，本发明提供了从人类诱导多能干细胞(iPSC)(包括基因编辑的iPSC)开发此类造血谱系的有效体外方法。根据本公开在各种实施例中产生的细胞是功能性的和/或更接近地类似于从外周血或骨髓中分离的对应谱系。本发明还提供了通过本文公开的方法产生的经分离的细胞和细胞组合物，以及用于细胞疗法的方法。

一方面，本公开提供了一种制备包含先天免疫系统的髓系细胞的细胞群体的方法。该方法包括制备多能干细胞(PSC)群体(诸如分化为胚状体的诱导多能干细胞(iPSC)群体)，并富集CD34+细胞，从而制备CD34+富集的群体。在CD34+富集的群体中诱导内皮细胞到造血细胞转变(EHT)，从而制备造血干细胞(HSC)群体，之后任选地进一步富集CD34+细胞。所得的HSC群体(或其级分)可以分化为先天免疫系统的髓系谱系(例如，吞噬细胞或其前体)。在一些实施例中，本公开提供了一种从HSC群体体外生成嗜中性粒细胞、单核细胞/巨噬细胞以及未成熟和成熟髓系树突状细胞(DC)(或其前体)的方法。

在各种实施例中，iPSC通过对体细胞进行重编程来制备。在一些实施例中，iPSC由体细胞产生，诸如(但不限于)成纤维细胞或PBMC(或从其分离的细胞)。在一些实施例中，iPSC来源于从外周血分离的CD34+细胞。

在各种实施例中，对iPSC进行基因编辑以辅助HLA匹配，诸如使一个或多个HLA I类和/或II类等位基因缺失。例如，iPSC可以经基因编辑以使HLA-A、HLA-B和HLA-C中的一者或多者缺失，并且使HLA-DP、HLA-DQ和HLA-DR中的一者或多者缺失。在某些实施例中，iPSC保留至少一种HLA I类和至少一种HLA II类复合物的表达。在某些实施例中，iPSC对于至少一个保留的I类和II类基因座是纯合的。在一些实施例中，iPSC经基因编辑为HLA-A^neg、对于HLA-B和HLA-C两者均为纯合的、以及HLA-DPB1^neg和HLA-DQB1^neg。在一些实施例中，iPSC对于HLA-DRB1是进一步纯合的。

在各种实施例中，使用培养系统制备和扩增iPSC。可以从培养物中回收经扩增的iPSC，以产生胚状体(EB)。由iPSC分化产生的EB是iPSC的三维聚集体，并且包含三个(或者替代性地两个或一个)胚层(取决于分化方法)。在一些实施例中，该方法包括从EB中收获CD34+富集的细胞，并诱导内皮细胞到造血细胞分化。

在一些实施例中，iPSC分化进行直至细胞为至少约20％ CD34+或至少约30％CD34+。在一些实施例中，可以在iPSC分化的第7天至第14天诱导CD34富集和EHT。iPSC的分化可以根据已知的技术进行。在一些实施例中，iPSC分化涉及以下因子，诸如但不限于bFGF、Y27632、BMP4、VEGF、SCF、EPO、TPO、IL-6、IL-11和/或IGF-1的组合。

对EHT的诱导可以用任何已知的方法进行。在一些实施例中，对EHT的诱导产生包含LT-HSC的造血干细胞(HSC)群体。在一些实施例中，EHT使用机械、生物化学、药理学和/或遗传学手段(例如，通过刺激、抑制和/或遗传修饰)通过内皮细胞或造血内皮细胞(HEC)前体产生HSC。在一些实施例中，EHT产生干细胞群体，该干细胞群体包含长期造血干细胞(LT-HSC)、短期造血干细胞(ST-HSC)和造血干细胞祖细胞中的一者或多者。

在一些实施例中，该方法包括增加DNA(胞嘧啶-5-)-甲基转移酶3β(Dnmt3b)在PSC、胚状体、CD34+富集的细胞、EC、HEC或HSC中的表达或活性，这可以通过机械、遗传、生物化学或药理学手段进行。例如，在一些实施例中，细胞与有效量的机械敏感受体或机械敏感通道激动剂接触，该激动剂增加Dnmt3b的活性或表达。在一些实施例中，机械敏感受体是Piezol。示例性的Piezol激动剂是Yoda1。在各种实施例中，将药理学Piezo1激活应用于从EB中收获的CD34+细胞。在一些实施例中，该方法不涉及增加dnmt3b的表达，诸如通过使用Piezo1激动剂。

在各种实施例中，CD34+细胞(例如，漂浮细胞和/或贴壁细胞)是在iPSC分化的第10天至第20天之间(诸如iPSC分化的第12天至第17天)经历内皮细胞到造血细胞转变的培养物中收获的。能够产生先天性髓系、红系和淋巴谱系的造血干细胞(HSC)可以通过基于CD34的表达和谱系特异性标记(称为Lin-)的缺失来鉴定。

在各种实施例中，HSC群体或其级分分化为造血谱系，其可以选自共同髓系祖细胞(CMP)、淋巴样预处理多能祖细胞(LMPP)、粒细胞巨噬细胞DC祖细胞(GMDP)、粒细胞/巨噬细胞谱系限制性祖细胞(GMP)、巨核细胞/红细胞祖细胞(MEP)、巨噬细胞/树突状细胞(DC)祖细胞(MDP)、共同DC祖细胞(CDP)、常规(或经典)髓系树突状细胞(cDC)、共同单核细胞祖细胞(cMoP)和浆细胞样DC(pDC)及其级分，从中可以产生单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞。

在一些实施例中，细胞被修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)。此外，或任选地，吞噬CAR可以被工程化以表达细胞因子(例如，IL-4、IL-6、IL-15等或干扰素)，以使表达CAR的细胞在靶向肿瘤方面更有效(例如)。在非限制性实例中，细胞可以通过载体有效转导，诸如但不限于携带CAR的逆转录病毒或非整合病毒载体或非病毒载体。在一些实施例中，CAR可以靶向肿瘤相关抗原或标记物。

在其他方面，本发明提供了一种包含髓系细胞或其前体的细胞群体或其药学上可接受的组合物，并且其可以通过本文所述的方法产生。在一些实施例中，细胞群体是祖细胞髓系谱系细胞群体，其在施用于有需要的受试者后能够植入胸腺、脾脏或次级淋巴器官。在各种实施例中，制备用于细胞疗法的组合物，其包含细胞群体和药学上可接受的赋形剂。在一些实施例中，细胞群体是HLA-A^neg、对于HLA-B和HLA-C两者均为纯合的、以及HLA-DPB1^neg和HLA-DQB1^neg。在一些实施例中，细胞群体对于HLA-DRB1是进一步纯合的。在各种实施例中，组合物包含选自单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、嗜中性粒细胞和髓系祖细胞中的一种或多种的髓系谱系。

在其他方面，本发明提供了一种细胞疗法方法，包括向有此需要的人受试者施用本文所述的细胞群体或其药学上可接受的组合物。在各种实施例中，本文所述的方法用于治疗血液(恶性和非恶性)、骨髓、免疫疾病和感染性疾病。在各种实施例中，人类受试者患有包括淋巴细胞减少、癌症、免疫缺陷、自身免疫性疾病中的一种或多种的病症。

从以下详细的公开内容和工作实例中，本公开的其他方面和实施例将变得显而易见。

附图说明

图1显示ETV2过表达(OE)不影响多能性。图1显示代表iPSC用腺病毒载体过表达ETV2和GFP序列的转导效率的FACS图。如TRA-1-60干细胞标记物的表达所示，ETV2过表达不影响iPSC干细胞特性。

图2显示ETV2过表达(OE)增加造血内皮细胞的产率。造血内皮细胞(描述为CD235a-CD34+CD31+)的代表性流式细胞仪分析和相对定量表明ETV2-OE增强造血内皮细胞的形成。

图3显示ETV2过表达(OE)增强iPSC分化期间CD34+细胞的形成。CD34+细胞的代表性流式细胞仪分析，并且相对定量表明ETV2-OE增强CD34+细胞的形成。

图4A和图4B显示用Piezo1激活来源的iPSC来源的HSC经历与骨髓(BM)-HSC类似的原T细胞分化。图4A是用Piezo1激活来源的骨髓(BM)HSC和iPSC-HSC向CD34+CD7+前T细胞分化效率的FACS图。图4B是对通过(1)BM-HSC和(2)iPSC-HSC(Piezo1激活)来源的CD34+CD7+细胞(％)的定量。图4B显示三次实验的平均值。

图5A和图5B显示用Piezo1激活产生的iPSC来源的HSC经历T细胞分化，并且可以类似于BM-HSC被CD3/CD28珠激活。图5A是用Piezo1激活产生的BM-HSC和iPSC来源的HSC分化的T细胞的激活效率(CD3+CD69+表达)的FACS图。图5B是对通过(1)BM-HSC和(2)iPSC-HSC(Piezo1激活)来源的CD3+CD69+细胞(％)的定量。图5B显示三次实验的平均值。

图6显示iPSC来源的HSC(在该实例中用Piezo1激活)可以分化为功能性T细胞。IFNγ表达是T细胞受体(TCR)经由CD3/CD28珠刺激后T细胞激活的结果。在Piezo1激活后产生的由iPSC来源的HSC分化的T细胞中IFNγ的表达增强了HSC进一步分化为功能性细胞的能力(例如，T细胞、髓系细胞等)。图6显示三次实验的平均值。

图7A和图7B显示来源于分化的iPSC(D8+7)的HSC可以分化为嗜中性粒细胞，如通过CD15+和CD11b(嗜中性粒细胞标记物)的存在(图7A)或由嗜中性粒细胞释放髓过氧化物酶(MPO)(图7B)所鉴定，并且在向嗜中性粒细胞分化方面优于D8-iPSC-CD34+细胞。

图8A和图8B显示，由来源于分化的iPSC(D8+7)的HSC分化的嗜中性粒细胞具有吞噬活性。

图9A和图9B显示通过FACS和免疫荧光进行的HLA编辑的(例如，三重敲除)细胞的表型分析。图9A显示HLA I类分子(HLA-A、HLA-B和HLA-C)在细胞表面的总体表达，其中HLA编辑的细胞对总体HLAI类表达呈阳性，其程度与野生型细胞(即，gHSC)相似。图9B显示经由免疫荧光的HLA-A的细胞表达，其中HLA-A在HLA编辑的克隆中不表达。

图10显示HLA编辑的克隆保留它们的多能性(保持三系分化)，如免疫荧光所示，其中外胚层分化由巢蛋白-488和PAX6-594染色指示，中胚层分化由GATA-488染色指示，并且内胚层分化由CXCR4-488和FOX2A-594染色指示。

图11显示了HLA编辑的HSC的免疫相容性。将HLA编辑的HSC和对照HSC(WT、B2M KO和HLA II类无效)与HLA-B和HLA-C匹配但HLA-A不匹配的外周血单核细胞(PBMC)共培养，并且通过膜联蛋白V染色测定来测量PBMC介导的细胞毒性。

图12显示HLA编辑的HSC的体内移植潜力。将等比例的mCherry HLA编辑的HSC和野生型HSC(gHSC)混合，用于竞争性移植到小鼠中，其中通过FACS评估骨髓(BM)和外周血样品，以比较样品中存在的每种细胞类型的相对量。

图13A和13B显示，HLA-A的缺失不影响I类肽的呈递。图13A显示免疫肽组分析的示意图。图13B显示免疫肽组分析的结果，结果显示WT和HLA编辑细胞的I类分子呈递的肽和代表性蛋白的数量存在极小差异。

图14A和14B显示HLA-DP和DQ的缺失不影响II类肽的呈递。图14A显示免疫肽组分析图。图14B显示，尽管HLA-DP和DQ的缺失，细胞仍然保留了其通过HLA II类呈递广谱肽的能力。

图15是抗原介导免疫反应在体内测试的示意图：分别为迟发型超敏反应测定(DTH)、致敏阶段和消除阶段。

图16A和16B显示经HLA编辑的HSC重建了功能性免疫系统，如通过免疫缺陷小鼠的DTH反应证实。图16A显示对移植小鼠进行的迟发型超敏反应测定，该测定涉及不同类型的免疫细胞的相互作用。通过皮下注射绵羊红细胞(抗原)使小鼠致敏。功能性免疫系统导致左爪肿胀，用微型卡尺测量。如图16A中可以看出，非移植小鼠由于其免疫缺陷，没有显示任何左爪肿胀。相反地，移植有脐带血CD34+细胞的小鼠显示组织肿胀，并且其左爪直径增加一倍。图16B是对图16A所示结果的图形评估。

图17A和17B显示WT和HLA编辑的HSC可以分化为单核细胞/巨噬细胞谱系，并且还保留了I类和II类分子两者的整体表达，如通过CD11b+CD14+标记物所鉴定(图17A)。图17B显示以CD11b+CD14+设门的细胞的HLA-I和HLA-II分析。

图18A至18C显示HLA-DQB1和HLA-DPB1缺失不影响其他HLAII类分子的表达。图18A是HLA编辑的iPSC分化为巨噬细胞的示意图。图18B是免疫荧光实验，证实了DPB1和DQB1分子的特异性缺失。图18C显示相同的细胞保留了II类DRB1的表达。

术语“gHSC”在本文中用于指本公开的iPSC来源的造血干细胞。

术语“野生型”(WT)、“未编辑的”、“非HLA编辑的”在本文中可互换使用，以指代本公开的非基因编辑的细胞。

EB34+细胞指胚胎体来源的CD34+细胞。这些包括造血内皮细胞。

具体实施方式

本公开在各个方面和实施例中提供了用于产生用于细胞疗法的造血谱系的方法，包括先天髓系谱系，诸如单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞和嗜中性粒细胞、以及其前体。前体包括共同髓系祖细胞(CMP)、粒细胞/巨噬细胞谱系限制性祖细胞(GMP)、巨噬细胞/树突状细胞(DC)祖细胞(MDP)、共同DC祖细胞(CDP)、常规(或经典)髓系树突状细胞(cDC)、共同单核细胞祖细胞(cMoP)和浆细胞样DC(pDC)。在各种实施例中，本发明提供了从人类诱导多能干细胞(iPSC)(包括基因编辑的iPSC)开发此类造血谱系的有效体外方法。根据本公开在各种实施例中产生的细胞是功能性的和/或更接近地类似于从外周血或骨髓中分离的对应谱系。本发明还提供了通过本文公开的方法产生的经分离的细胞和细胞组合物，以及用于细胞疗法的方法。

根据本公开的方面和实施例，人类诱导多能干细胞(hiPSC)产生基本上无限的多能干细胞(PSC)的能力被用来产生无限的造血细胞供应，包括但不限于产生免疫细胞的先天髓系谱系或其基因修饰版本(例如，CAR-T表达细胞)的治疗谱系。先天免疫系统髓系谱系在疗法中的用途一直受到其有限的可用性、细胞数量、受限的扩增潜力和组织相容性问题的限制。此外，与原代细胞相比，hiPSC可以更容易地在体外进行遗传修饰，从而提供改善细胞靶向特异性、细胞数量以及绕过例如HLA匹配问题。此外，与原代细胞相比，完全工程化的hiPSC克隆可以作为稳定且安全的来源(Nianias和Themeli，2019)。此外，由于hiPSC与人类胚胎干细胞(hESC)不同，是非胚胎来源的，因此它们也没有伦理顾虑，并且质量一致。因此，使用根据本公开的hiPSC具有优于原代细胞的若干优点，以产生治疗性造血谱系，诸如单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞(未成熟和成熟树突状细胞)、嗜中性粒细胞及其前体。

