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CN120167331A - 聚合两个抗病基因培育抗灰斑病玉米自交系的方法及其应用 - Google Patents

聚合两个抗病基因培育抗灰斑病玉米自交系的方法及其应用 Download PDF

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CN120167331A
CN120167331A CN202311765282.XA CN202311765282A CN120167331A CN 120167331 A CN120167331 A CN 120167331A CN 202311765282 A CN202311765282 A CN 202311765282A CN 120167331 A CN120167331 A CN 120167331A
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CN
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qrgls
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genes
homozygous
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Application number
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徐明良
朱芒
钟涛
番兴明
李茜
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China Agricultural University
China National Seed Group Co Ltd
Original Assignee
China Agricultural University
China National Seed Group Co Ltd
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Abstract

本申请提供一种培育抗灰斑病玉米自交系的方法，通过将两个抗灰斑病位点qRgls1和qRgls2的抗病基因导入感病玉米植株中，得到在两个抗病位点同时含有纯合抗病基因且抗病性显著增强的玉米新种质。本申请还提供通过所述方法得到的抗灰斑病玉米自交系的植株或其部分，所述植株或其部分在qRgls1和qRgls2两个位点同时携带纯合抗病基因。

Description

聚合两个抗病基因培育抗灰斑病玉米自交系的方法及其应用
技术领域
本发明属于农业技术领域，特别是涉及作物抗病育种领域中抗病玉米自交系的选育方法，具体涉及聚合两个抗灰斑病基因的玉米自交系选育方法及其应用。
背景技术
玉米是当今世界最重要的粮食、饲料、工业原料和能源作物。玉米灰斑病是一种世界性的玉米叶部真菌性病害，由玉蜀黍尾孢菌(Cercospora zeae-maydis)和玉米尾孢菌(Cercospora zeina)引起，严重影响玉米的产量和品质。灰斑病于1991年首次在我国辽宁省丹东市发现，之后在吉林、河北、甘肃、湖北及云南等地均有报道。近年来，灰斑病已经成为我国玉米生产中主要的叶部病害之一，其中灰斑病在东北春玉米产区和西南玉米产区尤为严重。
灰斑病病斑首先出现在植株的下部叶片，然后逐渐向上部叶片侵染。发病初期，病斑呈水渍状褪绿斑，之后扩展成灰褐色。典型的灰斑病病斑两端平齐近似矩形，与叶脉平行分布。发病严重时，病斑会扩展成片，导致叶片枯萎，甚至导致整株玉米枯死。玉米灰斑病的发生一般会导致玉米减产10-30％，发病严重时减产可达60％甚至绝产，对我国玉米生产构成了严重的威胁。
根据已有的报道，玉米对灰斑病的抗性属于数量遗传抗性，由多个微效或中等效应的位点控制，且以加性效应为主。截至目前，仅有少数抗灰斑病基因被克隆：其中一个抗灰斑病基因是ZmCCoAOMT2，参与苯丙烷类代谢和木质素合成，介导玉米对灰斑病的抗性；另一个抗灰斑病基因来源于大刍草、控制拟病斑产生的基因ZmMM1，调控细胞死亡，从而显示对灰斑病的抗性；与抗灰斑病相关的基因还包括ZmPK(参见中国发明专利号ZL201910160206.3，对应的授权公告号CN109705202B)、ZmDi19(参见CN114262369A)、ZmHRL(参见CN114410651A)和ZmPMT1(参见CN114907461A)。除此之外，大量关于抗灰斑病位点的研究基本处于初定位阶段，少数进行了精细定位。
目前生产中控制玉米病害的手段包括错期播种、强化田间管理、化学防治(例如，喷施杀真菌剂)以及培育抗病品种等。其中，错期播种容易导致土地在一定时间内无法被其它作物利用，造成土地资源浪费；田间管理和使用杀真菌剂不仅会增加农业生产的投入成本，而且可能危害到生态环境安全，且化学防治手段效果不明显。因此，培育抗病品种是控制灰斑病最经济有效的途径。然而，目前培育成功的抗灰斑病玉米品种仍然较少，而且高抗灰斑病品种的培育很大程度上依赖于对致病机理和抗性遗传的深入研究，需要进一步鉴定抗灰斑病的基因，解析抗灰斑病的遗传基础。开发与抗病位点紧密连锁的分子标记，通过分子标记辅助改良能够快速、有目的地将抗病位点导入骨干自交系中，从而提高改良系对病害的抗性。Zhao等(Marker-assisted introgression of qHSR1 to improve maizeresistance to head smut.Mol Breeding(2012)30:1077-1088；doi:10.1007/s11032-011-9694-3，https://link.springer.com/article/10.1007/s11032-011-9694-3)通过分子标记回交改良将抗丝黑穗病的位点qHSR1导入10个自交系中，能够显著增强玉米对丝黑穗病的抗性。Li等(Evaluation of ZmCCT haplotypes for genetic improvement ofmaize hybrids.Theor Appl Genet(2017)130:2587-2600；doi:10.1007/s00122-017-2978-1，https://link.springer.com/article/10.1007/s00122-017-2978-1)利用分子标记辅助选择将9个不同单倍型的抗病ZmCCT基因导入7个优良自交系中，获得的63个改良玉米材料，对茎腐病均具有较好的抗性。然而，目前在本领域中尚不了解能否通过分子标记聚合两个或更多个抗病位点来增强玉米对同一病害的抗性，对于这样的技术也未有报道。因此，本领域对于培育抗灰斑病玉米品种的方法存在持续的需求。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种培育抗病害(例如，抗灰斑病)玉米自交系的方法，该方法是一种安全的杂交方法，旨在通过分子标记聚合两个或更多个抗病位点来增强玉米对同一病害(例如，灰斑病)的抗性。
本发明的另一个目的是提供一种抗灰斑病玉米自交系，其具有良好的灰斑病抗性，种植该玉米自交系能够减少玉米植株感染灰斑病的概率，提高玉米的产量和品质。
本发明采用分子标记辅助选择技术，快速实现了两个抗灰斑病位点qRgls1(功能基因为ZmWAK-RLK，参见中国发明专利申请号201910140479.1，对应的公开公告号CN109705200A)和qRgls2(功能基因为ZmPK，参见中国发明专利号ZL201910160206.3，对应的授权公告号CN109705202B)的聚合，创制了一种对灰斑病抗性显著增强且稳定遗传的玉米新种质，为玉米抗病育种提供了重要的种质资源。
