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CN120204168A - 包裹特定miRNA的脂质纳米粒及其在神经损伤治疗药物中的应用 - Google Patents

包裹特定miRNA的脂质纳米粒及其在神经损伤治疗药物中的应用 Download PDF

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CN120204168A
CN120204168A CN202510381566.1A CN202510381566A CN120204168A CN 120204168 A CN120204168 A CN 120204168A CN 202510381566 A CN202510381566 A CN 202510381566A CN 120204168 A CN120204168 A CN 120204168A
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lnp
mimics
solution
lipid
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CN202510381566.1A
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王广
沈瑶
杨雪松
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Jinan University
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Abstract

本发明涉及一种包裹特定miRNA的脂质纳米粒及其在神经损伤治疗药物中的应用，属于生物医药技术领域。本发明直接利用外泌体中的有效成分miRNA的分子模拟物miRNA mimics，提供了一种脂质纳米粒递送特定miRNA体系用于治疗神经损伤，不仅克服了直接利用外泌体治疗的异质性问题，还解决了外泌体产出率低、大规模生产纯化困难等问题，通过LNP递送方式实现LNP‑miRNA‑mimics在神经损伤治疗中的应用，实现了单纯成分治疗策略，进一步开发LNP治疗神经损伤的应用价值。相较于直接将脐带间充质干细胞外泌体应用于治疗神经损伤，LNP‑miRNA‑mimics治疗体系更加均一，重复性好，是良好的递送治疗方案。

Description

包裹特定miRNA的脂质纳米粒及其在神经损伤治疗药物中的 应用
技术领域
本发明涉及一种包裹特定miRNA的脂质纳米粒及其在神经损伤治疗药物中的应用，属于生物医药技术领域。
背景技术
神经再生修复是损伤后恢复功能的关键领域，尤其在脊髓损伤(spinal cordinjury，SCI)中，其研究具有重要意义。SCI是一种严重的中枢神经系统(central nervoussystem，CNS)损伤，通常导致损伤水平以下的运动、感觉或自主功能丧失。据2024年WHO报道目前全球有超过1500万人患有SCI，发病率和死亡率逐年上升。有效的预防、治疗、康复和持续的医疗保健对于减轻全球SCI负担至关重要。与周围神经系统(peripheral nervoussystem，PNS)的神经损伤不同，PNS在发生沃勒氏变性后，断裂的轴突可能会重新长入远端神经鞘，并重新支配周围靶点。而成人CNS的可塑性低，神经元再生有限，损伤后的再生极其薄弱。经多年的研究，目前认为创伤性SCI可通过长距离轴突再生，构建新的局部中继神经回路(通过使用外源性神经干细胞/祖细胞(NSC)或使用内源性NSC来实现)。但各种策略的复杂性导致其临床可实施性极低，因此开发安全有效的临床治疗方法促进神经可塑性、神经发生和重建受损神经回路的治疗策略对于改善SCI后的神经愈合都是必要的。