一方面，本公开提供了一种用于在先天免疫系统中制备包含髓系细胞的细胞群体的方法。该方法包括制备多能干细胞(PSC)群体(诸如分化为胚状体的诱导多能干细胞(iPSC)群体)，并富集CD34+细胞，从而制备CD34+富集的群体。在CD34+富集的群体中诱导内皮细胞到造血细胞转变(EHT)，从而制备造血干细胞(HSC)群体，之后任选地进一步富集CD34+细胞。所得的HSC群体(或其级分)可以分化为先天免疫系统的髓系谱系(例如，吞噬细胞或其前体)。

在一些方面和实施例中，本公开提供了一种从HSC群体中产生嗜中性粒细胞、单核细胞/巨噬细胞以及未成熟和成熟髓系DC(或其前体)的方法。

传统上，通过iPSC分化为胚状体直至第8天以收获CD34+细胞来制备造血谱系。CD34通常用作造血内皮细胞、造血干细胞和造血祖细胞的标记物。根据本公开的方面和实施例，发现诱导CD34+细胞群体的内皮细胞到造血细胞转变(EHT)并且其可以来源于iPSC胚状体，可以用于体外产生高级造血谱系。

在一些实施例中，髓系谱系是粒细胞，诸如嗜中性粒细胞。也就是说，包含嗜中性粒细胞的细胞群体由HSC分化。嗜中性粒细胞与嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞一起是粒细胞的亚群。在免疫系统受到攻击的事件中，嗜中性粒细胞首先到达现场。嗜中性粒细胞祖细胞和成熟嗜中性粒细胞分别被称为proNeu、preNeu、未成熟Neu和成熟Neu，这至少部分反映了原始粒细胞、早幼粒细胞、中幼粒细胞/晚幼粒细胞以及带状和分叶嗜中性粒细胞的常规形态学分类。

来自HSC的嗜中性粒细胞可以在培养条件下产生，并基于细胞表面分子的表达来鉴定。例如，可以通过CD117和CD49d的表达来定义不同的祖细胞阶段。CD117^midCD49d^high细胞可分为SSC^lowCD34+细胞和SSC^highCD34-细胞，分别代表原始粒细胞(proNeu1)和早幼粒细胞(proNeu2/preNeu)。这些细胞进展至CD117-CD49d^mid，并是CD11b+CD101+，这定义了中幼粒细胞/晚幼粒细胞(未成熟-Neus)。CD117-CD49d^low细胞是CD11b+CD101+，并且可以另外地表达CD16，与带状/分叶嗜中性粒细胞(成熟Neu)相似。此外，这些HSC来源的细胞逐渐表达CD35，这也是人类髓系细胞在体内成熟的标记物。这些细胞亚群((i)CD117^mid CD49d^highSSC^low CD34+，(ii)CD117^mid CD49d^highSSC^high CD34-，(iii)CD117-CD49d^mid以及(iv)CD117-CD49d^low)在形态上分别与原始粒细胞、早幼粒细胞、中幼粒细胞/晚幼粒细胞和嗜中性粒细胞相似。

通过在干细胞因子(SCF)和IL-3存在下培养包含HSC的细胞群体，可以从HSC中分化早幼粒细胞。在各种实施例中，在粒细胞集落刺激因子(G-CSF)的存在下进一步培养HSC细胞群体。通过在G-CSF的存在下培养，早幼粒细胞可以分化为嗜中性粒细胞。

在一些方面和实施例中，髓系谱系是单核细胞或巨噬细胞。单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞是先天免疫中单核吞噬细胞系统的一部分，其中单核细胞是巨噬细胞和树突状细胞不同亚群的前体。它们存在于血液中，并作为常驻群体存在于全身许多器官中，包括脑、皮肤、肝脏、肺、肾脏和心脏。它们对于控制病原体、启动免疫反应和支持组织功能都至关重要。

通过在G-CSF和M-CSF存在下培养来源的早幼粒细胞，HSC群体可以分化为CD14+单核细胞，G-CSF和M-CSF触发髓系祖细胞向经典单核细胞分化。CD45表达此类分化的量度。还添加GM-CSF以促进单核细胞增殖。经典单核细胞群体的特征在于CD14，任选地通过CD11b进行分类。另外的细胞因子/生长因子，诸如但不限于SCF、TPO、IL-3和FLT-3配体，可以补充GM-CSF，以促进单核细胞的强劲生成。

可以用作单核细胞标识符的表型标记物包括但不限于CD9、CD11b、CD11c、CDw12、CD13、CD15、CDw17、CD31、CD32、CD33、CD35、CD36、CD38、CD43、CD49b、CD49e、CD49f、CD63、CD64、CD65s、CD68、CD84、CD85、CD86、CD87、CD89、CD91、CDw92、CD93、CD98、CD101、CD102、CD111、CD112、CD115、CD116、CD119、CDw121b、CDw123、CD127、CDw128、CDw131、CD147、CD155、CD156a、CD157、CD162、CD163、CD164、CD168、CD171、CD172a、CD180、CD206、CD131a1、CD2132、CDw210、CD226、CD281、CD282、CD284和CD286。在某些实施例中，单核细胞包括CD14+CD16-单核细胞、CD14+CD16+单核细胞或CD14-CD16+单核细胞。在各种实施例中，嗜中性粒细胞释放髓过氧化物酶(MPO)，其是先天免疫系统的关键要素，以提供对入侵病原体的防御。嗜中性粒细胞暴露于炎症介质(例如，趋化因子、细胞因子、补体蛋白或氧化剂诸如HOCl)也触发嗜中性粒细胞胞外陷阱(NET)的释放。因此，在一些实施例中，MPO被用作测量嗜中性粒细胞激活的标记物。

在一些实施例中，单核细胞分化为巨噬细胞。对于巨噬细胞分化，在人类M-CSF的存在下培养CD14+细胞。用于将单核细胞分化为巨噬细胞的方案是本领域技术人员熟知的。

在一些实施例中，细胞分化为树突状细胞(DC)。对于DC分化，CD14+细胞补充有GM-CSF和IL-4。在一些实施例中，将细胞接种于超低贴壁培养条件下，并使其进一步分化为树突状细胞。通过在培养基中补充LPS和/或TNFα可以实现树突状细胞的成熟。可以补充的其他因子包括IL-1β、INF-γ和PGE-2。用于将单核细胞分化为DC的方案是本领域技术人员熟知的。根据本公开，可以体外产生各种类型的巨噬细胞群体。

巨噬细胞分布于全身各种组织和器官中，并表现出高度的异质性和多样性。巨噬细胞表面表达的几种特异性标记物已被用于识别不同的亚群，诸如F4/80、CD68、SRA-1和CD169(2)。CD169+巨噬细胞是分布于人体多个组织和器官的独特巨噬细胞亚群。

来源于单核细胞前体的巨噬细胞取决于局部组织环境经历特异性分化。它们对组织内的环境因素(例如受损细胞、激活淋巴细胞或微生物产物)作出反应，分化成不同的功能表型。M1巨噬细胞表型的特征在于产生高水平的促炎细胞因子、介导对病原体的抵抗的能力力、强大的杀菌特性、产生大量的活性氮和氧中间体、以及促进Th1反应。相比之下，M2巨噬细胞的特征在于其参与寄生虫控制、组织重塑、免疫调节、肿瘤促进和高效的吞噬活性。M2巨噬细胞基于其不同的基因表达谱可以进一步分为多个亚群，具体是M2a、M2b、M2c和M2d。

通常表达的M1巨噬细胞标记物包括但不限于：CD64、IDO、SOCS1、CXCL10、CD86、CD80、MHCII、IL-1R、TLR2、TLR4、iNOS、SOCS3、CD83、PD-L1、CD69、MHCI、CD32、CD16、IFIT家族成员或ISG家族成员；而通常表达的人类M2巨噬细胞标记物包括但不限于多功能酶转谷氨酰胺酶2(TGM2)MRC1、CD23、CCL22、CD206、CD163和/或CD209。

巨噬细胞还包括T细胞受体+和CD169+巨噬细胞。这些巨噬细胞表达TCR共受体CD3以及TCRαβ和γδ亚型。TNF是巨噬细胞中TCRαβ表达的关键调节因子之一。TCRγδ巨噬细胞参与宿主对细菌激发(challenge)的防御。两种TCR+巨噬细胞亚群均表达已被证实为对T细胞信号传导必要的分子，诸如ZAP70、LAT、Fyn和Lck。此外，它们表现出强大的吞噬能力，并分泌趋化因子CCL2。

CD169+巨噬细胞主要位于次级淋巴器官中，但在免疫激活后重新分布。CD169+巨噬细胞能够将抗原呈递给B细胞并激活CD8+T细胞。CD169+巨噬细胞参与凋亡细胞清除诱导的免疫耐受，发挥抗肿瘤和抗病毒作用。

在一些实施例中，髓系谱系是树突状细胞(DC)谱系。DC检测内稳态失衡并处理抗原以呈递给T细胞，从而建立先天性免疫反应和适应性免疫反应之间的联系。此外，DC可以分泌细胞因子和生长因子来调节正在进行的免疫反应，并受其与其他免疫细胞(如自然杀伤细胞和先天淋巴细胞(ILC))相互作用的影响。

DC有两种不同的功能状态：“成熟”和“未成熟”。这些通过多种特征来区分，但激活次级淋巴器官中抗原特异性的初始T细胞是成熟DC的标志。DC成熟是由组织内稳态失调触发的，通过识别病原体相关分子模式(PAMP)或损伤相关分子模式(DAMP)来检测。

DC的标识符包括但不限于CD45+CD11c+CD1c+以及HLA-DR+。在LPS刺激后，DC经历成熟过程，并上调共刺激分子(诸如CD80和CD40)，而CD16、HLA-DR和PDL1则不受影响。其他可以用作DC标识符的其他表型标记物包括但不限于CD83、CD1a、CD1c、CD141、CD207、CLEC9a、CD123、CD85、CD180、CD187、CD205、CD281、CD282、CD284、CD286以及部分CD206、CD207、CD208和CD209。

DC可以进一步分为多种亚型，诸如浆细胞样DC(pDC)(fcer1/ILT3/ILT7/DR6)、髓系/常规DC1(cDC1)(CD141/CLEC9A/XCR1/CADM1/BTLA)、和髓样/常规DC2(cDC2)(CD1c/CD172a/FcεR1/SIRPA)和LC(langerin/CD1a)。

在各种实施例中，通过将CD34+细胞(例如，从EB解离中回收的)与有效量的机械敏感受体或机械敏感通道激动剂(其增加Dnmt3b的活性或表达)接触来产生粒细胞或吞噬细胞或其祖细胞(如本文所述)。在各种实施例中，CD34+细胞进一步在包含一种或多种生长因子和细胞因子的培养基中培养，这些生长因子和细胞因子选自TPO、SCF、Flt3L、IL3、IL-6、IL7、IL-11、IGF、bFGF和IL15，该培养基任选地包含VEGF、bFGF、BMP激活剂、Wnt通路激活剂或ROCK抑制剂(例如，thiazovivin或Y27632)中的一种或多种。由此产生HSC可以在生长因子和细胞因子(诸如但不限于IL-3、IL-7、IL-15、SCF和FLT-3L)的存在下培养。细胞可以在M-CSF和/或G-CSF的存在下培养，以分化为髓系谱系(如前所述)，并任选地补充有IL-4和TNF-α(如所述)。

在一些实施例中，CD34+细胞(即，从EB解离中回收的)与有效量的机械敏感受体或机械敏感通道激动剂接触，该激动剂增加Dnmt3b的活性或表达。在一些实施例中，机械敏感受体是Piezol。示例性Piezol激动剂包括Yoda1、单链(ss)RNA(例如，ssRNA40)、Jedi1和Jedi2或其类似物。在一些实施例中，机械敏感受体是Trpv4。示例性的Trpv4激动剂是GSK1016790A。诱导EHT的方式(无论是否使用机械敏感受体激动剂)均可使用，并且本文进行了描述。在一些实施例中，诱导EHT后，细胞(HSC或其子代)分化为免疫细胞的先天髓系谱系，即吞噬细胞谱系。

在各种实施例中，iPSC通过对体细胞进行重编程来制备。术语“诱导多能干细胞”或“iPSC”是指源于体细胞的细胞，诸如已经被重编程回到胚胎样多能状态的皮肤或血细胞。在一些实施例中，iPSC由体细胞产生，诸如(但不限于)成纤维细胞或PBMC(或从其分离的细胞)。在一些实施例中，iPSC来源于淋巴细胞、粒细胞/巨噬细胞谱系限制性祖细胞(GMP)、脐带血细胞、PBMC、CD34+细胞或其他人类初级组织。在一些实施例中，iPSC来源于从外周血分离的CD34+细胞。在各种实施例中，iPSC对于受体(需要如本文所述治疗的受试者)而言是自体的或同种异体的(例如，在一个或多个基因座处HLA匹配的)。在各种实施例中，iPSC可以经基因编辑以帮助HLA匹配(诸如使一个或多个HLA I类和/或II类等位基因或它们的主调节因子缺失，包括但不限于β-2-微球蛋白(B2M)、CIITA等)，或经基因编辑以使其他功能缺失或表达其他功能。例如，iPSC可以经基因编辑以使HLA-A、HLA-B和HLA-C中的一者或多者缺失，并且使HLA-DP、HLA-DQ和HLA-DR中的一者或多者缺失。在某些实施例中，iPSC保留至少一种HLAI类和至少一种HLA II类复合物的表达。在某些实施例中，iPSC对于至少一个保留的I类和II类基因座是纯合的。

在各种实施例中，iPSC经基因编辑成为以下之一：(i)HLA-A-B+C+DP-DR+DQ+，(ii)HLA-A-B+C+DP+DR+DQ-，(iii)HLA-A-B+C+DP-DR+DQ-；(iv)HLA-A-B-C+DP-DR+DQ+；(v)HLA-A-B-C+DP+DR+DQ-、(vi)HLA-A-B-C+DP-DR+DQ-。对于保留的HLA(例如HLA-B、HLA-C和HLA-DR)，细胞可以是纯合的或仅保留基因的单个拷贝。例如，经修饰的细胞至少被鉴定为(a)HLA-C+和HLA-DR+，并且任选被鉴定为(b)HLA-B-、(c)HLA-DP-和(d)HLA-DQ-中的一者或多者。在示例性实施例中，经修饰的细胞是HLA-B+、HLA-DP-和HLA-DQ-。

在一些实施例中，iPSC经基因编辑为HLA-A^neg、对于HLA-B和HLA-C两者均为纯合的、以及HLA-DPB1^neg和HLA-DQB1^neg。在一些实施例中，iPSC对于HLA-DRB1是进一步纯合的。

如本文所用，关于特定HLA I类或II类分子的术语“阴性”(-)或“阴性”指示该基因的两个拷贝在细胞系或群体中均已被破坏，并且因此该细胞系或群体不显示该基因的显著功能性表达。此类细胞可以通过全部或部分基因缺失或破坏产生，或者替代性地通过其他技术诸如siRNA产生。如本文所用，术语“缺失”在靶基因的遗传修饰(即，基因编辑)的上下文中是指对应的基因产物(即，对应的多肽)的功能性表达的废除。此类基因编辑包括编码序列的全部或部分基因缺失或破坏，或关键顺式作用表达控制序列的缺失。

