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CN120137926B - 一种嗜热毁丝霉尿酸酶突变体及其应用 - Google Patents

一种嗜热毁丝霉尿酸酶突变体及其应用

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CN120137926B
CN120137926B CN202510615636.5A CN202510615636A CN120137926B CN 120137926 B CN120137926 B CN 120137926B CN 202510615636 A CN202510615636 A CN 202510615636A CN 120137926 B CN120137926 B CN 120137926B
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myceliophthora thermophila
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周子莘
徐宏轩
周可欣
周麟
李孜乐
罗静
刘梦婷
周莹莹
陈怡君
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Hangzhou Normal University
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Abstract

本发明公开一种嗜热毁丝霉尿酸酶突变体及其应用，所述嗜热毁丝霉尿酸酶突变体在原始野生型嗜热毁丝霉尿酸酶（如SEQ ID NO.1所示）或去除第297‑304位氨基酸的野生型嗜热毁丝霉尿酸酶（如SEQ ID NO.3所示）上包含一个或两个以上组合的突变，能够应用于治疗与尿酸升高相关疾病，如高尿酸血症、高尿酸尿症和痛风。本发明所提供的嗜热毁丝霉尿酸酶突变体具有更高的催化活性和更好的热稳定性及抗酶消化稳定性。

Description

一种嗜热毁丝霉尿酸酶突变体及其应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种嗜热毁丝霉尿酸酶突变体及其应用。
背景技术
高尿酸血症是嘌呤代谢紊乱引起的代谢异常综合症，从患者数量看，是仅次于糖尿病的第二大代谢类疾病。高尿酸血症也伴有许多并发症，如肥胖、高血压、高血脂、肾功能受损、糖尿病、冠心病等，传统降尿酸药物会加重肾脏负担，进一步恶化病情。在白血病、淋巴瘤等血液肿瘤化疗时肿瘤细胞大量死亡裂解，胞内核酸大量降解造成血浆尿酸急剧升高，在短期内有大量尿酸沉积于肾脏而引起急性肾功能衰竭，形成以高尿酸血症为代表的肿瘤溶解综合征（tumor lysis syndrome, TLS）。
尿酸是人体内嘌呤代谢的最终产物，过高的尿酸水平会导致痛风、高尿酸血症等疾病。目前临床治疗高尿酸血症或痛风的药物主要包括抑制尿酸生成药物如别嘌醇、非布司他等黄嘌呤氧化酶抑制药；促进尿酸排泄药物，如苯溴马隆等作用于肾小管上皮靶点抑制尿酸盐重吸收；缓解痛风急性发作的免疫抑制药；以及可直接分解尿酸的尿酸酶类药物。苯溴马隆、非布司他等药物长期服用对肝、肾等器官易造成损害。
尿酸酶，又叫尿酸氧化酶（Urate Oxidase，UOX，EC 1.7.3.3），广泛存在于微生物（苛求芽孢杆菌、黄曲霉等）、植物（大豆等）、动物（猪、狗、狒狒等），在氧气存在的情况下能将尿酸氧化成5-羟基异尿酸，继而转变为尿囊素。尿囊素是一种容易消除的惰性和水溶性嘌呤代谢物，主要经肾排泄。其特异性强，催化效率高，临床研究表明尿酸酶可快速高效降低血清尿酸，几乎没有毒副作用，对高尿酸血症患者、难治性痛风患者均具有较好的疗效；然而，其具有稳定性差、给药后易被清除、免疫原性问题等缺点，极大限制其临床应用。
因此，开发一种稳定、催化效力高的尿酸酶用于治疗高尿酸血症相关疾病具有十分重要的意义。
术语解释
突变用三联体表示：字母-数字-字母，其中的数字表示突变氨基酸的位置， 数字前的字母对应突变设计的氨基酸，数字后的字母表示用于置换数字前氨基酸的氨基酸。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种活性高、稳定性好重组突变嗜热毁丝霉（Myceliophthora thermophila）尿酸酶，有望减少尿酸酶治疗用量，降低外源性蛋白导致的免疫原性。
本发明采用以下技术方案：
一种嗜热毁丝霉尿酸酶突变体，其在对应于SEQ ID NO:1的野生型嗜热毁丝霉尿酸酶或C端截短第297-304位氨基酸的野生型嗜热毁丝霉尿酸酶（如SEQ ID NO:3所示）的位置处包含至少一个突变，或包含两个以上组合的突变；其中所述突变选自：