近年来，神经损伤再生修复的研究逐渐聚焦于多个方面，包括促进神经细胞再生、修复损伤区域的神经连接以及重建神经功能。生物材料的应用、细胞治疗和基因编辑技术等前沿手段为神经再生治疗提供了新的可能。在神经系统中各种转录因子、DNA甲基化和染色质结构的表观遗传修饰因子以及微小RNA(miRNA)的活性与促再生转录程序的激活有关。miRNA的表达依赖于组织和环境。特定的miRNA在神经发育中起着关键作用，并按照这些作用相对应的时间和空间以特定方式表达。在神经损伤的代表性疾病SCI中，创伤发生后，几个看似独立的生物过程(例如轴突变性/再生、炎症、细胞死亡、髓鞘损失)相互交织，在这种情况下，miRNA就像一个完美协调的网络，每个miRNA可以作用于不同的mRNA，并且一个分子也可以被多个miRNA靶向，因此miRNA作为内部调控系统，可以精确控制不同的神经过程，协调它们的作用以调控复杂的基因表达网络。因此SCI后找寻特定的miRNA分子在体调控，可以促进轴突再生的功能整合，以改善SCI后的神经愈合。间充质干细胞外泌体已被证明在SCI后神经修复治疗中发挥积极作用，而外泌体是稳定的miRNA来源，那么外泌体中是否具有通用型功能性治疗的核酸分子值得进一步研究，能达到治疗效用可进一步开发应用。
miRNA、mRNA、质粒DNA等核酸药物为基因治疗提供了治疗潜力。然而，裸露的核酸药物在循环中不稳定、易降解，RNA、DNA等生物材料所带的负电荷限制了它们穿过同样带负电荷的细胞膜，基于此在SCI中应用安全有效的递送载体传递治疗性miRNA分子是必要的。脂质纳米粒(LNP)是一种非凡的载体，自新冠病毒感染mRNA疫苗的获批，LNP加速了mRNA在人体中的应用，与其他载体相比，LNP具有包封率高、结构稳定、制备简单等优势。可电离的脂质分子被设计为LNP的主要成分，LNP在特定pH下通过相转化释放其核酸内容物以发挥调控治疗作用。目前FDA仅批准了三种用于RNA递送的可电离阳离子脂质。SM-102和ALC-0315是首批投入临床领域递送mRNA的单胺脂质。关于LNP的治疗应用主要集中于mRNA的递送疫苗开发及肿瘤治疗研究中，利用LNP的递送性质传递miRNA治疗分子，在神经损伤再生修复治疗研究中值得被探索。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种包裹特定miRNA的脂质纳米粒及其在神经损伤治疗药物中的应用，以神经损伤模型--SCI为例验证其疗效。脐带间充质干细胞外泌体促进神经损伤修复已被证明具有积极作用，因此本发明的首要目的在于利用外泌体中的积极有效治疗成分—miRNA，以LNP为递送载体，以LNP-miRNA-mimics形式治疗神经损伤，提供治疗神经损伤的新方法。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种包裹特定miRNA的脂质纳米粒，所述特定miRNA为miRNA的分子模拟物，即miRNAmimics，包括has-miR939-5p mimics、has-miR665 mimics、has-miR185-3p mimics。
优选的，所述has-miR939-5p mimics正义链的核酸序列如SEQ ID NO.1所示，反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述has-miR665 mimics正义链的核酸序列如SEQ IDNO.3所示，反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述has-miR185-3p mimics正义链的核酸序列如SEQ ID NO.5所示，反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
优选的，所述脂质纳米粒的脂质成分包括：ALC-0315、DSPC、胆固醇、ALC-0159。
进一步优选的，所述ALC-0315、DSPC、胆固醇、ALC-0159的摩尔比为46.3：9.4：42.7：1.6。
本发明中，所述的包裹特定miRNA的脂质纳米粒LNP-miRNA-mimics的粒径范围为50～125nm，分散性指数(PDI)小于0.2，Zeta电位范围为-15～+15mV。
上述包裹特定miRNA的脂质纳米粒的制备方法，包括如下步骤：