体细胞可以通过表达选自Sox2、Oct3/4、c-Myc、Nanog、Lin28和klf4的重编程因子而被重编程。在一些实施例中，重编程因子是Sox2、Oct3/4、c-Myc、Nanog、Lin28和klf4。在一些实施例中，重编程因子是Sox2、Oct3/4、c-Myc和klf4。用于制备iPSC的方法描述于例如美国专利10,676,165；美国专利9,580,689；以及美国专利9,376,664，这些专利特此以引用方式全文并入。在各种实施例中，使用众所周知的病毒载体系统诸如慢病毒、仙台病毒或麻疹病毒系统来表达重编程因子。替代性地，可通过将编码重编程因子的mRNA导入体细胞来表达重编程因子。此外，可以通过引入表达重编程因子的非整合型附加型质粒来产生iPSC，即，用于产生无转基因和无病毒的iPSC。可以采用已知附加型质粒，其具有有限的复制能力并且因此在经过几代细胞后会丢失。

在一些实施例中，人类多能干细胞(例如，iPSC)经基因编辑。基因编辑可以包括但不限于例如HLA基因修饰(例如，一个或多个HLA I类和/或II类基因的缺失)、β2微球蛋白(β2M)的缺失、CIITA的缺失、粒细胞或吞噬细胞受体基因的缺失或添加、或嵌合抗原受体(CAR)基因的添加。示例性CAR细胞(例如，单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞和嗜中性粒细胞)可以靶向肿瘤抗原，例如CD19、CD38、CD33、CD47和CD20中的一种或多种。

在一些实施例中，iPSC是使用长度为16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或更多核苷酸的gRNA进行基因编辑。在一些实施例中，gRNA包含在5'末端处或其附近的修饰(例如，在5'末端的1至10、1至5或1至2个核苷酸内)和/或在3'末端处或其附近的修饰(例如，在3'末端的1至10、1至5或1至2个核苷酸内)。在一些实施例中，经修饰的gRNA表现出对核酸酶的抗性增加。在一些实施例中，gRNA包含两个单独的RNA分子(即，“双gRNA”)。双gRNA包含两个单独的RNA分子：“crispr RNA”(或“crRNA”)和“tracr RNA”，并且是本领域技术人员所熟知的。

通常，各种基因编辑技术是已知的，其可以根据本公开的各种实施例来应用。基因编辑技术包括但不限于锌指(ZF)、转录激活因子样效应器(TALE)等。含有这些DNA结合结构域和Fokl核酸内切酶的切割结构域中的一者或多者的融合蛋白可用于在细胞中的DNA的所需区域中产生双链断裂(参见，例如，美国专利申请公开号US2012/0064620、美国专利申请公开号US2011/0239315、美国专利号8,470,973、美国专利申请公开号US 2013/0217119、美国专利号8,420,782、美国专利申请公开号US2011/0301073、美国专利申请公开号US2011/0145940、美国专利号8,450,471、美国专利号8,440,431、美国专利号8,440,432和美国专利申请公开号2013/0122581，其所有内容特此以引用的方式并入)。在一些实施例中，基因编辑使用本领域已知的CRISPR相关Cas系统(例如，CRISPR-Cas9)来进行。参见例如US 8,697,359、US 8,906,616和US 8,999,641，这些中的每一者特此以引用方式全文并入。在各种实施例中，基因编辑采用II型Cas核酸内切酶(诸如Cas9)或V型Cas核酸内切酶(诸如Cas12a)。II型和V型Cas核酸内切酶是RNA引导的。引导所需基因编辑(同时限制或避免脱靶编辑)的gRNA设计是本领域已知的。参见例如Mohr SE等人,CRISPR guideRNA design for research applications,FEBS J.2016年9月；283(17):3232–3238。在其他实施例中，可以采用与化脓性链球菌Cas9或普雷沃氏菌和弗朗西斯菌1(Cpf1或Cas12a)具有同源性(尽管一级序列同源性低)的非规范II型或V型Cas核酸内切酶。本领域已知许多此类非规范Cas核酸内切酶。Nidhi S,等人Novel CRISPR–Cas Systems: An Updated Review of theCurrent Achievements,Applications, and FutureResearchPerspectives,Int J MolSci.2021年4月；22(7):3327。在其他实施例中，基因编辑采用碱基编辑或引物编辑来结合突变，而不引起双链断裂。参见例如Antoniou P等人,Base andPrimeEditing Technologies for BloodDisorders,Front.Genome编辑,2021年1月28日；Matsuokas IG,Prime Editing:Genome Editing for RareGeneticDiseases Without Double-Strand Breaks or Donor DNA,Front.Genet.,2020年6月9日。各种其他基因编辑过程是已知的，包括使用死Cas(dCas)系统(例如，Cas融合蛋白)将DNA修饰酶导向所需靶，使用dCas作为引导RNA导向系统。Brezgin S,Dead Cas Systems: Types,Principles,and Applications,IntJ Mol Sci.2019年12月；20(23):6041。

可以在不产生双链DNA断裂的情况下安装精确基因组改变的碱基编辑器也可以用于细胞(例如，iPSC)中的基因编辑(例如，设计基因疗法载体)。碱基编辑器基本上包含催化禁用的核酸酶，诸如Cas9镍酶(nCas9)，它不能产生DSB，并且与核碱基脱氨酶融合，并且在一些情况下，与DNA糖基化酶抑制剂融合。目前，存在2种主要的碱基编辑器，胞苷碱基编辑器(CBE)和腺嘌呤碱基编辑器(ABE)，它们催化C>T和A>G转变。碱基编辑器可通过例如HDAd5/35++载体递送，以高效地编辑启动子和增强子，从而将基因激活或失活。示例性的方法描述于美国专利号9,840,699；10,167,457；10,113,163；11,306,324；11,268,082；11,319,532；和11,155,803。还设想包含与Cas核酸内切酶缀合(例如，融合)的逆转录酶和用作DNA合成模板的与引导RNA缀合(例如，融合)的多核苷酸的引物编辑器，如WO 2020/191153中所述。

可用于基因组编辑应用的示例性载体包括但不限于质粒、逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体(例如，Ad5/35、Ad5、Ad26、Ad34、Ad35、Ad48)、细小病毒(例如，腺相关病毒(AAV)载体、单纯疱疹病毒载体、杆状病毒载体、冠状病毒、负链RNA病毒诸如正粘病毒(例如，流感病毒)、弹状病毒(例如，狂犬病和水泡性口炎病毒)、副粘病毒(例如麻疹和仙台病毒)、正链RNA病毒诸如小核糖核酸病毒和甲病毒以及双链DNA病毒(包括疱疹病毒(例如，1型和2型单纯疱疹病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、巨细胞病毒)和痘病毒(例如金丝雀痘病毒、痘苗病毒或改良痘苗病毒))。可以通过本领域已知的任何方法，包括但不限于转导、转染、感染和电穿孔，将包含目的核酸分子的载体递送至细胞(例如，iPS细胞、内皮细胞、造血内皮细胞、HSC(ST-HSC或LT-HSC))。这些载体中的任一者都可以包括转座元件(诸如背负式转座子或睡美人转座子)。转座子将特定的DNA序列插入脊椎动物的基因组中。一旦从转座子上切除，的基因可以通过转座酶催化切割存在于细胞核基因组内的相似切除位点而整合到哺乳动物细胞的基因组中。

为了提高效率，在一些实施例中，Cas和gRNA可以在被递送到细胞中之前进行组合。Cas-gRNA复合物被称为核糖核蛋白(RNP)。已经开发出将RNP直接递送至细胞的许多方法。例如，可以通过脂转染或电穿孔将RNP递送到培养物中的细胞中。可以采用使用核转染方案的电穿孔，并且此程序允许RNP快速进入细胞核，因此可以立即开始切割基因组。参见例如Zhang S,Shen J,Li D,Cheng Y.Strategies in thedeliveryofCas9ribonucleopro teinfor CRISPR/Cas9 genome editing.Theranostics.2021年1月1日；11(2):614-648，其特此以引用方式全文并入。在一些实施例中，Cas9和gRNA作为RNP电穿孔到供体iPSC和/或HSC中。

通常，原间隔区相邻基序(PAM)是Cas核酸酶切割所需要的，并且该原间隔区相邻基序通常在切割位点下游3至4个核苷酸处发现。PAM是短的DNA序列(通常长度为2至6个碱基对)，它位于针对由CRISPR系统(诸如CRISPR-Cas9)切割的DNA区域之后。在一些实施例中，靶向HLA基因座的单倍型或多态性的PAM序列、sgRNA或碱基编辑工具不包括四个G、四个C、GC重复序列或其组合。

在一些实施例中，对独特HLA单倍型具有特异性的CRISPR/Cas9系统可通过设计靶向供体特异性HLA-A、HLA-DPB1和HLA-DQB1基因(例如)中的每一者的单一gRNA，使用本文所述的gRNA来开发。为了进行基因敲除，gRNA将Cas9蛋白靶向到合适的位点进行编辑。接下来，Cas9蛋白可以执行双链断裂(DSB)，其中DNA通过非同源末端连接(NHEJ)机制进行修复，该机制产生导致移码突变的indels，并且终止所得蛋白质的功能。然而，脱靶基因修饰可以发生并且改变其他完整基因的功能。例如，即使在一定程度的不匹配存在的情况下，Cas9核酸内切酶仍可以在不需要的脱靶位置处产生DSB。这种脱靶活动可以产生基因组不稳定事件，诸如点突变和基因组结构变异。在各种实施例中，靶向HLA-A的sgRNA可以靶向定义为29942532-29942626的6号染色体区域。在各种实施例中，靶向HLA-DQB1的sgRNA可以靶向定义为32665067-32664798的6号染色体区域。在各种实施例中，靶向HLA-DPB1的sgRNA可以靶向定义为33080672-33080935的6号染色体区域。

gRNA可用于开发克隆iPSC。可以评估此类iPSC系的(i)靶上编辑，(ii)脱靶编辑，和(iii)易位编辑，例如使用测序，如本文所述。具体来说，此种测定可以通过多重PCR进行，该多重PCR利用经设计以靶向和富集目的区域的引物，然后进行下一代测序(例如，扩增子测序，AMP-seq)。靶上组和易位组可以扩增预期的编辑区域，允许选择具有预期编辑的iPSC克隆，其没有由非预期的DSB切割位点融合引起的染色体易位。脱靶组可以富集通过测序鉴定的任何潜在的脱靶区域，并且允许选择脱靶突变可忽略的iPSC克隆。总之，这些测定使iPSC克隆的筛选能够选择具有所需编辑的克隆，同时排除潜在的CRISPR/Cas9相关的基因组完整性问题。

在一些实施例中，为了进一步确保经重编程和编辑的iPSC的基因组稳定性和完整性，可以执行遗传和基因组测定以选择例如没有经历易位和突变事件并且没有整合附加型载体的克隆。例如，对CD34+细胞和重编程后的iPSC克隆进行全基因组测序(WGS)，其中比较基因组的因编辑而产生的差异。这些分析提供对哪些iPSC克隆基因组不同于CD34+起始材料的评估，使得能够明智地选择在重编程期间不产生突变的iPSC克隆。

在一些实施例中，使用系统诸如KARYOSTAT测定的核型分析用于选择在重编程期间不产生indel和易位的iPSC克隆，例如在Ramme AP,等人,“Supporting datasetoftwo integration-freeinduced pluripotent stem cell lines fromrelatedhumandonors,”Data Brief.2021年5月15日；37:107140中所述，其特此以引用方式全文并入。KARYOSTAT测定允许以类似于G显带核型分析的分辨率将染色体畸变可视化。对于染色体获得，可以检测到的结构异常的大小>2Mb，并且对于染色体丢失，可以检测到的结构异常的大小>1Mb。KARYOSTAT阵列经功能化用于通过低分辨率DNA拷贝数分析来实现平衡的全基因组覆盖，其中测定覆盖所有36,000个RefSeq基因，包括14,000个OMIM靶标。该测定能够检测非整倍体、亚显微畸变和镶嵌事件。

在一些实施例中，使用阵列比较基因组杂交(aCGH)分析来选择在重编程期间不产生拷贝数畸变(CNA)的iPSC克隆，例如如Wiesner等人“Molecular Techniques”，编辑：Klaus J.Busam,Pedram Gerami,Richard A.Scolyer,“Pathology of MelanocyticTumors,”Elsevier,2019,364-373页,ISBN 9780323374576；以及Hussein SM,等人“Copynumber variation and selection during reprogramming to pluripotency,”Nature.2011年3月3日；471(7336):58-62中所述，其特此以引用方式全文并入。aCGH是通过比较样品DNA和参考DNA来分析CNA的整个基因组的技术。

在一些实施例中，靶向血红素恶性肿瘤NGS组分析用于选择在重编程期间不产生血液恶性肿瘤突变的iPSC克隆。例如，靶向血红素恶性肿瘤NGS组可以专注于髓性白血病、淋巴瘤和/或其他血液恶性肿瘤相关基因，以产生比更广泛的方法更小、更易于管理的数据集。靶向血红素恶性肿瘤NGS组分析包括使用高度多重PCR扩增与血液恶性肿瘤相关联的区域，然后进行下一代测序。

在一些实施例中，液滴式数字PCR(ddPCR)用于选择iPSC克隆，其不整合附加型载体，并且已经足够传代以进行附加型载体清除。如本文所述，CD34+细胞的iPSC重编程可以通过递送编码重编程因子的附加型载体来实现。然而，尽管很少，附加型载体可以随机整合到细胞基因组中，这可能破坏发育过程、体内平衡等。因此，ddPCR方法可用于检测iPSC培养物中残留的附加型载体，并且能够选择不整合附加型载体的iPSC克隆。

在一些实施例中，在评估所选择的克隆没有与编辑相关的基因组畸变后，可以另外测试克隆在扩增期间可能出现的自发突变。例如，影响血液恶性肿瘤基因、indel、易位、数量畸变的突变，例如，如经预编辑的重编程克隆所述。自发突变的分析可包括全基因组测序(WGS)、KARYOSTAT分析、阵列比较基因组杂交(aCGH)分析、靶向血红素恶性肿瘤NGS组AMP-Seq分析和/或液滴式数字PCR(ddPCR)。

在各种实施例中，使用培养系统制备和扩增iPSC。可以从培养物中回收经扩增的iPSC，以产生胚状体(EB)。由iPSC分化产生的EB是iPSC的三维聚集体，并且基于分化方法包含三个(或者两个或一个)胚胎胚层。例如，EB的制备描述于US2019/0177695中，其特此以引用方式全文并入。在一些实施例中，通过iPSC的分化制备的EB在生物反应器中扩增，例如Abecasis B.等人,Expansion of3D human induced pluripotent stem cell aggregates in bioreactors: Bioprocess intensification and scaling-up approaches.J.ofBiotechnol.246(2017)81-93中所述。EB可用于产生任何所需细胞类型。用于EB的扩增或分化的其他方法，包括3D悬浮培养描述于WO 2020/086889中，其特此以引用方式全文并入。

在一些实施例中，根据每个方面的方法可以包括从多能干细胞(例如，EB)产生CD34+富集的细胞并且诱导内皮细胞到造血细胞分化。包含相对高频率LT-HSC的HSC可使用以下从细胞群体中产生：各种刺激或因素，包括机械、生物化学、代谢和/或地形刺激，以及诸如细胞外基质、小生境因素、细胞外源性因素、细胞内在特性的诱导等因素；并且包括药理学和/或遗传学手段。