(a)在第129位，精氨酸被丙氨酸替换（R129A）；
(b)在第243位，丙氨酸被天冬氨酸替换（A243D）；
(c)在第248位，天冬氨酸被谷氨酸替换（D248E）;
(d)在第212位，丝氨酸被亮氨酸替换（S212L）；
(e)在第55位，缬氨酸被亮氨酸和异亮氨酸替换（V55I）；
(f)在第160位，丙氨酸被丝氨酸替换（A160S）；
(g)在第208位，赖氨酸被丙氨酸替换（K208A）
(h)在第191位，赖氨酸被天冬酰胺替换（K191N）；
(i)在第24位，赖氨酸被谷氨酰胺替换（K24Q）；
(j)在第275位，赖氨酸被天冬酰胺替换（K275N）；
(k)在第202位，精氨酸被组氨酸替换（R202H）；
(l)在第166位，精氨酸被异亮氨酸替换（R166I）；
(n)在第68位，赖氨酸被异亮氨酸、丙氨酸替换（K68I、K68A）；
(o)在第137位，精氨酸被谷氨酸替换（R137E）；
(p)在第145位，赖氨酸被丝氨酸替换（K145S）；
(q)在第290位，异亮氨酸被苯丙氨酸、缬氨酸替换（I290F、I290V）；
(r)在第179位，异亮氨酸被缬氨酸替换（I179V）。
优选地，嗜热毁丝霉尿酸酶突变体还包含以下一个或两个以上组合的突变：
(s)在第96位，丝氨酸被天冬氨酸替换（S96D）；
(t)在第227位，脯氨酸被谷氨酰胺替换（P227Q）。
优选地，嗜热毁丝霉尿酸酶突变体还包含以下一个或两个以上组合的突变：
(u)在第228位，丝氨酸被甘氨酸替换（S228G）；
(v)在第290位，异亮氨酸被酪氨酸替换替换（I290Y）。
在某些实施方式中，所述嗜热毁丝霉尿酸酶突变体包含下述的至少一个突变：S96D、K191N、I179V、A160S、S212L、V55I。
在某些其他实施方式中，所述嗜热毁丝霉尿酸酶突变体包含下述的至少一个突变：S96D、K191N、I179V、A160S、S212L、V55I、 K145S、R202H。
所述嗜热毁丝霉尿酸酶突变体与野生型尿酸酶相比，活性提高103%。
所述嗜热毁丝霉尿酸酶突变体与野生型尿酸酶相比，在胰酶存在下可以例如具有高10-12倍、5-9倍、2-5倍的稳定性。
本发明的第二个目的是提供上述嗜热毁丝霉尿酸酶突变体在制备治疗高尿酸血症和/或高尿酸尿症药物中的应用。
优选地，主要应用于口服肠道降尿酸尿酸酶新药。
本发明的第三个目的是提供上述嗜热毁丝霉尿酸酶突变体在制备治疗痛风药物中的应用。
本发明的第四个目的是提供一种用于治疗高尿酸血症、高尿酸尿症或痛风的药物，活性成分为上述嗜热毁丝霉尿酸酶突变体。
优选地，所述药物可以包含提高pH的试剂。
优选地，所述嗜热毁丝霉尿酸酶突变体可以采取可溶形式或晶体形式。
此外，本发明还提供编码所述嗜热毁丝霉尿酸酶突变体的核酸序列、包含上述核酸序列的表达载体以及包含上述表达载体的宿主细胞，例如大肠埃希氏杆菌（Escherichiacoli）细胞。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明通过在多个关键氨基酸位点进行突变，提供了一种嗜热毁丝霉尿酸酶突变体，该突变体相较于野生型尿酸酶具有明显的活性和稳定性提升，通过特定位点突变，突变体的尿酸降解能力增强，其酶活性提高103%；此外，在胰酶存在下，突变体稳定性提高2-12倍，即更耐受消化道环境，适用于口服制剂，相比于传统静脉注射尿酸酶，使用更方便，患者依从性更高。
综上，本发明的嗜热毁丝霉尿酸酶突变体在尿酸降解活性、稳定性、药物应用潜力等方面均具有显著优势，能够为痛风及高尿酸血症、高尿酸尿症患者提供更有效、更方便的治疗方案，在医药行业中具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为重组尿酸酶纯化过程SDS-PAGE图，其中从左至右分别为：诱导前；诱导后；上清；沉淀；流穿；洗脱；Marker。
图2为单点突变嗜热毁丝霉尿酸酶抗胰酶消化能力总结。
图3为双重突变嗜热毁丝霉尿酸酶抗胰酶消化能力总结。
图4为三重突变嗜热毁丝霉尿酸酶抗胰酶消化能力总结。
图5为重组突变嗜热毁丝霉尿酸酶抗胰酶消化能力SDS-PAGE胶图。
图6为重组突变嗜热毁丝霉尿酸酶酶活性曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
野生型嗜热毁丝霉尿酸酶（mtUOX）的氨基酸序列如下SEQ ID NO:1所示：MPNLASARYGKDNVRVCKVQRDEKTGFHTVTEMTVSCLLEGQIETSYTAADNSVVVATDSIKNTIYIKAKEHPVNPPELYASLLGQHFLDKYPHISTAHVNLAVHRWTRLEVDGAPHPHSFYRDGQETRNVEVAVSRGPGGIRIKSSIVGLSVFKSTGSAFHGFVRDEYTTLPETWDRILSTDVDCSWTWKPFDTVEAVQQRVERFDKAWESARGIILRLFAVEESPSVQNTMYKMSEQILEAVPEVDRVDFALPNKHYFELDLSWHKGIKNTGKDAEVYVPQSGPNGLIKCEVARDETTLAHR
