CN120239821A

CN120239821A - 中和抗体测定方法

Info

Publication number: CN120239821A
Application number: CN202380080211.8A
Authority: CN
Inventors: R·赫尔米; D·C·威克拉玛拉奇; W·徐
Original assignee: Merck Sharp and Dohme BV
Current assignee: Merck Sharp and Dohme BV
Priority date: 2022-09-23
Filing date: 2023-09-18
Publication date: 2025-07-01
Also published as: EP4591064A1; US20250383363A1; WO2024064044A1

Abstract

本公开一般涉及确定用药物治疗的受试者的样品中存在中和抗体(NAb)的测定。

Description

中和抗体测定方法

技术领域

本公开一般涉及中和抗体(NAb)测定，尤其是检测用药物治疗的受试者的生物样品中的NAb的方法。

背景技术

其为单克隆抗体(mAb)药物的生物治疗剂的批准标志着免疫调节癌症疗法的黄金时代，其在数十种肿瘤适应症中获得批准，并在进行中的临床试验中具有更多适应症。然而，生物治疗剂的施用具有诱导不期望的免疫原性的潜力，导致抗药物抗体(ADA)，包括中和抗体(NAb)的发展。NAb通过阻止药物与其靶的结合或由于空间位阻抑制结合后的下游信号传导而缩小治疗功效。在一些情况下，通过生物治疗剂诱导的NAb交叉反应并中和内源性对应物的生物活性，导致基本正常生理功能的受损并且因此引起危及生命的不良作用。

由于潜在的广泛副作用以及治疗失败，需要监测ADA应答的阳性率和幅度。确认的ADA阳性样品使用中和Ab测定进行测试，以评价其中和能力。由于mAb生物治疗剂在肿瘤适应症中的高剂量和长半衰期，为ADA和NAb测定收集的血清样品经常含有大量药物，其干扰ADA和NAb测定。

与ADA测定相比，药物干扰对于NAb测定尤其成问题。这是因为ADA测定中使用的标记药物可以与研究样品中存在的药物竞争。另外，ADA方法通常更灵敏，并且可以应用另外的步骤例如过夜温育或简单酸解离，而不影响合适的测定灵敏度。然而，在NAb测定中，来自研究样品的药物无法与加入NAb测定中的药物区分开。在其中存在药物摩尔比高于NAb的情况下，NAb将与过量的药物完全复合，导致假阴性读出。在其中药物直接缀合至辣根过氧化物酶(HRP)、SULFO-TAG^TM或其它有关标记的情况下，例如在间接配体或细胞结合测定中，来自样品的游离药物将与测定中的标记药物竞争，导致信号减弱，因此导致假阳性结果。在这些情况下，需要更复杂的提取技术，例如酸解磁珠提取法(Bead Extraction and AcidDissociation)(BEAD)来富集NAb并克服药物干扰。简言之，药物/ADA复合物用酸进行解离，然后添加生物素化的药物(生物素-药物)以竞争NAb结合。在用链霉抗生物素蛋白包被的磁珠拉下生物素-药物/NAb复合物并洗涤后，NAb用二次酸处理进行洗脱，中和，然后用于下游NAb测定中。然而，在BEAD测定过程中的苛刻酸处理经常可以使酸敏感性Nab阳性对照(PC)变性，并且还可以使测试样品中的酸不稳定性NAb变性，导致对NAb活性估计不足[10]。另外，BEAD测定需要大量的生物素缀合药物，以便至少以生物素-药物/样品药物的1:1比率与来自样品药物的NAb有效地竞争，其进而又需要大量的链霉抗生物素蛋白包被的磁珠。生物素-药物和链霉抗生物素蛋白-磁珠(SA-磁珠)两者均为昂贵的试剂，并且手动处理96孔形式的磁珠会是繁琐的，并且是在测定转移和故障排除过程中的主要关注点之一。

其中酸处理失败的其它情况可能是由于生物治疗剂的特殊形式，例如聚乙二醇化结构域Ab，其中聚乙二醇(PEG)部分占据了蛋白质骨架周围的很大空间。在这种情况下，由于其小分子量和低得多的热稳定性，加热不仅已用于解离ADA/药物复合物，而且还使结构域Ab药物选择性地变性。由于变性样品药物降低或消除了竞争，因此使药物变性可以促进下游生物素-药物富集。然而，加热至变性和解离具有有限的用途，并且可能仅适用于具有小分子量的模态。

因此，需要这样的方法，其克服上文提到的挑战，以检测生物样品(即，来自用治疗性抗体治疗的患者的样品)中的中和抗体。

附图说明

图1显示了所公开的PEG沉淀、酸解离和作为测定药物的生物素-药物(PABAD)方法的概述示意图。此方法超过酸解磁珠提取法(BEAD)方法的优点包括以下：(i)仅需要1步酸处理。酸处理更温和，因为进行酸处理的是1:1ADA:药物团块而非血清，(ii)生物素标记的药物不仅用于提取，而且还用作测定药物；(iii)与BEAD相比，需要更低数量的所需的生物素标记药物(1mg相对于1μg/96孔板)；(iv)不需要磁珠。

图2显示了就酸稳定性筛选中和抗体(NAb)阳性对照(PC)的结果。

图3A示出了对于BEAD方法，在样品酸预处理之后的NAb PC回收率的比较。

图3B示出了对于PABAD方法，在样品酸预处理之后的PC回收率的比较。

图4A显示了在不同量的第一mAb治疗药物的存在下，用BEAD测试的酸敏感性NAbPC的灵敏度和药物耐受性的比较。水平虚线指示了关于BEAD方法的分割点(用于区分阳性结果和阴性结果的阈值)。

图4B显示了在不同量的第一mAb治疗药物的存在下，用PABAD方法测试的酸敏感性NAb PC的灵敏度和药物耐受性的比较。水平虚线指示了关于PABAD方法的分割点。

图4C显示了在不同量的第一mAb治疗药物的存在下，用BEAD方法测试的酸抗性NAbPC的灵敏度和药物耐受性的比较。水平虚线指示了关于BEAD方法的分割点。

图4D显示了在不同量的第一mAb治疗药物的存在下，用PABAD方法测试的酸抗性NAb PC的灵敏度和药物耐受性的比较。水平虚线指示了关于PABAD方法的分割点。

图5A显示了在不同量的第二mAb治疗药物(药物2)的存在下，用BEAD方法测试的酸敏感性NAb PC的灵敏度和药物耐受性的比较。水平虚线指示了关于BEAD方法的分割点。

图5B显示了在不同量的第二mAb治疗药物(药物2)的存在下，用PABAD方法测试的酸敏感性NAb PC的灵敏度和药物耐受性的比较。水平虚线指示了关于PABAD方法的分割点。

图5C显示了在不同量的第二mAb治疗药物(药物2)的存在下，用BEAD方法测试的酸抗性NAb PC的灵敏度和药物耐受性的比较。水平虚线指示了关于BEAD方法的分割点。

图5D显示了在不同量的第二mAb治疗药物(药物2)的存在下，用PABAD方法测试的酸抗性NAb PC的灵敏度和药物耐受性的比较。水平虚线指示了关于PABAD方法的分割点。

