CN120209086A - 一种抗菌肽及其在溃疡性结肠炎治疗中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种抗菌肽及其在溃疡性结肠炎治疗中的应用。本发明从抗菌肽数据库中筛选出针对肠道致病菌的天然抗菌肽，利用生物信息学技术和计算机辅助药物设计技术，对现有的天然抗菌肽设计改造得到一种新的抗菌肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明通过化学合成所述抗菌肽，并在实验中验证了其抗菌活性、细胞毒性、溶血活性，同时验证了该抗菌肽对溃疡性结肠炎的治疗效果，证明了该抗菌肽具有用于治疗溃疡性结肠炎的应用前景。

Description

一种抗菌肽及其在溃疡性结肠炎治疗中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种抗菌肽及其在溃疡性结肠炎治疗中的应用。

背景技术

溃疡性结肠炎是一种影响直肠和结肠的终身炎症性疾病。其全球的发病率呈逐渐上升趋势。该疾病可高度影响患者的生活，导致长期并发症，目前，还该疾病确切机制仍不清楚，其患病原因与生活方式饮食、遗传因素、免疫缺陷和肠道菌群失调等相关。目前还没有治疗这种疾病的特定药物，尽管治疗技术有所进步，包括5-氨基水杨酸、抗生素、免疫抑制剂和生物制剂等治疗药物已在临床上使用。但这些治疗方法并不是普遍适用的，长期使用这些药物可能会导致一系列的副作用。尤其是用抗生素治疗溃疡性结肠炎时，会产生耐药性。

抗菌肽是一类广泛存在于自然界，具有广谱抗菌活性的多肽类物质，因其独特的抗菌作用机制被视为传统抗生素的新型替代药物。由于天然抗菌肽往往存在活性不强，高电荷肽有着潜在的细胞毒性等缺点，其研发与应用也受到来源、不稳定性、毒性和生物利用度的限制。因此基于天然抗菌肽的设计与优化成为了近期研究热点。

抗菌肽由于其独特的作用机制，与抗生素完全不同，在已报道的抗菌肽的作用机理中，有些抗菌肽通过破坏细菌细胞膜结构，使细菌内容物外渗而死亡；还有些抗菌肽能够抑制细菌特异性酶或者DNA转录和蛋白质翻译，影响胞内蛋白质相互作用，这些作用机制都不容易引起细菌的耐药性，因此，抗菌肽有望替代抗生素解决病菌耐药性问题，以及由抗生素滥用导致的一系列问题。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供一种抗菌肽，具有高效稳定无毒性的优点，可用于溃疡性结肠炎的治疗中。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

第一方面，本发明提供了一种抗菌肽，所述抗菌肽的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

本发明从抗菌肽数据库中中筛选针对肠道致病菌的天然抗菌肽，通过利用生物信息学技术和计算机辅助药物设计技术，对现有天然的抗菌肽设计改造，以提高其活性，降低其细胞毒性。本发明对该天然抗菌肽进行了如下改造：删减带正电荷的氨基酸-精氨酸；将亲水区不带电的丝氨酸残基替换为色氨酸；将络氨酸和苏氨酸替换为脯氨酸和色氨酸，最终设计得到一种新的抗菌肽，其氨基酸序列为：LWRDLICLCRNRRCNRGQLFPGWCPGWWLRCCRR。本发明通过N末端酰胺化修饰及氨基酸替换等改造得到的抗菌肽降低了原有抗菌肽的正电荷数，减少了抗菌肽的细胞毒性，同时，通过增加疏水性和两亲性提高了抗菌肽的作用效果。本发明所得的抗菌肽具有高效稳定无毒性的优点。

第二方面，本发明提供了所述的抗菌肽在制备抗菌剂中的应用。

本发明对所得的抗菌肽进行了杀菌活性检测，结果显示，该抗菌肽具有较好的杀菌活性。所述抗菌肽浓度为7.5μM时，其杀菌率可达到99％以上；浓度为25μg/mL时，杀菌率均可达到100％。