1)将ALC-0315、DSPC、胆固醇、ALC-0159以乙醇为溶剂分别配制为脂质储备液，按比例混合后配置为复方-乙醇溶液；
2)利用柠檬酸钠缓冲液将miRNAmimics稀释至工作浓度，得到水相溶液；
3)将复方-乙醇溶液和水相溶液混合，自主形成LNP-miRNA-mimics复合物，并利用PBS缓冲液稀释；
4)通过超滤将LNP-miRNA-mimics复合物利用PBS缓冲液置换，使乙醇含量降至0.5％以下，然后浓缩；
5)向浓缩后的LNP-miRNA-mimics复合物中添加蔗糖作为冷冻保护剂，经0.22μm过滤后得到包裹特定miRNA的脂质纳米粒，即LNP-miRNA-mimics。
优选的，步骤1)中所述的脂质储备液浓度为5～12.5mg/mL。
进一步优选的，步骤1)中所述的脂质储备液浓度为10mg/mL。
优选的，步骤2)中所述的水相溶液中has-miR939-5p mimics、has-miR665mimics、has-miR185-3p mimics的质量比为1:1:1，水相溶液中总miRNAmimics的工作浓度以步骤3)所述的LNP-miRNA-mimics复合物中包含0.4～1mg/mL的LNP-miRNA-mimics计算配制。
进一步优选的，水相溶液中总miRNAmimics的工作浓度以步骤3)所述的LNP-miRNA-mimics复合物中包含0.5mg/mL的LNP-miRNA-mimics计算配制。
优选的，步骤3)中所述的PBS缓冲液稀释为加入LNP-miRNA-mimics复合物2～3倍体积的PBS缓冲液进行稀释，以保持LNP-miRNA-mimics复合物稳定性，否则高浓度的乙醇会造成脂质纳米粒融合；所述的PBS缓冲液的pH为6.9～7.9。
优选的，步骤4)中所述的超滤为使用100kDa超滤离心管3000～4000×g离心10～15min；所述的PBS缓冲液的pH为6.9～7.9。
优选的，步骤5)中所述的蔗糖浓度为最终溶液中含8％～10％蔗糖，轻轻混匀后保存。
进一步优选的，步骤5)中所述的蔗糖浓度为最终溶液中含10％蔗糖。
上述包裹特定miRNA的脂质纳米粒在制备神经损伤治疗药物中的应用。
优选的，所述包裹特定miRNA的脂质纳米粒能够促进神经损伤再生修复；
进一步优选的，所述包裹特定miRNA的脂质纳米粒能够促进脊髓损伤后的行为恢复、肌肉恢复及损伤部位的神经元恢复。
有益效果：
(1)间充质干细胞外泌体已被证明在治疗神经性损伤中发挥积极作用，本发明在前期研究中发现间充质干细胞外泌体中的特定miRNA可以作为神经损伤的有效治疗成分，所述的miRNA包括has-miR939-5p、has-miR665、has-miR185-3p。基于此，本发明直接利用外泌体中的有效成分miRNA的分子模拟物(miRNAmimics)，提供了一种脂质纳米粒递送特定miRNA体系(LNP-miRNA-mimics)用于治疗神经损伤，不仅克服了直接利用外泌体治疗的异质性问题，还解决了外泌体产出率低、大规模生产纯化困难等问题，通过LNP递送方式实现LNP-miRNA-mimics在神经损伤治疗中的应用，实现了单纯成分治疗策略，进一步开发LNP治疗神经损伤的应用价值。
(2)本发明采用可电离脂质ALC-0315、辅助脂质DSPC、结构脂质胆固醇和聚乙二醇脂质ALC-0159为载体制备了LNP-miRNA-mimics治疗体系，miRNA mimics是来源于脐带间充质干细胞外泌体中的miRNA的分子模拟物，其中包含has-miR939-5p mimics、has-miR665mimics、has-miR185-3p mimics三类mimics。相较于直接将脐带间充质干细胞外泌体应用于治疗神经损伤，LNP-miRNA-mimics治疗体系更加均一，重复性好，是良好的递送治疗方案。
附图说明
图1为装载特定miRNA的脂质纳米粒成分示意图。
图2为装载特定miRNA的脂质纳米粒的特性检测分析图；其中A为LNP-NC的粒径分布图；A1为LNP-NC的Zeta电位峰值图；B为LNP-miRNA-mimics的粒径分布图；B1为LNP-miRNA-mimics的Zeta电位峰值图。
