CN120206028A - 刀片上进行的组织切片的目标微区激光切割、收集装置及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了刀片上进行的组织切片的目标微区激光切割、收集装置及方法，其中在刀片上进行的组织切片的目标微区激光切割、收集装置包括载体台、刀片、激光切割系统、控制模块和收集器，激光切割系统包括激光器、扩束镜、振镜以及物镜，通过调整振镜的扫描角度θ并结合物镜将扫描后的激光聚焦实现组织切片上的目标微区的切割以及目标微区的弹起。本发明将激光显微切割与机械切片相结合，在激光边缘弹射结合介电泳力的作用下实现置于倾斜刀片上的组织切片特定微区的非接触式收集，确保样品的形态在整个获取过程的一体化，精确地保留了目标细胞或细胞群的三维位置信息，提高了切割效率，还能够实现非接触式切割，防止样品被污染。

Description

刀片上进行的组织切片的目标微区激光切割、收集装置及 方法

技术领域

本发明涉及光电成像领域，尤其涉及刀片上进行的组织切片的目标微区激光切割、收集装置及方法。

背景技术

异质细胞或细胞群的空间组学信息分析在生物医学研究中具有重要意义。生物组织中特异性细胞的分离是生物学家研究异质细胞基因表达，进一步了解生物学功能或疾病机制的基础。因此，需要一种高精度、无污染的方法将目标细胞或细胞群从周围生物组织中分离。激光显微切割是一种强大的技术，能够对组织切片进行成像，并定位目标细胞，利用微激光束实现高精度分离，有效地结合了形态学和各种分子分析。

然而，现有的激光显微切割技术在实施之前均需要先通过组织切片机将组织块切成组织切片，再采用与激光显微切割系统进行切割如申请公开号为CN114923755A的发明专利，提供了一种基于激光显微切割技术分离大白菜组织细胞的方法，在对样品进行预处理后进行组织切片，再将处理后的组织切片转移至激光显微切割显微镜的载物台上，使用激光将目标细胞切割下来，随后用离心管盖收集样品；通常在组织切片转移至激光显微切割显微镜的载物台上时，还需将组织切片处理成适配的尺寸后进行贴片，再进行激光切割操作，这使得目标细胞或细胞群的三维位置信息较难准确获得，并且获取目标微区的效率比较低，对于目标微区的RNA、蛋白质等的下游分析有一定影响。同时，在转移组织切片和收集目标细胞时，样本容易被接触、污染，同时，该类方法中，目标细胞的收集通过人工进行，在多个目标细胞需要分类收集的情况下，收集效率较低且样本易被污染。

发明内容

因此，为解决上述问题，本发明提供了刀片上进行的组织切片的目标微区激光切割、收集装置及方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

在刀片上进行的组织切片的目标微区激光切割、收集装置，包括：

载体台，用于放置样本组织块并控制其移动；

刀片，通过夹具倾斜地设置在载体台的一侧，刀片的倾斜角度为φ（请提供一个角度范围，以及说明设定这个角度的原因/有益效果），刀片静止不动，并通过移动载体台使刀片相对于载体台上的样本组织块移动从而完成机械切片并获得组织切片，切削完成后，组织切片位于刀片的上表面，且刀片作为组织切片的基底；

激光切割系统，包括用于提供脉冲激光的激光器、用于将激光器发射的激光进行扩束的扩束镜、用于控制扩束后的激光的扫描角度和扫描速度的振镜以及用于聚焦扫描后的激光光束的物镜，通过调整振镜的扫描角度θ并结合物镜将扫描后的激光聚焦实现组织切片和组织切片上的目标微区的切割以及目标微区的弹起；

