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CN120187407A - 重组aav载体及其用途 - Google Patents

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CN120187407A
CN120187407A CN202180105043.4A CN202180105043A CN120187407A CN 120187407 A CN120187407 A CN 120187407A CN 202180105043 A CN202180105043 A CN 202180105043A CN 120187407 A CN120187407 A CN 120187407A
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raav
ala
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林睿
罗敏敏
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Jianda Jiuzhou Beijing Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Jianda Jiuzhou Beijing Biotechnology Co ltd
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Abstract

提供了一种重组腺相关病毒(rAAV)衣壳蛋白，包括11个连续氨基酸X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10Q的氨基酸序列，以及包含该序列的rAAV载体及其用途。

Description

重组AAV载体及其用途
技术领域
本公开涉及腺相关病毒(AAV)载体领域，特别是重组AAV(rAAV)衣壳蛋白、含有该rAAV衣壳蛋白的rAAV载体及其用途。
背景技术
小胶质细胞约占中枢神经系统(CNS)细胞总数的10％。小胶质细胞最初被认为是碎片清除者，现在被认为是正常和病理条件下CNS的主要调节者。小胶质细胞进行主动监视，并在遇到免疫攻击时启动快速的先天和适应性免疫反应。除了在免疫方面的功能外，最近的研究揭示了小胶质细胞在控制神经回路发育和可塑性方面的多方面作用。新兴的证据表明，小胶质细胞功能障碍是CNS衰老和CNS疾病(包括神经系统疾病和脑癌)进展的关键因素。许多临床研究已经确定了小胶质细胞高度表达的基因的风险相关改变，强调了小胶质细胞在CNS疾病进展中的参与以及靶向小胶质细胞进行治疗干预的潜力。
研究小胶质细胞的一个关键挑战在于不能有效地标记和操纵它们。目前的方法严重依赖于产生生殖系转基因小鼠模型，将转基因或遗传修饰引入小胶质细胞，这是耗时、费力且往往效率低下的。此外，生殖系转基因的参与阻碍了其在低繁殖率和长传代时间的动物模型((例如，非人灵长类动物))中的广泛应用，也无法将其用作人类的治疗工具。
重组病毒载体是操纵小胶质细胞的一种有吸引力的替代方法，对小胶质细胞基因治疗具有很广阔的前景。特别是，由于缺乏明显的致病性，重组腺相关病毒(rAAV)是目前基础研究和基因治疗中最常用的病毒载体。然而，尽管rAAV能够转导广泛的哺乳动物细胞类型，但rAAV对小胶质细胞的转导仍然非常差。使用现有AAV衣壳包装的rAAV在小胶质细胞中，特别是在体内，没有达到高转导率和足够的转基因表达水平。
另一方面，小胶质细胞(以及一般的巨噬细胞)的病毒转导也面临诱导免疫激活的潜在问题。例如，重组腺病毒有效地转导巨噬细胞，但同时使转导的细胞产生免疫反应。
因此，仍需要开发一种系统来实现小胶质细胞中的高转导率和足够的转基因表达水平，而不触发转导细胞的免疫再激活。
发明内容
为了克服上述技术问题中的至少一个，本公开提供了介导有效基因递送至小胶质细胞的新的AAV衣壳及其应用。
本文提供了重组腺相关病毒(rAAV)衣壳蛋白，与亲本AAV衣壳蛋白相比，其具有7个氨基酸肽插入()。当本文提供的所述rAAV衣壳蛋白存在于AAV载体/病毒粒子中时，与没有肽插入的AAV病毒粒子相比，无论在体内还是体外，都能提高小胶质细胞的转导效率。还提供了重组AAV载体/病毒粒子及其包含其中提供的rAAV衣壳蛋白的药物组合物；以及在研究和临床实践中使用这些rAAV衣壳蛋白和载体/病毒粒子的方法，例如，将多核苷酸序列递送到小胶质细胞以治疗与小胶质细胞相关的疾病。
根据本公开的一个方面，提供了一种重组腺相关病毒(rAAV)衣壳蛋白，其包括11个连续氨基酸X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10Q的氨基酸序列，其中X1选自Ala或Leu；X2选自Gln、Met、Thr、Val或Pro；X3选自Trp、Thr、Glu、Pro、Leu、Ala或Gln；X4选自Pro、Thr、Met、Ser、Arg或Ala；X5选自Pro、Ser、Val、Asp或Phe；X6选自Lys或Pro；X7选自Thr或Arg；X8选自Thr、Glu或Pro；X9选自Ser、Pro或Ala；和X10选自Ala或Asp。
在一些实施方案中，所述所述rAAV衣壳蛋白包括11个连续氨基酸X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10Q的氨基酸序列，其中X6是Lys；X7是Thr；X8是Thr；X9是Ser；和/或X10是Ala。在一些实施方案中，所述rAAV衣壳蛋白包括11个连续氨基酸X1X2X3X4X5KTTSAQ的氨基酸序列。在另一些实施方案中，X1选自Ala或Leu。在另一些实施方案中，X2选自Gln、Met、Thr或Val。在另一些实施方案中，X3选自Trp、Thr、Glu、Pro或Leu。在另一些实施方案中，X4选自Pro、Thr、Met或Ser。在另一些实施方案中，X5选自Ser、Val、Asp或Pro。在一些具体的实施方案中，X1是Ala、X2是Gln、X3是Trp、X4是Pro、X5是Pro。在一些具体的实施方案中，X1是Leu、X2是Met、X3是Thr、X4是Pro、X5是Pro。在一些具体的实施方案中，X1是Ala、X2是Thr；X3是Glu、X4是Pro、X5是Pro。在一些具体的实施方案中，X1是Ala、X2是Gln、X3是Pro、X4是Thr、X5是Ser。在一些具体的实施方案中，X1是Ala、X2是Gln、X3是Leu、X4是Met、X5是Val。在一些具体的实施方案中，X1是Ala、X2是Gln、X3是Trp、X4是Thr、X5是Asp。在一些具体的实施方案中，X1是Ala、X2是Val、X3是Leu、X4是Ser、X5是Pro。
在一些具体的实施方案中，所述rAAV衣壳蛋白包括AQWPPKTTSAQ(SEQ ID NO.:1)的氨基酸序列。在一些具体的实施方案中，所述rAAV衣壳蛋白包括LMTPPKTTSAQ(SEQ IDNO.:2)的氨基酸序列。在一些具体的实施方案中，所述rAAV衣壳蛋白包括ATEPPKTTSAQ(SEQID NO.:3)的氨基酸序列。在一些具体的实施方案中，所述rAAV衣壳蛋白包括AQPTSKTTSAQ(SEQ ID NO.:71)的氨基酸序列。在一些具体的实施方案中，所述rAAV衣壳蛋白包括AQLMVKTTSAQ(SEQ ID NO.:72)的氨基酸序列。在一些具体的实施方案中，所述rAAV衣壳蛋白包括AQWTDKTTSAQ(SEQ ID NO.:73)的氨基酸序列。在一些具体的实施方案中，所述rAAV衣壳蛋白包括AVLSPKTTSAQ(SEQ ID NO.:74)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述rAAV衣壳蛋白包括X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10Q的氨基酸序列，其中，X1是Ala；X6是Pro；和/或X7是Arg。在一些实施方案中，所述rAAV衣壳蛋白包括AX2X3X4X5PRX8X9X10Q的氨基酸序列。在另一些实施方案中，X2选自Gln或Pro。在另一些实施方案中，X3选自Thr、Ala或Gln。在另一些实施方案中，X4选自Arg或Ala。在另一些实施方案中，X5选自Pro或Phe。在另一些实施方案中，X8选自Glu或Pro。在另一些实施方案中，X9选自Pro或Ala。在另一些实施方案中，X10选自Ala或Asp。在一些具体的实施方案中，X2是Gln、X3是Gln、X4是Arg、X5是Pro、X8是Glu、X9是Pro、X10是Ala。在一些具体的实施方案中，X2是Gln、X3是Gln、X4是Arg、X5是Pro、X8是Pro、X9是Ala、X10是Asp。在一些具体的实施方案中，X2是Gln、X3是Thr、X4是Ala、X5是Phe、X8是Glu、X9是Pro、X10是Ala。在一些具体的实施方案中，X2是Pro、X3是Ala、X4是Arg、X5是Pro、X8是Glu、X9是Pro、X10是Ala。
在一些具体的实施方案中，所述rAAV衣壳蛋白包括AQQRPPREPAQ(SEQ ID NO.:4)的氨基酸序列。在一些具体的实施方案中，所述rAAV衣壳蛋白包括AQQRPPRPADQ(SEQ IDNO.:5)的氨基酸序列。在一些具体的实施方案中，所述rAAV衣壳蛋白包括AQTAFPREPAQ(SEQID NO.:75)的氨基酸序列。在一些具体的实施方案中，所述rAAV衣壳蛋白包括APARPPREPAQ(SEQ ID NO.:76)的氨基酸序列。
根据本公开的另一方面，提供了一种多核苷酸序列，其编码本公开提供的rAAV衣壳蛋白。
根据本公开的又一方面，提供了一种重组腺相关病毒(rAAV)载体，其包括本公开提供的衣壳蛋白。在一些实施方案中，rAAV载体还包括异源多核苷酸序列。在一些实施方案中，异源多核苷酸序列编码异源多肽、非编码RNA或CRISPR剂。
在一些实施方案中，所述CRISPR剂包括DNA靶向的RNA，例如，crRNA样RNA、tracrRNA样RNA、单导RNA等。在一些实施方案中，所述异源多核苷酸序列编码蛋白质，如抗体、膜蛋白(如受体)、伴侣蛋白或泛素连接酶。在一些实施方案中，所述异源多核苷酸序列编码miRNA、siRNA、piRNA、lncRNA或向导RNA。
根据本公开的又一方面，提供了一种药物组合物，其包括本公开提供的rAAV载体/病毒粒子，以及药学上可接受的载体。
根据本公开的又一方面，提供了一种用于将本公开提供的rAAV载体递送至靶细胞的方法，其包括使所述靶细胞与所述rAAV载体/病毒粒子接触。在一些实施方案中，所述靶细胞是体外或体内的小胶质细胞。在一些实施方案中，所述接触是在拓扑异构酶或蛋白酶体的抑制剂存在的情况下进行的。在某些实施方案中，所述接触是在拓扑异构酶抑制剂和/或DNA损伤诱导剂存在的情况下进行的。所述拓扑异构酶抑制剂可选自多柔比星(DNA拓扑异构酶II抑制剂)、硼替佐米(蛋白酶体抑制剂)、依托泊苷(DNA拓扑异构酶II抑制剂)、替尼泊苷(DNA拓扑异构酶II抑制剂)、香兰素(非同源末端连接抑制剂)等。所述DNA损伤诱导剂可以是博来霉素等。
根据本公开的又一方面，提供了一种宿主细胞，其包括本公开提供的编码所述rAAV衣壳蛋白的多核苷酸序列。
根据本公开的又一方面，提供了一种用于治疗神经系统疾病(neurologicaldisorder)的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的所述药物组合物。在一些实施方案中，所述神经系统疾病可以是与小胶质细胞有关的疾病。在一些实施方案中，所述神经系统疾病可包括阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病和肌萎缩性侧索硬化症、脑白质病、胶质瘤和非典型畸胎瘤/横纹肌样瘤。
能够介导有效小胶质细胞转导的工程AAV衣壳的开发为研究小胶质细胞生物学提供了急需的病毒工具。本公开表明，本文提供的rAAV能够在小胶质细胞中进行充分的转基因表达，用于标记、监测和操作。本文新进化的AAV衣壳可以促进各种遗传编码工具(例如用于信号分子的荧光传感器，光遗传学的和化学遗传学的效应物)和基因编辑方法在体外和体内小胶质细胞中的应用。将本文提供的rAAV与其他靶向CNS中其他细胞类型的rAAV相结合，也代表了研究同一动物中小胶质细胞与不同细胞类型之间相互作用的有希望的策略。最近的单细胞转录组学研究揭示了小胶质细胞在大脑中出乎意料的巨大区域异质性。因此，本公开的rAAV可能是体内脑区域特异性小胶质细胞操作的理想工具，以研究小胶质细胞在控制不同脑区域神经回路中的作用。
人类患者的遗传学研究发现了许多在小胶质细胞中高度富集的CNS疾病的药物靶点和信号通路。将疾病相关突变引入小鼠模型导致小胶质细胞功能障碍，并诱导与人类患者相似的病理和行为表型，强调了基于小胶质细胞的基因治疗的巨大潜力。作为基因治疗的关键前提，治疗剂有效转移到靶细胞需要合适的载体。缺乏安全、有效和临床相关的递送方式阻碍了小胶质细胞基因治疗的发展。本公开的AAV衣壳的成功进化证明了利用rAAV进行有效小胶质转导的可能性，并为未来优化基于小胶质细胞基因治疗的AAV衣壳奠定了基础。