其核苷酸序列如下SEQ ID NO:2所示：ATGCCGAACTTGGCATCCGCTCGTTACGGCAAAGATAACGTTCGTGTTTGCAAAGTTCAGCGTGATGAAAAAACCGGTTTCCACACCGTTACCGAAATGACTGTTAGCTGTCTGCTGGAAGGTCAGATCGAAACTTCTTACACTGCAGCGGACAACTCCGTTGTTGTTGCGACCGATTCCATCAAGAATACCATCTACATCAAAGCGAAAGAACATCCGGTAAACCCACCGGAACTGTACGCTTCTCTGCTGGGTCAGCACTTCTTGGACAAATATCCACACATCTCTACCGCTCACGTTAACCTGGCTGTGCACCGTTGGACTCGTCTGGAAGTTGATGGTGCACCGCATCCGCACTCTTTCTACCGTGACGGCCAAGAAACTCGTAACGTTGAAGTTGCTGTTTCTCGTGGTCCAGGTGGTATCCGCATCAAATCCAGCATCGTGGGCCTGTCTGTGTTCAAATCTACCGGTTCTGCGTTCCACGGTTTCGTTCGTGACGAATACACCACTCTGCCGGAAACCTGGGACCGTATCTTGTCTACCGACGTTGACTGCTCTTGGACCTGGAAACCGTTCGATACCGTTGAAGCGGTTCAGCAGCGTGTTGAACGTTTCGACAAGGCGTGGGAATCCGCGCGTGGTATCATCTTGCGTCTGTTCGCGGTAGAAGAATCTCCGTCCGTTCAGAACACCATGTACAAGATGAGCGAACAGATCTTGGAAGCAGTACCGGAAGTTGACCGTGTTGATTTCGCTTTGCCGAACAAACACTACTTCGAACTGGACCTGTCTTGGCACAAAGGTATCAAGAACACCGGTAAAGACGCTGAAGTTTACGTACCGCAGTCTGGTCCGAACGGTCTGATCAAATGCGAAGTAGCACGTGACGAAACCACTCTGGCGCACCGT
本发明还提供了一种重组嗜热毁丝霉尿酸酶F1B2，其氨基酸序列如下SEQ ID NO:3所示：MPNLASARYGKDNVRVCKVQRDEKTGFHTVTEMTVSCLLEGQIETSYTAADNSVVVATDSIKNTIYIKAKEHPVNPPELYASLLGQHFLDKYPHISTAHVNLAVHRWTRLEVDGAPHPHSFYRDGQETRNVEVAVSRGPGGIRIKSSIVGLSVFKSTGSAFHGFVRDEYTTLPETWDRILSTDVDCSWTWKPFDTVEAVQQRVERFDKAWESARGIILRLFAVEESPSVQNTMYKMSEQILEAVPEVDRVDFALPNKHYFELDLSWHKGIKNTGKDAEVYVPQSGPNGLIKCEVARD
其核苷酸序列如下SEQ ID NO:4所示：ATGCCGAACTTGGCATCCGCTCGTTACGGCAAAGATAACGTTCGTGTTTGCAAAGTTCAGCGTGATGAAAAAACCGGTTTCCACACCGTTACCGAAATGACTGTTAGCTGTCTGCTGGAAGGTCAGATCGAAACTTCTTACACTGCAGCGGACAACTCCGTTGTTGTTGCGACCGATTCCATCAAGAATACCATCTACATCAAAGCGAAAGAACATCCGGTAAACCCACCGGAACTGTACGCTTCTCTGCTGGGTCAGCACTTCTTGGACAAATATCCACACATCTCTACCGCTCACGTTAACCTGGCTGTGCACCGTTGGACTCGTCTGGAAGTTGATGGTGCACCGCATCCGCACTCTTTCTACCGTGACGGCCAAGAAACTCGTAACGTTGAAGTTGCTGTTTCTCGTGGTCCAGGTGGTATCCGCATCAAATCCAGCATCGTGGGCCTGTCTGTGTTCAAATCTACCGGTTCTGCGTTCCACGGTTTCGTTCGTGACGAATACACCACTCTGCCGGAAACCTGGGACCGTATCTTGTCTACCGACGTTGACTGCTCTTGGACCTGGAAACCGTTCGATACCGTTGAAGCGGTTCAGCAGCGTGTTGAACGTTTCGACAAGGCGTGGGAATCCGCGCGTGGTATCATCTTGCGTCTGTTCGCGGTAGAAGAATCTCCGTCCGTTCAGAACACCATGTACAAGATGAGCGAACAGATCTTGGAAGCAGTACCGGAAGTTGACCGTGTTGATTTCGCTTTGCCGAACAAACACTACTTCGAACTGGACCTGTCTTGGCACAAAGGTATCAAGAACACCGGTAAAGACGCTGAAGTTTACGTACCGCAGTCTGGTCCGAACGGTCTGATCAAATGCGAAGTAGCACGTGAC
本发明还提供了一种重组嗜热毁丝霉尿酸酶F1B2-S96D，其氨基酸序列如下SEQID NO:5所示：MPNLASARYGKDNVRVCKVQRDEKTGFHTVTEMTVSCLLEGQIETSYTAADNSVVVATDSIKNTIYIKAKEHPVNPPELYASLLGQHFLDKYPHIDTAHVNLAVHRWTRLEVDGAPHPHSFYRDGQETRNVEVAVSRGPGGIRIKSSIVGLSVFKSTGSAFHGFVRDEYTTLPETWDRILSTDVDCSWTWKPFDTVEAVQQRVERFDKAWESARGIILRLFAVEESPSVQNTMYKMSEQILEAVPEVDRVDFALPNKHYFELDLSWHKGIKNTGKDAEVYVPQSGPNGLIKCEVARD
其核苷酸序列如下SEQ ID NO:6所示：ATGCCGAACTTGGCATCCGCTCGTTACGGCAAAGATAACGTTCGTGTTTGCAAAGTTCAGCGTGATGAAAAAACCGGTTTCCACACCGTTACCGAAATGACTGTTAGCTGTCTGCTGGAAGGTCAGATCGAAACTTCTTACACTGCAGCGGACAACTCCGTTGTTGTTGCGACCGATTCCATCAAGAATACCATCTACATCAAAGCGAAAGAACATCCGGTAAACCCACCGGAACTGTACGCTTCTCTGCTGGGTCAGCACTTCTTGGACAAATATCCACACATCGACACCGCTCACGTTAACCTGGCTGTGCACCGTTGGACTCGTCTGGAAGTTGATGGTGCACCGCATCCGCACTCTTTCTACCGTGACGGCCAAGAAACTCGTAACGTTGAAGTTGCTGTTTCTCGTGGTCCAGGTGGTATCCGCATCAAATCCAGCATCGTGGGCCTGTCTGTGTTCAAATCTACCGGTTCTGCGTTCCACGGTTTCGTTCGTGACGAATACACCACTCTGCCGGAAACCTGGGACCGTATCTTGTCTACCGACGTTGACTGCTCTTGGACCTGGAAACCGTTCGATACCGTTGAAGCGGTTCAGCAGCGTGTTGAACGTTTCGACAAGGCGTGGGAATCCGCGCGTGGTATCATCTTGCGTCTGTTCGCGGTAGAAGAATCTCCGTCCGTTCAGAACACCATGTACAAGATGAGCGAACAGATCTTGGAAGCAGTACCGGAAGTTGACCGTGTTGATTTCGCTTTGCCGAACAAACACTACTTCGAACTGGACCTGTCTTGGCACAAAGGTATCAAGAACACCGGTAAAGACGCTGAAGTTTACGTACCGCAGTCTGGTCCGAACGGTCTGATCAAATGCGAAGTAGCACGTGACGAAACCACTCTGGCGCACCGT
本发明还提供了一种重组嗜热毁丝霉尿酸酶F1B2-A160S-V55I，其氨基酸序列如下SEQ ID NO:7所示：MPNLASARYGKDNVRVCKVQRDEKTGFHTVTEMTVSCLLEGQIETSYTAADNSVIVATDSIKNTIYIKAKEHPVNPPELYASLLGQHFLDKYPHISTAHVNLAVHRWTRLEVDGAPHPHSFYRDGQETRNVEVAVSRGPGGIRIKSSIVGLSVFKSTGSFHGFVRDEYTTLPETWDRILSTDVDCSWTWKPFDTVEAVQQRVERFDKAWESARGIILRLFAVEESPSVQNTMYKMSEQILEAVPEVDRVDFALPNKHYFELDLSWHKGIKNTGKDAEVYVPQSGPNGLIKCEVARD