控制模块，分别与载体台和激光切割系统信号连接，并同步控制机械切片和激光切割；

收集器，位于组织切片上的目标微区的上方，用于在静电场作用下使弹起的目标微区发生极化，从而在介电泳力的作用下将目标微区吸附至收集器中。

优选的，还包括静电发生器，所述静电发生器与收集器之间连接有静电发生头，并对收集器均匀施加静电。

优选的，实施激光扫描切割的区域设置在刀片上表面位于刀片前端刀尖处至距离刀尖10μm之间的区域。

优选的，所述扩束镜设置于所述激光器和振镜之间，包括靠近所述激光器的第一透镜以及靠近所述振镜的第二透镜。

优选的，所述物镜位于刀片的斜上方，且物镜发射出的聚焦后的光斑的光轴与刀片的上表面垂直。

优选的，所述目标微区的上方通过纵横阵列或者蜂窝状排列有多个收集器。刀片上进行的组织切片的目标微区激光切割、收集方法，包括以下步骤：

S1、将样本组织块放置在载体台上的操作位置，并对样本组织块进行成像，选定待切割的目标微区，并存储样本组织块的组织切片位置以及所有目标微区的目标位置信息；

S2、收集器连接静电发生器，并调整收集器的位置，确保收集器位于目标微区的上方；

S3、激光器提供脉冲激光，该脉冲激光经过扩束镜扩束和振镜扫描后通过物镜聚焦成能量达到所设定的切割阈值的光斑，并等待触发信号出光；

S4、控制模块信号控制载体台带动样本组织块水平移动，确保刀片与样本组织块相对移动实现机械切片，当移动到步骤S1中所存储的组织切片位置时，控制模块发送信号至振镜和脉冲激光，通过调整振镜的扫描角度θ和扫描速度v，对目标微区上的一系列目标位置点逐一进行扫描消融，当一个闭合曲线最后一点被消融时，同步产生的冲击波压力在刀面反射使目标微区弹起；

S5、开启收集器，在收集器产生的非均匀电场中发生极化，使目标微区在介电泳力作用下被吸附至所述收集器中。

优选的，步骤S4中，振镜采用单轴振镜横向扫描方式，通过设定扫描时间控制扫描速度，进而调整脉冲激光在进刀的方向的切削速度v，确保相邻消融点的间隔小于消融点直径。

优选的，当所述目标微区直径小于100μm时，通过与所述刀片的上表面垂直方向的聚焦光斑实现目标微区的切割和弹射；

当所述目标微区直径大于100μm时，增加沿水平方向射出的用于增大施加给所述目标微区的弹射力的水平聚焦光束。

优选的，当具有多个目标微区且目标微区上呈列阵排布有多个收集器时，所述步骤S5还包括在每个收集器完成收集后，依次调整空余的收集器的位置到下一个目标微区的上方进行收集，直至没有空余收集器。

本发明技术方案的有益效果主要体现在：

1、将激光显微切割与机械切片相结合，确保样品的形态从组织块到组织切片再到组织切片中的单细胞或细胞群（目标微区）的整个获取过程的一体化，较为精确地保留了目标细胞或细胞群的三维位置信息，更有利于实现特异性细胞的空间组织学分析，同时，相比传统的激光显微切割方法，无需进行额外的组织切片和贴片步骤，通过倾斜刀片切削并利用刀片作为组织切片的基底，并直接对刀片表面的组织切片进行激光扫描切割，不仅提高了切割效率，还能够实现非接触式切割，防止样品被污染。

2、利用聚焦激光对组织切片在切割过程中产生的反射式弹射力，结合带电收集器的非均匀电场下对目标微区产生的介电泳力，实现了对置于倾斜刀片表面的目标微区的非接触式快速收集，同时，当具有多个目标微区时，通过在目标微区上方设置纵横阵列或者蜂窝状排列的多个收集器依次对不同目标微区进行收集，进一步提高收集效率。

3、根据目标微区的不同直径采用不同的激光切割方式，对于不同尺寸的目标微区的收集具备更高的兼容性，对于直径较小的目标微区，通过与刀片的上表面垂直方向的聚焦光斑即可实现目标微区的切割和弹射，对于直径较大的目标微区，在原有的聚焦光斑的基础上再增加水平方向射出的聚焦光束以提高弹射力，便于大直径目标微区的收集。

4、通过调整振镜的扫描角度和扫描速度实现聚焦光斑在切片上的消融点位置和消融点间距的调控，同时，通过设置扫描速度确保相邻消融点的间隔小于消融点直径从而保证切割的连续性，确保目标微区的完整切割。