在其他实施方案中，包含前文所述变体衣壳蛋白的AAV载体/病毒粒子可以包含上述或随后公开的实施方案中的任何实施方案。实际上，应当理解，本文公开的某些特征，为清楚起见，在单独实施方案的上下文中描述，也可以组合在单个实施方案中提供。相反，本文公开的各种特征，为简短起见，在单个实施方案的上下文中描述，也可以单独提供或以任何合适的子组合提供。与本发明有关的实施方案的所有组合明确地包含在本发明中并在本文中公开，就如同每个和每种组合都单独和明确地公开一样。此外，各种实施方案及其元素的所有子组合也具体包含在本发明中，并且在本文中公开，就如同每个和每种这样的子组合在本文中单独和明确地公开一样。
附图说明
图1.定向进化产生在体外和体内介导有效的小胶质细胞转导的AAV-MG。(A)体外筛选过程示意图。在AAV9 VP1蛋白的第588个氨基酸和第589个氨基酸之间随机插入七聚体。在培养的小鼠小胶质细胞中筛选文库两轮。(B)从培养的小鼠小胶质细胞中回收的AAV9衣壳变体的分布，按富集评分降序排序。饼状图显示AAV-cMG.WPP在总回收序列中的归一化频率。青色：AAV-cMG.WPP。(C)体内选择过程示意图。在AAV-cMG.WPP中插入的七聚体及其邻近的四个氨基酸中引入了半随机突变。在Cx3cr1CreER小鼠纹状体和中脑中筛选文库。从大脑中选择性地回收了Cre-重组的AAV基因组的衣壳变体。(D)从Cx3cr1CreER小鼠大脑中回收的AAV-cMG.WPP变体的分布，按富集评分降序排序。饼状图显示AAV-MG1.1和AAV-MG1.2在总回收序列中的归一化频率。品红：AAV-MG1.1，绿色：AAV-MG1.2，青色：AAV-cMG.WPP。(E)示出注射AAV-cMG.WPP-SFFV-DIO-mScarlet、AAV-MG1.1-SFFV-DIO-mScarlet或AAV-MG1.2-SFFV-DIO-mScarlet的Cx3cr1CreER小鼠眼眶前额皮质(OFC，上)和纹状体(下)中mScarlet表达模式的代表性图像。在眼眶后给药或不给药多柔比星时分别注射AAV。详细的量化结果如图5A所示。(F)示出注射AAV-MG1.1-SFFV-DIO-mScarlet的Cx3cr1CreER小鼠OFC和纹状体中mScarlet和Iba+免疫信号共定位的代表性图像。详细的量化结果如图5D所示。比例尺，250μm(E)，100μm(F)。
图2.AAV-cMG在体外介导有效的小胶质细胞转导。(A)选择过程示意图。在AAV9VP1蛋白的第588个氨基酸和第589个氨基酸之间随机插入7个氨基酸。在培养的小鼠小胶质细胞中筛选文库两轮。(B)从培养的小鼠小胶质细胞中回收的AAV9衣壳变体的分布，按富集评分降序排序。饼状图显示AAV-cMG.QRP在总回收序列中的归一化频率。(C)用AAV-MG.QRP包装的mScarlet报告子(reporter)AAV转导的培养的小鼠小胶质细胞的代表性图像。(D)AAV-MG.QRP变体的选择过程示意图。右图显示从培养的小鼠小胶质细胞中回收的AAV-MG.QRP变体的分布，按富集评分降序排序。饼状图显示AAV-cMG在总回收序列中的归一化频率。(E)用不同衣壳包装的mScarlet报告子AAV转导的培养的小鼠小胶质细胞的代表性图像。(F)示出用AAV-cMG-SFFV-mScarlet转导的培养的小鼠小胶质细胞中mScarlet和Iba+免疫信号的共定位的代表性免疫荧光图像。(G)用不同衣壳包装的mScarlet报告子AAV转导的培养的小鼠小胶质细胞的mScarlet+百分比和平均荧光强度的量化(3pt中每组n＝6个重复；5pt中每组5个重复；柱状图表示每组的平均值；Dunnett事后检验的单因素方差分析(ANOVA))。(H)示出含(右)或不含(左)多柔比星的AAV-cMG-SFFV-mScarlet转导的培养小胶质细胞的代表性图像。(I)含或不含多柔比星的AAV-cMG-SFFV-mScarlet转导的培养的小鼠小胶质细胞的mScarlet+百分比和平均荧光强度的量化(每组n＝6个重复；柱状图表示每组的平均值；邓尼特(Dunnett)事后检验的单因素方差分析)。比例尺，200μm(C、E、H)，50μm(F)。
图3.通过AAV-cMG.WPP转导培养的小鼠小胶质细胞。(A)用不同衣壳包装的mScarlet报告子rAAV转导的培养的小鼠小胶质细胞的代表性图像。(B)示出用AAV-cMG.WPP包装的mScarlet报告子rAAV转导的培养的小鼠小胶质细胞中mScarlet和Iba+免疫信号的共定位的代表性免疫荧光图像。(C)用不同衣壳包装的mScarlet报告子rAAV转导的培养的小鼠小胶质细胞的mScarlet+百分比和平均荧光强度的量化(每组n＝4个重复；柱状图表示每组的平均值；Dunnett事后检验的单因素方差分析)。(D)四个处理组的培养的小鼠小胶质细胞转录组的主成分分析：对照未转导(稳态)、LPS处理(反应态)、白细胞介素-4处理(IL4；替代激活态)和AAV-cMG.WPP转导组(每组n＝3个重复)。(E)示出(D)中不同处理组中小胶质细胞反应态和替代激活态的标记基因表达的热图。比例尺，100μm(A)，50μm(B)。
图4.AAV-MG在体内介导有效的小胶质细胞转导。(A)示出注射AAV-cMG.WPP-SFFV-DIO-mScarlet(左)、AAV-MG1.1-SFFV-DIO-mScarlet(中)或AAV-MG1.2-SFFV-DIO-mScarlet(右)的Cx3cr1CreER小鼠中脑mScarlet表达模式的代表性图像。(B)示出注射AAV-MG1.1-SFFV-DIO-mScarlet(左)或AAV-MG1.2-SFFV-DIO-mScarlet(右)的Cx3cr1CreER小鼠海马体和丘脑中mScarlet表达模式的代表性图像。比例尺，500μm。
图5.AAV-MG介导的体内小胶质细胞转导的量化。(A)注射AAV-cMG.WPP-SFFV-DIO-mScarlet、AAV-MG1.1-SFFV-DIO-mScarlet或AAV-MG1.2-SFFV-DIO-mScarlet的Cx3cr1CreER小鼠OFC、纹状体和中脑中mScarlet标记的小胶质细胞计数(每组n＝3只小鼠；Tukey事后检验的双向方差分析；对于OFC、纹状体和中脑，cMG.WPP vs.MG1.1的P<0.0001；对于OFC、纹状体和中脑，cMG.WPP vs.MG1.2的P<0.0001)。x轴表示脑切片与病毒注射部位的距离(μm)。(B)注射AAV-MG1.1-SFFV-DIO-mScarlet(左)或AAV-MG1.2-SFFV-DIO-mScarlet(右)的Cx3cr1CreER小鼠纹状体中mScarlet标记的小胶质细胞的荧光强度分布(每组n＝3只小鼠)。在眼眶后给药或不给药多柔比星(Doxo)时分别注射AAV。(C)注射AAV-MG1.1-SFFV-DIO-mScarlet的Cx3cr1CreER小鼠中脑内mScarlet和Iba+免疫信号共定位的代表性图像。(D)mScarlet和Iba双阳性小胶质细胞占总mScarlet阳性小胶质细胞的百分比的量化(每组n＝3只小鼠)。(E)示出注射AAV5-SFFV-DIO-mScarlet(左)、AAV6TM-SFFV-DIO-mScarlet(中)或AAV9-SFFV-DIO-mScarlet(右)的Cx3cr1CreER小鼠纹状体中mScarlet表达模式的代表性图像。比例尺，100μm(C)，100μm(E)。
图6.AAV-MG在体内对小胶质细胞的转导不会诱导小胶质细胞激活。(A)分离自3只小鼠的197个小胶质细胞(未转导90个，AAV-MG1.1转导11个，AAV-MG1.2转导96个)的UMAP图。插图显示了mScarlet转录本的对数归一化表达水平。(B)小提琴图显示稳态标记基因(Cx3cr1、Tmem119、P2ry12和Csf1r)和反应性标记基因(Cd74、Tlr2、Cebpb和Spp1)的表达水平。(C)参考小胶质细胞数据集(使用10x Genomics平台对对照小鼠的4500个小胶质细胞和LPS处理小鼠的9832个小胶质细胞进行测序)和查询数据集(使用Smart-seq2协议测序)重新计算的UMAP图。插图总结了Smart-seq2测序的小胶质细胞的状态，正如Seurat标签转移所预测的那样。
图7.参考单细胞RNA测序数据集表征稳态和反应态小胶质细胞的单细胞转录组。(A)图6A中Smart-seq2数据集中基因计数、线粒体RNA百分比和核糖体RNA百分比的量化。红点表示未通过质量检查并从后续分析中删除的测序小胶质细胞。共获得197个质量控制(QC)阳性的单个小胶质细胞(未转导90个，AAV-MG1.1转导11个，AAV-MG1.2转导96个)，平均基因检出率为每个细胞3961个基因。(B)参考小胶质细胞数据集中14332个小胶质细胞的UMAP图[4500来自对照小鼠，9832来自LPS处理小鼠(0.83mg/kg，腹腔注射)，使用10xGenomics平台测序]。(C)小提琴图显示了参考小胶质细胞数据集中稳态标记基因(Cx3cr1、Tmem119、P2ry12和Csf1r)和反应态标记基因(Cd74、Tlr2、Cebpb和Spp1)的表达水平。(D)在参考小胶质细胞数据集中，小胶质细胞在稳态和反应状态下的基因表达变化的量化。红点表示反应态标记基因。
图8.AAV-MG能够实现小胶质细胞Ca2+信号和ATP传输的体内双光子成像。(A)钙信号和ATP传输的体内双光子成像实验过程示意图。(B)LPS(左)或生理盐水(右)注射后3小时小胶质细胞中GCaMP8表达的图像和GCaMP8荧光信号的热图。(C)LPS(红色)或生理盐水(黑色)腹腔注射后小胶质细胞胞体(microglia somata)GCaMP8荧光信号的量化(LPS组n＝14个细胞，生理盐水组n＝10个细胞；双向方差分析，#：Tukey的事后vs.0小时，*：Sidak的事后vs.生理盐水)。(D)LPS(左)或生理盐水(右)注射后3小时小胶质细胞中GRABATP1.0表达的图像和GRABATP1.0荧光信号的热图。(E)LPS(红色)或生理盐水(黑色)腹腔注射后小胶质细胞胞体GRABATP1.0荧光信号的量化(LPS组n＝14个细胞，生理盐水组n＝10个细胞；双向方差分析，#：Tukey事后分析vs.0小时，*：Sidak事后分析vs.生理盐水)。误差棒表示s.e.m.。比例尺，100μm(B、D)。
图9.AAV-MG1.2急性激光消融后小胶质细胞胞外ATP变化的体内双光子成像。(A)对照小鼠(黑色)或接受激光消融的小鼠(红色)的小胶质细胞胞体GRABATP1.0荧光信号的量化(对照组n＝10个细胞，激光消融组n＝16个细胞；双向方差分析)。(B)成像过程中10min(左)、20min(中)和40min(右)小胶质细胞中GRABATP1.0的表达图像和GRABATP1.0荧光信号的热图。对于激光消融组，在成像过程开始时(0min)将激光应用于视场中心。误差棒表示s.e.m.。比例尺，100μm。
图10.AAV-MG介导的体内有效的小胶质细胞基因组编辑。(A)注射AAV-MG1.1-sgRNA-LacZ(左)或AAV-MG1.1-sgRNA-Tmem119(右)的Cx3cr1CreER:Rosa26-LSL-Cas9小鼠纹状体的代表性免疫荧光图像。脑切片采用Tmem119免疫染色。右上方的图显示了左边图中框状区域的放大视图。右下图显示背纹状体1.5mm×1.5mm区域内Tmem119阳性像素的百分比(每组n＝3只小鼠；双向方差分析)。x轴表示脑切片与病毒注射部位的距离(μm)。(B)注射AAV-MG1.2-sgRNA-LacZ(左)或AAV-MG1.2-sgRNA-Cd68(右)的Cx3cr1CreER：Rosa26-LSL-Cas9小鼠纹状体的代表性免疫荧光图像。脑切片采用Cd68免疫染色。右上方的图显示了左边图中框状区域的放大视图。右下图显示背纹状体1mm×1mm区域内Cd68阳性细胞的数量(每组n＝3只小鼠；双向方差分析)。x轴表示脑切片与病毒注射部位的距离(μm)。(C)激光消融对小胶质细胞反应的体内双光子成像的实验过程示意图。(D)注射AAV-MG1.2-CMV-SaCas9(黑色)或AAV-MG1.2-CMV-SaCas9-U6-sgRNA-P2ry12(红色)的Cx3cr1GFP小鼠激光消融部位的小胶质细胞过程延伸的量化(注射AAV-MG1.2-CMV-SaCas9的3只小鼠n＝4个视场，注射AAV-MG1.2-CMV-SaCas9-U6-sgRNA-P2ry12的3只小鼠n＝6个视场；双向方差分析)。(E)注射AAV-MG1.2-CMV-SaCas9(左)或AAV-MG1.2-CMV-SaCas9-U6-sgRNA-P2ry12(右)的Cx3cr1GFP小鼠的小胶质细胞向双光子激光消融部位募集过程的代表性图像。误差棒表示s.e.m.。比例尺，200μm(A左、B左)，100μm(A右、B右)，20μm(E)。
图11.AAV-MG介导的体内小胶质细胞特异性基因敲除。(A)注射AAV-MG1.1-sgRNA-LacZ(上)或AAV-MG1.1-sgRNA-Tmem119(下)的Cx3cr1CreER:Rosa26-LSL-Cas9小鼠纹状体的代表性免疫荧光图像。脑切片采用Tmem119免疫染色。(B)注射AAV-MG1.2-sgRNA-LacZ(上)或AAV-MG1.2-sgRNA-Cd68(下)的Cx3cr1 CreER:Rosa26-LSL-Cas9小鼠纹状体的代表性免疫荧光图像。脑切片采用Cd68免疫染色。(C)注射AAV-MG1.2-CMV-SaCas9(上)或AAV-MG1.2-CMV-SaCas9-U6-sgRNA-P2ry12(下)后Cx3cr1GFP小鼠S1皮质的代表性图像。脑切片采用P2ry12免疫染色。(D)注射AAV-MG1.2-CMV-SaCas9(黑色)或AAV-MG1.2-CMV-SaCas9-sgRNA-P2ry12(红色)的Cx3cr1GFP小鼠S1皮质1mm×1mm区域内P2ry12阳性像素的百分比的量化(P2ry12敲除组n＝3只小鼠；对照组n＝2只小鼠；双向方差分析)。误差棒表示s.e.m.。比例尺，500μm(A、B)，100μm(C)。