图3为装载特定miRNA的脂质纳米粒对神经元细胞的调控作用分析图；其中A为神经元细胞中的has-miR185-3p表达量柱形图；A1为神经元细胞中的has-miR665表达量柱形图；A2为神经元细胞中的has-miR939-5p表达量柱形图；B为神经元细胞中神经元标志物Tuj1的表达量柱形图；B1为神经元细胞中生长相关蛋白(GAP43)的表达量柱形图；C为神经元细胞抗氧化标志物NQO1的表达量柱形图；C1为神经元细胞抗氧化标志物SOD1的表达量柱形图；C2为神经元细胞抗氧化标志物HO1的表达量柱形图。
图4为装载特定miRNA的脂质纳米粒在小鼠脊髓中的在体表达时间分析图；其中A为注射LNP体系的活体荧光成像图；A1为LNP体系在体表达的荧光强度随时间变化折线图；B为LNP体系治疗21天过程中小鼠的体重变化折线图。
图5为装载特定miRNA的脂质纳米粒促进脊髓损伤小鼠的后肢行为恢复结果图；其中A为SCI小鼠足迹动态图；B为SCI小鼠的后肢步长随时间变化折线图；C为SCI小鼠的BMS评分随时间变化折线图；其中*/**/***表示各处理组与Sham(假手术)组相比存在显著性差异，#/##表示LNP-miRNA-mimics组与LNP-NC组(阴性对照组)相比存在显著性差异。
图6为装载特定miRNA的脂质纳米粒促进脊髓损伤小鼠恢复的脊髓原位神经元及星形胶质细胞表达结果图；其中A为脊髓损伤部位神经元Tuj1(绿色)及星形胶质细胞GFAP(红色)的表达情况；A1为GFAP的荧光强度统计；A2为Tuj1的荧光强度统计。
图7为装载特定miRNA的脂质纳米粒促进脊髓损伤小鼠双后肢肌肉及神经-肌接头恢复结果图；其中A为后肢肌束横截面laminin(绿色)染色；A1为后肢肌束横截面积统计；B为后肢肌肉神经-肌接头染色结果图，其中SV2/NF(绿色)显示支配肌肉的神经情况，α-Bungarotoxin(红色)染色显示神经肌肉接头处的烟碱乙酰胆碱受体；B1为双后肢胫骨前肌烟碱乙酰胆碱受体面积统计。
具体实施方式
下面通过具体实施方式及附图来进一步说明本发明技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
以下实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂厂商购买得到的。
下述实施例中所述的材料中：小鼠的品种为C57BL/6J小鼠。
实施例1
装载特定miRNA的脂质纳米粒(LNP体系)的制备(关键成分如图1所示)
(1)利用FDA批准的ALC-0315载体制备脂质纳米粒(LNP)，将可电离脂质ALC-0315(赛诺邦格)、辅助脂质DSPC(赛诺邦格)、结构脂质胆固醇(赛诺邦格)、聚乙二醇脂质ALC-0159(艾伟拓)以乙醇为溶剂分别配制成10mg/mL的脂质储备液，然后按照摩尔比为ALC-0315：DSPC：胆固醇：ALC-0159＝46.3：9.4：42.7：1.6将脂质储备液混合，配置为复方-乙醇溶液。
(2)利用酸性RNase-free柠檬酸钠缓冲液(源叶生物)将miRNAmimics(金斯瑞)稀释至工作浓度，所述miRNAmimics包括has-miR185-3p mimics、has-miR665 mimics、has-miR939-5p mimics(按照LNP-miRNA-mimics复合物中包含0.5mg/mL的LNP-miRNA-mimics计算miRNAmimics投入质量，其中miRNA mimics水溶液按照has-miR185-3p mimics、has-miR665 mimics、has-miR939-5p mimics质量比1:1:1投入，三个miRNA-mimics反义链5’端均使用cy5荧光基团进行修饰)，得到水相溶液；
上述miRNA mimics序列如下：
has-miR939-5p mimics：
正义链(5'-3')：UGGGGAGCUGAGGCUCUGGGGGUG(SEQ ID NO.1)
反义链(5'-3')：Cy5-CCCCCAGAGCCUCAGCUCCCCAUU(SEQ ID NO.2)
has-miR665 mimics：
正义链(5'-3')：ACCAGGAGGCUGAGGCCCCU(SEQ ID NO.3)