图6示出了在添加的生物素-药物上NAb的百分比占据率。添加的生物素-药物越多，NAb的占据率百分比越低。

图7显示了在不同量的mAb药物的存在下，使用PABAD方法检测NAb的第三mAb治疗药物(药物3)。水平虚线指示了30％抑制的任意分割点。

图8显示了在不同量的mAb药物的存在下，使用PABAD方法检测NAb的第三mAb治疗药物(药物3)。水平虚线指示了30％抑制的任意分割点。

具体实施方式

本公开涉及确定受试者的样品中的中和抗体(NAb)的存在的测定，所述受试者已用药物，例如治疗性抗体进行治疗。

本公开涉及用于确定来自已接受药物的受试者的样品中是否存在药物的中和抗体(NAb)的方法，所述方法包括以下步骤：a)使样品与药物接触，所述药物的量足以结合样品中尚未与药物结合的任何抗药物抗体(ADA)，b)通过使步骤a)中的样品与聚乙二醇(PEG)接触，来沉淀任何结合的ADA/药物复合物，(c)用弱酸溶液解离ADA/药物复合物沉淀物，以得到包含游离药物和游离ADA的混合物，(d)使步骤c)中的混合物与具有标记的药物接触，以允许标记的药物与游离ADA结合以得到标记的ADA/药物复合物，(e)将来自步骤d)的标记的ADA/药物复合物固定到亲和表面上，其中所述亲和表面用对于标记药物的亲和分子进行包被，使得亲和分子与标记的ADA/药物复合物结合并且将ADA/药物复合物固定到亲和表面上，(f)通过使固定的标记的ADA/药物复合物与具有标记的药物靶接触，以允许标记的药物靶与固定的ADA/药物复合物中的药物结合，并洗掉过量的标记的药物靶，使任何NAb/药物复合物与ADA药物复合物分离，(g)确定与固定的标记的ADA/药物复合物结合的标记药物靶的水平，(h)对不含ADA和/或NAb的阴性对照(NC)执行所述方法的步骤a)至步骤g)，并且(i)将用样品执行的步骤g)中与固定的标记的ADA/药物复合物结合的标记药物靶的水平与用NC执行的步骤g)中测量的与固定的ADA/药物复合物结合的标记药物靶的水平进行比较；其中与NC中固定的标记的ADA/药物复合物结合的标记药物靶的水平相比，与样品中固定的标记的ADA/药物复合物结合的标记药物靶的更低水平指示了样品中NAb的存在。

在一个实施方案中，所述方法从使样品与药物接触开始，所述药物的量足以结合样品中尚未与药物结合的任何抗药物抗体(ADA)。足以结合尚未与药物结合的任何ADA的量通常是比结合样品中的所有ADA分子所需的药物量高得多的药物量。在本公开的方法的一个实施方案中，所添加的量范围为约10μg/mL至约25μg/mL。在本公开的方法的各个实施方案中，所添加的量范围为约5μg/mL至约15μg/mL、约10μg/mL至约20μg/mL、约18μg/mL至约25μg/mL。在一些实施方案中，所述量为至少10μg/mL、10-25μg/mL或25μg/mL。来自受试者的样品可能包含ADA/药物复合物和游离ADA。样品中的ADA可能包含NAb和非中和抗体两者。

在一个实施方案中，使用PEG沉淀选择性地沉淀ADA/药物免疫复合物，以得到含有ADA/药物复合物的团块，其中ADA和药物为1:1比率。任何剩余的游离药物都用上清液洗掉。团块然后在室温下在弱酸中重悬浮并解离短时间，随后为在基础缓冲液中加入少量标记药物，以形成标记药物/ADA复合物。这些标记药物不仅充当NAb结合的竞争者，而且一旦它们被转移并与亲和板结合，它们就还可能充当测定药物。添加标记的药物靶以结合亲和表面上的标记药物(标记药物/ADA复合物)。样品中NAb的量增加指示了更高百分比的生物素-药物被NAb结合且阻断，因此存在更低的药物-靶信号。因此，PEG沉淀不仅消除游离药物，而且还消除BEAD所需的苛刻的第一酸处理，以及对于大量药物标记的需要。

在一个实施方案中，ADA/药物复合物的选择性沉淀通过聚乙二醇(PEG)沉淀来执行，其中所使用的PEG是PEG或PEG-氯化钠(PEG-NaCl)。在所述方法的各个实施方案中，用于选择性沉淀ADA/药物免疫复合物的PEG为约1％至约10.0％、约2％至约7.0％、约5％至约8％、或约6％至约10％PEG的浓度。在所述方法的各个实施方案中，用于选择性沉淀ADA/药物免疫复合物的PEG为约1％至约10.0％、约1％、约2％、约3.5％、约4％、约4.5％、约5％、约5.5％或约6％PEG的浓度。在本发明的一些实施方案中，用于选择性沉淀ADA/药物免疫复合物的PEG为约3％至约6％PEG。在本发明的一些实施方案中，用于选择性沉淀ADA/药物免疫复合物的PEG为约3％至约5％PEG。在本发明的一些实施方案中，用于选择性沉淀ADA/药物免疫复合物的PEG为约4％至约6％PEG。在本发明的一些实施方案中，用于选择性沉淀ADA/药物免疫复合物的PEG为约4％至约5％PEG。

在所述方法的各个实施方案中，用于选择性沉淀ADA/药物免疫复合物的PEG是浓度为约1％至约10.0％、约2％至约7.0％、约5％至约8％、或约6％至约10％PEG-NaCl的PEG-NaCl。在所述方法的各个实施方案中，用于选择性沉淀ADA/药物免疫复合物的PEG-NaCl为约1％至约10.0％、约1％、约2％、约3.5％、约4％、约4.5％、约5％、约5.5％或约6％PEG的浓度。在本发明的一些实施方案中，用于选择性沉淀ADA/药物免疫复合物的PEG-NaCl为约3.5％至约4.5％PEG-NaCl。在所述方法的一些实施方案中，用于选择性沉淀ADA/药物免疫复合物的PEG-NaCl为4％PEG-NaCl。在本发明的一些实施方案中，用于选择性沉淀ADA/药物免疫复合物的PEG-NaCl为约4％至约5％PEG-NaCl。

在本公开的方法的一个方面，用于选择性沉淀ADA/药物免疫复合物的PEG或PEG-NaCl中的PEG为具有1,000至40,000道尔顿的分子量的PEG。在本公开的方法的各个实施方案中，PEG为PEG1000、PEG1450、PEG3350、PEG 3000、PEG6000、PEG8000、PEG10000、PEG14000、PEG15000、PEG20000或PEG25000。在一些实施方案中，使用PEG8000。

在所述方法的一个实施方案中，步骤b)的含有1:1比率的ADA/药物免疫复合物的团块沉淀物在用选自下述酸的非限制性实例的弱酸处理后解离，其包括乳酸、柠檬酸、草酸、三氟乙酸、琥珀酸、苹果酸、天冬氨酸、硝酸、盐酸、硫酸、硼酸及其组合。在所述方法的一些实施方案中，酸为乳酸。浓度为约20mM至250mM的乳酸可用于ADA/药物免疫复合物的解离中。在一些实施方案中，约20mM、约50mM、约100mM、约150mM或约200mM的乳酸可用于ADA/药物免疫复合物的解离中。在本发明的一些实施方案中，浓度为约50mM至100mM的乳酸可用于ADA/药物免疫复合物的解离中。

在所述方法的一个替代实施方案中，来自步骤b)的含有1:1比率的ADA/药物免疫复合物的团块沉淀物在用弱碱处理后解离。

在一个方面，来自步骤b)的含有1:1比率的ADA/药物免疫复合物的团块沉淀物在用弱酸处理约10分钟至约60分钟的时间后解离。在一些实施方案中，团块用弱酸解离约15分钟。

药物，例如本文公开的治疗性抗体和抗原结合片段，缀合到与亲和分子结合的标记。标记药物与用亲和分子包被的亲和表面结合，所述亲和分子与标记的ADA/药物复合物结合，以将ADA/药物复合物固定到亲和表面上。药物标记及其亲和分子(标记/亲和分子对)的非限制性实例是生物素/链霉抗生物素蛋白、生物素/亲和素、生物素/captavidin、蛋白A/免疫球蛋白、蛋白G/免疫球蛋白和GST/谷胱甘肽。