在一些实施例中，该方法包括在对EHT诱导之前，从多能干细胞制备具有造血潜能的内皮细胞。在一些实施例中，GATA2/ETV2、GATA2/TAL1或ER71/GATA2/SCL的组合过量表达可导致从PSC来源形成具有造血潜能的内皮细胞。在一些实施例中，该方法包括在iPSC中过量表达E26转化特异性变体2(ETV2)转录因子。ETV2可通过引入编码非整合附加型质粒来表达，用于ETV2的组成型或诱导型表达，以及用于产生无转基因的造血EC。在一些实施例中，ETV2由引入至iPSC中的mRNA表达。可以使用任何可用的方法引入mRNA，包括电穿孔或脂转染。表达ETV2的细胞的分化可以包括添加VEGF-A。参见Wang K,等人,Robust differentiation ofhuman pluripotent stem cells into endothelial cells via temporal modulation ofETV2 with mRNA.Sci.Adv.第6卷(2020)。根据本公开的实施例，以这种方式产生的细胞可用于产生CD34+细胞和诱导EHT。

在CD34+富集后，使用机械、生物化学、药理学和/或遗传刺激或修饰从内皮细胞产生HSC。

在一些实施例中，iPSC分化进行直至细胞为至少约10％ CD34+，或至少约20％CD34+，或至少约25％ CD34+，或至少约30％ CD34+。在一些实施例中，CD34富集和EHT可以在iPSC分化的第7天至第14天(诸如例如第8天、第9天、第10天、第11天、第12天、第13天或第14天)被诱导。iPSC的分化可以根据已知的技术进行。在一些实施例中，iPSC分化涉及以下因子，诸如但不限于bFGF、Y27632、BMP4、VEGF、SCF、EPO、TPO、IL-6、IL-11和/或IGF-1的组合。在一些实施例中，使用无饲养层、无血清和/或GMP相容材料来分化hPSC。无血清培养物通常包含细胞因子/生长因子/小分子的混合物。

单核细胞谱系分化可以如以下公开在5个连续步骤中进行：Yanagimachi等人Robust and Highly Efficient Differentiation ofFunctional Monocytic Cells fromHuman Pluripotent Stem Cells under Serum-and Feeder Cell-Free Conditions.PLOSONE.2013年4月3日；8(4):e59243或其改进，诸如但不限于替换或省略细胞因子或步骤之一，以加速功能性单核细胞的分化。

在非限制性实例中，分离的单核细胞可以在补充有M-CSF的无血清中培养。然后，可以通过添加LPS和IFN-γ来刺激M1型巨噬细胞，或添加IL-4来刺激M2a型巨噬细胞极化。M1型巨噬细胞可以通过高水平的CD80和CCR7标记物以及低水平的CD206和CD209来鉴定。相比之下，M2a型巨噬细胞可以通过CD206和CD209来鉴定，其对CD80和CCR7任选地为阴性或低水平。巨噬细胞的功能性可以通过众所周知的技术来证明，诸如但不限于使用荧光标记的大肠杆菌进行吞噬测定。

替代性地，在一些实施例中，饲养层细胞(诸如STO小鼠成纤维细胞细胞饲养层)可以用于扩增髓系细胞(例如，吞噬细胞或其前体)。在一些实施例中，hPSC与鼠骨髓来源的饲养细胞诸如OP9、STO小鼠成纤维细胞或血液来源的外周血单核细胞(PBMC)或脐带血来源的间充质干细胞或淋巴细胞来源的癌细胞系细胞的饲养层在含血清的培养基中共培养。培养物可以含有生长因子和细胞因子以支持胚状体或单层系统的分化。饲养细胞共培养系统可用于产生多能HSPC，其可进一步分化成若干造血谱系，包括单核细胞或巨噬细胞、树突细胞、嗜中性粒细胞、NK细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、巨核细胞和红细胞。参见NetsrithongR.等人,Multilineage differentiation potential of hematoendothelial progenitors derived from human induced pluripotent stem cells,Stem CellResearch&Therapy Vol.11Art.481(2020)。替代性地，可以使用利用具有特定信号的限定条件的逐步过程。例如，HOXA9、ERG、RORA、SOX4和MYB在人类PSC中的表达有利于直接分化为具有多系潜能的CD34+/CD45+祖细胞。此外，因子诸如HOXB4、CDX4、SCL/TAL1或RUNX1a的表达支持人类PSC中的造血程序。参见Doulatov S.等人,Induction ofmultipotential hematopoietic progenitorsfromhumanpluripotent stemcells via re-specification oflineage-restricted precursors,Cell Stem Cell.2013年10月3日；13(4)。

对EHT的诱导可以用任何已知的方法进行。在一些实施例中，对EHT的诱导产生包含LT-HSC的造血干细胞(HSC)群体。在一些实施例中，EHT使用机械、生物化学、药理学和/或遗传学手段(例如，通过刺激、抑制和/或遗传修饰)通过内皮细胞或造血内皮细胞(HEC)前体产生HSC。在一些实施例中，EHT产生干细胞群体，该干细胞群体包含长期造血干细胞(LT-HSC)、短期造血干细胞(ST-HSC)和造血干细胞祖细胞中的一者或多者。在实施例中，使用包含一种或多种生长因子和细胞因子的培养基进行EHT，该细胞因子选自TPO、SCF、Flt3L、IL3、IL-6、IL7、IL-11、IGF、bFGF和IL15。该培养基可以任选地包含VEGF、bFGF、BMP激活剂、Wnt途径激活剂或ROCK抑制剂(例如噻唑威宁或Y27632)中的一者或多者。

在一些实施例中，该方法包括增加dnmt3b在PSC、胚状体、CD34+富集的细胞、EC、HEC或HSC中的表达或活性，这可以通过机械、遗传、生物化学或药理学手段进行。在一些实施例中，该方法包括增加细胞中的DNA(胞嘧啶-5-)-甲基转移酶3β(Dnmt3b)和/或GTP酶IMAP家族成员6(Gimap6)的活性或表达。参见WO 2019/236943和WO 2021/119061，它们特此以引用方式全文并入。在一些实施例中，对EHT的诱导包括增加dnmt3b的表达或活性。

在一些实施例中，细胞与有效量的机械敏感受体或机械敏感通道激动剂接触，该激动剂增加Dnmt3b的活性或表达。在一些实施例中，机械敏感受体是Piezol。示例性的Piezol激动剂是Yoda1。在一些实施例中，机械敏感受体是Trpv4。示例性的Trpv4激动剂是GSK1016790A。Yodal(2-[5-[[(2,6-二氯苯基)甲基]硫代]-1,3,4-噻二唑-2-基]-吡嗪)是针对机械敏感离子通道Piezol开发的小分子激动剂。Syeda R,Chemical activation ofthe mechanotransduction channel Piezol.eLife(2015)。

Yodal的衍生物可用于各种实施例中。例如，在一些实施例中，采用包含2,6-二氯苯基核的衍生物。示例性激动剂公开于Evans EL,等人,Yoda1 analogue (Dooku1) which antagonizesYoda1-evoked activation ofPiezo1 and aortic relaxation,BritishJ.of Pharmacology 175(1744-1759):2018中。其他Piezo1激动剂包括Jedi1、Jedi2、ssRNA40及其衍生物和类似物。参见Wang Y.,等人,Alever-like transduction pathwayfor long-distancechemical- and mechano-gatingofthemechanosensitivePie zo1 channel.Nature Communications(2018)9:1300；Sugisawa等人,RNASensingby Gut Piezo1 Is Essential for Systemic Serotonin Synthesis,Cell,Volume 182,Issue 3,2020,Pages 609-624，以引用方式全文并入本文。这些Piezo1激动剂是市售的。在各种实施例中，Piezo1激动剂或衍生物物的有效量在约1μM至约500μM、或约5μM至约200μM、或约5μM至约100μM的范围内，或者在一些实施例中，在约25μM至约150μM、或约25μM至约100μM、或约25μM至约50μM的范围内。

在各种实施例中，将药理学Piezo1激活应用于CD34+细胞(即，CD34+富集的细胞)。在某些实施例中，药理学Piezo1激活可以进一步应用于iPSC、胚状体、EC、血原性内皮细胞(HEC)、HSC、造血祖细胞以及造血谱系。在某些实施例中，Piezo1激活至少应用于由iPSC产生的EB、从EB中分离的CD34+细胞和/或其组合。

替代性地或另外，Dnmt3b的活性或表达可以在细胞中(例如在CD34富集的细胞中)直接增加。例如，Dnmt3b的mRNA表达可通过将编码Dnmt3b的转录物递送至细胞，或通过引入编码Dnmt3b的转基因，或无转基因方法(不限于将非整合附加体引入细胞)来增加。在一些实施例中，采用基因编辑向细胞中的Dnmt3b表达元件引入遗传修饰，诸如但不限于增加启动子强度、核糖体结合、RNA稳定性和/或影响RNA剪接。

在一些实施例中，该方法包括增加Gimap6在细胞中的活性或表达，单独或与Dnmt3b和/或在周期性应变或压电激活时被上调或下调的其他基因组合。为了增加Gimap6的活性或表达，可以将编码Gimap6的mRNA转录物引入细胞，也可以采用无转基因方法，包括但不限于将附加体引入细胞；或者替代性地编码Gimap6的转基因。在一些实施例中，采用基因编辑将遗传修饰引入细胞中的Gimap6表达元件(诸如一个或多个修饰以增加启动子强度、核糖体结合、RNA稳定性或影响RNA剪接)。

在本公开的采用mRNA递送至细胞的实施例中，可以使用已知的化学修饰来避免细胞中的先天免疫反应。例如，仅包含规范核苷酸的合成RNA可以结合模式识别受体，并且可以在细胞中触发有效的免疫反应。这种反应可导致翻译阻断、炎性细胞因子的分泌和细胞死亡。包含某些非常规核苷酸的RNA可以逃避先天免疫系统的检测，并且可以高效翻译成蛋白质。参见US 9,181,319，其特此以引用方式并入，特别是关于核苷酸修饰以避免先天免疫反应。

在一些实施例中，通过将转基因引入细胞来增加Dnmt3b和/或Gimap6的表达，这可以指导所需过表达水平(具有不同的启动子强度或表达控制元件的其他选择)。可以使用本领域已知的各种病毒载体或转染试剂(包括脂质纳米颗粒)来引入转基因。在一些实施例中，Dnmt3b和/或Gimap6的表达通过无转基因方法(例如，附加体递送)来增加。在一些实施例中，使用基因编辑技术增加Dnmt3b和/或Gimap6或本文公开的其他基因的表达或活性，例如，以引入一个或多个修饰以增加启动子强度、核糖体结合或RNA稳定性。

在一些实施例中，该方法不涉及增加dnmt3b的表达，诸如通过使用Piezo1激动剂。

在一些实施例中，该方法包括对细胞应用循环2D、3D或4D拉伸。在各种实施例中，经受周期性2D、3D或4D拉伸的细胞选自CD34富集的细胞、iPSC、EC和HEC中的一种或多种。例如，将细胞群体引入提供周期性应变生物力学拉伸的生物反应器，如WO 2017/096215中所述，其特此以引用方式全文并入。周期性应变生物力学拉伸可以增加Dnmt3b和/或Gimap6的活性或表达。在这些实施例中，机械手段向细胞或其上培养有细胞(例如，EC或HEC)的细胞培养表面施加拉伸力。例如，计算机控制的真空泵系统或用于提供附接到柔性生物相容性和/或仿生表面的拉伸力的其他构件(例如，FlexCell^TM张力系统、Cytostretcher系统)可用于在限定和受控的周期性应变条件下对细胞施加体外周期性2D、3D或4D拉伸。例如，施加的周期性拉伸可以是约1％至约20％的周期性应变(例如，约6％的周期性应变)，持续数小时或数天(例如，约7天)。在各种实施例中，施加周期性应变至少约一小时、至少约两小时、至少约六小时、至少约八小时、至少约12小时、至少约24小时、至少约48小时、至少约72小时、至少约96小时、至少约120小时、至少约144小时或至少约168小时。在各种实施例中，不采用周期性拉伸。

替代性地或附加地，EHT通过Trpv4激活来刺激。Trpv4激活可以通过使细胞(例如，CD34富集的细胞、EC或HEC)与一种或多种Trpv4激动剂接触，该激动剂任选地选自GSK1016790A、4α-PDD或其类似物和/或衍生物。

当细胞群体在本文中被描述为具有某种表型时，应理解该表型代表细胞群体的显著部分，诸如细胞群体的至少25％、至少40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约75％、或至少约80％、或至少约90％。此外，在各个步骤处，细胞群体可以富集所需表型的细胞，和/或去除不需要的表型的细胞，使得细胞群体包含所需表型的至少约75％，或至少约80％，或至少约90％。此种阳性和阴性选择方法是本领域已知的。例如，可以基于细胞表面抗原(包括本文所述的那些)使用荧光激活细胞分选仪或结合细胞与某些细胞表面抗原的磁珠来分选细胞。可以使用阴性选择柱来移除表达不需要的细胞表面标记物的细胞。在一些实施例中，富集细胞用于CD34+细胞(在经历EHT之前和/或之后)。在一些实施例中，在促进CD34+细胞的扩增的条件下培养细胞群体，从而产生扩增的干细胞群体。

在各种实施例中，CD34+细胞(例如，漂浮细胞和/或贴壁细胞)是在iPSC分化的第10天至第20天之间(诸如iPSC分化的第12天至第17天)经历内皮细胞到造血细胞转变的培养物中收获的。

在各种实施例中，HSC或CD34富集的细胞进一步扩增。例如，可以根据以下文献中公开的方法扩增HSC或CD34富集的细胞：US 8,168,428；US 9,028,811；US10,272,110；以及US10,278,990，这些专利特此以引用方式全文并入。在一些实施例中，HSC或CD34富集的细胞的体外扩增使用前列腺素E₂(PGE2)或PGE₂衍生物。在本公开的一些实施例中，HSC包含至少约0.01％ LT-HSC，或至少约0.05％ LT-HSC，或至少约0.1％ LT-HSC，或至少约0.5％LT-HSC，或至少约1％ LT-HSC。

产生先天髓系、红系和淋巴谱系的造血干细胞(HSC)可以基于CD34的表达和谱系特异性标记物(称为Lin-)的缺乏来鉴定。在一些实施例中，富集包含HSC的干细胞群体，例如，如US 9,834,754中所述，其特此以引用方式全文并入。例如，该方法可以包括基于CD34、CD90、CD38和CD43中的一者或多者的表达来分选细胞群体。可以选择是CD34⁺、CD90⁺、CD38^-和CD43^-中的一者或多者的组分用于进一步分化。在一些实施例中，用于分化成造血谱系的干细胞群体位至少约80％ CD34^-、或至少约90％ CD34⁺、或至少约95％ CD34⁺。

在一些实施例中，干细胞群体、或CD34富集的细胞或其级分、或衍生细胞群体如US2020/0308540中所述进行扩增，其特此以引用方式全文并入。例如，通过将细胞暴露于包括例如SR1或SR1衍生物的芳香烃受体拮抗剂来扩增细胞。另外参见Wagner等人,Cell StemCell 2016；18(1):144-55和Boitano A.,等人,Aryl Hydrocarbon Receptor Antagonists Promote the Expansion of Human Hematopoietic Stem Cells.Science 2010年9月10日；329(5997):1345–1348。