图12.注射(A)AAV-MG.TAF-SFFV-DIO-mScarlet、(B)AAV-MG.APA-SFFV-DIO-mScarlet、(C)AAV-MG.PTS-SFFV-DIO-mScarlet、(D)AAV-MG.LMV-SFFV-DIO-mScarlet、(E)AAV-MG.WTD-SFFV-DIO-mScarlet或(F)AAV-MG.VLS-SFFV-DIO-mScarlet的Cx3cr1CreER小鼠纹状体中mScarlet表达模式的代表性图像。比例尺，500μm。
具体实施方式
在描述本方法和组合物之前，应理解本发明不限于所描述的特定方法或组合物，这些是可以变化的。还应理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，而不旨在限制，因为本发明的范围将仅受所附权利要求书的限制。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域技术人员通常理解的相同含义。尽管任何与本文描述的类似或等效的方法和材料可用于本发明的实践或测试，但现在描述了一些潜在的和优选的方法和材料。本文提及的所有出版物通过引用并入本文，以公开和描述与引用出版物相关的方法和/或材料。应当理解，在存在矛盾的程度上，本公开取代合并出版物的任何公开。
值得注意的是，在本文和所附权利要求书中使用的，单数形式“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“所述(the)”包括复数指称物，除非上下文明确另有规定。因此，例如，提及“一种重组AAV病毒粒子”包括多个这样的病毒粒子，提及“小胶质细胞”包括提及本领域技术人员已知的一个或多个小胶质细胞及其等同物，等等。
定义
除非另有定义，本文使用的所有科学技术术语具有本技术所属领域技术人员通常理解的相同含义。
腺相关病毒(AAV)是细小病毒科(Parvoviridae)的一员，属于依赖病毒(Dependovirus)属。AAV是一种非致病性细小病毒，由无包膜的二十面体衣壳内的约4.7kb的单链DNA基因组组成。基因组包含三个开放阅读框(ORF)，两侧是反向末端重复序列(ITR)，作为病毒复制和包装信号的起源。rep ORF编码四种非结构蛋白，在病毒复制、转录调控、位点特异性整合和病毒粒子组装中发挥作用。cap ORF编码三种结构蛋白(VP 1-3)，这些结构蛋白组装形成一个60聚体(60-mer)的病毒衣壳。最后，ORF作为cap基因内的替代阅读框产生组装激活蛋白(AAP)，AAP是一种将AAV衣壳蛋白定位到核仁并在衣壳组装过程中发挥作用的病毒蛋白。根据AAV的晶体结构，参与形成二十面体五重、三重和两重对称界面的VP氨基酸已可视化。三重对称轴上的表面环被认为与宿主细胞受体结合有关，并已成为诱变研究的目标。
AAV有几种自然存在的(“野生型”)血清型和100多种已知的变体，每种变体的氨基酸序列不同，特别是在衣壳蛋白的高变区，因此它们的基因递送特性不同。AAV与任何人类疾病都不相关，这使得重组AAV具有临床应用的吸引力。
除非另有说明，术语“腺相关病毒”或“AAV”是指所有亚型或血清型以及复制能力型和重组型。术语“AAV”包括，但不限于，AAV 1型(AAV-1或AAV1)、AAV 2型(AAV-2或AAV2)、AAV 3型(AAV-3A或AAV3A)、AAV 3B型(AAV-3B或AAV3B)、AAV 4型(AAV-4或AAV4)、AAV 5型(AAV-5或AAV5)、AAV 6型(AAV-6或AAV6)、AAV 7型(AAV-7或AAV7)、AAV 8型(AAV-8或AAV8)、AAV 9型(AAV-9或AAV9)、AAV 10型(AAV-10或AAV 10或AAVrh10)、禽类AAV、牛类AAV、犬类AAV、山羊类AAV、马类AAV、灵长类动物AAV、非灵长类动物AAV、绵羊类AAV。“灵长类动物AAV”是指感染灵长类动物的AAV，“非灵长类动物AAV”是指感染非灵长类哺乳动物的AAV，“牛类AAV”是指感染牛类哺乳动物的AAV等。
各种AAV血清型的基因组序列，以及天然末端重复序列(TR)、Rep蛋白和衣壳亚基的序列在本领域是已知的。这样的序列可以在文献或公共数据库如GenBank中找到。参见，例如，GenBank登录号NC_002077.1(AAV1)、AF063497.1(AAV1)、NC_001401.2(AAV2)、AF043303.1(AAV2)、J01901.1(AAV2)、U48704.1(AAV3A)、NC_001729.1(AAV3A)、AF028705.1(AAV3B)、NC.001829.1(AAV4)、U89790.1(AAV4)、NC_006152.1(AA5)、AF085716.1(AAV-5)、AF028704.1(AAV6)、NC 006260.1(AAV7)、AF513851.1(AAV8)、AY530579.1(AAV9)、AAT46337(AAV10)和AAO88208(AAVrh10)；这些公开通过参考并入本文，用于教导AAV多核苷酸和氨基酸序列。
本文使用的术语“重组腺相关病毒衣壳蛋白”或“rAAV衣壳蛋白”是指与野生型VP1-VP3衣壳蛋白相比，在VP1-VP3衣壳蛋白的GH环中包含7个氨基酸肽插入的AAV衣壳蛋白。
本文使用的术语“重组腺相关病毒粒子”、“rAAV病毒粒子”、“rAAV载体”或“rAAV颗粒”是指包含重组/变体衣壳蛋白的病毒粒子。
如果AAV载体/病毒粒子包含异源多核苷酸序列，则所述异源多核苷酸序列是指非野生型AAV基因组的多核苷酸序列，例如，递送至靶细胞的转基因、递送至靶细胞的RNAi剂或CRISPR剂等。通常，异源多核苷酸序列的两侧至少有一个，通常有两个AAV反向末端重复序列(ITR)。
本文使用的术语“异源的”是指源自基因典型地不同于与其进行比较的实体的其余部分的实体。例如，通过基因工程技术引入到来自不同物种的质粒或载体中的多核苷酸，即是异源多核苷酸。因此，例如，包含编码外源基因产物的异源核酸序列的rAAV是包含通常不包含在天然存在的野生型AAV中的多核苷酸的rAAV，并且编码的异源基因产物是通常不被天然存在的野生型AAV编码的基因产物。
本文使用的术语“包装”是指导致AAV颗粒的组装和封装的一系列细胞内事件。AAV“rep”和“cap”基因是指编码腺相关病毒复制和衣壳化蛋白的多核苷酸序列。AAV rep和cap在本文中称为AAV“包装基因”。
本文使用的术语“多核苷酸”是指任何长度的核苷酸的聚合形式，包括脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其类似物。多核苷酸可以包括修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物，并且可以被非核苷酸组分中断。如果存在，对核苷酸结构的修饰可以在聚合物组装之前或之后进行。术语多核苷酸，如本文所用，可互换地指双链和单链分子。除非另有说明或要求，本文中包含多核苷酸的任何实施方案包括双链形式和已知或预测构成双链形式的两种互补单链形式中的每一种。
本文使用的术语“基因”是指在细胞中执行某种功能的多核苷酸。例如，基因可以包含能够编码基因产物的开放阅读框。基因产物的一个示例是蛋白质，它是由基因转录和翻译而来的。基因产物的另一个示例是RNA，例如功能性RNA产物，例如适体、干扰RNA、核糖体RNA(rRNA)、转移RNA(tRNA)、非编码RNA(ncRNA)、核酸酶向导RNA等，其被转录但不被翻译。
关于“CRISPR/Cas9剂”，术语“CRISPR”包括规律间隔成簇短回文重复序列/CRISPR相关(Cas)系统，这些系统通过使用CRISPR RNA(crRNA)指导入侵核酸的沉默，为细菌和古细菌提供针对病毒和质粒的适应性免疫。Cas9蛋白(或其功能等同物和/或变体，即Cas9样蛋白)天然含有DNA内切酶活性，其活性取决于该蛋白与两种天然存在或合成的RNA分子(称为crRNA和tracrRNA，也称为向导RNA)的结合。在某些情况下，这两个分子共价连接形成一个分子(也称为单导RNA(“sgRNA”))。因此，Cas9或Cas9样蛋白与DNA靶向的RNA(该术语包括双分子向导RNA结构和单分子向导RNA结构)结合，激活Cas9或Cas9样蛋白并引导蛋白质到达靶核酸序列。如果Cas9或Cas9样蛋白保留其天然的酶促功能，它将切割靶DNA以产生双链断裂，从而导致基因组改变(即编辑：删除、插入(当供体多核苷酸存在时)、替换等)，从而改变基因表达。
本文使用的术语“CRISPR剂”包括任何剂(或编码该类剂的核酸)，其包括天然或合成的序列，可用于基于Cas9的系统(例如，Cas9或Cas9样蛋白；DNA靶向RNA的任何组分，例如，crRNA样RNA、tracrRNA样RNA、单导RNA等；供体多核苷酸；诸如此类)。
本文所用的术语“治疗(treatment)”、“用于治疗(treating)”等是指获得所需的药理学和/或生理学效果。就完全或部分预防疾病或其症状而言，该效果可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或归因于该疾病的不良影响而言，该效果可以是治疗性的。
术语“个体”、“宿主”、“受试者”和“患者”在本文中可互换使用，并且是指哺乳动物，包括但不限于人类；非人类灵长类动物，包括猿类；哺乳运动动物(如马)；农场哺乳动物(如绵羊、山羊等)；哺乳动物宠物(狗、猫等)；啮齿类动物(如小鼠、大鼠等)。
本文所用的术语“小胶质细胞”是指中胚层/间充质来源的细胞，它们迁移到中枢神经系统，在独特的脑微环境中成为常驻巨噬细胞。小胶质细胞是高度动态的细胞，与神经元和非神经元细胞相互作用。小胶质细胞通过连续的突起伸展和收缩来巡逻脑实质，并且能够从分支形态过渡到变形体形态，这一特征与细胞激活一致。小胶质细胞表达广泛的受体，因此对从神经递质到细胞因子和血浆蛋白的多种刺激作出反应。它们在健康大脑中作为突触功能和新生神经元吞噬的调节因子发挥着至关重要的作用，在突触可塑性和成人神经发生中具有重要意义。在疾病中，它们在神经性和神经炎症性病症中起着至关重要的作用。它们与T细胞的相互作用是脑自身免疫发展的主要组成部分，而它们通过诱导ROS和iNOS与神经元的致病相互作用在神经系统疾病中起着至关重要的作用。新兴的遗传工具和动物模型揭示了小胶质细胞的起源，它们与外周单核细胞的联系，以及它们对疾病发病机制的贡献。由于小胶质细胞可能在中枢神经系统中发挥有益和致病的功能，因此了解它们在疾病特异性背景下的作用对于确定针对中枢神经系统疾病的新型小胶质细胞靶向治疗是必要的。
本文所使用的术语“定向进化”是指一种衣壳工程方法，在体外和/或体内，通过反复的遗传多样化和选择过程模拟自然进化，从而积累有益的突变，逐步改善生物分子的功能。定向进化通常涉及一种被称为“生物筛选”的体内方法，用于从文库中选择AAV变体，这些变体具有对感兴趣的细胞或组织类型更有效的感染性。
关于细胞修饰，通过外源DNA(例如通过重组病毒)进行的术语“基因修饰”或“转化”或“转染”或“转导”是指将这种DNA引入细胞内。外源DNA的存在导致永久或短暂的遗传变化。转化DNA可能会也可能不会被整合(共价连接)到细胞的基因组中。
在不受理论约束的情况下，本公开部分基于几种新的AAV衣壳的惊人发现，这些AAV衣壳通过筛选过程介导有效的基因递送到小胶质细胞。
重组腺相关病毒(rAAV)载体
腺相关病毒(Adeno-associated virus，AAV)是细小病毒的一个家族，其无包膜衣壳内具有4.7kb的单链DNA基因组。天然存在的AAV病毒基因组具有2个反向末端重复序列(ITR)——作为病毒复制和包装信号的起源——其两侧有2个主要开放阅读框(ORF)：rep(编码在病毒复制、转录调控、位点特异性整合和病毒粒子组装中起作用的蛋白质)和cap。cap ORF编码3个结构蛋白，这些结构蛋白组装形成60聚体的病毒衣壳。已经分离出许多天然存在的AAV变体和血清型，但没有一种与人类疾病相关。
重组类型的AAV(rAAV)可以用作基因递送载体，在ITR之间插入标记或感兴趣的治疗基因，以代替rep和cap。这些载体已被证明在体外和体内都能转导分裂和非分裂细胞，并能在有丝分裂后的组织中稳定地表达转基因数年。
重组AAV(rAAV)在越来越多的临床试验中取得了可喜的结果。然而，基因递送的障碍可能会限制AAV的实用性，例如抗衣壳免疫反应，某些组织的低转导，无法靶向递送到特定细胞类型以及相对较低的携带能力。在许多情况下，没有足够的机制知识来有效地赋予合理设计以改进AAV的能力。作为一种替代方案，定向进化已经成为一种创造新的AAV变体以满足特定生物医学需求的策略。定向进化策略利用遗传多样化和选择过程来积累有益的突变，从而逐步提高生物分子的功能。在这个过程中，野生型AAV cap基因通过几种方法进行多样化，以创建大型遗传文库，这些文库被包装成病毒颗粒文库，然后施加选择性压力来分离能够克服基因递送障碍的新变体。重要的是，基因递送问题的机制基础不需要知道功能的定向进化，从而可以加速增强载体的开发。