在一些实施方案中，药物用生物素进行标记，并且亲和分子是链霉抗生物素蛋白。所述方法进一步包括在基础缓冲液中每96孔板添加约1ng至约10ng之间的少量标记药物，例如生物素标记药物，其终止酸解离并允许标记药物与解离的ADA/药物免疫复合物结合。进一步地，将标记样品转移到用对于标记药物特异性的亲和分子(即，分子结合标记)包被的亲和表面，例如链霉抗生物素蛋白(SA)-MSD板，以捕获与ADA结合的生物素标记药物(和游离生物素标记药物)两者。与ADA结合的捕获的标记药物用标记的药物靶进行处理，并且就NAb的存在分析来自标记药物靶的信号。加上标记标签的药物靶仅与未被结合NAb阻断的抗体结合，即，与ADA结合的标记药物的一小部分(图1)。

在所述方法的一个实施方案中，药物靶通过可检测标记进行标记。在一些实施方案中，标记药物靶的可检测标记选自：(i)磺基标签标记、(ii)化学发光标记、(iiii)电化学发光标记、(iv)放射性同位素、(v)荧光标记和(vi)酶标记(通过酶促反应检测)。在所述方法的一些实施方案中，标记药物靶的可检测标记是电化学发光标记，例如加上磺基标签的标记(SULFO-TAG^TM)。

通过将来自标记药物靶的信号针对阴性对照(NC)(不含NAb的样品)和任选的阳性对照(PC)(具有NAb的样品，例如掺料有NAb的阴性样品)进行比较，来检测样品中的NAb。在一个实施方案中，NAb NC通过合并来自患者的商购可得的血清样品来获得，所述患者从未暴露于该药物(幼稚的人合并血清或正常血清样品)。商购可得的血清中药物的不存在可通过在幼稚血清样品中筛选药物的存在来确认。PC可通过用对照NAb掺料幼稚血清样品来获得，所述对照Nab对于待测试的治疗药物是特异性的。

在一些实施方案中，未添加对照NAb的幼稚合并血清用作NAb NC。在一些实施方案中，通过用对照NAb掺料幼稚血清样品来获得NAb阳性对照。可通过本领域已知的用于产生单克隆抗体和重组蛋白质的方法来产生对于不同治疗药物特异性的对照NAb。

可通过用0.1-2μg/mL的Nab掺料幼稚血清样品来获得NAb PC。幼稚血清可用浓度为约0.2-0.5μg/mL之间的NAb进行掺料，以获得低阳性对照(LPC)。在一些实施方案中，幼稚血清可用浓度为约0.1至约0.25μg/mL、约0.2至约0.45μg/mL、或约0.25至约0.5μg/mL的幼稚合并血清的NAb进行掺料，以获得LPC。在一些实施方案中，幼稚血清可用0.2μg/mL进行掺料，以获得LPC。阳性对照可通过用0-2μg/mL的对照NAb掺料幼稚血清样品来获得。

幼稚血清可用浓度为约0.8-2μg/mL的NAb进行掺料，以获得高阳性对照(HPC)。在各个实施方案中，幼稚血清可用浓度为约0.8至约0.9μg/mL、约0.9至约1μg/mL、约1至约1.15μg/mL、约1.1至约1.25、或约1.2至约2μg/mL的幼稚合并血清的NAb进行掺料，以获得LPC。在一些实施方案中，幼稚血清可用1.25μg/mL的幼稚合并血清进行掺料，以获得HPC。

与NC中固定的标记的ADA/药物复合物结合的标记药物靶的水平相比，与样品中固定的标记的ADA/药物复合物结合的标记药物靶的更低水平指示了样品中NAb的存在。样品中NAb的量增加指示了更高百分比的标记药物被NAb结合且阻断，并且因此存在更少的标记药物靶结合，以及因此来自标记的更低信号，即，来自标记标签的更低信号指示了NAb的存在。

从不含NAb的样品中检测到的信号将与从NAb NC中获得的信号可比较。从对于NAb阳性的样品中检测到的信号将低于从阴性对照中获得的信号，并且可能与从LPC和HPC中获得的信号进行比较。

在一个实施方案中，通过确定来自用治疗药物治疗的患者的多个样品中的标记药物靶的水平，来建立与固定的标记的ADA/药物复合物结合的标记药物靶水平的百分比变化的分割点。在一个实施方案中，可能建立范围为约5％至约100％抑制的多重分割点。在各个实施方案中，可能建立约5％、约8％、约10％、约14％、约15％、约20％、约25％、约30％、约32％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约90％、约95％和约100％的分割点。分割点可通过测试用治疗药物治疗的多个患者样品来建立。在所述方法的各个实施方案中，分割点可能通过测试约50至约200个患者样品来建立。

在所述方法的一些实施方案中，得自步骤c)的解离ADA和游离药物的一部分用于总ADA检测测定。

在所述方法的一些实施方案中，得自步骤c)的解离ADA和游离药物的一部分或来自步骤f)的NAb/药物复合物进行加工，以检测总ADA、NAb的存在，和/或用于在基于细胞的结合或功能测定中评估任何NAb的活性。在一些实施方案中，为了在基于细胞的结合或功能测定中使用，来自步骤f)的NAb/药物复合物，例如，其中ADA固定到与生物素化的药物结合的链霉抗生物素蛋白珠(SA-BEAD)上的，通过二次酸解离进行进一步加工，以得到待用于基于细胞的结合或功能测定中的游离NAb。细胞结合或功能测定的一些非限制性实例是酶联免疫吸附测定(ELISA)、桥接ELISA、均质迁移率测定(HMSA)和基于细胞的报告基因测定(RGA)。

定义

下文列出了本文使用的各种术语的定义。这些定义适用于如它们在本说明书和权利要求自始至终使用的术语，除非在特定情况下个别地或作为更大组的部分另有限制。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解相同的含义。一般地，本文使用的命名法以及细胞培养、分子遗传学、有机化学和肽化学中的实验室程序是本领域众所周知且常用的那些。

如本文所用，冠词“一个(a)”和“一个(an)”是指冠词的一个或多于一个(即，至少一个)语法对象。例如，“要素”意指一个要素或多于一个要素。此外，术语“包括(including)”以及其它形式例如“包括(include)”、“包括(includes)”和“包括(included)”的使用不受限制。

如本文所用，定量术语中的术语“约”是指它修饰的值的正或负10％(如果该值不可细分，例如分子或核苷酸的数目，则四舍五入到最接近的整数)。

本文公开的所有范围都包括所述端点在内并且可独立地组合(例如，“从50mg到500mg”的范围包括端点50mg和500mg、以及所有中间值和范围在内)。

如本文所用，术语“包含”可能包括实施方案“由……组成”和“基本上由……组成”。如本文所用，术语“包含”、“包括”、“具有(having)”、“具有(has)”、“可能”、“含有”及其变体预期为开放式过渡短语、术语或词语，其要求指定的成分或步骤的存在，并且允许其它成分或步骤的存在。然而，术语“包含”应该解释为包括关于以下更狭义的实施方案的支持：(i)“由……组成”，其允许仅指定的成分或步骤的存在，以及(ii)“基本上由……组成”，其允许仅指定的成分或步骤，连同非物质添加物，例如任何可接受的载体或流体的存在。

术语“抗体”以最广泛的意义使用，并且具体地涵盖例如个别单克隆抗体(包括中和抗体、全长或完整单克隆抗体)、具有多表位或单表位特异性的抗体组合物、多克隆或单价区域。抗原结合片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子，例如sc-Fv；由抗体片段形成的多特异性抗体。