反义链(5'-3')：Cy5-GGGCCUCAGCCUCCUGGUUU(SEQ ID NO.4)
has-miR185-3p mimics：
正义链(5'-3')：AGGGGCUGGCUUUCCUCUGGUC(SEQ ID NO.5)
反义链(5'-3')：Cy5-CCAGAGGAAAGCCAGCCCCUUU(SEQ ID NO.6)
(3)将微流控芯片装入纳米药物制造仪(MingTai，Microflow S)，将复方-乙醇溶液和水相溶液按1:3的体积比装入一次性灭菌注射器中，排空空气后装入纳米药物制造仪。通过纳米药物制造仪令复方-乙醇溶液中的脂质与水相溶液中的miRNA mimics自主形成LNP-miRNA-mimics复合物(LNP-miRNA-mimics+乙醇+柠檬酸钠缓冲液体系)，并加入3倍体积的无菌PBS缓冲液(pH7.4，Thermo Fisher)稀释，以保持LNP-miRNA-mimics复合物稳定性。
(4)经100kDa超滤离心管(MERCK MILLIPORE)4000×g离心10min，离心后补加PBS缓冲液至原体积，重复超滤至乙醇含量降至0.5％以下。
(5)将LNP-miRNA-mimics复合物浓缩后加入含有蔗糖(艾维拓)的PBS缓冲液，蔗糖的添加终浓度为10％，作为冷冻保护剂，经0.22μm过滤器过滤，即获得装载特定miRNA的脂质纳米粒(LNP-miRNA-mimics)。
(6)阴性对照组脂质纳米粒(LNP-NC)以相同的方式包裹阴性对照序列(反义链5’端使用cy5荧光基团进行修饰)所得。
上述阴性对照序列如下：
正义链(5'-3')：UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT(SEQ ID NO.7)
反义链(5'-3')：Cy5-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT(SEQ ID NO.8)
上述脂质纳米粒的包封委托南京金斯瑞生物科技有限公司完成，所得每组脂质纳米粒溶液的LNP-miRNA-mimics或LNP-NC的浓度均为0.5mg/mL，于-80℃低温保存，避免反复冻融。
实施例2
装载特定miRNA的脂质纳米粒的特性检测
取3μL实施例1制备得到的LNP体系，加入1mL的RNase-free水稀释混匀后，利用动态光散射法检测脂质纳米粒粒径分布并计算其多分散指数(PDI)，利用激光多普勒电泳检测其Zeta电位，通过pH试纸检测pH范围，通过核酸绿试剂法(Quant-iT RiboGreen RNA试剂盒)对LNP的最终有效荷载miRNA浓度定量并计算封装效率，封装效率＝检测浓度荷载质量/投入质量×100％。检测结果如图2所示，A-A1显示了LNP-NC的纳米粒径及Zeta电位峰值图，A显示平均粒径大小为70.62nm，A1显示Zeta电位为-2.7470mV；表1为LNP-NC基本性质检测结果，其中，pH为7.4±0.5，动态光散射的分散指数(PDI)为0.08；B图为LNP-miRNA-mimics的检测结果；B-B1显示了LNP-miRNA-mimics的纳米粒径及Zeta电位峰值图，平均粒径大小为70.70nm，Zeta电位为-3.1910mV；表2为LNP-miRNA-mimics基本性质检测结果，其中，pH为7.4±0.5，动态光散射的分散指数(PDI)为0.07，符合LNP体系要求的基本物理化学参数。
表1.LNP-NC基本性质检测结果
表2.LNP-miRNA-mimics基本性质检测结果
实施例3
装载特定miRNA的脂质纳米粒对神经细胞的调控作用分析
采用神经损伤的通用细胞模型--小鼠神经元细胞模型检测LNP-miRNA-mimics转染后对神经元细胞的调控作用。
(1)体外神经元细胞模型构建：取出生24h内的C57BL/6J乳鼠脑部，剥离其海马区，并将获得的海马区脑膜及血管剥离干净，利用灭菌眼科剪使其完全破碎至无肉眼明显可见组织块，转移至25cm2细胞培养瓶中，添加3mL神经元细胞培养基(Gbico，2186946)于37℃、5％CO2条件下培养7～10天得神经元细胞培养物进行后续实验。