附图说明

图1是刀片上进行的组织切片的目标微区激光切割、收集装置的结构示意图；

图2是刀片上进行的组织切片的目标微区激光切割、收集方法的原理示意图；

图3是刀片上进行的组织切片的目标微区激光切割、收集方法的流程图；

图4是同步结合扫描角度和扫描速度对目标微区进行激光切割的原理示意图；

图5是对直径较大的目标微区的切割、收集方法的示意图；

图6是具备多个收集器的实施例中目标微区的收集方法的示意图。

具体实施方式

为使本发明的目的、优点和特点能够更加清楚、详细地展示，将通过下面优选实施例的非限制性说明进行图示和解释。该实施例仅是应用本发明技术方案的典型范例，凡采取等同替换或者等效变换而形成的技术方案，均落在本发明要求保护的范围之内。

同时声明，在方案的描述中，需要说明的是，术语 “上”、“下” “内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。

此外，本方案中的术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或者暗示对重要性的排序，或者隐含指明所示的技术特征的数量。因此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明中，“多个”的含义是两个或者两个以上，除非另有明确具体的限定。

本发明揭示了在刀片110上进行的组织切片的目标微区激光切割、收集装置，其中，需要先在样本组织块107上进行切片，然后在组织切片108上通过激光切割分割出目标微区109，目标微区109可以是小尺寸的目标微区109，如：单个的细胞，也可以是大尺寸的目标微区109，如：细胞群；

如图1、图2所示，该装置包括：

载体台，用于放置样本组织块107并控制其移动，在整个切割过程中，需确保样本组织块107始终固定在载体台上的操作位置上。

刀片110，通过夹具倾斜地设置在载体台的一侧，刀片110静止不动，并通过移动载体台使刀片110相对于载体台上的样本组织块107移动从而完成机械切片并获得组织切片108，切削完成后，组织切片108位于刀片110的上表面，且刀片110作为组织切片108的基底，刀片110的倾斜角度为φ，故而位于刀片110上表面的组织切片108的倾斜角度也为φ。

在一些实施例中，所述刀片110的材质可选用金刚石、玻璃刀、钢刀和碳化钨刀中的一种。

在一些实施例中，刀片110在夹具上的位置和角度可调整，在进行机械切片之前，先通过精准调节刀片110在夹具上的位置和角度，使得在载体台运动切削过程中实现对组织切片108的整体厚度的均匀性的控制，在一些实施例中，所述倾斜角度φ为30°-45°，刀片110的倾斜角度φ在该范围内，切片的整体厚度较为均匀。

激光切割系统，包括用于提供脉冲激光的激光器101、用于将激光器101发射的激光进行扩束的扩束镜、用于控制扩束后的激光的扫描角度和扫描速度的振镜104以及用于聚焦扫描后的激光光束的物镜106，在一实施例中，所述振镜104与物镜106之间还设置有用于将振镜104扫描后的光束反射到物镜106的反射镜105；其中，所述物镜106将扫描后的激光聚焦成达到切割阈值的光斑，并采用该光斑完成目标微区109的切割，通过调整振镜104的扫描角度θ并结合物镜106将扫描后的激光聚焦实现组织切片108和组织切片108上的目标微区109的切割以及目标微区109的弹起。

控制模块114，分别与载体台和激光切割系统信号连接，并同步控制机械切片和激光切割，其中，所述控制模块114至少与所述载体台、激光器101以及振镜104信号连接，在工作过程中，控制模块114实时调控载体台的移动位置，并同步触发激光切割系统内的激光器101的激光发射、振镜104的扫描角度以及扫描速度等，从而实现目标微区109的切割和捕获。

收集器111，位于组织切片108上的目标微区109的上方，用于在静电场作用下使弹起的目标微区109发生极化，从而在介电泳力的作用下将目标微区109自收集器111的底部吸附至收集器111中。

在一些实施例中，还设置有静电发生器113，所述静电发生器113与收集器111之间连接有静电发生头112，其中，静电发生器113用于产生静电，静电发生头112用于对收集器111均匀施加静电，从而确保收集器111带有静电，并在静电场作用下使弹起的目标微区109发生极化，从而在介电泳力作用下被吸附收集；其中，还可以通过实验测得收集器111和静电发生头112的最佳距离，并通过固定装置将收集器111和静电发生头112调节至最佳距离，以便使收集器111存储更多的静电量，从而产生更大的电场强度，提高收集效率和收集稳定性，在一些实施例中，所述收集器111可选用介电常数较大的材料制成，从而便于存储更多静电量，产生更强的电场，使得目标微区109极化强度更大，介电泳吸附力更强。