本文提及的药物是抗体，并且在具体实施方案中是治疗性抗体。术语“治疗性抗体”是指作为治疗剂或药物施用的抗体，包括处于开发中或正在经历临床前或临床测试的治疗性抗体。在具体实施方案中，治疗性抗体是用于治疗炎性疾病、癌症或自身免疫的抗体。在具体实施方案中，治疗性抗体是抗CD27抗体或其抗原结合片段、抗LAG3抗体或其抗原结合片段、抗TIGIT抗体或其抗原结合片段、抗VISTA抗体或其抗原结合片段、抗BTLA抗体或其抗原结合片段、抗TIM3抗体或其抗原结合片段、抗CTLA4抗体或其抗原结合片段、抗HVEM抗体或其抗原结合片段、抗CD70抗体或其抗原结合片段、抗OX40抗体或其抗原结合片段、抗CD28抗体或其抗原结合片段、抗PD1抗体或其抗原结合片段、抗PDL1抗体或其抗原结合片段、抗PDL2抗体或其抗原结合片段、抗GITR抗体或其抗原结合片段、抗ICOS抗体或其抗原结合片段、抗SIRPα抗体或其抗原结合片段、抗ILT2抗体或其抗原结合片段、抗ILT3抗体或其抗原结合片段、抗ILT4抗体或其抗原结合片段、抗ILT5抗体或其抗原结合片段、抗4-1BB抗体或其抗原结合片段、抗NK2GA抗体或其抗原结合片段、抗NK2GC抗体或其抗原结合片段、抗NK2GE抗体或其抗原结合片段、抗TSLP抗体或其抗原结合片段、抗IL10抗体或其抗原结合片段。治疗性抗体的非限制性实例是阿维鲁单抗、巴利昔单抗、贝伐珠单抗、贝洛托单抗、布罗利尤单抗、卡那单抗、卡妥索单抗、杜匹鲁单抗、度伐利尤单抗、达雷妥尤单抗、埃罗妥珠单抗、法索单抗(fanolesomab)、奥瑞利珠单抗、瑞利珠单抗、奥拉单抗(olaratumab)、耐昔妥珠单抗、英夫利昔单抗、奥托昔单抗、阿特珠单抗、美泊利单抗、纳武单抗、阿利西尤单抗、依达赛珠单抗、依洛尤单抗、达妥昔单抗、帕博利珠单抗、雷莫芦单抗、维得利珠单抗、阿仑珠单抗、帕妥珠单抗、英夫利昔单抗、奥妥珠单抗、本妥昔单抗、贝利尤单抗、伊匹木单抗、地舒单抗、奥法妥木单抗、贝索单抗(besilesomab)、托珠单抗、戈利木单抗、乌司奴单抗、培塞利珠单抗、卡妥索单抗、依库珠单抗、雷珠单抗、帕尼单抗、那他珠单抗、贝伐珠单抗、奥马珠单抗、西妥昔单抗、依法珠单抗、替伊莫单抗、阿达木单抗、托西莫单抗、阿仑单抗、曲妥珠单抗、吉妥珠单抗奥唑米星、英夫利昔单抗、帕利珠单抗、耐昔妥珠单抗、雷昔库单抗、利妥昔单抗、司库奇尤单抗、司妥昔单抗。

如本文所用，术语“抗原”意指导致免疫系统产生针对其的抗体或特异性细胞介导的免疫应答的任何物质。疾病相关抗原是与任何疾病相关的任何物质，所述任何疾病导致免疫系统产生针对其的抗体或特异性细胞介导的应答。

术语“标记”和“可检测标记”可互换地指可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、化学或其它物理手段检测的组合物。例如，有用的标记包括荧光染料、发光剂、放射性同位素(例如，³²P、³H)、电子致密试剂、酶、生物素、地高辛、或半抗原和蛋白质、核酸或其它实体，所述实体可能例如通过将放射性标记掺入与靶分子特异性反应的寡核苷酸、肽或抗体内而变得可检测。可能采用本领域已知的用于将抗体与标记缀合的任何方法，例如使用Hermanson,Bioconjugate Techniques1996,Academic Press,Inc.,San Diego中描述的方法。

如本文所用，“药物靶”、“治疗性抗体靶”、“抗体靶”或“蛋白质靶”意指通过治疗性抗体靶向的抗原。通过抗体药物靶向的药物靶的实例包括但不限于蛋白质例如TNFα、CD27、PD1、PDL1、PDL2、TIGIT、LAG-3、VISTA、BTLA、TIM3、CTLA4、HVEM、CD70、OX40、CD28、GITR、ICOS、SIRPα、IL10、IL-4R、IL-6R、IL-33、CD20、CD3、IL-33、IL-2、IL-15、IL-18Feld 1、C5、ANGPTL-3、ACTIVIN A、GDF8、PCSK9、VEGF、Tie-2、NGF，或病毒抗原，例如SARS-cov、ebola或mers-cov。

本文公开的药物靶可能与可检测标记缀合。可检测标记的实例包括但不限于放射性同位素、化学发光标记、电化学发光标记、荧光团、发色团和酶标记。在所述方法的一些实施方案中，标记标签是电化学发光标记。在所述方法的一个具体实施方案中是电化学发光标记标签，例如SULFO-TAG^TM(Meso Scale Discovery)，其测量来自与磺基复合物(sulphocomplex)结合的钌的信号。

如本文所用，术语“免疫原性”或“免疫反应性”是指针对药物或在具体实施方案中施用于受试者的治疗性抗体(即，抗体被识别为外来的并生成体液或细胞免疫应答)的适应性免疫应答的发展。

“抗药物抗体”或“ADA”是可能针对药物的任何区域，如例如药物的可变结构域、恒定结构域或糖结构的抗体。此类抗药物抗体可能在抗体治疗期间作为患者的免疫原性反应出现(参见Pan,Y.,等人，FASEB J.9(1995)43-49)。大多数“抗药物抗体”与药物的一个或多个互补决定区结合。与药物对于其靶抗原的亲和力相比，抗药物抗体针对其药物的抗原的亲和力一般而言更低。抗药物抗体可能是中和抗体或非中和抗体。

如本文所用，“中和抗体”或“NAb”是ADA的子集。中和抗体可能是ADA的临床最相关部分，因为它们与治疗性抗体的活性位点结合，即，结合治疗性抗体的抗原结合位点，阻止治疗性抗体结合治疗性抗体靶，并且抑制其药理学功能，而非NAb与不涉及靶结合并且致使药物具有药理学活性的位点结合，尽管它从循环中的清除仍可以受到影响(Amrani等人，Journal of Translational Autoimmunity 1(2019)Article 100004)。

术语“PEG-沉淀”或“使用PEG沉淀”是指重分子量蛋白质复合物(例如，药物-抗药物抗体复合物)在PEG溶液中的沉淀，其中PEG的浓度增加，直到有效蛋白质浓度增加直到超过临界浓度，并且发生沉淀。

术语“样品”包括但不限于来自活物或曾为活物的任何数量的物质。此类活物包括但不限于人、小鼠、猴、大鼠、兔和其它动物，并且此类样品可能包括但不限于来自受试者的全血、血清或血浆。样品可能是例如在治疗性抗体的临床或临床前测试期间从受试者中获得的血清样品。

如本文所用，术语“受试者”是指人或非人生物。本文描述的方法是指人受试者和动物受试者两者。受试者可以是接受作为治疗的治疗性抗体的“患者”，并且还可能包括关于药物的临床试验中的参与者，其中所述受试者已施用该药物用于试验目的。