(2)将2μL实施例1制备的LNP体系加入到2mL步骤(1)制得的神经元细胞培养物中，使LNP-NC或LNP-miRNA-mimics在神经元细胞培养物中的终浓度为500ng/mL，培养48h。
(3)培养结束后分别收取转染后细胞提取总RNA，利用qPCR检测miRNA是否转染成功及细胞分化、氧化应激等标志物的表达。
结果如图3所示，A～A2显示了LNP-miRNA-mimics转染成功使神经元细胞中的has-miR185-3p(A)、has-miR665(A1)、has-miR939-5p(A2)同时高表达；B～B1显示了LNP-miRNA-mimics转染能够促进神经元细胞中的神经元特异性III类β-微管蛋白(Tuj1)及生长相关蛋白(GAP43)的表达量；C～C2表明LNP-miRNA-mimics转染后，神经元细胞中的抗氧化标志物NQO1(NAD(P)H醌脱氢酶1)、SOD1(超氧化物歧化酶1)的表达量增高；表明LNP-miRNA-mimics能够促进神经元的分化再生能力和氧化应激防御功能。
实施例4
装载特定miRNA的脂质纳米粒在小鼠脊髓中的在体表达时间分析
(1)随机选取18只小鼠，平均分为三组处理，即LNP-NC组、LNP-miRNA-mimics组、Sham组(假手术组，即仅实施椎板去除术，不造成脊髓压迫后缝合)。
(2)脊髓损伤小鼠模型构建：构建可重复的压迫性(脊髓受压)小鼠SCI模型，探究LNP体系在脊髓损伤小鼠组织原位的在体表达时间。暴露小鼠T10部位脊柱后，利用一对细尖的Dumont#5镊子及Vana剪刀小心切除椎板，确保没有切除或挤压脊髓；暴露相应位置的脊髓后，将校准的Dumont#5镊子放置在暴露脊髓的中间段，尖端接触底部，闭合镊子直至垫片连接，保持原位压迫15s造成脊髓压迫损伤，损伤后立即在损伤部位使用注射器局部注射10μL实施例1制备的cy5标记的LNP-NC溶液或LNP-miRNA-mimics溶液(溶液中脂质纳米粒LNP-NC或LNP-miRNA-mimics的浓度均为0.5mg/mL)；取出镊子小心缝合内部肌肉层，注意不要挤压脊髓，然后再二次缝合表面皮肤。
(3)在进行干预的第24小时、48小时、7天、14天分别使用全光谱动物活体成像系统对LNP-NC、LNP-miRNA-mimics两组进行LNP体系在体表达时间检测并记录动物体重变化。
结果如图4所示，其中A-A1为cy5标记的LNP体系在各组小鼠体内的持续表达情况，在给予处理后的24至48小时内荧光强度显示LNP体系在体高表达，随后荧光强度逐渐减弱，到第14天时基本检测不到在体荧光表达；如A1所示，LNP体系在体表达的荧光强度随时间逐渐减弱；同时B的结果显示，LNP-miRNA-mimics组的SCI小鼠体重从第7天开始具有回升趋势，并且到第21天时LNP-miRNA-mimics组小鼠体重恢复至Sham组水平(与Sham组小鼠相比，p＝0.9944无统计学差异)。
实施例5
装载特定miRNA的脂质纳米粒促进脊髓损伤小鼠的后肢行为恢复
脊髓损伤(SCI)在病理上包括三个阶段：急性期(＜48h)、亚急性期(48h～14d)、慢性期(＞6m)；各种原因所导致的脊髓受压或横断，将引发快速的继发性损伤级联反应，比如出血、炎症等，神经元细胞和胶质细胞被破坏，脉管系统被破坏并损害血脊髓屏障，从而造成严重的后果。本实验构建了可重复的压迫性(脊髓受压)小鼠SCI模型，探究LNP-miRNA-mimics在促进脊髓损伤小鼠后肢行为恢复中的作用，具体步骤如下：
(1)随机选取18只小鼠，平均分为三组，即Sham组、LNP-NC组、LNP-miRNA-mimics组；其中，Sham组为假手术组，即仅实施椎板去除术，不造成脊髓压迫后缝合。
(2)按照实施例4步骤(2)构建脊髓损伤小鼠模型，其中，LNP-NC组为在脊髓损伤急性期在病灶内对小鼠注射10μL实施例1制备的LNP-NC溶液；LNP-miRNA-mimics组为在脊髓损伤急性期在病灶内对小鼠注射10μL实施例1制备的LNP-miRNA-mimics溶液。
(3)在进行干预的第1、7、14、21天分别对上述三组小鼠进行BMS评分及利用足迹分析对小鼠后肢步长进行分析。