其核苷酸序列如下SEQ ID NO:8所示：ATGCCGAACTTGGCATCCGCTCGTTACGGCAAAGATAACGTTCGTGTTTGCAAAGTTCAGCGTGATGAAAAAACCGGTTTCCACACCGTTACCGAAATGACTGTTAGCTGTCTGCTGGAAGGTCAGATCGAAACTTCTTACACTGCAGCGGACAACTCCGTTATCGTTGCGACCGATTCCATCAAGAATACCATCTACATCAAAGCGAAAGAACATCCGGTAAACCCACCGGAACTGTACGCTTCTCTGCTGGGTCAGCACTTCTTGGACAAATATCCACACATCTCTACCGCTCACGTTAACCTGGCTGTGCACCGTTGGACTCGTCTGGAAGTTGATGGTGCACCGCATCCGCACTCTTTCTACCGTGACGGCCAAGAAACTCGTAACGTTGAAGTTGCTGTTTCTCGTGGTCCAGGTGGTATCCGCATCAAATCCAGCATCGTGGGCCTGTCTGTGTTCAAATCTACCGGTTCTTCTTTCCACGGTTTCGTTCGTGACGAATACACCACTCTGCCGGAAACCTGGGACCGTATCTTGTCTACCGACGTTGACTGCTCTTGGACCTGGAAACCGTTCGATACCGTTGAAGCGGTTCAGCAGCGTGTTGAACGTTTCGACAAGGCGTGGGAATCCGCGCGTGGTATCATCTTGCGTCTGTTCGCGGTAGAAGAATCTCCGTCCGTTCAGAACACCATGTACAAGATGAGCGAACAGATCTTGGAAGCAGTACCGGAAGTTGACCGTGTTGATTTCGCTTTGCCGAACAAACACTACTTCGAACTGGACCTGTCTTGGCACAAAGGTATCAAGAACACCGGTAAAGACGCTGAAGTTTACGTACCGCAGTCTGGTCCGAACGGTCTGATCAAATGCGAAGTAGCACGTGACGAAACCACTCTGGCGCACCGT
实施例
实施例1：嗜热毁丝霉尿酸酶系列突变体的重组表达载体构建
选取拟突变位点，通过PCR手段扩增目的基因，经核酸胶验证后，转入大肠杆菌DH5α，常规卡那霉素平板挑单克隆测定突变编码序列确认得到嗜热毁丝霉尿酸酶突变体。
实施例2：嗜热毁丝霉尿酸酶突变体的表达与纯化
采用大肠杆菌BL21(DE3)原核表达体系表达目的蛋白，将转化的大肠杆菌细胞在LB培养基（含0.1g/L卡那霉素）培养4-6 h，加200 μM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）于17℃诱导12 h，5000 rpm，10 min，离心，收集细胞，用于尿酸酶突变体的纯化。
使用亲和层析的方法进行纯化，将破碎后的菌液上清与镍介质混合，通过6×His-标签使目的蛋白与镍介质特异性结合，经低浓度咪唑洗杂、高浓度咪唑洗脱的步骤后得到高纯度的目的蛋白溶液。通过SDS-PAGE检测目的蛋白纯度，结果如图1所示。mtUOX及其突变体分子量大小约为34.2 kDa；mtUOX及其突变体在Tris-HCl pH 8.0，150 mM NaCl溶液中稳定。
实施例3：嗜热毁丝霉尿酸酶系列突变体抗胰酶消化稳定性测定
胰酶稳定性测定步骤：将100 uM尿酸酶液和1 mg/mL胰酶按照等体积比例混合，在37℃孵育一定时间；分别在孵育0 min、10 min、20 min、30 min、45 min、60 min取样20 uL，加入5×SDS，立即95℃变性10 min，通过SDS-PAGE验证蛋白和胰酶孵育后降解情况。
设计了21种突变嗜热毁丝霉尿酸酶，其各自对应于野生型序列（SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3）具有1个氨基酸替换。本实施例中采用活性更强的C端截短第297-304位氨基酸的野生型嗜热毁丝霉尿酸酶（如SEQ ID NO:3所示）作为突变体母体，所述突变体母体为F1B2，被标注为R1；且后续所有突变体的比活性、抗胰酶消化能力的提高百分比和提高倍数均以R1为基准。
表1描绘了重组突变嗜热毁丝霉来源尿酸酶的氨基酸替换以及每种酶的比活性（每μM酶，1 min内消耗的尿酸的μM数）、胰酶稳定性（胰酶消化30 min后的蛋白剩余量，“-“表示突变体比活性或抗胰酶消化能力低于野生型尿酸酶。
表1
克隆 替换 胰酶消化30 min后剩余（%） 提高倍数 比活性 提高百分比（%）
WT 6.49 / 30.33 /
R1 F1B2 10.28 / 100.08 /
R1-M1 S96D 27.39 4.22 136.88 36.77
R1-M2 K191N 21.74 3.35 100.12 0.04
R1-M3 I179V 18.82 2.90 185.70 85.55