关于实施例的缩写

Ab 抗体

ADA 抗药物抗体

ADA/药物抗药物抗体药物复合物

BEAD 酸解磁珠提取法

BSA 牛血清白蛋白

CLB 竞争性配体结合

FBS 胎牛血清

Fc 可结晶片段

HCl 盐酸

hFc 人Fc

HPC 高阳性对照

LA 乳酸

LBD 配体结合测定

LPC 低阳性对照

M 摩尔

Mab 单克隆抗体

mFc 小鼠Fc

MRD 最低所需稀释度

N 当量

NAb 中和抗体

NaCl 氯化钠

NC 阴性对照

NHS N-羟基琥珀酰亚胺

PandA 沉淀和酸解离

PABAD PEG沉淀、酸解离和作为测定药物的生物素-药物

PBS 磷酸盐缓冲盐水

PBST 具有Tween的磷酸盐缓冲盐水

PC 阳性对照

PEG 聚乙二醇

RPM 转/分钟

RT 室温

SA 链霉抗生物素蛋白

S/N 信号/噪声

实施例

以下实施例意欲是说明性的，并且不应被解释进一步限制。本申请自始至终引用的附图以及所有参考文献、专利和已公开的专利申请的内容都通过引用明确地并入本文。

材料和方法

试剂

单克隆抗体治疗剂和用作阳性对照的抗药物抗体克隆全部由Merck&Co.,Inc.(San Francisco,CA,USA)开发。幼稚的人合并血清和来自个别供体的血清购自BioIVT(Hicksville,NY)。抗His抗体的不同克隆或由Merck&Co.,Inc.(San Francisco,CA,USA)开发，或购自R&D systems Inc.,(Minneapolis,MN)。抗小鼠Fc抗体和抗人Fc抗体购自Invitrogen,Waltham,MA。含有His标签、人Fc或小鼠Fc的靶蛋白全部购自Acrobiosystems,Newark,DE。使用来自Thermo Scientific,Waltham,MA的MSD Gold Sulfo Tag NHS酯(2μmol)(Meso Scale Diagnostic,Rockville,MD)和Zeba旋转脱盐柱40K进行小规模内部加上磺基标签的蛋白质标记。PEG8000和20％PEG-NaCl购自TekNova(Hollister,CA)。用于沉淀的V形底板来自Nunc,Rochester,NY。测试的酸使用乳酸(Spectrum Chemical MFG Corp,New Brunswick,NJ)、甘氨酸(GE Healthcare Life Sciences,Piscataway,NJ)、冰乙酸(Fisher chemicals,Pittsburg,PA)和来自Fisher chemicals(Pittsburg,PA)的1当量(N)盐酸(用于pH调整)进行制备。中和缓冲液，1摩尔(M)Tris-HCl pH 8.8和1.5M Tris-HClpH8.8购自TekNova(Hollister,CA)。这些实验中使用的所有缓冲液都使用FBS(Sigma-Aldrich Inc,St.Louis,MO)、BSA(bioWORLD,Dublin,OH)、PBS、PBST和蒸馏水进行制备，全部来自Merck&Co.,Inc.(West Point,PA,USA)。生物素-药物缀合和加上磺基标签的药物制备在Radix(Georgetown,TX)处完成，而加上磺基标签的靶蛋白的大规模分批在SyneosHealth(Princeton,NJ)处制备。链霉抗生物素蛋白板(SA-MSD板)、具有亲水表面的HighBind(HB-MSD板)和读取缓冲液T(4X)全部来自Meso Scale Diagnostic(Rockville,MD)。

酸解磁珠提取法(BEAD)程序

简言之，首先将50μL的人血清样品和对照与等体积的以pH 2.0的400mM甘氨酸-HCl混合，并且在振荡器(Labnet Orbit P4,Woodbridge,NJ)上以900转/分钟(rpm)在RT下温育60分钟。向每个样品中添加11.2μL含有89μg/mL生物素-药物的1.5M Trizma Base(pH8.8)，并且在以900rpm振荡的同时温育过夜。从药物产品中解离的NAb将与生物素-药物结合，然后固定到以6mg/mL添加的20μL链霉抗生物素蛋白包被的磁珠上。然后使用微孔板磁体(96F Magnet LifeSep Biomagnetic Separators,BioTek,Winooski,VT)捕获珠复合物，并且用PBST洗涤三次。通过用80μL的以pH 2.0的200mM甘氨酸的二次酸处理，在RT下以900rpm的10分钟振荡，从珠复合物中释放结合的NAb。然后将80微升的这种含有NAb的酸溶液转移到新板中，并且用15μL的在1M Tris盐酸(HCl)pH 8.8中的10％FBS进行中和。

PABAD程序

将测定缓冲液中的过量游离药物(60μg/mL)加入样品(50μL血清+10μL药物/缓冲液)中，并且在V形底聚丙烯板中伴随以450rpm的振荡在37℃下温育1小时。此步骤允许对于样品中的任何剩余的游离NAb的NAb-药物复合物形成[12]。在复合物形成之后，将40μL的10％PEG-NaCl溶液加入每个样品中(样品中PEG-NaCl的最终浓度为4％)，在以450rpm振荡的同时在RT下温育5分钟，然后在4℃下无振荡温育过夜。对使用不同PEG或PEG-NaCl的NAb-药物沉淀条件进行优化，以实现测定的优选特异性和灵敏度，并且使其它血清组分，特别是非特异性血清蛋白的影响降到最低。

在过夜温育之后，板在4℃下以3700g离心30分钟。在使板倾斜的同时，小心地去除上清液，而不干扰V形底孔的中心的团块。通过添加200μL的4％PEG-NaCl溶液，随后为在4℃下以3700g离心20分钟，将样品洗涤两次。在最后一次洗涤后，小心地去除上清液。然后，在以600rpm振荡的同时，样品用150μL的50mM LA在RT下处理15分钟。之后，将生物素-药物(样品中的最终浓度为20ng/mL)加入中和缓冲液中的样品中，并且在以600rpm振荡的同时在RT下温育90分钟。一旦与生物素-药物的温育完成，就将50μL的样品一式两份加入SA-MSD板中，所述板先前用10％FBS的PBS溶液进行封闭，并且在以450rpm振荡的同时在RT下温育一小时。SA-MSD板然后用PBS洗涤3次，拍干并且在以450rpm振荡的同时，与50μL的加上磺基标签的靶(0.25μg/mL)一起在RT下温育一小时。在完成后，板用PBS洗涤3次并且拍干以去除任何残留的缓冲液。将读取缓冲液T(含有三丙胺的基于Tris的缓冲液)(2X)(150μL)加入样品中，并且使用MSD板阅读器读取板。不存在任何阳性对照(PC)的样品被视为没有任何抑制的完全测定应答。百分比抑制通过以下进行计算：从1中减去在PC的存在下的样品应答与完全测定应答的比率，并且乘以100((1-S(样品读数)/对照(读数)x100)。

实施例1：

PABAD测定形式的概述

PABAD方法的概述显示于图1中，其中黑色箭头指示步骤。首先，将另外的药物材料加入样品中，以确保样品中的所有ADA(ADA包含NAb和非中和ADA)都与药物结合，以形成ADA/药物免疫复合物。PEG-NaCl然后以最佳浓度加入样品中，以选择性沉淀免疫复合物，但不沉淀游离药物。在4℃下无需搅动的过夜温育后，免疫复合物通过离心进行沉淀，洗涤，然后用酸溶液重新溶解。然后将生物素-药物加入中和缓冲液中，使得ADA/NAb现在可以与生物素-药物结合。在将混合物转移到链霉抗生物素蛋白-MSD板并洗涤后，所有游离药物都去除，并且仅生物素-药物与板结合，并且游离生物素-药物可以用加上磺基标签的药物靶进行检测。

实施例2：

竞争性配体结合(CLB)NAb测定形式的可行性

关于CLB NAb测定的最常见形式是将重组药物靶包被到板上，然后添加与血清样品预温育的HRP或钌标记的药物。如果样品含有NAb，则药物与包被的药物靶的结合降低，以给出与缺乏NAb的对照样品相比更低的信号。然而，我们提出的方法将生物素-药物加入酸解离的药物/NAb团块中，以竞争NAb结合。将生物素-药物/药物/NAb的混合物加入SA包被的MSD中是最佳的，使得仅生物素-药物与SA-MSD结合，而游离药物被洗掉。