在一些实施例中，促进CD34⁺细胞扩增的化合物包括嘧啶吲哚衍生物，包括例如UM171或UM729(参见US2020/0308540，其特此以引用方式并入)。

在一些实施例中，干细胞群体或CD34+富集的细胞被进一步富集用于表达骨膜素和/或血小板来源生长因子受体α(pdgfra)的细胞，或经修饰以表达骨膜素和/或pdgfra，如WO 2020/205969(其特此以引用方式全文并入)中所述。此种表达可通过将编码转录物递送至细胞，或通过引入编码转基因，或无转基因方法(不限于将非整合附加体引入细胞)来进行。在一些实施例中，采用基因编辑来向细胞中的表达元件引入遗传修饰，诸如以修饰启动子活性或强度、核糖体结合、RNA稳定性或影响RNA剪接。

在其他实施例中，干细胞群体或CD34富集的细胞与组蛋白甲基转移酶EZH1抑制剂一起培养。替代性地，EZH1在干细胞群体中部分或完全缺失或失活或暂时沉默。对EZH1的抑制可将骨髓祖细胞(例如，CD34+CD45+)引导至淋巴谱系。参见WO 2018/048828，其特此以引用方式全文并入。在其他实施例中，EZH1在干细胞群体中过表达。

在各种实施例中，HSC群体或其级分分化为造血谱系，其可以选自共同髓系祖细胞(CMP)、淋巴样预处理多能祖细胞(LMPP)、粒细胞巨噬细胞DC祖细胞(GMDP)、粒细胞/巨噬细胞谱系限制性祖细胞(GMP)、巨核细胞/红细胞祖细胞(MEP)、巨噬细胞/树突状细胞(DC)祖细胞(MDP)、共同DC祖细胞(CDP)、常规(或经典)髓系树突状细胞(cDC)、共同单核细胞祖细胞(cMoP)和浆细胞样DC(pDC)及其级分，从中可以产生单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞。

iPSC的分化(例如，向EB的分化)可以采用WNT激动剂，诸如CHIR99021。WNT激动剂是模拟或增加WNT信号传导的分子。WNT激动剂的非限制性实例包括小分子CHIR-99021(CAS252917-06-9)、2-氨基-4,6-二取代的嘧啶，例如BML 284(CAS 853220-52-7)、SKL2001(CAS 909089-13-0)、WAY 262611(CAS1123231-07-1)、WAY 316606(CAS 915759-45-4)、SB 216763(CAS280744-09-4)、IQ 1(CAS 331001-62-8)、QS 11(CAS 944328-88-5)、脱氧胆酸(CAS 83-44-3)、BIO(CAS 667463-62-9)、肯帕罗酮(CAS 142273-20-9)或(杂)芳基嘧啶。在一些实施例中，WNT激动剂是激动剂抗体或其功能片段或抗体样多肽。

iPSC的分化(例如，向EB的分化)可以使用ROCK抑制剂。用于建立和分化iPSC的示例性ROCK抑制剂包括但不限于：噻唑威宁、Y27632、法舒地尔、AR122-86、RevitaCell.TM.补充剂、H-1152、Y-30141、Wf-536、HA-1077、羟基-HA-1077、GSK269962A、SB-772077-B、N-(4-吡啶基)-N'-(2,4,6-三氯苯基)脲、3-(4-吡啶基)-1H-吲哚和(R)-(+)-反式-N-(4-吡啶基)-4-(1-氨基乙基)-环己烷甲酰胺、H-100和ROCK抑制剂，其公开在美国专利号8,044,201中，其特此以引用方式全文并入。

在一些实施例中，将共同髓系祖细胞(CMP)、淋巴预处理多能祖细胞(LMPP)、粒细胞巨噬细胞DC祖细胞(GMDP)、粒细胞/巨噬细胞谱系限制性祖细胞(GMP)、巨核细胞/红细胞祖细胞(MEP)、巨噬细胞/树突状细胞(DC)祖细胞(MDP)、共同DC祖细胞(CDP)、常规(或经典)髓系树突状细胞(cDC)、共同单核细胞祖细胞(cMoP)或浆细胞样DC(pDC)与Notch配体(部分或全部)、SHH、细胞外基质组分和/或其组合一起体外培养以使细胞分化。此外，根据已知方法，异种OP9-DL1或STO小鼠成纤维细胞或血液来源的外周血单核细胞(PBMC)、或脐带血来源的间充质干细胞或淋巴细胞来源的癌细胞系细胞的饲养层细胞通常用于将造血细胞分化为先天髓系细胞、T细胞或NK细胞，并且可以任选地用于将细胞分化为其他谱系。OP9-DL1共培养系统使用用Notch配体δ样1(DLL1)转导的骨髓基质细胞系(OP9)来支持来自干细胞来源的T细胞发育。OP9-DL1系统限制细胞临床应用的潜力。需要一种可以从hiPSC中产生吞噬细胞(例如单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞和嗜中性粒细胞)用于临床使用的无饲养层细胞系统，并且在一些实施例中，本发明满足了这一目的。在非限制性实例中，为了利用Notch配体产生成熟吞噬细胞，iPSC扩增进行6天，随后形成胚状体，这需要约8天。将细胞进一步培养约5天，以使HSC从其来源的CD34+造血内皮细胞能够发育。然后将HCS在特定培养基中培养(其可以包含Notch配体)以分化为髓系细胞，诸如单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞和嗜中性粒细胞(如前所述)。

在一些实施例中，需要细胞因子和/或生长因子的存在，这些包括但不限于干细胞因子、Fms样酪氨酸激酶3配体、VEGF、bFGF、SCF、Flt3L、TPO、IL3、IL7和IL15；以及任选地，BMP激活剂，以启动永久造血内皮向共同髓系祖细胞(CMP)、淋巴预处理多能祖细胞(LMPP)、粒细胞巨噬细胞DC祖细胞(GMDP)、粒细胞/巨噬细胞谱系限制性祖细胞(GMP)、巨核细胞/红细胞祖细胞(MEP)、巨噬细胞/树突状细胞(DC)祖细胞(MDP)、共同DC祖细胞(CDP)、常规(或经典)髓系树突状细胞(cDC)、常见单核细胞祖细胞(cMoP)或浆细胞样DC(pDC)的分化。在一些实施例中，使多能干细胞来源的吞噬细胞祖细胞或吞噬细胞前体与包含一种或多种生长因子和细胞因子(选自SCF、Flt3L、IL3、IL7和IL15)的组合物接触，其中培养基不含VEGF、bFGF、TPO、BMP激活剂和ROCK抑制剂中的一种或多种，以启动吞噬细胞祖细胞或吞噬细胞前体向单核细胞、巨噬细胞或树突状细胞的分化。

本文所用术语“Notch配体”是指能够与存在于造血干细胞或祖细胞T细胞膜中的Notch受体多肽结合的配体。Notch受体包括Notch-1、Notch-2、Notch-3和Notch-4。Notch配体通常具有DSL结构域(D-δ、S-锯齿和L-Lag2)，其包含在氨基末端处的20至22个氨基酸以及在细胞外表面上的3至8个EGF重复序列。在各种实施例中，Notch配体包含δ样-1(DLL1)、δ样-4(DLL4)、δ^Max(公开于PCT/US2020/041765和PCT/US2020/030977，其引用方式全文并入本文)或其功能部分、Jagged 1(JAG1)、Jagged 2(JAG2)、δ样配体3(DLL3)和X-δ2中的至少一种。胸腺基质细胞在体内向进入的淋巴细胞祖细胞传递的关键信号由DL4介导，该DL4由皮质胸腺上皮细胞表达。

本文所用的“Notch配体”还包括完整的(全长的)、部分的(截短的形式)或经修饰的(包含一个或多个突变，诸如保守突变)notch配体，以及保留全长Notch配体的至少一种活性或功能的任何物种或其片段的Notch配体。还包括模拟缺口配体的肽。Notch配体可以是“规范notch配体”或“非规范notch配体”。规范notch配体的特征在于细胞外结构域，其通常包括N-末端(NT)结构域，随后是δ/锯齿/LAG-2(DSL)结构域和多个串联排列的表皮生长因子(EGF)样重复序列。规范配体结合Notch通常需要DSL结构域和侧翼NT结构域以及含有δ和OSM-11样蛋白(DOS)基序的前两个EGF重复序列。一些规范配体的胞内结构域含有羧基末端PSD-95/Dlg/ZO-1-配体(PDZL)基序，其作用不依赖于Notch信号传导。

在一些实施例中，Notch配体是抗Notch(激动剂)抗体，其可以结合和参与Notch信号传导。在一些实施例中，抗体是单克隆抗体(包括人或人源化抗体)、单链抗体(scFv)、纳米抗体或能够激活Notch信号传导途径的其他抗体片段或抗原结合分子。

在一些实施例中，Notch配体是δ家族Notch配体。在一些实施例中，δ家族配体是δ-1(Genbank登录号AF003522，智人)、δ样1(DLL1，Genbank登陆号NM_005618和NP_005609，智人；Genbank登录号X80903、148324、小家鼠)、δ-4(Genbank登录号AF273454、BAB18580，小家鼠；Genbank登录号AF279305、AAF81912，智人)和/或δ样4(DLL4；Genbank登陆号Q9NR61、AAF76427、AF253468、NM_019074，智人；Genbank登录号NM 019454，小家鼠)。Notch配体是市售的，或者可以通过例如重组DNA技术来生产。

在一些实施例中，Notch配体包含与人类DLL1或DLL4 Notch配体至少约70％、或至少约80％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约97％相同(例如，约100％相同)的氨基酸序列。Notch配体的功能性衍生物(包括其片段或部分)将能够结合并激活Notch受体。与Notch受体的结合可以通过本领域已知的多种方法来确定，包括体外结合测定和受体激活/细胞信号传导测定。

在各种实施例中，Notch配体是可溶的，并且任选地固定在微粒或纳米颗粒上，其任选地是顺磁性的，以允许磁性富集或浓缩过程。在其他实施例中，Notch配体被固定在2D或3D培养表面上，任选地与其他粘附分子诸如VCAM-1一起。参见US2020/0399599，其特此以引用方式全文并入。在其他实施例中，珠或颗粒是聚合物(例如，聚苯乙烯或PLGA)、金、右旋糖酐铁，或者由生物材料构成，诸如由脂质和/或蛋白质形成的颗粒。在各种实施例中，颗粒具有从约0.01μm(10nm)至约500μm(例如，约1μm至约7μm)的直径或最大尺寸。在其他实施例中，可以采用具有缀合配体的聚合物支架，如WO 2020/131582中所述，其特此以引用方式全文并入。例如，支架可以由聚乳酸、聚乙醇酸、PLGA、藻酸盐或藻酸盐衍生物、明胶、胶原、琼脂糖、透明质酸、聚(赖氨酸)、聚羟基丁酸酯、聚-ε-己内酯、聚磷腈、聚(乙烯醇)、聚(环氧烷)、聚(环氧乙烷)、聚(烯丙胺)、聚(丙烯酸酯)、聚(4-氨基甲基苯乙烯)、普朗尼克多元醇、泊洛沙姆、聚(糖醛酸)、聚(酸酐)、聚(乙烯基吡咯烷酮)及其任何组合构成。在一些实施例中，支架包括直径在约1pm与100pm之间的孔隙。

在一些实施例中，Notch配体的C-末端与所选择的支持物缀合。在一些实施例中，这可以包括在Notch配体的C-末端处添加序列，该序列可以例如通过生物素分子与支持物酶促缀合。在另一个实施例中，制备Notch配体-Fc融合体，使得Fc片段可以通过与蛋白A或蛋白G结合而被固定，该蛋白A或蛋白G与支持物缀合。当然，可以采用任何已知的蛋白质缀合方法。

在一些实施例中，Notch配体是具有关于hDLL4的一个或多个亲和力增强突变的DLL4，诸如以下中的一者或多者(或全部)：G28S、F107L、I143F、H194Y、L206P、N257P、T271L、F280Y、S301R和Q305P。参见Gonzalez-Perez,等人,Affinity-matured DLL4ligandsas broad-spectrum modulators ofNotch signaling,Nature ChemicalBiology(2022)。

因此，在各种实施例中，Notch配体被固定化、功能化和/或包埋在2D或3D培养系统中。Notch配体可以与细胞外基质的组分一起掺入，诸如选自纤连蛋白、重组人纤维蛋白片段和层粘连蛋白中的一者或多者。在一些实施例中，Notch配体和/或细胞外基质的组分被包埋在提供3D培养条件的惰性材料中。示例性材料包括但不限于纤维素、藻酸盐及其组合。在一些实施例中，Notch配体、细胞外基质的组分或其组合与培养条件接触，为细胞提供有助于分化和/或扩增的形貌图案和/或纹理(例如，粗糙度)。

在各种实施例中，HSC/HSPC群体在人工胸腺类器官(ATO)中培养。参见Hagen,M.等人.(2019)。ATO将在无血清条件下包含HSC(或HSC聚集体)与表达Notch配体的基质细胞系的培养物。人工胸腺类器官是3D系统，诱导造血前体分化为初始CD3⁺CD8⁺和CD3⁺CD4⁺T细胞或髓系谱系细胞。在一些实施例中，人工胸腺类器官包含DLL4和BMP2、或其功能性片段。

在一些方面和实施例中，本发明提供了用于获得以下的培养平台：共同髓系祖细胞(CMP)、淋巴预处理多能祖细胞(LMPP)、粒细胞巨噬细胞DC祖细胞(GMDP)、粒细胞/巨噬细胞谱系限制性祖细胞(GMP)、巨核细胞/红细胞祖细胞(MEP)、巨噬细胞/树突状细胞(DC)祖细胞(MDP)、共同DC祖细胞(CDP)、常规(或经典)髓系树突状细胞(cDC)、常见单核细胞祖细胞(cMoP)或浆细胞样DC(pDC)。培养平台包括使细胞(例如，来自EB的CD34+细胞)与有效量的机械敏感受体或机械敏感通道激动剂接触，以增加Dnmt3b的活性或表达。在一些实施例中，机械敏感受体是Piezol。示例性Piezol激动剂包括Yoda1、ssRNA40、Jedi1和Jedi2。在一些实施例中，机械敏感受体是Trpv4。示例性的Trpv4激动剂是GSK1016790A。培养基可以包含选自TPO、SCF、Flt3L、IL3、IL-6、IL7、IL-11、IGF、bFGF和IL15的一种或多种生长因子和细胞因子中。该培养基可以任选地包含VEGF、bFGF、BMP激活剂、Wnt途径激活剂或ROCK抑制剂(例如噻唑威宁或Y27632)中的一者或多者。随后，在一种或多种适用于分化为所需髓系细胞或其前体的生长因子/细胞因子/激动剂或抑制剂的存在下培养细胞(例如，单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞和嗜中性粒细胞或其前体，如前所述)。在一些实施例中，培养基适用于使HSC分化成吞噬细胞祖细胞(例如，共同髓系祖细胞(CMP)、淋巴预处理多能祖细胞(LMPP)、粒细胞巨噬细胞DC祖细胞(GMDP)、粒细胞/巨噬细胞谱系限制性祖细胞(GMP)、巨核细胞/红细胞祖细胞(MEP)、巨噬细胞/树突状细胞(DC)祖细胞(MDP)、共同DC祖细胞(CDP)、常规(或经典)髓系树突状细胞(cDC)、共同单核细胞祖细胞(cMoP)、粒细胞和巨噬细胞祖细胞(GMP)、粒细胞-巨噬细胞祖细胞(GMP)和浆细胞样DC(pDC)。例如，在分化培养开始时，添加IL-3、IL-7、IL-15、SCF和FLT-3L，并且在下一阶段，向培养基补充除IL-3之外的前述细胞因子。替代性地，首先在SCF、FLt-3L、TPO、GM-CSF、IL-3和IL-6中培养细胞，并且然后在IGF-1、SIS3、IL-7和IL-21或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-4(IL-4)、白血病抑制因子(LIF)和巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)中的一种或多种中培养。