其中，在完成机械切片后，位于组织切片108底部的刀片110可作为承载组织切片108的载玻片，为保证激光切割的质量，所述组织切片108需要与所述刀片110的上表面保持良好的贴合状态，实施激光扫描切割的区域设置在刀片上表面位于刀片前端刀尖处至距离刀尖10μm之间的区域，由于刀片前端的刀尖处最先接触并切割样本组织块107，且刀片是倾斜设置的，在完成切割后，刀片与其前端刀尖处越接近的位置与组织切片108底部的贴合度也越好，因此，将刀片前端刀尖至距离刀尖10μm之间的区域作为实施激光扫描切割的区域可以更好地保证激光切割的质量。

在一些实施例中，所述激光器101选用紫外脉冲激光器101，紫外脉冲激光器101的波长较短，便于产生更小的聚焦光斑，在脉冲能量不变的情况下，能够达到更高的能量密度，同时可提高激光切割的精密度。

在另一些实施例中，所述激光器101还可选用皮秒脉冲激光器101，皮秒脉冲相比于纳秒脉冲，存在非线性吸收，在更小的脉冲能量下能够在短距离内产生较强的冲击波压力，从而在实现切割的同时，产生的冲击波足以使目标微区109在被激光分割的最后一点的位置发生边缘弹射，进而帮助后续目标微区109的收集。

所述扩束镜设置于所述激光器101和振镜104之间，包括靠近所述激光器101的第一透镜102以及靠近所述振镜104的第二透镜103，在一些实施例中，第一透镜102、第二透镜103可采用高纯度熔融石英材料制成，并镀有紫外增透膜，以保证高透射率，减少能量损失，所述扩束镜的扩束倍数可根据需要实时调整，在此不做赘述。

所述物镜106位于刀片110的斜上方，在一优选实施例中，物镜106发射出的聚焦后的光斑的光轴与刀片110的上表面垂直，确保激光切割的精确性。

所述目标微区109上可排列有多个收集器111，从而提高收集效率和通量，在一些实施例中，所述目标微区109的上方通过纵横阵列排列有多个收集器111，纵横列的收集器111排布数量，例如：M×N（1≤M≤10，1≤N≤10，M、N均为正整数），在收集过程中，可通过激光切割预先在切片上连续切割一组目标微区109，然后同步开启一组目标微区109上方的多个收集器111进行收集，在收集完毕后，再调整下一组收集器111的位置，并进行下一组目标微区109的切割和收集；在另一些实施例中，所述目标微区109的上方还可呈蜂窝状地排列有多个收集器111。

在一些实施例中，还可设置与在刀片110上进行的组织切片的目标微区激光切割、收集装置耦合的多种成像模块，该成像模块用于样本组织块107表面的成像以及对目标微区109的切割位置进行定位，在载体台带动样本组织块107移动至刀片110底部之前，先移动至成像模块进行成像，并选定待切割目标微区109，记录位置信息，便于后续同步进行机械切削和激光切割。

如图3所示，刀片110上进行的组织切片108的目标微区109激光切割、收集方法，包括以下步骤：

S1、将样本组织块107放置在载体台上的操作位置，并对样本组织块107进行成像，选定待切割的目标微区109，并存储样本组织块107的组织切片108位置以及所有目标微区109的目标位置信息。

S2、收集器111连接静电发生器113，并调整收集器111的位置，确保收集器111位于目标微区109的上方。

S3、激光器101提供脉冲激光，该脉冲激光经过扩束镜扩束和振镜104扫描后通过物镜106聚焦成能量达到所设定的切割阈值的光斑，并等待触发信号出光。

S4、控制模块114信号控制载体台带动样本组织块107水平移动，确保刀片110与样本组织块107相对移动实现机械切片，当移动到步骤S1中所存储的组织切片108位置时，控制模块114发送信号至振镜104和脉冲激光，通过调整振镜104的扫描角度θ和扫描速度v，对目标微区109上的一系列目标位置点逐一进行扫描消融，当一个闭合曲线最后一点被消融时，同步产生的冲击波压力在刀面反射使目标微区109弹起。