为了测试关于这种测定形式的最佳条件，将固定量的生物素-药物包被到SA-MSD板上，随后为用各种连续稀释的加上磺基标签的靶蛋白(重组、小鼠Fc(mFc)融合的、人Fc(hFc)融合的、加上His标签的)的直接检测，或者用加上His标签的靶蛋白或mFc融合的靶蛋白的间接检测。然后，这些使用不同的加上磺基标签的抗His克隆或抗mFc抗体进行检测。如表1中所示的，不同形式得到截然不同的信噪比(S/N)。由于测定流程的简单和足够高的S/N，选择磺基标签标记的His-靶蛋白作为CLB NAb测定中的检测试剂(表1)。

表1.以不同测定形式的加上磺基标签的蛋白质的S/N比

Ab：抗体；S/N：信噪比；mFc：小鼠Fc；hFc：人Fc

S/N比对于每种蛋白质进行计算。

实施例3：

竞争性配体结合(CLB)NAb测定形式的可行性

PABAD超过BEAD的潜在优点之一是降低的酸处理，因此具有与酸敏感性NAb PC的更好相容性的可能性。为了测试这一假设，我们首先测试了对于此项目可用的10种NAb PC的酸稳定性。首先使NAb PC与600mM乙酸一起温育，并且在37℃下温育一小时，然后用Tris缓冲液中和至中性pH，然后在使用非酸处理的NAb PC作为对照的CLB测定中进行测试。如图2中所示的，仅PC 8和9仍具有其NAb活性的超过一半，而所有剩余PC具有小于40％的NAb活性。与酸稳定性结果一致的是，在BEAD中测试时，酸抗性克隆仍具有非常良好的抑制，而酸敏感性克隆具有降低的抑制或具有完全丧失的抑制(图3A-3B)。

实施例4：

NAb-药物复合物的酸解离的优化

一旦已确定CLB NAb测定形式并且已知NAb PC的酸稳定性，下一步就是筛选最佳酸条件，其可以最大限度地解离NAb/药物复合物，同时仍保存NAb活性。在测定缓冲液中制备的NAb和药物的2倍稀释物以范围为156ng/mL至2.5μg/mL的1:1比率(10μL的PC+10μL的药物)在37℃下伴随以600rpm的振荡混合1小时。样品然后用以各种浓度和pH的12种不同酸的实验对象组在RT下处理15或30分钟，随后为生物素-药物加入中和缓冲液中。在将中和缓冲液与样品混合后，孔中的最终生物素-药物浓度保持在20ng/mL下。样品然后加入预封闭的SA-MSD板中，并且最后洗涤并用加上磺基标签的靶蛋白(0.25μg/mL)检测。在评价中包括两种酸稳定性和两种酸敏感性NAb PC，以确保所选条件对于酸敏感性和酸稳定性NAb PC两者均为最佳的。对于此实验，我们使用30％抑制作为任意的测定灵敏度/分割点。表2显示了在RT下15分钟的酸处理之后达到≥30％抑制所需的NAb PC浓度。基于这些数据，50或100mM乳酸是理想的，以能够检测到至少156ng/mL的所有四种NAb PC并达到≥30％抑制。在测试的两种温育时间中，15分钟的酸处理具有更高的测定灵敏度，并且因此被选择(表2和未显示的数据)。

表2.筛选用于PABAD的酸。

实施例5：

样品中用于最佳NAb回收率和测定灵敏度的生物素-药物/药物的比率

在当前程序中使用PandA作为第一步的主要优点在于所有游离mAb药物都将保留在上清液中并最终被洗掉，在PEG沉淀的团块中留下大致1:1摩尔比的NAb和药物[12]。这意味着可以急剧降低加入酸解离免疫复合物中以竞争NAb结合的生物素-药物。

为了测试这一假设，并且为了进一步优化测定读出用于改善的灵敏度，测试了一系列不同浓度的生物素-药物和加上磺基标签的靶蛋白，连同2种生物素-药物温育时间(90分钟和过夜)。简言之，将范围为41至10,000ng/mL的1:1比率的NAb PC和药物混合，并且在37℃下温育一小时以形成免疫复合物。样品然后用50mM乳酸进行解离，并且将不同量的生物素-药物加入中和缓冲液中。如表3中所示的，以20或25ng/mL的生物素-药物伴随0.15或0.25μg/mL磺基标签-靶显示了非常良好的NAb回收率。此外，将生物素-药物浓度增加到38ng/mL导致更低的NAb回收率。因此，选择20ng/mL的生物素-药物和0.25μg/mL磺基标签-靶作为最终条件。与生物素-药物的过夜或90分钟温育给出非常相似的结果，因此选择90分钟温育时间(数据未显示)。

表3.生物素-药物和加上磺基标签的靶蛋白浓度的抑制百分比优化

对于生物素化的药物和加上磺基标签的靶蛋白浓度的每种组合评价了通过NAbPC的百分比抑制。显示了关于所测试的4种PC克隆之一的数据，并且其它三种遵循类似的模式。

实施例6：

最低所需稀释度(MRD)和PEG沉淀的优化

我们首先优化了不同的PEG浓度以及PEG形式(例如，PEG或PEG-NaCl)。将PEG或PEG-NaCl溶液与血清样品以1:1的比率充分混合，以产生3％-6％的最终PEG浓度，并且在4℃下无需搅拌温育过夜。第二天，将样品以3700g离心，并且用与用于先前PEG沉淀步骤相同浓度的PEG溶液进行洗涤。表4中的数据显示了，与PEG的相比，PEG-NaCl不仅得到更好的NAb回收率，而且还在3.5-4.5％的更广泛范围内。对于所有未来实验选择4％PEG-NaCl浓度。

表4.NAb-药物复合物沉淀的优化

对于每种沉淀条件评价了Nab对加上磺基标签的CD27与生物素化的药物的结合的百分比抑制。％PEG 8000(第2-7列)，％PEG-NaCl(第8-14列)。显示了关于所测试的2种PC克隆之一的数据。

我们还用10个个别正常人血清样品的实验对象组测试了不同的MRD，保持相同的NAb PC浓度。如先前实验中，30％抑制用作任意的测定灵敏度/分割点。如表5中所示的，具有50％血清的来自所有个别供体的样品(50μL血清+50μL PEG-NaCl)对于≤500ng/mL的PC都显示了≥30％抑制，其中大多数供体仅需要≤256ng/mL。对血清进行至25％的进一步稀释不改善测定灵敏度。另外，当以50％的MRD作为测定分割点测试76个个别血清样品时，标准差相对较小，并且给出0.68的最终分割点(信噪比)和32％抑制(1-信噪比)(图4B和4D)。因此，选择50％血清用于未来的实验。

表5.PABAD测定选择性(达到30％抑制的NAb PC浓度)

受试者	50％血清中的PC浓度(ng/mL)	25％血清中的PC浓度(ng/mL)
			1	500	1000
2	205	262
			3	500	512
4	131	410
			5	256	262
6	256	262
			7	131	262
8	131	262
			9	131	328
10	131	328

测试了来自10个个别健康供体的血清，以确定对测定应答的基质干扰。使用达到30％抑制的NAb PC浓度作为基质对测定选择性的作用的估计值。

实施例7：

使用BEAD或PABAD的酸敏感性NAb PC的相容性

具有建立的所有关键步骤包括MRD、PEG-NaCl浓度、酸以及PABAD优化的生物素-药物和加上磺基标签的药物靶的量，我们接下来直接用所有10种NAb PC比较BEAD和PABAD测定。如图3A-3B中所示的，当NAb PC以313ng/mL进行测试时，10种NAb PC中的4种对于BEAD提取完全丧失了NAb活性。然而，当用PABAD方法进行测试时，相同10种NAb PC中的9种具有>50％回收率，其中仅一种PC展示了低于40％的回收率。这些结果证实了，PABAD测定与酸敏感性NAb PC更相容，同时还维持与酸抗性NAb PC的良好相容性。