在一些实施例中，HSC群体或其级分分化为髓系谱系或其祖细胞或衍生物，而不依靠使用机械敏感受体或机械敏感通道的激动剂(诸如Yoda1)。在一些实施例中，机械敏感受体或机械敏感通道的激动剂(诸如Yoda1)的使用是任选的。因此，在一些实施例中，从分化的多能干细胞群体中富集CD34+细胞，以制备CD34+富集的群体。诱导CD34+富集的细胞群体进行内皮细胞到造血细胞转变至少持续两天，但不超过12天，其中机械敏感受体或机械敏感通道的激动剂(诸如Yoda1、jedi1、jedi2、ssRNA40)的使用是任选的。HSC和/或HSPC分化为祖细胞髓系谱系细胞群体或髓系谱系细胞群体。

在一些实施例中，CD34+富集的细胞群体的内皮细胞到造血细胞转变被诱导至少两天，并且进一步持续约4小时、或约8小时、或约12小时、或约16小时、或约20小时、或约24小时、或约2天、或约3天、或约4天、或约5天、或约6天、或约7天、或约8天、或约9天、或约10天，但总计不超过12天。在示例性实施例中，诱导EHT持续约4天至约10天，或约5天至约8天(例如，在5至7天的范围内)。

在一些实施例中，细胞基于iPSC、胚胎体、hCD34+细胞或髓系前体的基因编辑，或经由目标细胞群体中的mRNA表达来表达CAR。另外，或任选地，细胞可以被工程化以表达细胞因子(例如，IL-4，IL-6，IL-15等或干扰素)，以使CAR在靶向肿瘤方面更有效。

在非限制性实例中，细胞(例如单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞和嗜中性粒细胞、或其前体)可以通过载体有效转导，诸如但不限于携带第一代、第二代、第三代、第四代或第五代CAR的逆转录病毒或非整合病毒载体(例如腺病毒、腺相关病毒、整合缺陷型逆转录慢病毒、痘病毒)或非病毒载体(例如质粒载体、人工染色体)或附加型或附加型杂交载体(参见例如Sadelain等人,Cancer Discov.3(4):388-398(2013)；Kostelny等人,Immunol.Rev.257:127-133(2014)；Sharpe等人,Dis.ModelMeeh.8(4):337-350(2015)；Brentjens等人,Clin.Cancer Res.13:5426-5435(2007)；Gade等人,Cancer Res.65:9080-9088(2005)；Maher等人,Nat.Biotechnol.20:70-75(2002)；Kostelny等人,J.Immunol.173:2143-2150(2004)；Sadelain等人,Curr.Opin.Immunol.(2009)；Hollyman等人,J.Immunother.32:169-180(2009))。这些上述参考文献中的每个均以引用方式全文并入本文。CAR可以靶向肿瘤相关抗原或标记物(例如，CD19、CD38、CD33、CD47、CD20等)。按照常规方案，CAR表达可以在不同的吞噬细胞(例如，单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞和嗜中性粒细胞)或其亚群中得到证实。CAR细胞(例如，CAR.CD19-巨噬细胞、CAR.CD38-巨噬细胞、CAR.CD33-巨噬细胞、CAR.CD47-巨噬细胞、CAR.CD20-巨噬细胞等)与未修饰的巨噬细胞相比，可能对CD19、CD38、CD33、CD47、CD20细胞系和从患者(例如患有B细胞前体ALL)获得的原代母细胞表现出更高的肿瘤活性(例如，抗白血病活性)。

CAR旨在增强细胞识别、结合和杀死肿瘤细胞的能力。在一些实施例中，CAR增强了吞噬细胞(例如，单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞和嗜中性粒细胞)识别肿瘤细胞的能力。在一些实施例中，CAR增强吞噬细胞的抗肿瘤活性。在一些实施例中，但不限于此，CAR是G蛋白偶联受体87(GPR87)CAR和溶质载体家族7成员11(SLC7A11(xCT))CAR、TNF受体超家族成员17(BCMA)CAR、CD30 CAR、CD19 CAR、CD22-CAR、CD33 CAR、CD133-CAR、NKG2D CAR(或包含NKG2D胞外结构域的CAR或受体)、间皮素-CAR、CD70 CAR、NKp30 CAR、CD73 CAR或CAR-吞噬细胞(例如，CAR-单核细胞、CAR-巨噬细胞、CAR-树突状细胞或CAR-嗜中性粒细胞)，其靶向以下肿瘤或肿瘤抗原：

(i)人表皮生长因子受体2(HER2)-卵巢癌、乳腺癌、胶质母细胞瘤、结肠癌、骨肉瘤和髓母细胞瘤；

(ii)表皮生长因子受体(EGFR)-非小细胞肺癌、上皮癌和胶质瘤；

(iii)间皮素-间皮瘤、卵巢癌和胰腺腺癌；

(iv)前列腺特异性膜抗原(PSMA)-前列腺癌；

(v)癌胚抗原(CEA)-胰腺腺癌、乳腺癌和结直肠癌；

(vi)磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3-肝细胞癌；

(vii)表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII)-胶质母细胞瘤；

(viii)二唾液酸神经节苷脂2(GD2)-神经母细胞瘤和黑色素瘤；

(ix)碳酸酐酶IX(CAIX)-肾细胞癌；

(x)白细胞介素-13Ra2-胶质瘤；

(xi)成纤维细胞活化蛋白(FAP)-恶性胸膜间皮瘤；

(xii)L1细胞粘附分子(L1-CAM)-神经母细胞瘤、黑色素瘤和卵巢癌；

(xiii)癌抗原125(CA125)-上皮性卵巢癌；

(xiv)分化簇133(CD 133)-胶质母细胞瘤和胆管癌、腺癌；

(xv)癌/睾丸抗原1B(CTAG1B)-黑色素瘤和卵巢癌；

(xvi)黏蛋白1-精囊癌；

(xvii)叶酸受体-a(FR-a)-卵巢癌；

(xviii)选自ErbB1、ErbB2、ErbB3或ErbB4、IGF1R、IGF2R、TβR I-II、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、PDGFR(α/β)或FGFR1至4中的一种或多种的生长因子受体。参见例如Zhou Z等人,Chimeric antigen receptor T cells applied to solid tumors.FrontImmunol.2022年10月31日；或Pooria等人,Novel antigens of CAR T cell therapy: New roads； old destination, Translational Oncology,Volume 14,Issue7,2021,Zhang C,,et al.,Chimeric Antigen Receptor T-Cell Therapy.In:StatPearls[Internet].Treasure Island(FL):StatPearls Publishing，其中的每一个通过引用并入本文。

因此，在本发明的一些方面和实施例中，对基因修饰的吞噬细胞群体或其前体或子代进行工程化，以使其在细胞表面表达嵌合抗原受体(CAR)，并且特别是特异性结合生长因子受体的CAR。最典型地，CAR包含来自Fcε受体γ(FcεRIγ)的胞内结构域。然而，在进一步考虑的实施例中，CAR还可以包含T细胞受体(TCR)CD3ζ(CD3ζ)胞内结构域，单独或与来自第二代或第三代CAR构建体的另外组分(例如CD28、CD134、CD137和/或ICOS)组合。

在一些实施例中，CAR包含抑制吞噬细胞(例如，单核细胞、巨噬细胞或树突状细胞)中抗吞噬信号传导的至少一个结构域(例如，胞外结构域、跨膜结构域和/或胞内结构域)。在一些实施例中，相对于没有CAR的相同类型的细胞，CAR例如通过抑制CD47和/或SIRPα活性来改善吞噬细胞(例如，单核细胞、巨噬细胞或树突状细胞)的效应子活性。在一些实施例中，CAR通过结合CD47并抑制SIRPα活性来充当显性负性受体(例如，CD47捕获物(sink))。

在一些实施例中，相对于未修饰的巨噬细胞、单核细胞或树突状细胞，CAR修饰的巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞或嗜中性粒细胞表现出一种或多种炎症细胞因子的产生增加。一种或多种炎性细胞因子可以选自TNFα、IL-6、IL-1a、IL-1b、IL-12、IL-18、IL-8、IL-2、IL-23、IFNα、IFNβ、IFNγ、IL-2、IL-8、IL33、CCL3、CXCL12、CCL22、CCL4、CXCL10或CCL2中的一种或多种。

在其他方面，本发明提供了一种包含髓系细胞或其前体的细胞群体或其药学上可接受的组合物，并且其可以通过本文所述的方法产生。在一些实施例中，细胞群体是祖细胞髓系谱系细胞群体，其在施用于有需要的受试者后能够植入胸腺、脾脏或次级淋巴器官。在各种实施例中，制备用于细胞疗法的组合物，其包含细胞群体和药学上可接受的赋形剂。药物组合物可以包含至少约10²个细胞，或至少约10³、或至少约10⁴、或至少约10⁵、或至少约10⁶、或至少约10⁷、或至少约10⁸个细胞，或至少约10⁹个细胞、或至少约10¹⁰个细胞、或至少约10¹¹个细胞、或至少约10¹²个细胞、或至少约10¹³个细胞、或至少约10¹⁴个细胞。例如，在一些实施例中，向受试者施用药物组合物，并且该组合物可以包含每千克受试者体重约100,000至约400,000个细胞(例如，约200,000个细胞/千克)的细胞。在其他实施例中，以每千克约10⁵至约5×10⁵个细胞(例如，约2.5×10⁵个细胞/kg)、或每千克约10⁶至约5×10⁶个细胞(例如，约2.55×10⁶个细胞/kg)、或每千克约5×10⁶至约10⁷个细胞(例如，约5×10⁶个细胞/kg)、或每千克约10⁷至约10⁸个细胞(例如，约5×10⁷个细胞/kg)、或每千克约10⁸至约10⁹个细胞(例如，约5×10⁸个细胞/kg)、或每千克约10⁹至约10¹⁰个细胞、或每千克约10¹⁰至约10¹¹或约10¹¹至约10¹²个细胞、或每千克约10¹²至约10¹³个细胞、或每千克接受者体重约10¹³至约10¹⁴个细胞施用细胞。

在一些实施例中，细胞群体是HLA-A^neg、对于HLA-B和HLA-C两者均为纯合的、以及HLA-DPB1^neg和HLA-DQB1^neg。在一些实施例中，细胞群体对于HLA-DRB1是进一步纯合的。在各种实施例中，组合物包含选自以下中的一种或多种的髓系谱系：单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、嗜中性粒细胞、髓系祖细胞(CMP)、早幼粒细胞、粒细胞/巨噬细胞谱系限制性祖细胞(GMP)、巨噬细胞/树突状细胞(DC)祖细胞(MDP)、共同DC祖细胞(CDP)、常规(或经典)髓系树突状细胞(cDC)、共同单核细胞祖细胞(cMoP)和浆细胞样DC(pDC)。

用于所公开方法的药物组合物还可以含有用于治疗特定目标疾病的其他治疗剂。例如，药物组合物还可以包含细胞因子和生长因子(白细胞介素、干扰素、FGF、VEGF、PDGF、PIGF、STAT等)。此类附加因子和/或药剂可以包含在药物组合物中，以产生本文公开的治疗方法的优点，即，提供改善的治疗效果和降低的全身毒性。

吞噬细胞或CAR-吞噬细胞(例如，CAR-单核细胞、CAR-巨噬细胞、CAR-树突状细胞或CAR-嗜中性粒细胞)可以以符合良好医疗规范的方式配制、给药和施用。在这种情况下考虑的因素包括所治疗的特定疾病或疾患、所治疗的特定哺乳动物(例如，人类)、单个患者的临床状况、疾病或疾患的原因、药剂的递送部位、施用方法、施用时间表以及医师已知的其他因素。待施用细胞的治疗有效量将受此类考虑因素支配。

在其他方面，本发明提供了一种细胞疗法方法，包括向有此需要的人受试者施用本文所述的细胞群体或其药学上可接受的组合物。在各种实施例中，本文所述的方法用于治疗血液(恶性和非恶性)、骨髓、免疫疾病和感染性疾病。在各种实施例中，人类受试者患有包括淋巴细胞减少、癌症、免疫缺陷、自身免疫性疾病中的一种或多种的病症。疾病的实例包括各种自身免疫疾病，包括但不限于斑秃、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、皮肌炎、糖尿病(1型)、某些形式的幼年特发性关节炎、肾小球肾炎、格雷夫斯病、格林-巴利综合征、特发性血小板减少性紫癜、重症肌无力、某些形式的心肌炎、多发性硬化症、天疱疮/类天疱疮、恶性贫血、结节性多动脉炎、多肌炎、原发性胆汁性肝硬化、牛皮癣、类风湿性关节炎、硬皮病/系统性硬化症、干燥综合征、系统性红斑狼疮、全身性红斑狼疮、某些形式的甲状腺炎、某些形式的葡萄膜炎、白癜风、肉芽肿性多血管炎(韦格纳)。可以治疗的血液恶性肿瘤包括但不限于急性和慢性白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤和骨髓增生异常综合征。可以治疗的传染病包括但不限于HIV(人类免疫缺陷病毒)、RSV(呼吸道合胞病毒)、EBV(爱泼斯坦-巴尔病毒)、CMV(巨细胞病毒)、腺病毒和BK多瘤病毒相关疾患。其他病症包括：骨骼发育不良、血红蛋白病；贫血，包括但不限于缺铁性贫血、恶性贫血、再生障碍性贫血、镰状细胞性贫血、维生素缺乏性贫血和溶血性贫血；骨髓衰竭综合征和某些遗传性疾患(例如，影响免疫系统的遗传性疾患)。在一些实施例中，受试者患有癌症，诸如血液恶性肿瘤，包括但不限于白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤；或实体肿瘤，包括但不限于脑肿瘤、前列腺肿瘤、乳腺肿瘤、肺肿瘤、结肠肿瘤、子宫肿瘤、皮肤肿瘤、肝肿瘤、骨肿瘤、胰腺肿瘤、卵巢肿瘤、睾丸肿瘤、膀胱肿瘤、肾肿瘤、头部肿瘤、颈部肿瘤、胃肿瘤、宫颈肿瘤、直肠肿瘤、喉肿瘤或食道肿瘤。

在一些实施例中，受试者患有选自以下的病症：急性髓系白血病；急性淋巴细胞白血病；慢性髓系白血病；慢性淋巴细胞白血病；骨髓增生性疾患；骨髓增生异常综合征；多发性骨髓瘤；非霍奇金氏淋巴瘤；霍奇金病；再生障碍性贫血；纯红细胞再生障碍性贫血；阵发性睡眠性血红蛋白尿；范可尼贫血；重型地中海贫血；镰状细胞性贫血；严重联合免疫缺陷(SCID)；威斯科特-奥尔德里奇综合征；噬血细胞性淋巴组织细胞增生症；先天性代谢缺陷；重症先天性粒细胞缺乏症；Shwachman-Diamond综合征；Diamond-Blackfan贫血；以及白细胞粘附缺陷。

在采用如本文所述的HLA编辑的细胞的实施例中，组合物可以在一个或多个保留的HLA基因座处与受试者匹配。例如，在一些实施例中，细胞与HLA-B、HLA-C和HLA-DRB1单倍型匹配。