已知与玉米灰斑病抗性有关的一个主效QTL(Quantitative Trait Loci)位点qRgls1位于玉米第8号染色体，其抗病基因序列来源于玉米抗病材料Y32(下文也称为“热带抗灰斑病材料Y32”或“热带抗病材料Y32”)，关于携带qRgls1的玉米抗病材料Y32的信息可参见Zhang，Y.，Xu，L.，Fan，X.，Tan，J.，Chen，W.，&Xu，M.(2012)QTL mapping ofresistance to gray leaf spot in maize.Theoretical and applied genetics，125(8)，1797-1808。已知与玉米灰斑病抗性有关的另一个主效QTL位点qRgls2位于玉米第5号染色体，其抗病基因序列也来源于抗病材料Y32，关于携带qRgls2的玉米抗病材料Y32的信息可参见Xu,L.,Zhang,Y.,Shao,S.,Chen,W.,Tan,J.,Zhu,M.,&Xu,M.，(2014)High-resolution mapping and characterization of qRgls2,a major quantitative traitlocus involved in maize resistance to gray leaf spot.BMC plant biology,14(1),230。
具体而言，玉米抗病材料Y32(也称为“热带抗灰斑病材料Y32”或“热带抗病材料Y32”)是指玉米热带自交系Y32，其是从泰国热带玉米Suwan1群体选育出的抗灰斑病玉米材料。研究已确定玉米抗病材料Y32同时携带两个与玉米灰斑病抗性有关的主效QTL位点：qRgls1和qRgls2。然而，玉米抗病材料Y32适应热带气候，通常不适合大规模种植(尤其是不适合在温带区域种植)，目前主要作为重要的种质资源、用于玉米育种。
相对于玉米抗病材料Y32，玉米的温带感病材料Q11在qRgls1和qRgls2两个位点上均携带感病基因序列，详见上述两篇参考文献。温带感病材料Q11与热带抗病材料Y32来源不同，且高度易感灰斑病，有利于组配分离群体挖掘抗灰斑病位点，通过与热带抗病材料组配抗病性状分离群体，用于QTL定位和抗病机理分析。
温带感病材料Q11是一种对玉米灰斑病敏感的玉米材料，容易受灰斑病侵害。相对于玉米抗病材料Y32而言，温带感病材料Q11在抗灰斑病等效位点qRgls1和qRgls2对应的功能基因被称作“感病基因”。
在第一方面中，本发明提供一种培育抗灰斑病玉米自交系的方法，所述方法包括：
(1)以热带抗灰斑病材料Y32作为供体亲本(父本)与作为受体亲本的温带感病材料Q11(母本)进行杂交、回交，并进行以下两种选择：
(i)从回交后代中选择qRgls1位点杂合的单株作为父本与Q11杂交继续进行下一轮回交，回交6次直到BC7F1代，其中BC7F1代材料的遗传背景基本回复到轮回亲本Q11，选择qRgls1位点杂合的单株进行自交，得到在qRgls1位点携带纯合抗病基因的改良材料Q11qRgls1和携带感病基因的对照材料Q11CK-1；
(ii)从回交后代中选择qRgls2位点杂合的单株作为父本与Q11杂交继续进行下一轮回交，回交6次直到BC7F1代，其中BC7F1代材料的遗传背景基本回复到轮回亲本Q11，选择qRgls2位点杂合的单株进行自交，得到在qRgls2位点携带纯合抗病基因的改良材料Q11qRgls2和携带感病基因的对照材料Q11CK-2；
(2)将获得的改良材料Q11qRgls1与获得的改良材料Q11qRgls2进行杂交然后将杂交后代自交，得到在qRgls1和qRgls2位点同时携带纯合抗病基因的改良材料Q11qRgls1/2以及含有两个感病基因的对照材料Q11CK，
其中在qRgls1和qRgls2位点同时携带纯合抗病基因的改良材料Q11qRgls1/2为抗灰斑病玉米自交系材料，并且所述抗病基因为ZmWAK-RLK和ZmPK。
其中，初始杂交以热带抗灰斑病材料Y32作为父本，以温带感病材料Q11作为母本，并且以温带感病材料Q11作为轮回亲本。回交直到BC7F1代，目的是使遗传背景基本回复到轮回亲本Q11，背景回复率理论上可达98％以上，基本和轮回亲本Q11一致。
在一个实施方案中，所述方法还包括收集在qRgls1和qRgls2位点同时携带纯合抗病基因的自交系Q11qRgls1/2的种子。
在一个实施方案中，利用qRgls1位点连锁的分子标记(例如，但不限于，35-5-3F/R和GI90F/R)检测并挑选携带qRgls1位点杂合或纯合的玉米材料。
在一个实施方案中，利用qRgls2位点连锁的分子标记(例如，但不限于，IDP36F/R和Q22F/R)检测并挑选携带qRgls2位点杂合或纯合的玉米材料。
在一个实施方案中，利用qRgls1位点连锁的分子标记(例如，35-5-3F/R和GI90F/R，GZ204，IDP2，IDP11，M2，18-5，SNP2，IDP5等)和qRgls2位点连锁的分子标记(例如，IDP36F/R和Q22F/R，G346，DD3，M23，DD11等)检测并挑选携带qRgls1位点纯合和qRgls2位点纯合的玉米材料(即，在qRgls1和qRgls2位点同时携带纯合抗病基因的玉米材料)。
在一些实施方案中，利用qRgls1位点连锁的分子标记或qRgls2位点连锁的分子标记进行检测的方法是本领域常规方法，例如，PCR扩增后进行聚丙烯酰胺胶凝胶电泳或琼脂糖凝胶电泳，或PCR产物直接测序等。
本领域技术人员应该理解，对于作为杂交初始亲本的玉米灰斑病感病材料的选择，不限于上述温带感病材料Q11，选择同样在qRgls1和qRgls2位点携带感病基因的玉米感病材料也可以与热带抗灰斑病材料Y32杂交，能够实现本发明所述的育种方法，从而得到具有抗灰斑病性状的玉米自交系；对于抗灰斑病玉米材料的选择，应限于在qRgls1和qRgls2位点同时携带抗病基因的玉米材料，例如热带抗灰斑病材料Y32，或者利用本发明的方法培育的在qRgls1和qRgls2位点同时携带纯合抗病基因的自交系。
在另一个实施方案中，本发明在qRgls1和qRgls2位点同时携带纯合抗病基因的自交系Q11qRgls1/2可以替代热带抗灰斑病材料Y32，作为父本，并使用在qRgls1和qRgls2位点携带感病基因的玉米感病材料(例如，但不限于，温带感病材料Q11)作为母本，进行上述培育抗灰斑病玉米自交系的方法步骤，从而得到抗灰斑病玉米自交系。
在第二方面中，本发明提供一种培育抗灰斑病玉米自交系的方法，所述方法包括：
(1)以同时携带qRgls1和qRgls2的抗灰斑病玉米材料作为供体亲本(父本)与作为受体亲本的感病玉米材料(母本)进行杂交、回交，并进行以下两种选择：
(i)从回交后代中选择qRgls1位点杂合的单株作为父本与所述感病玉米材料杂交继续进行下一轮回交，回交6次直到BC7F1代，其中BC7F1代材料的遗传背景基本回复到所述感病玉米材料(作为轮回亲本)，选择qRgls1位点杂合的单株进行自交，得到在qRgls1位点携带纯合抗病基因的改良材料1和携带感病基因的对照材料1；
(ii)从回交后代中选择qRgls2位点杂合的单株作为父本与所述感病玉米材料杂交继续进行下一轮回交，回交6次直到BC7F1代，其中BC7F1代材料的遗传背景基本回复到所述感病玉米材料(作为轮回亲本)，选择qRgls2位点杂合的单株进行自交，得到在qRgls2位点携带纯合抗病基因的改良材料2和携带感病基因的对照材料2；
(2)将获得的改良材料1与获得的改良材料2进行杂交然后将杂交后代自交，得到在qRgls1和qRgls2位点同时携带纯合抗病基因的改良材料3以及含有两个感病基因的对照材料3，
其中在qRgls1和qRgls2位点同时携带纯合抗病基因的改良材料3为抗灰斑病玉米自交系材料，并且所述抗病基因为ZmWAK-RLK和ZmPK。