R1-M4 A160S 18.63 2.87 100.79 0.71
R1-M5 I290F 17.98 2.77 34.65 -
R1-M6 S212L 15.97 2.46 101.83 1.75
R1-M7 A243D 12.92 1.99 106.34 6.25
R1-M8 R202H 12.53 1.93 148.83 48.71
R1-M9 I290V 11.42 1.76 103.35 3.27
R1-M10 K145S 11.23 1.73 111.28 11.19
R1-M11 P227Q 9.60 1.48 62.54 -
R1-M12 K24Q - - 154.97 54.85
R1-M13 K275N - - 153.68 53.56
R1-M14 R129A - - 145.65 45.53
R1-M15 R166I - - 144.92 44.80
R1-M16 K68A - - 136.77 36.66
R1-M17 K68I - - 134.51 34.40
R1-M18 R137E - - 117.88 17.79
R1-M19 V55I - - 117.88 17.79
R1-M20 K208A - - 117.79 17.70
R1-M21 D248E - - 114.57 14.48
其中单点突变嗜热毁丝霉尿酸酶抗胰酶消化能力总结如图2所示。
以上结果表明S96D、K191N、I179V、A160S、S212L、V55I是对酶活或抗胰酶消化能力提高的关键突变位点，因此含有这6个突变的嗜热毁丝霉尿酸酶在第二轮嗜热毁丝霉尿酸酶的设计中被用作母体，记为R2。
表2描绘了突变尿酸酶的氨基酸替换以及每种酶的比活性（每μM酶，1 min内消耗的尿酸的μM数）、胰酶稳定性（胰酶消化30 min后的蛋白剩余量，“-“表示比活性或抗胰酶消化能力低于野生型尿酸酶。
表2
克隆 替换 胰酶消化30 min后剩余（%） 提高倍数 比活性 提高百分比（%）
R2-M1 A160S-V55I 78.72 12.13 101.98 1.90
R2-M2 A160S-S212L 60.16 9.27 157.12 -
R2-M3 S212L-V55I 56.07 8.64 111.51 11.42
R2-M4 I179V-V55I 47.64 7.34 175.16 -
R2-M5 S96D-A160S 46.60 7.18 107.06 6.97
R2-M6 S96D-V55I 44.78 6.90 105.46 5.38
R2-M7 A243D-V55I 41.54 6.40 109.06 8.97
R2-M8 A160S-A243D 39.39 6.07 100.41 0.33
R2-M9 S228G-I290Y 39.20 6.04 - -
R2-M10 K191N-V55I 36.86 5.68 101.26 1.18
R3-M11 S212L-A243D 30.50 4.70 172.39 10.38
R2-M12 S212L-K191N 12.68 3.96 101.84 1.76
R2-M13 S96D-A243D 16.87 2.60 120.95 20.85
R2-M14 K191N-I179V 16.55 2.55 100.17 0.09
R2-M15 S96D-S212L 15.71 2.42 148.64 48.52
R2-M16 S96D-K191N 15.58 2.40 149.78 49.66
R2-M17 K191N-A160S 14.54 2.24 100.48 0.40
R2-M18 I179V-A160S 13.95 2.15 154.77 54.65
R2-M19 S96D-I179V 13.76 2.12 203.65 103.49
R2-M20 S212L-R129A 12.27 1.89 167.67 67.54
R2-M21 K191N-A243D 10.32 1.59 - -
R2-M22 I179V-A243D - - 140.49 40.38
R2-M23 I179V-S212L - - 124.38 24.28
其中双重突变嗜热毁丝霉尿酸酶抗胰酶消化能力总结如图3所示。
以上结果表明A160S-V55I、A160S-S212L、S212L-V55I、I179V-V55I、S96D-A160S、S96D-V55I、A243D-V55I、A160S-A243D是对酶活或抗胰酶消化能力提高的关键突变位点，因此含有这8个突变的嗜热毁丝霉尿酸酶在第三轮嗜热毁丝霉尿酸酶的设计中被用作母体，记为R3。
表3描绘了突变尿酸酶的氨基酸替换以及每种酶的比活性（每μM酶，1 min内消耗的尿酸的μM数）、胰酶稳定性（胰酶消化30 min后的蛋白剩余量，“-“表示比活性或抗胰酶消化能力低于野生型尿酸酶。