本公开的细胞组合物(例如，根据本公开内容制备的)可以进一步包含药学上可接受的赋形剂或载体。此类赋形剂或载体溶液还可以含有缓冲剂、稀释剂和其他合适的添加剂。缓冲液是指其化学构成中和酸或碱而pH不会显著改变的溶液或液体。本发明设想的缓冲液的实例包括但不限于正常/生理盐水(0.9％ NaCl)、水中的5％葡萄糖(D5W)、Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水(PBS)、林格氏溶液。该组合物可以包含适于静脉输注或其他施用途径的赋形剂，并且该组合物可以包含合适的防冻剂。示例性的载剂是DMSO(例如，约10％ DMSO)。其他载剂可以包括二甲氧基乙烷(DME)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)或二甲基乙酰胺，包括它们的混合物或组合。细胞组合物可以在可植入装置(例如，支架)中或在袋中或在小瓶、试管或容器中以适当的体积提供，并且冷冻储存直至使用。

可以与细胞一起施用其他化合物，诸如细胞毒性剂、免疫抑制剂和/或细胞因子或生长因子(例如，干细胞因子、血小板生成素、转化生长因子(TGF)-α或β、成纤维细胞生长因子(FGF)、血管生成素(Ang)家族生长因子、胰岛素样生长因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、TNF-α或TNF-β、VEGF、白细胞介素(例如，IL-2、6、7、8、10、12、15等)和干扰素(例如，INF-α或INF-γ))。组合施用包括使用单独的配制品或单一药物配制品的共同施用和以任一顺序的连续施用，其中优选地存在两个(或所有)活性剂同时发挥其生物活性的时间段。

可以与本发明的吞噬细胞共施用的药剂(诸如激素、生长因子和细胞因子抗体)包括分子诸如(肾素)；生长激素，包括人类生长激素和牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；促甲状腺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰岛素A链；胰岛素B链；胰岛素原；促卵泡激素；降钙素；促黄体生成激素；胰高血糖素；凝血因子，诸如因子vmc、因子IX、组织因子(TF)和血管性血友病因子；抗凝血因子，诸如蛋白C；心房利钠因子；肺表面活性物质；纤溶酶原激活剂，诸如尿激酶或人类尿液或组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)；铃蟾肽；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子-α和肿瘤坏死因子-β；脑啡肽酶；RANTES(激活时调节，正常T细胞表达和分泌)；人巨噬细胞炎症蛋白(MIP-1-α)；血清白蛋白，诸如人血清白蛋白；穆勒氏管抑制物质；松弛素A链；松弛素B链；松弛素原；鼠促性腺激素相关肽；微生物蛋白，诸如β-内酰胺酶；脱氧核糖核酸酶；IgE；细胞毒性T淋巴细胞相关抗原(CTLA)，诸如CTLA-4；抑制素；激活素；血管内皮生长因子(VEGF)；激素或生长因子受体；蛋白A或D；类风湿因子；神经营养因子，诸如骨来源的神经营养因子(BDNF)、神经营养因子-3、神经营养因子-4、神经营养因子-5或神经营养因子-6(NT-3、NT4、NT-5或NT-6)或神经生长因子，诸如NGF-β；血小板来源的生长因子(PDGF)；成纤维细胞生长因子，诸如aFGF和bFGF；成纤维细胞生长因子受体2(FGFR2)、表皮生长因子(EGF)；转化生长因子(TGF)，诸如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5；骨形态发生蛋白(BMP)，包括BMP1、BMP6、BMP7和BMP受体2；胰岛素样生长因子-I和胰岛素样生长因子-II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)、胰岛素样生长因子结合蛋白、肝细胞生长因子(HGF)、EpCAM、GD3、FLT3、PSMA、PSCA、MUC1、MUC16、STEAP、CEA、TENB2、EphA受体、EphB受体、叶酸受体、FOLR1、间皮素、cripto、alphavbeta6、整合素、VEGF、VEGFR、EGFR、转铁蛋白受体、IRTA1、IRTA2、IRTA3、IRTA4、IRTA5；CD蛋白，诸如CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD8、CD11、CD14、CD19、CD20、CD21、CD22、CD25、CD26、CD28、CD30、CD33、CD36、CD37、CD38、CD40、CD44、CD52、CD55、CD56、CD59、CD70、CD79、CD80。CD81、CD103、CD105、CD134、CD137、CD138、CD152、TNF-α、IFN-α、GM-CSF、IL-3或与一种或多种肿瘤相关抗原或细胞表面受体结合的抗体；促红细胞生成素；骨诱导因子；免疫毒素；骨形态发生蛋白(BMP)；干扰素，诸如干扰素-α、干扰素-β和干扰素-γ；集落刺激因子(CSF)，例如M-CSF、GM-CSF和G-CSF；白细胞介素(IL)，例如IL-2、IL-6、IL-12、IL-23、IL-12/23p40、IL-17、IL-15、IL-21、IL-1a、IL-1b、IL-18、IL-8、IL-4、IL-3和IL-5；超氧化物歧化酶；T细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；病毒抗原，例如像HIV包膜的一部分；转运蛋白；归巢受体；地址素；调节蛋白；整合素，诸如CD11a、CD11b、CD11c、CD18、ICAM、VLA-4和VCAM；肿瘤相关抗原，诸如HER2、HER3或HER4受体；内皮糖蛋白、c-Met、c-kit、1GF1R、PSGR、NGEP、PSMA、PSCA、LGR5、B7H4、TAG72(肿瘤相关糖蛋白72)以及以上列出的多肽中任一种的片段。

可以施用的抗体或其片段的实例包括但不限于抗PD-L1抗体、阿昔单抗(Reopro)、阿达木单抗(Humira、Amjevita)、阿法西普(Amevive)、阿仑单抗(Campath)、巴利昔单抗(Simulect)、贝利尤单抗(Benlysta)、贝洛托舒单抗(Zinplava)、卡那单抗(Ilaris)、赛妥珠单抗(Cimzia)、西妥昔单抗(Erbitux)、达克利珠单抗(Zenapax、Zinbryta)、地诺单抗(Prolia、Xgeva)、依法利珠单抗(Raptiva)、戈利木单抗(Simponi、Simponi Aria)、英夫利昔单抗(Remicade)、伊匹单抗(Yervoy)、依奇珠单抗(Taltz)、那他珠单抗(Tysabri)、纳武单抗(Opdivo)、奥拉单抗(Lartruvo)、奥马珠单抗(Xolair)、帕利珠单抗(Synagis)、帕尼单抗(Vectibix)、派姆单抗(Keytruda)、利妥昔单抗(Rituxan)、托珠单抗(Actemra)、曲妥珠单抗(Herceptin)、苏金单抗(Cosentyx)、雷珠单抗、阿昔单抗、雷昔库单抗、卡普赛珠单抗、英夫利昔单抗、贝伐单抗、达比加群、依达鲁奇单抗、或乌司奴单抗(Stelara)或其组合。此外，抗体可以选自抗雌激素受体抗体、抗孕激素受体抗体、抗p53抗体、抗EGFR抗体、抗组织蛋白酶D抗体、抗Bcl-2抗体、抗E-钙粘蛋白抗体、抗CA125抗体、抗CA15-3抗体、抗CA19-9抗体、抗c-erbB-2抗体、抗P-糖蛋白抗体、抗CEA抗体、抗视网膜母细胞瘤蛋白抗体、抗ras癌蛋白抗体、抗Lewis X抗体、抗Ki-67抗体、抗PCNA抗体、抗CD3抗体、抗CD4抗体、抗CD5抗体、抗CD7抗体、抗CD8抗体、抗CD9/p24抗体、抗CD1抗体、抗CD11c抗体、抗CD13抗体、抗CD14抗体、抗CD15抗体、抗CD19抗体、抗CD20抗体、抗体、抗CD22抗体、抗CD23抗体、抗CD30抗体、抗CD31抗体、抗CD33抗体、抗CD34抗体、抗CD35抗体、抗CD38抗体、抗CD39抗体、抗CD41抗体、抗LCA/CD45抗体、抗CD45RO抗体、抗CD45RA抗体、抗CD71抗体、抗CD95/Fas抗体、抗CD99抗体、抗CD100抗体、抗S-100抗体、抗CD106抗体、抗泛素抗体、抗c-myc抗体、抗细胞角蛋白抗体、抗λ轻链抗体、抗黑素体抗体、抗前列腺特异抗原抗体、抗tau抗原抗体、抗纤维蛋白抗体、抗角蛋白抗体和抗Tn抗原抗体。

如果治疗剂的施用时间使得附加治疗剂的药理活性和药物组合物中的活性成分在时间上重叠，从而发挥组合治疗效果，则共同施用无需治疗剂同时施用。一般而言，每种药剂将以该药剂确定的剂量并按时间表施用。

在某些实施例中，在CAR疗法前，患者使用化疗剂(诸如氟达拉滨或环磷酰胺)经历淋巴细胞清除性化疗(或其他已知方法)。

如本文所用，术语“约”意指相关数值的±10％。

参考以下实例进一步描述本公开的某些方面和实施例。

实例

实例1–ETV2过表达增加造血内皮细胞的产率，并且增强iPSC分化期间CD34+细胞的形成，但不影响多能性。

方法

通过本领域已知的附加型重编程从hCD34+细胞发育iPSC，并且基本上如Yu,等人Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells,Science318,1917-1920,(2007)；和J.Yu,等人Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences.Science 324,797-801,(2009)所述。胚状体和造血内皮分化基本上如以下文献所述：R.Sugimura,等人,Haematopoieticstem andprogenitor cells from human pluripotent stem cells.Nature 545,432-438,(2017)；C.M.Sturgeon,等人,Wntsignaling controlsthe specificationofdefinitive andprimitivehematopoiesisfrom human pluripotent stem cells.Nat Biotechnol 32,554-561,(2014)；J.Yu,等人Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.Science 318,1917-1920,(2007)；和J.Yu,等人Human induced pluripotent stem cells free ofvector and transgene sequences.Science 324,797-801,(2009)所述。

简言之，将hiPSC解离并重悬于补充有L-谷氨酰胺、青霉素/链霉素、抗坏血酸、人全转铁蛋白、单硫代甘油、BMP4和Y-27632的培养基中。接下来，将细胞接种在10cm培养皿(EZSPHERE或低附接平板)中用于EB形成。在第1天，向培养基中添加bFGF和BMP4。在第2天，用含有SB431542、CHIR99021、bFGF和BMP4的培养基替换培养基。在第4天，用补充有VEGF和bFGF的培养基替换细胞培养基。在第6天，用补充有bFGF、VEGF、白细胞介素(IL)-6、IGF-1、IL-11、SCF和EPO的培养基替换细胞培养基。将细胞保持在5％ CO₂、5％ O₂和95％湿度的培养箱中。为了收获CD34+细胞，在第8天解离EB，通过70μm滤器过滤细胞，并且通过CD34磁珠染色分离CD34+细胞。

结果

使用在EF1A启动子控制下的含有ETV2和GFP序列的腺病毒载剂来转导诱导多能干细胞(iPSC)。在转导后，观察到约45％的iPSC培养物为GFP阳性，从而证实ETV2过表达(ETV2-OE)。进一步观察到，iPSC细胞中的ETV2-OE保留iPSC的多能性特性，如干细胞标记物表达TRA-1-60所示(图1)。图1显示代表iPSC用腺病毒载体过表达ETV2和GFP序列的转导效率的FACS图。

接下来，ETV2-OE-iPSC(以及用携带GFP序列但不含ETV2的载体转导的对照iPSC)分化为胚状体，并且随后分化为造血内皮细胞(Strugeon等人,2014)。结果表明，ETV2的过表达促进造血内皮细胞的形成，如CD235a^-群体内的CD34⁺和CD31⁺标记物的表达所证明的(图2)。具体而言，图2显示造血内皮细胞(此处定义为CD235a-CD34+CD31+)的代表性流式细胞仪分析，并且相对定量表明，与对照相比，ETV2-OE增强造血内皮细胞的形成。

此外，结果表明ETV2-OE增强CD34⁺细胞的形成(图3)。图3显示CD34+细胞的代表性流式细胞仪分析，并且相对定量表明ETV2-OE增强CD34+细胞的形成。

总体而言，这些数据指示ETV2在iPSC中的过表达不影响它们的多能性，并且促进它们经历造血内皮和造血分化的能力。

实例2—用Piezo1激活产生的iPSC来源的HSC经历与骨髓来源的HSC相似的谱系分化。

方法

为了分析EHT，将EB来源的CD34+细胞悬浮在含有Y-27632、TPO、IL-3、SCF、IL-6、IL-11、IGF-1、VEGF、bFGF、BMP4和FLT3的培养基中。细胞粘附于孔底约4至18小时(通过目视检查)后，将Yoda1添加到培养物中。4至7天后，收集细胞用于分析。

iPSC分化为胚状体8天。在第8天，收获来自iPSC来源的胚状体的CD34+细胞，并且再培养5至7天以诱导内皮细胞到造血细胞(EHT)转变。然后，在第5天至第7天之间从EHT培养物中收获CD34+细胞，用于进一步的造血谱系分化。

结果

图4A和图4B显示用Piezo1激活来源的iPSC来源的HSC经历与骨髓(BM)-HSC类似的原T细胞分化。此外，图5A和图5B显示用Piezo1激活产生的iPSC来源的HSC经历T细胞分化并且可以类似于BM-HSC用CD3/CD28珠激活。图6显示用Piezo1激活产生的iPSC来源的HSC可以分化为功能性T细胞，如通过用CD3/CD28珠刺激后INFγ表达所证明。总之，这些结果表明，在HSC形成期间Piezo1激活增强了HSC体外进一步分化为造血谱系的能力。

图7A和图7B显示来源于分化的iPSC(D8+7iPSC-CD34+细胞、+或-Yoda 1或“Y”)的HSC可以分化为嗜中性粒细胞，如通过CD15+和CD11b(嗜中性粒细胞标记物)的存在(图7A)或由嗜中性粒细胞释放髓过氧化物酶(MPO)所鉴定(图7B)。D8+7iPSC CD34+细胞在分化为嗜中性粒细胞方面优于D8-iPSC-CD34+细胞。

图8A和图8B显示，由来源于分化的iPSC(D8+7iPSC-CD34，+或–Yoda 1)的HSC分化的嗜中性粒细胞具有类似于由来自骨髓CD34+细胞分化的嗜中性粒细胞的吞噬活性。

实例3–评估HLA剔除HSC中的脱靶编辑

执行三重敲除的(HLA编辑的)HSC克隆的HLA分型，以检查不需要的编辑，并且确保在6号染色体的其他区域内没有发生主要的编辑事件，例如缺失。执行测序方法和分析以评价gRNA脱靶活性的程度，并且选择代表影响非靶HLA基因的低风险的gRNA。

通过将全长P5测序接头连接到末端制备的DSB，在固定和透化的细胞中使用原位断裂标记执行测序。提取基因组DNA，片段化，末端制备，并且使用化学修饰的半功能性P7接头来连接。所得DNA文库含有功能性DSB标记片段(P5:P7)和非功能性基因组DNA片段(P7:P7)的混合物。随后对富含DNA标记片段的DNA文库进行DNA测序，除去所有外来的、非功能性DNA。由于文库制备不含PCR，所获得的每个测序读数相当于来自细胞的单个标记的DSB末端。这产生了DNA断裂读数，使得能够通过测序直接检测和量化基因组DSB，而不需要纠错，并且能够绘制脱靶突变的清晰列表。