在一个实施方案中，同时携带qRgls1和qRgls2的抗灰斑病玉米材料为热带抗灰斑病材料Y32，并且，通过本发明的方法培育的抗灰斑病玉米自交系材料(即，根据本发明第二方面的方法培育的在qRgls1和qRgls2位点同时携带纯合抗病基因的改良材料3，或根据本发明第一方面的方法培育的在qRgls1和qRgls2位点同时携带纯合抗病基因的改良材料Q11qRgls1/2)也可用于本发明第一方面或第二方面所述的培育抗灰斑病玉米自交系的方法。
在一个实施方案中，感病玉米材料没有特别限制，其相对于同时携带qRgls1和qRgls2的抗灰斑病玉米材料而言，在抗灰斑病等效位点qRgls1和qRgls2对应的功能基因不具有抗灰斑病活性，容易感染灰斑病。在一个实施方案中，感病玉米材料可以为Q11，其他感病玉米材料也可以用于本发明第一方面或第二方面所述的培育抗灰斑病玉米自交系的方法。
在第三方面中，本发明提供一种抗灰斑病玉米自交系，该抗灰斑病玉米自交系通过第一方面的方法获得，在qRgls1和qRgls2位点均携带纯合抗病基因。
具体地，在qRgls1和qRgls2位点携带的抗病基因分别为ZmWAK-RLK和ZmPK。并且，所述抗病基因在对应位点纯合存在。
在一些实施方案中，本发明提供抗灰斑病玉米自交系的种子，所述种子在qRgls1和qRgls2位点均携带纯合抗病基因。
在一些实施方案中，本发明提供抗灰斑病玉米自交系的植株，包括子代植株，所述植株在qRgls1和qRgls2位点均携带纯合抗病基因。
在一些实施方案中，本发明提供抗灰斑病玉米自交系的植物部分，所述植物部分在qRgls1和qRgls2位点均携带纯合抗病基因。
所述植物部分表示完整植物的一部分，包括单个细胞和细胞组织(诸如在植物中完整的植物细胞)、细胞团和组织培养物。植物部分的实例包括，但不限于，来自花粉、胚珠、叶、胚、根、根尖、花药、花、果实、茎、苗和种子的单个细胞和组织；以及花粉、胚珠、叶、胚、根、根尖、花药、花、果实、茎、苗、接穗、砧木、种子、原生质体、愈伤组织，等等。
在第四方面中，本发明提供在qRgls1和qRgls2位点同时携带纯合抗病基因的玉米自交系在玉米育种中的用途。
例如，在qRgls1和qRgls2位点同时携带纯合抗病基因的玉米自交系可以用于育种，例如Q11qRgls1/2可与具有其它所需性状的玉米材料杂交，也可通过转基因的方法引入编码赋予其它所需性状的蛋白的核苷酸，从而得到兼具抗灰斑病和其它所需性状的玉米。
例如，在qRgls1和qRgls2位点同时携带纯合抗病基因的玉米自交系可以用于培育除玉米灰斑病抗性之外还具有其他所需性状的玉米材料，所述其他所需性状是以下中的一种或多种：除草剂耐受性、耐旱性、耐热性、低或高土壤pH水平耐受性、耐盐性、细菌病害抗性、病毒病害抗性、真菌病害抗性、害虫抗性(例如，线虫抗性或昆虫抗性)、雄性不育、位点特异性重组；非生物胁迫耐受性、改良的磷特性、改良的抗氧化特性；改良的种子必需氨基酸特性、减少的植酸盐、改良的脂肪酸代谢和改良的碳水化合物代谢。
在一些实施方案中，其他所需性状的获得可以通过杂交获得。
在一个实施方案中，本发明提供一种培育具有抗灰斑病和另外一种或多种所需性状的玉米自交系的方法，所述方法包括：以在qRgls1和qRgls2位点同时携带纯合抗病基因的玉米材料作为父本，以具有其它所需性状的玉米材料作为母本，按照本发明第一方面所述培育抗灰斑病玉米自交系的方法步骤流程进行杂交、回交、选择和自交，最终得到具有抗灰斑病和另外一种或多种所需性状的玉米自交系。
在一些实施方案中，其他所需性状的获得可以通过将编码赋予所需性状的蛋白的一种或多种外源核酸引入在qRgls1和qRgls2位点同时携带纯合抗病基因的玉米材料中实现，例如，通过转基因的方式实现。
在一个实施方案中，本发明提供一种培育具有抗灰斑病和另外一种或多种所需性状的玉米自交系的方法，所述包括将编码赋予所需性状的蛋白的一种或多种外源核酸引入在qRgls1和qRgls2位点同时携带纯合抗病基因的玉米材料中，例如，通过转基因的方式引入。
在第五方面中，本发明涉及一种提高玉米产量的方法，所述方法包括种植在qRgls1和qRgls2位点同时携带纯合抗病基因的玉米材料或其种子，或种植在qRgls1和qRgls2位点同时携带纯合抗病基因并具有其他所需性状的玉米材料或其种子。
在一些实施方案中，所述其他所需性状可以是以下中的一种或多种，但不限于此：除草剂耐受性、耐旱性、耐热性、低或高土壤pH水平耐受性、耐盐性、细菌病害抗性、病毒病害抗性、真菌病害抗性、害虫抗性(例如，线虫抗性或昆虫抗性)、雄性不育、位点特异性重组；非生物胁迫耐受性、改良的磷特性、改良的抗氧化特性；改良的种子必需氨基酸特性、减少的植酸盐、改良的脂肪酸代谢和改良的碳水化合物代谢。
在一些实施方案中，在qRgls1和qRgls2位点同时携带纯合抗病基因并具有其他所需性状的玉米材料可以通过将编码赋予所需性状的蛋白的一种或多种外源核酸引入在qRgls1和qRgls2位点同时携带纯合抗病基因的玉米材料中而获得，例如，通过转基因的方式获得；或者可以通过杂交获得，例如，以在qRgls1和qRgls2位点同时携带纯合抗病基因的玉米材料作为父本，以具有其它所需性状的玉米材料作为母本，按照本发明第一方面所述培育抗灰斑病玉米自交系的方法步骤流程进行杂交、回交、选择和自交，最终得到具有抗灰斑病和另外一种或多种所需性状的玉米自交系。
在第六方面中，本发明提供一种抗灰斑病玉米材料的分离的基因组，其中所述基因组在qRgls1和qRgls2位点均携带纯合抗病基因，并且其中所述抗病基因为ZmWAK-RLK和ZmPK。
在一些实施方案中，所述分离的基因组还包含一种或多种其他外源核酸，所述一种或多种其他外源核酸编码赋予所述玉米材料所需性状的蛋白，其中所述所需性状是以下中的一种或多种：除草剂耐受性、耐旱性、耐热性、低或高土壤pH水平耐受性、耐盐性、细菌病害抗性、病毒病害抗性、真菌病害抗性、害虫抗性(例如，线虫抗性或昆虫抗性)、雄性不育、位点特异性重组；非生物胁迫耐受性、改良的磷特性、改良的抗氧化特性；改良的种子必需氨基酸特性、减少的植酸盐、改良的脂肪酸代谢和改良的碳水化合物代谢。
在第七方面中，本发明提供一种培育具有增强的病害抗性的植物的方法，所述方法包括：使用抗病植物材料作为父本，对应的感病植物材料作为杂交母本和轮回亲本，通过杂交和一系列回交使两个或更多个抗所述病害的位点同时携带纯合抗病害基因，从而得到在两个或更多个抗所述病害的位点同时携带纯合抗病害基因的植物或其种子。其中所述在两个或更多个抗所述病害的位点同时携带纯合抗病害基因的植物具有增强的病害抗性。其中所述杂交和一系列回交按照本发明第一方面所述培育抗灰斑病玉米自交系的方法步骤流程进行杂交、回交、选择和自交，最终得到在两个或更多个抗所述病害的位点同时携带纯合抗病害基因的植物。
在一个实施方案中，所述病害抗性可以是细菌病害抗性、病毒病害抗性、真菌病害抗性或害虫抗性。其中所述害虫抗性可以是线虫抗性或昆虫抗性。
在一个实施方案中，所述抗病害基因可以是参与细菌病害抗性、病毒病害抗性、真菌病害抗性、线虫抗性或害虫抗性的基因。在一个优选实施方案中，所述抗病害基因是抗灰斑病基因。
在一个实施方案中，所述植物是双子叶植物或单子叶植物。其中双子叶植物的实例包括但不限于：烟草、拟南芥、番茄、马铃薯、番薯、甜菜、西兰花、油菜、菜豆、大豆、胡萝卜、草莓、莴苣、棉花等；单子叶植物的实例包括但不限于：玉米/玉蜀黍、稻、燕麦、黑麦、小麦、大麦、高粱、小米等。