三种AAV衣壳蛋白(即VP1、VP2和VP3)通过转录本的替代mRNA剪接和替代翻译起始密码子的使用，以重叠的方式从cap ORF产生。这三种衣壳蛋白都采用共同的终止密码子。虽然在实施例和附图中仅示出了VP1，但是应当理解，VP1、VP2和VP3中的每一个都包含本发明提供的11个连续氨基酸X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10Q的氨基酸序列。
在一些实施方案中，与野生型VP1-VP3衣壳蛋白相比，本发明提供的11个连续氨基酸X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10Q的氨基酸序列插入到VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白的GH环中。
对于VP1衣壳蛋白，上述氨基酸序列插入到AAV9的野生型VP1的第588位氨基酸和第589位氨基酸之间，或者插入到与AAV9不同的另一AAV血清型衣壳蛋白的相应位置。在一些实施方案中，另一AAV血清型可包括AAV2、AAVl、AAV3A、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV10等。在一些实施方案中，所述肽插入可位于AAV2的第587位氨基酸和第588位氨基酸之间。在一些实施方案中，所述肽插入可位于AAVl的第591位氨基酸和第592位氨基酸之间。在一些实施方案中，所述肽插入可位于AAV3A的第588位氨基酸和第589位氨基酸之间。在一些实施方案中，所述肽插入可位于AAV3B的第588位氨基酸和第589位氨基酸之间。在一些实施方案中，所述肽插入可位于AAV4的第584位氨基酸和第585位氨基酸之间。在一些实施方案中，所述肽插入可位于AAV5的第575位氨基酸和第576位氨基酸之间。在一些实施方案中，所述肽插入可位于AAV6的第591位氨基酸和第592位氨基酸之间。在一些实施方案中，所述肽插入可位于AAV7的第589位氨基酸和第590位氨基酸之间。在一些实施方案中，所述肽插入可位于AAV8的第591位氨基酸和第592位氨基酸之间。在一些实施方案中，所述肽插入可位于AAV10的第588位氨基酸和第589位氨基酸之间。
在一些实施方案中，变体VP1衣壳蛋白，从AAV9的第587位氨基酸至第597位氨基酸，或与AAV9不同的另一AAV血清型衣壳蛋白的相应位置，包括本发明提供的11个连续氨基酸X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10Q的氨基酸序列。
在一些实施方案中，AAV9的野生型VP1衣壳蛋白包括如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，rAAV的变体VP1衣壳蛋白包括如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，rAAV的变体VP1衣壳蛋白包括如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，rAAV的变体VP1衣壳蛋白包括如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，rAAV的变体VP1衣壳蛋白包括如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，rAAV的变体VP1衣壳蛋白包括如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，rAAV的变体VP1衣壳蛋白包括如SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，rAAV的变体VP1衣壳蛋白包括如SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，rAAV的变体VP1衣壳蛋白包括如SEQ ID NO:59所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，rAAV的变体VP1衣壳蛋白包括如SEQ ID NO:62所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，rAAV的变体VP1衣壳蛋白包括如SEQ ID NO:65所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，rAAV的变体VP1衣壳蛋白包括如SEQ ID NO:68所示的氨基酸序列。
此外，根据具体实施方案，与野生型VP1衣壳蛋白或包括如SEQ ID NO.:7所示的氨基酸序列的变体VP1衣壳蛋白相比，包括如SEQ ID NO.:10、11、59、62、65或68所示的氨基酸序列的变体VP1衣壳蛋白在体内对小胶质细胞具有显著更高的转导能力。此外，根据具体实施方案，与野生型VP1衣壳蛋白或包括如SEQ ID NO.:8所示的氨基酸序列的变体VP1衣壳蛋白相比，包括如SEQ ID NO.:9、53或56所示的氨基酸序列的变体VP1衣壳蛋白在体内对小胶质细胞具有显著更高的转导能力。
对于VP2衣壳蛋白，上述11个连续氨基酸X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10Q的氨基酸序列插入到AAV9的野生型VP2的第451位氨基酸和第452位氨基酸之间，或插入到与AAV9不同的另一AAV血清型的VP2衣壳蛋白的相应位置。在一些实施方案中，变体VP2衣壳蛋白，从AAV9的第450位氨基酸至第460位氨基酸，或与AAV9不同的另一AAV血清型的VP2衣壳蛋白的相应位置，包括本发明提供的11个连续氨基酸X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10Q的氨基酸序列。与X1到X10相关的定义与上述相同。
在一些实施方案中，AAV9的野生型VP2衣壳蛋白包括如SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，rAAV的变体VP2衣壳蛋白包括如SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，rAAV的变体VP2衣壳蛋白包括如SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，rAAV的变体VP2衣壳蛋白包括如SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，rAAV的变体VP2衣壳蛋白包括如SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，rAAV的变体VP2衣壳蛋白包括如SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，rAAV的变体VP2衣壳蛋白包括如SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，rAAV的变体VP2衣壳蛋白包括如SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，rAAV的变体VP2衣壳蛋白包括如SEQ ID NO:60所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，rAAV的变体VP2衣壳蛋白包括如SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，rAAV的变体VP2衣壳蛋白包括如SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，rAAV的变体VP2衣壳蛋白包括如SEQ ID NO:69所示的氨基酸序列。
此外，根据具体实施方案，与野生型VP2衣壳蛋白或包括如SEQ ID NO.:43所示的氨基酸序列的变体VP2衣壳蛋白相比，包括如SEQ ID NO.:49、51、60、63、66或69所示的氨基酸序列的变体VP2衣壳蛋白在体内对小胶质细胞具有显著更高的转导能力。此外，根据具体实施方案，与野生型VP2衣壳蛋白或包括如SEQ ID NO.:45所示的氨基酸序列的变体VP2衣壳蛋白相比，包括如SEQ ID NO.:47、54或57所示的氨基酸序列的变体VP2衣壳蛋白在体内对小胶质细胞具有显著更高的转导能力。
对于VP3衣壳蛋白，上述11个连续氨基酸X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10Q的氨基酸序列插入到AAV9的野生型VP3的第386位氨基酸和第387位氨基酸之间，或插入到与AAV9不同的另一AAV血清型的VP3衣壳蛋白的相应位置。在一些实施方案中，变体VP3衣壳蛋白，从AAV9的第385位氨基酸至第395位氨基酸，或与AAV9不同的另一AAV血清型的VP3衣壳蛋白的相应位置，包括本发明提供的11个连续氨基酸X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10Q的氨基酸序列。
在一些实施方案中，AAV9的野生型VP3衣壳蛋白包括如SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，rAAV的变体VP3衣壳蛋白包括如SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，rAAV的变体VP3衣壳蛋白包括如SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，rAAV的变体VP3衣壳蛋白包括如SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，rAAV的变体VP3衣壳蛋白包括如SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，rAAV的变体VP3衣壳蛋白包括如SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，rAAV的变体VP3衣壳蛋白包括如SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，rAAV的变体VP3衣壳蛋白包括如SEQ ID NO:58所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，rAAV的变体VP3衣壳蛋白包括如SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，rAAV的变体VP3衣壳蛋白包括如SEQ ID NO:64所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，rAAV的变体VP3衣壳蛋白包括如SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，rAAV的变体VP3衣壳蛋白包括如SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列。
此外，根据具体实施方案，与野生型VP3衣壳蛋白或包括如SEQ ID NO.:44所示的氨基酸序列的变体VP3衣壳蛋白相比，包括如SEQ ID NO.:50、52、61、64、67或70所示的氨基酸序列的变体VP3衣壳蛋白在体内对小胶质细胞具有显著更高的转导能力。此外，根据具体实施方案，与野生型VP3衣壳蛋白或包括如SEQ ID NO.:46所示的氨基酸序列的变体VP3衣壳蛋白相比，包括如SEQ ID NO.:48、55或58所示的氨基酸序列的变体VP3衣壳蛋白在体内对小胶质细胞具有显著更高的转导能力。
在一些实施方案中，与不含有这种7个氨基酸肽插入的亲本AAV病毒粒子相比，含有上述rAAV衣壳蛋白的rAAV载体/病毒粒子在体外和体内都具有显著的小胶质细胞转导效率。在一些具体的实施方案中，小胶质细胞可能是培养的小胶质细胞，也可能是大脑或脊髓中的小胶质细胞。
此外，根据一些实施方案，与野生型VP1-VP3衣壳蛋白或包括如SEQ ID NO.:1所示的氨基酸序列的变体VP1-VP3衣壳蛋白相比，包括如SEQ ID NO.:2、33、71、72、73或74所示的氨基酸序列的变体VP1-VP3衣壳蛋白在体内对小胶质细胞具有显著更高的转导能力。
此外，根据一些实施方案，与野生型VP1-VP3衣壳蛋白或包括如SEQ ID NO.:4所示的氨基酸序列的变体VP1-VP3衣壳蛋白相比，包括如SEQ ID NO.:5、75或76所示的氨基酸序列的变体VP1-VP3衣壳蛋白在体内对小胶质细胞具有显著更高的转导能力。
通常，本文公开的变体是通过使用一个AAV文库和/或多个文库生成的。这样一个或多个AAV文库是通过使编码AAV衣壳的结构蛋白(例如VP1-VP3)的cap基因发生突变而产生的，通过病毒基因组工程领域的熟练技术人员所知道并容易获得的一系列定向进化技术产生，例如基于Cre重组的AAV靶向进化(CREATE)。
本文使用的CREATE过程能够开发AAV衣壳，更有效地在体内或体外转导定义的表达CRE的细胞群。为了实现CREATE策略，在文库中的AAV变体基因组中添加Cre重组酶靶向序列。非限制地，CREATE过程包括将AAV文库递送到细胞或转基因小鼠中，包括选择性表达Cre重组酶的靶细胞。对于那些成功转导靶细胞的rAAV，它们的基因组将被Cre重组酶修饰。对于那些转导非靶细胞的rAAV，它们的基因组不会被修改。通过这种方式，特异性引物可以选择性地回收能够转导靶细胞的AAV变体的基因组。