实施例8：

a.PABAD和BEAD在治疗药物(第一治疗药物/药物1)中的测定灵敏度和药物耐受性

已证实了PABAD方法与酸抗性和酸敏感性NAb PC两者具有更广泛的相容性，我们随后挑选了两种NAb PC，一种是酸敏感性的而一种是酸抗性的，以进一步比较使用PABAD和BEAD方法两者的灵敏度和药物耐受性。将范围为0.2至2μg/mL的NAb PC浓度连同0、1、10、20、50和100μg/mL的药物一起掺料到合并的正常人血清内。使样品在37℃下温育一小时以形成免疫复合物。

通过用BEAD或PABAD测定多次测试76个正常人血清样品，并且如推荐的使用平均值减去1.645倍标准差的公式获得95百分位数，来确定分割点。关于以这种方式评价的BEAD和PABAD的分割点分别为14％和32％抑制，如通过图4A-4B中的水平虚线所指示的。

如图4A中所示的，当用BEAD方法测试这种酸敏感性NAb PC时，在任何药物的不存在下，灵敏度是良好的，为约200ng/mL。然而，当存在药物时，即使在1μg/mL下，灵敏度也下降到500ng/mL。当药物高于50μg/mL时，只能检测到1000ng/mL NAb。这与PABAD方法形成鲜明对比，如图4B中所示的，即使在以100μg/mL测试的最高药物浓度的存在下，灵敏度在200ng/mL下仍是非常良好的。

如图4C中所示的，酸抗性NAb PC与BEAD方法具有好得多的相容性，使得在20μg/mL药物的存在下仍可以检测到200ng/mL NAb。仅在50和100μg/mL的较高药物浓度下，灵敏度才分别下降到300和500ng/mL。有趣的是，对于此处测试的酸抗性NAb PC，即使在以100μg/mL的最高药物水平下，PABAD方法也导致200ng/mL的最大测定灵敏度，与酸敏感性NAb PC非常相似(图4D)。因此，PABAD方法证实了对于酸敏感性和酸抗性NAb PC两者优良的灵敏度和药物耐受性。

b.PABAD在不同mAb治疗药物(药物3)中的测定灵敏度和药物耐受性

我们确定了PABAD应用于评价其它生物治疗剂中的中和抗体的容易性。我们分别使用两种中和抗体(一种酸稳定性的和一种酸敏感性的)比较了PABAD和BEAD对于第二单克隆抗体治疗药物(药物2)的灵敏度和药物耐受性。与先前评价类似，在0、1、10、20、50和100μg/mL的药物的存在下，将范围为0.05至2μg/mL的连续稀释的NAb PC掺料到合并的正常人血清内，随后为在37℃下1小时的免疫复合物形成。与先前一样，使用来自76个未治疗的(naive)受试者的个别血清在多天内以不同的板布局进行CP评价。图5A-5D展示了对于药物2对于酸敏感性和抗性PC使用PABAD或BEAD方法的中和抗体评价的灵敏度和药物耐受性。

在样品中的任何游离药物的不存在下，BEAD方法显示了对于测定敏感性和抗性NAb PC两者非常高的灵敏度(图5A和5C)。然而，在药物的存在下，酸敏感性PC的测定灵敏度急剧下降(图5A)。如预计的，尽管药物耐受性仍在20μg/mL的范围内，但酸抗性NAb PC在BEAD测定中指示了更好的应答。另一方面，PABAD方法显示了与酸敏感性和酸抗性NAb PC两者更好的相容性(图5B和5D)。除与两种PC更好的相容性之外，PABAD方法还指示了关于敏感性和抗性NAb PC分别高达50μg/mL和100μg/mL的游离药物的更高药物耐受性。出乎意料的是，在样品中的游离药物的不存在下，PABAD测定灵敏度对于两种PC均低于BEAD方法。无论如何，PABAD方法对于药物2中的NAb评价工作良好，并且数据支持该方法适用于其它单克隆抗体治疗剂中的NAb评价的理由。

我们还测量了PABAD对于第三单克隆抗体治疗药物(药物3)和第四单克隆抗体治疗药物(药物4)的灵敏度和药物耐受性，类似于药物2。如图7和8中所示的，PABAD方法显示了对于药物3和药物4两者极大的相容性。最大测定灵敏度对于药物3和药物4两者在125-250ng/mL之间。药物耐受性对于药物3和药物4分别高达150μg/mL和200μg/mL的游离药物。

讨论(实施例1-8)：

药物干扰是NAb测定的最大挑战之一，尤其是对于肿瘤适应症中的mAb研发流程。酸解离和生物素化的药物提取已广泛用于基于板和珠两者的预处理程序。尽管大多数应用成功，但酸解离可以通过导致NAb PC变性、药物靶释放使NAb测定失败，因此加剧靶干扰以及与聚乙二醇化的生物制剂的不相容性[10]。在由于酸敏感性的NAb PC变性的情况下，可以筛选出更温和的酸或更短的酸处理条件，或者在最坏的情况下，必须重新生成且筛选新的酸抗性NAb PC。在ADA测定中，由于用于大多数ADA测定的桥接形式，与NAb测定相比，药物干扰通常更易于克服。然而，当药物水平非常高时，即使对于ADA测定，简单的酸解离也可能不足以克服药物干扰[12]。最近以来，已使用克服ADA测定中的药物干扰的新方法，称为PEG沉淀和酸解离(PandA)[12]。虽然使用PEG以选择性沉淀免疫复合物早已为人所知[13，14]，但Zoghbi等人描述PandA的首个出版物[12]应用PEG以选择性沉淀免疫复合物，使得上清液中的所有游离药物都可以被洗掉，留下1:1比率的ADA：药物免疫复合物。这种免疫复合物然后进行短暂解离并且在酸化条件下包被到MSD板上。然后加入钌标记的药物并结合到板吸附的ADA上，以给出信号读出。

在PABAD方法中，优点之一在于标记药物不仅用于竞争NAb结合，而且还用于最终的竞争性配体结合测定中。在BEAD测定中，理论上，为了具有NAb的更好竞争和更好回收，需要加入生物素-药物至高于样品中的药物水平的水平。根据我们的经验，我们通常以生物素-药物/样品药物的1:1比率开始，并且有时需要高达3:1以实现良好的药物耐受性。肿瘤适应症中的mAb生物治疗剂具有数百微克/mL的样品药物水平并不罕见。如果样品含有100μg/mL的mAb药物，并且100μl的起始样品体积用于BEAD处理，则对于每个孔需要10-30μg的生物素-药物，其对于整块96孔板为1-3mg。由于所使用的大量生物素-药物，因此需要相应地增加拉下这些生物素-药物所需的磁珠量，以确保所有生物素-药物都被拉下。这不是本文公开或请求保护的PABAD方法所必需的。而与直觉相反的是，我们发现添加更多的生物素-药物实际上减少灵敏度。这是因为一种药物分子被NAb占据的百分比等于(总NAb)/(沉淀的样品药物+加入的生物素-药物)*100％，无论它是游离药物还是生物素-药物。这在图6中示出。假设沉淀团块中存在10种NAb和10种样品药物，当加入1种生物素-药物时，则每种药物(样品药物或生物素-药物)被NAb占据的几率为(10NAb)/(11总药物)*100％＝90.9％。然而，如果加入10种生物素-药物，则现在每种药物被NAb结合的几率降低到(10NAb)/(20总药物)*100％＝50％。因此，我们可以使用低至10-20ng/mL的生物素-药物的浓度，其对于整块96孔板为0.5-1.0μg，与典型的BEAD测定中需要1-3mg的生物素-药物相比，其为1/1000。另外，无需磁珠并且无需二次酸解离步骤。