在第八方面中，本发明提供一种培育具有增强的优良性状的植物的方法，所述方法包括：使用具有优良性状的植物材料作为父本，不具有该优良性状的植物材料作为杂交母本和轮回亲本，通过杂交和一系列回交使两个或更多个优良性状相关的位点同时携带纯合优良性状相关基因，从而得到在两个或更多个抗所述优良性状相关的位点同时携带纯合优良性状相关基因的植物或其种子。其中所述在两个或更多个抗所述优良性状相关的位点同时携带纯合优良性状相关基因的植物具有增强的优良性状。其中所述杂交和一系列回交按照本发明第一方面所述培育抗灰斑病玉米自交系的方法步骤流程进行杂交、回交、选择和自交，最终得到在两个或更多个抗所述优良性状相关的位点同时携带纯合优良性状相关基因的植物。
在一个实施方案中，所述优良性状可以是选自以下中的一种或多种，不但限于此：除草剂耐受性、耐旱性、耐热性、低或高土壤pH水平耐受性、耐盐性、细菌病害抗性、病毒病害抗性、真菌病害抗性、害虫抗性(例如，线虫抗性或昆虫抗性)、雄性不育、位点特异性重组；非生物胁迫耐受性、改良的磷特性、改良的抗氧化特性；改良的种子必需氨基酸特性、减少的植酸盐、改良的脂肪酸代谢和改良的碳水化合物代谢。
在一个实施方案中，所述植物是双子叶植物或单子叶植物。其中双子叶植物的实例包括但不限于：烟草、拟南芥、番茄、马铃薯、番薯、甜菜、西兰花、油菜、菜豆、大豆、胡萝卜、草莓、莴苣、棉花等；单子叶植物的实例包括但不限于：玉米/玉蜀黍、稻、燕麦、黑麦、小麦、大麦、高粱、小米等。
本发明的优点
本发明结合了生物技术手段和常规育种方法，将抗灰斑病位点导入感病玉米材料中，得到在两个抗病位点同时包含纯合抗病基因且抗病性显著增强的玉米新种质。用该方法得到的抗病玉米自交系，有利于降低灰斑病造成的产量损失，增加了玉米对灰斑病的持久抗病性和地区适应性，具有重要的育种价值。本发明的育种方法是一种安全的育种方法，具有深远的理论和实践意义。并且，本发明的育种方法可以推及到除抗灰斑病之外的其他优良性状和除玉米之外的其他植物(例如，农作物)，通过杂交和一系列回交使两个或更多个优良性状相关的位点同时携带纯合优良性状相关基因，从而得到在两个或更多个抗所述优良性状相关的位点同时携带纯合优良性状相关基因的植物或其种子，所述在两个或更多个抗所述优良性状相关的位点同时携带纯合优良性状相关基因的植物具有增强的优良性状。
附图说明
通过参考下面的附图，本领域技术人员将更容易理解本发明的技术方案。这些附图形成本发明的一部分。
图1为实施例1中qRgls1改良系抗病性鉴定的结果。
图2为实施例2中qRgls2改良系抗病性鉴定的结果。
图3为实施例3中聚合qRgls1和qRgls2改良系抗病性鉴定的结果。
具体实施方式
定义
为了更好地理解本发明，相关术语的定义和解释提供如下。除非在此另外定义，否则与本发明结合使用的科学和技术术语将具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
如本文所用，杂交育种是将父本与母本杂交，形成不同的遗传多样性。再通过对杂交后代的筛选，获得具有父本与母本的优良性状，且不带有父本与母本中不良性状的新品种的育种方法。
本文所用，术语“杂交”、“异花授粉”或“杂交育种”是指将一株植物上一朵花的花粉(人工或天然地)施用于另一株植物上一朵花的胚珠(柱头)的过程。
如本文所用，“自交”是指通过自体受精或自花授粉产生种子，即，花粉和胚珠来自同一植株。术语“自交”、“自花授粉”或“自授粉”可互换使用，意指将一种植物上的一朵花的花粉(人工或天然地)施用至同一植物上的同一朵花或不同花的胚珠(柱头)的过程。
在人工控制自花授粉情况下，经若干代，不断淘汰不良的穗行，选择农艺性状较好的单株进行自交，从而获得农艺性状较整齐一致、遗传基础较单纯的系，称为自交系。培育自交系是玉米杂交育种的物质基础，优异的自交系可以有效地促进突破性新品种的诞生。
如本文所用，术语“近交”或“近交系”是指相对纯种的品系。
如本文所用，“回交”是指两个亲本杂交产生的杂交子代与亲本之一反复杂交的过程。例如，杂交后代，例如第一代杂种(F1)，可以与其亲本之一杂交一次或多次。回交可用于将一个或多个单基因座转化(诸如一个或多个所需性状)从一个遗传背景引入另一个遗传背景。回交的目的是使亲本的优良特性在杂种后代中慢慢加强，而把非轮回亲本的某一优点转移到杂种。
“轮回亲本(recurrent parent)”是指在回交时使用的亲本。一般在第一次杂交时选具有优良特性的品种作母本，而在以后各次回交时作父本，这样的亲本在回交时叫轮回亲本。
如本文所用，术语“子代”是指特定杂交的后代，通常指F1代。一般来说，子代来自两个个体(即，父本和母本)的交配，尽管一些物种(特别是一些植物和雌雄同体动物)可以自交(即，同一植株充当雄性和雌性配子两者的供体)。“后代”可以是F1、F2或任何后续的代，包括经营养性或有性繁殖产生的任意代的植株。
“植物”通常是指处于发育的任何阶段的任何植物，在本文中特别是指玉米植物。
如本文所用，术语“植物部分”是指并且表示植物的一部分，包括单个细胞和细胞组织(诸如在植物中完整的植物细胞)、细胞团和组织培养物，通常可以由这些部分再生植物。植物部分的实例包括，但不限于，来自花粉、胚珠、叶、胚、根、根尖、花药、花、果实、茎、苗和种子的单个细胞和组织；以及花粉、胚珠、叶、胚、根、根尖、花药、花、果实、茎、苗、接穗、砧木、种子、原生质体、愈伤组织，等等。
“双子叶植物(Dicot)”是指胚具有两个种子半部或子叶的开花植物，双子叶植物具有分支叶脉和作为四或五的倍数的花部分。“单子叶植物(Monocot)”定义为胚具有一个子叶或种子叶的开花植物，所述单子叶植物具有平行的叶脉和作为三的倍数的花部分。
如本文所用，术语“品种”是指通过结构特征和性能可与相同物种内的其它品种区别开的类似植物群。培育自交系是玉米杂交育种的物质基础，优异的自交系可以有效地促进突破性新品种的诞生。
“系”或“品系”是一组相同亲本的个体，其通常在一定程度上近交，并且通常在大多数基因座上是纯合和同种的(同基因的或接近同基因的)。“亚系”是指后代的近交亚组，其在遗传上不同于从相同祖先传下来的其它类似的近交亚组。术语“系”还广泛地用于包括但不限于通过组织培养技术从单亲本植物无性繁殖的一组植物或由于来自共同亲本的后代而在遗传上非常相似的一组近交植物。
“优良系”是农艺学上优良的系，其由育种和选择的许多循环获得，其以实现优良的农艺性能。许多优良系是可获得的。“优良种群”是一类优良个体或品系，其可用于表示就给定植物物种的农艺学优良基因型而言的现有技术水平。
“基因型”是指细胞或生物体的遗传组成。“种质”是指包括一个生物体的遗传质量的物理基础的遗传物质。如本文所用，种质包括种子和可从中生长新植物的活组织；备选地，可将另一植物部分，诸如叶片、茎、花粉或细胞培养成完整植物。种质资源提供了植物育种者用来改良商业栽培品种的遗传性状的来源。
在植物育种领域所用的术语“纯合”是指生物体在某一基因座上两个等位基因相同，“杂合”是指生物体在某一基因座上两个等位基因不同。
“连锁”是指这样的现象：其中如果染色体上等位基因的传递是独立的，则同一染色体上的各等位基因倾向于比偶然预期更大频率地一起分离。基因重组在整个基因组中以假定的随机频率发生。遗传图谱通过测量性状或标志对之间的重组频率构建。染色体上的性状或标志彼此越接近，则重组频率越低，并且连锁程度越大。如果两个或更多个性状或标志通常是共分离的，则在本文中认为它们是连锁的。
抗灰斑病位点qRgls1对应的功能基因为ZmWAK-RLK(参见中国发明专利申请号201910140479.1，对应的公开公告号CN109705200A)，该功能基因ZmWAK-RLK的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示：
SEQ ID NO:1：