在一些实施例中，步骤S4中，振镜104采用单轴振镜104横向扫描方式，通过调整振镜104的扫描角度θ控制脉冲激光的消融点位置，通过设定扫描时间控制扫描速度，进而调整脉冲激光在进刀的方向的切削速度v，确保相邻消融点的间隔小于消融点直径。

如图4所示，以样本组织块107的左上角作为坐标原点o建立坐标系，在切片之前对其表面成像，存储目标微区109位置信息，之后，样本组织块107被刀片110切削为组织切片108，并随刀片110产生倾斜角度φ，此时以组织切片108的左上角作为坐标系原点O’，并在组织切片108上对目标微区109进行激光切割，为降低对目标位置信息变换的复杂性，采用单轴振镜104横向扫描的方式，仅需设定沿x方向的扫描角度，如图4所示，针对x方向上同一高度的两个消融点，进行横向扫描，从消融点1扫到2，再从消融点3扫到4，进而精准确定目标微区109上用于切割的各消融点的目标位置，对于y方向，也即进刀方向，通过控制扫描时间确定振镜104的扫描速度，进而精确控制切削速度v，以保证不同高度的相邻两个消融点（如消融点1和消融点3）之间的间隔Δn小于消融点的直径，避免相邻消融点之间存在不被切断的部分，从而实现切割连续性，确保目标微区109的完整分离；另外，考虑到组织切片108和刀片110表面的贴合区域极小，这种横向扫描配合机械切削的方式，既能实现精准同步，又能使得用于消融的激光束始终位于目标微区109的焦面，保证了切割质量。

S5、开启收集器111，在收集器111产生的非均匀电场中发生极化，使目标微区109在介电泳力作用下被吸附至所述收集器111中。

其中，当所述目标微区109直径小于100μm时，此时目标微区109的直径较小，面积重力也较小，通过与所述刀片110的上表面垂直方向的聚焦光斑即可实现目标微区109的切割和弹射；

如图5所示，当所述目标微区109直径大于100μm时，由于此时目标微区109的直径较大，目标微区109的面积和重力也随之增加，此时，聚焦激光束在目标微区109边缘产生的冲击波不足以使目标微区109发生弹射，也无法到达上方收集器111所产生的静电场范围内，因此，垂直方向的聚焦光斑无法实现目标微区109的切割和弹射，为确保目标微区109顺利收集，增加沿水平方向射出的用于增大施加给所述目标微区109的弹射力的水平聚焦光束以提高弹射力，与组织相互作用时产生的与光束垂直方向的冲击波压力用于将直径较大的目标微区109抬高，此时，由于目标微区109面积较大，水平激光束116对目标微区109沿水平方向的局部损伤可以忽略。

如图6所示，当具有多个目标微区109且目标微区109上呈列阵排布有多个收集器111时，所述步骤S5还包括在每个收集器111完成收集后，依次调整空余的收集器111的位置到下一个目标微区109的上方进行收集，直至没有空余收集器111，其中，在激光切割一排目标微区109后，同一排收集器111依次收集对应的目标微区109（如图6所示，依次收集109a、109b、109c等），并在收集过程中逐步调整移动收集器111的位置；同排目标微区109收集完毕后，再进行下一排目标微区109的切割和收集，再进行下一排目标微区109的收集前，将对应的一排收集器111移动至待收集的目标微区109的上方；图6中采用标准的八连管收集器117，以便配合离心机通用，便于后续进行RNA、蛋白质测序。

本发明尚有多种实施方式，凡采用等同变换或者等效变换而形成的所有技术方案，均落在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.在刀片上进行的组织切片的目标微区激光切割、收集装置，其特征在于：包括：

载体台，用于放置样本组织块并控制其移动；

刀片，通过夹具倾斜地设置在载体台的一侧，刀片的倾斜角度为φ，刀片静止不动，并通过移动载体台使刀片相对于载体台上的样本组织块移动从而完成机械切片并获得组织切片，切削完成后，组织切片位于刀片的上表面，且刀片作为组织切片的基底；