表3
克隆 替换 胰酶消化30 min后剩余（%） 提高倍数 比活性 提高百分比（%）
R3-M1 A160S-V55I-S96D 71.20 10.97 112.17 12.08
R3-M2 A160S-V55I-I179V 37.71 5.81 103.47 3.39
R3-M3 A160S-V55I-K191N 35.24 5.43 103.42 -
R3-M4 A160S-V55I-S212L 31.15 4.80 109.96 -
R3-M5 A160S-V55I-A243D 28.43 4.38 114.63 14.54
R3-M6 A160S-V55I -R202H 24.40 3.76 246.07 -
R3-M7 S212L-V55I-R202H 18.11 2.79 247.37 -
R3-M8 S212L-V55I K145S 17.91 2.76 104.03 3.95
R3-M9 S96D-V55I -R202H 17.46 2.69 123.25 23.15
R3-M10 S96D-A160S-K145S 16.10 2.48 246.64 -
R3-M11 I179V-V55I-R202H 15.77 2.43 110.47 -
R3-M12 A160S-S212L-R202H 13.76 2.12 230.01 -
R3-M13 S96D-V55I-K145S 13.69 2.11 124.59 24.49
R3-M14 S96D-A160S-R202H 13.56 2.09 240.10 -
R3-M15 A243D-V55IK-145S 11.81 1.82 119.84 19.74
R3-M16 A160S-A243D-K145S 11.16 1.72 184.94 -
R3-M17 A243D-V55I-R202H 10.84 1.67 275.82 -
R3-M18 I179V-V55I-K145S - - 166.34 66.21
R3-M19 A160S-A243D-R202H - - 111.86 11.77
其中三重突变嗜热毁丝霉尿酸酶抗胰酶消化能力总结如图4所示。
表4描绘了所有突变尿酸酶的氨基酸替换以及每种酶的比活性（每μM酶，1 min内消耗的尿酸的μM数）、胰酶稳定性（胰酶消化30 min后的蛋白剩余量，“-“表示比活性或抗胰酶消化能力低于野生型尿酸酶。
表4
Protein 胰酶消化30min后剩余（%） 提高倍数 比活性 提高百分比（%）
R2-M1 78.72 12.13 101.98 1.9
R3-M1 71.20 10.97 112.17 12.08
R2-M2 60.16 9.27 157.12 -
R2-M3 56.07 8.64 111.51 11.42
R2-M4 47.64 7.34 175.16 -
R2-M5 46.60 7.18 107.06 6.97
R2-M6 44.78 6.90 105.46 5.38
R2-M7 41.54 6.40 109.06 8.97
R2-M8 39.39 6.07 100.41 0.33
R2-M9 39.20 6.04 - -
R3-M2 37.71 5.81 103.47 3.39
R2-M10 36.86 5.68 101.26 1.18
R3-M3 35.24 5.43 103.42 -
R3-M4 31.15 4.80 109.96 -
R3-M11 30.50 4.70 172.39 10.38
R3-M5 28.43 4.38 114.63 14.54
R1-M1 27.39 4.22 136.88 36.77
R2-M12 12.68 3.96 101.84 1.76
R3-M6 24.40 3.76 246.07 -
R1-M2 21.74 3.35 100.12 0.04
R1-M3 18.82 2.90 185.7 85.55
R1-M4 18.63 2.87 100.79 0.71
R3-M7 18.11 2.79 247.37 -
R1-M5 17.98 2.77 34.65 -
R3-M8 17.91 2.76 104.03 3.95
R3-M9 17.46 2.69 123.25 23.15
R2-M13 16.87 2.60 120.95 20.85
R2-M14 16.55 2.55 100.17 0.09
R3-M10 16.10 2.48 246.64 -
R1-M6 15.97 2.46 101.83 1.75
R3-M11 15.77 2.43 110.47 -
R2-M15 15.71 2.42 148.64 48.52
R2-M16 15.58 2.40 149.78 49.66
R2-M17 14.54 2.24 100.48 0.4