优选地，所述抗菌剂抑制的细菌包括革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌。

优选地，所述革兰氏阳性菌包括金黄色葡萄球菌；所述革兰氏阴性菌包括大肠杆菌、耐药性鲍曼不动杆菌。

第三方面，本发明提供了一种抗菌剂，包括所述的抗菌肽。

优选地，所述抗菌肽的作用浓度不低于7.5μM。

第四方面，本发明提供了所述的抗菌肽在制备治疗溃疡性结肠炎的药物或制剂中的应用。

本发明通过实验验证了所述抗菌肽对动物肠道菌群的影响以及该抗菌肽对溃疡性结肠炎的治疗效果。

优选地，所述抗菌肽通过作用于肠道菌群来治疗溃疡性结肠炎。

第五方面，本发明提供了一种治疗溃疡性结肠炎的药物或制剂，包括所述的抗菌肽。

本发明的有益效果为：

本发明从抗菌肽数据库中筛选出针对肠道致病菌的天然抗菌肽，利用生物信息学技术和计算机辅助药物设计技术，对现有的天然抗菌肽设计改造得到一种新的抗菌肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明通过化学合成所述抗菌肽，并在实验中验证了其抗菌活性、细胞毒性、溶血活性，同时验证了该抗菌肽对溃疡性结肠炎的治疗效果，证明了该抗菌肽具有用于治疗溃疡性结肠炎的应用前景。

附图说明

图1为本发明化学合成的抗菌肽的质谱结果。

图2为本发明所述抗菌肽的二级结构预测图。

图3为不同浓度抗菌肽处理后的杀菌平板图；A图为金黄色葡萄球菌的结果；B图为耐药性鲍曼不动杆菌的结果；C图为大肠杆菌的结果。

图4为不同浓度抗菌肽处理后细菌存活率直方图；A图为金黄色葡萄球菌的结果；B图为耐药性鲍曼不动杆菌的结果；C图为大肠杆菌的结果。

图5为本发明所述抗菌肽的细胞毒性结果。

图6为本发明所述抗菌肽的细胞溶血结果。

图7为造模后小鼠的体重变化。

图8为治疗后小鼠的体重变化。

图9为结肠长度比较结果。

图10为脾脏指数比较结果。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1：

本发明在Antimicrobial Peptide Database中寻找能够作用于肠道致病菌的天然抗菌肽，筛选得到一种天然抗菌肽，氨基酸序列为：LSRDLICLCRNRRCNRGELFYGTCAGPFLRCCRRRR。根据数据库信息可知，该抗菌肽从C57BL/6小鼠的小肠中分离得到，其疏水性为31％，净电荷数为+10。该天然抗菌肽对肠道沙门氏菌、鼠伤寒phoP菌株、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和单核细胞增生李斯特菌均具有活性。但高电荷抗菌肽具有较强的细胞毒性，因此本发明对该天然抗菌肽进行了如下改造：删减带正电荷的氨基酸-精氨酸；抗菌肽的两亲性对于抗菌活性及抗菌谱选择性也有很大影响，将亲水区不带电的丝氨酸残基替换为色氨酸以增强两亲性；为增加疏水性将络氨酸和苏氨酸替换为脯氨酸和色氨酸，最终设计得到一种新的抗菌肽，其氨基酸序列为：LWRDLICLCRNRRCNRGQLFPGWCPGWWLRCCRR。改造后利用算法进行预测，预测结果表明，其为抗菌肽的正确性为99.9％，其净电荷为+7，疏水性保持在50％。本发明将改造筛选后的抗菌肽序列进行化学合成，随后进行质谱分析。质谱结果表明(图1)，本发明设计的抗菌肽跟化学合成的抗菌肽分子量几乎一致，分别为4293.13g/mol和4294.11g/mol，纯度高于95％。用Alphafold3预测其二级结构，结果显示为α螺旋结构(图2)。本发明用该化学合成的抗菌肽开展后续实验。

实施例2：

本实施例对实施例1化学合成的抗菌肽进行杀菌活性检测。检测的细菌包括：典型革兰氏阳性菌——金黄色葡萄球菌、典型革兰氏阴性菌——大肠杆菌及多重耐药性鲍曼不动杆菌。最小杀菌浓度(MBC)是杀死细菌的最低药物浓度，采用菌落计数法测定。

杀菌实验过程：

用PBS将金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、多重耐药性鲍曼不动杆菌的菌悬液稀释至活菌数为10⁵cfu/mL。用PBS将抗菌肽分别稀释至不同浓度：400μg/mL、200μg/mL、100μg/mL和50μg/mL。

将稀释好的菌悬液与抗菌肽按照体积比为1：1混合，共同在37℃培养箱中培养2小时，然后接种于固体LB培养基上，37℃培养12h。同时，以PBS为对照处理。MBC是由在固体培养基上形成的菌落数量决定的，通过菌落计数法，根据每个平板上的菌落数量，按照式(1)计算抗菌肽的杀菌率。

杀菌率(％)＝(实验组平板菌落数/对照组平板菌落数)×100％——式(1)