激光切割系统，包括用于提供脉冲激光的激光器、用于将激光器发射的激光进行扩束的扩束镜、用于控制扩束后的激光的扫描角度和扫描速度的振镜以及用于聚焦扫描后的激光光束的物镜，通过调整振镜的扫描角度θ并结合物镜将扫描后的激光聚焦实现组织切片和组织切片上的目标微区的切割以及目标微区的弹起；

控制模块，分别与载体台和激光切割系统信号连接，并同步控制机械切片和激光切割；

收集器，位于组织切片上的目标微区的上方，用于在静电场作用下使弹起的目标微区发生极化，从而在介电泳力的作用下将目标微区吸附至收集器中。

2.根据权利要求1所述的在刀片上进行的组织切片的目标微区激光切割、收集装置，其特征在于：还包括静电发生器，所述静电发生器与收集器之间连接有静电发生头，并对收集器均匀施加静电。

3.根据权利要求1所述的在刀片上进行的组织切片的目标微区激光切割、收集装置，其特征在于：实施激光扫描切割的区域设置在刀片上表面位于刀片前端刀尖处至距离刀尖10μm之间的区域。

4.根据权利要求1所述的在刀片上进行的组织切片的目标微区激光切割、收集装置，其特征在于：所述扩束镜设置于所述激光器和振镜之间，包括靠近所述激光器的第一透镜以及靠近所述振镜的第二透镜。

5.根据权利要求1所述的在刀片上进行的组织切片的目标微区激光切割、收集装置，其特征在于：所述物镜位于刀片的斜上方，且物镜发射出的聚焦后的光斑的光轴与刀片的上表面垂直。

6.根据权利要求1所述的在刀片上进行的组织切片的目标微区激光切割、收集装置，其特征在于：所述目标微区的上方通过纵横阵列或者蜂窝状排列有多个收集器。

7.刀片上进行的组织切片的目标微区激光切割、收集方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1、将样本组织块放置在载体台上的操作位置，并对样本组织块进行成像，选定待切割的目标微区，并存储样本组织块的组织切片位置以及所有目标微区的目标位置信息；

S2、收集器连接静电发生器，并调整收集器的位置，确保收集器位于目标微区的上方；

S3、激光器提供脉冲激光，该脉冲激光经过扩束镜扩束和振镜扫描后通过物镜聚焦成能量达到所设定的切割阈值的光斑，并等待触发信号出光；

S4、控制模块信号控制载体台带动样本组织块水平移动，确保刀片与样本组织块相对移动实现机械切片，当移动到步骤S1中所存储的组织切片位置时，控制模块发送信号至振镜和脉冲激光，通过调整振镜的扫描角度θ和扫描速度v，对目标微区上的一系列目标位置点逐一进行扫描消融，当一个闭合曲线最后一点被消融时，同步产生的冲击波压力在刀面反射使目标微区弹起；

S5、开启收集器，在收集器产生的非均匀电场中发生极化，使目标微区在介电泳力作用下被吸附至所述收集器中。

8.根据权利要求7所述的刀片上进行的组织切片的目标微区激光切割、收集方法，其特征在于：步骤S4中，振镜采用单轴振镜横向扫描方式，通过设定扫描时间控制扫描速度，进而调整脉冲激光在进刀的方向的切削速度v，确保相邻消融点的间隔小于消融点直径。

9.根据权利要求7所述的刀片上进行的组织切片的目标微区激光切割、收集方法，其特征在于：

当所述目标微区直径小于100μm时，通过与所述刀片的上表面垂直方向的聚焦光斑实现目标微区的切割和弹射；

当所述目标微区直径大于100μm时，增加沿水平方向射出的用于增大施加给所述目标微区的弹射力的水平聚焦光束。

10.根据权利要求7-9任一所述的刀片上进行的组织切片的目标微区激光切割、收集方法，其特征在于：当具有多个目标微区且目标微区上呈列阵排布有多个收集器时，所述步骤S5还包括在每个收集器完成收集后，依次调整空余的收集器的位置到下一个目标微区的上方进行收集，直至没有空余收集器。