R2-M18 13.95 2.15 154.77 54.65
R2-M19 13.76 2.12 203.65 103.49
R3-M12 13.76 2.12 230.01 -
R3-M13 13.69 2.11 124.59 24.49
R3-M14 13.56 2.09 240.1 -
R1-M7 12.92 1.99 106.34 6.25
R1-M8 12.53 1.93 148.83 48.71
R2-M20 12.27 1.89 167.67 67.54
R3-M15 11.81 1.82 119.84 19.74
R1-M9 11.42 1.76 103.35 3.27
R1-M10 11.23 1.73 111.28 11.19
R3-M16 11.16 1.72 184.94 -
R3-M17 10.84 1.67 275.82 -
R2-M21 10.32 1.59 - -
R1-M11 9.60 1.48 62.54 -
R3-M18 - - 166.34 66.21
R1-M12 - - 154.97 54.85
R1-M13 - - 153.68 53.56
R1-M14 - - 145.65 45.53
R1-M15 - - 144.92 44.8
R2-M22 - - 140.49 40.38
R1-M16 - - 136.77 36.66
R1-M17 - - 134.51 34.4
R2-M23 - - 124.38 24.28
R1-M18 - - 117.88 17.79
R1-M19 - - 117.88 17.79
R1-M20 - - 117.79 17.7
R1-M21 - - 114.57 14.48
R3-M19 - - 111.86 11.77
本实施例SDS-PAGE验结果如图5所示；由图5可知，A160S-V55I、A160S-V55I-S96D和A160S-S212L突变体抗胰酶消化能力较强，消化速度较慢，而野生型嗜热毁丝霉尿酸酶则易被胰酶消化。
实施例4：嗜热毁丝霉尿酸酶系列突变体活性测定
活性测定定义：每分钟氧化1 μmol底物尿酸所需的酶量为一个活力单位。
酶活性测定步骤：将尿酸粉溶解在pH 8.6的四硼酸钠溶液中，配置得到300 μM尿酸溶液。将适当尿酸酶液用SEC buffer（Tris-HCl pH8.0，150 mM NaCl）稀释至5 μM。
设置酶标仪检测波长为293 nm和37℃；取无紫外吸收的96孔板，在孔中依次加入5μL尿酸酶液，取预热至37℃的尿酸溶液195 μL与尿酸酶液混合，开始反应，连续测定293 nm处吸光值的变化20 min，每1 min检测一次数值。以相同尿酸浓度，无酶溶液做空白对照。
通过尿酸浓度下降速度比较催化反应活性，部分突变体的酶活性结果如图6所示。由结果可知本发明突变体具有良好的酶活性。
上述实施例并非是对于本发明的限制，本发明并非仅限于上述实施例，只要符合本发明要求，均属于本发明的保护范围。此外应理解，在阅读了本发明的上述描述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (7)

1.一种嗜热毁丝霉尿酸酶突变体，其特征在于，在去除第297-304位氨基酸的野生型嗜热毁丝霉尿酸酶上的突变位点为A160S，所述去除第297-304位氨基酸的野生型嗜热毁丝霉尿酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.根据权利要求1所述的嗜热毁丝霉尿酸酶突变体，其特征在于，所述突变体在去除第297-304位氨基酸的野生型嗜热毁丝霉尿酸酶上的突变位点为A160S-V55I、A160S-S212L、A160S-S96D或A160S-A243D。
3.根据权利要求2所述的嗜热毁丝霉尿酸酶突变体，其特征在于，所述突变体在去除第297-304位氨基酸的野生型嗜热毁丝霉尿酸酶上的突变位点为A160S-V55I-S96D、A160S-V55I-I179V、A160S-V55I-K191N、A160S-V55I-S212L、A160S-V55I-A243D或A160S-V55I -R202H。
4.如权利要求1-3任一项所述的嗜热毁丝霉尿酸酶突变体在制备治疗高尿酸血症和/或高尿酸尿症药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述药物的给药方式为口服，作用于肠道。
6.如权利要求1-3任一项所述的嗜热毁丝霉尿酸酶突变体在制备治疗痛风药物中的应用。
7.一种用于治疗高尿酸血症、高尿酸尿症或痛风的药物，其特征在于，活性成分为权利要求1-3任一项所述的嗜热毁丝霉尿酸酶突变体。
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