ATGGCGACGATGTCTGCAGCGTCTCATCGCTGCTGTGCTTCTTCCTTGAGAGCTTTAACGGTGTTATTTGTGTTGGCAGCTCTTGTTTCAGATGTTGGCGGGCGACATCATCATCATGTTTGTCCTCCTTATTTCTCCTGCGGTGGTTTTAGCAATATATCGTATCCATTCCGTCGGCAAGGTGATCCATCGGGGTGCGGTGTCCAATCGTATGAGCTGGTTTGCACGGATACAGACGCTACCATTCGCATCGGCAGTGGAACGTATACCGTGCTTAGCATCAACTCCACCTATTCTTACTTCTGGGTCGTTGATGCCGACCTGGACATCCAGAGCAGTTGCCCCCTTCCCTGGTGGGATCACCATGGTGAGACCAGTACTGCCAACTCATATCGTAGGAGGACTGAGTTCAGGCCTTATTTCCTTTATCCGAATTCGATGTCGATTATCTTTGTGAATTGCTCGAAGCCAATAGAGAACAATGATATATATGAGCCGGTGCCTTGCTTGAGCAATTCTTCTTTCATCTACTTGCTAACTCACTACTCGTATGGCTATGCTCTTGCTGAGATTCTGGAGCCCTCATGCGGTTACCTAGCCATGATTTATTTGGGTGGTCCAGGCATACCGGTGCCCAAGAATACAAGCTATCCAGATGTTGTTAAGTTAATGAGGAATGGATTTGGCCTTAGATTTCCTTCTTCGATTGGTGACCGCGGCATCAGAGAATGTTTCGCAGAGTCTGTGCGGTATCTGATCATCCTATCCTATTTTCCTCCTATGCATGACTTTGTCATCTGAAAACCGTCCGTTGCATTCCCTTCGTAATTCTTTTATATGCTATGGCATGGTCTTGCAGTAATTTCCTTAAAGAGCCAAGAAAGTATCAGATTGTGGACATTCTAATGGTCGAGGAATTATGGTCTTGTTTTCTCGATCAACATGGATCAACTAATAATGTTGTCACTTCTGTTATCATCGACATTATCAAAACAATACCAATATGTATGTGGCTTCTGAAATCTACACATGGTACTCTCTCCGGCTATCATCATTTGTTGAATAAACATCGTATGTTTTGTGGCTTCTGTTTTTTTTTAATTCTTCATGTTTACAACCTTGGATTTTTTTCGGCAGTTTTTTGCAGGCTTGTATTGATGCCGCTAGCAGTATTTGTCTTCCTAGCCCATAAATACTGGAAAGCAAGGATTACAATAGATGCAGTCGAGAAGTTCCTGCGGATGCAGCAGATGCTCGTTCCGATGAGATATGCATACACAAACATCATTGCTATCACCGGTCATTTTAGAGAAAAGCTCGGACAAGGAGGCTACGGTTCTGTATACAAGGGGGTGCTACAGCCAGGTGAAGTACATGTTGCTGTCAAGATGTTAGGCAACTCCAACTGTAATGGAGAAGAGTTCATCAGTGAGGTCGCCACCATTGGCAAGATCCACCATTTCAATGTTGTGCGCCTCATTGGGTTTTGCTCCGAGGAAAATAGAAGGGCACTTATCTACGAGTTCATGCCCCATGGATCTCTCGATAAGTACATCTTCTCGTCGGAGAAGAGTTTCTCATGGGACAAACTCAATGAGATCGCTCTGGGCATTGCTAGAGGTCTCAACTACCTACATCACGGGTGCGATATGCAAATTGTACACTTCGACATCAAGCCACACAACATCCTTCTTGACAGCAACTTTGTTCCAAAAGTTGCTGATTTTGGGCTTGCCAAACTGTTCCCAAGAGACGACAGTTTCGTGCCACTGAGCGCTACGCGGGGAACGATAGGCTATATAGCTCCAGAGATGGTATCTCGAAGCTTTGGTGTCATCTCTAGCAAATCTGATGTGTATAGCTTTGGAATGCTACTGTTGGAGATGACGGGCGGGCGAAGGAACGCAGATCCTTATGCAGGAAGCTCCAGTCAAGCATACTACCCATCCTTGGTGTACAGCCAGCTAAGCCAAGGAGATTTGGGCGAGATCAGTGACGGTGTTGATATGCACGAGTTAGAGAAGAAGCTATGTATCATTGGACTTTGGTGCATCCAGATGAAGCCGCAAGATCGACCGACGATGAGCGACGTCATAGAGATGCTTGAAGTTGGTGTCGATGGCATCCAAATGCCTCCAAGGCCATTCTTTTGTGATGACGAGGGTGATAGTTCTTACTCTGCAATCTCTGAATCGGATACAATAGAAGAGTAG
功能基因ZmWAK-RLK编码的蛋白序列如SEQ ID NO:2所示：
SEQ ID NO:2(*表示终止子)：
MATMSAASHRCCASSLRALTVLFVLAALVSDVGGRHHHHVCPPYFSCGGFSNISYPFRRQGDPSGCGVQSYELVCTDTDATIRIGSGTYTVLSINSTYSYFWVVDADLDIQSSCPLPWWDHHGETSTANSYRRRTEFRPYFLYPNSMSIIFVNCSKPIENNDIYEPVPCLSNSSFIYLLTHYSYGYALAEILEPSCGYLAMIYLGGPGIPVPKNTSYPDVVKLMRNGFGLRFPSSIGDRGIRECFAESVRNFLKEPRKYQIVDILMVEELWSCFLDQHGSTNNVVTSVIIDIIKTIPICMWLLKSTHVFCRLVLMPLAVFVFLAHKYWKARITIDAVEKFLRMQQMLVPMRYAYTNIIAITGHFREKLGQGGYGSVYKGVLQPGEVHVAVKMLGNSNCNGEEFISEVATIGKIHHFNVVRLIGFCSEENRRALIYEFMPHGSLDKYIFSSEKSFSWDKLNEIALGIARGLNYLHHGCDMQIVHFDIKPHNILLDSNFVPKVADFGLAKLFPRDDSFVPLSATRGTIGYIAPEMVSRSFGVISSKSDVYSFGMLLLEMTGGRRNADPYAGSSSQAYYPSLVYSQLSQGDLGEISDGVDMHELEKKLCIIGLWCIQMKPQDRPTMSDVIEMLEVGVDGIQMPPRPFFCDDEGDSSYSAISESDTIEE*
本领域技术人员应该理解，提及功能基因ZmWAK-RLK编码的蛋白，本发明涵盖SEQID NO:2的保留抗灰斑病活性的衍生序列，例如，与SEQ ID NO:2具有至少80％的序列同一性同时保留抗灰斑病活性的氨基酸序列，例如，具有至少85％、90％、95％或99％的序列同一性同时保留抗灰斑病活性的氨基酸序列；或与SEQ ID NO:2相比存在一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30或更多个)氨基酸取代、缺失或插入同时保留抗灰斑病活性的氨基酸序列。优选地，所述氨基酸取代为保守性取代。相应地，提及功能基因ZmWAK-RLK，本发明涵盖编码SEQ ID NO:2及其保留抗灰斑病活性的衍生物的核苷酸序列。
抗灰斑病位点qRgls2对应的功能基因为ZmPK(参见中国发明专利号ZL201910160206.3，对应的授权公告号CN109705202B)，该功能基因为ZmPK的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示：
SEQ ID NO:3：
ATGGGCGCTTGCTTCTCCTCCGCCTCTGCCGCCCCCGCCGGCGCCGCCGTCGACGAGCGCCGCCCGTCCAAGGAGGGCGACGGCAAGAAGAGGCGCCGCGCCGCCGGGG