一旦一个或多个AAV文库生成，病毒就会被包装，这样每个AAV颗粒就由突变的VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白组成。然后对文库的变体进行体外和/或体内进行选择性压力技术处理，该技术为AAV领域的技术人员所熟知并易于获得。例如，但不限于，AAV变体可以通过使用如下方式选择：i)亲和柱，其中不同馏分的洗脱产生具有改变的结合特性的变体；ii)原代细胞——从组织样本或永生细胞系中分离出来，模拟人体细胞的行为，产生具有更高效率和/或组织特异性的AAV变体；iii)动物模型——模拟临床基因治疗环境——产生成功感染目标组织的AAV变体；iv)人类异种移植物模型，产生感染移植人类细胞的AAV变体；和/或所选择技术的组合。
一旦病毒被选择，它们可以通过已知的技术回收，例如，但不限于，腺病毒介导的复制、PCR扩增、下一代测序和克隆等。然后通过反复的选择技术富集病毒克隆，分离AAVDNA以回收选定的感兴趣的变体cap基因。这些选择的变体可以经受进一步的修饰或突变，因此可以作为进一步选择步骤的新起点，以迭代地增加AAV病毒的适应度。然而，在某些情况下，成功生成的衣壳没有额外的突变。
本文公开的AAV变体至少部分是通过使用体外或体内定向进化方法产生的，例如上述技术，涉及在注射到小鼠纹状体和/或中脑后的培养的原代小鼠小胶质细胞或体内小胶质细胞中使用筛选。因此，本文公开的AAV变体衣壳包括在VP1、VP2和/或VP3的GH环中插入的7个氨基酸肽，其赋予比相应亲本AAV衣壳蛋白或对照组更有效的转导。如本文所用，“相应亲本AAV衣壳蛋白”是指与主体变体AAV衣壳蛋白具有相同野生型或变体AAV血清型的AAV衣壳蛋白，但不包含主体变体AAV衣壳蛋白的肽插入。
在一些实施方案中，相对于相应的亲本AAV衣壳蛋白，所述变体AAV衣壳蛋白包括由7个氨基酸组成的异源肽，其通过共价键插入AAV衣壳蛋白G-H环或环IV中。通过AAV衣壳蛋白的“G-H环”或环IV，是指本领域中称为AAV衣壳蛋白的GH环或环IV的溶剂可接近部分。
在某些实施方案中，插入位点是位于任何野生型AAV血清型或AAV变体的VP1的第570位氨基酸和第614位氨基酸、VP2的第451位氨基酸和第452位氨基酸和/或VP3的第386位氨基酸和第387位氨基酸之间的两个相邻氨基酸之间的单个插入位点。
例如，插入位点位于任何AAV血清型或变体VP1的第570-610位氨基酸、第580-600位氨基酸、第570-575位氨基酸、第575-580位氨基酸、第580-585位氨基酸、第585-590位氨基酸、第590-600位氨基酸或第600-614位氨基酸的两个相邻氨基酸之间。在优选实施方案中，插入位点位于第580位氨基酸和第581位氨基酸之间、第581位氨基酸和第582位氨基酸之间、第583位氨基酸和第584位氨基酸之间、第584位氨基酸和第585位氨基酸之间、第585位氨基酸和第586位氨基酸之间、第586位氨基酸和第587位氨基酸之间、第587位氨基酸和第588位氨基酸之间、第588位氨基酸和第589位氨基酸、或第589位氨基酸和第590位氨基酸之间。插入位点可以在第575位氨基酸和第576位氨基酸之间、第576位氨基酸和第577位氨基酸之间、第577位氨基酸和第578位氨基酸之间、第578位氨基酸和第579之间或第579位氨基酸和第580位氨基酸之间。插入位点可以是第590位氨基酸和第591位氨基酸之间、第591位氨基酸和第592位氨基酸之间、第592位氨基酸和第593位氨基酸之间、第593位氨基酸和第594位氨基酸之间、第594位氨基酸和第595位氨基酸之间、第595位氨基酸和第596位氨基酸之间、第596位氨基酸和第597位氨基酸之间、第597位氨基酸和第598位氨基酸之间、第598位氨基酸和第599位氨基酸之间或第599位氨基酸和第600位氨基酸之间。在优选实施方案中，插入位点位于AAV2的第587位氨基酸和第588位氨基酸之间、AAVl的第591位氨基酸和第592位氨基酸之间、AAV3A的第588位氨基酸和第589位氨基酸之间、AAV3B第588位氨基酸和第589位氨基酸之间、AAV4的第584位氨基酸和第585位氨基酸之间、AAV5的第575位氨基酸和第576位氨基酸之间、AAV6的第591位氨基酸和第592位氨基酸之间、AAV7的第589位氨基酸和第590位氨基酸之间、AAV8的第591位氨基酸和第592位氨基酸之间、AAV9的第588位氨基酸和第589位氨基酸之间，或者AAV10的第588位氨基酸和第589位氨基酸之间。本领域技术人员将知道，基于各种AAV血清型衣壳蛋白氨基酸序列的比较，其中“对应于AAV9的氨基酸”的插入位点将位于任何给定AAV血清型的衣壳蛋白中。
本文公开的肽插入先前未被描述和/或插入到AAV衣壳中。不希望被理论束缚，任何公开的肽插入的存在都可能增加AAV在体外或体内向小胶质细胞的转导的作用。
在某些实施方案中，对于氨基酸序列X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10Q，X1选自Ala或Leu；X2选自Gln、Met、Thr、Val或Pro；X3选自Trp、Thr、Glu、Pro、Leu、Ala或Gln；X4选自Pro、Thr、Met、Ser、Arg或Ala；X5选自Pro、Ser、Val、Asp或Phe；X6选自Lys或Pro；X7选自Thr或Arg；X8选自Thr、Glu或Pro；X9选自Ser、Pro或Ala；X10选自Ala或Asp。
在某些实施方案中，变体VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白包括氨基酸序列AQWPPKTTSAQ(SEQ ID NO.:1)、LMTPPKTTSAQ(SEQ ID NO.:2)、ATEPPKTTSAQ(SEQ ID NO.:3)、AQQRPPREPAQ(SEQ ID NO.:4)、AQQRPPRPADQ(SEQ ID NO.:5)、AQPTSKTTSAQ(SEQ ID NO.:71)、AQLMVKTTSAQ(SEQ ID NO.:72)、AQWTDKTTSAQ(SEQ ID NO.:73)、AVLSPKTTSAQ(SEQ IDNO.:74)、AQTAFPREPAQ(SEQ ID NO.:75)或APARPPREPAQ(SEQ ID NO.:76)。
在一些实施方案中，rAAV病毒粒子可通过将表达本公开的变体衣壳蛋白的质粒、腺病毒辅助质粒和可选地表达异源多核苷酸序列的转基因质粒共转染293/293T细胞而产生。
在一些实施方案中，rAAV病毒粒子包括编码基因产物的异源多核苷酸序列。在一些实施方案中，基因产物是干扰RNA。在一些实施方案中，基因产物是长的或短的非编码RNA。在一些实施方案中，基因产物是反义RNA。在一些实施方案中，基因产物是向导RNA。在一些实施方案中，基因产物是适体。在一些实施方案中，基因产物是多肽。在一些实施方案中，基因产物是分泌抗体。在一些实施方案中，基因产物是单链抗体。在一些实施方案中，基因产物是VHH结构域。在一些实施方案中，基因产物是可溶性受体。在一些实施方案中，基因产物是亲和体(affibody)。在一些实施方案中，基因产物是伴侣蛋白(chaperone)。在一些实施方案中，基因产物是位点特异性核酸酶，其提供基因功能的位点特异性敲低。
在一些实施方案中，与亲本AAV病毒粒子和其他野生型AAV血清型相比，本公开的rAAV病毒粒子具有更高的转导率和更强的异源多核苷酸序列表达。
在一些实施方案中，本公开的rAAV病毒粒子被转导到培养的小胶质细胞中，而不诱导小胶质细胞中的促炎途径。
在某些实施方案中，与亲本AAV9病毒粒子和其他野生型AAV血清型相比，包括变体VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白的rAAV9病毒粒子在培养的小胶质细胞中具有更高的转导率和更强的异源多核苷酸序列表达，其中所述变体VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白包含AQWPPKTTSAQ(SEQ ID NO.:1)或AQQRPPREPAQ(SEQ ID NO.:4)的氨基酸序列。
在某些实施方案中，与包括AQQRPPREPAQ(SEQ ID NO.:1)的rAAV9病毒粒子以及亲本AAV9病毒粒子和其他野生型AAV血清型相比，包括变体VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白rAAV9病毒粒子的进一步提高了体内小胶质细胞的转导率和更强的异源多核苷酸序列表达，其中所述变体VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白包含LMTPPKTTSAQ(SEQ ID NO.:2)、ATEPPKTTSAQ(SEQID NO.:3)、AQPTSKTTSAQ(SEQ ID NO.:71)、AQLMVKTTSAQ(SEQ ID NO.:72)、AQWTDKTTSAQ(SEQ ID NO.:73)或AVLSPKTTSAQ(SEQ ID NO.:74)的氨基酸序列。
在某些实施方案中，与包括AQQRPPREPAQ(SEQ ID NO.:4)的rAAV9病毒粒子以及亲本AAV9病毒粒子和其他野生型AAV血清型相比，包括变体VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白的rAAV9病毒粒子进一步提高了体内小胶质细胞的转导率和更强的异源多核苷酸序列表达，其中所述变体VP1、VP2和/或VP3衣壳蛋白包含AQQRPPRPADQ(SEQ ID NO.:5)、AQTAFPREPAQ(SEQ ID NO.:75)或APARPPREPAQ(SEQ ID NO.:76)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，rAAV介导的转基因在小胶质细胞中的表达可以通过药理学途径进一步增加。在某些实施方案中，拓扑异构酶和蛋白酶体抑制剂用于进一步提高异源核苷酸序列的表达水平，该异源核苷酸序列通过使用本公开的rAAV病毒粒子进行转导。在优选实施方案中，拓扑异构酶抑制剂，例如多柔比星，用于增加异源核苷酸序列的表达水平，该异源核苷酸序列通过使用本发明的rAAV病毒粒子转导。
在一些实施方案中，本公开的rAAV病毒粒子介导的转导无论是在体外还是在体内都不会诱导小胶质细胞激活。
在一些实施方案中，本公开的rAAV病毒粒子携带编码CRISPR剂的异源核苷酸序列，用于体外和体内的基因组编辑，例如基因敲除。在一些实施方案中，本公开的rAAV病毒粒子携带编码向导RNA的异源核苷酸序列。
以下实施例旨在为普通技术人员提供完整的公开和描述，以指导如何制备和使用本文公开的变体AAV衣壳，并且不旨在限制本文公开的发明的范围。此外，下述实施例并不代表下述实验是全部或唯一的实验。
方法
小鼠。根据《中国实验动物管理条例》，动物的保健和使用经北京市国家生物科学研究所动物管理与使用委员会批准。Cx3cr1CreER小鼠(021160，B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm2.1(cre/ERT2)Litt/WganJ)、Cx3cr1GFP小鼠(005582，B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J)和Rosa26-LSL-Cas9小鼠(024857，B6；129-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*，-EGFP)Fezh/J)获得于Jackson实验室。用任意性别的成年小鼠进行体内病毒注射。出生第1天(P1)和成年C57BL/6N野生型小鼠来自北京Vital River实验动物技术公司。小鼠维持12/12小时的光周期(早上8点亮灯)，并随意提供食物和水。
质粒。用于衣壳筛选的质粒构建如下：pAAV-CMV-mScarlet-ΔCap-DIO-SV40pA质粒包含mScarlet表达盒，顺式Cap盒和DIO盒。mScarlet表达盒由CMV启动子、mScarlet编码序列和SV40pA序列组成。顺式Cap盒包括AAV5 p41启动子序列、AAV2 rep剪接序列和AAV9cap序列。修改AAV9 cap序列，引入XbaI和AgeI位点，用于后续文库生成。DIO表达盒包含SV40pA序列。根据原报道构建pCRII-9Cap-xE质粒和AAV2/9REP-AAP辅助质粒。为方便文库的构建，将野生型VP1的第449位、野生型VP2的第312位和/或野生型VP3的第247位氨基酸赖氨酸突变为精氨酸。
通过将pAAV-DIO-hChR2(H134R)-mCherry(Addgene 20297)的Ef1a启动子替换为pAAV-SFFV质粒(Addgene 46911)的SFFV启动子，构建pAAV-SFFV骨架。将mScarlet编码序列亚克隆到DIO表达盒中制备pAAV-SFFV-DIO-mScarlet质粒，或将其亚克隆到SFFV启动子后制备pAAV-SFFV-mScarlet质粒。为了制作pAAV-SFFV-DIO-jGCaMP8s质粒，合成了jGCaMP8s(Addgene 162380)编码序列并将其亚克隆到DIO表达盒中。将原质粒(Addgene 60231)上的hSyn-Cre-2A-GFP-KASH表达盒替换为DIO-mScarlet表达盒，构建pAAV-U6-sgRNA-SFFV-DIO-mScarlet质粒。从小鼠Brie CRISPR KO sgRNA文库(Addgene 73632)中选择靶向Tmem119(5′-GGGACCCCGTACCTTCAGCG)和Cd68(5′-atcctatacccaattcaggg)的sgRNA，随后合成并克隆到pAAV-U6-sgRNA-SFFV-DIO-mScarlet质粒中。利用web工具Benchling(https://benchling.com/crispr)设计靶向P2ry12的SaCas9 sgRNA(5’-CGGCTCCCAGTTTAGCATCACT)，随后根据SaCas9用户手册合成并克隆到原始pX601质粒45中。