结果如图5所示，其中A、B为各组小鼠的后肢步长恢复情况，随着恢复时间的增加，LNP-miRNA-mimics组中的SCI小鼠后肢步长具有明显改善，具体的，相比于LNP-NC组，LNP-miRNA-mimics组的SCI小鼠从第7天开始，后肢运动功能开始恢复，且步长从第7天起持续至第21天均优于LNP-NC组SCI小鼠。具体的，第7天时，LNP-miRNA-mimics组小鼠的步长与LNP-NC组相比，##p＝0.0062，具有统计学差异，第14天时，#p＝0.0135，第21天时，##p＝0.0079，持续具有统计学差异。并且第14天时，LNP-miRNA-mimics组小鼠的步长与Sham组相比，p＝0.2166，已无统计学差异，说明LNP-miRNA-mimics组SCI小鼠后肢步长相较于Sham组已无明显差异。
同时由图5中的C可得，BMS评分显示LNP-miRNA-mimics组中的SCI小鼠运动评分从第7天起均明显高于LNP-NC组，具体的，在第14天时，LNP-miRNA-mimics组与LNP-NC组相比，#p＝0.0134，具有统计学差异，这说明在第14天LNP-miRNA-mimics组中的SCI小鼠后肢运动功能已优于LNP-NC组的SCI小鼠，且差异持续至第21天。第21天时，LNP-miRNA-mimics组与LNP-NC组相比，##p＝0.0062，具有明显统计学差异；
上述结果表明，在小鼠脊髓损伤急性期及时施用LNP-miRNA-mimics进行治疗，能够有效促进脊髓损伤小鼠后肢运动功能的恢复和后肢步长的改善。
实施例6
装载特定miRNA的脂质纳米粒促进脊髓损伤小鼠的损伤后损伤部位神经元恢复
取实施例5处理后第21天的小鼠的脊髓进行冰冻包埋后切片，切片厚度为8-10μm。利用免疫荧光染色标记损伤部位的星形胶质细胞(GFAP)及神经元标志物Tuj1的表达情况，染色完成后，利用碟式显微镜(OLYMPUSBX61)观察脊髓原位GFAP及Tuj1表达情况。结果如图6所示，A表示GFAP(红色)及Tuj1(绿色)在脊髓损伤原位的表达情况，A1～A2分别显示了GFAP及Tuj1的原位荧光强度定量统计；结果表明，LNP-miRNA-mimics治疗后相较于LNP-NC组明显限制了GFAP的表达以限制胶质疤痕的过度形成，并且LNP-miRNA-mimics组能够促进脊髓损伤原位Tuj1的表达，提示装载特定miRNA的脂质纳米粒能够促进脊髓损伤部位的神经元恢复。
实施例7
装载特定miRNA的脂质纳米粒促进脊髓损伤小鼠双后肢肌肉及神经-肌接头恢复
取实施例5处理后第21天的小鼠双后肢胫骨前肌进行冰冻包埋后切片，切片厚度为8μm。利用免疫荧光染色标记肌束横截面及神经-肌接头恢复情况，染色完成后，利用碟式显微镜(OLYMPUSBX61)进行观察。结果如图7所示，其中A～A1显示了Laminin(绿色)标记的双后肢胫骨前肌肌束横截面积的变化，结果表明，经LNP-miRNA-mimics组治疗后相较于LNP-NC组双后肢胫骨前肌肌束横截面积得到明显改善，并且与LNP-NC组具有明显差异，更加趋近于Sham组。B图显示了神经元轴突标记物SV2\NF(绿色)及烟碱乙酰胆碱受体(AchR)α-银环蛇毒素(α-Bungarotoxin)(红色)组合标记的胫骨前肌组织切片中的神经-肌接头表达情况，LNP-miRNA-mimics组的α-Bungarotoxin(红色)和SV2\NF(绿色)的共表达情况优于LNP-NC组，这表明LNP-miRNA-mimics组双后肢胫骨前肌的神经支配恢复优于LNP-NC组；B1图的双后肢胫骨前肌烟碱乙酰胆碱受体面积定量显示LNP-NC组、LNP-miRNA-mimics组肌肉烟碱乙酰胆碱受体面积明显低于Sham组，但两组之间无显著差异，说明LNP-miRNA-mimics治疗主要作用于神经恢复。

Claims (10)

1.一种包裹特定miRNA的脂质纳米粒，其特征在于，所述特定miRNA为miRNA的分子模拟物，即miRNAmimics，包括has-miR939-5p mimics、has-miR665 mimics、has-miR185-3pmimics。