CATCGCCGGATGCCGCGGCGCCCGTGCGCGTGGAGTTCGGCTACGAGAGGGACTTC
GAGGCGCGCTACGAGGTCGGCCGCCTGCTCGGCCACGGCCAGTTCGGCTACACCTT
CGCCGCCACCGACCGCGGCTCTGGGGACCGCGTTGCCGTCAAGCGCATCGACAAGG
CCAAGGTGAGCTGCCGCCTGCCCCCCCGCACCCCAAGCCGCCGCGCTGTCCCTGTCT
CTGTCTCTCCTACTAGTAGTAGTAGCTGGTGGTGATTCCGAGCGCGTCTTTGGTCTG
GTGCATCGAACCACTTGTGCTTGGTGCATTTCGAGGGGATTCGGTGTAATTCCGTGC
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GATTGGAGCCGTTCATTTTAGGACATTTCCGGTGCCTTTTGGGAGGCGTTTAGCTCA
ACGAGTAGCTCACTCACATTTCTAGCTGTTTGGCCGCTTCATTTCTCCCAAGCTTTCG
TTGTTTGCCGGTGGTTCTGAGCTGCGGGATCTTGACGTTGGCCAGAGAGGTGGTTTC
GACATTCAGGCATCTCGGATGACCTCTTAGTTTGGCACTACAGCTCTATTATTTCGG
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GCCCTACTAATAATTTCAATAAGATTGCCTGCCTCCTTGAATGGTTGGGGCTTGGAA
GGTTCCTGTCGAAGAAAAAGTCAGGAAAGATAACAATTGCGCACTTGCAGTGGACA
ACGCTTCCCTGTCTTCTATGCTATAGGTGGACAGCATTTTTCTAGGTATAATTAATTT
GACCTTCAAACATATGTATACTAACCAACGCGGTTTTGATTCCATCAAATGTTTTGG
ACTCTCTCTGCTGAACTGTCAAAGTTACTTCATGGGGCAAAATGTCAAATTTTCTGG
AACCTTCCGTAGTATATTTTGGAAATGAGTGTTTATTGTGTCATTGGAAATACCGTT
CATGTGTCTGTGACAGAATGTGTCACTAGAAAGCTGAATTGGTGTTGTCCTTGTCAA
AAAGGCACTAAACACGAGTCTGAAAATTAGGCCTGTTCTTGGTAAGGGAAGGAATC
TGAGCATCAATGCTGATAGGAATAGACTCTGTCTGTCAATATTGTTAACTTGTTTAT
AGGGCTTCGAGTTTTCAACTTTTGAGGCAGATAAGTAGGATACCTCTTTTGATCATG
ATATATAACATATTCTTATATACCTCAAGCCTTGCACTGTTAAGTTAATGTGGCATC
CTTTCTAGAGATCATGACCTCAAGTTGCATATGGATGCCAATAATATCGACACCAA
GTGAACATCAGTGTCTGTGGAATATGCCGAAAGCAGCCAACGTGCCATTACTGAAT
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GTAACGTAATGAATCAAAATAGGCTATAAACATGCAATTCAACATATCATTATCAT
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TTGGATGCAGATCTATCGAACCCAGGGACTTTGTGCTTCCAGTGAAAAGTTATATGG
ACCCATAGGCCAGAGGATGTGAGAGTTTTACCTCTCTGGAAGTTATATGCGCTAGC
ATTAGTGTGGTCATCAATGGGATCAAAGATGAGCTCCACCTTTGGTGTAGAGCTGG
AGCTAGGGGACTCTAGCATCCTGGCGCTCCAATCTTCCATCCAGTGAACTCTGTTTT
TTGGGTCTAGTAGGTCAAGGGTCCAGTTATTTTTTCTTTCTGCTGTAAAGTCTCTAGT
TAAGGTGTGAGTTTTGTATGGTGTTTTTTCGAGGTTTCCCCAAACCTCACCTTTTTTC
CTTCTTAATATAATGATATGCAGCTTTCCTGCGTATTCGAGAAAAGAAAGTTTTATC
TCTCTGGAAGTTAACTGCAGAGGAACTTGTTACATTGTTGAGAGTTGTCTCACCGAG
TCACCAGGTCGCTGGTTCAAAGCAGTCTCTCCACATTTATGTGGAAGGCTTGCCTCG
GTTTATCCCTTCCCAAGACTCTACTTGTGGGAGACTCTGGCATTGGGTCTGTCCTAT
GCCGTTGAAGCGCTAGGTTCGTTTATCCCTTCCCTATACCCACTTGTCAGAGCCTCC
AACACTGAGTCTGCCCTAAGCTTCCAAGTTCCAACACTGGGTCTGCCCTAGGCCGTC
GAAGCGTTATATGATTGCCATGTACTGTTATGCTTTGTTGCCTTCACATATTTTCCGT
TCGAAATCATCTCCTTGTTGCCTTCACATATTGCCTTGTTGCTTTCACATATTTTCTG
TTCCACGTCATACTTAGAAGTTAGAACACGTGATTTATGCCAATTAAGATTATTATT
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GCCTGTCCGAGTTCCGCAAGCTCCTACGGACAGCGAGCATGAGCAACGTACCCAGC
CCAAGGGGGCCCCCAAACCCTCAGGCTCTGTGA
该功能基因ZmPK的编码的蛋白序列如SEQ ID NO:4所示：
SEQ ID NO:4(*表示终止子)：
MGACFSSASAAPAGAAVDERRPSKEGDGKKRRRAAGASPDAAAPVRVEFGYERDFEARYEVGRLLGHGQFGYTFAATDRGSGDRVAVKRIDKAKMTRPVAVEDVKREVKILKALKGHQNIVHFYNAFEDDSYVYIVMELCEGGELLDRILAKKNSRYSEKDAAVVVRQMLKVAAECHLRGLVHRDMKPENFLFKSNKEDSPLKATDFGLSDFIKPGKKFHDIVGSAYYVAPEVLKRRSGPESDVWSIGVITYILLCGRRPFWDKTEDGIFKEVLRNKPDFRKRPWSSISPGAKDFVKRLLVKNPRARLTAAQALSHPWVREGGEASDIPVDISVLSNMRQFVKYSRFKQFALRALASTLNEEELSDLKDQFDAIDIDKSGSISIEEMRHALAKDLPWRLKGPRVLEIIQAIDSNTDGLVDFKEFVAATLHIHQMAELDSERWGIRCQAAFSKFDLDGDGYITPEELRMVQHPGLKGSIEPLLEEADIDKDGKISLSEFRKLLRTASMSNVPSPRGPPNPQAL*