下表1总结两个代表性克隆相对于野生型细胞的编辑策略的结果。

表1：克隆HSC HLA敲除。

表2提供实验中使用的gRNA的非限制性实例，其可用于敲除指定HLA基因的表达。

表2：示例性gRNA序列

结果表明，编辑策略成功地选择性靶向HLA-A、DPB1和DQB1基因，而不影响其他HLA基因或在别处引入主要缺失。

通过FACS和免疫荧光对HLA编辑的克隆进行表型分析，证实了这些结果。如图9A和图9B所示，与野生型细胞的HLA-I类分子的总体表达相比，HLA编辑的细胞的HLA-I类分子的总体表达测试为阳性。通过免疫荧光的HLA-A的特异性表达证实了HLA-A在HLA编辑的细胞中不表达，证实了基因编辑策略仅成功使HLA-A基因缺失的发现。具体地说，图9A显示HLA编辑的细胞对于I类HLA都是阳性的，其程度与野生型(WT)(即非HLA编辑的)细胞相同。这一结果指示，尽管HLA-A缺失，但其他I类分子如HLA-B和C被表达，并且不受基因编辑策略的影响。

为了证实HLA-A基因缺失，用免疫荧光分析了HLA-A的特异性表达。从图9B中可以看出，HLA-A在HLA编辑的克隆中不表达，指示基因编辑策略仅在使HLA-A基因特异性地缺失方面是高效的。此种保留全部I类表达并且HLA-A缺失将促进患者配型，同时避免NK细胞介导的排斥。

实例4-评价HLA编辑的HSC的多能性和免疫相容性

评价HLA编辑的细胞保留多能性的能力。如图10所示，HLA编辑的iPSC克隆的免疫荧光评价指示它们保持三系分化，其中外胚层分化由巢蛋白-488和PAX6-594染色指示，中胚层分化由GATA-488染色指示，并且内胚层分化由CXCR4-488和FOX2A-594染色指示。

HLA I类分子在所有有核细胞的表面上表达，并且如果在供体与受体之间，HLA I类分子不匹配，则细胞可以被CD8+T细胞识别并且杀死。此外，HLA不匹配可能导致细胞因子释放综合征(CRS)和移植物抗宿主病(GVHD)。相反，通过B2M KO使HLA-I分子完全缺失，将使细胞成为NK细胞介导的细胞毒性的靶标。保留全部I类表达并且HLA-A缺失可促进患者配型，同时防止NK细胞介导的排斥。因此，通过与外周血单核细胞(PBMC)共培养来测试HLA编辑的HSC的免疫相容性，以评价免疫细胞是否将排斥HLA编辑的和野生型HSC(gHSC)的移植物。

将野生型(gHSC)和HLA编辑的HSC与HLA-B和HLA-C标记物匹配但HLA-A不匹配的PBMC共培养。缺乏HLA-I类分子表达的B2M KO HSC和缺乏HLA-II类分子表达的CIITA KOHSC用作对照，以分别比较HLA-无效和HLA不匹配的PBMC介导的细胞毒性程度。图11显示通过膜联蛋白V染色测量的共培养物中的PBMC介导的细胞毒性测定的结果。结果显示在HLA编辑的HSC中HLA-A的缺失会保护细胞免受PBMC介导的细胞毒性影响，而WT、B2M KO和CIITAKO易受PBMC介导的细胞毒性影响。与来自同一PBMC供体的分选的CD8+T细胞共培养的HSC保护HLA编辑和B2M KO HSC免受CD8+T细胞的细胞毒性影响。相反，与分选的NK细胞共培养的HSC仅保护WT和HLA编辑的细胞免受NK细胞介导的细胞毒性影响。

总之，免疫相容性结果显示，PBMC样品中存在的CD8+T细胞负责杀死HLA分子(WT和CIITA KO)不匹配的细胞，而PBMC中存在的NK细胞负责杀死HLA无效的细胞(B2M KO)。然而，HLA编辑的HSC经保护不受CD8+T细胞介导的细胞毒性影响(因为不匹配的HLA-A已经被敲除)，并且经保护不受NK细胞介导的细胞毒性的影响(因为HLAI类分子的表达在很大程度上被保留)。

实例5-评价HLA编辑的HSC的体内移植潜力

为了评价HLA编辑的HSC的移植潜力，通过针对WT HSC的竞争性移植来评估细胞的体内移植能力。将等比例的mCherry HLA编辑的HSC和野生型HSC(gHSC)混合，并且移植到小鼠中，其中通过FACS回收和评价骨髓(BM)和外周血样品，以比较样品中存在的每种细胞类型的相对量。如图12所示，HLA编辑的HSC和WT HSC两者促成在BM和外周血样品中大致相等的移植。这些结果证实HLA编辑的HSC(根据本公开制备的)在其移植和重建潜力方面与WTHSC相当。因此，预期WT(未编辑的，亲代)HSC的性质与本公开的HLA编辑的HSC的性质一致，用于产生T细胞谱系。

实例6–HLA编辑的HSC向CD4+/CD8+T细胞的分化

抗原呈递细胞(APC)通过HLA-II分子将抗原呈递给辅助性CD4+T细胞。辅助性CD4+T细胞的激活促进抗原特异性CD8+T细胞的产生，这些CD8+T细胞进一步发育成抗原特异性CTL。同样，HLA I类分子在所有有核细胞表面上表达，并将细胞内蛋白质的肽片段展示给CD8+CTL。CTL在识别细胞表面上表达的HLA-I-肽复合物后，诱导靶(受感染的)细胞的细胞毒性杀伤。因此，进行研究以确定HLA-A的缺失是否影响编辑的HSC的I类肽呈递。如图13A和13B所示，免疫肽组分析显示，HLA-A的缺失不影响I类肽的整体呈递。与野生型(未HLA编辑的)HSC相比时，HLA-A编辑的细胞显示相当的肽和蛋白质呈递。此外，如图14A和14B所示，HLA-DQB1和HLA-DPB1的缺失不影响通过由HSC分化的巨噬细胞对II类肽的整体呈递。总之，这些数据表明，尽管HLA-A、HLA-DQ和HLA-DP分子缺失，这些细胞(及其来源的谱系)仍保留了其呈递广谱I类和II类肽的能力。

实例7–抗原介导免疫反应的体内测试。

图15是迟发型超敏反应的示意图，显示抗原呈递的致敏和诱发阶段。简而言之，抗原注射后，抗原由抗原呈递细胞(APC)处理，并由APC表面的MHC II类分子呈递。CD4+T细胞识别抗原呈递细胞(APC)上的肽-MHC。当受到抗原激发(antigenic challenge)时，CD4+辅助性T细胞被激活，并且细胞因子募集巨噬细胞和其他免疫细胞，这诱导组织肿胀。

对移植小鼠进行了迟发型超敏反应测定。具体来说，通过皮下注射绵羊红细胞作为抗原使小鼠致敏。如果小鼠具有功能性免疫系统，APC处理抗原并将肽抗原呈递给CD4+T细胞。接下来，通过在小鼠左爪皮下注射相同的抗原进行激发。此时，T细胞被激活并分泌细胞因子，这些细胞因子在抗原注射部位募集巨噬细胞和其他免疫细胞，从而引起组织肿胀。在该测定中，功能性免疫系统导致左爪肿胀，如用微型卡尺所测量。

如图16A和16B中可以看出，对照(未移植)小鼠由于其免疫缺陷，左爪未出现肿胀。相反地，移植有脐带血CD34+细胞的小鼠显示组织肿胀，并且其左爪直径增加一倍。在移植了WT(未编辑HSC)和HLA编辑的HSC两者的小鼠中均发现了相似的免疫系统反应。

实例8：HLA编辑的HSC分化为造血谱系，即原单核细胞/巨噬细胞

进行实验以确定HLA缺失是否影响HSC分化为不同类型的免疫细胞的能力。使用基本如实例2中描述的方法，HLA编辑的HSC分化为原单核细胞/巨噬细胞。确定HLA编辑的HSC能够分化为与WT(非HLA编辑的)HSC相当的单核细胞/巨噬细胞谱系，如通过其CD11b+-CD14+表达所测量(图17A)。此外，CD11b+-CD14+设门群体显示等效的HLA-I和HLA-II表达(图17B)，指示HLA编辑的HSC也保留了I类和II类分子两者的整体表达。

通过评估由HSC分化的巨噬细胞的表达，评估了由编辑的HSC支持的HLA-DQB1和HLA-DPB1中的其他II类分子的整体表达。研究设计示意性地显示在图18A中。发现，HLA-DQB1和HLA-DPB1的缺失不影响其他HLA II类分子的表达(图18B)。例如，HLA-DR在WT和HLA编辑的细胞两者中均有相当的表达(图18C)。在图18B和18C中，CIITA-KO作为阳性对照。

参考文献

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Claims (39)

1.一种用于制备先天髓系谱系细胞群体或其祖细胞的方法，所述方法包括：

从分化的多能干细胞(PSC)群体富集CD34+细胞，以制备CD34+富集的群体；

诱导CD34+富集的细胞群体进行内皮细胞到造血细胞转变至少两天，但不超过12天，以制备包含造血干细胞(HSC)和/或造血干细胞祖细胞(HSPC)的群体；以及

使包含造血干细胞(HSC)和/或造血干细胞祖细胞(HSPC)的所述群体分化为祖细胞髓系细胞群体或髓系细胞群体。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述PSC群体是来源于淋巴细胞、脐带血细胞、外周血单核细胞、CD34+细胞或人类原代组织的人类iPSC群体。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述iPSC群体来源于从外周血分离的CD34+富集的细胞。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其中iPSC对于一个或多个HLAI类和/或II类基因为纯合的。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述iPSC对于HLA-DRB1是纯合的。

6.根据权利要求4所述的方法，其中所述iPSC对于HLA-B和HLA-C两者是纯合的。

7.根据权利要求2至4中任一项所述的方法，其中对所述iPSC进行基因编辑以使一个或多个HLA I类基因缺失、使一个或多个II类基因缺失和/或使支配HLA或MHC表达或呈递能力的一个或多个基因缺失。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述iPSC包括HLA-A的缺失。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其中所述iPSC包含HLA-DPB1和/或HLA-DQB1的缺失。

10.根据权利要求2至9中任一项所述的方法，其中所述iPSC经基因编辑为HLA-A^neg、对于HLA-B和HLA-C两者均为纯合的、以及HLA-DPB1^neg和HLA-DQB1^neg，并且任选地对于HLA-DRB1是进一步纯合的。

11.根据权利要求7所述的方法，其中支配HLA或MHC表达或呈递能力的所述一个或多个基因是β2-微球蛋白和/或CIITA。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中，使iPSC分化为胚状体(EB)，解离所述EB，并回收CD34+细胞。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中在iPSC分化的第8天至第15天诱导CD34+富集和内皮细胞到造血细胞转变。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述CD34富集的群体在包含Y-27632、TPO、IL-3、SCF、IL-6、IL-11、IGF-1、VEGF、bFGF、BMP4和FLT3中的一种或多种的培养基中培养。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述内皮细胞到造血细胞转变产生HSC群体，所述HSC群体包含长期造血干细胞(LT-HSC)、短期造血干细胞和造血干细胞祖细胞中的一者或多者。

16.根据权利要求12至15中任一项所述的方法，其中从经历内皮细胞到造血细胞转变的培养物中收获CD34+细胞，包括收获CD34+漂浮细胞和/或粘附细胞。

17.根据权利要求15或16所述的方法，其中所述HSC群体包含长期造血干细胞(LT-HSC)。

18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中对内皮细胞到造血细胞转变的诱导包括增加dnmt3b的表达或活性。

19.根据权利要求18所述的方法，其中对内皮细胞到造血细胞转变的所述诱导包括对所述CD34+富集的细胞施加周期性拉伸。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述周期性拉伸是2D、3D或4D周期性拉伸。

21.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中对内皮细胞到造血细胞转变的所述诱导包括Piezo1激活。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述Piezo1激活是通过将所述CD34+富集的细胞或其级分与一种或多种Piezo1激动剂接触来进行，所述一种或多种Piezo1激动剂任选地选自Yoda1、Jedi1、Jedi2、ssRNA40或其类似物或衍生物。

23.根据权利要求1至22中任一项所述的方法，其中对内皮细胞到造血细胞转变的所述诱导包括Trpv4激活。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述Trpv4激活是通过将所述CD34+富集的细胞与一种或多种Trpv4激动剂接触来进行，所述一种或多种Trpv4激动剂任选地选自GSK1016790A、4α-PDD或其类似物或衍生物。

25.根据权利要求1至24中任一项所述的方法，其中所述髓系谱系选自嗜中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞或其髓系前体中的一种或多种。

26.根据权利要求25所述的方法，其中使所述HSC群体分化为包含早幼粒细胞的群体，任选地通过在包含干细胞因子(SCF)和IL-3以及任选地粒细胞集落刺激因子(G-CSF)的培养基中培养所述HSC群体来进行。

27.根据权利要求26所述的方法，其中所述包含早幼粒细胞的细胞群体分化为包含嗜中性粒细胞的细胞群体，任选地通过在G-CSF中培养所述包含早幼粒细胞的细胞群体来进行。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述包含早幼粒细胞的细胞群体分化为包含单核细胞或巨噬细胞的细胞群体，任选地通过在粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)中培养所述包含早幼粒细胞的细胞群体来进行。

29.根据权利要求27所述的方法，其中所述包含早幼粒细胞的细胞群体分化为包含树突状细胞的细胞群体，任选地通过在粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和TNF-α以及任选地IL-4中培养所述包含早幼粒细胞的细胞群体来进行。

30.根据权利要求29所述的方法，其中通过在包含GM-CSF、IL-1β、TNF-α、INF-γ和PGE-2的培养基中培养所述包含树突状细胞的细胞群体来制备成熟树突状细胞。

31.根据权利要求25至30中任一项所述的方法，其中所述髓系谱系细胞表达嵌合抗原受体(CAR)。

32.一种包含细胞群体的组合物，所述细胞群体包含由根据权利要求1至31中任一项所述的方法产生的髓系谱系细胞和药学上可接受的载体。

33.一种包含髓系谱系的组合物，所述髓系谱系为HLA-A^neg、对于HLA-B和HLA-C两者均为纯合的、以及HLA-DPB1^neg和HLA-DQB1^neg，并且任选地对于HLA-DRB1是进一步纯合的。

34.根据权利要求33所述的组合物，其中所述髓系谱系选自单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、嗜中性粒细胞和髓系祖细胞中的一种或多种。

35.根据权利要求34所述的组合物，其中所述髓系祖细胞选自以下中的一种或多种：(CMP)、早幼粒细胞、粒细胞/巨噬细胞谱系限制性祖细胞(GMP)、巨噬细胞/树突状细胞(DC)祖细胞(MDP)、共同DC祖细胞(CDP)、常规(或经典)髓系树突状细胞(cDC)、共同单核细胞祖细胞(cMoP)和浆细胞样DC(pDC)。

36.一种用于细胞疗法的方法，所述方法包括向有此需要的人类受试者施用根据权利要求32至35所述的组合物。

37.根据权利要求36所述的方法，其中所述人类受试者患有包括淋巴细胞减少症、癌症、免疫缺陷、自身免疫性疾病、病毒感染、骨骼发育不良和骨髓衰竭综合征中的一种或多种的病状。

38.根据权利要求36所述的方法，其中所述受试者患有癌症，所述癌症任选地是血液恶性肿瘤或实体肿瘤。

39.根据权利要求36至38中任一项所述的方法，其中所述组合物在选自HLA-B、HLA-C和HLA-DRB1的一个或多个位点处与所述受试者匹配。