杀菌结果如图3-4所示。从杀菌平板的结果可知，本发明所述抗菌肽对三种代表性的细菌均有显著的杀菌活性，浓度为25μg/mL时，杀菌率均可达到100％(图3)。

使用GraphPad Prism 8构建存活率直方图，结果显示，所述抗菌肽浓度为7.5μM时，其杀菌率可达到99％以上(图4)。

实施例3：

本实施例对实施例1化学合成的抗菌肽(AMPs)进行细胞毒性实验。

将小鼠巨噬细胞RAW264.7培养至对数生长期，以每孔10⁵个细胞的密度接种于96孔板中，并置于细胞培养箱(5％二氧化碳，37℃)中24小时。弃上清液，将AMPs加入至DMEM培养基中，使AMPs的最终浓度分别为12.5、25、50、100、200μg/mL，不含AMP的样品作为空白对照，培养12h，每孔加入10μL CCK-8，再孵育2h。最后，使用酶标仪在450nm波长处测量吸光度。按照式(1)计算细胞的存活率，采用GraphPad Prism 8作图。

细胞存活率(％)＝(OD实验孔-OD空白孔)/(OD对照孔-OD空白孔)×100％——式(2)

巨噬细胞RAW264.7的毒性结果显示，在0-200μg/mL浓度下，抗菌肽对巨噬细胞无毒性效应(图5)。

实施例4：

本实施例对实施例1化学合成的抗菌肽(AMPs)进行细胞溶血实验。

取新鲜血液，离心，弃上清，PBS洗涤4-6次后，收集红细胞直至上清。将分散在PBS中的2％ V/V红细胞悬液与AMPs混合，使得AMPs的最终浓度分别为12.5、25、50、100和200μg/mL。以PBS样品为阴性对照，以2％ Triton X-100样品为阳性对照。37℃温和孵育2h后，离心收集上清，用酶标仪检测样品570nm处的吸光度。按照式(3)计算溶血率，使用GraphPadPrism 8绘制溶血率直方图。

溶血率(％)＝【OD(实验组)-OD(PBS组)】/【OD(阳性对照组)-OD(PBS组)】——式(3)

细胞溶血结果如图6所示，本发明的抗菌肽(LR)与其他抗菌肽(KC，氨基酸序列：KWWIKKVFKWIKGIGKEVVIRTGIEIAACKIKGEC)对比可得，在浓度为100μg/mL时，LR几乎不产生溶血，而KC溶血率远高于LR的溶血率。

实施例5：

本实施例验证实施例1化学合成的抗菌肽(AMPs)在溃疡性结肠炎中的应用。

实验过程：

选择健康的6-8周龄雌性C57小鼠(体重18-20g)随机分组，实验组小鼠给予2.5％DSS水，自由饮水7d，对照组小鼠给予正常水，通过每天称量其体重和观察小鼠粪便隐便血情况，判断建立UC模型。脾脏指数和结肠长度是UC疾病表型的重要指标。将造模成功实验组小鼠以5mg/kg的AMPs剂量，灌胃治疗7天，对照组以相同剂量的PBS灌胃7天，随着实验组AMPs治疗小鼠的时间增加，小鼠体重逐渐增加，小鼠的结肠长度在治疗周期结束后，与PBS治疗组相比，显著上升，脾脏指数也在AMPs治疗周期结束后显著下降。

脾脏指数测定：首先，测量小鼠的体重(克)：将小鼠称重，记录其体重；再测量小鼠的脾脏重量(克)：用天平称重，记录脾脏的重量。按照式(4)计算脾指数。

脾指数＝脾脏重量(克)/小鼠体重(克)——式(4)

结果如图7-10所示。DSS水处理后导致了小鼠显著的体重下降。小鼠体重变化、结肠长度和脾脏指数表明，在AMPs治疗后，溃疡性结肠炎症状都有所恢复。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (9)

1.一种抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的抗菌肽在制备抗菌剂中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述抗菌剂抑制的细菌包括革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述革兰氏阳性菌包括金黄色葡萄球菌；所述革兰氏阴性菌包括大肠杆菌、耐药性鲍曼不动杆菌。

5.一种抗菌剂，其特征在于，包括权利要求1所述的抗菌肽。

6.如权利要求5所述的抗菌剂，其特征在于，所述抗菌肽的作用浓度不低于7.5μM。

7.如权利要求1所述的抗菌肽在制备治疗溃疡性结肠炎的药物或制剂中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述抗菌肽通过作用于肠道菌群来治疗溃疡性结肠炎。

9.一种治疗溃疡性结肠炎的药物或制剂，其特征在于，包括权利要求1所述的抗菌肽。