总之，所公开或所请求保护的PABAD方法消除了BEAD中苛刻且漫长的一次酸解离，使用1/1000的生物素-药物浓度并消除了磁珠，使得酸敏感性Nab物质以简化得多的程序得到保存。另外，这种预处理使得同一样品能够经历PEG沉淀和酸解离，然后可以在ADA测定中测试部分样品，而剩余样品可以在4℃下中和并且与生物素-药物一起温育。由于对于ADA测定只需要小体积，因此筛选和确认性测定可以同时完成。这似乎可能增加确认性ADA测试样品数目，然而，关于取出和制备样品、PEG沉淀过夜等节省的时间可以是值得的。一旦已知ADA结果，然后就将阳性样品加载到SA-MSD上以完成NAb测试。这是用于mAb生物治疗剂的免疫原性测试的真正的一体化方法。

在其中需要基于细胞的功能性测定或基于细胞的结合测定的情况下，在PandA沉淀后需要更多的与磁珠组合的生物素-药物，以与团块中的药物更好地竞争并尽可能多地回收NAb。这仍然比BEAD处理更好，因为它仅具有两次更短和更温和的酸处理，并且需要更少的生物素-药物以与沉淀的药物竞争。

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所公开的主题事项的范围不受本文所述的具体实施方案和实施例的限制。事实上，除所述修改之外本公开的各种修改根据前述说明书和附图对于本领域技术人员将变得显而易见。此类修改预期落入所附权利要求的范围内。

本文引用的所有参考文献(例如，出版物或专利或专利申请)都通过引用以其整体并入本文且用于所有目的，其程度与每个个别参考文献(例如，出版物或专利或专利申请)具体地且个别地指示通过引用以其整体并入用于所有目的是相同的。其它实施方案在以下权利要求的范围内。

Claims

1.一种用于确定来自已接受药物的受试者的样品中存在该药物的中和抗体(NAb)的方法，所述方法包括以下步骤：

a)使样品与药物接触，所述药物的量足以结合样品中尚未与药物结合的任何抗药物抗体(ADA)；

b)通过使步骤a)中的样品与聚乙二醇(PEG)接触，来沉淀任何结合的ADA/药物复合物；

c)用弱酸溶液解离ADA/药物复合物沉淀物，以得到包含游离药物和游离ADA的混合物；

d)使步骤c)中的混合物与具有标记的药物接触，以允许标记的药物与游离ADA结合以得到标记的ADA/药物复合物；

e)将来自步骤d)的标记的ADA/药物复合物固定到亲和表面上，其中所述亲和表面用对于标记药物的亲和分子进行包被；

f)通过使固定的标记的ADA/药物复合物与具有标记的药物靶接触，以允许标记的药物靶与固定的标记的ADA/药物复合物中并非NAb/药物复合物的药物结合，并洗掉过量的标记的药物靶，使任何NAb/药物复合物从ADA药物复合物中分离；

g)确定与固定的标记的ADA/药物复合物结合的标记药物靶的水平；

h)对不含ADA和/或NAb的阴性对照(NC)执行所述方法的步骤a)至步骤g)；和

i)将用样品执行的步骤g)中与固定的标记的ADA/药物复合物结合的标记药物靶的水平与用NC执行的步骤g)中测量的与固定的ADA/药物复合物结合的标记药物靶的水平进行比较；

其中与NC中固定的标记的ADA/药物复合物结合的标记药物靶的水平相比，与样品中固定的标记的ADA/药物复合物结合的标记药物靶的更低水平指示了样品中Nab的存在。

2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤d)和步骤e)中使用的药物标记及其亲和分子分别选自：(i)生物素和链霉抗生物素蛋白，(ii)生物素和亲和素，(iii)生物素和captavidin，(iv)蛋白A和免疫球蛋白，(v)蛋白G和免疫球蛋白，以及(vi)谷胱甘肽-S-转移酶(GST)和谷胱甘肽。

3.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述药物靶标记选自：(i)磺基标签标记、(ii)化学发光标记、(iii)电化学发光标记、(iv)放射性同位素、(v)荧光标记和(vi)酶标记。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中步骤d)和步骤e)中使用的药物标记及其亲和分子分别为生物素和链霉抗生物素蛋白。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述标记的药物靶是电化学发光磺基标签标记。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其进一步包括将用样品执行的步骤g)中与固定的标记的ADA/药物复合物结合的标记药物靶的水平与分割点进行比较的步骤，所述分割点通过确定用具有Nab的阳性对照(PC)执行的步骤g)中测量的与固定的ADA/药物复合物结合的标记药物靶的水平而生成。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中步骤e)的亲和表面是亲和板。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中步骤b)的PEG在具有约1％至8％的PEG浓度的低分子量PEG-NaCl溶液中提供。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中步骤b)的PEG在具有约4-5％的PEG浓度的PEG-NaCl溶液中提供。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述PEG是PEG8000。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其进一步包括用弱酸溶液解离来自步骤f)的NAb/药物复合物以得到包含游离药物和游离NAb的混合物，并且在基于细胞的结合或功能测定中评估所述NAb的活性。

12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中用弱酸溶液的解离进行少于60分钟的时段。

13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中用弱酸溶液的解离进行约15分钟的时段。

14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述方法在96孔板中进行。

15.根据权利要求14所述的方法，其中步骤d)中的96孔板每孔使用的标记药物的量小于10ng。

16.根据权利要求14-15中任一项所述的方法，其中步骤d)中的96孔板每孔使用的具有标记的药物的量小于1ng。

17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述药物是选自以下的治疗性抗体药物：

a.抗CD27抗体或其抗原结合片段；

b.抗LAG3抗体或其抗原结合片段；

c.抗TIGIT抗体或其抗原结合片段；

d.抗VISTA抗体或其抗原结合片段；

e.抗BTLA抗体或其抗原结合片段；

f.抗TIM3抗体或其抗原结合片段；

g.抗CTLA4抗体或其抗原结合片段；

h.抗HVEM抗体或其抗原结合片段；

i.抗CD70抗体或其抗原结合片段；

j.抗OX40抗体或其抗原结合片段；

k.抗CD28抗体或其抗原结合片段；

l.抗PD1抗体或其抗原结合片段；

m.抗PDL1抗体或其抗原结合片段；

n.抗PDL2抗体或其抗原结合片段；

o.抗GITR抗体或其抗原结合片段；

p.抗ICOS抗体或其抗原结合片段；

q.抗SIRPα抗体或其抗原结合片段；

r.抗ILT2抗体或其抗原结合片段；

s.抗ILT3抗体或其抗原结合片段；

t.抗ILT4抗体或其抗原结合片段；

u.抗ILT5抗体或其抗原结合片段；

v.抗4-1BB抗体或其抗原结合片段；

w.抗NK2GA抗体或其抗原结合片段；

x.抗NK2GC抗体或其抗原结合片段；

y.抗NK2GE抗体或其抗原结合片段；

z.抗TSLP抗体或其抗原结合片段；和

aa.抗IL10抗体或其抗原结合片段。

18.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述药物是人或人源化单克隆抗体药物。

19.根据权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述药物靶是蛋白质抗原。

20.根据权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述药物靶是病毒抗原。

21.根据权利要求19所述的方法，其中所述药物靶选自TNFα、CD27、PD1、PDL1、PDL2、TIGIT、LAG-3、VISTA、BTLA、TIM3、CTLA4、HVEM、CD70、OX40、CD28、GITR、ICOS、SIRPα、IL10、IL-4R、IL-6R、IL-33、CD20、CD3、IL-33、IL-2、IL-15、IL-18、Feld 1、C5、ANGPTL-3、ACTIVINA、GDF8、PCSK9、VEGF、Tie-2、NGF。

22.根据权利要求20所述的方法，其中所述药物靶选自SARS-CoV、RSV、ebola或MERS-CoV。