本领域技术人员应该理解，提及功能基因ZmPK编码的蛋白，本发明涵盖SEQ IDNO:4的保留抗灰斑病活性的衍生序列，例如，与SEQ ID NO:4具有至少80％的序列同一性同时保留抗灰斑病活性的氨基酸序列，例如，具有至少85％、90％、95％或99％的序列同一性同时保留抗灰斑病活性的氨基酸序列；或与SEQ ID NO:4相比存在一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30或更多个)氨基酸取代、缺失或插入同时保留抗灰斑病活性的氨基酸序列。优选地，所述氨基酸取代为保守性取代。相应地，提及功能基因ZmPK，本发明涵盖编码SEQ ID NO:4及其保留抗灰斑病活性的衍生物的核苷酸序列。
实施例
通过参考下面的实施例，本领域技术人员将更清楚本发明的技术方案及其技术效果。本领域技术人员应该理解，以下实施例仅用于举例说明的目的，并不以任何方式解释为限制本发明的保护范围。本发明的保护范围由权利要求书限定。在不背离本发明的精神和范围的前提下，本领域技术人员能够对本发明的实施方案进行相应的修改，这些修改也包括本发明的范围内。
实施例1：抗灰斑病位点qRgls1改良玉米的选育和抗病性鉴定
一、qRgls1位点改良玉米的获得
1.以热带抗病材料Y32为父本，温带感病材料Q11为母本，进行杂交，得到杂交F1代植株；
2.以F1代植株为父本，Q11为母本，进行杂交(即，回交)，得到BC1F1代植株；
3.利用qRgls1位点连锁的分子标记35-5-3F/R和GI90F/R检测BC1F1代植株的基因型；
35-5-3F:5’-AAGCACAGAGATGAGACGCT-3’(SEQ ID NO:5)
35-5-3R:5’-ACGTGTTCCAGCTTCCAGTT-3’(SEQ ID NO:6)
GI90F:5’-GGTTGCTTTGCCATGAAGTT-3’(SEQ ID NO:7)
GI90R:5’-CCCATGGACGGTGAAAGTAT-3’(SEQ ID NO:8)
4.每一代植株中挑选qRgls1位点杂合的植株作为父本，Q11为母本，连续进行6次杂交(即，回交)，得到BC7F1代植株；此时遗传背景基本回复到轮回亲本Q11；
5.利用qRgls1位点连锁的分子标记35-5-3F/R和GI90F/R检测BC7F1代植株的基因型，挑选该位点杂合的个体进行自交，得到BC7F2代植株；
6.利用分子标记35-5-3F/R和GI90F/R对BC7F2代植株进行基因型检测，分别挑选在qRgls1位点携带纯合抗病基因和纯合感病基因的植株，各自自交，最终得到BC7F3代植株：包括在qRgls1位点携带纯合抗病基因的植株Q11qRgls1和携带纯合感病基因的对照植株Q11CK -1。
二、植株的抗病性鉴定
1.供试植株：
在BC7F3代植株中检测基因型后，挑选纯合植株进行自交并收获种子，然后种植该种子得到的是BC7F4代的植株进行抗病性鉴定。
以BC7F4代的在qRgls1位点携带纯合抗病基因的Q11qRgls1和携带纯合感病基因的对照材料Q11CK-1作为供试植株。
2.抗病性鉴定
抗病性鉴定在云南省保山市进行，自然条件下感染玉蜀黍尾孢菌(Cecrosporazeae-maydis Tehon&Daniels)，发生灰斑病。授粉两周后进行表型调查，采用五级分级标准，根据病斑面积的占比给每个玉米单株进行分级。相同基因型组成的群体发病程度用病情指数(DSI)表示。
其中病情指数(DSI)按式I计算
病情等级的分级标准根据病斑面积占玉米叶片面积的百分比(以X表示)进行，分级标准和对应的赋值参见表1。
表1.玉米灰斑病病情等级的分级标准和赋值
分级标准和赋值 病斑面积占玉米叶片面积的百分比(X)
1级(赋值为0) 0％＜X≤5％
3级(赋值为0.25) 5％＜X≤10％
5级(赋值为0.5) 10％＜X≤30％
7级(赋值为0.75) 30％＜X≤70％
9级(赋值为1) 70％＜X≤100％
结果见图1，结果表明，与qRgls1位点含有纯合感病基因的对照植株相比，qRgls1位点携带纯合抗病基因植株的抗性显著提高，病情指数降低了17.6％。
实施例2：抗灰斑病位点qRgls2改良玉米的选育和抗病性鉴定
一、qRgls2位点改良玉米的获得
1.以热带抗病材料Y32为父本，温带感病材料Q11为母本，进行杂交，得到杂交F1代植株；
2.以F1代植株为父本，Q11为母本，进行杂交(即，回交)，得到BC1F1代植株；
3.利用qRgls2位点连锁的分子标记IDP36F/R和Q22F/R检测BC1F1代植株的基因型；
IDP36F:5’-TCCTCCTGGCAGTCTAGGAA-3’(SEQ ID NO:9)
IDP36R:5’-TCCGTTTTGTTCTGTTGTGC-3’(SEQ ID NO:10)
Q22F:5’-GGTGCTCCATTGATTGACCT-3’(SEQ ID NO:11)
Q22R:5’-CGCCCTGTTCTTATTTGCTC-3’(SEQ ID NO:12)
4.每一代植株中挑选qRgls2位点杂合的植株作为父本，Q11为母本，连续进行6次杂交(即，回交)，得到BC7F1代植株；此时遗传背景基本回复到轮回亲本Q11；
5.利用qRgls2位点连锁的分子标记IDP36F/R和Q22F/R检测BC7F1代植株的基因型，挑选qRgls2位点杂合的植株进行自交，得到BC7F2代植株；
6.利用分子标记IDP36F/R和Q22F/R对BC7F2代植株进行基因型检测，分别挑选在qRgls2位点携带纯合抗病基因和感病基因的个体，各自进行自交，最终得到BC7F3代植株：包括在qRgls2位点携带纯合抗病基因的植株Q11qRgls2和携带纯合感病基因的对照植株Q11CK -2。
二、植株的抗病性鉴定
1.供试植株：
在BC7F3代植株中检测基因型后，挑选纯合植株进行自交并收获种子，然后种植该种子得到的是BC7F4代的植株进行抗病性鉴定。
以BC7F4代的qRgls2位点携带纯合抗病基因的植株Q11qRgls2和携带纯合感病基因的对照植株Q11CK-2作为供试植株。
2.抗病性鉴定
按照与实施例1相同的方法在云南省保山市对qRgls2位点携带纯合抗病基因的植株Q11qRgls2和携带纯合感病基因的对照植株Q11CK-2进行抗病性鉴定。
结果见图2，结果表明，与在qRgls2位点含有感病基因的对照植株相比，qRgls2位点携带纯合抗病基因的植株抗病性显著提高，病情指数降低了25％。
实施例3：聚合qRgls1和qRgls2位点改良玉米的选育和抗病性鉴定
一、聚合qRgls1和qRgls2改良玉米的获得
1.以实施例1中得到的在qRgls1位点携带纯合抗病基因的植株Q11qRgls1和实施例2中得到的在qRgls2位点携带纯合抗病基因的植株Q11qRgls2进行杂交，得到qRgls1和qRgls2两个位点均为杂合的F1代植株；
2.以步骤1中获得F1植株进行自交，得到F2代植株；
3.利用分子标记35-5-3F/R、GI90F/R、IDP36F/R和Q22F/R分别对F2代植株的基因型进行检测，挑选在qRgls1和qRgls2位点同时携带纯合抗病基因的植株进行自交，得到在qRgls1位点和qRgls2位点同时携带纯合抗病基因的植株Q11qRgls1/2；另外，并挑选在两个位点同时携带纯合感病基因的植株进行自交，得到对照植株Q11CK。
二、植株的抗病性鉴定
1.供试植株：
以在qRgls1和qRgls2位点同时携带纯合抗病基因的植株Q11qRgls1/2和对照植株Q11CK作为供试植株。
2.抗病性鉴定
按照与实施例1相同的方法在云南省保山市对在qRgls1和qRgls2位点同时携带纯合抗病基因的植株Q11qRgls1/2和对照植株Q11CK进行抗病性鉴定。
结果见图3，结果表明，与在qRgls1和qRgls2位点含有感病基因的对照植株相比，在qRgls1和qRgls2位点同时携带纯合抗病基因植株的抗病性显著增加，相应的病情指数降低了55.6％。并且，发明人意外地发现，与在单个位点携带纯合抗病基因的玉米植株相比，在qRgls1和qRgls2位点上同时携带纯合抗病基因的植株灰斑病抗性呈现增效效应，病情指数显著降低的百分比显著超过两个单个纯合位点的病情指数显著降低的百分比之和。