为了尽量减少细菌生长过程中潜在的自发重组，使用Stbl3细胞系扩增含有DIO表达盒的AAV载体。
AAV包装。按照本领域中常用的协议包装AAV载体。简单地说，将AAV载体和AAV辅助质粒共转染HEK293T细胞。转染96小时后收获细胞，通过冻融循环和超声波将病毒颗粒从细胞中释放出来。用氯化铯密度梯度超离心纯化病毒，透析到磷酸盐缓冲盐水(PBS)缓冲液中。采用qPCR检测病毒滴度。
小鼠小胶质细胞的分离与培养。原代小鼠小胶质细胞来源于P1 C57BL/6野生型小鼠。将幼崽放在冰上1-2min，直到没有反应，然后用75％的酒精浸泡，小心地去掉头部。用干净的无菌剪刀收集脑，置于10cm的培养皿中，培养皿中含有10mL冰解离培养基[DMEM/F12(11330032,Gibco)，添加100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素(P/S,15140-122,Gibco)]。在解剖显微镜下用5号杜蒙钳切除脑膜。在解离介质中机械解离脑。解离的细胞通过40μm细胞过滤器过滤，在室温下以1000rpm离心10min。用培养基[DMEM/F12，添加10％胎牛血清(FBS，0099-141,Gibco)，5ng/mL粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF，PRP100489，Abbkine)和1％ P/S]重悬微球，以每T-75塑料培养瓶(Falcon)五个脑的密度镀上聚L-赖氨酸(P8920，Sigma-Aldrich)。分离后24小时更换培养基。之后每3天更换50％培养基。两周后，使用轨道振动器在37℃下以180转/分的速度摇瓶2小时，以收获小胶质细胞。培养的小胶质细胞保持在37℃ 5％ CO2的加湿培养箱中。
体外AAV转导。为了测试从体外筛选中鉴定出的候选衣壳，将小胶质细胞置于96孔细胞培养板(6005550，PerkinElmer)中。用候选衣壳包装的rAAV转导小胶质细胞，感染复数(MOI)为10,000。rAAV转导前在培养基中加入多柔比星(0.1μg/mL；D1515，Sigma-Aldrich)。2天后，将培养基改为TIC培养基[DMEM/F12，添加1％ P/S、2mM L-谷氨酰胺(25030-081，Gibco)、5mg/mL N-乙酰半胱氨酸(A9165，Sigma-Aldrich)、5mg/mL胰岛素(I0516，Sigma-Aldrich)、100mg/mL载铁蛋白(T1147，Sigma-Aldrich)、100ng/mL亚硒酸钠(S5261，Sigma-Aldrich)、2ng/mL重组小鼠TGF-β2(50153-M08H，Sino Biological)、100ng/mL重组小鼠IL-34(50055-M08H，Sino Biological)、1.5mg/mL胆固醇(羊毛，700000P，默克公司)]。rAAV转导5天后，用Opera Phenix高含量筛选系统(PerkinElmer)进行荧光成像和分析。
培养小胶质细胞RNA测序。对于M1小胶质细胞极化，小鼠原代小胶质细胞在TIC培养基中暴露于200ng/mL脂多糖(LPS，L4130，Sigma-Aldrich)24小时。对于M2小胶质细胞极化，小鼠原代小胶质细胞暴露于20ng/mL重组小鼠白细胞介素-4(214-14，PeproTech)中24小时。使用Trizol(15596018，Thermo Fisher Scientific)提取未经处理的对照组、LPS处理组、白细胞介素-4处理组和rAAV转导的小胶质细胞的总RNA，并在Illumina平台上进行单端75bp高通量测序。
体外筛选。本研究使用的引物详细序列列于表1。AAV-cMG.WPP和AAV-cMG.QRP通过筛选有效转导培养的小鼠小胶质细胞的AAV变体来鉴定。首先，使用CREATE协议将随机七聚体插入AAV9衣壳的每个衣壳蛋白VP 1-3的阅读框中，构建AAV衣壳文库。简单地说，以pCRII-9Cap-xE质粒为模板，用XF和7xMNN引物进行PCR生成文库片段。pAAV-CMV-mScarlet-ΔCap-DIO-SV40pA质粒经XbaI和AgeI线性化。将文库片段用Gibson组装成线性化的pAAV-CMV-mScarlet-ΔCap-DIO-SV40pA质粒。通过将AAV衣壳文库、AAV2/9REP-AAP辅助质粒和AAV辅助质粒共转染HEK293T细胞，将得到的文库包装成rAAV。大约10个文库rAAV被用来转导培养的小鼠小胶质细胞24小时。转导48小时后，使用Trizol回收成功转导培养的小胶质细胞的rAAV基因组。首先，用9CapF和SV40pA-R引物通过PCR从回收的AAV基因组中扩增出cap序列。纯化后的PCR产物作为模板，用XF和588i-R引物进行第二次PCR反应。然后将回收的cap序列组装回pAAV-CMV-mScarlet-ΔCap-DIO-SV40pA质粒中，并在培养的小鼠小胶质细胞中再次筛选。通过下一代测序(NGS)确定经过两轮筛选后高度富集的候选基因，并进行单独检测。变体的富集分数计算如下：
富集分数＝Log10((第2轮的归一化读计数)/(第1轮的归一化读计数))。
为了进一步鉴定在体外介导更有效的小胶质细胞转导的AAV-cMG.WPP和AAV-cMG.QRP变体，构建了AAV-cMG.WPP和AAV-cMG.QRP衣壳突变文库，其中插入的七聚体和AAV-cMG.WPP或AAV-cMG.QRP衣壳中的四个侧翼氨基酸被随机化(图1C和2D)。如上所述，在培养的小鼠小胶质细胞中筛选AAV-cMG.WPP和AAV-cMG.QRP衣壳突变文库。
体内筛选。为了鉴定在体内有效转导小鼠小胶质细胞的AAV-cMG.WPP和AAV-cMG.QRP变体，构建了AAV-cMG.WPP和AAV-cMG.QRP衣壳突变文库，其中插入的七聚体和AAV-cMG.WPP衣壳中的四个侧翼氨基酸被随机化(图1C和2D)。简单地说，以pCRII-9Cap-xE质粒为模板，使用XF和WPP-mut-R1-10引物进行10次分离PCR反应生成文库片段。将等量的10个PCR产物混合并使用Gibson组装组装到pAAV-CMV-mScarlet-ΔCap-DIO-SV40pA质粒中。如上所述，结果文库被包装到rAAV中。将AAV-cMG.WPP和AAV-cMG.QRP衣壳突变文库rAAV分别注射到3只Cx3cr1CreER小鼠的纹状体(800nL)和中脑(500nL)。病毒注射后连续5天注射他莫昔芬(腹腔注射，10mg/kg)。注射病毒后10天处死小鼠。解剖大脑，并使用Trizol回收体内成功转导细胞的rAAV基因组。利用9CapF和CDF引物选择性扩增Cre重组基因组中的cap序列。通过NGS鉴定了高富集的候选物质并进行了单独测试。变体的富集分数计算如下：
富集分数＝Log10((活体筛选样本的归一化读计数)/(AAV文库的归一化读计数))。
筛选NGS样品制备。文库rAAV用蛋白酶K在37℃下处理过夜。通过苯酚氯仿提取和乙醇沉淀获得AAV基因组。以100ng AAV基因组作为PCR模板。使用588i-F和588i-R引物扩增含有插入七聚体的cap片段。PCR产物进行纯化，作为第二次PCR的模板，使用1527和1532引物对扩增。最后进行PCR，为使用标准引物的后续NGS添加唯一索引。在提交NGS之前，用2％琼脂糖凝胶选择索引PCR产物的大小。
在体内选择中，使用9CapF和CDF引物选择性扩增Cre重组AAV基因组中的cap序列。包含插入七聚体的cap片段随后按如上所述进行扩增和索引。
普通手术和病毒注射。术前用戊巴比妥(腹腔注射，80mg/kg)麻醉小鼠，然后置于小鼠立体定向仪中。然后将病毒注射到小鼠的眶额皮质(OFC)、纹状体、中脑、海马体或丘脑。
使用微注射泵(Nanoliter 2010注射器，WPI)和Micro4控制器(WPI)进行注射。病毒以46nL/min的速度被递送到靶区。病毒注射后立即眶后注射多柔比星(150ng/g)。除涉及体内CRISPR/Cas9 KO的实验在病毒注射后至少3周进行外，所有后续实验均在病毒注射后至少2周进行。对于Cx3cr1CreER小鼠，在病毒注射后连续3天(如上所述连续5天进行体内筛选)腹腔注射他莫昔芬。
单细胞分离用于小胶质细胞单细胞RNA测序(scRNA-seq)。为了最大限度地减少体外激活，采用冷-机械离解方案。所有的程序都在冰上用冷缓冲液或在冷冻离心机中进行。小鼠被深度麻醉并灌注。快速取出脑，浸泡在Dounce缓冲液(含HEPES+DNase+RNase抑制剂的HBSS)中，切成更小的块。迅速将组织溶液转移到15ml Dounce均质机中，用宽松的杵轻轻均质约10次。将剩余的组织片沉淀，将含有细胞悬浮液的上清液收集到新的试管中。在沉积物组织中加入新的Dounce缓冲液，并重复另一轮均质。将收集到的细胞液离心、重悬，依次通过70μm和30μm的预湿细胞过滤器去除碎片。细胞再次离心，重悬于37％等渗Percoll(SIP)中。以Percoll梯度的HBSS/30％/37％(细胞)/70％富集小胶质细胞，200g离心20min，最小加速度，无制动。小心地收集30％-37％之间的间期细胞，洗涤，重悬于0.04％ BSA的杜氏磷酸盐缓冲液(Dulbecco's PBS)中。然后人工挑选细胞进行Smart-seq或通过10’基因组Chromium单细胞3'v3(10’Genomics Chromium Single Cell 3'v3)协议运行，随后在Illumina平台上进行测序。
基于Smart-seq2的scRNA-seq文库构建及测序。用口吸器在立体荧光显微镜下取牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)缓冲液[0.04％ BSA(0332，Amresco)的HBSS缓冲液]中的单个小胶质细胞。如前所述，使用改进的STRT-seq协议来构建单细胞RNA-seq文库，进行构建文库。简单地说，将细胞裂解，mRNA被释放到含有条形码逆转录引物的裂解缓冲液中。mRNA被逆转录成cDNA。cDNA预扩增后，将不同条形码标记的单细胞转录组汇总在一起。使用生物素修饰的引物进行另外4个PCR循环，以丰富cDNA的3'端。通过超声(Covaris)将扩增子随机剪切成约300bp的片段，并用Dynabeads MyOne链霉亲和素C1(65002，Invitrogen)纯化。纯化后的片段在Illumina平台上进行150bp对端读数测序。
测序数据处理和质量控制(QC)。10’Genomics平台生成的参考数据集通过“cellranger count”与预构建的GRCm38参考基因组对齐，并通过“cellranger aggr”命令(Cell Ranger v3.1.0)进行组合。用Seurat41(v4.0.2)软件加载得到的特征条形码矩阵文件，并按照以下QC标准进行筛选：去除线粒体RNA大于10％的细胞和表达300个以上特征的细胞，去除表达少于10个细胞的特征。在QC之后，使用默认参数运行Seurat工作流程，并使用UMAP嵌入的CellSelector函数，手动对显示Hexb58持续高表达的簇进行子集设置，从数据集中保留真正的小胶质细胞。
对于Smart-seq2数据集，采用uni-tools文档(https://umi-tools.readthedocs.io/en/latest/Single_cell_tutorial.html)中列出的协议，其中fastq文件使用uni-tools59解复用，与STAR60(v2.5.4b)对齐，并使用featureCounts61(Subread v1.6.3)量化。对“umi_tools白名单”过程进行了轻微修改，其中搜索100个细胞以获得扩展白名单，但通过仅保留在文库准备步骤中实际使用的细胞条形码来“清洗”白名单，这些细胞条形码被命名为“ground truth barcode”。在“umi_tools extract”步骤中，只保留那些包含“ground truth barcode”的读数，而删除带有适配器污染或重大测序错误的读数。计算特征细胞矩阵中的文库大小、特征数、线粒体RNA百分比和核糖体RNA百分比，以进行质量控制。使用scater62(v1.18.6)quickPerCellQC函数根据这四个指标识别和删除细胞异常值。通过检测mScarlet报告子转录物来确定rAAV在测序小胶质细胞中的转导。
小胶质细胞状态降维和识别的无监督分析。在10’参考数据集和Smart-seq2数据集上使用默认参数执行Seurat工作流程。计算两个数据集的标准PCA，并选择数据集的维数为40(dims＝1:40)。为了确定小胶质细胞的状态，首先将对照小鼠的小胶质细胞标记为“稳态”，将LPS处理小鼠的小胶质细胞标记为“反应态”。然后，使用FindTransferAnchors函数在PCA空间中找到查询(Smart-seq2)和参考(10’)数据集之间的转移锚，并使用MapQuery函数将查询数据投影到参考数据集上。将参考数据集和查询数据集进一步合并，并在合并后的数据集上重新运行UMAP降维，以获得UMAP空间中的“从头可视化”。