2.如权利要求1所述的脂质纳米粒，其特征在于，所述has-miR939-5p mimics正义链的核酸序列如SEQ ID NO.1所示，反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述has-miR665mimics正义链的核酸序列如SEQ ID NO.3所示，反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述has-miR185-3p mimics正义链的核酸序列如SEQ ID NO.5所示，反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
3.如权利要求1所述的脂质纳米粒，其特征在于，所述脂质纳米粒的脂质成分包括：ALC-0315、DSPC、胆固醇、ALC-0159；
优选的，所述ALC-0315、DSPC、胆固醇、ALC-0159的摩尔比为46.3：9.4：42.7：1.6。
4.权利要求1所述的脂质纳米粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)将ALC-0315、DSPC、胆固醇、ALC-0159以乙醇为溶剂分别配制为脂质储备液，按比例混合后配置为复方-乙醇溶液；
2)利用柠檬酸钠缓冲液将miRNAmimics稀释至工作浓度，得到水相溶液；
3)将复方-乙醇溶液和水相溶液混合，自主形成LNP-miRNA-mimics复合物，并利用PBS缓冲液稀释；
4)通过超滤将LNP-miRNA-mimics复合物利用PBS缓冲液置换，使乙醇含量降至0.5％以下，然后浓缩；
5)向浓缩后的LNP-miRNA-mimics复合物中添加蔗糖作为冷冻保护剂，经0.22μm过滤后得到包裹特定miRNA的脂质纳米粒，即LNP-miRNA-mimics。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中所述的脂质储备液浓度为5～12.5mg/mL；
进一步优选的，所述的脂质储备液浓度为10mg/mL。
6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中所述的水相溶液中has-miR939-5pmimics、has-miR665 mimics、has-miR185-3p mimics的质量比为1:1:1，水相溶液中总miRNA mimics的工作浓度以步骤3)所述的LNP-miRNA-mimics复合物中包含0.4～1mg/mL的LNP-miRNA-mimics计算配制；
进一步优选的，水相溶液中总miRNAmimics的工作浓度以步骤3)所述的LNP-miRNA-mimics复合物中包含0.5mg/mL的LNP-miRNA-mimics计算配制。
7.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤3)中所述的PBS缓冲液稀释为加入LNP-miRNA-mimics复合物2～3倍体积的PBS缓冲液进行稀释；所述PBS缓冲液的pH为6.9～7.9。
8.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤4)中所述的超滤为使用100kDa超滤离心管3000～4000×g离心10～15min；所述PBS缓冲液的pH为6.9～7.9。
9.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤5)中所述的蔗糖浓度为最终溶液中含8％～10％蔗糖；
进一步优选的，所述的蔗糖浓度为最终溶液中含10％蔗糖。
10.如权利要求1所述的包裹特定miRNA的脂质纳米粒在制备神经损伤治疗药物中的应用；
优选的，所述包裹特定miRNA的脂质纳米粒能够促进神经损伤再生修复；
进一步优选的，所述包裹特定miRNA的脂质纳米粒能够促进脊髓损伤后的行为恢复、肌肉恢复及损伤部位的神经元恢复。
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