本领域技术人员将进一步认识到，在不脱离其精神或中心特征的情况下，本发明可以以其他具体形式来实施。由于本发明的前述描述仅公开了其示例性实施方案，应该理解的是，其他变化被认为是在本发明的范围内。因此，本发明不限于在此详细描述的特定实施方案。相反，应当参考所附权利要求来指示本发明的范围和内容。

Claims (17)

1.一种培育抗灰斑病玉米自交系的方法，所述方法包括：
(1)以热带抗灰斑病材料Y32作为供体亲本与作为受体亲本的温带感病材料Q11进行杂交、回交，并进行以下两种选择：
(i)从回交后代中选择qRgls1位点杂合的单株作为父本与Q11杂交继续进行下一轮回交，回交6次直到BC7F1代，其中BC7F1代材料的遗传背景基本回复到轮回亲本Q11，选择qRgls1位点杂合的单株进行自交，得到在qRgls1位点携带纯合抗病基因的改良材料Q11qRgls1和携带感病基因的对照材料Q11CK-1；
(ii)从回交后代中选择qRgls2位点杂合的单株作为父本与Q11杂交继续进行下一轮回交，回交6次直到BC7F1代，其中BC7F1代材料的遗传背景基本回复到轮回亲本Q11，选择qRgls2位点杂合的单株进行自交，得到在qRgls2位点携带纯合抗病基因的改良材料Q11qRgls2和携带感病基因的对照材料Q11CK-2；
(2)将获得的改良材料Q11qRgls1与获得的改良材料Q11qRgls2进行杂交然后将杂交后代自交，得到在qRgls1和qRgls2位点同时携带纯合抗病基因的改良材料Q11qRgls1/2以及含有纯合感病基因的对照材料Q11CK，
其中在qRgls1和qRgls2位点同时携带纯合抗病基因的改良材料Q11qRgls1/2为抗灰斑病玉米自交系材料，并且所述抗病基因为ZmWAK-RLK和ZmPK。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法还包括收集在qRgls1和qRgls2位点同时携带纯合抗病基因的自交系Q11qRgls1/2的种子。
3.根据权利要求1所述的方法，其中利用qRgls1位点连锁的分子标记检测并挑选qRgls1位点杂合或纯合的玉米植株。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述qRgls1位点连锁的分子标记是SEQ ID NO:5-6所示的35-5-3F/R和SEQ ID NO:7-8所示的GI90F/R，或是GZ204、IDP2、IDP11、M2、18-5、SNP2或IDP5。
5.根据权利要求1或3所述的方法，其中利用qRgls2位点连锁的分子标记检测并挑选qRgls2位点杂合或纯合的玉米植株。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述qRgls2位点连锁的分子标记是SEQ ID NO:9-10所示的IDP36F/R和SEQ ID NO:11-12所示的Q22F/R，或是G346、DD3、M23或DD11。
7.一种抗灰斑病玉米材料的植株或其部分，其中所述植株或其部分在qRgls1和qRgls2两个位点均携带纯合抗病基因。
8.根据权利要求所述的植株或其部分，其中所述植株或其部分包括后代植株、种子、单个细胞、细胞组织、细胞团或组织培养物。
9.一种抗灰斑病玉米材料的分离的基因组，其中所述基因组在qRgls1和qRgls2位点均携带纯合抗病基因，并且其中所述抗病基因为ZmWAK-RLK和ZmPK。
10.一种培育具有抗灰斑病和另外一种或多种其他所需性状的玉米品种的方法，所述包括将编码赋予所需性状的蛋白的一种或多种外源核酸引入在qRgls1和qRgls2位点同时携带纯合抗病基因的玉米材料中，例如，通过转基因的方式引入，或者通过杂交的方式引入。
11.一种提高玉米产量的方法，所述方法包括种植在qRgls1和qRgls2位点同时携带纯合抗病基因的玉米材料或其种子，或种植在qRgls1和qRgls2位点同时携带纯合抗病基因并具有其他所需性状的玉米材料或其种子。
12.根据权利要求10或11所述的方法，其中所述其他所需性状是以下中的一种或多种：除草剂耐受性、耐旱性、耐热性、低或高土壤pH水平耐受性、耐盐性、细菌病害抗性、病毒病害抗性、真菌病害抗性、害虫抗性(例如，线虫抗性或昆虫抗性)、雄性不育、位点特异性重组；非生物胁迫耐受性、改良的磷特性、改良的抗氧化特性；改良的种子必需氨基酸特性、减少的植酸盐、改良的脂肪酸代谢和改良的碳水化合物代谢。
13.在qRgls1和qRgls2位点同时携带纯合抗病基因的玉米自交系在杂交育种中的用途，其中所述在qRgls1和qRgls2位点同时携带纯合抗病基因的玉米自交系替代权利要求1所述的热带抗灰斑病材料Y32作为父本，并使用在qRgls1和qRgls2位点携带感病基因的玉米感病材料作为母本，按照权利要求1所述的杂交、回交、选择和自交流程进行杂交育种，获得抗灰斑病玉米自交系。
14.一种培育具有增强的病害抗性的植物的方法，所述方法包括：使用抗病植物材料作为父本，对应的感病植物材料作为杂交母本和轮回亲本，通过杂交和一系列回交使两个或更多个抗所述病害的位点同时携带纯合抗病害基因，从而得到在两个或更多个抗所述病害的位点同时携带纯合抗病害基因的植物或其种子，其中所述在两个或更多个抗所述病害的位点同时携带纯合抗病害基因的植物具有增强的病害抗性，其中所述杂交和一系列回交按照权利要求1所述的方法的步骤流程进行杂交、回交、选择和自交，最终得到在两个或更多个抗所述病害的位点同时携带纯合抗病害基因的植物。
15.一种培育具有增强的优良性状的植物的方法，所述方法包括：使用具有优良性状的植物材料作为父本，不具有该优良性状的植物材料作为杂交母本和轮回亲本，通过杂交和一系列回交使两个或更多个优良性状相关的位点同时携带纯合优良性状相关基因，从而得到在两个或更多个抗所述优良性状相关的位点同时携带纯合优良性状相关基因的植物或其种子，其中所述在两个或更多个抗所述优良性状相关的位点同时携带纯合优良性状相关基因的植物具有增强的优良性状，其中所述杂交和一系列回交按照权利要求1所述的方法的步骤流程进行杂交、回交、选择和自交，最终得到在两个或更多个抗所述优良性状相关的位点同时携带纯合优良性状相关基因的植物。
16.根据权利要求14或15所述的方法，其中所述植物是双子叶植物或单子叶植物。
17.一种培育抗灰斑病玉米自交系的方法，所述方法包括：
(1)以同时携带qRgls1和qRgls2的抗灰斑病玉米材料作为供体亲本与作为受体亲本的感病玉米材料进行杂交、回交，并进行以下两种选择：
(i)从回交后代中选择qRgls1位点杂合的单株作为父本与所述感病玉米材料杂交继续进行下一轮回交，回交6次直到BC7F1代，其中BC7F1代材料的遗传背景基本回复到所述感病玉米材料(作为轮回亲本)，选择qRgls1位点杂合的单株进行自交，得到在qRgls1位点携带纯合抗病基因的改良材料1和携带感病基因的对照材料1；
(ii)从回交后代中选择qRgls2位点杂合的单株作为父本与所述感病玉米材料杂交继续进行下一轮回交，回交6次直到BC7F1代，其中BC7F1代材料的遗传背景基本回复到所述感病玉米材料(作为轮回亲本)，选择qRgls2位点杂合的单株进行自交，得到在qRgls2位点携带纯合抗病基因的改良材料2和携带感病基因的对照材料2；
(2)将获得的改良材料1与获得的改良材料2进行杂交然后将杂交后代自交，得到在qRgls1和qRgls2位点同时携带纯合抗病基因的改良材料3以及含有两个感病基因的对照材料3，
其中在qRgls1和qRgls2位点同时携带纯合抗病基因的改良材料3为抗灰斑病玉米自交系材料，并且所述抗病基因为ZmWAK-RLK和ZmPK。
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