体内双光子成像。在8周龄时，将AAV-MG1.1或AAV-MG1.2衣壳包装的rAAV(1μL)注射到Cx3cr1CreER或Cx3cr1GFP小鼠初级体感皮层(S1)的II-IV层。两周后，小心移除病毒注射部位中心直径为3mm的圆形颅骨。将包括成像室的定制设计的钢头棒放置在开颅上，用氰基丙烯酸酯胶和牙科水泥固定在暴露的颅骨上。使小鼠从手术中回收一周。采用FluoViewFVMPE-RS显微镜(Olympus，25×，1.05NA水浸透镜)在硬脑膜下100-150μm处进行双光子成像。激光调谐到920nm，jGCaMP8s和GRABATP成像保持在50mW以下，GFP成像保持在40mW以下。小胶质细胞使用z堆栈(z-stacks)成像，每个z堆栈由16个图像组成，间隔2μm(总深度30μm)。使用StackReg插件纠正横向偏移。使用定制的Matlab脚本和GraphPad Prism软件进行数据量化。
为了监测LPS刺激后jGCaMP8s和GRABATP1.0荧光信号的变化，以1.5fps对636×636μm视场(512×512像素分辨率，1.24μm/像素)进行成像。首先进行10min延时成像(50个z堆栈)以记录基线荧光。然后腹腔注射LPS(10mg/kg)。注射LPS后立即进行另外的10min成像(jGCaMP8s成像6次，GRABATP1.0成像7次)，每隔50min进行一次成像。为每个堆栈创建了一个最大投影。人工选择小胶质细胞。在10min的成像过程中，小胶质细胞胞体的荧光强度为25个z堆栈的平均值。
为了监测激光消融后GRABATP1.0荧光信号的变化，以1.5fps对636×636μm视场(512×512像素分辨率)进行成像。聚焦成像场中心直径为15μm的圆形区域，施加约500mW的920nm激光脉冲(30ms/脉冲)诱导急性组织损伤。激光消融后立即进行40min延时成像(200z堆栈)。为每个堆栈创建了一个最大投影。人工选择小胶质细胞胞体计算荧光强度。
对于表达GFP的小胶质细胞对急性组织损伤的成像反应，以1.5fps对318×318μm视场(512×512像素分辨率，0.62μm/像素)进行成像。如上所述，诱导急性组织损伤。激光消融后立即、40min(对照小鼠；200z堆栈)或80min(P2ry12基因敲除小鼠；400个z堆栈)延时成像。按上述计算归一化的小胶质细胞反应。
免疫组织化学。用过量戊巴比妥麻醉小鼠，心内灌注PBS，然后灌注多聚甲醛(PFA，4％wt/vol于PBS中)。在室温下，将大脑解剖并在4％ PFA中固定至少4小时。然后将样品在30％蔗糖溶液中脱水。脑切片(30μm)在Cryostat显微切片机(Leica CM1950)上制备。切片用0.3％Triton X-100在PBS(PBST)中渗透，在室温下用2％ BSA的PBST阻断1小时。用一抗(抗-Iba1，1:500，019-19741，Wako；抗-TMEM119，1:1000，ab209064，Abcam；抗-CD68，1:500，ab53444，Abcam；抗-P2RY12，1:100，848002，BioLegend)孵育切片，4℃过夜。样品在PBST中洗涤三次，然后与荧光二抗(山羊抗兔-AF647，111-605-144，Jackson ImmunoResearch；山羊抗兔-AF488，111-545-003，Jackson ImmunoResearch；山羊抗大鼠-Cy5，112-175-143，Jackson ImmunoResearch)室温保存2小时。
对于培养的小胶质细胞，首先用冷PBS洗涤细胞，然后在室温下用4％ PFA固定10min。在PBS中再次洗涤后，将细胞在PBST中通透化，并在室温下用2％ BSA的PBST阻断20min。然后将细胞与抗体(抗-Iba1，1:500，019-19741，Wako)在室温下孵育2小时。细胞在PBST中洗涤3次，然后与荧光二抗(山羊抗兔-AF488，111-545-003，JacksonImmunoResearch)在室温下孵育1小时。
固定组织的图像采集与分析。在蔡司LSM880共聚焦扫描显微镜上进行共聚焦显微镜观察。对于载玻片扫描成像，使用具有10’物镜的Olympus VS120虚拟显微镜载玻片扫描系统进行宽视场荧光成像。使用Imaris进行细胞计数。为了评估多柔比星给药对mScarlet表达的影响，用Imaris测量了以病毒注射部位为中心的9个脑切片纹状体中标记细胞的平均荧光强度。为了量化Tmem119 sgRNA的敲除效率，使用ImageJ中的“Threshold”函数计算覆盖背纹状体的1.5mm×1.5mm区域内信号阳性像素的百分比。为了量化P2ry12 sgRNA的敲除效率，使用ImageJ中的“Threshold”函数计算覆盖S1皮质的1mm×1mm面积上信号阳性像素的百分比。在Cd68敲除实验中，使用Imaris在覆盖背纹状体的1.5mm×1.5mm区域内量化Cd68阳性细胞的数量。
实施例
实施例1.体外筛选衣壳文库
将野生型AAV9衣壳用作生成衣壳文库的起点，其中每个AAV9衣壳变体在AAV9 VP1蛋白的第588位氨基酸和第589位氨基酸之间含有随机的7个氨基酸插入(图1A)。该文库被包装成rAAV，并在培养的小鼠小胶质细胞中连续筛选两轮(图1A和2A)。用衣壳文库rAAV对培养的小鼠小胶质细胞进行转导，并回收了成功介导转导的衣壳变体。然后，将回收的衣壳变体包装成rAAV，并在培养的小鼠小胶质细胞中再次筛选。通过下一代测序，鉴定了经过两轮筛选后高度富集的衣壳变体(图1B和2B)。
两种衣壳变体，一种含有“WPPKTTS”七聚体插入(以下简称AAV-cMG.WPP；图1B)，一种含有“QRPPREP”七聚体插入(以下简称AAV-cMG.QRP；图2B)，与测试的其他候选物相比，培养的小胶质细胞的转导明显更高。AAV-cMG.WPP的VP1蛋白具有如SEQ ID NO.:7所示的氨基酸序列，以及AAV-cMG.QRP的VP1蛋白具有如SEQ ID NO.:8所示的氨基酸序列。然后，分别用候选衣壳变体将单链mScarlet报告子载体包装成rAAV，并转导到培养的小鼠小胶质细胞中。将这些衣壳变体的转导能力与亲本AAV9衣壳以及三种已报道可转导培养的小鼠小胶质细胞的AAV衣壳[AAV5、AAV8和带有Y731F/Y705F/T492V三重突变(AAV6TM)28的AAV6]进行了比较。
在第二轮筛选中，AAV-cMG.WPP富集超过170倍，占总回收变体的12.91％(图1B)。与AAV5(～12％)、AAV6TM(～3％)、AAV8(～34％)或AAV9(～10％)衣壳相比，AAV-cMG.WPP(～75％)的转导率显著提高(图3A-C)。与AAV5、AAV6TM、AAV8或AAV9衣壳相比，AAV-cMG.WPP还能显著增强mScarlet的表达(图3A和C)。
在第二轮筛选中，AAV-cMG.QRP富集约400倍，占总回收变体的5.05％(图2B)。与AAV5、AAV6TM、AAV8或AAV9衣壳相比，AAV-cMG.QRP具有明显更高的转导率和更强的mScarlet表达(图2C、E、G)。
实施例2.检验AAV-cMG.WPP对小胶质细胞表型的影响
外部刺激可诱导小胶质细胞进入反应态或替代激活态。为了检验AAV-cMG.WPP介导的转导是否可以触发小胶质细胞表型变化，对从四种不同样品中获得的转录组数据进行主成分分析：未转导的对照(稳态)，LPS处理(反应态)，白细胞介素-4处理(替代激活态)和AAV-cMG.WPP转导的培养的小鼠小胶质细胞(图3D)。AAV-cMG.WPP转导的小胶质细胞向对照组未转导的小胶质细胞聚集，远离LPS处理或白介素-4处理的小胶质细胞(图3D)。进一步的差异基因表达分析也表明AAV-cMG.WPP转导在培养的小胶质细胞中不会诱导促炎途径(图3E)。因此，这些结果证明了AAV-MG.WPP在介导培养的小胶质细胞中安全转基因递送的实用性。
实施例3.进一步筛选AAV-cMG.WPP半随机突变衣壳文库用于体内转导
通过对AAV-cMG.WPP中插入的七聚体及其邻近的4个氨基酸进行半随机突变，生成了一个额外的衣壳文库(图1C)。将这个新的文库包装成rAAV，并通过将文库rAAV注射到Cx3cr1CreER小鼠的大脑中进行体内筛选。采用CREATE策略从Cre重组的AAV基因组(即在体内成功转导小胶质细胞的rAAV基因组)中选择性地回收衣壳变体。经过两轮筛选，鉴定出两种高度富集的衣壳变体(图1D)，它们都包含AAV-cMG.WPP的第587-589位氨基酸位置的突变。第一种变体包括第587-589位的氨基酸序列“LMT”，占总回收变体的13.8％(图1D)。第二种变体包括第587-589位的氨基酸序列“ATE”，占总回收变体的5.7％(图1D)。这两种AAV-cMG.WPP衣壳变体分别命名为AAV-MG1.1和AAV-MG1.2。AAV-MG1.1的VP1蛋白具有如SEQ IDNO.:10所示的氨基酸序列。AAV-MG1.2的VP1蛋白具有如SEQ ID NO.:11所示的氨基酸序列。
另外四种AAV-cMG.WPP变体也被鉴定能够在体内转导小胶质细胞，并在Cx3cr1CreER小鼠纹状体中诱导强烈而广泛的mScarlet表达(图12C-F)。第一种变体，AAV-MG.PTS，在AAV-cMG.WPP的第589-591位包括氨基酸序列“PTS”(图12C)。第二种变体，AAV-MG.LMV，在AAV-cMG.WPP的第589-591位包括氨基酸序列“LMV”(图12D)。第三种变体，AAV-MG.WTD，在AAV-cMG.WPP的第589-591位包括氨基酸序列“WTD”(图12E)。第四种变体，AAV-MG.VLS，在AAV-cMG.WPP的第588-590位包括氨基酸序列“VLS”(图12F)。AAV-MG.PTS的VP1蛋白具有如SEQ ID NO.:59所示的氨基酸序列。AAV-MG.LMV的VP1蛋白具有如SEQ ID NO.:62所示的氨基酸序列。AAV-MG.WTD的VP1蛋白具有如SEQ ID NO.:65所示的氨基酸序列。AAV-MG.VLS的VP1蛋白具有如SEQ ID NO.:68所示的氨基酸序列。
实施例4.检验AAV-MG1.1和AAV-MG1.2在体内转导小胶质细胞的能力
使用AAV-MG1.1和AAV-MG1.2将单链Cre依赖性mScarlet报告子载体包装成rAAV(AAV-MG1.1/1.2-SFFV-DIO-mScarlet)。然后，将这些rAAV注射到Cx3cr1CreER小鼠的大脑中，并对相应的AAV-cMG.WPP rAAV进行评估。两种AAV-MG在所有测试的大脑区域(眶额皮质、纹状体、中脑、海马体和丘脑)中都驱动了强烈而广泛的mScarlet表达；图1E、4A、4B和5A)。
进一步研究发现，利用离子钙结合接头分子1(Iba1)的免疫反应性作为小胶质细胞的标记物，mScarlet在小胶质细胞中的表达受到限制，并且几乎所有注射部位核心区域的小胶质细胞都被标记(图1F、5C和5D)。两种AAV-MG的体内小胶质转导效率也远高于亲本AAV9衣壳，也远高于AAV5和AAV6TM衣壳。在Cx3cr1CreER小鼠中，AAV9、AAV5或AAV6TM rAAV只实现了小胶质细胞的稀疏和模糊标记(图5E)。
实施例5.检验拓扑异构酶抑制剂对AAV-MG体内小胶质细胞转导效率的影响
先前的研究已经证实，使用小分子药物抑制拓扑异构酶和蛋白酶体可以促进rAAV在体外和体内的转导。因此，检验这种方法是否可以进一步提高AAV-MG在体内的小胶质细胞转导效率。FDA批准的拓扑异构酶抑制剂多柔比星(doxorubicin)已被证明可以增加体内神经元中rAAV的表达水平。在Cx3cr1CreER小鼠脑内立体定向注射AAV-MG1.1/1.2-SFFV-DIO-mScarlet后，立即通过眼眶后注射给予多柔比星。对于两种AAV-MG，多柔比星给药显著提高了小胶质细胞中mScarlet的表达水平，但没有增加mScarlet标记的小胶质细胞的数量(图1E、5A和5B)。这些结果证明了利用药理学方法进一步增强AAV介导的转基因在小胶质细胞中的表达的可能性。
实施例6.检验AAV-MG介导的转导对小胶质细胞体内活化的影响
在确定AAV-MG在体内介导小胶质细胞的有效转导后，检验AAV-MG介导的转导是否会引发脑内小胶质细胞表型改变。将AAV-MG1.1/1.2-SFFV-DIO-mScarlet注射到Cx3cr1CreER小鼠纹状体两周后，选择mScarlet+和mScarlet-小胶质细胞，采用改进的Smart-seq2方案进行单细胞RNA测序(scRNA-seq)。使用均匀流形近似和投影(UMAP)对小胶质细胞进行投影表明，未转导的和转导的小胶质细胞形成均质簇(图6A和7A)。此外，在未转导的和转导的小胶质细胞之间，稳态小胶质细胞标记基因或反应态小胶质细胞标记基因的表达没有差异(图6B)。利用在Seurat中实现的标签转移策略，将Smart-seq2数据集中的小胶质细胞投射到稳态和反应态小胶质细胞的参考10×数据集(图7B-D)，并重新计算合并的UMAP投影来表示来自两个数据集的小胶质细胞状态(图6C)。Smart-seq2数据集中的大多数小胶质细胞位于稳态小胶质细胞簇内(图6C)。这些结果支持AAV-MG介导的转导在体内不会诱导小胶质细胞活化。
实施例7.AAV-MG在小胶质细胞内的递送效率分析
在本实施例中，测试了AAV-MG是否能有效地将各种遗传载荷递送到小胶质细胞中。在小胶质细胞中表达两种新开发的基因编码荧光传感器，以检查小胶质细胞对外周内毒素挑战的生理反应(图8A)。首先，使用AAV-MG1.2包装携带最新一代钙指示剂jGCaMP8s(AAV-MG1.2-SFFV-DIO-GCaMP8s)的单链Cre依赖性AAV载体。将rAAV注射到Cx3cr1CreER小鼠的初级体感(S1)皮层。允许病毒转基因表达两周后，注射10mg/kg LPS(i.p.)诱导全身炎症。通过双光子成像跟踪小胶质细胞胞体中的Ca2+信号(图8A)。结果显示，在LPS注射后1小时，Ca2+信号显著增加(图8B和8C)。这种LPS诱导的细胞内Ca2+持续升高，并在注射后3小时达到峰值，然后开始下降(图8B和8C)。Ca2+信号的增加不是由腹腔注射过程本身引起的，因为腹腔注射生理盐水并没有导致显著的jGCaMP8s荧光变化(图8B和8C)。
进一步，使用AAV-MG1.2(AAV-MG1.2-SFFV-DIO-GRABATP1.0)包装单链Cre依赖性AAV载体，包含新开发的ATP荧光传感器GRABATP1.0。GRABATP1.0传感器在Cx3cr1CreER小鼠S1皮质小胶质细胞中表达，并通过体内双光子成像监测GRAB荧光信号。腹腔注射10mg/kg LPS后，检测小胶质细胞胞体外ATP的变化(图8A)。与上述GCaMP成像实验类似，LPS注射后1小时，GRAB荧光信号显著增加(图8D和8E)。注射后2小时荧光信号趋于稳定，注射后6小时荧光信号保持高水平(图8D和8E)。结果表明，LPS注射后小胶质细胞胞体内ATP信号的持续增加与星形胶质细胞中观察到的LPS诱导的ATP闪烁不同，表明细胞在外周内毒素刺激后具有特异性ATP感应。经腹腔注射生理盐水后，未见明显信号改变(图8D和8E)，再次表明升高的GRAB荧光信号不是归因于腹腔注射程序。
还检验了急性组织损伤时小胶质细胞胞体的胞外ATP的变化。采用短暂的激光消融来诱导局部组织损伤，导致GRAB荧光信号立即增加，持续增加长达40min(图9)。
实施例8.AAV-MG对小胶质细胞基因组编辑能力的分析
本实施例探讨了AAV-MG在小胶质细胞基因组编辑中的实用性。将Cre依赖性Rosa26 Cas9报告子小鼠(Rosa26-LSL-Cas9)与Cx3cr1CreER小鼠杂交。他莫昔芬注射液诱导小胶质细胞中化脓性链球菌Cas9(SpCas9)的表达。AAV-MG用于包装表达sgRNA的单链AAV载体。选择在脑小胶质细胞中选择性表达的两个基因Tmem119和Cd68作为编辑靶点(AAV-MG1.1-sgRNA-Tmem119和AAV-MG1.2-sgRNA-Cd68)。携带靶向LacZ的sgRNA的rAAV作为对照病毒(AAV-MG1.1/1.2-sgRNA-LacZ)。将rAAV注入纹状体4周后，通过免疫染色检验其敲除效果。对于这两个靶基因，在注射敲除rAAV的小鼠大脑纹状体中，其编码蛋白的免疫荧光信号显著降低，而在注射对照rAAV的小鼠大脑中并非如此(图10A、10B、11A和11B)。通过单次纹状体内注射AAV，沿前后轴在背纹状体的大片区域内实现了靶基因的有效敲除(图10A、10B、11A和11B)。这些结果表明，将Cas9转基因小鼠与AAV-MG介导的sgRNA递送相结合，可以以区域特异性的方式对小胶质细胞进行体内基因组编辑。
实施例9.证明AAV-MG在体内直接编辑小胶质细胞基因组的能力
为了进一步证明在体内直接进行小胶质细胞基因组编辑，利用AAV-MG1.2在小胶质细胞中表达来自单个AAV载体(AAV-MG1.2-CMV-SaCas9-U6-sgRNA)的小型化Cas9(金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)Cas9，SaCas9)和sgRNA。将sgRNA设计用于靶向小胶质细胞稳态标记基因P2ry12，该基因是细胞外多核苷酸激活小胶质细胞所必需的。从缺失的免疫染色信号可以看出，在Cx3cr1GFP转基因小鼠的S1皮质中，单次注射这种rAAV可以大面积敲除P2ry12基因，而Cx3cr1GFP转基因小鼠在小胶质细胞中选择性表达GFP(图11C和11D)。已知小胶质细胞免疫激活可下调P2ry12的表达。为了排除观察到的P2ry12敲除是由于rAAV触发的小胶质细胞激活所致的可能性，使用只携带SaCas9而不携带sgRNA的对照rAAV(AAV-MG1.2-CMV-SaCas9)。结果表明，不含sgRNA的SaCas9表达不影响内源性P2ry12的表达(图11C和11D)，表明AAV-MG1.2介导的转导不会诱导小胶质细胞激活，并且SaCas9基因敲除需要特定的sgRNA。
实施例10.检验AAV-MG1.2介导的P2ry12基因敲除的生理后果
为了检验AAV-MG1.2介导的P2ry12基因敲除的生理后果，将AAV-MG1.2-CMV-SaCas9-U6-sgRNA-P2ry12或AAV-MG1.2-CMV-SaCas9载体注射到Cx3cr1GFP转基因小鼠的S1皮质。四周后，通过S1皮质的体内双光子成像跟踪组织损伤的小胶质细胞形态学反应(图10C)。对注射了对照rAAV的小鼠脑局灶性激光消融诱导小胶质细胞突起向损伤部位迅速延伸和募集，并在消融后30-40min达到峰值(图10D和10E)。与之形成鲜明对比的是，注射P2ry12敲除rAAV的小鼠脑内小胶质细胞的趋化反应显著降低：小胶质细胞反应仅在局部激光消融后约30min开始，并在约80min后达到峰值(图10D和10E)。基于AAV的基因敲除方法规避了P2ry12缺乏在发育过程中的潜在混淆效应，因此这些结果进一步支持P2ry12在引导小胶质细胞向皮质损伤部位的定向分支延伸中的作用。
实施例11.AAV-cMG.QRP半随机突变衣壳文库的进一步筛选
为了进一步提高AAV-cMG.QRP的转导效率。在培养的小鼠小胶质细胞中，对AAV-cMG.QRP进行了另一轮定向进化(图2D)。首先，通过半随机突变插入的七聚体和AAV-cMG.QRP中相邻的4个氨基酸，生成了一个额外的衣壳文库(图2D)。将这个新的文库包装成rAAV，并在培养的小鼠小胶质细胞中筛选。经过一轮筛选，鉴定出一个高度富集的衣壳变体，该变体包含AAV-cMG.QRP的第594-596位氨基酸的突变(图2D)。该变体包括第594-596位的氨基酸序列“PAD”，占总回收变体的0.79％(图2D)。这种变体被命名为AAV-cMG。与AAV5、AAV6TM、AAV8、AAV9或AAV-cMG.QRP衣壳相比，AAV-cMG具有明显更高的转导率和更强的mScarlet表达(图2E、2F和2G)。同样，多柔比星也显著提高了培养的小鼠小胶质细胞中AAV-cMG的mSaclet表达水平(图2H和2I)。AAV-cMG的VP1蛋白具有如SEQ ID NO.:9所示的氨基酸序列。
在Cx3cr1CreER小鼠大脑中筛选AAV-cMG.QRP突变文库。鉴定了两种能够在体内转导小胶质细胞的变体。第一种变体，AAV-MG.TAF，包括AAV-cMG.QRP的第589-591位的氨基酸序列“TAF”(图12A)。第二种变体，AAV-MG.APA，包括AAV-cMG.QRP的第587-589位的氨基酸序列“APA”(图12B)。AAV-MG.TAF的VP1蛋白具有如SEQ ID NO.:53所示的氨基酸序列，AAV-MG.APA的VP1蛋白具有如SEQ ID NO.:56所示的氨基酸序列。

Claims (20)

1.一种重组腺相关病毒(rAAV)衣壳蛋白，包括11个连续氨基酸X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10Q的氨基酸序列，其中
X1选自Ala或Leu；
X2选自Gln、Met、Thr、Val或Pro；
X3选自Trp、Thr、Glu、Pro、Leu、Ala或Gln；
X4选自Pro、Thr、Met、Ser、Arg或Ala；
X5选自Pro、Ser、Val、Asp或Phe；
X6选自Lys或Pro；
X7选自Thr或Arg；
X8选自Thr、Glu或Pro；
X9选自Ser、Pro或Ala；和
X10选自Ala或Asp。
2.根据权利要求1所述的rAAV衣壳蛋白，其中X6是Lys；X7是Thr；X8是Thr；X9是Ser；和/或X10是Ala。
3.根据权利要求2所述的rAAV衣壳蛋白，其中X1选自Ala或Leu；X2选自Gln、Met、Thr或Val；X3选自Trp、Thr、Glu、Pro或Leu；X4选自Pro、Thr、Met或Ser；和/或X5选自Ser、Val、Asp或Pro。
4.根据权利要求2或3所述的rAAV衣壳蛋白，其中
X1是Ala、X2是Gln、X3是Trp、X4是Pro、X5是Pro；
X1是Leu、X2是Met、X3是Thr、X4是Pro、X5是Pro；
X1是Ala、X2是Thr；X3是Glu、X4是Pro、X5是Pro；
X1是Ala、X2是Gln；X3是Pro、X4是Thr、X5是Ser；
X1是Ala、X2是Gln；X3是Leu、X4是Met、X5是Val；
X1是Ala、X2是Gln；X3是Trp、X4是Thr、X5是Asp；或
X1是Ala、X2是Val；X3是Leu、X4是Ser、X5是Pro。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的rAAV衣壳蛋白，其中所述衣壳蛋白包括选自如下的氨基酸序列：AQWPPKTTSAQ(SEQ ID NO.:1)、LMTPPKTTSAQ(SEQ ID NO.:2)、ATEPPKTTSAQ(SEQ ID NO.:3)、AQPTSKTTSAQ(SEQ ID NO.:71)、AQLMVKTTSAQ(SEQ ID NO.:72)、AQWTDKTTSAQ(SEQ ID NO.:73)和AVLSPKTTSAQ(SEQ ID NO.:74)。
6.根据权利要求1所述的rAAV衣壳蛋白，其中X1是Ala；X6是Pro；和/或X7是Arg。
7.根据权利要求6所述的rAAV衣壳蛋白，其中X2选自Gln或Pro；X3选自Thr、Ala或Gln；X4选自Arg或Ala；X5选自Pro或Phe；X8选自Glu或Pro；X9选自Pro或Ala；和/或X10选自Ala或Asp。
8.根据权利要求6或7所述的rAAV衣壳蛋白，其中
X2是Gln、X3是Gln、X4是Arg、X5是Pro、X8是Glu、X9是Pro、X10是Ala；
X2是Gln、X3是Gln、X4是Arg、X5是Pro、X8是Pro、X9是Ala、X10是Asp；
X2是Gln、X3是Thr、X4是Ala、X5是Phe、X8是Glu、X9是Pro、X10是Ala；或
X2是Pro、X3是Ala、X4是Arg、X5是Pro、X8是Glu、X9是Pro、X10是Ala。
9.根据权利要求6-8中任一项所述的rAAV衣壳蛋白，其中所述衣壳蛋白包括选自如下的氨基酸序列：AQQRPPREPAQ(SEQ ID NO.:4)、AQQRPPRPADQ(SEQ ID NO.:5)、AQTAFPREPAQ(SEQ ID NO.:75)和APARPPREPAQ(SEQ ID NO.:76)。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的rAAV衣壳蛋白，其中与野生型衣壳蛋白相比，所述11个连续氨基酸X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10Q的氨基酸序列插入GH-环中，优选地插入AAV9的野生型VP1的第588位氨基酸和第589位氨基酸之间、野生型VP2的第451位氨基酸和第452位氨基酸之间和/或野生型VP3的第386位氨基酸和第387位氨基酸之间，或与AAV9不同的另一AAV血清型的衣壳蛋白的相应位置。
11.多核苷酸序列，其编码权利要求1-10中任一项所述的rAAV衣壳蛋白。
12.重组腺相关病毒(rAAV)载体，包括权利要求1-10中任一项所述的rAAV衣壳蛋白。
13.根据权利要求12所述的rAAV载体，还包括异源多核苷酸序列，其中所述异源多核苷酸序列优选地编码异源多肽、非编码RNA或CRISPR剂。
14.根据权利要求13所述的rAAV载体，其中所述异源多核苷酸序列编码miRNA、siRNA、piRNA、lncRNA或向导RNA。
15.药物组合物，包括权利要求12-14中任一项所述的rAAV载体，以及一种或多种药学上可接受的载体。
16.用于将权利要求12-14中任一项所述的rAAV载体递送到靶细胞的方法，包括使所述靶细胞与所述rAAV载体接触。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述靶细胞是体外或体内的小胶质细胞，优选地存在拓扑异构酶、蛋白酶体或非同源末端连接的抑制剂或DNA损伤诱导剂，其中所述抑制剂更优选地选自多柔比星、硼替佐米、依托泊苷、替尼泊苷、香兰素和博来霉素。
18.宿主细胞，包括权利要求12-14中任一项所述的rAAV载体。
19.用于治疗神经系统疾病的方法，包括向有需要的受试者施用治疗有效量的权利要求15所述的药物组合物，，所述神经系统疾病是与小胶质细胞相关的疾病。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述神经系统疾病包括阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、肌萎缩性侧索硬化症、脑白质病、胶质瘤和非典型畸胎瘤/横纹肌样瘤。
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